BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Kitin dan Kitosan

Kitin mempunyai rumus empiris (C6H9O4.NHCOCH3)n dan merupakan zat

padat yang tidak larut dalam air, pelarut organik, alkali pekat, asam mineral

lemah tetapi larut dalam asam-asam mineral yang pekat. Polisakarida ini

mempunyai berat molekul tinggi dan merupakan polimer berantai lurus dengan

nama lain β-(1,4)-2-asetamida-2-dioksi-D-glukosa (N-asetil-D-Glukosamin)

(Suryanto et al., 2005).

Kitin mempunyai persamaan dengan selulosa, dimana ikatan yang terjadi

antar monomernya terangkai dengan ikatan glukosida pada posisi β -1,4.

Sedangkan perbedaannya pada selulosa adalah gugus hidroksil yang terikat pada

atom karbon nomor 2, pada kitin digantikan oleh gugus asetamida (NHCOCH3)

sehingga kitin menjadi sebuah polimer berunit N-asetil-glukosamin. Struktur kitin

dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Struktur kitin (Murray et al., 2003).

Kitin merupakan homopolimer dari β -1,4 N-asetil-D-glukosamin dan

merupakan polimer kedua terbanyak di alam setelah selulosa. Senyawa ini dapat

ditemukan pada cangkang udang, kepiting, molusca, seranggga, annelida, dan

beberapa dinding sel jamur dan alga. Kitin dapat dihidrolisis secara enzimatis

oleh enzim kitinase, menghasilkan monomer β -1,4-N-asetil-D-glukosamin

(Yurnaliza, 2002).

Rantai kitin antara satu dengan yang lainnya berasosiasi dengan ikatan

hidrogen yang sangat kuat antara gugus N-H dari satu rantai dan gugus C=O dari

rantai yang berdekatan. Ikatan hidrogen menyebabkan kitin tidak dapat larut

dalam air dan membentuk formasi serabut (fibril) ((Cabib, (1987) dalam

Suryantoa et al., (2005)).

Kitosan merupakan kitin yang dihilangkan gugus asetilnya dengan

menggunakan basa kuat. Gugus amina dan hidroksil menjadikan kitosan bersifat

lebih aktif dan bersifat polikationik (Widodo et al., 2005).

Gambar 2. Struktur kitosan (Murray et al., 2003).

9

B. Mikroba penghasil kitinase

Aktinomisetes, bakteri dan jamur merupakan organisme yang mampu

memanfaatkan kitin sebagai sumber karbon dan nitrogen. Genus bakteri yang

sudah banyak dilaporkan memiliki kitinase antara lain Aeoromonas, Alteromonas,

Chromobacterium, Enterobacter, Ewingella, Pseudoalteromonas, Pseudomonas,

Serratia, Vibrio, Bacillus, Pyrococcus ((Chernin et al., (1998); Pleban et al.,

(1997); Gao et al., (2003) dalam Suryantoa et al., (2005)) dan Clostridia ((Patil

et al., (2000) dalam Wahyuni (2008)).

Koloidal kitin merupakan salah satu substrat yang dapat digunakan untuk

menginduksi kitinase pada bakteri, jamur dan aktinomisetes. Substrat ini mampu

menginduksi enzim hidrolitik seperti β-1,4-N-asetilglukosaminidase, endokitinase

dan kitobiosidase pada Aeromonas caviae, Enterobacter agglomeras, Bacillus

cereus ((Inbar and Chet, (1991); Chernin et al., (1995); (Pleban et al., (1997)

dalam Suryanto et al., (2005)).

C. Kitinase

Harman et al., (1993) dan Sahai et al., (1993) dalam Suryanto et al.,

(2005) membagi kitinase dalam tiga tipe yaitu :

1. Endokitinase (EC 3.2.1.14) yaitu kitinase yang memotong secara acak

ikatan β-1,4 bagian internal mikrofibril kitin. Produk akhir yang terbentuk

bersifat mudah larut berupa oligomer pendek N-asetilglukosamin

(GIcNAc) yang mempunyai berat molekul rendah seperti kitotetraose.

10

Gambar 3. Reaksi pemutusan ikatan β-1,4 pada bagian internal mikrofibril kitin

2. Eksokitinase (EC 3.2.1.14) dinamakan juga kitobiodase atau kitin

1,4-β-kitobiodase, yaitu enzim yang mengatalisis secara aktif pembebasan

unit-unit diasetilkitobiose tanpa ada unit-unit monosakarida atau

polisakarida yang dibentuk. Pemotongan hanya terjadi pada ujung non

reduksi mikrofibril kitin dan tidak secara acak.

Gambar 4. Reaksi pembebasan unit-unit diasetilkitobiose oleh enzim eksokitinase

11

3. β-1,4-N-asetilglukosaminidase (EC 3.2.1.30) merupakan suatu kitinase

yang bekerja pada pemutusan diasetilkitobiose, kitotriose dan kitotetraose

dengan menghasilkan monomer-monomer GIcNAc.

Gambar 5. Reaksi pemutusan diasetilkitobiose, kitotriose dan kitotetraose dan menghasilkan monomer-monomer GIcNAc

Kitinase berguna dalam produksi kitooligosakarida. Kitooligosakarida

berperan sebagai pertahanan tanaman, juga digunakan dalam kesehatan manusia.

Sebagai contoh, kitoheksosa dan kitoheptosa memperlihatkan aktivitas anti tumor.

GicNAc berguna sebagai obat anti inflamasi. Senyawa ini dalam tubuh manusia

disintesis dari glukosa dan digabungkan dengan glikoprotein dan

glikosaminoglikan ((Patil et al., (2000) dalam Suryantoa et al., (2005)). Kitinase

juga berperan dalam produksi protein sel tunggal dari limbah kitin untuk makanan

hewan ((Shaikh et al., (1993) dalam Suryantoa et al., (2005)). Kitinase juga dapat

12

digunakan dalam pertanian sebagai pengendalian jamur patogen tanaman dan

hama serangga. Kombinasi σ-toksin dan kitinase dilaporkan lebih efektif dalam

membunuh hama serangga ((Patil et al., (2000) dalam Suryantoa et al., (2005)).

D. Data awal karakteristik isolat bakteri kitinolitik SSD2A7.1 dan SSA2B4.1

Data awal karakteristik isolat SSA2B4.1 dan isolat SSD2A7.1 diperoleh

dari penelitian Wahyuni et al., (2008) meliputi data indeks kitinolitik (IK), aktivitas

enzim kitinase, waktu optimum produksi enzim dan pH optimum serta suhu

optimum enzim kitinase dari kedua isolat tersebut adalah sebagai berikut :

Tabel 1. Indeks kitinolitik isolat-isolat bakteri kitinolitik pada suhu 37oC

No Kode Isolat Asal IK(suhu 370C)

Waktu inkubasi

1 SSA2B4.1 Air Tambak udang Salenrang Bontoa Maros SulSel

4,0 2 hari

2 SSD2A7.1 Air Tambak udang Kec. Langnga Pinrang SulSel

6.7 6 hari

Isolat SSA2B4.1 memiliki IK sebesar 4,0 setelah diinkubasi selama

2 hari, sedangkan isolat SSD2A7.1 memiliki IK sebesar 6,7 setelah diunkubasi

selama 6 hari.

Setelah diperoleh data IK dari kedua isolat tersebut yang cukup tinggi,

maka dilakukanlah produksi enzim kitinase yang kemudian dievaluasi aktivitas

enzim kitinase yang terbaik pada fermentasi 2, 4 dan 6 hari. Berikut data hasil

pengujian aktivitas enzim (U/mL) dari kedua isolat tersebut.

13

Tabel 2. Aktivitas Enzim Kitinase (U/ml) Pada Suhu Produksi Enzim 37 oC

No Nama IsolatAktivitas enzim kitinase (U/mL) Kesimpulan

Waktu Optimum Produksi Enzim

1 SSD2A7.1 0,449 6 hari2 SSA2B4.1 0,451 2 hari

Isolat SSA2B4.1 memberikan aktivitas enzim kitinase terbesar pada

fermentasi selama 2 hari sedangkan isolat SSD2A7.1 memberikan aktivitas enzim

kitinase terbesar pada fermentasi selama 6 hari.

Setelah mengetahui aktivitas enzim kitinase dari isolat SSA2B4.1 dan

SSD2A7.1 dilakukan pengujian aktivitas enzim kitinase dengan suasana pH buffer

yang bervariasi pada nilai pH 2-12 dan pada rentang suhu 20oC-80oC dan diperoleh

hasil sebagi berikut :

Tabel 3. pH optimum dan suhu optimum enzim kitinase dari isolat SSA2B4.1 dan isolat SSD2A7.1

No

.

Kode isolat pH

Optimum

Suhu Optimum (oC)

1 SSA2B4.1 4-6 702 SSD2A7.1 6-8 70

Hasil pengujian terhadap adanya logam-logam dan senyawa pengkelat

logam terhadap aktivitas enzim memberikan hasil bahwa enzim kitinase dari kedua

isolat tersebut bukan termasuk metaloenzim. Hasil pengujian stabilitas enzim

terhadap senyawa denaturan menunjukkan enzim dari kedua isolat tersebut sangat

14

tahan terhadap senyawa denaturan. Selain itu dari hasil uji sifat termostabil dari

enzim kitinolitik yang berasal dari isolat SSD2A7.1 dan SSA2B4.1 pada suhu 70oC,

80oC dan 90oC diperoleh aktivitas enzim yang relatif stabil setelah mengalami

pemanasan selama 1-5 jam. Enzim kitinase dari isolat SSD2A7.1 memiliki

ketahanan panas selama 5 (lima) jam pada pemanasan 70oC, 80oC dan 90oC pada

pH 6,0; serta pemanasan 80oC pada pH 8,0. Sedangkan enzim kitinase dari isolat

SSA2B4.1 mampu tahan selama 5 jam pada suhu 70oC pH 6,0 dan 8,0.

Berdasarkan sifat kestabilan yang dimiliki mengindikasikan bahwa kitinase dari

isolat SSD2A7.1 adalah kitinase dengan sifat unik.

C. Identifikasi isolat bakteri

1. Pewarnaan Gram

Christian Gram adalah seorang ahli bakteriologi Denmark yang

menemukan suatu pewarnaan bertingkat, yang dinamakan pewarnaan Gram.

Pewarnaan Gram dilakukan untuk menentukan jenis Gram bakteri dan bentuk

bakteri yang diamati dengan menggunakan mikroskop. Dalam pewarnaan Gram

bakteri dibedakan menjadi 2 kelompok, yakni bakteri Gram positif dan Gram

negatif. Bakteri Gram positif berwarna ungu atau biru di bawah mikroskop yang

disebabkan kompleks warna kristal violet-iodium tetap dipertahankan meskipun

diberi larutan pemucat. Sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah atau

merah muda karena kompleks warna tersebut larut ketika diberikan larutan

pemucat dan kemudian mengambil zat warna kedua yang berwarna merah.

15

Tabel 4. Tahapan pewarnaan Gram

Zat warna Gram positif Gram negatif

Kristal violet Ungu Ungu

Larutan lugol Ungu Ungu

Larutan pemucat Ungu Tidak berwarna

Safranin Ungu Merah

Perbedaan hasil dalam pewarnaan tersebut disebabkan perbedaan struktur

dinding sel dan komposisi dinding sel dari kedua kelompok bakteri tersebut,

karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dengan

kelompok lainnya, pewarnaan Gram juga disebut pewarnaan diferensial

(Waluyo, 2008).

16

Gambar 6. Perbedaan dinding sel bakteri Gram negatif dan Gram positif (Anonimd, 2009).

2. Uji biokimia

Mikroorganisme tumbuh dan berkembangbiak dengan menggunakan

berbagai bahan yang terdapat di lingkungannya. Zat hara yang terdapat

di lingkungan sekelilingnya terdiri dari molekul sederhana seperti H2S dan NH4+,

atau molekul organik yang kompleks seperti protein dan polisakarida. Mikroba

mengoksidasikan zat hara ini untuk memperoleh energi dan senyawa pemula

untuk sintesis dinding sel, membran dan flagela.

Penggunaan zat hara tergantung aktivitas metabolisme mikroba.

Metabolisme seringkali menghasilkan hasil sampingan yang dapat digunakan

untuk identifikasi mikroorganisme. Untuk mengidentifikasi suatu mikrorganisme

dilakukan uji biokimia untuk mengetahui aktivitas metabolisme mikroorganisme.

Uji biokimia ini mencakup uji fermentasi karbohidrat, uji hidrolisis pati, uji

17

methyl red, uji Voges-Proskauer , uji oksidase, uji katalase, uji indol, uji sitrat, uji

pencairan gelatin, uji urease, uji hidrogen sulfida (H2S), uji selulase dan uji

protease. Pengamatan aktivitas metabolisme diketahui dari kemampuan

mikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang kompleks

seperti pati dan protein. Selain itu pengamatan juga dilakukan pada molekul yang

sederhana seperti sakarida. Hasil dari berbagai uji ini digunakan untuk pencirian

dan identifikasi mikroorganisme (Lay, 1994).

a. Uji fermentasi karbohidrat.

Kemampuan memfermentasikan berbagai karbohidrat dan produk

fermentasi yang dihasilkan merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi

mikroorganisme.

Hasil akhir fermentasi karbohidrat ditentukan oleh sifat mikroba, media

biakan yang digunakan serta faktor lingkungan, antara lain suhu dan pH. Media

fermentasi harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasikan dan

difermentasikan oleh mikroorganisme. Untuk menentukan adanya fermentasi

karbohidrat, di laboratorium digunakan media kaldu karbohidrat dan media

MR-VP (Methyl Red-Voges Proskauer). Kaldu karbohidrat yang digunakan

mengandung 0,5-1% karbohidrat. Karbohidrat yang sering dipakai adalah

glukosa, sukrosa, laktosa, manitol dan maltosa. Selain karbohidrat ke dalam media

18

ditambahkan juga ekstrak daging dan pepton sebagai sumber nitrogen, vitamin

dan mineral.

Bakteri yang ditumbuhkan dalam media biakan cair karbohidrat, akan

mengalami fermentasi dan menghasilkan asam. Asam yang dihasilkan akan

menurunkan pH media biakan. Untuk mendeteksi ada tidaknya penurunan pH

maka digunakan indikator. Indikator yang sering digunakan ialah merah fenol,

brom kresol ungu atau brom timol biru. Bila terjadi penurunan pH maka akan

terjadi perubahan warna menjadi warna kuning. Pada pH diatas 7 merah fenol

berwarna merah dan brom kresol ungu berwarna ungu sedangkan brom timol biru

berwarna biru.

Kaldu karbohidrat selain digunakan untuk uji pembentukan asam juga

digunakan untuk uji pembentukan gas. Pembentukan gas dapat ditentukan dengan

menggunakan tabung Smith atau tabung Durham. Tabung Smith digunakan bila

jumlah dan macam gas yang dihasilkan harus ditentukan, sedangkan tabung

Durham digunakan bila hanya ingin mengetahui ada tidaknya gas yang terbentuk

tanpa harus mengetahui jumlah gas yang terbentuk dan jenis gas yang terbentuk.

Bila terbentuk gas, maka gas akan masuk ke dalam tabung Durham dan mendesak

cairan dalam tabung Durham. Gas yang terbentuk terlihat sebagai gelembung

udara yang terperangkap dalam tabung Durham. Setelah diinkubasi diamati

perubahan warna dan pembentukan gas dalam tabung Durham. Hal ini dapat

menjadi tanda senyawa apa yang difermentasikan dan dapat menjadi dasar acuan

dalam identifikasi bakteri (Lay, 1994).

19

Berdasarkan hasil fermentasi karbohidrat bakteri dapat dikelompokkan

menjadi 5 kelompok yaitu :

1. Bakteri asam laktat (BAL) homofermentatif yang hanya mampu

menghasilkan asam laktat, dengan hasil uji berupa warna media berubah

menjadi warna kuning atau lebih kuning dari warna tabung kontrol dan

tidak terbentuk gas pada tabung Durham.

2. Bakteri asam laktat (BAL) heterofermentatif yang mampu menghasilkan

asam laktat, etil alkohol, serta gas CO2, dengan hasil uji berupa warna

media berubah menjadi warna kuning atau lebih kuning dari warna tabung

kontrol dan terbentuk gas pada tabung Durham.

3. Bakteri aseton, butil alkohol yang mampu menghasilkan aseton, butil

alkohol, asam butirat, isopropil alkohol, asam asetat, asam format serta gas

CO2 dan H2, dengan hasil uji berupa warna media tidak berubah dan

terbentuk gas dalam tabung Durham (Lay, 1994).

4. Bakteri coli-aerogeneses tifoid yang mampu menghasilkan 2,3 butana diol,

asam format, asam asetat, asam suksinat, etil alkohol serta gas CO2 dan H2,

dengan hasil uji berupa warna media berubah menjadi warna kuning atau

lebih kuning dari warna tabung kontrol dan terbentuk gas pada tabung

Durham, namun pada uji VP memberikan hasil uji positif dan uji MR

memberikan hasil uji yang bervariasi (tergantung genus dan spesies

bakteri).

20

5. Bakteri asam propionat yang mampu menghasilkan asam propionat, asam

asetat dan CO2, dengan hasil uji berupa warna media berubah menjadi

warna kuning atau lebih kuning dari warna tabung kontrol dan terbentuk

gas pada tabung Durham, namun pada uji MR memberikan hasil uji positif

dan uji VP memberikan hasil uji yang bervariasi (tergantung genus dan

spesies bakteri) (Pelczar et al., 1998).

b. Uji methyl red

Uji methyl red (MR) dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri dapat

membentuk asam campuran dan asam yang sedemikian banyaknya sehingga dapat

mengubah indikator metil merah menjadi merah. Beberapa jenis bakteri dapat

membentuk asam tetapi tidak cukup banyak untuk dapat mengubah warna

indikator. Bakteri seperti Escherichia coli dapat memberikan hasil pengujian

positif karena dapat menurunkan pH sampai di bawah 5,0. Sebaliknya Klebsiella

aerogenes mengadakan dekarboksilasi dan kondensasi asam piruvat untuk

membentuk asetilmetilkarbinol, sehingga pH meningkat, dan bila ditambahkan

metil merah warnanya menjadi kuning, yang berarti hasil pengujian negatif.

Pengujian seharusnya jangan dilakukan sebelum biakan berumur dua hari pada

suhu 37oC atau tiga hari pada suhu 30oC. Metil merah berwarna merah pada

lingkungan dengan pH 4,4 dan berwarna kuning dalam lingkungan dengan pH

6.2.

21

6,2 pH 6,2 kuning E. aerogenes 5,1 pH 5,1 kuning perubahan Kemerahan warna MR

E. coli 4,4 pH 4,4 merah

Gambar 7. Perubahan warna indikator MR pada bakteri Escherichia coli dan Klebsiella aerogenes.

Uji ini sangat berguna dalam membedakan beberapa kelompok bakteri

yang mampu memfermentasikan karbohidrat menjadi asam campuran, gas dan

menentukkan kisaran pH asam yang dihasilkan dari fermentasi karbohidrat dan

mengidentifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan

(Lay, 1994).

c. Uji Voges-Proskauer

Uji Voges-Proskauer digunakan untuk membedakan antara organisme

yang menghasilkan asam dalam jumlah yang besar dan yang menghasilkan

nonasidik atau produk netral seperti asetilmetilkarbinol (asetoin) dari hasil

metabolisme glukosa. Produk netral ini membuat bakteri dapat memfermentasi

karbohidrat dalam jumlah yang besar. Adanya kandungan asetoin yang diproduksi

dalam larutan ditandai dengan perubahan warna larutan dari kuning menjadi

merah muda hingga merah tua. Staphylococcus aureus dapat memproduksi

asetoin sebagai hasil fermentasi glukosa yang membedakannya dengan

Staphylococcus lainnya.

22

Uji ini juga digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang dapat

memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol sebagai produk utama, dan

akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Penambahan

40% KOH dan 5% larutan α-naftol dalam etanol dapat menentukan adanya

asetoin (asetilmetilkarbinol) yakni suatu senyawa awal dalam sintesis

2,3-butanadiol. Pada penambahan KOH, adanya asetoin ditunjukkan oleh

perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas

dengan penambahan larutan α-naphtol. Perubahan warna kaldu biakan lebih jelas

pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena sebagian 2,3-butanadiol

dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi.

Berdasarkan hal tersebut maka tabung yang berisi kaldu dikocok sehingga

berbuih, kemudian dibuka tutup tabungnya dan dimiringkan di atas meja.

Uji Voges-Proskauer merupakan uji tidak langsung untuk mengetahui

adanya 2,3-butanadiol karena dalam uji ini yang terdeteksi adalah pembentukan

asetoin. Namun karena asetoin merupakan senyawa awal dalam pembentukan

2,3-butanadiol dan selalu diperoleh secara serentak, sehingga uji Voges-Proskauer

dapat digunakan untuk menentukan adanya 2,3-butanadiol (Lay, 1994).

d. Uji katalase

Setiap bakteri mempunyai suatu enzim yang tergolong flavoprotein yang

dapat bereaksi dengan oksigen membentuk senyawa-senyawa beracun yaitu

23

hidrogen peroksida (H2O2) dan suatu radikal bebas yaitu superoksida

(O2-*) sebagai berikut :

Flavoprotein O2→

H2O2 + O2-*

Bakteri yang bersifat aerobik dan bersifat anaerobik aerotoleran

mempunyai enzim katalase yang dapat memecah H2O2 dan enzim superoksida

dismutase yang memecah radikal bebas tersebut.

2 O2-* + 2H+ superoksidadismutase

→ H2O2 + O2(g)

H2O2 katalase

→ H2O + ½ O2 (g)

Bakteri yang bersifat anaerobik fakultatif juga mempunyai enzim

superoksida dismutase, tetapi tidak mempunyai enzim katalase, melainkan

mempunyai enzim peroksidase yang mengatalisis reaksi antara H2O2 dengan

senyawa organik, menghasilkan senyawa yang tidak beracun. Reaksinya adalah

sebagai berikut :

H2O2 + senyawa organik peroksidase→ senyawa organik teroksidasi + H2O

Bakteri yang bersifat anaerobik obligat tidak mempunyai enzim

superoksida dismutase maupun katalase. Oleh karena itu, oksigen merupakan

racun bagi bakteri tersebut karena senyawa yang terbentuk dari reaksi flavoprotein

dengan oksigen yaitu H2O2 dan suatu radikal bebas yaitu O2-*. Jenis bakteri ini

akan memberikan hasil uji katalase negatif (Fardiaz, 1992).

24

Katalase adalah enzim yang mengatalisis penguraian hidrogen peroksida

(H2O2) menjadi H2O dan O2. Hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel

karena bahan ini dapat menginaktivasikan beberapa jenis enzim dalam sel.

Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga

mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob harus menguraikan bahan

toksik tersebut.

Katalase merupakan salah satu enzim yang digunakan mikroorganisme

untuk menguraikan hidrogen peroksida, enzim lainnya yang dapat menguraikan

hidrogen peroksida adalah peroksidase. Pada penguraian hidrogen peroksida oleh

peroksidase tidak dihasilkan gas atau gelembung oksigen. Penentuan adanya

katalase diuji dengan larutan 3% H2O2 pada koloni terpisah. Pada bakteri yang

bersifat katalase-positif terlihat pembentukan gelembung udara sekitar koloni.

Uji katalase berguna dalam identifikasi kelompok bakteri aerobik dan

anaerobik aerotoleran dengan bakteri anaerobik fakultatif. Pada bakteri bentuk

kokus, uji katalase digunakan untuk membedakan Staphylococcus dan

Streptococcus. Kelompok Streptococcus bersifat katalase-negatif, sedangkan

Staphylococcus bersifat katalase-positif.

e. Uji oksidase

Transport elektron sering disebut juga sistem rantai respirasi atau sistem

oksidasi terminal. Transport elektron berlangsung pada krista (membran dalam)

dalam mitokondria. Molekul yang berperan penting dalam reaksi ini adalah

25

NADH dan FADH2, yang dihasilkan dari siklus Krebs. Selain itu, molekul lain

yang juga berperan adalah molekul oksigen (O2), koenzim Q (Ubiquinone),

sitokrom b, sitokrom c, dan sitokrom a atau sitokrom oksidase.

Pertama-tama, NADH dan FADH2 mengalami oksidasi, dan elektron

berenergi tinggi yang berasal dari reaksi oksidasi ini ditransfer ke koenzim Q.

Energi yang dihasilkan ketika NADH dan FADH2 melepaskan elektronnya cukup

besar untuk menyatukan ADP dan fosfat anorganik menjadi ATP. Kemudian

koenzim Q dioksidasi oleh sitokrom b. Selain melepaskan elektron, koenzim Q

juga melepaskan 2 ion H+. Setelah itu sitokrom b dioksidasi oleh sitokrom c.

Energi yang dihasilkan dari proses oksidasi sitokrom b oleh sitokrom c juga

menghasilkan cukup energi untuk menyatukan ADP dan fosfat anorganik menjadi

ATP, kemudian sitokrom c mereduksi sitokrom a.

Pada keadaan aerobik atau pada mikroorganisme yang bersifat aerobik,

jenis sitokrom a yang dimiliki adalah sitokrom aa3 atau sitokrom oksidase. Pada

tahap selanjutnya sitokrom oskidase ini kemudian akan dioksidasi oleh sebuah

atom oksigen yang merupakan zat yang paling elektronegatif dalam rantai

tersebut, dan merupakan akseptor elektron terakhir.

26

Gambar 8. Transport elektron pada respirasi anaerob (kiri) dan Transport elektron pada respirasi aerob (kanan).

Setelah menerima elektron dari sitokrom oksidase, oksigen tersebut

kemudian bergabung dengan ion H+ yang dihasilkan dari oksidasi koenzim Q oleh

sitokrom b membentuk air (H2O). Oksidasi yang terakhir ini menghasilkan energi

yang cukup besar untuk dapat menyatukan ADP dan gugus fosfat anorganik

menjadi ATP. Jadi, secara keseluruhan ada tiga tempat pada Transport elektron

yang menghasilkan ATP (Jakubowski,. 2008).

Uji oksidase berfungsi untuk menentukan adanya sitokrom oksidase yang

dapat ditemukan pada mikroorganisme tertentu. Mikroorganisme aerobik dan

anaerobik fakultatif memiliki enzim sitokrom oksidase dan oksigen sebagai

akseptor elektronnya sehingga dalam uji ini akan memberikan hasil uji positif

27

yang ditunjukkan dengan perubahan warna koloni bakteri menjadi hitam dalam

waktu 30 menit setelah penambahan reagen uji. Perubahan warna ini disebabkan

sitokrom oksidase mengoksidasikan larytan reagen. Pada mikroorganisme

anaerobik obligat akan memberikan hasil uji negatif yang ditandai dengan tidak

terjadi peruabahn warna (Lay, 1994).

f. Uji reduksi nitrat

Dalam keadaan kekurangan oksigen atau pada mikroorganisme yang

bersifat anaerob dan tidak memiliki enzim sitokrom oksidase (sitokrom aa3), maka

mikroorganisme akan menggunakan molekul bukan oksigen sebagai akseptor

elektron terakhir. Nitrat (NO3-) digunakan oleh mikroorganisme tertentu sebagai

akseptor elektron terakhir dengan cara mereduksi nitrat menjadi nitrit (NO2-).

Beberapa mikroorganisme mereduksikan nitrit menjadi gas nitrogen (N2).

NO3- + 2e- + 2 H+ nitratase

→ NO2- + H2O

2NO2- + 7e- + 8 H+ nitratase

→ N2(g) + 4 H2O

Kemampuan mereduksi nitrat dapat digunakan sebagai ciri dalam

identifikasi bakteri Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa mampu

menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron terakhir. E. coli mereduksikan

nitrat menjadi nitrit sedangkan P. aeruginosa mampu mereduksikannnya lebih

lanjut menjadi N2. Sebaliknya Straphylococcus epidermis tidak dapat

menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron terakhir.

28

Uji nitrat dilakukan dengan menumbuhkan mikroorganisme dalam kaldu

nutrien yang mengandung 0,5 % KNO3 dan dilengkapi tabung Durham. Setelah

masa inkubasi, diamati pembentukan gas dalam tabung Durham dan keberadaan

nitrit dalam media biakan. Gas yang terperangkap dalam tabung Durham

merupakan campuran gas N2 dan CO2. Gas N2 berasal dari penguraian sempurna

nitrat sedangkan CO2 merupakan produk respirasi anaerobik. Keberadaan nitrit

dalam media dapat diuji dengan penambahan asam sulfanilat dan α-naftilamin

yang akan bereaksi dengan nitrit yang ditunjukkan dengan perubahan warna

media menjadi merah atau merah muda (Lay, 1994).

g. Uji indol

Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim

terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan

oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. Bakteri menguraikan triptofan

membentuk asam piruvat yang kemudian dapat digunakan sebagai sumber

energinya. Bakteri tertentu seperti Escherichia coli mampu menggunakan

triptofan sebagai sumber karbon.

29

Gambar 9. Hidrolisis triptofan dan uji indol (Lay, 1994).

Pembentukan indol dari triptofan oleh mikroorganisme dapat diketahui

dengan menumbuhkannya dalam media biakan yang kaya dengan triptofan

(Lay, 1994). Untuk uji ini biasanya dipakai kaldu tripton (1%) karena medium ini

mengandung banyak triptofan. Triptofan biasanya diberikan dalam bentuk tripton

yang merupakan suatu polipeptida yang kaya dengan residu triptofan (Lay,1992).

Medium untuk uji pembentukan indol dapat digunakan medium tripton cair atau

hidrolisat kasein. Penumpukan indol dalam media biakan dapat diketahui dengan

penambahan berbagai reagen yaitu reagen Gnezda, reagen Kovacs, reagen

Ehrlich, reagen Salkowski, dan reagen Coles dan Onslow. Masing-masing reagen

menunjukan hasil yang berbeda jika terbentuk indol. Untuk media biakan semi

30

padat, terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya senyawa yang tidak larut

dalam air dan berwarna merah pada permukaan medium, sedangkan untuk

medium tripton cair juga menghasilkan hasil uji positif terbentuknya indol yang

berbeda-beda, yakni tergantung pada jenis reagen yang digunakan. Pada pengujian

dengan reagen Gnezda, terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya kristal

asam oksalat yang berwarna merah muda. Pada pengujian dengan reagen Kovacs,

terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya warna merah pada lapisan

larutan reagen. Pada pengujian dengan reagen Erhlich, terbentuknya indol ditandai

dengan terbentuknya warna merah ungu dibawah lapisan eter. Pada pengujian

dengan reagen Salkowski, terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya warna

merah pada media, sedangkan Pada pengujian dengan reagen Coles dan Onslow,

terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya warna merah ungu pada kapas

penutup tabung reaksi (Waluyo, 2008).

Triptofan merupakan suatu asam amino dengan gugus indol. Bakteri

tertentu mampu menghasilkan enzim triptofanase yang mengkatalisis penguraian

gugus indol dari triptofan. Dalam media biakan, indol menumpuk sebagai bahan

buangan, sedangkan bagian lainnya dari molekul triptofan seperti asam piruvat

dapat digunakan sebagai sumber energi melalui siklus asam sitrat, sedangkan

amonium (NH4+) dapat digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara

mikroorganisme.

31

h. Uji hidrogen sulfida ( H2S)

Banyak protein kaya akan asam amino sistein dan metionin. Asam amino

ini dihasilkan saat protein dihidrolisiskan untuk memenuhi kebutuhan zat hara

mikroorganisme. Pembentukan asam sulfida (H2S) oleh mikroorganisme

menunjukan adanya penguraian asam amino yang mengandung sulfur.

Mikroorganisme yang tumbuh akan menghasilkan enzim desulfurase saat

dibiakkan dalam media yang kaya dengan asam amino yang mengandung H2S.

Fe2+ yang terdapat dalam media biakan bereaksi dengan H2S dan menghasilkan

senyawa FeS yang berwarna hitam dan tidak larut air.

Gambar 10. Penguraian sistein oleh enzim desulfurase (Lay, 1994).

Produksi H2S dapat terlihat dengan menggunakan media yang

mengandung polipeptida dan kaya asam amino yang mengandung sulfur dan ion

Fe2+. Dalam hal ini dapat digunakan media TSIA (Triple Sugar Iron Agar). Pada

media ini H2S akan bereaksi dengan Fe menjadi FeS yang berwarna hitam.

32

Jika medium yang digunakan adalah lead asetat agar maka H2S bereaksi dengan

Pb menjadi PbS yang berwarna hitam.

Media TSIA digunakan terutama untuk mengidentifikasi bakteri Gram

negatif. Media ini mengandung 3 macam gula yaitu glukosa, laktosa, sukrosa,

indikator merah fenol dan FeSO4 untuk memperlihatkan pembentukan H2S yang

ditunjukan dengan terbentunya endapan hitam. Konsentrasi glukosa adalah 1/10

dari konsentrasi laktosa atau sukrosa agar fermentasi glukosa saja yang dapat

terlihat. Reaksi dibaca setelah 24-48 jam (Lay, 1994).

i. Uji sitrat

Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme

menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini

digunakan medium Simmon’s citrate agar yang merupakan medium sintetik

dengan trinatrium sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, amonium (NH4+)

sebagai sumber nitrogen dan brom timol biru sebagai indikator pH. Bila

mikroorganisme mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari

medium biakan, sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna

medium dari hijau menjadi biru. Perubahan warna dari hijau menjadi biru

menunjukkan bahwa mikroorganisme mampu menggunakan sitrat sebagai satu-

satunya sumber karbon, sedangkan pada medium sitrat koser kemampuan

menggunakan sitrat ditunjukkan oleh kekeruhan yang menandakan adanya

pertumbuhan mikroba.

33

Na+ + H2PO4- → NaH2PO4

natrium dihidrogen fosfat

Gambar 11. Penggunaan sitrat oleh bakteri.

Penanaman dalam medium Simmon’s citrate agar (SCA) dimaksudkan

untuk mengetahui apakah senyawa sitrat dapat dipakai sebagai satu-satunya

sumber karbon bagi mikorganisme. Dalam medium ini digunakan trinatrium sitrat

sebagai sumber karbon. Bila trinatrium sitrat ini dapat diuraikan maka amonium

dihidrogenfosfat turut teruraikan dan akan melepaskan NH4+ sehingga

menyebabkan medium menjadi alkalis, dan indikator brom timol biru berubah

dari hijau menjadi biru (Gupte, 1990).

j. Uji pencairan gelatin

Gelatin adalah protein yang diperoleh ketika proses merebus tulang rawan

atau jaringan ikat hewan lainnya. Protein ini bila didinginkan membentuk gel.

Beberapa mikroorganisme tertentu mampu menghasilkan enzim gelatinase yang

dapat menguraikan molekul gelatin menjadi peptida-peptida kecil penyusun

gelatin tersebut, sehingga peptida-peptida yang dihasilkan dari proses penguraian

34

tersebut dapat digunakan sebagai zat hara. Hidrolisis gelatin oleh mikroorganisme

dikatalisasikan oleh enzim gelatinase. Gelatin yang telah dicerna oleh mikroba

tidak dapat membentuk gel dan akan berwujud cair.

Gelatingelatinase→ peptida-peptida kecil

Kemampuan untuk mencernakan gelatin dapat digunakan dalam pencirian

mikroorganisme, contohnya Serratia marcescens yang dapat mencairkan gelatin

dapat dibedakan dari Klebsiella pneumonia atau Escherichia coli yang tidak dapat

mencairkan gelatin. Hidrolisis gelatin dapat pula digunakan untuk mengetahui

sifat patogen galur mikroorganisme karena seringkali dikaitkan dengan produksi

enzim untuk menguraikan bahan pengikat jaringan untuk memudahkan

penyebaran organisme.

Uji gelatin di laboratorium digunakan dengan cara menusukkan

mikroorganisme yang diuji ke dalam media semi padat yang mengandung kaldu

nutrien dan gelatin. Media ini diinkubasi dan diamati kemampuan

mikroorganisme mencairkan gelatin. Pada suhu 35oC gelatin dapat mencair bila

diinokulasi dengan mikroorganisme yang mampu mencairkan gelatin. Gelatin

yang mencair setelah masa inkubasi, dimasukkan dalam lemari es selama 30

menit untuk mengetahui kemampuan mikrorganisme mencairkan gelatin. Bila

mikroorganisme mampu mencerna gelatin, maka media semi padat gelatin tetap

berwujud cair setelah dikeluarkan dari lemari es, namun jika media semi padat

35

gelatin membeku kembali setelah dikeluarkan dari lemari es maka di inkubasi

selama 1 minggu pada suhu yang sama.

k. Uji hidrolisis pati

Pati tersusun dari unit–unit glukosa yang dihubungkan oleh ikatan

1,4–α–glikosida, walaupun rantai ini mempunyai banyak percabangan karena

adanya ikatan 1,6–α–glikosida. Polimer pati terdiri atas 2 jenis yaitu amilosa dan

amilopektin.

Amilosa terdapat dalam pati sekitar 20% dan terdiri atas unit glukosa yang

berkisar 50-300 unit yang membentuk rantai lurus yang berikatan pada atom

karbon nomor 1 dan nomor 4 atau disebut ikatan 1,4 (Gambar 12.a). Dalam

larutan, rantai ini membentuk heliks (spiral) karena adanya ikatan dengan

konfigurasi α pada setiap unit glukosa. Bentuk ini terdiri dari enam unit glukosa

perputaran heliks, yang menyebabkan amilosa membentuk kompleks dengan

bermacam-macam molekul kecil yang dapat masuk ke dalam kumparannya.

Warna biru tua atau biru kehitaman yang diberikan pada penambahan iod pada

pati adalah contoh pembentukan kompleks tersebut. Sedangkan amilopektin

memiliki struktur yang bercabang. Sekalipun setiap molekul dapat mempunyai

300-500 unit glukosa, rantai dengan ikatan 1,4 hanya terdapat rata-rata sepanjang

25-30 unit glukosa. Rantai demikian mempunyai percabangan melalui ikatan 1,6

(Gambar 12.b). Karena strukturnya yang banyak bercabang sehingga pati dapat

mengembang dan membentuk koloid dalam air (Hart, 1983).

36

nO

OO

O O

OO

OHOH

CH2OHCH2OH

OH

OHOH

OH

CH2OHCH2OH

OH

OH

α – 1,4 - glikosidik

n

α – 1,4 - glikosidik

α – 1,6 - glikosidik

O

OO

O O

OO

OH

OH

CH2CH2OH

OH

OH

OHOH

CH2OHCH2OH

OH

OH

O

OO

O

OH

OH

CH2OHCH2OH

OH

OH

Gambar 12.a. Struktur molekul amilosa

Gambar 12.b. Struktur molekul amilopektin

Enzim -amilase (EC.3.2.1.1, -1,4-D-glukan glukanohidrolase,

endoamilase) merupakan enzim yang menghidrolisis ikatan -1,4-glikosidik dari

pati dan maltodekstrin secara acak pada bagian dalam molekul polisakarida

(Ballschmiter et al., 2006). Terdapat tiga jenis enzim amilolitik yaitu -amilase,

β-amilase, dan glukoamilase. Pada hidrolisis pati, enzim yang berperan adalah

-amilase yang bekerja memutuskan ikatan dengan konfigurasi α pada pati.

Hidrolisis pati oleh enzim -amilase terbagi dalam dua jalur, yaitu hidrolisis

amilosa dan hidrolisis amilopektin.

37

Menurut Suhartono (1989) hidrolisis amilosa oleh -amilase terjadi

melalui dua tahap. Tahap pertama adalah penguraian amilosa menjadi maltosa dan

maltotriosa yang terjadi secara acak. Penguraian ini terjadi secara cepat yang

diikuti dengan menurunnya viskositas dengan cepat. Tahapan kedua berlangsung

relatif lambat, dengan pembentukan glukosa dan maltosa sebagai hasil akhir.

Tahap I : amilosa −amilase→ maltosa + maltotriosa

Gambar 13.a. Penguraian amilosa menjadi maltosa dan maltotriosa

Tahap II : maltotriosa −amilase→ maltosa + glukosa

maltosa −amilase→ glukosa + glukosa

Gambar 13.b. Pembentukkan glukosa dan maltosa dari maltosa dan maltotriosa

38

Hidrolisis amilopektin oleh -amilase menghasilkan glukosa, maltosa dan

berbagai jenis -limit dekstrin yang merupakan oligosakarida yang terdiri dari

empat atau lebih residu gula yang mengandung ikatan -1,6 glikosidik.

Amilopektin−amilase→

glukosa + maltosa + oligosakarida (gula > 4, ikatan -1,6

glikosidik)

Gambar 14. Hidrolisis amilopektin oleh -amilase.

Hasil hidrolisis pati oleh enzim -amilase yang berasal dari bakteri yang

berbeda akan menghasilkan produk akhir yang berbeda pula. Bakteri jenis

Bacillus amyloliquefaciens dan Bacillus subtilis menghasilkan produk akhir

berupa maltosa, glukosa dan maltooligosakarida. Bacillus licheniformis

menghasilkan maltosa, maltotriosa dan maltopentosa. Streptomyces hygroscopicus

dan Thermoactinomyces vulgaris menghasilkan maltosa. Acinetobacter sp

menghasilkan maltosa dan maltotriosa (Suhartono, 1989).

39

Daerah kerja enzim -amilase pada amilosa dan amilopektin yang terdapat

pada pati dapat dilihat pada Gambar berikut :

Gambar 15. Daerah kerja enzim -amilase pada amilosa dan amilopektin (Suhartono, 1989).

Pada uji hidrolisis pati, mikroorganisme ditumbuhkan pada media yang

mengandung nutrien dan pati. Mikroorganisme yang mampu membentuk amilase

dalam media yang mengandung zat pati, akan menghidrolisis pati yang ada pada

medium uji sehingga terbentuk zona bening di sekitar daerah pertumbuhan

mikroorganisme dan diberi beberapa tetes iodium, bila medium masih

mengandung pati maka akan tampak warna biru kehitaman di sekitar

pertumbuhan bakteri, namun bila pati terhidrolisis, maka daerah-daerah yang tidak

mengandung pati lagi akan tampak jernih (Lay, 1994).

l. Uji selulase

Selulosa adalah polimer tak bercabang dari glukosa yang dihubungkan

melalui ikatan 1,4-β glikosida. Molekul lurus dengan unit glukosa rata-rata

sebanyak 5000 ini beragregasi membentuk fibril yang terikat melalui ikatan

Amilosa Amilopektin

40

hidrogen di antara gugus hidroksil pada rantai di sebelahnya. Serat selulosa yang

mempunyai kekuatan fisik yang tinggi terbentuk dari fibril-fibril ini tergulung

seperti spiral dengan arah-arah yang berlawanan menurut satu sumbu

(Hart, 1983).

Gambar 16. Struktur selulosa (Murray et al., 2003).

Enzim selulase merupakan enzim inducible, yaitu enzim yang dihasilkan

sebagai respon terhadap jenis makanan yang terdapat di dalam lingkungan

pertumbuhan organisme penghasilnya. Enzim ini merupakan suatu kompleks

enzim yang bekerja bersama-sama atau bertahap dalam menguraikan selulosa

menjadi unit glukosa (Kim et al., 1995).

Kompleks enzim selulase mempunyai tiga komponen utama yang bekerja

bersama-sama atau bertahap dalam menguraikan selulosa menjadi unit glukosa,

yaitu :

1. Endo-selulase yang memotong ikatan bagian dalam struktur kristal dari

selulosa dan mengeluarkan unit selulosa dari rantai polisakarida.

2. Ekso-selulase yang memotong 2-4 unit selulosa dari rantai akhir hasil

produksi endo-selulase dan menghasilkan tetrasakarida atau disakarida seperti

selobiosa.

41

3. Selobiose atau β-glukosidase yang menghidrolisis produk dari ekso-selulase

menjadi monosakarida.

Gambar 17. Mekanisme kerja enzim selulase.

Tiga jenis reaksi yang dikatalisis oleh selulase : 1). Memotong interaksi

nonkovalen dalam bentuk ikatan hidrogen yang ada dalam struktur kristal selulosa

oleh enzim endo-selulase, 2). Hidrolisis serat selulosa menjadi sakarida yang lebih

sederhana oleh ekso-selulase, 3). Hidrolisis disakarida dan tetrasakarida menjadi

glukosa oleh enzim β-glukosidase (Anonimc. 2009).

Uji selulase bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba yang dapat

mencerna selulosa menjadi sakarida yang lebih sederhana seperti khamir jenis

Cryptococcus sp, beberapa golongan fungi yaitu Trichoderma, Penicillium,

Aspergillus dan Sporotrichium ((Mandels et al., (1985); Hoffman et al., (1985);

Brown et al., (1987); Lakshmikant et al., (1990); Erikkson et al., (1983) dalam

Immanuel et al., (2007)) dan beberapa golongan bakteri yaitu Pseudomonas,

42

Cellulomonas, Bacillus, Micrococcus, Cellovibrio dan Sporosphytophaga

((Nakamura et al., (1982); Immanuel et al., (2006) dalam Immanuel et al.,

(2007)). Uji positif ditandai dengan tumbuhnya mikroba pada media luria agar

(LA) yang mengandung karboksimetilselulosa dan membentuk zona bening di

sekitar daerah inokulasi mikroba pada media (Lay, 1994).

m. Uji protease

Bakteri proteolitik adalah bakteri yang mampu menghasilkan enzim

proteinase ekstraseluler, yaitu enzim pemecah protein yang diproduksi di dalam

sel kemudian dilepaskan keluar dari sel. Semua bakteri mempunyai enzim

protease di dalam sel, tetapi tidak semua bakteri mempunyai enzim protease

ekstraseluler. Bakteri proteolitik dapat digolongkan menjadi beberapa kelompok

yaitu :

1. Bakteri aerobik atau anaerobik, tidak membentuk spora, misalnya

Pseudomonas dan Proteus.

2. Bakteri aerobik atau anaerobik, membentuk spora, misalnya Bacillus.

3. Bakteri anaerobik pembentuk spora, misalnya sebagian spesies

Clostridium (Fardiaz, 1992).

Protease ekstraseluler lebih dikenal dengan nama enzim proteolitik atau

protease yang merupakan enzim yang dapat menghidrolisis protein menjadi

senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti peptida-peptida kecil dan asam

amino. Oleh karena yang dipecah adalah rantai peptida, maka enzim tersebut

43

dinamakan juga peptidase. Berdasarkan cara pemotongan ikatan peptida, enzim

peptidase dapat dibagi menjadi eksopeptidase dan endopeptidase (Mubarik et al.,

2000).

Eksopeptidase bekerja pada kedua ujung molekul protein, yang terdiri dari

dua jenis enzim yaitu karboksipeptidase dan amino peptidase (Naiola et al.,

(2007). Karboksipeptidase dapat melepaskan asam amino yang memiliki gugus

–COOH bebas pada ujung molekul protein sedangkan amino peptidase dapat

melepaskan asam amino pada ujung lainnya yang memiliki gugus –NH2 bebas.

Gambar 18. Hidrolisis protein oleh enzim eksopeptidase (Poedjiadi, 1994).

Sedangkan enzim endopeptidase memecah protein pada tempat-tempat

tertentu dalam molekul protein dan biasanya tidak mempengaruhi gugus yang

terletak di ujung molekul protein. Endopeptidase bekerja spesifik memutuskan

ikatan peptida pada asam amino tertentu dalam molekul protein, seperti :

1. Tripsin memutuskan ikatan peptida setelah asam amino arginin dan lisin

dan bekerja optimum pada pH 8.

2. Kimotripsin memutuskan ikatan peptida setelah asam amino fenilalanin,

triptofan, tirosin dan bekerja lambat pemutusan ikatan peptida setelah

asam amino asparagin, histidin, metionin dan lesin. Bekerja optimum pada

pH 8.

44

3. Elastase memotong setelah asam amino alanin, glisin, serin dan valin.

4. Thermolisin memotong sebelum asam amino isoleusin, metionin,

fenilalanin, triptofan, tirosin dan valin, selain itu juga dapat memotong

setelah asam amino alanin, aspartan, histidin dan treonin.

5. Pepsin memotong sebelum asam amino leusin, fenilalanin, triptofan, dan

tirosin. Bekerja optimum pada pH 2.

6. Endopeptidase V8 memotong setelah asam glutamat dan bekerja optimum

pada pH 8 (Anonima, 2009).

Uji protease bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba yang dapat

menghasilkan enzim protease atau mikroba yang dapat menghidrolisis protein

menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti peptida-peptida kecil dan

dari peptida-peptida kecil menjadi asam amino, seperti bakteri golongan

Actinomycetes, Bacillus, Pseudomonas, Clostridium dan Proteus serta jamur jenis

Phanerochaete chrysosporium (Akhdiya, 2003; Anonima, 2009; Martina et al.,

2003). Uji positif ditandai dengan tumbuhnya mikroba pada media luria agar (LA)

yang mengandung susu skim dan membentuk zona bening di sekitar daerah

inokulasi mikroba pada media (Akhdiya, 2003).

n. Uji urease

Urease merupakan salah satu bentuk enzim yang berperan dalam proses

perkecambahan. Enzim urease memiliki substrat spesifik yaitu urea. Enzim ini

dapat mengkatalis reaksi pemecahan urea yang bersifat patogen dalam sel

45

tumbuhan menjadi amonia dan CO2. Urease ditemukan terutama dalam kuantitas

besar pada jackbean dan kedelai juga terdapat pada beberapa jaringan hewan dan

pencernaan mikroorganisme. Urease ditemukan pada berbagai macam organisme

seperti bakteri, jamur dan tumbuhan tingkat tinggi. Urease pada lingkungan

berperan dalam jalur sistem transportasi nitrogen.

(NH2)2CO urease

→

H 2O CO2 + 2NH3

Reaksi enzimatis yang melibatkan enzim urease tergolong ke dalam reaksi

hidrolisa dimana aktivitasnya dipengaruhi oleh adanya air.

Uji urease atau uji hidrolisis urea digunakan untuk mengidentifikasi

kelompok Proteus dari patogen-patogen gram negatif lainnya. Salah satu ciri

khas Proteus ialah kemampuannya menghasilkan enzim urease yang dapat

melepaskan amoniak dari molekul urea. Ciri ini tidak dimiliki oleh bakteri lain

yang mungkin dikelirukan dengan Proteus.

Medium yang digunakan dalam uji ini adalah kaldu urea yang merupakan

larutan ekstrak khamir dan urea yang diberi larutan penyangga. Medium tersebut

juga mengandung merah fenol sebagai indikator pH. Bila mikroba yang

diidentifikasi menghasilkan urease, maka amonia yang dilepaskan ke dalam

medium akan menaikan pH. Bila pH menjadi makin tinggi maka merah fenol

akan berubah warna dari kuning menjadi merah keunguan (Hadioetomo, 1985).

46

F. Impelementasi pada bidang pendidikan

Materi pelajaran kimia kini telah mulai diajarkan pada peserta didik sejak

di Sekolah Menengah Pertama (SMP), namun belum diajarkan dalam bentuk

suatu mata pelajaran tersendiri, tetapi masih digabungkan dengan mata pelajaran

Ilmu Pengetahuan Alam (IPA) lainnya seperti fisika dan biologi yang dikenal

dengan mata pelajaran Sains atau IPA terpadu. Mata pelajaran kimia mulai

diajarkan dalam bentuk suatu mata pelajaran tersendiri pada peserta didik di

bangku Sekolah Menengah Atas (SMA).

Pusat Kurikulum BALITBANG DEPDIKNAS (2007) mendefinisikan IPA

sebagai “pengetahuan yang sistematis dan tersusun secara teratur, berlaku umum

(universal), dan berupa kumpulan data hasil observasi dan eksperimen”. Merujuk

pada pengertian IPA tersebut, maka dapat disimpulkan bahwa hakikat IPA

meliputi empat unsur utama yaitu:

1. Sikap: rasa ingin tahu tentang benda, fenomena alam, makhluk hidup, serta

hubungan sebab akibat yang menimbulkan masalah baru yang dapat

dipecahkan melalui prosedur yang benar; IPA bersifat open ended;

2. Proses: prosedur pemecahan masalah melalui metode ilmiah; metode ilmiah

meliputi penyusunan hipotesis, perancangan eksperimen atau percobaan,

evaluasi, pengukuran, dan penarikan kesimpulan;

3. Produk: berupa fakta, prinsip, teori, dan hukum;

4. Aplikasi: penerapan metode ilmiah dan konsep IPA dalam kehidupan sehari-

hari.

47

Keempat unsur itu merupakan ciri IPA yang utuh yang sebenarnya tidak

dapat dipisahkan satu sama lain. Dalam proses pembelajaran IPA keempat unsur

itu diharapkan dapat muncul, sehingga peserta didik dapat mengalami proses

pembelajaran secara utuh, memahami fenomena alam melalui kegiatan

pemecahan masalah, metode ilmiah, dan meniru cara ilmuwan bekerja dalam

menemukan fakta baru.

Kimia merupakan ilmu yang termasuk rumpun IPA, oleh karenanya kimia

mempunyai karakteristik sama dengan IPA. Karakeristik tersebut adalah objek

ilmu kimia, cara memperoleh dan kegunaannya. Kimia adalah ilmu yang mencari

jawaban atas pertanyaan apa, mengapa, dan bagaimana gejala-gejala alam yang

berkaitan dengan komposisi, struktur dan sifat, perubahan, dinamika, dan

energetika zat. Oleh Sebab itu mata pelajaran kimia mempelajari segala sesuatu

tentang zat yang meliputi komposisi, struktur dan sifat, perubahan, dinamika dan

energetika zat yang melibatkan keterampilan dan penalaran. Ada dua hal yang

berkaitan dengan kimia yang tidak terpisahkan, yaitu kimia sebagai produk

(pengetahuan kimia yang berupa fakta, konsep, prinsip, hukum dan teori) temuan

ilmuan dan kimia sebagai proses (kerja ilmiah). Oleh sebab itu, pembelajaran

kimia dan penilaian hasil belajar kimia harus memperhatikan karakteristik ilmu

kimia dan penilaian hasil belajar kimia harus memperhatikan karakteristik ilmu

kimia sebagai proses dan produk

Mata pelajaran Kimia perlu diajarkan untuk tujuan yang lebih khusus yaitu

membekali peserta didik pengetahuan, pemahaman dan sejumlah kemampuan

48

yang dipersyaratkan untuk memasuki jenjang pendidikan yang lebih tinggi serta

pengembangan ilmu pengetahuan dan teknologi. Tujuan mata pelajaran Kimia

dicapai oleh peserta didik melalui berbagai pendekatan, antara lain pendekatan

induktif dalam bentuk proses inkuiri ilmiah pada tataran inkuiri terbuka. Proses

inkuiri ilmiah bertujuan menumbuhkan kemampuan berfikir, bekerja dan bersikap

ilmiah serta berkomunikasi sebagai salah satu aspek penting kecakapan hidup.

Oleh karena itu pembelajaran kimia menekankan pada pemberian pengalaman

belajar secara langsung melalui penggunaan dan pengembangan keterampilan

proses dan sikap ilmiah.

Salah satu cara pemberian pengalaman belajar secara langsung melalui

penggunaan dan pengembangan keterampilan proses dan sikap ilmiah yang dapat

dilakukan oleh guru dalam proses pembelajaran IPA terpadu atau Sains untuk

jenjang pendidikan SMP maupun mata pelajaran kimia untuk jenjang pendidikan

SMA adalah dengan mengadakan praktikum yang berhubungan dengan materi

pelajaran yang diajarkan.

Guru dapat memperkaya khasanah pengetahuan dalam pembelajaran IPA

terpadu atau Sains di SMP maupun mata pelajaran kimia di SMA, salah satunya

melalui hasil-hasil penelitian yang berhubungan dengan materi pelajaran yang

akan diajarkan, misalnya hasil penelitian karakterisasi sifat biokimia hasil

penapisan isolat bakteri kitinolitik yang dapat diimplementasikan pada beberapa

49

materi pembelajaran IPA terpadu atau Sains di SMP dan mata pelajaran kimia

di SMA.

Deskripsi implementasi hasil penelitian karakterisasi sifat biokimia hasil

penapisan isolat bakteri kitinolitik, pada bidang pendidikan dapat disajikan pada

Tabel 5 berikut.

No. Jenjang Pendidikan

Mata Pelajaran

Materi Pembelajaran

Kelas/ Semester

Alokasi Waktu

1. SMP IPA Terpadu (sains)

1.Asam dan Basa VII/1 4 x 40 Menit(2 Kali Pertemuan)

2. SMA Kimia 2.Katalis

3.Reaksi Redoks

4.Asam dan Basa

5.Karbohidrat

6.Protein

XI/1

X/2

XII/1

XI/2

XII/2

XII/2

2 x 45 Menit(1 Kali Pertemuan)

10 x 45 Menit(5 Kali Pertemuan)

4 x 45 Menit(2 Kali Pertemuan)

8 x 45 Menit(4 Kali Pertemuan)

2 x 45 Menit(1 Kali Pertemuan)

2 x 45 Menit(1 Kali Pertemuan)

50