Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

ΦAPMAKEYTIKHΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

ΔIAΛEΞEIΣ1-3

EIΣAΓΩΓHΣTHNΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

ΚΑΙΣΤΗΝTEXNOΛOΓIATOYΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥDNA

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

ΗΠΡΟΟΔΟΣΤΗΣΜΟΡΙΑΚΗΣΒΙΟΛΟΓΙΑΣΕΔΩΣΕΩΘΗΣΗΚΑΙΣΤΗΝΑΝΑΠΤΥΞΗΤΗΣΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

HΜοριακήΒιολογίαπουέχειωςαντικείμενοτηνανάλυσητηςδομήςκαιτηςέκφρασηςτουγενετικούυλικούανέπτυξεμιάσειράεργαλείααπαραίτηταγιατηνανάπτυξηκαιτηςΦαρμακευτικηςΒιοτεχνολογίας,όπωςτιςδυνατότητες:

✔  Nα«κόβουμε»τοDNAσεμικρότερατμήματα✔  Να«αρχειοθετούμε»τοDNAστοεργαστήριο✔  NααναλύουμετηνπρωτοταγήδομήτουDNA✔  Nαμετράμετηνέκφρασητωνγονιδίων✔  Nαεκφράζουμεταγονίδιασεετερόλογασυστήματαείτεγιανα

μελετήσουμετηλειτουργικότητάτουςήγιαναπαράγουμεμεγάλεςποσότητεςτωνπροϊόντωντους

✔  Ναενισχύουμεγενετικόυλικόαπόαπειροελάχιστεςποσότητες

ΕισαγωγήDNAσεευκαρυωτικάκύτταρααλλάζειτονφαινότυποτους

ΕφαρμογήστηΦαρμακευτικήΒιοτεχνολογία;G

enes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Παραγωγή Mεγάλων Ποσοτήτων Πρωτεϊνών µε Kλωνοποίηση

Φορείς Έκφρασης

DNAΜΠΟΡΕΙΝΑΑΠΟΜΟΝΩΘΕΙΕΙΤΕΑΠΟΚΥΤΤΑΡΑΗΑΠΟΙΣΤΟΥΣΠΡΟΚΕΙΜΕΝΟΥ

ΝΑΜΕΛΕΤΗΘΕΙ■  ΠΡΟΣΟΧΗ:

ΤοDNAείναιέναΤΕΡΑΣΤΙΟμόριο(ακόμηκαιτοDNAτωνσχετικάμικρώνβακτηριακώνγονιδιωμάτωνείναιαρκετάμεγάλο)πουείναιεξαιρετικάευαίσθητοστημηχανικήκαταπόνηση,δηλαδήμπορείπολύεύκολανα«σπάσει»σεμικρότεραθραύσματακατάτηδιάρκειατωνεργαστηριακώνχειρισμών.

ΕΠΟΜΕΝΩΣ

ü Το«κόψιμο»τουDNAσεμικρότεραθεραύσματαμπορείναβελτιώσειτημηχανικήτουσταθερότητακαινααπλοποιήσειτοχειρισμότου

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

ΠΩΣMΠOPOYMENA«KOΨOYME»TODNAΣEMIKPOTEPAΘPAYΣMATA;

METHXPHΣHEIΔIKΩNENZYMΩN

✍ YΠAPXOYNΠPOΫΠOΘEΣEIΣ;

✔ NAI,TAENZYMAAYTAΘAΠPEΠEINAΔIAΣΠOYNTODNAΠANTAΣTIΣIΔIEΣAΛΛHΛOYXIEΣOIOΠOIEΣEINAIEKTΩN

ΠPOTEPΩNΓNΩΣTEΣ

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

ENΔONOYKΛEAΣEΣΠEPIOPIΣMOY

Oιενδονουκλεάσεςπεριορισμούείναιένζυματαοποίααναγνωρίζουνσυγκεκριμένες

παλινδρομικέςαλληλουχίεςτουDNAκαιτιςδιασπούνπάνταστοίδιοσημείο.Μπορύνναθεωρηθούνσαν«μοριακάψαλίδια»που

κόβουντοDNA

Παραδείγματαστιςεπόμενεςδιαφάνειες

ΤΙΕΙΝΑΙΟΙENΔONOYKΛEAΣEΣΠEPIOPIΣMOY;

Οι ενδονουκλεάσες περιορισµού είναι ενδονουκλεάσες οι οποίες αναγνωρίζουν συγκεκριµένες παλινδροµικές αλληλουχίες στο DNA, το οποίο διασπούν πάντα στις

ίδιες προκαθορισµένες θεσεις.

Θαδείξουμεμερικάπαραδείγματαστιςεπόμενεςδύοδιαφάνειες

ΤΕΣΣΕΡΙΣ�ΔΗΜΟΦΙΛΕΙΣ��ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΩΝΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

EcoRI

HindIII

AluI

NotI

PstI

θέσηδιάσπασης Σακχαροφωσφορικόςσκελετός

ΑΠΟΠΟΥΠΡΟΕΡΧΟΝΤΑΙΟΙΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ;

✔ Οι ενδονουκλεάσες περιορισµού αποµονώθηκαν αρχικά από βακτήρια. Είναι συστατικά ενός

µηχανισµού άµυνας των βακτηρίων ενάντια σε εισβολή ξένου γενετικού υλικού, π.χ. από

µόλυνση µε κάποιον βακτηριοφάγο.

✄ Γιατί οι ενδονουκλεάσες περιορισµού δεν διασπούν και το DNA του βακτηρίου που τα

παράγει;

ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΗΧΗΜΙΚΗΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΤΟΥΒΑΚΤΗΡΙΑΚΟΥDNAΤΟΠΡΟΣΤΑΤΕΥΕΙΑΠΟ

ΠΕΨΗΑΠΟΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

ΜεθυλιωμένοDNA

ΜημεθυλιωμένοDNA

ΗEcoRIδεμπορείναδιασπάσειτομεθυλιωμένοDNA

ΜημεθυλιωμένοDNA

ΔιάσπασητουDNA

«κολλώδη»άκρα

ΕνδονουκλεάσηπεριορισμούEcoRI

EcoRIμεθυλάση

ΕνδονουκλεάσηπεριορισμούEcoRI

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗ ΚΟΠΗ ΤΙ;

Πως αναλύεται το DNA µετά την πέψη του µε ενδονουκλεάσες περιορισµού;

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

HΛEKTPOΦOPHTIKHANAΛYΣHTΩNΘPAYΣMATΩNTOYDNA

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

APXEΣHΛEKTPOΦOPHTIKHΣANAΛYΣHΣ

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

KΛΩNOΠOIHΣH H «αρχειοθέτηση» του DNA

στο εργαστήριο

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Φορείς κλωνοποίησης - Tα πλασµίδια

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

H Διαδικασία της Kλωνοποίησης

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Πολλαπλασιασµός των Aντιγράφων ενός Γονιδίου

µε Kλωνοποίηση

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Aπαραίτητες Iδιότητες ενός Πλασµιδιακού Φορέα

Kλωνοποίησης1. Aλληλουχίες έναρξης αντιγραφής (ORI) 2. Γονίδιο που επιτρέπει εύκολη επιλογή

(π.χ.Aντίσταση σε αντιβιοτικό) 3. Aλληλουχίες που επιτρέπουν κοπή από αρκετές ενδονουκλεάσες περιορισµού (polylinker)

4. ( Έναν υποκινητή που να επιτρέπει ρυθµιζόµενη έκφραση)

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Δηµιουργία µιας Γενωµικής Bιβλιοθήκης

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Γενωµικές & cDNA Bιβλιοθήκες

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Διαδικασία Παρασκευής cDNA

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Χωρητικότητα κοινών φορέων κλωνοποίησης

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Bιβλιοθήκες DNA µπορούν να Kατασκευασθούν και σε

Φάγους

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Τα βασικά βήµατα της κλωνοποίησης DNA σε πλασµίδιο

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Συρραφή ΘραυσµάτωνDNA µε Διαδοχική Kλωνοποίηση

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Προσανατολισµένη κλωνοποίηση του δίκλωνου cDNA σε πλασµιδιακό φορέα

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Διάκριση µπλε-λευκών αποικιών για τον εντοπισµό ανασυνδυασµένων φορέων

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

ΠΩΣ MΠOPOYME NA TAYTOΠOIHΣOYME

AΠOIKIEΣ ΠOY ΠEPIEXOYN ANAΣYNΔYAΣMENOYΣ ΦOPEIΣ KΛΩNOΠOIHΣHΣ

AΠO AYTEΣ ΠOY ΠEPIEXOYN «AΔEIOYΣ»

ΦOPEIΣ;

Τακοσμίδιαείναιπλασμιδιακοίφορείςκλωνοποίησηςπουπεριέχουνμίαήδύοθέσεις�cos�.(Ηθέσηcosείναιμίααλληλουχίαπερίπου200bpπουπροέρχεταιαπότονφάγολκαιηοποίαείναιαπαραίτητηγιατο«πακετάρισμα»τουDNAσεσωματίδιαφάγου).ΠωςκλωνοποιούμετοDNAσεένακοσμίδιο;1.Χρησιμοποιούμετηθέσηπολλαπλήςκλωνοποίησης(polylinker)γιαναενθέσουμε

θραύσματαDNAπουέχουνδημιουργηθείμεπέψημεενδονουκλεάσεςπεριορισμού.

2.ΤοDNAπακετάρεταισεφάγους,ακριβώςόπωςκαιτοDNAτουίδιουτουφάγου.3.Τακοσμίδιαπολλαπλασιάζονταιμέσασταβακτηριακάκύτταραόπωςκαιτα

πλασμίδια(δηλ.φέρουνγονίδιαπουπροσδίδουνστακύτταρααντίστασησεαντιβιοτικό).

4.Τακοσμίδιααπομονώνονταιακριβώςόπωςκαιταπλασμίδια.Τοπλεονέκτηματουςείναιότιμπορούννα«πακετάρουν»μέσαστην«κεφαλή»του

φάγουμεγαλύτερασεμέγεθοςθραύσματαDNA(40-55kbofDNA,δηλ.Σεκοσμίδιαμεγέθους~5kbμπορούμεναεισάγουμεενθέματα33-50kb)).

Kοσµίδια

•  Τοκοσμίδιο«κόβεται»μετηνενδονουκλεάσηBglIIσεθέσηκοντάστηθέσηcos.•  ΤογενωμικόDNA«κόβεται»μετηνενδονουκλεάσηSau3A(μερικήυδρόλυση),πουδημιουργεί

συμβατά«κολλώδη»άκραμετηνBglII.Ταθραύσματατακατεργαζόμαστεμεαλκαλικήφωσφατάση(ΓΙΑΤΙ;)

•  ΤοDNAδότηςσυνδέεταιμετοDNAδέκτη(κοσμίδιο)μετηνDNAλιγάσηδημιουργώνταςενσειράσυνδέσεις.ΤοDNAκαθαρίζεταιμεβάσητομέγεθος.

•  ΤοDNA«πακετάρεται»σεφάγους.

Kλωνοποίηση σε κοσµίδια - Παράδειγµα

Το DNA των κοσµιδίων «πακετάρεται» σε γραµµική µορφή

Κοσµίδια - ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

YBPIΔIΣMOΣ NOYKΛEΪNIKΩN OΞEΩN

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Tαυτοποίηση Aποικιών που Περιέχουν Θετικούς

Kλώνους µε Yβριδισµό -1

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Tαυτοποίηση Aποικιών που Περιέχουν Θετικούς

Kλώνους µε Yβριδισµό - 2

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

ΠΩΣ MΠOPOYME NA EΠITYXOYME THN

ANAΛYΣH/TAYTOΠOIHΣH ΣYΓKEKPIMENΩN ΘPAYΣMATΩN DNA

(πριν την κλωνοποίηση ή και µετά);

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Στύπωµα κατά Southern: ανάλυση DNA µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα, στύπωµα και υβριδοποίηση - 1

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Στύπωµα κατά Southern:

ανάλυση DNA µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα, στύπωµα και

υβριδοποίηση - 2

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

ANIXNEYΣH THΣ METAΛΛAΞHΣ ΠOY ΠPOKAΛEI ΔPEΠANOKYTTAPIKH

ANAIMIA ΜΕ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟ ΝΟΥΚΛΕΪΝΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Διαδικασία αλληλούχισης DNA µε τη µέθοδο του Sanger που βασίζεται στη

χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Διαδικασία αλληλούχισης DNA µε τη µέθοδο του Sanger που βασίζεται στη

χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

TI KANOYME OTAN TO ΔIAΘEΣIMO ΓENETIKO

YΛIKO ΔEN EINAI ΔIAΘEΣIMO ΣE ΠOΣOTHTEΣ

IKANEΣ ΠPOΣ ANAΛYΣH; ΦTIAXNOYME ΠEPIΣΣOTEPO ΜΕ ΤΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ

(PCR)

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

PCR – Η ενίσχυση του DNA in vitro

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Ο κύκλος της τεχνικής PCR

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την

PCR - 1

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την PCR - 2

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την PCR - 3

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Μοριακή διαγνωστική µε PCR στην ιατροδικαστική

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Aνίχνευση HIV µε RT-PCR

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Xρήση RT-PCR µε πολλαπλούς εκκινητές στη µοριακή διαγνωστική µιάς

ιογενούς κτηνιατρικής νόσου

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

H PCR στην κλωνοποιηση DNA και RNA

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Χρήση της PCR πραγµατικού χρόνου για τη µέτρηση της ποσότητας των

µορίων-στόχων που περιέχει ένα δείγµα

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Μοριακοί φάροι για την PCR πραγµατικού χρόνου

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Παραγωγή Mεγάλων Ποσοτήτων Πρωτεϊνών µε Kλωνοποίηση

Φορείς Έκφρασης

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Kατευθυνόµενη Mεταλλαξιγένεση

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Eισαγωγή Kατευθυνόµενων Tροποποιήσεων στο

Γενετικό Yλικό

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

Kατασκευή Διαγονιδιακών Ποντικών