22

4 Hasil dan Pembahasan

Danau Kakaban menyimpan berbagai organisme yang langka dan unik. Danau ini terbentuk

dari air laut yang terperangkap oleh terumbu karang di sekelilingnya akibat adanya aktivitas

tektonik. Dengan demikian, diharapkan α-amilase dari isolat bakteri Danau Kakaban

mempunyai karakter yang unik.

Pada penelitian ini dilakukan penapisan aktivitas α-amilase terhadap 40 isolat bakteri dari

Danau Kakaban. Selanjutnya dilakukan penapisan aktivitas aktivitas α-amilase pendegradasi

pati kentang. Dari hasil penapisan tersebut dipilih salah satu isolat untuk dilakukan produksi,

isolasi dan karakterisasi aktivitas α-amilase pendegradasi pati kentang.

4.1 Penapisan Aktivitas α-Amilase dengan Red Amylopectine

Red amylopectine merupakan hasil pewarnaan amilopektin dengan penambahan cibacron

brilliant red 3b-a. Cibacron brilliant red 3b-a berinteraksi secara kovalen pada amilopektin

dengan panjang residu D-glukosa tertentu.

Hasil penapisan empat puluh isolat bakteri dari Danau Kakaban dengan red amylopectine

diperoleh enam isolat bakteri yang menunjukkan aktivitas positif terhadap α-amilase.

Keenam isolat bakteri tersebut adalah KBU 2-3L, KBU 2-FL, KBU 1-6L, KBH 1-7L, KBH

1-3L, dan KBU 2-1L.

Aktivitas positif terhadap α-amilase ditunjukkan dengan adanya daerah bening dengan latar

belakang merah (Gambar 4. 1). Daerah bening tersebut terjadi akibat adanya degradasi red

amylopectine oleh aktivitas α-amilase. Amilopektin yang terdapat pada red amylopectine

terdegradasi menjadi molekul yang lebih sederhana, misalnya oligosakarida. Molekul produk

dari degradasi red amylopectine tidak berwarna. Hal ini disebabkan interaksi cibacron

brilliant red 3b-a spesifik terhadap amilopektin pada panjang residu D-glukosa tertentu.

23

Gambar 4. 1 Hasil penapisan aktivitas α-amilase dengan red amylopectin

Enam isolat bakteri dari Danau Kakaban yang menunjukkan aktivitas -amilase. 1.

KBU 2-3L, 2. KBU 2-FL, 3. KBU 1-6L, 4. KBH 1-7L, 5. KBH 1-3L, dan 6. KBU 2-1L.

Penapisan aktivitas α-amilase dengan red amylopectine memiliki banyak keuntungan. Salah

satu keuntungan pemakaian red amylopectin ini adalah proses penapisan dilakukan tetap

mempertahankan kultur agar tetap hidup. Teknik ini sangat berbeda dengan teknik degradasi

kompleks pati-iodin yang sering dipakai. Penapisan aktivitas α-amilase dengan teknik

degradasi kompleks pati-iodin dilakukan dengan ’membunuh’ kultur pada penambahan

larutan KI/I2. Dengan demikian, pemakaian red amylopectine dapat digunakan untuk

penapisan aktivitas α-amilase secara berkesinambungan. Kultur tetap hidup pada media

pertumbuhan, sehingga dapat diamati profil aktivitas α-amilase selama masa pertumbuhan

bakteri.

Gambar 4. 2 Aktivitas α-amilase isolat KBH 1-7L selama tiga hari masa pertumbuhan

Aktivitas α-amilase pada hari ke-1 (A), hari ke-2 (B) dan hari ke-3 (C).

Pada penelitian ini juga dilakukan pengamatan aktivitas α-amilase dengan red amylopectine

selama pertumbuhan isolat bakteri. Pengamatan aktivitas α-amilase tersebut dilakukan

selama tiga hari. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa adanya warna terang dengan

24

latar belakang merah. Berdasarkan Gambar 4.2, warna terang tersebut semakin melebar

selama masa pertumbuhan isolat bakteri. Hal ini menunjukkan bahwa sekresi α-amilase terus

meningkat selama masa pertumbuhan isolat bakteri.

4.2 Penapisan Aktivitas α-Amilase Pendegradasi Pati Kentang

Isolat bakteri yang menunjukkan aktivitas α-amilase terhadap red amylopectine ditumbuhkan

pada media pertumbuhan yang mengandung 1% pati kentang terlarut. Hasil penapisan

dengan penambahan larutan KI/I2 pada media pertumbuhan diperoleh empat isolat yang

menunjukkan aktivitas positif terhadap α-amilase. Aktivitas positif tersebut ditunjukkan

dengan adanya warna terang dengan latar belakang biru/ungu. Keempat isolat bakteri

tersebut adalah KBU 1-6L, KBU 2-3L, KBU 2-FL dan KBH 1-7L.

Gambar 4. 3 Hasil penapisan α-amilase pendegradasi pati kentang

Empat isolat bakteri Danau Kakaban yang memunujukkan aktivitas α-amilase

pendegradasi pati kentang. 1. KBU 1-6L, 2. KBU 2-3L, 3. KBU 2-FL,

dan 4. KBH 1-7L

Berdasarkan Gambar 4. 3, terdapat empat isolat yang menunjukkan aktivitas α-amilase

pendegradasi pati kentang. Hasil penapisan tersebut menunjukkan adanya perbedaan pada

hasil penapisan aktivitas α-amilase dengan red amylopectine. Perbedaan tersebut

menunjukkan bahwa isolat KBH 1-3L dan KBU 2-1L tidak mampu mendegradasi pati

kentang. Hal ini dapat dijelaskan dengan melihat struktur dan komposisi pati kentang. Pati

kentang tersusun dari amilosa dan amilopektin, sedangkan red amylopectine hanya tersusun

dari amilopektin. Adanya gugus fosfat yang terdapat pada pati kentang menyababkan pati

25

kentang sulit terdegradasi. Selain itu, komponen lain yang terkandung dalam pati kentang

tersebut menghambat degradasi pati oleh kedua isolat, KBU2-1L dan KBL 1-3L.

Gambar 4. 4 Hasil penapisan aktivitas α-amilase pendegradasi butir pati kentang

isolat KBU 1-6L

A. Pati kentang mentah, B. Pati kentang terlarut

Salah satu isolat yang menunjukkan aktivitas α-amilase pendegradasi pati kentang juga

dilakukan penapisan α-amilase pendegradasi butir pati kentang. Isolat yang diteliti pada

penapisan ini adalah KBU 1-6L. Hasil penapisan α-amilase pendegradasi butir pati kentang

menunjukkan bahwa isolat KBU 1-6L mampu mendegradasi butir pati kentang. Dengan

demikian, α-amilase dari isolat KBU 1-6L dapat digunakan untuk mendegradasi butir pati

kentang, sehingga tidak perlu dilakukan gelatinisasi dalam proses pengolahan pati sebagai

bahan baku industri.

4.3 Produksi α-Amilase

Pada tahap awal, dilakukan pemilihan jenis pati sebagai penginduksi α-amilase. Pemilihan

jenis pati penginduksi dilakukan dengan produksi 25 mL enzim dengan konsentrasi pati

penginduksi sebesar 0,05%. Enzim ekstraseluler pada supernatan diuji aktivitas α-amilase

dengan Metode Fuwa. Dari keempat jenis pati yang dicoba (beras, jagung, sagu dan

singkong), aktivitas α-amilase paling besar terdapat pada α-amilase yang diinduksi dengan

pati jagung. Dengan demikian, jenis pati yang baik digunakan untuk penginduksi α-amilase

tersebut adalah pati jagung. Pada penelitian ini jumlah pati jagung sangat terbatas, sehingga

dipilih pati beras sebagai penginduksi dalam produksi α-amilase pada penelitian ini.

26

Tahap selanjutnya dilakukan produksi α-amilase dari isolat KBU 1-6L sebanyak 200 mL.

Enzim α-amilase yang diperoleh dari supernatan hasil sentrifugasi media pertumbuhan

dianalisis dengan elektroforesis pada gel SDS-PAGE 10%.

Gambar 4. 5 Zimograf (A) dan SDS-PAGE (B) dari isolat KBU 1-6L

Analisis zimogram yang dilakukan pada penelitian ini menunjukkan bahwa isolat KBU 1-6L

diduga memiliki satu jenis α-amilase. Hal ini ditunjukkan dengan munculnya satu pita pada

gel Native-PAGE hasil analisis zimogram. Satu pita tersebut dimungkinkan pada protein

yang dihasilkan isolat KBU 1-6L terdapat satu jenis α-amilase.

Pewarnaan gel SDS-PAGE dengan coomasie brilliant blue dilakukan untuk mengetahui

berat molekul α-amilase dari isolat KBU 1-6L. Berdasarkan Gambar 4. 1(B), jumlah pita

yang muncul menunjukkan bahwa masih terdapat protein lain selain α-amilase dari isolat

KBU 1-6L. Hasil pita yang diperoleh tidak begitu jelas terlihat. Hal ini disebabkan ekspresi

α-amilase yang dilakukan kurang optimal. Aktivitas α-amilase hasil fraksinasi 0-80% adalah

169, 17 U/mL dengan kadar protein total sebesar 38, 6 mg/mL. Satu unit aktivitas

didefinisikan sebagai jumlah pati yang terdegradasi dengan penurunan absorbansi 10%

setiap 1 mL enzim.

27

4.4 Pengaruh pH terhadap Aktivitas α-Amilase

Perubahan pH sangat mempengaruhi aktivitas α-amilase. Pengujian pengaruh pH terhadap

aktivitas α-amilase yang dihasilkan oleh isolat KBU 1-6L dilakukan dengan uji DNS. α-

Amilase yang digunakan pada pengujian ini adalah α-amilase hasil fraksinasi amonium sulfat

0-80%.

Pada reaksi katalisis oleh α-amilase, kondisi pH yang terlalu rendah dapat menyebabkan

proses protonasi oleh pusat aktif. Begitu juga sebaliknya, pada pH yang terlalu tinggi

deprotonasi hidrogen donor. Dengan demikian, pengaruh pH terhadap aktivitas α-amilase

bergantung pada pKa kedua sisi aktif enzim tersebut [Nielsen et al., 2001]. Di samping itu,

kondisi pH berpengaruh pada struktur tersier dari protein (α-amilase). Struktur protein

ditentukan oleh kondisi asam dan basa yang mempengaruhi ionisasi rantai samping. Ketika

suatu protein berada dalam kondisi asam dan basa, residu asam amino penyusunnya

mengalami ionisasi. Ionisasi tersebut bergantung pada tetapan keasaman (pKa) dari masing-

masing residu asam amino penyusun protein.

Gambar 4. 6 Kurva aktivitas α-amilase terhadap variasi pH

Berdasarkan Gambar 4. 6, aktivitas α-amilase dari isolat KBU 1-6L cenderung meningkat

seiring dengan kenaikan pH. Namun, terjadi penurunan aktivitas α-amilase dari isolat KBU

1-6L setelah mencapai pH 7,0. Dengan demikian, pengujian pengaruh pH tersebut

menunjukkan bahwa aktivitas α-amilase yang dihasilkan isolat KBU 1-6L optimum pada pH

7,0. Satu unit aktivitas didefinisikan sebagai jumlah glukosa (mM) yang dihasilkan setiap 1

mL enzim.

28

4.5 Pengaruh Konsentrasi Garam terhadap Aktivitas α-Amilase

α-Amilase dari bakteri laut umumnya dipengaruhi oleh konsentrasi garam lingkungannya.

Garam-garam yang terlarut diduga mampu mengubah konformasi struktur tersier dari α-

amilase. Selain itu, konsentrasi garam yang sangat tinggi memungkinkan terjadinya

pengendapan α-amilase. Pengendapan protein semacam ini sering dikenal dengan salting

out. Garam-garam yang terlarut akan menurunkan kelarutan α-amilase. Hal ini disebabkan

adanya kompetisi hidrasi antara α-amilase dengan garam-gram yang terlarut. Pada

kenyataanya, bakteri laut mampu bertahan hidup dengan kondisi lingkungan dengan

menghasilkan enzim ektraseluler, misalnya α-amilase. Dengan demikian, α-amilase bakteri

laut diduga mempunyai sifat yang unik terhadap pengaruh konsentrasi garam di sekitarnya.

Gambar 4. 7 Kurva aktivitas α-amilase terhadap variasi konsentrasi garam

Pengaruh konsentrasi garam terhadap aktivitas α-amilase dari isolat KBU 1-6L dilakukan

dengan metode Fuwa. Pada pengujian ini digunakan garam NaCl dan CaCl2. Berdasarkan

Gambar 4. 7, terjadi kenaikan aktivitas α-amilase dari isolat KBU 1-6L pada penambahan α-

amilase sebesar 5,69 % dari aktivitas awal (tanpa penambahan NaCl). Kenaikan aktivitas α-

amilase juga terjadi pada penambahan 50 mM CaCl2. Pada penambahan 50 mM CaCl2

aktivitas α-amilase dari isolat KBU 1-6L meningkat sebesar 13,47 %.

Kenaikan α-amilase dari isolat KBU 1-6L pada pengujian ini disebabkan adanya kestabilan

konformasi struktur tersier dari α-amilase. Penambahan ion Na+ dan Ca

2+ menambah

kestabilan struktur tersier α-amilase. Hal ini terjadi karena α-amilase merupakan

metaloenzim, yaitu enzim yang mengikat ion logam. Kedua pengujian tersebut menunjukkan

29

pengaruh yang berbeda antara garam NaCl dan CaCl2. Hal ini disebabkan oleh perbedaan

jumlah ion yang dihasilkan kedua garam tersebut. Pada pelarutan NaCl diperoleh dua ion

(Na+ dan Cl

-), sedangkan pelarutan CaCl2 diperoleh tiga ion (Ca

2+ dan 2 Cl

-). Dengan

demikian, efek yang diberikan garam CaCl2 lebih besar daripada NaCl. Namun kestabilan

konformasi struktur tersier akan terganggu dengan semakin banyaknya ion-ion yang terlarut.

Pada pengujian ini, terjadi penurunan aktivitas α-amilase dari isolat KBU 1-6L setelah

penambahan 500 mM NaCl. Penambahan 500 mM NaCl mengakibatkan penurunan aktivitas

α-amilase sebesar 46,96 %, sedangkan aktivitas α-amilase mengalami penurunan sebesar

56,23 % pada penambahan 500 mM CaCl2.

4.6 Identifikasi Isolat Danau Kakaban

Identifikasi isolat bakteri Danau Kakaban yang mempunyai aktivitas α-amilase dilakukan

dengan pendekatan molekular. Hasil penentuan kekerabatan dengan program BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.html) menunjukkan bahwa isolat KBU 1-6L merupakan

Bacillus sp. Penentuan kekerabatan juga dilakukan terhadap isolat KBU 2-FL. Hasil

penentuan kekerabatan tersebut menunjukkan bahwa isolat KBU 2-FL merupakan

Pseudoalteromonas sp. dengan identitas maksimum sebesar 99 %.

Tabel 4. 1 Hasil penentuan kekerabatan dari isolat KBU 1-6L

Nomor akses Deskripsi Identitas maksimum (%)

EU821340.1 Bacillus sp. LM4 87

FJ641034.1 Bacillus firmus strain IMAUB 1032 87

FJ607048.1 Bacillus sp. 44-3 87

FJ535575.1 Bacillus sp. DCR_A68 87

EU685820.1 Bacillus sp. PK-1 87

EU685816.1 Bacillus sp. PK-14 87

EF377303.1 Bacillus sp. CCBAU 10727 87

EF032672.1 Bacillus firmus strain AU9 87

DQ084542,1 Bacillus sp. GD1204 87

AY372923.1 Brevibacillus sp. JS3 87

30

Hasil analisis morfologi dan fisiologi menunjukkan bahwa isolat KBU1-6L merupakan

Bacillus epiphytus.

Tabel 4. 2 Analisis morfologi dan fisiologi dari isolat KBU 1-6L

Karakter Isolat Isolat KBU 1-6L

Makroskopis koloni sirkular, filamentous, opaque, raised, tidak memiliki pigmen

Mikroskopis sel Sel berbentuk batang, gram positif, menghasilkan endospora

Motilitas Motil

Uji biokimia

a. Hidrolisis pati

b. Hidrolisis lemak

c. Hidrolisis kasein

d. Hidrolisis gelatin

e. Fermentasi glukosa

f. Fermentasi sukrosa

g. Fermentasi laktosa

h. Produksi H2S

i. Produksi indol

j. Produksi urease

k. Produksi katalase

l. Uji metil merah

m. Uji Voges-Proskauer

n. Uji TSI

o. Uji Simmon’s sitrat

p. Reduksi nitrat

Positif

Negatif

Positif

Positif

Positif

Negatif

Negatif

Negatif

Negatif

Negatif

Positif

Positif

Negatif

Positif

Negatif

Positif

KESIMPULAN Bacillus epiphytus