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Version 1 Last updated 12 mayo 2017

ab213327anti-Zika virus IgM μ-capture ELISA kit

Instrucciones de uso:Para la detección cuantitativa de anticuerpos IgM contra el virus Zika en plasma o suero humano (citrato, heparina).

Este producto es sólo para investigación y no está diseñado para diagnóstico.


Tabla de contenidos:

1. Antecedentes 1

2. Descripción Del Ensayo 2

3. Precauciones 3

4. Conservación Y Estabilidad 3

5. Limitaciones 4

6. Reactivos Incluidos 5

7. Componentes Requeridos, No Incluidos 5

8. Consejos Técnicos 6

9. Preparación De Reactivos 7

10. Toma De Muestras Y Conservación 9

11. Procedimiento Del Ensayo 10

12. Cálculos 12

13. Valores Típicos De Las Muestras 14

14. Procedimiento Rápido Del Ensayo 16

15. Resolución De Problemas 17

16. Interferencias 19

17. Notes 21

ab213327 anti-Zika virus IgM μ-capture ELISA Kit 1

1. Antecedentes

El kit de Abcam Anti-Zika Virus IgM μ-capture in vitro Human ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) kit (ab213327) está diseñado para la determinación cuantitativa de anticuerpos de clase IgM frente al virus Zika en muestras de suero y plasma humano (citrato, heparina).El kit incluye una placa de 96 pocillos que han sido recubiertos con anticuerpos anti-Human de clase IgM que se unen a los anticuerpos presentes en la muestra. Tras los lavados de los pocillos para descartar la muestra que no se ha unido específicamente, se añade el antígeno de virus Zika conjugado a HRP (horseradish peroxidase). El antígeno conjugado se une a los anticuerpos IgM capturados específicamente. En un segundo paso de lavado se elimina el conjugado que no se ha unido. El complejo inmunológico formado por el conjugado unido se visualiza añadiendo el substrato Tetramethylbenzidina (TMB) que da lugar a un producto azul. Finalmente, se añade ácido sulfúrico para parar la reacción, lo que da lugar a un color final amarillo. Usando un lector de placas de pocillo ELISA se mide la absorbancia a 450/620 nm.

La intensidad de este producto es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos IgM en la muestra.El virus Zika (ZIKV) es un virus un virus monocatenario de ARN de la familia Flaviviridae (género Flavivirus). Se aisló por primera vez en 1947 de un macaco Rhesus durante un estudio de fiebre amarilla en los bosques Zika de Uganda.


2. Descripción Del Ensayo

Prepare todos los reactivos, muestras, controles y estándares.

Añada las muestras, estándares y controles a los pocillos.

Añada el conjugado marcado con HRP a cada pocillo. Incube a 37ºC.

Después del lavado, añada substrato TMB a cada pocillo.Incube a temperatura ambiente. Añada la Stop Solution a cada

pocillo. Mida la absorbancia inmediatamente.


3. Precauciones

Por favor lea estas instrucciones antes de comenzar el ensayo. Todos los componentes del kit han sido formulados y testados para

funcionar como un kit. Entendemos que ocasionalmente los protocolos han de ser

modificados para adaptarlos a circunstancias experimentales especiales. Sin embargo, no podemos garantizar que el producto vaya a funcionar fuera de las condiciones que se detallan en este protocolo.

Los reactivos tienen que ser tratados como mutágenicos y deben ser manejados con precaución y desechados apropiadamente. Por favor revise con atención la ficha de seguridad (Safety Datasheet: SDS) que se adjunta con el producto para obtener más información sobre los componentes específicos.

Siga buenas prácticas de laboratorio. Use siempre guantes, bata de laboratorio y gafas de protección. No pipetee nunca con la boca. No coma, beba o fume dentro del área de laboratorio.

Todos los materiales biológicos deben ser considerados como potencialmente peligrosos y ser tratados como tal. Deben ser desechados de acuerdo con los procedimientos locales de seguridad establecidos.

4. Conservación Y Estabilidad

Guarde el kit a 4°C inmediatamente después de recibirlo.Por favor, consulte la lista de materiales incluidos para ver las condiciones de almacenamiento de cada componente. La información sobre la conservación de cada componente del kit se encuentra en la sección de “Reactivos Incluidos”. Alicuotee los componentes en volúmenes de trabajo adecuados antes de almacenarlos a la temperatura indicada.


5. Limitaciones

Este kit de ELISA está diseñado para investigación, no para su utilización en ensayos diagnósticos.

Todos los componentes de origen humano utilizados para la producción de estos reactivos han sido testados para la detección de anticuerpos anti-HIV, anti-HCV y anti HBsAg siendo negativos. Sin embargo, todos los componentes deben tratarse y manipularse como potencialmente infecciosos.

Utilice solamente pipetas y material limpio. No intercambie los tapones de los reactivos para evitar

contaminación cruzada. Cierre los viales de reactivos inmediatamente después de su uso

para evitar evaporación y contaminación microbiológica. Revise los viales de conjugado y controles después de abrirlos por

primera vez y sucesivas veces para descartar contaminación microbiológica.

Para evitar contaminación cruzada y falsos positivos, pipetee las muestras y el conjugado cuidadosamente en el fondo del pocillo sin salpicaduras.

Contaminación bacteriológica o ciclos de congelado y descongelado de la muestra puede afectar los valores de absorbancia.


6. Reactivos Incluidos

Componente CantidadConservación (antes de la preparación)

Conservación (después de la preparación)

Anti-Human IgM coated Microplate (12 x 8 wells) 96 pocillos 4⁰C 4⁰C

IgM Sample Diluent 100 mL 4⁰C 4⁰CStop Solution 15 mL 4⁰C 4⁰C20X Wash Buffer Concentrate 50 mL 4⁰C 4⁰C

Zika Virus Conjugate 15 mL 4⁰C 4⁰CTMB Substrate Solution 15 mL 4⁰C 4⁰CZika Virus IgM Positive Control 2 mL 4⁰C 4⁰C

Zika Virus IgM Cut-off Control 3 mL 4⁰C 4⁰C

Zika Virus IgM Negative Control 2 mL 4⁰C 4⁰C

Papel de cobertura 1 Unidad 4⁰C 4⁰C

7. Componentes Requeridos, No Incluidos

Estos componentes no están incluidos en el kit pero son necesarios para realizar el ensayo: Lector de microplacas capaz de medir absorbancias a 450 nm/

620 nm. Incubador de 37°C Pipetas de un canal y multicanal para volúmenes de entre 10 µL y

1000 µL Opcional: Lavador de placas automático Vortex Agua desionizada (MilliQ) o agua destilada reciente (ddH2O) Tubos desechables


8. Consejos Técnicos

Evite la formación de burbujas al mezclar o reconstituir los reactivos.

Evite la contaminación cruzada de muestras y reactivos cambiando las puntas entre la adición de las muestras, los estándares y los reactivos.

Asegúrese de que las placas están bien selladas o cubiertas durante las incubaciones.

La retirada completa de las soluciones durante los lavados es necesaria para obtener lecturas precisas.

La adición de la solución de substrato TMB inicia una reacción quinética que finaliza cuando se añade la Stop Solution. Por lo tanto, las soluciones de substrato TMB y Stop deben ser añadidas en la misma secuencia para evitar variaciones de tiempo.

Es importante que el tiempo de incubación en cada pocillo sea constante para obtener resultados reproducibles. El pipeteo de las muestras no debe ser extendido a más de diez minutos para evitar variaciones de incubación. Si se necesitan más de diez minutos, siga el mismo orden de pipeteo. Si se utiliza más de una placa, se recomienda repetir la curva de respuesta a dosis en cada una.

La eliminación incompleta del líquido de los pocillos puede influenciar la precisión del ensayo y/o incrementar el ruido de fondo.

El formato de este kit se basa en el número de ensayos. Un ensayo se refiere a un solo pocillo. El número de pocillos que contienen la muestra, los controles y los estándares puede variar dependiendo del ensayo. Se recomienda revisar el protocolo de forma completa para confirmar que este kit se adapta a sus necesidades. Por favor, contacte con nuestro servicio de Soporte Técnico si necesita cualquier información adicional.


9. Preparación De Reactivos

Centrifugue de manera breve los viales pequeños a baja velocidad antes de abrirlos.

9.1 Placa de pocillos Zika Virus IgM:La placa consiste en tiras de pocillos que se pueden separar las unas de otras y se pueden usar directamente. Estos pocillos están recubiertos con anticuerpos anti-Human de clase IgM. Inmediatamente después de separar las tiras que se vayan a utilizar, el resto de tiras debe ser resellado con el papel de aluminio junto al desecante que se provee y almacenado a 4°C.

9.2 IgM Sample Diluent:Una botella con 100 mL de tampón de fosfato (10 mM) para diluir las muestras; pH 7.2 ± 0.2; de color verde; para su uso directo y almacenado a 4°C.

9.3 Stop Solution:Una botella con 15 mL de ácido sulfúrico, 0.2 ml/L; para su uso directo y almacenado a 4⁰C.

9.4 20X Wash Buffer Concentrate:Una botella con 50 mL de un concentrado (20x) de tampón de fosfato (0.2M); pH 7.2 ± 0.2; para el lavado de pocillos y almacenado a 4°C. Diluir el concentrado de lavado 1 + 19; por ejemplo: 10 mL de concentrado de solución de lavado + 190 mL de agua destilada. El tampón diluido es estable durante 5 días a temperatura ambiente.

9.5 Zika Virus Conjugate:Una botella con 15 mL de antígeno de virus Zika conjugado con peroxidasa (HRP) de color rojo; para su uso directo y almacenado a 4°C.

9.6 TMB Substrate Solution:Una botella con 15 mL de 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) < 0.1%; para su uso directo y almacenado a 4°C protegido de la luz. La solución debe ser incolora o puede tener un ligero tono azul. Si el substrato se vuelve azul, puede estar contaminado y debe ser desechado.


9.7 Zika Virus IgM Positive Control:Una botella con 2 mL de control (suero o plasma humano); de color amarillo; para su uso directo y almacenado a 4°C.

9.8 Zika Virus IgM Cut-off Control:Una botella con 3 mL de control (suero o plasma humano); de color amarillo; para su uso directo y almacenado a 4°C.

9.9 Zika Virus IgM Negative Control:Una botella con 2 mL de control (suero o plasma humano); de color amarillo; para su uso directo y almacenado a 4°C.

9.10 Cover foil:Papel de aluminio; para su uso directo y almacenado a 4°C


10.Toma De Muestras Y Conservación

Utilizar muestras de suero o plasma (citrato o heparina) para este ensayo. Si el ensayo se realiza durante los primeros 5 días después de la obtención de la muestra, ésta debe guardarse a 4°C. Si no, la muestra debe ser alicuotada y congelada (-70°C a -20°C). Si las muestras han sido congeladas, después de la descongelación deben mezclarse bien antes de realizar el ensayo. Se deben evitar los ciclos repetidos de congelación-descongelación.

No se recomienda la utilización de muestras que han sido inactivadas por calor.

Antes de empezar el ensayo, todas las muestras deben ser diluidas 1/100 con IgM Sample Diluent. Añadir 10 µL de muestra a 1 mL de Sample Diluent para obtener una dilución 1/100. Mezclar bien usando un vortex.


11.Procedimiento Del Ensayo

Por favor, lea el protocolo detenidamente antes de realizar el ensayo. La fiabilidad del ensayo depende del seguimiento estricto del protocolo descrito.

Este protocolo ha sido validado para procedimiento manual. Si realiza el ELISA con sistemas automatizados, recomendamos incrementar los pasos de lavado de tres a cinco y el volumen de Washing Solution de 300 µL a 350 µL.

Antes de comenzar el ensayo, planee cuidadosamente la distribución e identificación para todas las muestras y estándares/controles (en duplicado). Seleccione el número requerido de tiras de pocillos e insértelas en el portaplacas.

Realice todos los pasos del ensayo en el orden correcto y sin retrasos.

Utilice una punta de pipeta desechable para cada muestra, estándar/control.

Ajuste la temperatura de la incubadora a 37°C ± 1 °C.

11.1 Añadir 100 µL de los estándares/controles y de las muestras diluidas a los pocillos correspondientes. Reservar un pocillo (A1) para el control negativo de sustrato (Subtrate Blank).

11.2 Cubrir los pocillos con el papel de aluminio (cover foil) que se adjunta con el kit.

11.3 Incubar 1 hora ± 5 min a 37°C ± 1°C.11.4 Retirar la lámina, aspirar el contenido de los pocillos y lavarlos 3

veces con 300 µL de Washing Solution. Evitar salpicar los otros pocillos durante los lavados. El tiempo de cada lavado debe ser al menos superior a cinco segundos. Después del último lavado, retirar la Washing Solution por aspiración o decantación. Invertir la placa y depositarla sobre papel limpio para retirar el exceso de líquido.

Nota: La retirada total de líquido en cada paso es esencial para el buen funcionamiento del ensayo.11.5 Añadir 100 µL del Conjugate en todos los pocillos excepto a los

controles negativos de substrato A1 (Substrate Blank well A1)11.6 Incubar 30 min a temperatura ambiente. No exponer a la luz

directa del sol.11.7 Repetir el paso 11.411.8 Añadir 100 µL de TMB Substrate Solution en todos los pocillos.


11.9 Incubar exactamente 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se desarrollará un color azul debido a la reacción enzimática.

11.10 Añadir 100 µL de Stop Solution en todos los pocillos en el mismo orden seguido al añadir el TMB Substrate, lo que desarrollará el cambio de color de azul a amarillo.

11.11 Medir la absorbancia a 450/620 nm en los próximos 30 min después de añadir la Stop Solution.


12.Cálculos

Ajustar el lector de placas ELISA a cero usando el Substrate Blank. Si el lector no puede ser ajustado a cero usando el Substrate Blank, substraer el valor de la absorbancia del blanco a todos los demás valores para obtener resultados fiables.Medir la absorbancia de todos los pocillos a 450 nm y escribir estos valores para cada control y muestra en el plano de la placa. Se recomienda las mediciones bicromáticas usando como referencia la longitud de onda de 620 nm.Cuando sea posible, calcular el valor medio de absorbancia de todos los duplicados. Para que el ensayo se considere válido es necesario que se cumplan los siguientes criterios:

Control negativo de sustrato: Valor de la absorbancia <0.100 Control negativo: Valor de la absorbancia <cut-off Control Cut-off: Valor de la absorbancia 0.150-1.300 Control positivo: Valor de la absorbancia >cut-offSi estos criterios no se cumplen, el ensayo no es válido y debe repetirse.

Cálculo de los resultadosEl valor del control cut-off es la absorbancia media de los pocillos con el control cut-off.Ejemplo: Valor absorbancia control Cut-off 0.44 + valor absorbancia control Cut-off 0.42 = 0.86/ 2 = 0.43 Cut-off = 0.43

Resultados en unidades Abcam [AU]Muestra (media) valor de absorbancia x 10 = [Abcam Units = AU]

Cut-off

Ejemplo: 1.591 x 10 = 37 AU (Unidades)0.43


Interpretación de Resultados

Result Value

Cut- off 10 AU

Positive > 11 AU

Equivocal 9 – 11 AU

Negative < 9 AU


13.Valores Típicos De Las Muestras

PRECISIÓNIntra-Ensayo

Muestra N CV (%)1 24 2.72 24 1.653 24 1.92

Inter-EnsayoMuestra N CV (%)

1 12 8.022 12 5.593 12 9.17

Sensibilidad y especificidad en muestras de pacientes

El propósito de este estudio es determinar la eficiencia del ensayo para discriminar entre muestras clínicas positivas y negativas.Para evaluar el rendimiento del kit anti-Zika Virus IgM μ-capture ELISA (ab213327), estudios internos se realizaron con muestras bien definidas. Muestras de recién nacidos e individuos inmunocomprometidos fueron excluidas de este ensayo, ya que los datos serológicos de estos pacientes tienen valores limitados.122 muestras: Muestras definidas ZIKV (virus Zika) positivas: 13 muestras Muestras definidas negativas: 43 muestras de embarazadas

(mujeres sanas, Alemania) 4 Muestras de sangre negativas (Frankfurt, Alemania) Panel de reactividad cruzada: 62 muestras (incluyendo EEUU,

Uganda, Guadalupe, New Caledonia)


Positivo Negativo Total

Positivo 9 2 11Negativo 0 110 110

anti-Zika Virus IgM μ-capture

ELISA Kit Total 9 112 121

(Los resultados ambiguos no han sido incluidos en los cálculos)

SENSIBILIDAD-La sensibilidad es >90% y se define como la probabilidad de que el ensayo resulte positivo en presencia del analito específico. En este caso, es del 100% (9/9).

ESPECIFICIDAD-La especificidad es >90% y se define como la probabilidad de que el ensayo resulte negativo en ausencia del analito específico. En este caso es del 98.2% (110/112).

Concordancia 98.3% (119/121).


14.Procedimiento Rápido Del Ensayo

Nota: Este protocolo es una referencia rápida para usuarios experimentados. Siga el protocolo detallado cuando realice el ensayo por primera vez.14.1 Diluir las muestras 1/100 con IgM Sample Diluent.14.2 Añadir 100 µL estándares/controles y muestras diluidas en sus

pocillos respectivos. Dejar el pocillo A1 para el control negativo de substrato (Substrate Blank)

14.3 Cubrir los pocillos con el papel de aluminio que se adjunta con el kit.

14.4 Incubar 1 hora ± 5 min a 37°C ± 1°C.14.5 Aspirar y lavar 3 veces con 300 µL of Washing Solution. Volcar la

placa sobre papel absorbente para retirar el líquido restante antes del siguiente paso.

14.6 Añadir 100 µL de Conjugate en todos los pocillos exceptuando el Substrate Blank A1.

14.7 Incubar 30 min a temperatura ambiente. No exponer a la luz directa del sol.

14.8 Repetir el paso de lavado.14.9 Añadir 100 µL de TMB Substrate Solution en todos los pocillos.14.10 Incubar 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.14.11 Añadir 100 µL de Stop Solution en todos los pocillos en el mismo

orden y velocidad utlizados para el TMB Substrate.14.12 Medir la absorbancia a 450/620 nm durante los siguientes 30 min

después la adición de la Stop Solution.


15.Resolución De Problemas

Problema Causa SoluciónTiempo de incubación muy

corto Incubar toda la noche a 4°C

Puede formarse un precipitado después de

añadir el sustrato si la concentración de la diana

es muy alta

Incrementar el factor de dilución de las muestras

Muestra utilizada es incompatible

La detección puede ser reducida o nula en tipos de

muestras no probadas anteriormente

Señal débil

Muestra preparada de manera incorrecta

Asegurar la preparación y dilución correcta de las

muestras

Burbujas en los pocillosAsegurar que no hay burbujas

en los pocillos al medir las absorbancias

Todos los pocillos no han sido lavados igual

Comprobar que los canales del lavador de placas no

están obstruidos. Lavar bien tal y como está recomendado

Mezcla de reactivos incompleta

Asegurar que todos los reactivos están bien

mezclados

Pipeteo inconsistente Utilizar pipetas calibradas para asegurar un pipeteo preciso

CV alto

Preparación o conservación inconsistente de las

muestras

Asegurar la preparación consistente de las muestras y

las condiciones de conservación óptimas (por ejemplo, minimizar los ciclos

de congelación/descongelación)


Problema Causa Solución

Los pocillos no están

suficientemente lavados

Lavar bien los pocillos tal y como recomienda el

protocolo

El Wash Buffer está contaminado Preparar Wash Buffer nuevo

Ruido de fondo alto (background)

Se ha esperado demasiado para

leer la placa después de añadir

la Stop Solution

Leer la placa inmediatamente después de

añadir la Stop Solution

Conservación incorrecta del kit

de ELISA

Guardar todos los reactivos tal y como se recomienda. Puede ser que no todos los reactivos deban guardarse en las mismas condiciones

Baja sensibilidad

Muestra utilizada es incompatible (ej. Suero vs extracto

celular)

La detección puede ser reducida o nula en tipos de

muestras no probadas anteriormente


16. Interferencias

Altas concentraciones de materiales que pueden causar interferencias tales como triglicéridos, bilirrubina o hemoglobina pueden interferir con el ensayo y a dar lugar a falsos negativos o falsos positivos.Para investigar esta posibilidad, se indagó en las publicaciones científicas disponibles en combinación con una investigación de aproximadamente 100 parametros: Se usaron diferentes kits de ELISA incluyendo los kits de detección

de diferentes isotipos de anticuerpos (IgA, IgG, IgM, IgG + IgM) contra bacterias, virus, hongos y parásitos, así como un kit ELISA para la detección de TSH.

Se utilizaron muestras definidas para controles positivos, negativos y ambiguos.

Se añadió una cantidad determinada de una substancia potencialmente interferente a cada muestra. La concentración final de cada sustancia está en rango patológico que ha sido descrito por otros proveedores (10 mg/mL hemoglobin, 0.5 mg/mL bilirubin and 5 mg/mL triglycerides). Los resultados obtenidos en la muestra con el añadido interferente deben estar alrededor del 60-140 % del resultado de la muestra sin tratamiento para cumplir los requerimientos.

Las especificaciones internas de 60-140 % se cumplieron siempre. No se observaron interferencias con muestras hemolíticas,

lipémicas, ictéricas a una concentración menor de 10 mg/mL hemoglobina, 0.5 mg/mL bilirubina y 5 mg/mL triglicéridos.

REACTIVIDAD CRUZADA

Se utilizó un panel de 62 especímenes de pacientes confirmados con otras enfermedades diferentes de infección con Zika (ZIKV) para establecer la especificidad analítica de este kit anti-Zika Virus IgM μ-capture ELISA kit.


Estos especímenes provienen de pacientes con patógenos que pueden causar síntomas parecidos a los producidos por ZIKV (ej. DENV, CHIV) o de individuos con enfermedades o condiciones que tienen una reactividad cruzada potencial tales como otros virus de la familia Flaviviridae (WNV, TBEV, YFV) o patógenos relacionados en la activación policlonal de las células B (virus Epstein-Barr, EBV).

Tipo de patógeno o enfermedad

Número de muestras

Resultados Positivos

Dengue virus (DENV) 12 0/12

West Nile virus (WNV) 20 1/20

Tick borne encephalitis virus (TBEV)

3 0/3

Chikungunya virus (CHIKV) 5 0/5

Yellow Fever virus (YFV) 12 1/12

Epstein-Barr virus 4 0/4

Rheumatoid Factor 5 0/5

ANA 1 0/1

Total 62 2/62

En un panel de especímenes con anticuerpos con posible reactividad cruzada, sólo mostraron reactividad cruzada mínima las muestras de West Nile virus (WNV) y Yellow Fever virus (YFV).

Por tanto, en áreas endémicas, infecciones dobles e infecciones anteriores con otros flavivirus deben tenerse en consideración.


17.Notes


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