Πρωτεϊνικές κινάσες

Ser/Thr και Πρωτεϊνικές φωσφατάσες

1. Ταξινόμηση, δομή και χαρακτηριστικά των Ser/Thr-ειδικών πρωτεϊνικών κινασών

Γενική ταξινόμηση και λειτουργία των πρωτεϊνικών κινασών Ταξινόμηση των Ser/Thr-ειδικών πρωτεϊνικών κινασών

2. Εξειδίκευση των Ser/Thr-ειδικών πρωτεϊνικών κινασών ως προς το υπόστρωμα

Η καταλυτική περιοχή των πρωτεϊνικών κινασών Ser/Thr

3. Αυτοαναστολή και εσωτερική ρύθμιση των Ser/Thr-ειδικών πρωτεϊνικών κινασών

Αυτοαναστολή Φωσφορυλίωση στο τμήμα ενεργοποίησης

4. Πρωτεϊνική κινάση Α Δομή και εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα της πρωτεϊνικής κινάσης Α Ρύθμιση της πρωτεϊνικής κινάσης Α Ενδοκυτταρικός εντοπισμός της ΡΚΑ

5. Πρωτεϊνική κινάση C Χαρακτηρισμός και ταξινόμηση Διέγερση από φορβολεστέρες Οικογένεια των πρωτεϊνικών κινασών C Δομή και ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C Ρύθμιση της ενεργοποίησης της πρωτεϊνικής κινάσης C Λειτουργίες της πρωτεϊνικής κινάσης C

6. Πρωτεϊνικές κινάσες εξαρτώμενες από το σύμπλοκο Ca2+/καλμοντουλίνη Σημασία και γενική λειτουργία Δομή και αυτό-ρύθμιση της CaM-κινάσης ΙΙ

7. Πρωτεϊνικές φωσφατάσες σερίνης/θρεονίνης Δομή και ταξινόμηση Λειτουργία και ρύθμιση

8o

226

8. Συντονισμένη δράση των πρωτεϊνικών κινασών και των πρωτεϊνικών φωσφατασών

Πρωτεϊνική φωσφορυλίωση και ρύθμιση του μεταβολισμού του γλυκογόνου Πρωτεϊνική φωσφατάση Ι και ρύθμιση του μεταβολισμού του γλυκογόνου Πρωτεΐνες που συνδέονται με το γλυκογόνο, G-υπομονάδα της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι Αναστολείς της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι

9. Ρύθμιση της πρωτεϊνικής φωσφορυλίωσης από υποκυτταρικές δομές σε

εξειδικευμένες περιοχές Πρωτεϊνική κινάση Α Κινάση β-αδρενεργικού υποδοχέα (βΑRΚ) Πρωτεϊνική κινάση C Πρωτεϊνική φωσφατάση Ι

10. Γενικές αρχές της ρύθμισης των ενζύμων με φωσφορυλίωση και απο-φωσφορυλίωση

227

Η αντιστρεπτή φωσφορυλίωση των πλευρικών αμινοξικών αλυσίδων είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη αρχή για τη ρύθμιση της δραστικότητας των ενζύμων και των σηματοδοτικών πρωτεϊνών. Μέσω αυτής της λειτουργίας, οι πρωτεϊνικές κινάσες και πρωτεϊνικές φωσφατάσες παίζουν βασικούς ρόλους στη ρύθμιση του μεταβολισμού, στην έκφραση γονιδίων, στην κυτταρική ανάπτυξη, διαίρεση και διαφοροποίηση.

Σχεδόν όλα τα ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια χρησιμοποιούν τη φωσφορυλίωση πρωτεϊνών για να δημιουργήσουν σήματα και να τα οδηγήσουν περαιτέρω. Οι πρωτεϊνικές κινάσες είναι ασφαλώς μια από τις μεγαλύτερες οικογένειες πρωτεϊνών στο κύτταρο. Συντηρητικοί υπολογισμοί προτείνουν ότι περισσότερες από 1000 πρωτεϊνικές κινάσες κωδικοποιούνται στο γονιδίωμα των θηλαστικών. Από τις ποικίλες πρωτεϊνικές κινάσες, οι κινάσες Ser/Thr και Tyr έχουν χαρακτηρισθεί καλύτερα.

1. Ταξινόμηση, δομή και χαρακτηριστικά των Ser/Thr-ειδικών πρωτεϊνικών κινασών

Γενική ταξινόμηση και λειτουργία των πρωτεϊνικών κινασών

Η πρώτη πρωτεϊνική κινάση που απομονώθηκε σε καθαρή μορφή ήταν η κινάση Ser/Thr του μυός, το 1959 (Krebs et al., 1959). Με την ανακάλυψη των κινασών Τyr (Erikson et al., 1979), οι κινάσες Ser/Thr έγιναν μέλη μιας άλλης εκτεταμένης κατηγορίας πρωτεϊνικών κινασών με ρυθμιστική σημασία, στις οποίες αποδόθηκε σύντομα η κύρια λειτουργία στις διαδικασίες της ανάπτυξης και της διαφοροποίησης. Σήμερα, εκατοντάδες διαφορετικές πρωτεϊνικές κινάσες των θηλαστικών είναι γνωστές, οι περισσότερες των οποίων είναι Ser/Thr- ή Τyr-ειδικές. Επιπλέον, υπάρχουν πρωτεϊνικές κινάσες που φωσφορυλιώνουν άλλα αμινοξέα. Βασιζόμενοι στη φύση των αμινοξικών υποδοχέων, τέσσερις κατηγορίες πρωτεϊνικών κινασών μπορούν να διακριθούν (Εικόνα 8.1): • Οι Ser/Thr-ειδικές πρωτεϊνικές κινάσες εστεροποιούν ένα φωσφορικό κατάλοιπο με

την αλκοολ-ομάδα των καταλοίπων Ser και Thr. • Οι Τyr-ειδικές πρωτεϊνικές κινάσες δημιουργούν ένα φωσφορικό εστέρα με τη

φαινολική ΟΗ ομάδα των καταλοίπων Tyr. • Οι Ιστιδινο-ειδικές πρωτεϊνικές κινάσες σχηματίζουν ένα φωσφορικό αμίδιο με την 1 ή

3 θέση της His. Τα μέλη αυτής της οικογένειας ενζύμων φωσφορυλιώνουν επίσης κατάλοιπα Lys και Arg.

• Ασπαραγινικο- ή γλουταμινικο-ειδικές πρωτεϊνικές κινάσες δημιουργούν έναν μεικτό φωσφορο-καρβοξυλικό ανυδρίτη.

Ενώ είναι διαθέσιμα αρκετά δεδομένα για τη δομή και τη λειτουργία των κινασών Ser/Thr- και Tyr-, οι άλλες δύο οικογένειες πρωτεϊνικών κινασών δεν έχουν χαρακτηρισθεί πλήρως.

Στην αλληλουχία των πρωτεϊνικών κινασών, αναγνωρίζεται μία ομόλογη καταλυτική περιοχή που περιλαμβάνει περίπου 270 αμινοξέα. Η περιοχή αυτή διαφοροποιείται ανάμεσα στις Ser/Thr- και Tyr-ειδικές πρωτεϊνικές κινάσες, ενώ επιπλέον μελέτες της ομολογίας της κατέστησαν ικανή την αναγνώριση υποοικογενειών των μεγαλύτερων οικογενειών των Ser/Thr- και Tyr-ειδικών πρωτεϊνικών κινασών.

228

Εικόνα 8.1 Ταξινόμηση των πρωτεϊνικών κινασών με βάση τα αμινοξέα των πρωτεϊνών-στόχων που φωσφορυλιώνουν. Από Krawss Gerhard, Biochemistry of Signal Transduction and Regulation, Wiley Eds, Κεφάλαιο 7. Η πρωτεϊνική φωσφορυλίωση από τις πρωτεϊνικές κινάσες είναι μια γενική και πολύπλευρη διαδικασία μέσα στο κύτταρο, δρώντας ως διακόπτης σε πολλά σηματοδοτικά μονοπάτια. Τα παραδείγματα κυτταρικών δραστηριοτήτων που ρυθμίζονται από πρωτεϊνικές κινάσες είναι ποικίλα, επηρεάζοντας πρακτικά όλη τη λειτουργία του κυττάρου. Πρωτεϊνική φωσφορυλίωση βρέθηκε σε:

• Ένζυμα: ως στοιχεία σηματοδοτικών αλυσίδων και σε ένζυμα του ενδιάμεσου μεταβολισμού. • Πρωτεΐνες προσαρμογής. • Σηματοδοτικές πρωτεΐνες. • Μεταγραφικούς παράγοντες. • Κανάλια ιόντων. • Διαμεμβρανικούς υποδοχείς. • Ριβοσωμικές πρωτεΐνες (ριβοσωμική πρωτεΐνη S6). • Δομικές πρωτεΐνες. • Μεταφορικές πρωτεΐνες.

229

Η δράση διακόπτη της πρωτεϊνικής φωσφορυλίωσης βασίζεται σε διαφορετικούς μηχανισμούς που μπορεί να λειτουργούν ξεχωριστά ή σε συνδυασμό. Η φωσφορυλίωση από τις πρωτεϊνικές κινάσες επηρεάζει τη λειτουργία και τη δράση του πρωτεϊνικού υποστρώματος, ειδικά με τους ακόλουθους τρόπους:

• Επάγει αλλαγές στη διαμόρφωση της πρωτεΐνης. • Άμεση παρεμβολή με πρόσδεση στο υπόστρωμα ή άλλους συμπαράγοντες πρόσδεσης,

π.χ., ισοκιτρική δεϋδρογονάση. • Εμφάνιση θέσεων πρόσδεσης για μόρια τελεστές: παραδείγματα είναι η πρόσδεση της

Tyr-P στις περιοχές SH2 και PTB και η πρόσδεση της Ser-P στις πρωτεΐνες 14−3-3.

Ταξινόμηση των Ser/Thr-ειδικών πρωτεϊνικών κινασών

Εξαιτίας της πολυπλοκότητας και του αριθμού των υποοικογενειών, παρουσιάζονται παρακάτω μόνο επιλεγμένες υποοικογένειες των Ser/Thr-ειδικών πρωτεϊνικών κινασών στα σπονδυλωτά (Hunter, 1991).

Υποοικογένειες των Ser/Thr-ειδικών πρωτεϊνικών κινασών − Πρωτεϊνικές κινάσες που ρυθμίζονται από κυκλικά νουκλεοτίδια • cAMP ρυθμιζόμενη πρωτεϊνική κινάση, πρωτεϊνική κινάση A, PKA • cGMP ρυθμιζόμενη πρωτεϊνική κινάση, PKG

− Πρωτεϊνικές κινάσες που ρυθμίζονται από τη διακυλογλυκερόλη και το Ca2+

• PKC, που διαιρείται περαιτέρω σε υποτύπους α, βI, βII, γ, δ, ε, ζ, η, ι, λ και μ.

− Πρωτεϊνικές κινάσες που ρυθμίζονται από Ca2+/καλμοδουλίνη • κινάση της γ υπομονάδας της φωσφορυλάσης • κινάση της ελαφριάς αλυσίδας της μυοσίνης, MLCK • πρωτεϊνική κινάση II εξαρτώμενη από Ca2+/καλμοδουλίνη

− Ριβοσωμική S6 πρωτεϊνική κινάση • Κινάσες που φωσφορυλιώνουν ειδικά τη ριβοσωμική πρωτεΐνη S6

− Κινάση των GPCRs • Κινάση του β-αδρενεργικού υποδοχέα, βARK.

− Κινάση II της καζεΐνης (η κινάση καζεΐνης πήρε το όνομά της επειδή παρατηρήθηκε ότι η καζεΐνη, η πρωτεΐνη του γάλακτος, είναι ένα καλό υπόστρωμα)

− Κινάση της συνθάσης του γλυκογόνου

− Κινάσες CDC2 (αντιπροσωπευτικά αυτής της οικογένειας είναι τα κεντρικά στοιχεία της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου)

− Κινάσες που προωθούν τη μίτωση, ΜΑΡ κινάσες (οι ΜΑΡ κινάσες συμμετέχουν στη μεταγωγή των σημάτων που προάγουν την αύξηση)

− Πρωτεϊνικές κινάσες Mos/Raf (οι πρωτεϊνικές κινάσες Mos/Raf επίσης συμμετέχουν στη μεταγωγή των σημάτων των αυξητικών παραγόντων).

Υπάρχουν πολλές άλλες πρωτεϊνικές κινάσες που δεν έχουν στενή σχέση με αυτές τις υποοικογένειες. Αυτές περιλαμβάνουν πρωτεϊνικές κινάσες με δύο ειδικότητες, επειδή μπορούν να φωσφορυλιώνουν Ser/Thr και Tyr κατάλοιπα. Ένα παράδειγμα μιας τέτοιας

230

πρωτεϊνικής κινάσης με δύο ειδικότητες είναι η κινάση της ΜΑΡ κινάσης (ΜΑΡΚΚ). 2. Εξειδίκευση των Ser/Thr-ειδικών πρωτεϊνικών κινασών ως προς το υπόστρωμα

Λαμβάνοντας υπ’όψην ότι υπάρχουν πολλά κατάλοιπα Ser και Thr στις πρωτεΐνες, η ερώτηση που προκύπτει είναι ποιοι παράγοντες καθορίζουν τη θέση φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης υποστρώματος. Με τη βοήθεια της ανταλλαγής στοχευμένων αμινοξέων των πρωτεϊνών-υποστρωμάτων, τη σύγκριση της αλληλουχίας των θέσεων φωσφορυλίωσης και τη χρήση καθορισμένων πεπτιδίων ως υποστρώματα μπορεί να δειχτεί ξεκάθαρα ότι η αλληλουχία της γειτονικής περιοχής ενός καταλοίπου Ser/Thr καθορίζει σημαντικά την εξειδίκευση.

Οι διαφορετικές κινάσες Ser/Thr έχουν διαφορετικές απαιτήσεις ως προς τη γειτονική αλληλουχία του καταλοίπου Ser/Thr για να φωσφορυλιωθούν, έτσι ώστε κάθε υποοικογένεια να έχει τη δική της κοινή αλληλουχία για φωσφορυλίωση. Ωστόσο, εντός της οικογένειας των Ser/Thr κινασών, οι αλληλουχίες των θέσεων φωσφορυλίωσης δείχνουν μεγάλη ποικιλότητα και είναι απίθανο να δώσουμε μια κοινή αλληλουχία για όλες τις κινάσες Ser/Thr. Αυτό οφείλεται στους διαφορετικούς ρόλους και στις πολύ διαφορετικές πρωτεΐνες υποστρώματα και δεν είναι παράξενο (Βλπ review Pearson and Kemp, 1991). Αξίζει να τονιστεί ότι αρκετά κατάλοιπα Ser/Thr βρίσκονται σε πολλές αλληλουχίες φωσφορυλίωσης και έτσι είναι πιθανή πολλαπλή και συνεργατική φωσφορυλίωση σε ένα τμήμα αλληλουχίας. Ένα παράδειγμα είναι η φωσφορυλίωση της μεγάλης υπομονάδας της RNA πολυμεράσης II, στο C τελικό άκρο της οποίας υπάρχουν 52 αντίγραφα της επταμερούς αλληλουχίας YSPTSPS ως πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης. Πολλές πρωτεϊνικές κινάσες δε δείχνουν ευδιάκριτη εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα, ειδικά στα πειράματα in vitro. Ορισμένες θέσεις φωσφορυλίωσης της ιστόνης Η1 μπορούν να φωσφορυλιωθούν από ποικίλες πρωτεϊνικές κινάσες. Η εξειδίκευσης των πρωτεϊνικών κινασών θα γίνει πλήρως κατανοητή μόνο όταν έχουμε διαθέσιμες όλες τις δομικές πληροφορίες για την πρόσδεση των υποστρωμάτων με τις πρωτεϊνικές κινάσες.

Η καταλυτική περιοχή των πρωτεϊνικών κινασών Ser/Thr

Δομικές πληροφορίες για τις Ser/Thr-ειδικές πρωτεϊνικές κινάσες (Goldsmith and Cobb, 1994, Johnson et al., 1996, Johnson, 1998) δηλώνουν μια αξιοσημείωτα συντηρημένη δομή της καταλυτικής περιοχής. Στην Εικόνα 8.2, φαίνεται η δομή της καταλυτικής υπομονάδας της πρωτεϊνικής κινάσης Α σε σύμπλεγμα με έναν πεπτιδικό αναστολέα, ο οποίος σε αυτήν την περίπτωση λειτουργεί ως ένα μοντέλο για υπόστρωμα φωσφορυλίωσης (Knighton et al., 1991).

Καθοριστικό ρόλο στην αλληλουχία των θέσεων φωσφορυλίωσης του υποστρώματος από την πρωτεϊνική κινάση Α, παίζουν δύο κατάλοιπα Arg στη γειτονική περιοχή του καταλοίπου Ser το οποίο φωσφορυλιώνεται (Εικόνα 8.3). Ο πεπτιδικός αναστολέας περιέχει τις δύο Arg, αλλά στερείται το κατάλοιπο Ser, το οποίο αντικαθίσταται από αλανίνη, συνεπώς δεν μπορεί να φωσφορυλιωθεί. Λόγω αυτών των χαρακτηριστικών, ο πεπτιδικός αναστολέας προσδένεται με έναν αρκετά όμοιο τρόπο και με όμοια συγγένεια, όπως και το υπόστρωμα, αλλά δεν μπορεί να φωσφορυλιωθεί, και έχει την ιδιότητα του ψευδοϋποστρώματος. Οι αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στην πρωτεϊνική κινάση Α και σε ένα υπόστρωμα, φαίνονται στην Εικόνα 8.3, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα φωσφορυλίωσης ένα πεπτίδιο γνωστό ως κεμπτίδιο.

231

Δομή της καταλυτικής υπομονάδας της PKA και η θέση σύνδεσης του πεπτιδίου PKI

Δομή της κινάσης I της κασεΐνης και η θέση σύνδεσης του ATP/Mg++

Mg

Εικόνα 8.2 Η δομή και οι θέσεις πρόσδεσης του υποστρώματος των κινασών Ser/Thr.

α) Πεπτιδική θέση πρόσδεσης: η δομή της καταλυτικής υπομονάδας της cAMP-εξαρτώμενης πρωτεϊνικής κινάσης Α από ποντίκι με προσδεδεμένο τον πεπτιδικό αναστολέα ΡΚΙ (5-22), που φαίνεται με σκούρο χρώμα στην εικόνα. Ο ΡΚΙ (5-22) είναι ένα κομμάτι (αμινοξέα 5-22) του φυσικού θερμοσταθερού αναστολέα ΡΚΙ της πρωτεϊνικής κινάσης. Ο πεπτιδικός αναστολέας προσδένεται στην περιοχή της θέσης πρόσδεσης του υποστρώματος ανάμεσα στους δύο λοβούς της πρωτεϊνικής κινάσης Α (Knighton et al., 1991). Ο Ρ-βρόχος παίρνει μέρος στην πρόσδεση του φωσφορικού καταλοίπου του ΑΤΡ. β) Θέση πρόσδεσης του ΑΤΡ: δομή της κινάσης Ι της καζεΐνης με συνδεδεμένο Mg-ATP. Το Mg2+ δείχνεται ως μια σφαίρα. (Από Kraulis, 1991).

Η καταλυτική περιοχή της πρωτεϊνικής κινάσης Α έχει δομή δύο λοβών, που αποτελείται από ένα μικρότερο λοβό με ένα μεγάλο τμήμα από δομές β-φύλλων και ένα μεγαλύτερο λοβό που αποτελείται περισσότερο από α-έλικες. Μέχρι σήμερα, όλες οι Ser/Thr- και Tyr-ειδικές πρωτεϊνικές κινάσες δομικά χαρακτηρίζονται από μια παρόμοια δομική περιοχή. Η θέση πρόσδεσης για το πρωτεϊνικό υπόστρωμα και η θέση πρόσδεσης για το ΑΤΡ εντοπίζονται στη σχισμή ανάμεσα στους δύο λοβούς. Ο συνδετικός κρίκος ανάμεσα στους δυο λοβούς είναι ελαστικός και λειτουργεί ως μεντεσές. Προσδένοντας στο υπόστρωμα πρωτεΐνες και ΑΤΡ, οι δύο λοβοί διπλώνουν μαζί, φέρνοντας τη θέση πρόσδεσης του ΑΤΡ στο εσωτερικό του μορίου, ανάμεσα στους δυο λοβούς. Ένας βρόγχος πλούσιος σε γλυκίνη περιέχεται στην περιοχή πρόσδεσης του ATP, με μια κοινή αλληλουχία Υ-Gly-X-Gly-(Phe/Tyr)-Gly-X-Val. Ο βρόγχος είναι εύκαμπτος και παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην κατάλυση της μεταφοράς φωσφόρου και τη ρύθμιση της πρωτεϊνικής κινάσης, επιπλέον και στην πρόσδεση του ΑΤΡ (Bossemeyer, 1994). Η πρόσδεση του ΑΤΡ δείχνεται, χρησιμοποιώντας την κινάση Ι της καζεΐνης ως παράδειγμα, στην Εικόνα 8.2β.

(α) (β)

232

Εικόνα 8. 3 Σημεία επαφής της πρωτεϊνικής κινάσης Α με τον αναστολέα και πεπτιδικά

υποστρώματα. Τα σημεία επαφής βρίσκονται ανάμεσα στην καταλυτική υπομονάδα της πρωτεϊνικής κινάσης Α, τον αναστολέα ΡΚΙ (5-24) και το πεπτιδικό υπόστρωμα (κεμπτίδιο). Ο αναστολέας προσδένεται, διαμέσου δύο καταλοίπων Arg (Ρ3, Ρ-2), στο ίδιο κατάλοιπο γλυκίνης με την ΡΚΑ που επίσης προσδένεται στο υπόστρωμα. Η θέση φωσφορυλίωσης χαρακτηρίζεται με Ρ, τα Ν- και C-τελικά άκρα χαρακτηρίζονται ως (-) και (+) αντίστοιχα και αριθμούνται αρχίζοντας από τη θέση φωσφορυλίωσης Από Kemp et al., 1994.

Το καταλυτικό κέντρο σχηματίζεται από κατάλοιπα και από τους δύο λοβούς. Σε συγκριτικές αλληλουχίες, πειράματα μεταλλάξεων και βιοχημικές μελέτες δείχνουν μια ουσιώδη λειτουργία στην κατάλυση της μεταφοράς φωσφόρου για τα συντηρημένα αμινοξέα Lys72, Asp166 και Αsp184 (μετρώντας από την ΡΚΑ). Ωστόσο, ο καταλυτικός μηχανισμός της μεταφοράς φωσφόρου δεν έχει οριστικά αποδειχθεί. Γενικά, θεωρείται ότι το Asp166, το οποίο είναι το ίδιο για όλες πρωτεϊνικές κινάσες, λειτουργεί ως καταλυτική βάση για την ενεργοποίηση του υδροξυλίου της Ser/Thr και ότι η αντίδραση λαμβάνει χώρα από μια «in line επίθεση» του OH της Ser στο γ-φωσφορικό. Ο αναστολέας προσδένεται στην επιφάνειας πρόσδεσης της κινάσης και σχηματίζει αρκετά σημεία επαφής για την πρωτεϊνική κινάση. Υδροφοβικά κατάλοιπα του αναστολέα βρίσκουν τα ισοδύναμα πρόσδεσής τους σε υδροφοβικούς θύλακες του ενζύμου. Τα κατάλοιπα Arg που είναι σημαντικά για την εξειδίκευση της πρόσδεσης στο υπόστρωμα βρίσκονται σε επαφή με τα κατάλοιπα Glu της πρωτεΐνης μέσω ιονικών αλληλεπιδράσεων (Εικόνα 8.3). Συνολικά, υπάρχουν πολλά πιθανά σημεία επαφής ανάμεσα στην κινάση και τον αναστολέα. Η ποικιλότητα των σημείων επαφής εξηγεί γιατί υπάρχει ανεκτικότητα για τις παραλλαγές στη γειτονική αλληλουχία του καταλοίπου Ser. Για ισχυρή πρόσδεση και σωστό προσανατολισμό μιας πρωτεΐνης υποστρώματος, δεν είναι απαραίτητο να σχηματίζονται όλες οι πιθανές επαφές. Ένα υπόστρωμα που παρέχει μόνο μερικά από τα σημεία επαφής μπορεί ακόμα να προσδεθεί με παραγωγικό τρόπο, υποθέτοντας ότι μερικά αμινοξέα-κλειδιά είναι

Ισολευκίνη Φαινυλαλανίνη

233

παρόντα. Τέτοια αμινοξέα-κλειδιά για την πρωτεϊνική κινάση Α είναι βασικά κατάλοιπα στη γειτονική περιοχή των καταλοίπων Ser (βλπ Εικόνα 8.3). Γενικά, οι πρωτεϊνικές κινάσες δεν έχουν εξειδικευμένες θέσεις αλληλεπίδρασης με το υπόστρωμα, γεγονός που δεν ισχύει για τις εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-νουκλεϊκού οξέος. Οι πρωτεϊνικές κινάσες δεν αναγνωρίζουν fixed αλληλουχίες, μάλλον αναγνωρίζουν οικογένειες ή συγγενείς αλληλουχίες.

3. Αυτοαναστολή και εσωτερική ρύθμιση των Ser/Thr-ειδικών πρωτεϊνικών κινασών

Οι πρωτεϊνικές κινάσες μπορούν να υπάρξουν σε ενεργή και ανενεργή μορφή, και αυτό εξηγεί γιατί μπορούν να παίζουν το ρόλο διακόπτη στα σηματοδοτικά μονοπάτια. Οι πρωτεϊνικές κινάσες είναι ιδιαιτέρως κατάλληλες ως διακόπτες στα σηματοδοτικά μονοπάτια και αυτό οφείλεται στην εύκαμπτη δομή των δύο περιοχών τους που μπορούν να υιοθετήσουν διαφορετικούς προσανατολισμούς σε σχέση με έναν άλλο. Επιπλέον, ένα σηματοδοτικό μόριο μπορεί να επάγει αλλαγές στη διαμόρφωση στη σχισμή μεταξύ των δύο περιοχών, αλλαγές μεγάλης σημασίας για την πρόσδεση του υποστρώματος και την καταλυτική ενεργότητα. Οι μεταπτώσεις ανάμεσα στην ανενεργή και την ενεργή μορφή της πρωτεϊνικής κινάσης ελέγχονται από διαφορετικούς μηχανισμούς:

o Πρόσδεση πρωτεϊνών ενεργοποιητών. o Πρόσδεση πρωτεϊνών αναστολέων. o Ελεγχόμενη από τον προσδέτη σύνδεση των ρυθμιστικών υπομονάδων. o Ενεργοποίηση από συμπαράγοντες (Πχ ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C

από διακυλογλυκερόλη και Ca2+). o Ομοιοπολική τροποποίηση με φωσφορυλίωση σε κατάλοιπα Ser/Thr και/ή Tyr. o Ρυθμιζόμενος κυτταρικός εντοπισμός. o Αλλαγές στην ολιγομερισμένη κατάσταση.

Πολλές έρευνες δομής-λειτουργίας έδειξαν ότι οι πρωτεϊνικές κινάσες μπορεί να υπάρξουν σε κατάσταση αναστολής, στην οποία τα δομικά στοιχεία του ενεργού κέντρου διπλώνουν πίσω και αναστέλλουν την πρόσδεση υποστρώματος και/ή την καταλυτική δραστικότητα. Για τις πρωτεϊνικές κινάσες που ρυθμίζονται από ανασταλτικές πρωτεΐνες ή ανασταλτικά στοιχεία, η αναστολή επίσης προκαλείται από ένα άμεσο ή έμμεσο μπλοκάρισμα του ενεργού κέντρου από την πρόσδεση του αναστολέα. Όταν φτάσει ένα σήμα (π.χ., σήμα φωσφορυλίωσης, πρόσδεση μιας αγγελιοφόρου ουσίας στον αναστολέα) το ένζυμο απαλλάσσεται από την κατάσταση αναστολής. Στη διαδικασία της ενεργοποίησης, το ανασταλτικό δομικό στοιχείο εκκενώνει το ενεργό κέντρο ή η πρωτεΐνη αναστολέας αποχωρίζεται (Εικόνα 8.4). Αυτός ο μηχανισμός είναι γνωστός ως εσωτερική ενδομοριακή τροποποίηση επειδή περιλαμβάνει τροποποίηση σε άμεση εγγύτητα με το ενεργό κέντρο. Δύο μηχανισμοί εσωτερικής τροποποίησης έχουν μελετηθεί: ρύθμιση με αυτοαναστολή και ρύθμιση με φωσφορυλίωση στο βρόγχο ενεργοποίησης.

234

MLCK

PKA

Εικόνα 8.4 Σχηματική αναπαράσταση της αυτοαναστολής και ενεργοποίησης των πρωτεϊνικών κινασών. α) Άρση της αυτοαναστολής με φωσφορυλίωση στην κινάση της ελαφριάς αλυσίδας της μυοσίνης (MLCK). β) Η καταλυτική υπομονάδα C της πρωτεϊνικής κινάσης Α, σε κατάσταση αναστολής που οφείλεται σε πρόσδεση μιας ανασταλτικής υπομονάδας R, μπορεί να απελευθερωθεί από ένα εξωτερικό σήμα και έτσι να ενεργοποιηθεί.

Αυτοαναστολή

Αν το ανασταλτικό δομικό στοιχείο είναι μέρος της πρωτεϊνικής κινάσης, αυτό είναι γνωστό ως αυτοαναστολή. Τα ανασταλτικά δομικά στοιχεία συχνά έχουν χαρακτήρα ψευδοϋποστρώματος. Έχουν μια ομοιότητα με το κανονικό υπόστρωμα και μπορούν να συσσωρευτούν στη θέση πρόσδεσης του υποστρώματος. Αν το ψευδοϋπόστρωμα στερείται υποδοχέα φωσφορικού, δε λαμβάνει χώρα φωσφορυλίωση (Kemp et al., 1994). Δομικές πληροφορίες για την αυτοαναστολή είναι διαθέσιμες για την κινάση της ελαφριάς αλυσίδας της μυοσίνης των θηλαστικών. Η κρυσταλλική δομή ενός καταλυτικού τμήματος της κινάσης έχει ένα αυτοανασταλτικό στοιχείο στο C-τελικό άκρο, που κάνει εξειδικευμένη επαφή με μέρη της ενεργής θέσης και της θέσης πρόσδεσης του ΑΤΡ. Η ενεργή θέση της MLCKινάσης μπλοκάρεται από το ανασταλτικό δομικό στοιχείο: − Σχηματίζοντας επαφές με τη θέση πρόσδεσης του υποστρώματος (λειτουργία ψευδοϋποστρώματος). − Με αποτελεσματική παρεμβολή με πρόσδεση του ΑΤΡ. − Δημιουργώντας επαφές με ουσιώδη κατάλοιπα και προστατεύοντάς τα. Το ανασταλτικό στοιχείο είναι υψηλά συμπληρωματικό με το ενεργό κέντρο και λόγω αυτής της συμπληρωματικότητας, πραγματοποιεί αποτελεσματική αναστολή.

Φωσφορυλίωση στο τμήμα ενεργοποίησης

Πολλές πρωτεϊνικές κινάσες απαιτούν φωσφορυλίωση καταλοίπων Ser/Thr ή Tyr για να

(α)

(β)

235

φτάσουν σε πλήρη ενεργότητα. Η φωσφορυλίωση ενεργοποίησης συχνά λαμβάνει χώρα στο τμήμα της δομής που βρίσκεται κοντά στο ενεργό κέντρο, γνωστό ως τμήμα ενεργοποίησης, το οποίο αποτελείται από δύο υψηλά συντηρημένα μοτίβα αλληλουχίας που βρίσκονται σε όλες σχεδόν τις κινάσες (Johnson et al., 1996). Η φωσφορυλίωση του τμήματος ενεργοποίησης μπορεί να καταλυθεί από άλλες πρωτεϊνικές κινάσες ή από την ίδια την πρωτεϊνική κινάση του ενεργού κέντρου. Στην τελευταία περίπτωση, αυτό είναι μια trans - αυτοφωσφορυλίωση ανάμεσα στις υπομονάδες μιας ολιγομερούς πρωτεϊνικής κινάσης. Οι θέσεις φωσφορυλίωσης Ser/Thr (π.χ. Thr197 της ΡΚΑ) ή Tyr εντοπίζονται στο τμήμα ενεργοποίησης. Η φωσφορυλίωση στο τμήμα ενεργοποίησης οδηγεί σε επανοργάνωση του ενεργού κέντρου με σκοπό τον άριστο προσανατολισμού των καταλυτικών ομαδοποιήσεων (Johnson και O’Reilly, 1996).

4. Πρωτεϊνική κινάση Α

Από τις πρωτεϊνικές κινάσες, η πρωτεϊνική κινάση Α είναι η καλύτερα μελετημένη και χαρακτηρισμένη (Francis και Corbin, 1994). Οι λειτουργίες της πρωτεϊνικής κινάσης Α είναι ποικίλες. Η πρωτεϊνική κινάση Α συμμετέχει στη ρύθμιση του μεταβολισμού του γλυκογόνου, των λιπιδίων και των σακχάρων. Τα υποστρώματα της πρωτεϊνικής κινάσης Α μπορεί να είναι άλλες πρωτεϊνικές κινάσες, όπως και ένζυμα του ενδιάμεσου μεταβολισμού. Η πρωτεϊνική κινάση Α συμμετέχει επίσης στην cAMP-διεγειρόμενη μεταγραφή των γονιδίων που έχουν ένα cAMP-απαντητικό στοιχείο στην περιοχή ελέγχου τους (Montminy, 1997). Μια αύξηση στη συγκέντρωση του cAMP οδηγεί στην ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α, η οποία φωσφορυλιώνει το μεταγραφικό παράγοντα CREB στη Ser133. Ο CREB προσδένεται στο μεταγραφικό συμπαράγοντα CBP στη φωσφορυλιωμένη κατάσταση και διεγείρει τη μεταγραφή.

∆ομή και εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα της πρωτεϊνικής κινάσης Α

Η ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α ελέγχεται από το cAMP. Απουσία του κυκλικού ΑΜΡ, η πρωτεϊνική κινάση Α υπάρχει ως ένα τετραμερές που αποτελείται από δύο ρυθμιστικές R υπομονάδες και δύο καταλυτικές C υπομονάδες. Η καταλυτική δραστικότητα είναι κρυμμένη στο ολοένζυμο C2R2, εφόσον ένα ανασταλτικό δομικό στοιχείο της R υπομονάδας μπλοκάρει την είσοδο προς την ενεργό θέση. Η πρόσδεση του cAMP στην R υπομονάδα οδηγεί σε μείωση της συγγένειας ανάμεσα στις R και C της τάξης 10.000-100.000. Το ολοένζυμο διαχωρίζεται στο διμερές των R υπομονάδων και σε δύο μονομερή των C, που τώρα γίνονται καταλυτικά ενεργές. Στα θηλαστικά, είναι γνωστές τέσσερις ισομορφές της R υπομονάδας (RΙα, RΙβ, RΙΙα και RΙΙβ) και τρεις υπότυποι της C υπομονάδας που ονομάζονται C, Cβ και Cγ. Η σύνθεση των υπομονάδων δείχνεται σχηματικά στην Εικόνα 8.5. Η R υπομονάδα έχει δύο θέσεις δέσμευσης για το cΑΜΡ με διαφορετική συγγένεια. Επιπλέον, η R υπομονάδα έχει μια περιοχή που περιέχει μια θέση αυτοφωσφορυλίωσης που συμμετέχει στην αυτοαναστολή της πρωτεϊνικής κινάσης Α. Η υπομονάδα C έχει ένα κατάλοιπο μυριστοϋλικού οξέος στο αμινο-τελικό άκρο, του οποίου η λειτουργία είναι άγνωστη. Επιπλέον, η υπομονάδα C έχει εξειδικευμένες θέσεις φωσφορυλίωσης, Thr197 και Ser338. Η Thr197 εντοπίζεται στο βρόγχο ενεργοποίησης και φωσφορυλιώνεται από ένα μηχανισμό αυτοφωσφορυλίωσης. Αυτό συνδέεται με αύξηση της συγγένειας για το ΑΤΡ και με καταλυτική δραστικότητα. Η κοινή αλληλουχία για την φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών από την πρωτεϊνική κινάση Α είναι η RRXSX. Η RII υπομονάδα περιέχει μια τέτοια αλληλουχία στην περιοχή αυτοαναστολής και άρα υπόκειται σε φωσφορυλίωση από την υπομονάδα C του ολοενζύμου,

236

αλλά χωρίς απελευθέρωση ή αναστολή. Η αναστολή της υπομονάδας C από την υπομονάδα R βασίζεται στην πρόσδεση της αυτοανασταλτικής αλληλουχίας της R στη θέση πρόσδεσης του υποστρώματος και σε τμήματα του ενεργού κέντρου της υπομονάδας C.

Ρύθμιση της πρωτεϊνικής κινάσης Α

Επιπλέον από τη ρύθμιση από το cAMP, η πρωτεϊνική κινάση Α επίσης υπόκειται και σε άλλες ρυθμιστικές επιδράσεις. Έτσι, η υπομονάδα C μπορεί να φωσφορυλιωθεί ειδικά. Ωστόσο, δεν είναι ξεκάθαρο ποια πρωτεϊνική κινάση είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση της υπομονάδας C.

PKAPKA

RΙα - RΙβ

RIIα - RIIβ

C - Cβ - Cγ

Regulatory

Catalytic

Εικόνα 8.5 Λειτουργικές περιοχές της πρωτεϊνικής κινάσης Α. Οι λειτουργικές περιοχές της

καταλυτικής (C) και της ρυθμιστικής (R) υπομονάδας της πρωτεϊνικής κινάσης Α δείχνονται σε ένα γραμμικό σχηματισμό. Μ: μυριστοϋλίωση.

Η ρύθμιση της πρωτεϊνικής κινάσης Α μπορεί επίσης να συμβεί μέσω του υποκυτταρικού εντοπισμού της. Η πρωτεϊνική κινάση Α περιέχοντας την RII υπομονάδα βρέθηκε συσχετισμένη με τον κυτταροσκελετό και με τη συσκευή Golgi. Για την αγκυροβόληση της πρωτεϊνικής κινάσης Α στα υποκυτταρικά διαμερίσματα μεσολαβούν εξειδικευμένες πρωτεΐνες γνωστές ως πρωτεΐνες αγκυροβόλησης της πρωτεϊνικής κινάσης Α (ΑΚΑΡ: Α kinase anchor protein). Η RII υπομονάδα λειτουργεί ως εξειδικευμένη υπομονάδα εντοπισμού μεσολαβώντας στην αλληλεπίδραση της πρωτεϊνικής κινάσης Α με τις πρωτεΐνες αγκυροβόλησης. Οι αλλαγές στη συγκέντρωση του cAMΡ που οδηγούν στην ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α στο κύτταρο είναι συγκριτικά μικρές. Σε πολλούς ιστούς, μια αύξηση 2-3 μονάδων στη συγκέντρωση του cAMP είναι αρκετή για να επιφέρει το μεγαλύτερο φυσιολογικό αποτέλεσμα. Το κύτταρο έχει διαθέσιμους διαφορετικούς μηχανισμούς που περιορίζουν την αύξηση στη συγκέντρωση του cAMΡ σε μια συγκριτικά στενή περιοχή συγκέντρωσης. Ένα

237

παράδειγμα είναι ο έλεγχος μέσω αρνητικής επανατροφοδότησης (negative feedback) από μια φωσφοδιεστεράση του cAMP. Η ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση Α φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί μια φωσφοδιεστεράση που υδρολύει το cAMP σε ΑΜΡ (Εικόνα 8.6). Αυτός ο μηχανισμός καθιστά ικανή την πρωτεϊνική κινάση Α να ελέγχει την ίδια τη σταθερή της κατάσταση ενεργοποίησης. Αυτό επιβεβαιώνεται γιατί, όσο το εξωτερικό σήμα ελαττώνεται, το σήμα του cAMP γρήγορα υποχωρεί.

Εικόνα 8.6 Αρνητικός επανατροφοδοτικός έλεγχος της πρωτεϊνικής κινάσης Α από μια

φωσφοδιεστεράση. Μετά την ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α, οι καταλυτικές υπομονάδες C απελευθερώνονται και φωσφορυλιώνουν μια φωσφοδιεστεράση, επιπλέον των υποστρωμάτων τους. Η φωσφοδιεστεράση ενεργοποιείται από τη φωσφορυλίωση και υδρολύει το cAMP σε ΑΜΡ, τότε η μεταγωγή σήματος μέσω της πρωτεϊνικής κινάσης Α μειώνεται ή τερματίζεται. Από Krawss Gerhard, Biochemistry of Signal Transduction and Regulation, Wiley Eds, Κεφάλαιο 7.

Ενδοκυτταρικός εντοπισμός της ΡΚΑ

Ο ενδοκυτταρικός εντοπισμός της ΡΚΑ παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην εξειδίκευσή της ως προς το υπόστρωμα που θα φωσφορυλιώσει. Ο ενδοκυτταρικός εντοπισμός της PKA γίνεται είτε μέσω της άμεσης σύνδεσης των R ή C υπομονάδων με τα υποστρώματά τους, είτε μέσω της σύνδεσής της με υποκυτταρικές δομές, είτε τέλος μέσω της πρόσδεσής της σε μέλη τις οικογένειας των πρωτεϊνών ΑΚΑΡ (A-kinase anchoring proteins), οι οποίες προσκολλώνται σε διάφορες υποκυτταρικές περιοχές. Πιο συγκεκριμένα οι RII υπομονάδες αλληλεπιδρούν με τις AKAP με αποτέλεσμα η PKAII να εντοπίζεται σε συγκεκριμένα κυτταρικά οργανίδια, όπως μιτοχόνδρια, κεντροσωμάτια, ενδοπλασματικό δίκτυο και σύμπλεγμα Golgi, υπεροξειδιοσώματα, κυτταροσκελετό, ιοντικά κανάλια και πυρήνα (Εικόνα 8.7).

Υπάρχουν συγκεκριμένες AKAP με περιοχές που έχουν υψηλή ικανότητα σύνδεσης με τις RII, οι οποίες όμως μπορούν να δεσμεύσουν και την RI. Για παράδειγμα η D-AKAP1 συνδέεται με την RI με 25 ως 500 φορές χαμηλότερη συγγένεια από ότι με τις RII υπομονάδες.

238

Οι R υπομονάδες διμερίζονται για να συνδεθεί η ΡΚΑ με τις AKAP. Παρ’ όλο που ο διμερισμός αυτός είναι απαραίτητος για τη σύνδεση με τις AKAP, οι περιοχές που συμμετέχουν στη σύνδεση και στο διμερισμό είναι ξεχωριστές.

Εικόνα 8.7 Οι ΡΚΑ προσδένονται σε διαφορετικού τύπου ΑΚΑΡ, οι οποίες εντοπίζονται

συνδεδεμένες σε διάφορα οργανίδια μέσα στο κύτταρο. Συναντώνται κυρίως κοντά σε υποδοχείς NMDA, κυστίδια, μιτοχόνδρια, κεντροσώματα και μικροσωληνίσκους. Φέρουν πάντα την ΡΚΑ και τις αντίστοιχες για το οργανίδιο πρωτεΐνες. Από Edwards and Scott, Current Opinion in Cell Biology, 2000.

Εικόνα 8.8 Τρία παραδείγματα που δείχνουν τη σύνδεση ΡΚΑ-ΑΚΑΡ. (a) Η ΑΚΑΡ Yotiao φέρνει κοντά την ΡΚΑ στον υποδοχέα NMDA. (b) Στα κύτταρα των νεφρικών σωληναρίων, οι ΡΚΑ, συνδεδεμένες με ΑΚΑΡ, φωσφορυλιώνουν τις ακουαπορίνες-2 επιτρέποντας τη μεταφορά τους προς τη μεμβράνη. (c) Οι ΡΚΑ, συνδεδεμένες μέσω ΑΚΑΡ στα μιτοχόνδρια, φωσφορυλιώνουν τον προ-αποπτωτικό παράγοντα BAD.

239

Η περιοχή σύνδεσης των R υπομονάδων με τις ΑΚΑΡ περιλαμβάνει μία α-έλικα, με υδρόφοβα αμινοξέα και μία α-έλικα με φορτισμένα αμινοξέα (Εικόνα 8.9). Με αντικατάσταση των φορτισμένων αμινοξέων από τη προλίνη (Pro), ένα αμινοξύ το οποίο εμποδίζει τον σχηματισμό της α-έλικας, καταργείται η σύνδεση της ΡΚΑ.

Τέλος, τo σύμπλοκο των ΑKAP με τη ΡΚΑ μπορεί να περιλαμβάνει και πρόσθετους τελεστές όπως κινάσες και φωσφατάσες σχηματίζοντας ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο, το “μεταγωγόσωμα” (transduceosome). Αυτό ελέγχει τη μεταφορά του σήματος της PKA από την κυτταρική μεμβράνη ως τον πυρήνα, ενώ δέχεται και σήματα από άλλους τελεστές. Επίσης συμμετέχει στη ρύθμιση της πρόσδεσης του συμπλόκου AKAP/PKA σε ενδοκυτταρικά διαμερίσματα καθώς και της φωσφορυλίωσης διαφόρων μορίων-στόχων. Για παράδειγμα, η ΑΚΑΡ Yotiao είναι μια πρωτεΐνη-σκαλωσιά (scaffold protein) μέσω της οποίας συνδέεται η τύπου-1 πρωτεϊνική φωσφατάση (ΡΡ1) καθώς και η ΡΚΑ με τους υποδοχείς-κανάλια του Ν-μεθυλο-D-ασπαρτικού (NMDA) με σκοπό τη ρύθμιση της δραστηριότητάς τους. Η συνδεδεμένη ΡΡ1 είναι ενεργή, μειώνοντας έτσι τη δραστηριότητα των καναλιών, όταν όμως ενεργοποιηθεί η ΡΚΑ, αναστέλλεται η δράση της ΡΡ1 και αυξάνεται πάλι η ροή ιόντων μέσω των καναλιών NMDA.

5. Πρωτεϊνική κινάση C

Χαρακτηρισμός και ταξινόμηση

Η οικογένεια ενζύμων των πρωτεϊνικών κινασών C περιλαμβάνει τις Ser/Thr-ειδικές πρωτεϊνικές κινάσες που απαιτούν τους ακόλουθους συμπαράγοντες για να ενεργοποιηθούν (Dekker και Parker, 1994; Newton, 1997, Oancea και Meyer, 1998):

− Ca2+ − Φωσφολιπίδια, όπως η φωσφατιδυλοχολίνη − Διακυλογλυκερόλη.

Η ρύθμιση από Ca+2 και διακυλογλυκερόλη αναγνωρίζει την πρωτεϊνική κινάση C ως συστατικό των μεταγωγικών μονοπατιών, στην πορεία των οποίων, ενεργοποιείται η

Εικόνα 8.9 Αλληλεπίδραση της ΡΚΑ με τις ΑΚΑΡ, μέσω των R υπομονάδων. Η ΑΚΑΡ που φαίνεται με γαλάζιο χρώμα, είναι συνδεδεμένη με τη μεμβράνη του οργανιδίου – στόχου (targeting locus). Στην άλλη πλευρά της ΑΚΑΡ φαίνεται το σημείο σύνδεσης (Αnchor) με τις δύο α-έλικες (μπλε και κόκκινη) των διμερισμένων ρυθμιστικών R υπομονάδων της ΡΚΑ που απεικονίζονται με μπλε και κόκκινο χρώμα. Από: www.engr.ucr.edu/-dmorikis/Morikisriia.html.

240

φωσφολιπάση C και παράγονται οι 2οι διαβιβαστές Ins(3,4,5)Ρ3/Ca2+ και διακυλογλυκερόλη. Η ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C μπορεί να συμβεί μέσω δύο κύριων μονοπατιών: Το πρώτο ξεκινά από τον υποδοχέα κινάσης τυροσίνης, ο οποίος διεγείρει την ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C ενεργοποιώντας τη φωσφολιπάση Cγ. Το δεύτερο μονοπάτι ξεκινά από μεμβρανικούς υποδοχείς G πρωτεϊνών, οι οποίοι μέσω ενεργοποίησης της φωσφολιπάσης Cβ ενεργοποιούν την πρωτεϊνική κινάση C.

∆ιέγερση από φορβολεστέρες

Μια ιδιότητα της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών C που είναι ιδιαίτερα πολύτιμη για την ταυτοποίηση και το χαρακτηρισμό τους είναι η ενεργοποίησή τους από προαγωγούς όγκων όπως οι φορβολεστέρες (Εικόνα 8.10). Η πρωτεϊνική κινάση C προσδένεται στον προωθητή όγκων, τον φορβολικό αιθυλεστέρα ΤΡΑ (tetradecanoyl phorbol acetate), με υψηλή συγγένεια και ενεργοποιείται. Η εξειδικευμένη ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C από φορβολεστέρες είναι σημαντικό εργαλείο για την απόδειξη της εμπλοκής τους στα μονοπάτια μεταγωγής σήματος. Με εξωτερική προσθήκη ΤΡΑ, είναι πιθανό να χρησιμοποιήσουμε συστήματα κυτταρικών μοντέλων για να εξετάσουμε ποιες βιολογικές αποκρίσεις ενός μονοπατιού μεταγωγής σήματος περιλαμβάνονται και ελέγχονται από την πρωτεϊνική κινάση C. Προαγωγείς όγκων όπως ο ΤΡΑ δεν μπορούν από μόνοι τους να προκαλέσουν

σχηματισμό όγκου, αλλά μάλλον προάγουν διέγερση του όγκου από καρκινογόνες ουσίες, π.χ., βενζοπυρένιο. Ο μηχανισμός με τον οποίο οι δομικά πολύ ετερογενείς προαγωγείς όγκου επιφέρουν τη δραστηριότητα δημιουργίας όγκου δεν έχει κατανοηθεί ακόμη. Στην περίπτωση του ΤΡΑ, η διέγερση της ΡΚC δημιουργεί τη βάση για την επεξήγηση. Εφ’ όσον ένας από τους ρόλους της πρωτεϊνικής κινάσης C είναι η ρύθμιση των διαδικασιών του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης, η μη ρυθμιστική δραστηριότητα της πρωτεϊνικής κινάσης C θα μπορούσε να οδηγήσει σε μη επιθυμητή φωσφορυλίωση και έτσι να επιφέρει ανώμαλη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

Η οικογένεια των πρωτεϊνικών κινασών C

Όπως οι περισσότερες από την οικογένεια των Ser/Thr-ειδικών πρωτεϊνικών κινασών, η οικογένεια των πρωτεϊνικών κινασών C επίσης δείχνει σημαντική ετερογένεια. Την παρούσα στιγμή, το λιγότερο 12 διαφορετικοί υπότυποι πρωτεϊνικών κινασών C έχουν ανακαλυφθεί στα θηλαστικά, βασιζόμενοι σε διαφορετικά κριτήρια όπως η αλληλουχία, η διέγερση και η ρύθμιση. Αυτοί είναι γνωστοί ως α, βΙ, βΙΙ, γ, δ, ε, ζ, η, ι, λ και μ ισομορφές. Όλα τα μέλη της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών C δεν διεγείρονται από Ca2+/διακυλογλυκερόλη. Οι ισομορφές ζ και ι δεν εξαρτώνται από Ca2+/διακυλογλυκερόλη, αλλά είναι μέλη της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών C λόγω της ομολογίας της αλληλουχίας. Η ύπαρξη πολλών ισομορφών της πρωτεϊνικής κινάσης C στα θηλαστικά δείχνει ότι οι ξεχωριστές ισομορφές εκπληρούν εξειδικευμένες λειτουργίες στον οργανισμό (Hug και Sarre, 1993; Dekker και Parker, 1994). Οι διαφορετικοί υπότυποι διακρίνονται από διαφορετικό

Εικόνα 8.10 Δομή του ΤΡΑ.

241

κυτταρικό εντοπισμό, διαφορετική ενεργοποίηση από συμπαράγοντες, και έναν διαφορετικό τύπο υποστρωματικών πρωτεϊνών. Για παράδειγμα, οι α, δ και ζ ισομορφές είναι ευρέως κατανεμημένες σε σχεδόν όλους τους ιστούς ενώ οι άλλες ισομορφές βρίσκονται μόνο σε ειδικούς ιστούς. Τα μέλη της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών C συντίθενται από μια πολυπεπτιδική αλυσίδα με μοριακό βάρος 68-83 kDa. Οι Ν-τελικές ρυθμιστικές περιοχές C1 και C2 και μια C-τελική καταλυτική περιοχή μπορούν να διαφοροποιηθούν στη βασική δομή (Εικ. 8.11). Επιπλέον, μια ψευδοϋποστρωματική αλληλουχία με αυτοανασταλτική λειτουργία εντοπίζεται στο Ν-τελικό άκρο. Η περιοχή C1 περιλαμβάνει περίπου 50 αμινοξέα και περιέχει ένα μοτίβο πλούσιο σε κυστεΐνες με δύο προσδεδεμένα ιόντα Zn2+. Σε πολλά ισοένζυμα, υπάρχουν δύο αντίγραφα της περιοχής C1, γνωστές ως περιοχές C1A και C1B (ή επίσης ως Cys1- και Cys-2 στοιχεία). Όταν εκφράζονται στην απομονωμένη μορφή, και οι δύο C1 περιοχές μπορούν να προσδένονται εξειδικευμένα σε φορβολεστέρες, ενώ in vivo μόνο μια από τις δύο θέσεις πρόσδεσης καταλαμβάνεται από φορβολεστέρες. Στο τμήμα C2, το οποίο δε βρίσκεται σε όλα τα μέλη της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών C, βρέθηκαν η θέση πρόσδεσης του Ca2+ και η θέση πρόσδεσης για τα οξικά φωσφολιπίδια. Τα συντηρημένα τμήματα C3 και C4 σχηματίζουν την καταλυτική περιοχή με τις θέσεις πρόσδεσης για το ΑΤΡ και τις υποστρωματικές πρωτεΐνες. Οι περισσότερες από τις βιοχημικές πληροφορίες είναι για την πρωτεϊνική κινάση Cα. Παρακάτω, ο όρος πρωτεϊνική κινάση C αναφέρεται στο ένζυμο πρωτεϊνική κινάση Cα.

Εικόνα 8.11 Λειτουργικές περιοχές της υπεροικογένειας των PKC. Οι ισομορφές των PKC περιέχουν 4 καλά συντηρημένες δομικές περιοχές (C1-C4). Η N-τελική ρυθμιστική τους περιοχή περιέχει μια θέση σύνδεσης ψευδοϋποστρώματος, μιας αυτοανασταλτικής αλληλουχίας (ΡS) καθώς και θέσεις σύνδεσης για τη διακυλογλυκερόλη (C1) και το Ca2+ (C2). Η άκρη της καταλυτικής περιοχής περιέχει την περιοχή σύνδεσης του ΑΤΡ (C3), του υποστρώματος και την περιοχή κινάσης (C4). Οι ρυθμιστικές και οι καταλυτικές περιοχές διαχωρίζονται από έναν εύκαμπτο σύνδεσμο. Από Reyland ME, Protein kinase C isoforms: Multi-functional regulators of cell life and death. Front Biosci. 2009,14:2386-99.

∆ομή και ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C

Απουσία των ενεργοποιητικών συμπαραγόντων, η καταλυτική περιοχή αυτο-αναστέλλεται από τη ρυθμιστική περιοχή (Orr και Newton, 1994). Βρέθηκε στη ρυθμιστική περιοχή ένα μοτίβο αλληλουχίας που λειτουργεί ως ψευδοϋπόστρωμα. Αυτό μοιάζει την κοινή αλληλουχία με θέσεις φωσφορυλίωσης της πρωτεϊνικής κινάσης C αλλά δεν έχει κατάλοιπο Ser ούτε Thr για φωσφορυλίωση. Αυτό το μοτίβο αλληλουχίας σε όλα τα μέλη της

242

οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών C. Θεωρείται ότι το ενεργό κέντρο αναστέλλεται με κατάληψη από το ψευδοϋπόστρωμα. Δύο ιδιότητες αποδίδονται στην πρόσδεση των ενεργών συμπαραγόντων Ca2+, διακυλογλυκερόλη και φωσφολιπιδίων: • Σταθεροποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C, στην οποία το ενεργό κέντρο είναι προσιτό

στις υποστρωματικές πρωτεΐνες. • Προώθηση της σύνδεσης της ΡΚC με τη μεμβράνη. Λεπτομερείς δομικές πληροφορίες για την πρωτεϊνική κινάση C δεν είναι διαθέσιμες προς το παρόν. Η αιτία είναι πιθανώς η ευλυγισία της πρωτεϊνικής κινάσης C και ο συσχετισμός της με τη μεμβράνη. Ο συσχετισμός με τη μεμβράνη, και έτσι η ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C, ελέγχονται από τους συμπαράγοντες Ca2+, διακυλογλυκερόλη και φωσφατιδυλοσερίνη. Ένας ειδικός ρόλος ανατίθεται στην ένταση και τη συχνότητα των σημάτων του Ca2+ και της διακυλογλυκερόλης. Πρόσδεση του Ca2+ στη C2 περιοχή οδηγεί σε αυξημένο συσχετισμό με τη μεμβράνη και σε ενεργοποίηση με απαλλαγή του ενεργού κέντρου από την αλληλεπίδραση με το αυτοανασταλτικό δομικό στοιχείο. Περαιτέρω ενεργοποίηση συμβαίνει με πρόσδεση της διακυλογλυκερόλης στη C1 περιοχή και πρόσδεση της φωσφατιδυλοσερίνης στην C2 περιοχή, με την οποία αυτοί οι προσδέτες λειτουργούν ως άγκυρα για το συσχετισμό της μεμβράνης. Η χρησιμοποίηση των δύο περιοχών C1 και C2 που στοχεύουν στη μεμβράνη βοηθά να εξασφαλιστεί υψηλή συγγένεια, εξειδίκευση και ρύθμιση της μεμβρανικής αλληλεπίδρασης. Η σημασία του συντονισμού των σημάτων του Ca2+ και της διακυλογλυκερόλης είναι πολύ καλά διευκρινισμένη για την πρωτεϊνική κινάση Cγ του εγκεφάλου (Οancea και Meyer, 1998). Για σταθερή ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Cγ, είναι απαραίτητο η υψηλή συχνότητα σημάτων Ca2+ και σήματος διακυλογλυκερόλης να είναι ταυτόχρονα ενεργά. Χαμηλή συχνότητα σημάτων Ca2+, σε αντίθεση, οδηγούν μόνο σε χαμηλή ενεργοποίηση παρουσία της διακυλογλυκερόλης. Λόγω αυτής της ιδιότητας, η λειτουργία του μοριακού μηχανισμού, που είναι ικανός να αποκρυπτογραφεί τα σήματα του Ca2+ και της διακυλογλυκερόλης, ανατίθεται στην πρωτεϊνική κινάση Cγ.

Ρύθμιση της ενεργοποίησης της πρωτεϊνικής κινάσης C

Ρύθμιση από την τοποθέτησή της κοντά στη μεμβράνη Πολλές λειτουργίες της πρωτεϊνικής κινάσης C στα σηματοδοτικά μονοπάτια είναι στενά συνδεδεμένες με την τοποθέτηση του ενζύμου κοντά στη μεμβράνη. Ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C, που γίνεται με προσθήκη φορβολεστέρων, για παράδειγμα, σχετίζεται με επανακατανομή του ενζύμου από το κυτταρόπλασμα στη μεμβράνη. Μια ισορροπία φαίνεται να υπάρχει ανάμεσα στις κυτταροπλασματικές και μεμβρανικές προσδεδεμένες μορφές της πρωτεϊνικής κινάσης C. Φαίνεται δε, ότι αυτή η ισορροπία μπορεί να μετατοπιστεί στην κατεύθυνση της μεμβράνης με τη βοήθεια των συμπαραγόντων: Ca2+, φωσφατιδυλοσερίνης και διακυλογλυκερόλης.

Ρύθμιση από τον εντοπισμό Εξειδικευμένοι πρωτεϊνικοί υποδοχείς συμμετέχουν και βοηθούν στην τοποθέτηση της πρωτεϊνικής κινάσης C κοντά στη μεμβράνη. Αυτοί είναι γνωστοί ως υποδοχείς για ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση C (RACK πρωτεΐνες: Receptor for Activated Protein Kinase C). Οι πρωτεΐνες RACK είναι πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη μεμβράνη και περιέχουν θέσεις πρόσδεσης για την πρωτεϊνική κινάση C και έτσι μεσολαβούν στην εξειδίκευση ως προς τον συσχετισμό μεμβράνης για την πρωτεϊνική κινάση C.

243

Ρύθμιση από τη φωσφορυλίωση Η πρωτεϊνική κινάση C έχει τρεις θέσεις φωσφορυλίωσης. Μια θέση φωσφορυλίωσης

(Τhr500 στην PKC βΙΙ) εντοπίζεται στο βρόχο ενεργοποίησης στην καταλυτική περιοχή (θέση φωσφορυλίωσης από μια άγνωστη ακόμη κινάση) και οι άλλες δυο στο C τελικό άκρο. Οι δύο φωσφορυλιώσεις στο C τελικό άκρο είναι αυτοφωσφορυλιώσεις, στις οποίες αποδίδεται επίσης μια ενεργοποιητική λειτουργία. Ακολουθώντας την ενεργοποίηση των μονοπατιών μεταγωγής σήματος, που περιέχουν την πρωτεϊνική κινάση C ως ρυθμιστικό στοιχείο, παρατηρήθηκε μια πιο μακράς διάρκειας διέγερση σε πολλές περιπτώσεις που επομένως καταλήγει σε μακράς διάρκειας βιολογικά αποτελέσματα. Αυτή η μεγάλης διάρκειας ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C δεν μπορεί να εξηγηθεί από την απελευθέρωση InsP3 και διακυλογλυκερόλης εντός των ορίων ενεργοποίησης μόνο της φωσφολιπάσης C, γιατί η ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C συνεχίστηκε ακόμη και όταν το σήμα της φωσφολιπάσης C και του Ca2+ χανόταν σιγά-σιγά.

Εικόνα 8.12 Λειτουργίες και ρύθμιση της πρωτεϊνικής κινάσης C. Τα σηματοδοτικά μονοπάτια που ελέγχονται από τον υποδοχέα οδηγούν σε σχηματισμό των ενδοκυτταρικών αγγελιοφόρων ουσιών Ca2+ και διακυλογλυκερόλης (DAG), που όπως οι φορβολεστέρες, ενεργοποιούν την πρωτεϊνική κινάση C (PKC). Η μετατόπιση στην κυτταρική μεμβράνη συνδέεται με την ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C, ενώ εμπλέκονται και οι υποδοχείς για την πρωτεϊνική κινάση C καθώς και οι πρωτεΐνες RACK. Υποστρώματα της πρωτεϊνικής κινάσης C είναι οι MARCKS πρωτεΐνες και άλλες πρωτεΐνες που σχετίζονται με τον κυτταροσκελετό. Άλλα υποστρώματα είναι η Raf κινάση και ο υποδοχέας της βιταμίνης D3. Από Krawss Gerhard, Biochemistry of Signal Transduction and Regulation, Wiley Eds, Κεφάλαιο 7. Διαρκής ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C σχετίζεται με άλλα μονοπάτια που οδηγούν στο σχηματισμό της διακυλογλυκερόλης. Λεπτομερέστερα, φωσφολιπίδια της κυτταρικής μεμβράνης μπορεί να είναι μια σημαντική πηγή για απελευθέρωση της

244

διακυλογλυκερόλης, λόγω της οποίας η φωσφατιδυλοχολίνη διαδραματίζει έναν σπουδαίο ρόλο. Η απελευθέρωση της διακυλογλυκερόλης από τη φωσφατιδυλοχολίνη μπορεί να συμβεί μέσω φωσφολιπασών τύπου C ή μέσω της φωσφολιπάσης D. Η φωσφολιπάση D μετατρέπει τη φωσφατιδυλοχολίνη σε φωσφατιδικό οξύ, από το οποίο μπορεί να παραχθεί διακυλογλυκερόλη με μετακίνηση του φωσφορικού καταλοίπου. Η ενεργοποίηση αυτών των φωσφολιπασών από αγωνιστές που διεγείρονται από Ca2+, έχει περιγραφεί συχνά, παρόλο που οι βασικοί μηχανισμοί δεν έχουν εξηγηθεί. Ελεύθερα λιπαρά οξέα διαδραματίζουν επίσης ένα ρόλο στην ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C. Ελεύθερα λιπαρά οξέα, κυρίως αραχιδονικό οξύ, μπορούν να απελευθερωθούν μετά από ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης Α2. Άμεση ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C από λιπαρά οξέα έχει περιγραφεί πολλές φορές, όσο υπάρχει διέγερση της φωσφολιπάσης Α2 που ακολουθεί ενεργοποίηση των εξαρτώμενων από G-πρωτεΐνες μονοπατιών μεταγωγής σήματος (Liscovitch και Cantely, 1994). Ωστόσο, οι λεπτομέρειες αυτής της ενεργοποίησης είναι ακόμα άγνωστες.

Λειτουργίες της πρωτεϊνικής κινάσης C

Τα μέλη της οικογένειας πρωτεϊνικής κινάσης C είναι κεντρικές σηματοδοτικές πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη ρύθμιση ενός μεγάλου πλήθους κυτταρικών διαδικασιών. Ένα πρόβλημα στην αναγνώριση των υποστρωμάτων των πρωτεϊνικών κινασών C είναι η χαμηλή τους εξειδίκευση για τα υποστρώματα, η οποία συχνά δεν μπορεί να διαφοροποιηθεί από αυτή της πρωτεϊνικής κινάσης Α, ιδιαιτέρως σε in vitro πειράματα. Η αλληλουχία των περιοχών φωσφορυλίωσης στα πρωτεϊνικά υποστρώματα είναι όμοια με αυτή της πρωτεϊνικής κινάσης Α, δηλ. βασικά αμινοξέα απαιτούνται ως γειτονικά του καταλοίπου Ser/Thr που φωσφορυλιώνεται. Οι ακόλουθες αλληλουχίες μπορεί να διαμορφωθούν για φωσφορυλίωση από την πρωτεϊνική κινάση C: (* = θέση φωσφορυλίωσης) S*/T*XK/R, K/RXXS*/T*, K/RXXS*/T*XK/R; K/RXS*/T*XK/R (Pearson and Kemp, 1991). Από τα πολλά υποστρώματα της πρωτεϊνικής κινάσης C οι πρωτεΐνες MARCKS είναι πολύ καλά χαρακτηρισμένες και αποτελούν εξειδικευμένα υποστρώματα της πρωτεϊνικής κινάσης C. Η συντομογραφία MARCKS σημαίνει myristoylated, alanine-rich C-kinase substrate. Οι MARCKS πρωτεΐνες είναι μια οικογένεια πρωτεϊνών που σχετίζονται με φυσιολογικά σημαντικές διαδικασίες όπως κυτταρική σταθερότητα, έκκριση, μεμβρανική μεταφορά και ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Όλες αυτές οι αλλαγές συσχετίζονται με αλλαγές και επανασχηματισμό του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Ο ρόλος της αλλαγής των εξωκυττάριων σημάτων σε αλλαγές της δομής του κυτταροσκελετού της ακτίνης αποδίδεται στις πρωτεΐνες MARCKS. Αυτές είναι εξαπλωμένα και εξειδικευμένα υποστρώματα της πρωτεϊνικής κινάσης C και η φωσφορυλίωσή τους χρησιμοποιείται σαν δείκτης της ενεργοποίησης της πρωτεϊνικής κινάσης C in vivo. Οι MARCKS πρωτεΐνες είναι όξινες πρωτεΐνες με υψηλή σύσταση στα αμινοξέα Ala, Gly, Pro και Glu. Μια αμινοτελική περιοχή κουβαλά μια λιπιδιακή άγκυρα στη μορφή μυριστοϋλικού οξέος, με την οποία υποτίθεται ότι μεσολαβεί στη σύνδεση με τη μεμβράνη. Μια βασική περιοχή τελεστής είναι σημαντική για τη ρύθμιση των MARCKS πρωτεϊνών. μια περιοχή σύνδεσης για Ca2+/καλμοδουλίνη και περιοχή φωσφορυλίωσης για την πρωτεϊνική κινάση C εντοπίζονται σε αυτή την περιοχή. Στη μη φωσφορυλιωμένη μορφή και σε έλλειψη Ca2+, οι MARCKS πρωτεΐνες προσδένονται σε ινίδια ακτίνης και επιδρούν στη δημιουργία σταυροσυνδέσεων μεταξύ τους. Η σύνδεση με το σύμπλοκο Ca2+/καλμοδουλίνη ή η φωσφορυλίωση από την πρωτεϊνική κινάση C παρεμποδίζει τη δημιουργία σταυροσυνδέσεων. Οι πρωτεΐνες MARCKS μπορούν έτσι να διαμορφώνουν τη συνολική κατάσταση των ινιδίων ακτίνης και λειτουργούν σαν τελεστές για την μετατροπή των εξωκυττάριων σημάτων που μεταφέρονται μέσα στο

245

κύτταρο μέσω των υποδοχέων που συνδέονται με G πρωτεΐνες (GPCR) και/ή υποδοχέων κινάσης τυροσίνης. Επιπλέον παραδείγματα υποστρωμάτων της πρωτεϊνικής κινάσης C είναι ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), ένας πρωτεϊνικός ανταλλάκτης Na+/H+ και η Raf κινάση. Ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C μπορεί, για παράδειγμα, να δράσει σε άλλα κεντρικά σηματοδοτικά μονοπάτια του κυττάρου. μπορεί να έχει μια ρυθμιστική δράση στη διαδικασία της μεταγραφής και εμπλέκεται στη ρύθμιση των διαδικασιών μεταφοράς. Πολλά υποστρώματα της πρωτεϊνικής κινάσης C είναι μεμβρανικές πρωτεΐνες και είναι φανερό ότι η μεμβρανική σύνδεση της πρωτεϊνικής κινάσης C έχει μεγάλη σημασία για τη φωσφορυλίωση αυτών των πρωτεϊνών.

6. Πρωτεϊνικές κινάσες εξαρτώμενες από το σύμπλοκο Ca2+/καλμοδουλίνη

Σημασία και γενική λειτουργία

Η σηματοδοτική λειτουργία του Ca2+ εκτελείται σαν ένα σύμπλοκο Ca2+/καλμοδουλίνης σε πολλά σηματοδοτικά μονοπάτια. Το σύμπλοκο Ca2+/καλμοδουλίνης μπορεί να προσδένεται ειδικά σε πρωτεΐνες-τελεστές και να διαμορφώνει τη δράση τους. Οι πρώτες πρωτεΐνες-τελεστές του συμπλόκου Ca2+/καλμοδουλίνης που ανακαλύφθηκαν είναι οι πρωτεϊνικές κινάσες Ca2+/καλμοδουλίνης (CaM κινάσες). Οι CaM κινάσες είναι διαδεδομένες και βρίσκονται πρακτικά σε όλα τα κύτταρα των θηλαστικών. Όπως άλλες πρωτεΐνες στόχοι ενδοκυττάριων μηνυμάτων, οι CaM κινάσες παρουσιάζουν μεγάλη ετερογένεια που προκαλείται από την ύπαρξη ξεχωριστών γονιδίων και του εναλλακτικού ματίσματος.

Πίνακας 8.1. Παραδείγματα υποστρωμάτων των Ca2+/καλμοδουλίνης - πρωτεϊνικών κινασών (Από Ann. Rev. Physiol. 1995, 57)

Μια γενική κατηγοριοποίηση των CaM κινασών διαφοροποιεί τις εξειδικευμένες CaM

κινάσες από τις πολυλειτουργικές CaΜ κινάσες. - Ένα παράδειγμα μιας εξειδικευμένης CaM κινάσης είναι η κινάση της ελαφριάς

αλυσίδας της μυοσίνης (MLCK), η πρωταρχική λειτουργία της οποίας είναι να

246

φωσφορυλιώνει την ελαφριά αλυσίδα της μυοσίνης και έτσι να ελέγχει τη σύσπαση των λείων μυών των ζώων. - Οι πολυλειτουργικές CaM κινάσες αναφέρονται συλλογικά σαν CaM κινάσες τύπου ΙΙ, ενώ διαφοροποιούνται και επιπλέον υπότυποι α, β, γ και δ. Οι α και β υπότυποι των CaM κινασών τύπου ΙΙ βρίσκονται μόνο στον εγκέφαλο ενώ οι άλλοι υπότυποι βρίσκονται επίσης σε άλλα όργανα. Οι πολυλειτουργικές CaM κινάσες ρυθμίζουν πολλές λειτουργίες (Πίνακας 1) όπως ο μεταβολισμός του γλυκογόνου, δράση των μεταγραφικών παραγόντων, σχηματισμός μικροϊνιδίων, συναπτική απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών, βιοσύνθεση νευροδιαβιβαστών και πολλές άλλες. Μια σημαντική κυτταρική λειτουργία στον εγκέφαλο αποδίδεται στην CaM κινάση ΙΙ, η οποία αποτελεί το 0,25% των συνολικών πρωτεϊνών.

∆ομή και αυτορύθμιση της CaM κινάσης ΙΙ

Από ρυθμιστικής άποψης, η CaM κινάση ΙΙ είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα καθώς έχει το χαρακτηριστικό του ενζύμου με ενσωματωμένο το "διακόπτη μνήμης" (memory switch). Η "μνήμη" επιτρέπει στην CaM κινάση να διατηρεί ένα διεγερτικό σήμα για μεγαλύτερη χρονική περίοδο και να παραμένει σε μια ενεργή κατάσταση, ακόμη και όταν το εναρκτήριο ερέθισμα έχει εξασθενήσει.

Εικόνα 8.13 Κύρια δομή και ολιγομερής δομή της CaM κινάσης ΙΙ του τύπου β. α) Ευθύγραμμη απεικόνιση της λειτουργικής δομής της CaM κινάσης ΙΙβ. β) Η ολιγομερής δομή που απεικονίζεται προτείνει ένα οκταμερές του τύπου β, βασιζόμενοι σε έρευνες του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Η αμινοτελική καταλυτική περιοχή παρουσιάζεται σαν ένας μεγάλος κύκλος και η C-τελική περιοχή ολιγομερισμού με μικρότερο κύκλο. CaM: καλμοδουλίνη. Από Krawss Gerhard, Biochemistry of Signal Transduction and Regulation, Wiley Eds, Κεφάλαιο 7.

247

Η CaM κινάση ρυθμίζεται τόσο από αυτοφωσφορυλίωση όσο και από το σύμπλοκο Ca2+/καλμοδουλίνης. Μια αμινοτελική καταλυτική περιοχή, μία ρυθμιστική περιοχή και μια περιοχή σύνδεσης μπορεί να διαφοροποιούνται στους διάφορους τύπους των CaM κινασών. Εικόνες ηλεκτρονικού μικροσκοπίου δείχνουν ότι η CaM κινάση ΙΙ έχει μια ολιγομερή δομή στην οποία 8-12 αντίγραφα του μονομερούς ενζύμου (α, β, γ ή δ υπότυπος) σχηματίζουν δομή κυλίνδρου με τις καταλυτικές περιοχές προσανατολισμένες προς τα έξω. Η συνολική δομή της CaM κινάσης μπορεί να προκύψει ως ομο-ολιγομερές ή ως ετερο-ολιγομερές συγκροτημένο από διαφορετικούς υπότυπους.

Απουσία Ca2+/καλμοδουλίνης, η καταλυτική περιοχή της CaM κινάσης υπάρχει σε ένα αυτοαναστελλόμενο στάδιο. Το ενεργό κέντρο μπλοκάρεται λόγω κατάληψης της ρυθμιστικής περιοχής από μια αλληλουχία ψευδοϋποστρώματος. Mια αύξηση στη συγκέντρωση του Ca2+ και του σχετιζόμενου σήματος ασβεστίου οδηγούν σε πρόσδεση του Ca2+/καλμοδουλίνης στο C-τελικό άκρο της ρυθμιστικής περιοχής, που απελευθερώνει το ένζυμο από την αναστελλόμενη του κατάσταση. Το ένζυμο τώρα ενεργοποιείται και μπορεί να εκτελέσει μια αυτοφωσφορυλίωση στην αυτοαναστελλόμενη αλληλουχία. Η φωσφορυλίωση συμβαίνει σε ένα συντηρημένο κατάλοιπο Thr (Thr286 του α υπότυπου) και είναι ενδομοριακή, για παράδειγμα, οι γειτονικές υπομονάδες του ολοενζύμου φωσφορυλιώνουν αμοιβαία η μια την άλλη. Η αυτοφωσφορυλίωση έχει δυο σημαντικές επιπτώσεις: Η συγγένεια για το Ca2+/καλμοδουλίνης αυξάνεται κατά τρεις βαθμούς σε μέγεθος. Το σύμπλεγμα Ca2+/καλμοδουλίνης διαχωρίζεται πολύ αργά μόνο από αυτό το υψηλής συγγένειας σύμπλεγμα. Η ενεργοποιημένη κατάσταση έτσι διατηρείται για μεγαλύτερη χρονική περίοδο. Ακόμη και όταν το σήμα Ca2+ έχει εξασθενίσει και η συγκέντρωση του Ca2+ έχει πέσει σε επίπεδο των 10-7 Μ, το ένζυμο παραμένει στην ενεργοποιημένη κατάσταση για αρκετά ακόμη δευτερόλεπτα, αφού η καλμοδουλίνη μπορεί να παραμένει συνδεδεμένη στο ένζυμο χωρίς συνδεδεμένο το Ca2+. Μετά το διαχωρισμό της καλμοδουλίνης, το φωσφορυλιωμένο ένζυμο έχει ακόμα 20-80% της δράσης της συνδεδεμένης μορφής του συμπλέγματος Ca2+/καλμοδουλίνης. Αυτό διαβεβαιώνει ότι σημαντική δράση παραμένει μετά την εξασθένιση του σήματος του Ca2+. Στη φωσφορυλιωμένη μορφή, η CaM κινάση είναι αυτόνομη, σε κατάσταση μη εξαρτώμενη του συμπλόκου Ca2+/καλμοδουλίνης. Αυτό τερματίζεται μόνο όταν φωσφατάσες διαχωρίζουν το ενεργοποημένο φωσφορικό κατάλοιπο και έτσι οδηγούν το ένζυμο πίσω στην ανενεργή κατάσταση. Το ειδικό χαρακτηριστικό της ρύθμισης της CaM κινάσης είναι η επίδραση μνήμης κατά τη διαδικασία ενεργοποίησης. Η ενεργοποίηση των ενζύμων ξεκινά από μια γενικά παροδική αύξηση του κυτταρικού Ca2+. Το Ca2+ ενεργοποιεί την CaM κινάση στη μορφή του συμπλόκου Ca2+/καλμοδουλίνης, η κινάση παραμένει ενεργή ακόμη και μετά την εξασθένιση του σήματος του Ca2+, γιατί το ένζυμο μετατρέπεται σε μια αυτόνομα ενεργοποιημένη κατάσταση κατά την αυτοφωσφορυλίωση. Ειδική σημασία αποδίδεται σε αυτή την ιδιότητα, συγκεκριμένα για ανίχνευση και διαφοροποίηση των επαναλαμβανόμενων σημάτων Ca2+. Το μεταξύ διάστημα της εμφάνισης των εναλλασσόμενων σημάτων Ca2+ είναι ένας καθοριστικός παράγοντας για την ένταση της ενεργοποίησης. Αν τα σήματα Ca2+ συμβαίνουν με υψηλότερη συχνότητα, μια μεγάλης διάρκειας και αποτελεσματική ενεργοποίηση είναι πιθανή αφού η κινάση παραμένει στην ενεργοποιημένη κατάσταση μεταξύ των σημάτων, εξαιτίας της επίδρασης μνήμης. Εξαιτίας αυτής της ειδικής ιδιότητας, γίνεται η υπόθεση ότι η CaM κινάση συμμετέχει ενεργά στο σχηματισμό μνήμης. Σύμφωνο με αυτό είναι η παρατήρηση ότι η ικανότητα μνήμης των διαγονιδιακών ζώων επηρεάζεται από την έκφραση της CaM κινάσης. Υπάρχουν διαφορετικοί μηχανισμοί που οδηγούν σε αυξημένη ενδοκυτταρική συγκέντρωση Ca2+ και έτσι σε ενεργοποίηση της CaM κινάσης. Οι CaM κινάσες ενεργοποιούνται σαν

248

συνέπεια της InsP3-μεσολαβούμενης απελευθέρωσης Ca2+ από το ΕΔ. Η εισροή του Ca2+ από εξωκυτταρική περιοχή, που προκαλείται από άνοιγμα ποικίλων προσδετο-ελεγχόμενων ή ελεγχόμενων από δυναμικό καναλιών Ca2+ , οδηγεί επίσης σε ενεργοποίηση των CaM κινασών. Έτσι, η CaM κινάση έχει ρόλο κλειδί σε αρκετά σηματοδοτικά μονοπάτια. Κάποια σημαντικά υποστρώματα της CaM κινάσης φαίνονται στον πίνακα 8.1.

Εικόνα 8.14 Ρύθμιση της CaM κινάσης ΙΙ από το σύμπλοκο Ca2+/καλμοδουλίνη και με φωσφορυλίωση. Η CaM κινάση ΙΙ είναι απενεργοποιημένη στην μη φωσφορυλιωμένη μορφή και απουσία του Ca2+/καλμοδουλίνης. Η σύνδεση του Ca2+/καλμοδουλίνης ενεργοποιεί την κινάση για φωσφορυλίωση των πρωτεϊνικών υποστρωμάτων. Κατά τη διαδικασία πραγματοποιείται αυτοφωσφορυλίωση στο συντηρημένο κατάλοιπο Thr που σταθεροποιεί την ενεργοποιημένη κατάσταση του ενζύμου. Σε αυτή την κατάσταση, σημαντική δράση των καταλοίπων είναι παρούσα ακόμη και μετά το διαχωρισμό του Ca2+/καλμοδουλίνης και το ένζυμο παραμένει σε αυτή την ενεργή κατάσταση για περισσότερο χρόνο μετά την εξασθένιση του σήματος του Ca2+. Η ενεργή κατάσταση τερματίζεται μόνο όταν το ενεργοποιημένο φωσφορικό κατάλοιπο υφίσταται διάσπαση του φωσφοεστερικού δεσμού από μια πρωτεϊνική φωσφατάση. Από Krawss Gerhard, Biochemistry of Signal Transduction and Regulation, Wiley Eds, Κεφάλαιο 7.

7. Πρωτεϊνικές φωσφατάσες σερίνης/θρεονίνης Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, οι φωσφορικοί εστέρες των καταλοίπων Ser και Thr είναι σταθεροί και εμφανίζουν μόνο ένα χαμηλό ποσοστό υδρόλυσης. Έτσι, το κύτταρο χρειάζεται τα δικά του εργαλεία για τον ρυθμιζόμενο διαχωρισμό των φωσφορικών

249

καταλοίπων, για να τερματίσει και να μετριάσει τα σήματα που διαμεσολαβούν στην πρωτεϊνική φωσφορυλίωση. Αυτός ο ρόλος εκτελείται από εξειδικευμένες πρωτεϊνικές φωσφατάσες.

∆ομή και ταξινόμηση των πρωτεϊνικών φωσφατασών σερίνης/θρεονίνης

Στα θηλαστικά, τουλάχιστον τέσσερις ομάδες των φωσφατασών Ser/Thr μπορούν να διαφοροποιηθούν: τα μέλη αυτών των ομάδων είναι γνωστά σαν πρωτεϊνικές φωφσφατάσες (PP) 1, 2Α, 2Β και 2C. Οι ΡΡ-1, ΡΡ-2Α και ΡΡ-2Β είναι υψηλά ομόλογες όσον αφορά την αλληλουχία της καταλυτικής περιοχής αλλά μπορεί να διαφέρουν στην εξειδίκευση του υποστρώματος και τον τύπο της ρύθμισης. Η πρωτεϊνική φωσφατάση 2Β είναι επίσης γνωστή ως καλσινευρίνη. Η καλσινευρίνη αποτελείται από μια καταλυτική υπομονάδα και μια ρυθμιστική υπομονάδα που δείχνει ομοιότητα με την καλμοδουλίνη. Μια περιοχή σύνδεσης για το σύμπλοκο Ca2+/καλμοδουλίνη, που απαιτείται για ενεργοποίηση της καλσινευρίνης, βρίσκεται στην καταλυτική υπομονάδα. Η πρωτεϊνική φωσφατάση καλσινευρίνη είχε ιδιαίτερο ενδιαφέρον, αφού μεσολαβεί στην ανοσοκατασταλτική επίδραση της φαρμακευτικής ουσίας κυκλοσπορίνης και της FK506, που συχνά χρησιμοποιείται σε μεταμοσχεύσεις οργάνων και ιστών. Από βιοχημική άποψη, η εφαρμογή και των δυο φαρμάκων ήταν ασαφής για μεγάλο χρονικό διάστημα. Σε αρχικά πειράματα, βρέθηκε ότι η κυκλοσπορίνη και η FK506 συνδέονται εξειδικευμένα σε δυο πρωτεΐνες γνωστές ως κυκλοφιλίνη και FK506 συνδετική πρωτεΐνη, αντίστοιχα. Και οι δυο πρωτεΐνες λειτουργούν σαν πεπτιδυλο-πρόλυλο cis/trans ισομεράσες. Η ανοσοκατασταλτική επίδραση της κυκλοσπορίνης και της FK506 θα μπορούσε αρχικά να εξηγηθεί από αυτές τις παρατηρήσεις. Μόνο με την ανακάλυψη ότι η κυκλοσπορίνη και η FK506 επιτυγχάνουν την ανοσοκατασταλτική επίδρασή τους μέσω αναστολής της καλσινευρίνης έγινε φανερό ότι η ανοσοκαταστολή μεσολαβείται από ένα σύμπλεγμα αλυσίδας αντιδράσεων που συμπεριλαμβάνουν την καλσινευρίνη. Δείχθηκε ότι τα σύμπλοκα της κυκλοσπορίνης/κυκλοφιλίνης και της FK506/ FK506 συνδετικής πρωτεΐνης συνδέονται στην καλσινευρίνη και αναστέλλουν την φωσφατιδική δράση της. Η καλσινευρίνη είναι τμήμα ενός σηματοδοτικού μονοπατιού που ενεργοποιείται από μια αύξηση στο ενδοκυτταρικό ασβέστιο λόγω σύνδεσης προσδέτη σε υποδοχέα της κυτταρικής μεμβράνης. Η αύξηση του Ca2+ ενεργοποιεί τη φωσφατιδική δράση της καλσινευρίνης, που αποφωσφορυλιώνει τα μέλη της οικογένειας των κυτταροπλασματικών NF-AT μεταγραφικών παραγόντων. Τα αποφωσφορυλιωμένα NF-AT μέλη εισέρχονται στον πυρήνα και προσδένονται στο DNA σε συνεργασία με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες, π.χ. AP-1. Με τον τρόπο αυτό πολλά γονίδια στόχοι σε διάφορους ιστούς μπορεί να ενεργοποιηθούν. Η μεταγραφή της ιντερλευκίνης 2 αναστέλλεται σαν μια από τις συνέπειες αναστολής της καλσινευρίνης. σαν ένα εξωκυττάριο σήμα, η ιντερλευκίνη 2 μπορεί να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων. Αυτή η ανακάλυψη έκανε ξεκάθαρο ότι η πρωτεϊνική φωσφατάση καλσινευρίνη έχει έναν ουσιαστικό ρόλο στις σηματοδοτικές διαδικασίες στα Τ λεμφοκύτταρα (Εικόνα 8.15). Η φωσφατάση Ser/Thr υπάρχει κυρίως σαν ετεροδιμερές, που αποτελείται από μια καταλυτική υπομονάδα και μια άλλη υπομονάδα, στην οποία συχνά αποδίδεται μια εξειδικευμένη λειτουργία για τον εντοπισμό των πρωτεϊνικών φωσφατασών. Στην περίπτωση της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι, αυτή η υπομονάδα είναι γνωστή σαν υπομονάδα στόχος. Μια κρυσταλλική δομή της καταλυτικής υπομονάδας της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι είναι διαθέσιμη. Το ένζυμο περιλαμβάνει δυο ιόντα μέταλλου στο ενεργό κέντρο, που είναι πιθανόν Mn2+. Και στα δυο ιόντα αποδίδεται μια λειτουργία στην κατάλυση και στη σύνδεση του υποστρώματος.

250

Εικόνα 8.15 Μοντέλο της λειτουργίας της καλσινευρίνης στα Τ λεμφοκύτταρα. Αντιγονικά πεπτίδια παρουσιάζονται στα Τ λεμφοκύτταρα από ένας αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο (APC) με κυττάρου-κυττάρου αλληλεπίδραση. Η σύνδεση του αντιγόνου ενεργοποιεί τον υποδοχέα του Τ κυττάρου που αρχίζει μια αλυσίδα σημάτων οδηγώντας σε αύξηση του κυτταροπλασματικού ασβεστίου και ενεργοποίηση της καλσινευρίνης. Η ενεργοποιημένη καλσινευρίνη διαχωρίζει ένα ανασταλτικό φωσφορικό κατάλοιπο από τον μεταγραφικό παράγοντα. Συνεπώς, ο NF-AT μεταφέρεται στον πυρήνα όπου διεγείρει τη μεταγραφή των αντίστοιχων γονιδίων. Μεταξύ των γονιδίων που ελέγχονται από τον NF-AT είναι το γονίδιο της κυτοκίνης ιντερλεκίνη 2 (IL-2). Μετά την έκκριση στο εξωκυτταρικό διάστημα, η IL-2 που έχει σχηματιστεί συνδέεται στους IL-2-υποδοχείς του ίδιου κυττάρου ή σε κύτταρα του ίδιου τύπου. Το πολλαπλασιαζόμενο σήμα δημιουργείται από τον ενεργοποιημένο IL-2-υποδοχέα, οδηγώντας σε πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων. Σύμπλοκα των ανοσοκαταστολέων κυκλοσπορίνη Α (CsA) ή των FK506 μαζί με τις συνδετικές πρωτεΐνες τους κυκλοφιλίνη και FK506 συνδετική πρωτεΐνη (FK506B), αντίστοιχα, αναστέλλουν την καλσινευρίνη και διακόπτουν τη μεταβίβαση του σήματος στον NF-AT. Από Krawss Gerhard, Biochemistry of Signal Transduction and Regulation, Wiley Eds, Κεφάλαιο 7.

Λειτουργία και Ρύθμιση των Πρωτεϊνικών Φωσφατασών Ser/Thr

Οι πρωτεϊνικές φωσφατάσες είναι ανταγωνιστές των πρωτεϊνικών κινασών. Εκτελούν διπλή λειτουργία. Μπορούν να προκαλέσουν εξασθένιση στη μεταφορά σήματος που γίνεται από πρωτεϊνική κινάση, με μείωση και τερματισμό του σήματος που δημιουργείται από την πρωτεϊνική φωσφορυλίωση. Οι πρωτεϊνικές φωσφατάσες μπορούν επίσης να έχουν ένα θετικό, ενισχυτικό αποτέλεσμα στα σηματοδοτικά μονοπάτια. Αποφωσφορυλίωση της σηματοδοτικής πρωτεΐνης από μια πρωτεϊνική φωσφατάση μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίησή της και έτσι στην ενίσχυση του σήματος.

Calcineurin-calmodulin

251

Εξαιτίας αυτών των λειτουργιών, οι πρωτεϊνικές φωσφατάσες αποτελούν απαραίτητο τμήμα των διαδικασιών μεταφοράς σήματος συμπεριλαμβάνοντας και πρωτεϊνική φωσφορυλίωση. Επομένως δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι οι πρωτεϊνικές φωσφατάσες υπόκεινται σε αντίστροφη και πολύπλοκη ρύθμιση. Η ρύθμιση των φωσφατασών Ser/Thr κυρίως από τρεις μηχανισμούς.

1. Προσανατολισμένος εντοπισμός: Με τη βοήθεια της υπομονάδας εντοπισμού, μια πρωτεϊνική φωσφατάση μπορεί να οδηγηθεί σε ευδιάκριτες υποκυτταρικές περιοχές στις οποίες εντοπίζονται επίσης και τα υποστρώματα της πρωτεϊνικής φωσφατάσης. 2. Εξειδικευμένοι πρωτεϊνικοί αναστολείς: Υπάρχουν εξειδικευμένοι πρωτεϊνικοί αναστολείς των φωσφατασών Ser/Thr οι οποίοι μπορούν να ελέγξουν τη δράση των πρωτεϊνικών φωσφατασών. Αυτοί οι αναστολείς γενικά υπόκεινται σε ρύθμιση του εαυτού τους, π.χ., με φωσφορυλίωση (Εικόνα 8.17). Εικόνα 8.17 Η ρύθμιση των πρωτεϊνικών φωσφατασών από πρωτεϊνικούς αναστολείς. Τα υποστρώματα της πρωτεϊνικής κινάσης Α περιλαμβάνουν αναστολείς των φωσφατασών που είναι φωσφορυλιωμένοι από την C υπομονάδα της πρωτεϊνικής κινάσης Α. Στη φωσφορυλιωμένη κατάσταση, οι αναστολείς των φωσφατασών συνδέονται στις πρωτεϊνικές φωσφατάσες και αναστέλλει την ενζυμική της δραστικότητα. 3. Φωσφορυλίωση: Η πρωτεϊνική φωσφατάση Ι έχει μια περιοχή φωσφορυλίωσης στο C-τελικό άκρο. Η φωσφορυλίωση σε αυτή την περιοχή από μια εξαρτώμενη από κυκλίνη πρωτεϊνική κινάση αναστέλλει τη δράση της φωσφατάσης.

252

8. Συντονισμένη ∆ράση των Πρωτεϊνικών Κινασών και των Πρωτεϊνικών Φωσφατασών

Η ισχύουσα κατάσταση της φωσφορυλίωσης μιας πρωτεΐνης σε κατάλοιπα Ser/Thr καθορίζεται από τη σχετική δράση της πρωτεϊνικής κινάσης Ser/Thr και της πρωτεϊνικής φωσφατάσης. Είναι επομένως κατανοητό, ότι το κύτταρο πρέπει να αναπτύξει ειδικούς μηχανισμούς για να ισορροπήσει τις δυο δραστηριότητες, και, όταν χρειάζεται, να επιτρέπουν τη δράση των κινασών ή των φωσφατασών να επικρατήσει. Ένα από τα καλύτερα μελετημένα παραδείγματα της συντονισμένης δράσης των πρωτεϊνικών κινασών και των πρωτεϊνικών φωσφατασών είναι η ρύθμιση του μεταβολισμού του γλυκογόνου στους σκελετικούς μύες. Ο μεταβολισμός του γλυκογόνου αποτελεί ένα παράδειγμα για το πώς δυο διαφορετικά σήματα, όπως ένα σήμα κυκλικού AMP και ένα σήμα ασβεστίου συναντώνται σε ένα μεταβολικό μονοπάτι και ελέγχουν τη δραστικότητα ενός μοναδικού ενζύμου.

Πρωτεϊνική Φωσφορυλίωση και Ρύθμιση του Μεταβολισμού του Γλυκογόνου

Ο καταβολισμός και η σύνθεση του γλυκογόνου υπόκειται σε έλεγχο μέσω του Ca2+ και μέσω της αδρεναλίνης (Εικόνα 8.18). Ο έλεγχος μέσω του Ca2+ συμβαίνει κυρίως κατά τη σύσπαση του μυός, ενώ η ορμονική ρύθμιση συμβαίνει σε κατάσταση χαλάρωσης του μυός. Η ορμονική ρύθμιση συμβαίνει μέσω ενός σηματοδοτικού μονοπατιού, τα συστατικά του οποίου έχουν περιγραφεί σε προηγούμενα κεφάλαια. Μετά τη σύνδεση της αδρεναλίνης σε ένα β-αδρενεργικό υποδοχέα, πραγματοποιείται ενεργοποίηση της αδενυλικής κυκλάσης, μέσω διεγερτικών G-πρωτεϊνών, και έτσι τα επίπεδα του cAMP αυξάνουν. Το cAMP ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση Α, η οποία στη συνέχεια φωσφορυλιώνει την κινάση της φωσφορυλάσης του γλυκογόνου και την ενεργοποιεί. Σε ένα ακόμη βήμα αυτού του καταρράκτη, η φωσφορυλάση του γλυκογόνου φωσφορυλιώνεται και ενεργοποιείται από την κινάση της φωσφορυλάσης. Η συνθάση του γλυκογόνου ρυθμίζεται μέσω του ίδιου μονοπατιού. Η συνθάση του γλυκογόνου είναι ανενεργή στη φωσφορυλιωμένη μορφή ενώ στη αποφωσφορυλιωμένη μορφή, είναι ενεργή. Τα τρία ένζυμα κλειδιά του μεταβολισμού του γλυκογόνου έτσι ρυθμίζονται με τη βοήθεια της αντιστρεπτής πρωτεϊνικής φωσφορυλίωσης. Το Ca2+ εμφανίζει τη ρυθμιστική του επίδραση στο επίπεδο της κινάσης της φωσφορυλάσης. Η είσοδος του Ca2+ παίζει σημαντικό ρόλο στη σύσπαση του μυός, μια διαδικασία κατά την οποία απελευθερώνεται Ca2+ από ενδοκυτταρικές αποθήκες και ενεργοποιεί την κινάση της φωσφορυλάσης. Στο επίπεδο της κινάσης της φωσφορυλάσης, δύο σήματα συναντώνται: ένα ορμονικό σήμα στη μορφή της αδρεναλίνης και το σήμα Ca2+. Η δομική βάση για αυτή τη διπλή ρύθμιση της κινάσης φωσφορυλάσης είναι η δομή των υπομονάδων του (Εικόνα 19). Η κινάση της φωσφορυλάσης αποτελείται από τέσσερις υπομονάδες: δυο ρυθμιστικές υπομονάδες α και β, μια καταλυτική υπομονάδα γ και την καλμοδουλίνη σαν την υπομονάδα δ. Στην αποφωσφορυλιωμένη κατάσταση, η κινάση της φωσφορυλάσης είναι ανενεργή, αφού η καταλυτική γ υπομονάδα αναστέλλεται από την αλληλεπίδραση με τις άλλες υπομονάδες. Όταν αυξάνεται η συγκέντρωση του Ca2+, η αναστολή αυξάνεται μερικά επειδή το Ca2+ προσδένεται στην καλμοδουλίνη. Μια επιπλέον συνεισφορά στην αναστολή προκαλείται από την τροπονίνη C, η οποία αλληλεπιδρά με την ανασταλτική β υπομονάδα. Σε αυτή την κατάσταση, η κινάση της φωσφορυλάσης είναι ενεργή και μπορεί να φωσφορυλιώσει τη συνθάση του γλυκογόνου. Η μείωση του γλυκογόνου ξεκινά και τελικά το ΑΤΡ γίνεται διαθέσιμο για τη σύσπαση μυών. Στην κατάσταση χάλασης, π.χ., σε συνθήκες χαμηλής συγκέντρωσης Ca2+, η κινάση της φωσφορυλάσης μπορεί να ενεργοποιηθεί από ένα ορμονικό σήμα, στο οποίο η

253

φωσφορυλίωση συμβαίνει στις ρυθμιστικές α και β υπομονάδες από την πρωτεϊνική κινάση Α. Στη φωσφορυλιωμένη μορφή, η κινάση χρειάζεται επίσης Ca2+, εντούτοις, το φωσφορυλιωμένο ένζυμο μπορεί να ενεργοποιηθεί από χαμηλότερες συγκεντρώσεις Ca2+ σε σχέση με το μη φωσφορυλιωμένο ένζυμο. Εξαιτίας της υψηλότερης ευαισθησίας προς το Ca2+, το φωσφορυλιωμένο ένζυμο μπορεί να είναι ενεργό ακόμη και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις Ca2+ που αποκρίνονται στην ενδοκυτταρική συγκέντρωση Ca2+ στη χαλαρωτική κατάσταση του μυός. Έτσι, η ορμονική διέγερση της μείωσης του γλυκογόνου είναι πιθανή στη χαλαρωτική κατάσταση.

Εικόνα 8.18 Ρύθμιση του μεταβολισμού του γλυκογόνου στους μύες.

Η κινάση φωσφορυλάση βρίσκεται στο κέντρο του μεταβολισμού του γλυκογόνου. Η κινάση φωσφορυλάση μπορεί να υπάρχει σε μια ενεργή, φωσφορυλιωμένη μορφή και σε μια ανενεργή, αποφωσφορυλιωμένη μορφή. Η φωσφορυλίωση της κινάσης φωσφορυλάσης ενεργοποιείται από ορμονικά σήματα (π.χ. αδρεναλίνη) και συμβαίνει μέσω ενεργοποίησης της πρωτεϊνικής κινάσης Α στο cAMP μονοπάτι. Απουσία ορμονικής διέγερσης, η κινάση φωσφορυλάση μπορεί επίσης να ενεργοποιηθεί από μια αύξηση στο κυτοσολικό Ca2+. Η ενεργή κινάση φωσφορυλάση ενεργοποιεί τη μείωση του γλυκογόνου και αναστέλλει τη σύνθεση του γλυκογόνου, στην οποία, από τη μια πλευρά ενεργοποιεί τη φωσφορυλάση του γλυκογόνου με φωσφορυλίωση, από την άλλη πλευρά αναστέλλει τη συνθάση του γλυκογόνου με φωσφορυλίωση.

254

Εικόνα 8.19 Δομή των υπομονάδων και ρύθμιση της κινάσης της φωσφορυλάσης του μυός. Η

κινάση της φωσφορυλάσης, σύμφωνα με την κατάσταση διέγερσης του μυός, ρυθμίζεται από δυο μονοπάτια. Στη νευρική διέγερση του μυός, τασεο-εξαρτώμενα κανάλια Ca2+ ανοίγουν, το κυτοσολικό Ca2+ αυξάνεται και συνδέεται στην καλμοδουλίνη, ενεργοποιώντας την κινάση της φωσφορυλάσης. Όταν ο μυς βρίσκεται σε χάλαση, η κινάση της φωσφορυλάσης διεγείρεται από ορμονικό σήμα. Το ορμονικό σήμα ξεκινά τη φωσφορυλίωση των α και β υπομονάδων της κινάσης της φωσφορυλάσης. Στη φωσφορυλιωμένη της μορφή, αυξάνεται η συγγένεια σύνδεσης του Ca2+ στην υπομονάδα δ (καλμοντουλίνη), και η ενεργοποίηση καθίσταται πιθανή και σε χαμηλές συγκεντρώσεις Ca2+.

Πρωτεϊνική Φωσφατάση Ι και Ρύθμιση του Μεταβολισμού του Γλυκογόνου

Η πρωτεϊνική φωσφατάση Ι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της αποικοδόμησης του γλυκογόνου. Τα ορμονικά σήματα, που οδηγούν σε ταυτόχρονη ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α και της κινάσης της φωσφορυλάσης, ξεκινούν την απενεργοποίηση της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι. Η αναστολή που προκύπτει από την αποφωσφορυλίωση και η διέγερση με φωσφορυλίωση του ενζύμου κλειδί στην αποικοδόμηση του γλυκογόνου διαβεβαιώνουν ότι η γρήγορη κινητοποίηση των αποθεμάτων γλυκογόνου στους μύες μπορεί να ακολουθήσει ένα ορμονικό σήμα.

Η βάση της ρύθμισης της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι είναι η ικανότητα της καταλυτικής υπομονάδας του ενζύμου να συνδέεται αντιστρεπτά με τις ανταποκρινόμενες ρυθμιστικές πρωτεΐνες. Σαν αποτέλεσμα, η δράση και η εξειδίκευση του ενζύμου προσαρμόζεται.

Πρωτεΐνες που συνδέονται με το γλυκογόνο, G υπομονάδα της πρωτεϊνικής

φωσφατάσης Ι

Η καταλυτική υπομονάδα της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι δημιουργεί σύμπλοκο με μια πρωτεΐνη που συνδέει το γλυκογόνο, γνωστή επίσης και ως G υπομονάδα της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι (Εικόνα 8.20). Η G υπομονάδα συνδέεται σφιχτά στο γλυκογόνο. Η σύνδεση της καταλυτικής υπομονάδας με την G υπομονάδα δημιουργεί μια μορφή της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι γνωστή ως πρωτεϊνική φωσφατάση Ι-G (PPIG). H PPIG είναι μια υψηλά ενεργή μορφή της πρωτεϊνικής φωσφατάσης, στην οποία η G υπομονάδα λειτουργεί ως διαμεσολαβητής ανάμεσα στη φωσφατάση και το στόχο της (γλυκογόνου), έτσι ώστε το ένζυμο να έρχεται σε απ’ ευθείας γειτνίαση με το υπόστρωμά του. Τα υποστρώματα

255

αποτελούν φωσφορυλιωμένες μορφές της φωσφορυλάσης του γλυκογόνου και της κινάσης της φωσφορυλάσης, οι οποίες συνδέονται και οι δυο με το γλυκογόνο. Η ρύθμιση της δράσης της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι επίσης μεσολαβείται από την G υπομονάδα. Αυτή μπορεί να φωσφορυλιωθεί σε δυο περιοχές, την Ρ1 και την Ρ2, που εντοπίζονται στη φωσφορυθμιστική περιοχή της G υπομονάδας. Η φωσφορυλίωση της Ρ1 στρέφει την προτίμηση του υποστρώματος της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι, προς τη συνθάση του γλυκογόνου και την κινάση της φωσφορυλάσης, διεγείροντας την αποφωσφορυλίωση τους. Η φωσφορυλίωση της Ρ2 έχει αντίθετη επίδραση, οδηγώντας σε μείωση στη συγγένεια για την καταλυτική υπομονάδα κατά ένα παράγοντα περίπου του 104 και οδηγώντας έτσι σε αποσύνδεση της καταλυτικής υπομονάδας από το γλυκογόνο. Μέσω αυτού του μηχανισμού, η φωσφορυλίωση της Ρ2 επιφέρει αναστολή της δράσης της πρωτεϊνικής φωσφατάσης στο γλυκογόνο. Η αποφωσφορυλίωση και η απενεργοποίηση της φωσφορυλάσης του γλυκογόνου παρεμποδίζεται από τη φωσφορυλίωση της Ρ2 θέσης της G υπομονάδας. Η ορμονική διέγερση του κυττάρου και η σχετική ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α οδηγούν στη φωσφορυλίωση των Ρ1 και Ρ2 περιοχών της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι. Συνεπώς, το ένζυμο αποσυνδέεται από τη G υπομονάδα και δεν μπορεί πλέον να αποφωσφορυλιώνει το υπόστρωμα που είναι συνδεδεμένο με το γλυκογόνο. Η ΡΡ1 απελευθερώνεται στο κυτόπλασμα αλλά διατηρεί ακόμη τη δράση αυτής της μορφής για υπόστρωματα που δεν είναι συνδεδεμένα με το γλυκογόνο.

Εικόνα 8.20 Ρύθμιση της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι που είναι συνδεδεμένη στο γλυκογόνο. Η

ρύθμιση της δράσης της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι (ΡΡΙ) συμβαίνει με τη φωσφορυλίωση της G υπομονάδας. Η G υπομονάδα φωσφορυλιώνεται στις θέσεις Ρ1 και Ρ2, κατά την αλληλουχία σημάτων με μεσολάβηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α. Σαν αποτέλεσμα της φωσφορυλίωσης, η καταλυτική υπομονάδα αποσυνδέεται. Η δράση φωσφατάσης των ελεύθερων καταλυτικών υπομονάδων αναστέλλεται από τη σύνδεση με έναν κυτοσολικό πρωτεϊνικό αναστολέα της φωσφατάσης (Ι), η σύνδεση του οποίου ελέγχεται επίσης μέσω μιας φωσφορυλίωσης με μεσολάβηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α. Η φωσφορυλιωμένη G υπομονάδα μπορεί να αποφωσφορυλιωθεί ξανά από την πρωτεϊνική φωσφατάση 2Α και μπορεί να συνδέσει μια καταλυτική υπομονάδα ΡΡΙ ακόμη μια φορά.

Νέος στόχος της καταλυτικής υπομονάδας απαιτεί την μετακίνηση του φωσφορικού καταλοίπου στη G υπομονάδα που είναι φωσφορυλιωμένη στην Ρ2 περιοχή. Αυτό συμβαίνει μέσω της πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α και 2Β (καλσινευρίνη). Έτσι, ένας καταρράκτης

256

πρωτεϊνικών κινασών εμπλέκεται στη ρύθμιση της αποφωσφορυλίωσης των ενζύμων κλειδιών της αποσύνθεσης του γλυκογόνου, ενώ μια φωσφατάση, που ονομάζεται πρωτεϊνική φωσφατάση Ι, ενεργοποιείται έμμεσα από άλλες πρωτεϊνικές φωσφατάσες. Μαζί με την καλσινευρίνη, μια πρωτεϊνική φωσφατάση που εξαρτάται από Ca2+ εμπλέκεται και έτσι είναι πιθανό να επηρεάζει το μεταβολισμό του γλυκογόνου μέσω σημάτων ασβεστίου. Η φωσφορυλίωση της Ρ1 επίσης προτείνει μια εξήγηση για την επιρροή της ινσουλίνης στο μεταβολισμό του γλυκογόνου. Η ινσουλίνη διεγείρει τη σύνθεση του γλυκογόνου και αναστέλλει τη διάσπασή του προκαλώντας αποφωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της συνθάσης του γλυκογόνου και αποφωσφορυλίωση και αναστολή της φωσφορυλάσης του γλυκογόνου. Και τα δυο ένζυμα αποφωσφορυλιώνονται από την πρωτεϊνική φωσφατάση PPIG. Η ινσουλίνη ενεργοποιεί την πρωτεϊνική φωσφατάση PPIG προκαλώντας φωσφορυλίωση της G υπομονάδας στην Ρ1 περιοχή, αλλά όχι στην Ρ2, μέσω μιας πρωτεϊνικής κινάσης που διεγείρεται από την ινσουλίνη (Εικόνα 8.21).

Εικόνα 8.21 Ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι που είναι συνδεδεμένη στο γλυκογόνο

από την ινσουλίνη. Η ινσουλίνη έχει μια διεγερτική επίδραση στη σύνθεση του γλυκογόνου ενεργοποιώντας την αποφωσφορυλίωση και την ενεργοποίηση της συνθάσης του γλυκογόνου και την αποφωσφορυλίωση και την αναστολή της φωσφορυλάσης του γλυκογόνου. Και τα δυο ένζυμα (υπόστρωμα S στην εικόνα) αποφωσφορυλιώνονται από την πρωτεϊνική φωσφατάση PPIG. Η ινσουλίνη μεσολαβεί στην ενεργοποίηση μιας πρωτεϊνικής κινάσης (πρωτεϊνική κινάση ευαίσθητη στην ινσουλίνη) μέσω ενός σηματοδοτικού μονοπατιού που διεγείρεται από την ινσουλίνη, η οποία φωσφορυλιώνει και έτσι ενεργοποιεί την πρωτεϊνική φωσφατάση PPIG στην Ρ1 περιοχή.

Αναστολείς της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι

Η πρωτεϊνική φωσφατάση Ι που έχει αποσυνδεθεί από το γλυκογόνο μπορεί να απενεργοποιηθεί με σύνδεση σε πρωτεϊνικούς αναστολείς, εμποδίζοντας μια ανεπιθύμητη αποφωσφορυλίωση των πρωτεϊνών στο κυτόπλασμα. Η δράση των πρωτεϊνικών αναστολέων μπορεί με τη σειρά της να ελεγχθεί από αντιστρεπτή φωσφορυλίωση. Μια ορμονική ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α οδηγεί σε φωσφορυλίωση των πρωτεϊνικών αναστολέων Ι, η φωσφορυλιωμένη μορφή είναι η ενεργή μορφή του αναστολέα. Αυτός ο

257

μηχανισμός εξασφαλίζει ότι διέγερση της πρωτεϊνικής φωσφορυλίωσης με μεσολάβηση του cAMP και της πρωτεϊνικής κινάσης Α δεν εξασθενεί από μια αντίθετη αποφωσφορυλίωση.

9. Ρύθμιση της πρωτεϊνικής φωσφορυλίωσης από υποκυτταρικές δομές σε εξειδικευμένες περιοχές

Η έκταση και η εξειδίκευση των αντιδράσεων των πρωτεϊνικών κινασών και φωσφατασών εξαρτώνται πολύ από το βαθμό στον οποίο το υπόστρωμα και το ένζυμο εντοπίζονται στην ίδια περιοχή του κυττάρου. Πολλά υποστρώματα των πρωτεϊνικών κινασών δρουν είτε ως μεμβρανοσυνδεόμενες είτε ως μοριοσυνδεόμενες μορφές. Οι πρωτεϊνικές κινάσες ή οι πρωτεϊνικές φωσφατάσες για να εκτελέσουν τη φυσιολογική τους λειτουργία σε μια σηματοδοτική διαδικασία, πρέπει σε πολλές περιπτώσεις να μεταφερθούν στην περιοχή των υποστρωμάτων τους. Αυτό ισχύει για τις πρωτεϊνικές κινάσες Ser/Thr όπως επίσης και για πολλές πρωτεϊνικές κινάσες Tyr. Κατά την ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών παρατηρείται συχνά διαμερισματοποίηση των πρωτεϊνικών κινασών, που επαναδιανέμονται σε νέες υποκυτταρικές περιοχές. Η εκτόπιση των πρωτεϊνικών κινασών είναι μια εξειδικευμένη διαδικασία, περικλείοντας τουλάχιστον δυο μηχανισμούς για να αποφασίσει την περιοχή στο κύτταρο στην οποία η κινάση θα είναι ενεργή. Στον ένα μηχανισμό, τμήματα ακολουθιών της πρωτεϊνικής κινάσης χρησιμοποιούνται ως ακολουθίες οδηγοί για την διαμερισματοποίηση.

Εικόνα 8.22 Η αρχή της εντόπισης στόχου των πρωτεϊνικών κινασών και των πρωτεϊνικών

φωσφατασών. Η διαμόρφωση του χώρου μεταξύ της καταλυτικής υπομονάδας μιας πρωτεϊνικής κινάσης ή πρωτεϊνικής φωσφατάσης και ενός μεμβρανοσυνδεόμενου υπόστρωματος διαμεσολαβείται από υπομονάδες εντοπισμού που συνδέονται εξειδικευμένα σε πρωτεΐνες ‘άγκυρας’ που εντοπίζονται στη μεμβράνη. Η εξειδίκευση του συνεντοπισμού επιτυγχάνεται κυρίως στο επίπεδο της σύνδεσης της υπομονάδας εντοπισμού και της πρωτεΐνης ‘άγκυρας’. Ο συνεντοπισμός ρυθμίζεται, συγκεκριμένα, από την αλληλεπίδραση της καταλυτικής υπομονάδας με την υπομονάδα εντοπισμού. Στην μεμβρανοσυνδεόμενη μορφή, η καταλυτική υπομονάδα έχει αυξήσει τη δράση της προς τα μεμβρανοσυνδεόμενα υποστρώματα.

258

Σε έναν άλλο μηχανισμό, μια συνδεδεμένη υπομονάδα της πρωτεϊνικής κινάσης ή της πρωτεϊνικής φωσφατάσης καθορίζει σε ποιο διαμέρισμα του κυττάρου και σε ποιο τμήμα της μεμβράνης το σήμα της πρωτεϊνικής φωσφορυλίωσης θα γίνει ενεργό. Η υπομονάδα λειτουργεί σαν μια υπομονάδα εντοπισμού, καθορίζει σε ποια περιοχή του κυττάρου η πρωτεϊνική κινάση έρχεται σε επαφή με τα υποστρώματά της. Με τη βοήθεια της υπομονάδας εντοπισμού, η πρωτεϊνική κινάση και τα υποστρώματα έρχονται σε στενή γειτνίαση το ένα με το άλλο και έτσι επιτυγχάνεται γρήγορη αλλαγή του υποστρώματος, εξαιτίας της υψηλής τοπικής συγκέντρωσης του ενζύμου. Η αρχή της εντόπισης στόχου φαίνεται στην Εικόνα 8.22. Επιπρόσθετα στη συνδετική περιοχή για την ανταποκρινόμενη πρωτεϊνική κινάση (ή πρωτεϊνική φωσφατάση), ο εντοπισμός της υπομονάδας έχει επίσης μια εξειδικευμένη συνδετική περιοχή για την πρωτεΐνη ‘άγκυρα’ (anchor protein), που βρίσκεται σε μια υποκυτταρική περιοχή όπου η πρωτεϊνική φωσφορυλίωση πρέπει να συμβαίνει. Μέσω της αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης ‘άγκυρας’ και της υπομονάδας εντοπισμού, η καταλυτική υπομονάδα διορθώνεται στην επιθυμητή περιοχή και είναι ικανή να αλλάζει το υπόστρωμα που εντοπίζεται στην ίδια περιοχή. Μεταξύ των πρωτεϊνικών κινασών που συζητήθηκαν ήδη, υπάρχουν μερικές για τις οποίες η λειτουργία συνδέεται σε μεγάλο βαθμό με την ειδική υποκυτταρική εντόπιση.

Πρωτεϊνική κινάση Α

Μια αύξηση στο cAMP και ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α συνοδεύονται, σε πολλές περιπτώσεις, από μια αλλαγή στην υποκυτταρική περιοχή του ολοενζύμου της πρωτεϊνικής κινάσης Α και της καταλυτικής υπομονάδας. Συγκεκριμένα, η πρωτεϊνική κινάση Α στα κύτταρα του νευρικού συστήματος βρίσκεται συχνά συνδεδεμένη με τον κυτταροσκελετό. Αυτή η σύνδεση διαμεσολαβείται από την RII υπομονάδα. Η σύνδεση του cAMP στη ρυθμιστική περιοχή απελευθερώνει την καταλυτική υπομονάδα που μπορεί να φωσφορυλιώσει υποστρώματα που βρίσκονται σε κοντινή γειτνιάζουσα περιοχή. Η απελευθερωμένη καταλυτική υπομονάδα μπορεί επίσης να μεταφερθεί σε άλλα διαμερίσματα του κυττάρου. Παράλληλα με την αύξηση στο cAMP, εκτόπιση της καταλυτικής υπομονάδας παρατηρείται σε πολλά κύτταρα από τη συσκευή Golgi ως τον πυρήνα μέσω του κυτταροπλάσματος, και συνοδεύεται από διέγερση της μεταγραφής. Οι πρωτεΐνες ‘άγκυρας’ της κινάσης Α (ΑΚΑΡ), οι οποίες είναι στενά συνδεδεμένες με τον κυτταροσκελετό, λειτουργούν ως άγκυρες για την πρωτεϊνική κινάση Α. Επιπρόσθετα της RII υπομονάδας της πρωτεϊνικής κινάσης Α, οι ΑΚΑΡ πρωτεΐνες φέρουν επίσης πρωτεϊνικές φωσφατάσες και άλλες πρωτεϊνικές κινάσες στον κυτταροσκελετό. Η ΑΚΑΡ79 πρωτεΐνη συνδέει την πρωτεϊνική κινάση C και την πρωτεϊνική φωσφατάση 2Β (καλσινευρίνη) καθώς επίσης και την RII υπομονάδα. Η πιθανότητα να μεταφερθούν και η πρωτεϊνική κινάση και η πρωτεϊνική φωσφατάση στο ίδιο μέρος του κυττάρου διαπλατύνει την πιθανότητα μιας συντονισμένης και με διαδοχικά επίπεδα ρύθμιση της δραστικότητας και των δυο ενζύμων. Με τη συγκέντρωση ποικίλων πρωτεϊνικών κινασών και φωσφατασών, οι πρωτεΐνες αγκυστρώματος οργανώνουν γεγονότα μεταφοράς σήματος και μπορούν να δημιουργήσουν εντοπισμένα και αποτελεσματικά γεγονότα σήματος σε συγκεκριμένες υποκυτταρικές περιοχές.

Κινάση β-αδρενεργικού υποδοχέα (βΑRK)

Η βARK είναι υπεύθυνη για την απενεργοποίηση και την απευαισθητοποίηση των ενεργοποιημένων β-αδρενεργικών υποδοχέων. Με τη σύνδεση ενός αγωνιστή στον β-αδρενεργικό υποδοχέα, παρατηρείται εκτόπιση της βARK από το κυτταρόπλασμα στη

259

μεμβράνη. Οι βγ υπομονάδες της G πρωτεΐνης που εμπλέκονται στη μεταφορά σήματος δρουν ως μεμβρανικές άγκυρες. Κατά την ενεργοποίηση του υποδοχέα, οι βγ υπομονάδες απελευθερώνονται και συνδέονται εξειδικευμένα στην βARK. Αφού οι βγ υπομονάδες συνδέονται στη μεμβράνη μέσω μιας λιπιδιακής άγκυρας, η σύνδεση του βγ συμπλέγματος στην βARK διασυνδέεται με την εκτόπιση της βARK στη μεμβράνη.

Πρωτεϊνική κινάση C

Σε πολλές περιπτώσεις, η διέγερση των κυττάρων με φορβολεστέρες ή με ορμόνες που ενεργοποιούν τη φωσφολιπάση Cβ ή τη φωσφολιπάση Cγ οδηγεί σε εκτόπιση της πρωτεϊνικής κινάσης C (ή ενός υποτύπου της φωσφολιπάσης C) από το κυτταρόπλασμα στη μεμβράνη, τον κυτταροσκελετό ή μέσα στον πυρήνα. Ο διαφορετικός εντοπισμός των ποικίλων ισομορφών της πρωτεϊνικής κινάσης C φαίνεται να μεσολαβείται από τις PKC πρωτεΐνες, από τις οποίες ποικίλες τάξεις έχουν αναγνωριστεί. Οι RACK πρωτεΐνες ανήκουν στην τάξη των targeting πρωτεϊνών που μεσολαβούν στην αγκύστρωση των PKC στη μεμβράνη. Οι RACK πρωτεΐνες συνδέονται σε ένα δομικό τμήμα της πρωτεϊνικής κινάσης C που δεν είναι ίδιο με το καταλυτικό κέντρο ή τη συνδετική περιοχή του υποστρώματος. Η πρωτεϊνική κινάση C μπορεί έτσι να μεταφερθεί στη μεμβράνη με έναν targeted τρόπο, χωρίς καμία παρεμβολή στην καταλυτική δράση. Μια άλλη τάξη πρωτεϊνών, που ονομάζονται πρωτεΐνες που συνδέονται στο υπόστρωμα (SBP), συνδέει τις PKC παρουσία του υποστρώματος σχηματίζοντας ένα τριαδικό σύμπλεγμα με την κινάση. Η φωσφορυλίωση των SBPs από την πρωτεϊνική κινάση C καταργεί την targeting αλληλεπίδραση και διαλύει το τριαδικό σύμπλεγμα.

Πρωτεϊνική φωσφατάση Ι

Η G υπομονάδα της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι, κατά τη συνδεδεμένη με το γλυκογόνο μορφή, θεωρείται ως η υπομονάδα εντοπισμού της. Η G υπομονάδα ενδυναμώνει τον targeted εντοπισμό της καταλυτικής υπομονάδας της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι στο γλυκογόνο έτσι ώστε ένας στενός χωρικός προσανατολισμός της πρωτεϊνικής φωσφατάσης και των υποστρωμάτων της, ένζυμα του μεταβολισμού του γλυκογόνου, να δημιουργείται.

10. Γενικές αρχές της ρύθμισης των ενζύμων με φωσφορυλίωση και

αποφωσφορυλίωση Τα αποτελέσματα της κινάσης φωσφορυλάσης και της πρωτεϊνικής φωσφατάσης Ι εξηγούν κάποιες σημαντικές αρχές της ρύθμισης της δράσης των ενζύμων με φωσφορυλίωση και αποφωσφορυλίωση. Δείχνουν ξεκάθαρα πως διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια μπορούν να συναντηθούν σε αντιδράσεις κλειδιά του μεταβολισμού, πώς σήματα μπορούν να συνεργαστούν το ένα με το άλλο και πώς κοινά συστατικά ενός ρυθμιστικού δικτύου μπορούν να ενεργοποιηθούν από διαφορετικά σήματα. Οι ακόλουθες αρχές τονίζονται: Η πρωτεϊνική φωσφορυλίωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να μετατρέψει τη δράση του ενζύμου σε ενεργή και μη ενεργή. Το ίδιο ισχύει και για την αποφωσφορυλίωση των ενζύμων. Στο κύτταρο, συχνά βρίσκουμε καταρράκτες αντιδράσεων φωσφορυλίωσης στις οποίες ορισμένες αντιδράσεις φωσφορυλίωσης συνδέονται η μια με την άλλη. Οι αντιδράσεις φωσφορυλίωσης μπορεί επίσης να αποτελούν στοιχεία αυτών των καταρρακτών. Επιπλέον, υπάρχουν δίκτυα φωσφορυλίωσης και αποφωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών τα οποία επιτρέπουν στο κύτταρο να αποκριθεί σε εξωτερικά ερεθίσματα με αρμονικό τρόπο.

260

Μια πρωτεϊνική κινάση ή πρωτεϊνική φωσφατάση μπορεί να ρυθμίζεται από διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια. Έτσι, διαφορετικά εξωτερικά ερεθίσματα μπορεί να επηρεάσουν τη φωσφορυλιωμένη κατάσταση μιας πρωτεΐνης. Αυτή η διαφορετική διέγερση μπορεί να διαμεσολαβείται από τις υπομονάδες του ενζύμου, για παράδειγμα. Για την κινάση φωσφορυλάση, απαιτείται ένα σήμα Ca2+ την Ca2+ /καλμοδουλίνη υπομονάδα ενώ ένα σήμα cAMP της πρωτεϊνικής κινάσης αυξάνεται με τη μορφή μιας φωσφορυλίωσης των α και β υπομονάδων. Σε ποια από τα σήματα θα αποκριθεί το κύτταρο εξαρτάται από την κατάσταση στην οποία βρίσκεται. Τα διαφορετικά σήματα μπορεί επίσης να ρυθμίζονται και να διαφοροποιούνται από διαφορετικές θέσεις φωσφορυλίωσης μιας πρωτεΐνης. Εξαιτίας της προτίμησης υποστρωμάτων των πρωτεϊνικών κινασών, οι πολλαπλές θέσεις φωσφορυλίωσης που υπάρχουν σε ένα πρωτεϊνικό υπόστρωμα μπορεί να φωσφορυλιωθούν από διαφορετικές πρωτεϊνικές κινάσες. Οι ανεξάρτητες θέσεις φωσφορυλίωσης μπορεί να έχουν ξεχωριστές λειτουργίες στη ρύθμιση της δράσης του ενζύμου έτσι ώστε μια ειδική ρύθμιση του ενζύμου να είναι πιθανή. Ένας καταρράκτης αντιδράσεων φωσφορυλίωσης, στον οποίο αρκετές πρωτεϊνικές κινάσες συνδέονται σε σειρά, μπορεί να διαμορφωθούν από ποικίλα σηματοδοτικά μονοπάτια, σύμφωνα με αυτό το μηχανισμό. Καλά παραδείγματα για τη σημασία των πολλαπλών θέσεων φωσφορυλίωσης αποτελούν οι πρωτεϊνικές κινάσες που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο. Η υποκυτταρική εντόπιση της κινάσης ή της φωσφορυλάσης επίσης παίζει κρίσιμο ρόλο στη δράση της πρωτεϊνικής κινάσης ή φωσφατάσης. Πολλές φυσιολογικές λειτουργίες της πρωτεϊνικής κινάσης και της πρωτεϊνικής φωσφατάσης εξαρτώνται στη μεταφορά του ενζύμου, με τη βοήθεια εξειδικευμένων αντιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, σε συγκεκριμένες υποκυτταρικές δομές κοντά στα υποστρώματά τους.

Βιβλιογραφία

Dekker LV., and Parker PJ., Protein kinase C: a question of specificity, Trends Biochem. Sci.,

1994, 19, 73-77 Edwards A., and Scott J., A-kinase anchoring proteins: protein kinase A and beyond, Current

Opinion in Cell Biology, 2000, 12, 217-222 Francis SH., and Corbin JD., Structure and function of cyclic nucleotide-dependent protein

kinases, Annu. Rev. Physiol., 1994, 56, 237-272 Goldsmith EJ., and Gobb MH., Protein kinases, Current Biology, 1994, 4, 833-840 Hug H., and Sarre TF., Protein kinase C isoenzymes: divergence in signal transduction,

Biochem. J., 1993, 291, 329-343 Kemp BE., Parker MW., Hu S., Tiganis T., and House C., Substrate and pseudosubstrate

interactions with protein kinases: determinants of specificity, Trends Bioch. Sci., 1994, 19, 441-448

Knighton DR., Zheng J., Ten Eyck LF., et al, Crustal structure of the catalytic subunit of cyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase, Science, 1991, 253, 407-413

Kraulis PJ., MOLSKRIPT: A program to produce both detailed and schematic plots of protein structures, J. Appl. Crystallogr., 1991, 24, 946-950

Krawss Gerhard, Biochemistry of Signal Transduction and Regulation, Wiley Eds, Κεφάλαιο 7

Krebs EG., Graves DJ., and Fischer EH., Factors affecting the activity of muscle phosphorylase kinase, J. Biol. Chem. 1959, 234, 2867-2873

261

Johnson LN., Noble ME., Owen DJ., Active and inactive protein kinases: structural basis for regulation, Cell, 1996, 85, 149-158

Johnson LN., and O’Reilly M., Control by phosphorylation, Curr. Opin. Struct. Biol., 1996, 6, 762-769

Liscovitch M., and Cantley LC., Lipid second messengers, Cell, 1994, 77, 329-334 Montminy M., Transcriptional regulation by cAMP, Ann. Rev. Biochem., 1997, 66, 807-822 Newton AC., Regulation of protein kinase C., Curr. Opin. Cell Biol., 1997, 9, 161-167 Johnson LN., Lowe ED., Noble ME., Owen DJ., The eleventh data lecture. The structural

basis for substrate recognition and control by protein kinases, FEBS Lett., 1998, 430, 1-11

Oancea E., and Meyer T., Protein kinase C as a molecular machine for decoding calcium and diacylglycerol signals, Cell, 1998, 95, 307-318

Pearson RB., and Kemp BE., Protein kinase phosphorylation sit sequencesand consensus specificity motifs; tabulations, Methods in Enzymology, 1991, 200, 62-81

262