ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΕΝΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ

-ΑΠΟΠΤΩΣΗ-

Ι. Σ. Παπασιδέρη

ΑΘΗΝΑ 2005

H ΒΑΣΙΛΙΣΣΑ ΤΗΣ

ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ

Julie Newdell, Artist – Scientist

Bid

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΕΝΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ - AΠΟΠΤΩΣΗ 17.1. Κυτταρική μορφολογία της απόπτωσης 17.2. Ο ρόλος των κασπασών στον αποπτωτικό θάνατο 17.3. Ενδοκυτταρική μετακίνηση πρωτεϊνών κατά την απόπτωση

17.4. Η αντι-αποπτωτική δραστηριότητα της πρωτεΐνης Bcl-2 17.5. Η συμμετοχή του κυτοχρώματος-c στην ενεργοποίηση των

κασπασών και στη συγκρότηση του «αποπτωσώματος» 17.6. Ο καθοριστικός ρόλος των «νευροτροφινών» στην απόπτωση

17.7. Απορρύθμιση των αποπτωτικών μηχανισμών σε

μεταλλαγμένους και γενετικά τροποποιημένους πρότυπους οργανισμούς

Βιβλιογραφία Παράρτημα: Στερεοσκοπικές εικόνες βιομορίων κυτταρικής απόπτωσης

Απόπτωση είναι μια γενετικά καθορισμένη και ενεργητική διαδικασία που συμμετέχει

καταλυτικά στην ομαλή ανάπτυξη και λειτουργία ενός μεγάλου

αριθμού ιστών

Εξελικτικά συντηρημένη λειτουργία

Κυτταρική μορφολογία της απόπτωσης

•Συμπύκνωση της χρωματίνης•Θρυμματισμός του πυρηνικού DNA•Δημιουργία οπών στις μεμβράνες των μιτοχονδρίων και της κυτταρικής μεμβράνης•Σχηματισμός φαγοσωμάτων

ΟΙ ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ – ΝΕΚΡΩΣΗΣ

Απόπτωση Νέκρωση

Κατανάλωση ATP + -Ακεραιότητα Ιστού + - (Λύση)

Κατακερματισμός DNA + -

Κυτταρική Μορφολογία

Αποπτωτικά σωμάτια Ρήξη

Οργανίδια Άθικτα Διογκωμένα

Φλεγμονή - +Φαγοκυττάρωση + - (Λύση)

ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ HeLa ΣΕ ΦΑΣΗ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΥ ΘΑΝΑΤΟΥ

ΙΝΟΒΛΑΣΤΗΣ ΣΕ ΦΑΣΗ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ:

(Α) ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΑ ΣΩΜΑΤΙΑ

(Β) ΣΥΜΠΥΚΝΩΣΗ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ

(Γ) ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΣΗ

(Δ) ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΕΣ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ

HeLa ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕΙΡΕΣ ΣΕ ΦΑΣΗ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ (ΑΚΤΙΝΟΜΥΚΙΝΗ-D)

REAL-TIME EVENTS OF CELL DEATH APOPTOSIS

Α Β Γ

ΑΠΟΠΤΩΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΩΜΑΤΙΚΗΣ ΣΕΙΡΑΣ C.elegans:

(Α) ΑΛΛΟΙΩΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΣΧΗΜΑΤΟΣ

(Β) ΣΥΜΠΥΚΝΩΣΗ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ (Hoechst 33342)

(Γ) ΕΚΛΕΚΤΙΚΗ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ ΠΟΡΤΟΚΑΛΙ ΤΗΣ ΑΚΡΙΔΙΝΗΣ

A

B Δ

Γ

ΑΣΥΓΧΡΟΝΗ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΑ ΡΥΘΜΙΖΟΜΕΝΗ ΣΥΜΠΥΚΝΩΣΗ ΠΥΡΗΝΩΝ ΤΡΟΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ

ΩΟΓΕΝΕΣΗ ΤΟΥ ΕΝΤΟΜΟΥ Drosophila melanogaster. (Α) ΣΤΑΔΙΟ 10. (Β) ΣΤΑΔΙΟ 11. (Γ) ΣΤΑΔΙΟ 12. (Δ) ΣΤΑΔΙΟ 13.

Γ

Α Β

Δ

ΣΤΕ

ΙΣΤΟΕΙΔΙΚΟΣ ΘΡΥΜΜΑΤΙΣΜΟΣ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ DNA (ΜΕΘΟΔΟΣ TUNEL) ΑΝΑΠΤΥΣΣΟΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΑΔΙΩΝ 12 – 14, ΚΑΤΑ ΤΗΝ

ΩΟΓΕΝΕΣΗ ΤΟΥ ΕΝΤΟΜΟΥ Drosophila melanogaster:

(Α) ΣΤΑΔΙΟ 12Α

(Β) ΣΤΑΔΙΟ 12Γ

(Γ) ΣΤΑΔΙΟ 13 (Πρώϊμο)

(Δ) ΣΤΑΔΙΟ 13 (Μέσο)

(Ε) ΣΤΑΔΙΟ 13 (Όψιμο)

(Ζ) ΣΤΑΔΙΟ 14

Η ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ CAD ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΤΟΝ ΘΡΥΜΜΑΤΙΣΜΟ ΤΟΥ

ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ DNA

Bax

CAD

ΝΟΥΚΛΕΟΣΩΜΑ

ΘΡΥΜΜΑΤΙΣΜΟΣ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ DNA

ΑΝΑΔΙΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΣΚΕΛΕΤΟΥ ΤΗΣ ΑΚΤΙΝΗΣ (ΧΡΩΣΗ ΦΛΟΥΟΡΕΣΚΙΝΗΣ: FITC) ΚΑΤA ΤΟΝ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΑ

ΡΥΘΜΙΖΟΜΕΝΟ, ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟ ΘΑΝΑΤΟ ΤΡΟΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΕΝΤΟΜΟΥ Drosophila melanogaster. (Α) ΣΤΑΔΙΟ 10. (Β) ΣΤΑΔΙΟ 11. (Γ) ΣΤΑΔΙΟ 12Α. (Δ) ΣΤΑΔΙΟ 12Β. (Ε) ΣΤΑΔΙΟ 12Γ. (ΣΤ) 13.

A

ΣΤ Ε

Δ Γ

B

ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΩΝ ΚΥΣΤΙΔΙΩΝ ΤΡΟΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΑΔΙΟΥ 13, ΣΕ ΦΑΣΗ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ,

ΚΑΙ ΕΠΑΚΟΛΟΥΘΗ ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΣΗ ΑΥΤΩΝ ΑΠO ΓΕΙΤΟΝΙΚΑ ΘΥΛΑΚΟΚΥΤΤΑΡΑ.

M 0 1 3 5 7 16

ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΘΡΥΜΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ DNA ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΟΥ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΥ

ΕΡΕΘΙΣΜΑΤΟΣ

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ ΘΡΥΜΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ DNA ΔΙΑ ΜΕΣΟΥ

ΤΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ TUNEL

Ο ρόλος των κασπασών στον αποπτωτικό θάνατο

Οι κασπάσες είναι μια εξελικτικά συντηρητική πρωτεϊνική οικογένεια κυτταροπλασματικών πρωτεασών και διακρίνονται από Α. Την παρουσία κυστείνης στο ενεργό τους κέντροΒ. Την υψηλή συγγένεια σύνδεσης με κατάλοιπα ασπαρτικού οξέος στα υποστρώματα στόχους

Η μετατροπή του προ-ενζύμου σε ενεργό μέσω πρωτεόλυσης αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα γεγονότα έναρξης της απόπτωσης

Το ενεργό κάντρο διαμορφώνεται από τις δύο μικρές (-ρ10) και τις δυο μεγάλες (-ρ20) υπομονάδες και είναι ιδιαίτερα συντηρημένο

Asp Asp

p20 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑ

p10 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑ

ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΗ ΥΠΟΜΟΝΑΔΑ

ΑΝΕΝΕΡΓΟΣ ΠΡΟ-ΚΑΣΠΑΣΗ

ΤΕΤΡΑΜΕΡΗΣ ENEΡΓΟΣ ΚΑΣΠΑΣΗ

ΕΝΕΡΓΟ ΚΕΝΤΡΟ

ΑΥΤΟΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ ΣΕ ΘΕΣΗ Asp

ΕΡΕΘΙΣΜΑ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΥ ΘΑΝΑΤΟΥ

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΚΑΣΠΑΣΩΝ ΜΕΣΩ ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗΣ

ΑΠΟΠΤΩΣΗ

Η ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ CAD ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΤΟΝ ΘΡΥΜΜΑΤΙΣΜΟ ΤΟΥ

ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ DNA

Bax

CAD

ΝΟΥΚΛΕΟΣΩΜΑ

ΘΡΥΜΜΑΤΙΣΜΟΣ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ DNA

  

CLEAVED AND ACTIVATED CASPASE-3 IN CELL CULTURE

in vivo assay

ΤΡΙΣΔΙΑΣΤΑΤΗ ΔΟΜΙΚΗ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΚΑΣΠΑΣΗΣ-3

ΔΙΜΕΡΗ ΚΑΣΠΑΣΗΣ-3

ΜΟΡΙΑΚΗ ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΤΩΝ ΚΑΣΠΑΣΩΝ

ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΚΑΣΠΑΣΩΝ

ΟΝΟΜΑ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ

PARP (poly-ADP-ribose-polymerase)

Πυρηνικό αντιγόνο

ICAD (inhibitor of CAD) Αναστολέας DNA νουκλεάσης CAD

Bid Μιτοχονδριακή πρωτεΐνη

p21Cip1/Waf1 Αναστολέας κυτταρικού κύκλου

Γ(κ)ελσολίνη Ρυθμιστής οργάνωσης κυτταροσκελετού ακτίνης

Λαμίνες-Α, -Β Πυρηνικά αντιγόνα

Πρωτεϊνική Κινάση-Cδ Φωσφορυλίωση πρωτεϊνών

Προ-κασπάση-3 Πρωτεόλυση PARP, ICAD

Προ-κασπάση-8 Πρωτεόλυση Bid, προ-κασπάση-3

Προ-κασπάση-9 Προ-κασπάση-3ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΑ ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΥΠΕΡ-ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ Bcl-2

Αντι-αποπτωτική δράση Προ-αποπτωτική δράση

Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, A1 Bad, Bak, Bax, Bid, Bik, Bim

Κατά τη διάρκεια του αποπτωτικού θανάτου έχουμε:

a. Την κατάργηση της διακυτταρικής επικοινωνίας

b. Την αποδιοργάνωση του κυτταρικού σκελετού

c. Την παρεμπόδιση της αντιγραφής και επιδιόρθωσης του πυρηνικού DNA

d. Τον Θρυμματισμό του πυρηνικού DNA

Ενδοκυτταρική μετακίνηση πρωτεϊνών κατά την απόπτωση

Υποδοχέας του παράγοντα νέκρωσης όγκων

Η ΣΥΝΔΕΣΗ ΤΟΥ FASL ΣΤΟΝ ΥΠΟΔΟΧΕΑ FAS

ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΤΗΝ ΣΤΡΑΤΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ

ΠΡΟ-ΚΑΣΠΑΣΗΣ-8 ΣΤΟ ΣΥΜΠΛΕΓΜΑ ΤΟΥ

ΥΠΟΔΟΧΕΑ, ΜΕΣΩ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΜΕ

ΤΟΝ ΕΝΔΙΑΜΕΣΟ ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΗ FADD

ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ

TNFR

ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΥΠΟΥ FAS

TNF APO-3L APO-2L (TRAIL)

APO-1L

(FASL)

DEATH DOMAIN

DEATH EFFECTOR

DOMAIN

CASPASE-8/10 CASPASE-8/10 CASPASE-8/10 CASPASE-8/10

TRADDTRADD

FADD FADD FADD FADD

Η ΣΥΝΔΕΣΗ FAS/FASL

ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ

ΚΑΣΠΑΣΗΣ-8

FASL

FAS

ΚΑΣΠΑΣΗ-8

ΠΡΟ-ΚΑΣΠΑΣΗ-8

ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ

ΣΗΜΑΤΟΣ TNF

FASL FAS

FASL FAS

APC

ΑΝΤΙΓΟΝΟ ΑΝΤΙΓΟΝΟ

Τ1 Τ2

MHC

TCR TCR

ΑΠΟΠΤΩΣΗ

ΑΠΟΠΤΩΣΗ

ΑΠΟΠΤΩΣΗFASL

ΑΠΟΠΤΩΣΗ

FASL

FAS

TCR

MHC

ΑΝΤΙΓΟΝΟ

CTL

ΙΙΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ

ΚΑΤΑΣΤΟΛΗ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗΣ

ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ

ΑΠΟΠΤΩΣΗ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ Τ-ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ

FASFASL

ΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ

ΑΝΟΣΟ-ΠΡΟΝΟΜΙΟΥΧΑ

ΚΥΤΤΑΡΑ

ΦΛΕΓΜΟΝΗ