ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

Μέθοδος διαχωρισμού των πρωτεϊνών του ορού και άλλων βιολογικών υγρών, ούρων, εγκεφαλονωτιαίου υγρού κ.ά.

Βασίζεται στην μετακίνηση φορτισμένων μορίων από την επίδραση ενός ηλεκτρικού πεδίου, στηριζόμενη στην αμφολυτική ιδιότητα των πρωτεϊνών.

Οι πρωτεΐνες συμπεριφέρονται σαν οξέα ή σαν βάσεις ανάλογα με το pH του διαλύματος μέσα στο οποίο βρίσκονται, έχοντας άλλοτε θετικό και άλλοτε αρνητικό φορτίο.

Έγινε για πρώτη φορά το 1937 από τον Tiselius μέσα σε διάλυμα, για την μελέτη πρωτεϊνών.

• Για κάθε πρωτεΐνη υπάρχει ένα pH στο οποίο η

πρωτεΐνη έχει ουδέτερο φορτίο. Το pH αυτό ονομάζεται

ισοηλεκτρικό σημείο (ΡΙ) της πρωτεΐνης.

• Σε pH πιο όξινο του ΡΙ δέχεται πρωτόνια, φορτίζεται

(+) και κινείται προς τον (-) πόλο (κάθοδο).

• Σε pH αλκαλικότερο του ΡΙ όπως γίνεται στην συνήθη

ηλεκτροφόρηση αποδίδει πρωτόνια, φορτίζεται (-) και

κινείται προς την άνοδο, (+) πόλο.

Η ταχύτητα της μετακίνησης των πρωτεϊνών 

Εξαρτάται από :

1) το καθαρό ηλεκτρικό φορτίο του μορίου

2) το μέγεθος και το σχήμα του μορίου

3) την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου

4) τις ιδιότητες του ηλεκτροφορητικού μέσου

5) την θερμοκρασία στην οποία γίνεται η ηλ/ση

Η εξίσωση της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του πρωτεϊνικού μορίου:

μ = Q / K . r . n

Q: συνολικό φορτίο του μορίουr: ιοντική ακτίνα μορίου δηλ. το νέφος των ιόντων που περιβάλλει το μόριοη: γλοιότητα του διαλύματος

Η κινητικότητα είναι ανάλογη του φορτίου του μορίου και αντιστρόφως ανάλογη με το μέγεθός του και την γλοιότητα του ρυθμιστικού διαλύματος.

Συσκευή ηλεκτροφόρησης αποτελείται από :

1.Πηγή συνεχούς ρεύματος με ρυθμιζόμενη σταθερή τάση ή ένταση.

2. Ηλεκτροφορητικό θάλαμο (μπανάκι) χωρισμένο σε 2 μέρη: στο ένα μέρος είναι προσαρμοσμένο το (+) ηλεκτρόδιο και στο άλλο το (-) ηλεκτρόδιο (συνήθως από πλατίνα ή άνθρακα) Η ταινία (αγαρόζη) τοποθετείται στην γέφυρα ανάμεσα στους δύο θαλάμους ώστε τα δύο άκρα της να είναι βυθισμένα μέσα στο Ρυθμιστικό Διάλυμα (ΡΔ) για να μπορεί το ρεύμα να περάσει μέσα από το ΡΔ και την ταινία στην οποία έχει τοποθετηθεί ο όρος, οπότε κλείνει το κύκλωμα και αρχίζει η ηλεκτροφόρηση.

Το ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ (ΡΔ) μεταφέρει το ηλεκτρικό ρεύμα και διατηρεί το ΡΗ και το φορτίο του μορίου.

Τα ΡΔ είναι βαρβιτουρικά ή tris με αλκαλικό ΡΗ ~ 8.6. Η ιοντική ισχύς (συγκέντρωση ιόντων) του ΡΔ προσδιορίζει την ιοντική ακτίνα του μορίου (πάχος ιόντων που περιβάλλουν το μόριο) και την ταχύτητα της μετακίνησης και την ένταση της ζώνης. Η υψηλή ιοντική ισχύς βάσει του τύπου της ηλ/κής κινητικότητας επιβραδύνει την ταχύτητα και σχηματίζονται ζώνες πιο ευδιάκριτες και καθαρές (πιο κοντά η μια στην άλλη) μικρότερος διαχωρισμός των ζωνών. Όσο ελαττώνεται η ιοντική ισχύς αυξάνει η διάχυση της κάθε ζώνης.

(ΡΔ) βαρβιτάλης ΡΗ = 8.6 i=0,025 – 0,075 του TRIS PH = 9.6 i=0,03 -0,12

Το μειονέκτημα των ΡΔ με υψηλή ιοντική ισχύ είναι η ανάπτυξη

θερμότητας που μετουσιώνει τις θερμοευαίσθητες πρωτεΐνες.

Άλλοι παράγοντες που επηρεάζουν την κινητικότητα είναι οι ιδιότητες του

ηλεκτροφορητικού μέσου (είδος, μέγεθος πόρων, καθαρότητα,

προσμίξεις).

Η αγαρόζη είναι καλό υλικό γιατί δεν έχει ιονιζόμενες ομάδες (μικρή

περιεκτικότητα αγαροπηκτίνης) και αυτό μειώνει την

ηλεκτροενδώσμωση και την χρώση μεταξύ των ζωνών

(υπόστρωμα). Επίσης έχει χαμηλή συγγένεια με τις πρωτεΐνες και δεν

επηρεάζει την κινητικότητά τους.

Η θερμοκρασία

Προκαλείται:

α) μικρότερος διαχωρισμός λόγω της αύξησης ταχύτητας μετακίνησης

(εξάτμιση)

β) μετουσίωση πρωτεϊνών

Η δίοδος ηλεκτρικού ρεύματος από ένα μέσο που προβάλλει ηλεκτρική

αντίσταση (R) συνοδεύεται από παραγωγή θερμότητας (N. Joule Τ = Ι 2Rt).

Χρόνος: όσο αυξάνεται ο χρόνος αυξάνει και η θερμοκρασία και η

ταχύτητα μετακίνησης.

Wick flow (τριχοειδική ροή ΡΔ)

Από την άνοδο της θο λόγω της ξηρότητας του gel μετακινείται ΡΔ

(από την περιφέρεια του gel προς το κέντρο του) δηλαδή από τους 2

θαλάμους προς την μεμβράνη και αυτή η ροή επηρεάζει τον

διαχωρισμό των πρωτεϊνών.

Οι θάλαμοι πρέπει να βρίσκονται υπό ψύξη και να διατηρείται

υγρασία (τοποθέτηση καλύμματος).

Το εύρος και η τελική μορφή των ζωνών εξαρτάται από

απλούς χειρισμούς όπως:

• πλύσιμο των ηλεκτροδίων τακτικά με νερό ώστε να υπάρχει

ομοιογενής εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου κατά μήκος του gel.• απορρόφηση υγρασίας από την επιφάνεια του gel πριν από

την εναπόθεση των δειγμάτων γιατί μέρος του ορού μπορεί να

εκπλυθή (διακεκομμένη ζώνη)• τοποθέτηση του ειδικού καλύμματος πάνω στο gel ώστε να

διατηρείται σχετική υγρασία και να μην ξηραίνεται το gel από

την ανάπτυξη θερμοκρασίας κατά την ηλεκτροφόρηση (wick

flow)• καλός μηχανισμός απαγωγής της θερμότητας από το

σύστημα ηλεκτροφόρησης ώστε να μην προκαλείται αύξηση της

ιοντικής ισχύος του buffer λόγω εξάτμισης και μικραίνει ο

διαχωρισμός των ζωνών

• ομαλή τοποθέτηση του ορού πάνω στο gel, προσοχή

για τυχόν ύπαρξη φυσαλίδων

• τα διαλύματα και οι χρώσεις να φυλάσσονται καλά

πωματισμένα προς αποφυγήν εξάτμισης.

• σε κρυσταλλική όψη του gel αν βρίσκεται στην

κατάψυξη ή ράγισμα ή εκδορές του gel λόγω ξήρανσης

ή ορατής μόλυνσης του gel από βακτήρια ή μύκητες

συνιστάται χρησιμοποίηση νέου gel.

Άλλα σφάλματα κατά την τεχνική:

•όχι σωστό buffer (αν έχει ιζήματα διηθείται. Mετά το τέλος της ηλ/σης δεν

μπορεί να ξαναχρησιμοποιείται λόγω ηλεκτρολύσεως του ύδατος)

•μειωμένος ή παρατεταμένος χρόνος ηλεκτροφόρησης, μικρότερος

χρόνος δίνει ψευδώς χαμηλές τιμές αλβουμίνης

•τραυματισμός του gel κατά την εναπόθεση του όρου ή ύπαρξη

φυσαλίδας μεταξύ του επιθέτη και του gel ή μη απορρόφηση της

περίσσειας του ορού με το απορροφητικό χαρτί, μετά την εναπόθεση.

•μη σωστή ρύθμιση τροφοδοτικού (σε Volt, min, θº)

•μη σωστή τοποθέτηση του gel στο μπανάκι ώστε τα άκρα του να μην

διαβρέχονται από το ΡΔ

• άνιση ποσότητα ΡΔ στα 2 διαμερίσματα του θαλάμου ηλ/σης, όχι περισσότερη ή λιγότερη από αυτή που υποδεικνύει το kit

• να μη έχει τοποθετηθεί σωστά το κάλυμμα στο μπανάκι

• αντιστροφή στους πόλους (0 + πόλος του gel να έχει μπεί στην κάθοδο (-) του τροφοδοτικού)

• μη καλή διαφανοποίηση της ταινίας (μη καλό πλύσιμο ή πλύσιμο της ταινίας ενώ δεν έχει στεγνώσει καλά)

• ξεφλούδισμα της αγαρόζης κατά το βάψιμο λόγω μη συχνής αντικατάστασης της χρωστικής ή υπερβολικής ακινησίας κατά το βάψιμο της ταινίας

• οροί μη αιμολυμένοι (ζώνη στην β ή α2 περιοχή) και μη λιπαιμικοί (ζώνη χυλομικρών στην εναπόθεση), ζώνη στην β-γ περιοχή μπορεί να οφείλεται σε ινωδογόνο λόγω ατελούς πήξης, συνιστάται οπότε επεξεργασία του ορού με θρομβίνη (30μl θρομβίνης σε 100μl ορού) και επανάληψη εξέτασης.

• Μετά την ηλεκτροφόρηση γίνεται μονιμοποίηση των πρωτεϊνών

(μεθανόλη- αφυδάτωση) πολύ καλό στέγνωμα σε θερμό αέρα ή

σε κλίβανο.

• Χρώση για τις πρωτεΐνες του ορού Goomassie Brilliant Blue-

μπλέ 595 nm τύπος G ή τύπος R 640nm ή Amido Black – μαύρο

μπλε χρώμα 640nm.

• Εκπλυση περίσσειας χρωστικής με διάλυμα οξεικού οξέος 5%

και διαύγαση της ταινίας με 95% μεθανόλη και 5% οξεικό οξύ.

• Ο ορός φυσιολογικού ατόμου δίνει 5 ζώνες αρχίζοντας από το

ανοδικότερο άκρο του gel: αλβουμίνη, α1 –σφαιρίνη,

α2-σφαιρίνη, β-σφαιρίνη και γ-σφαιρίνη.

Πυκνομέτρηση: • Αξιολόγηση του ηλεκτροφοριογράμματος όπου μετράται με ειδικό

φωτόμετρο σάρωσης, η πυκνότητα της κάθε ζώνης, από την ένταση του εξερχομένου φωτός το οποίο προσπίπτει σε ένα φωτοκύτταρο που μετατρέπει τις φωτεινές ακτίνες σε ηλεκτρικό ρεύμα.

• Το ρεύμα προκαλεί μετακίνηση της βελόνας του γαλβανομέτρου και δείχνει την απορρόφηση – οπτική πυκνότητα (Ο.D.) του εξεταστέου που είναι το ποσόν του φωτός που απορροφήθηκε πάνω σε μια κλίμακα αριθμημένη λογαριθμικά από 0 έως 2 (Α=-λογ Τ η απορρόφηση είναι ο αρνητικός λογάριθμος της διαπερατότητας).

• Ένας καταγραφέας σχηματίζει την καμπύλη της ηλ/σης και όταν υποστηρίζεται από λογισμικό γίνεται ολοκλήρωση της καμπύλης οπότε καταγράφεται και η % αναλογία των κλασμάτων.

• Η γραμματικότητα της μεθόδου (Ν. Beer) εξαρτάται από το

πυκνόμετρο και την συγκέντρωση της πρωτεΐνης στον ορό.

• Η γραμματικότητα του πυκνομέτρου ελέγχεται με ειδικά

standards από την εταιρεία (Service).

• Σήμερα με τα αυτόματα και ημιαυτόματα συστήματα

ηλεκτροφόρηση τα gel έχουν ενσωματωμένο το buffer με ανοδικό

και καθοδικό πόλο, τα δείγματα εναποτίθενται στο gel με

ειδικούς επιθέτες από μεμβράνη τελικού όγκου 1μl και η χρώση

γίνεται σε ειδικό μηχάνημα. Επίσης υπάρχει δυνατότητα

συμπύκνωσης του δείγματος απευθείας από το μηχάνημα

κάνοντας περισσότερες εναποθέσεις.

Χρησιμότητα ηλεκτροφόρησης ορού

 

•Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης

•Μέτρηση Μ- πρωτεΐνης (% αναλογία)

•Απεικόνιση φλεγμονώδους αντίδρασης-πρώϊμη φάση (αύξηση α1

αντιτρυψίνης, απτοσφαιρίνης, C3, σερουλοπλασμίνης και CRP) και

(ελάττωση αλβουμίνης και τρανσφερίνης). Οι αλλαγές στην συγκέντρωση

των πρωτεϊνών οφείλονται στην δράση κυτταροκινών IL-1 TNFa TNFβ

IL-6 που απελευθερώνονται στη θέση της βλάβης και αυξάνουν ή

μειώνουν την σύνθεση πρωτεϊνών στο ήπαρ.

•Απεικόνιση όψιμης φάσης φλεγμονής και ειδικής ανοσολογικής

απάντησης (μεταβολή γ-σφαιρινών).

Η εικόνα της ηλεκτροφόρησης ορού στην οξεία φλεγμονή δεν είναι

ειδική, όμως βοηθάει πολύ όταν υπάρχει μειωμένη λευκοκυτταρική

αντίδραση (χημειοθεραπείες, λευχαιμίες), γιατί μπορεί να προδηλώσει

μια λοίμωξη που δεν μπορεί να βρεθεί από την αύξηση των λευκών.

ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗ Ιmmunofixation (IFX) Έγινε για πρώτη φορά από τους Wilson & Alfonso το 1964 και τελειοποιήθηκε στο 1969 από τους Alper & Johnson.

Είναι συνδυασμός 2 τεχνικών :Ηλεκτροφόρησης και ιζηματινοαντίδρασης δηλ. της ένωσης [Ag-Αb] και σχηματισμού μη διαλυτού ανοσοσυμπλέγματος, πάνω στο gel.

Γίνεται σε δύο φάσεις:α. Διαχωρισμός των πρωτεϊνών με απλή ηλεκτροφόρησηβ. Η προσθήκη μονοδύναμου αντιορού (Αb) έναντι της ανθρώπινης G,A,M και της ελεύθερης και δεσμευμένης ελαφριάς κ και λ αλυσίδας καθηλώνει την ανοσοσφαιρίνη (Ag-ορού) στο σημείο του διαχωρισμού της.

Η ζώνη που αντιστοιχεί στο καθηλωμένο ανοσοσύμπλεγμα [Ag-Ab]

μετά από χρώση γίνεται ορατή.

Η μονοκλωνική ζώνη της πρωτεΐνης, καταλαμβάνει την ίδια

ακριβώς θέση και σχήμα όπως η μονοκλωνική ζώνη στην

ηλεκτροφόρηση αναφοράς (μόνον τότε γίνεται αποδεκτή ως Μ-

πρωτεΐνη).

Με την (IFX) μέθοδο ανιχνεύονται και ταυτοποιούνται μονοκλωνικές

αλλά και δικλωνικές ή ολογοκλωνικές αιμοσφαιρινοπάθειες.

Προβλήματα στην ανοσοκαθήλωση του ορού προκύπτουν κατά

την β΄ φάση της ιζηματινοαντίδρασης λόγω του φαινομένου

προζώνης, τα οποία επιλύονται με τις κατάλληλες αραιώσεις.

 

Η ανοσοκαθήλωση γίνεται για την: 

•Ταυτοποίηση των μονοκλωνικών ανοσοσφαιρινών που βρέθηκαν

στην ηλεκτροφόρηση του ορού (Καθορίζεται ο τύπος της βαρειάς και

ελαφριάς αλύσου).

•Ανίχνευση μικρής ή μεγάλης μονοκλωνικής ανοσοσφαιρίνης που

μεταναστεύει στην περιοχή των α ή β – σφαιρινών στην ηλεκτροφόρηση και

καλύπτεται από τις άλλες πρωτεΐνες που μεταναστεύουν εκεί (α2-

μακροσφαιρίνη, απτοσφαιρίνη, τρανσφερίνη, C3) δηλ. που δεν

ανιχνεύεται με την ηλεκτροφόρηση.

•Ανίχνευση μικρής ποσότητας μονοκλωνικής που καλύπτεται από μια

πολυκλωνική αύξηση των άλλων ανοσοσφαιρινών (γ-περιοχή).

Ηλεκτροφόρηση ισοηλεκτρικού εστιασμού

(ισοηλεκτρική εστίαση)

 

Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται ανάλογα με το ισοηλεκτρικό τους σημείο

(ΡΙ). Όταν βρεθούν στο PH του ισοηλεκτρικού τους σημείου, χάνουν το

φορτίο τους και ακινητοποιούνται.

Στην συσκευή της ηλ/σης με την βοήθεια κατάλληλων αμφολυτών

σχηματίζεται μια βαθμίδωση του ΡΗ μεταξύ ανόδου και καθόδου. Στα

ολιγοκλωνικά Ab σχηματίζουμε μια βαθμίδωση του ΡΗ από (3 έως 9).

Υπό την επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου οι πρωτεΐνες θα μετακινηθούν

και θα εστιαστούν η κάθε μια στο ισοηλεκτρικό της σημείο.

Διαχωρίζονται πρωτεΐνες που διαφέρουν έως 0,02 μονάδες ΡΗ.

ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ ΣΤΟ ΕΝΥ 

Δείκτης IgG = (IgG ΕΝΥΧΑλβ. ΟΡΟΥ): (IgG ΟΡΟΥ Χ Αλβ ΕΝΥ)

Δείκτης IgG < 0.65

Α) Δευτεροπαθής, λόγω αύξησης IgG στο πλάσμα

Β) Διάσπαση αιματεγκεφαλικού φραγμού

Γ) Ενδοθηκική σύνθεση

 

 

ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΟΣΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ ΣΤΟ ΕΝΥ

Παρουσία ολιγοκλωνικών ταινιών στο ΕΝΥ

Η παρουσία ολιγοκλωνικών ταινιών στο ΕΝΥ είναι πιο ευαίσθητος

δείκτης ενδοθηκικής σύνθεσης IgG, από τον δείκτη IgG

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΓΙΑ ΔΙΑΓΝΩΣΗ

Σ.Κ.Π

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΟΛΙΓΟΚΛΩΝΙΚΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ

(ΠΡΟΣΔΙΟΡΊΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΉ ΕΣΤΊΑΣΗ ΚΑΙ

ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗ)

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΔΕΙΚΤΗ IgG

IgG ΕΝΥ / IgG ΟΡΟΥ ΑΛΒΟΥΜΙΝΗ ΕΝΥ / ΑΛΒΟΥΜΙΝΗ ΟΡΟΥ

ΔΕΙΚΤΗΣ ΑΛΒΟΥΜΙΝΗΣ

ΑΛΒΟΥΜΙΝΗ ΕΝΥ / ΑΛΒΟΥΜΙΝΗ ΟΡΟΥ

(ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΑΙΜΑΤΕΓΚΕΦΑΛΙΚΟΥ ΦΡΑΓΜΟΥ)

Oλιγοκλωνικές ζώνες στο ΕΝΥ

Νόσος %Σκλήρυνση κατα πλάκας 97Υποξ. Σκληρυντική Πανεγκεφαλίτις 100Νευροσύφιλη 95Νευρο AIDS 80Νόσος Lyme 80ΣΕΛ 50Behcet 20Σαρκοείδωση 40Αταξία - Τηλαγγειεκτασία 60Αδρενολευκοδυστροφία 100Οξεία εγκεφαλίτις 5Οξεία μηνιγγίτις 5Νεόπλασμα εγκεφάλου 5

ΕΝΥ Ορός ΕΝΥ Ορός ΕΝΥ Ορός ΕΝΥ Ορός

1 32 4