CH 14. Acides aminés Peptides et protéines
CH 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PROTEINES
1. Acides aminés naturels
Les protéines sont des assemblages macromoléculaires biologiques formés par enchaînement d'acides aminés.
Naturels = issus des protéines. α Aminoacides
C
COOH
R NH2H
α
Centre chiral
1. Acides aminés naturels
Les acides aminés naturels ont la configuration qui correspond au L-glycéraldéhyde :
L-glycéraldéhyde L aminoacide
C
COOH
R
H2N HC
CHO
CH2OH
HO H
C
COOH
R
H2N H C
COOH
R NH2H=
On dénombre 20 acides aminés naturels 12 sont synthétisés par l'organisme 8 sont issus de l'alimentation : les 8 acides aminés essentiels (soulignés dans les schémas).
A. Les acides aminés alkylés
Glycine (Gly)G
COOH
NH2
2.35
9.78
Alanine (Ala)A
COOH
NH2
2.35
9.87
Valine (Val)V
COOH
NH2
2.29
9.74
Leucine (Leu)L
COOH
NH2
2.33
9.74
Isoleucine (Ile)I
COOH
NH2
2.32
9.76
B. Les acides aminés aliphatiques avec alcools
C. Les acides aminés soufrés
Sérine (Ser)S
COOH
NH2HO 2.19
9.21
Threonine (Thr)T
COOH
NH2HO 2.09
9.11
Cystéine (Cys)C
COOH
NH2HS 1.92
10.46 8.35
Méthionine (Met)M
COOH
NH2
S 2.13
9.28
D. Acide aminé hétérocyclique
E. Acides aminés aromatiques
COOH
NH Proline (Pro)P 1.95
10.64
COOH
NH2
Phénylalanine (Phe)F
2.16
9.18
Tyrosine (Tyr)Y
COOH
NH2HO
2.20
9.11 10.13
Tryptophane (Trp)W NH
NH2
COOH2.43
9.44
F. Aminodiacides et amides
Acide aspartique (Asp)D
HOOCCOOH
NH2
1.99
9.90 3.90
Acide glutamique (Glu)E
COOH
NH2
HOOC 2.10
9.47
4.07
Asparagine (Asn)N
COOH
NH2
H2N
O
2.10
8.84
Glutamine (Gln)Q
COOH
NH2
O
H2N2.17
9.13
G. Diaminoacides
Lysine (Lys)K
COOH
NH2
H2N2.16
9.18
10.79
Arginine (Arg)R
COOH
NH2NHHN
NH2 1.82
8.99
12.48
Histidine (His) H
COOH
NH2N NH
1.80
9.33
6.04
CH 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PROTEINES
1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base
En raison de la présence simultanée des deux fonctions acide et base, les acides aminés ont un comportement amphotère: l'état de la molécule va dépendre du pH.
pH acide pH basique
forme dipolaire (zwitterion)
R
NH3+
COOH OH-
H+
R
NH3+
COO- R
NH2
COO-
OH-
H+
R
NH3+
COOHH+
R
NH3+
COO-
+Ka1
R
NH2
COO-
R
NH3+
COO-
H++Ka2pH
0 0.5 1 1.5 2
Equiv. basepKa1 .piso .pKa2 .
R
NH2
COO-R
NH3+
COOH R
NH3+
COO-
Papier
Ionsnégatifs
Ionspositifs
Point d'application
Papier
Ionsnégatifs
Ionspositifs
Point d'application
Dans l'eau, quel que soit le pH, les acides aminés sont des espèce chargées. On peut régler le pH pour atteindre le point isoélectrique mais en aucun cas, les espèces ne sont exemptes de charges.
pH 9-10 et >
pH = point isoélectrique
pH 2-3 et <
Diacide aminé ou acide diaminé: !! à la séquence des pKa
Ex 1 : Acide aspartique 1) COOH proche de NH3+ : pKa1 = 2.09
2) autre COOH : pKa2 = 3.86 3) NH3
+ : pKa3 = 9.82 !!!!! Point isoélectrique : 3
NH3+
COO-HOOCOH
-
NH3+
COOHHOOC
pKa1 = 2.09
NH3+
COO--OOCOH-
NH3+
COO-HOOC
pKa2 = 3.86
NH3+
COO--OOC OH-
NH2
COO--OOC
pKa3 = 9.82
Ex 2 : Lysine : 1) COOH : pKa1 = 2.18 2) NH3
+ voisin : pKa2 = 9.2
3) autre NH3+ : pKa3 = 10.8
!!!!! Point isoélectrique : 10
OH-
pKa1 = 2.18 NH3+
COO-H3N+
NH3+
COOHH3N+
NH3+
COO-H3N+ OH-
pKa2 = 9.2 NH2
COO-H3N+
OH-
pKa3 = 10.8NH2
COO-H3N+
NH2
COO-H2N
Ex 3 : Arginine : 1) COOH : pKa1 = 1.8 2) NH3
+ : pKa2 = 9.0
3) Guanidinium : pKa3 = 12.5 !!!!! Point isoélectrique : 10.8
OH-
pKa1 = 1.8 NH3+
COO-NHH2N
NH2+
NH3+
COOHNHH2N
NH2+
OH-
pKa2 = 9.0NH3+
COO-NHH2N
NH2+
NH2
COO-NHH2N
NH2+
OH-
pKa3 = 12.5NH2
COO-NHH2N
NH2+
NH2
COO-NHH2N
NH
Le groupe guanidine: plus basique que RNH2
(moins acide que RNH3+)
C NN
N
H
HH
H
CH2
........
C NN
N
H
HH
H
CH2
H
......H+
+
C NN
N
H
HH
H
CH2
H
...
... +
C NN
N
H
HH
H
CH2
H
......+
Paire sp2 Basicité accrue Résonance
stabilisant le guanidinium
CH 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PROTEINES
1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides
3.1 Définition - Conventions
Un peptide est une molécule constituée d'acides aminés enchaînés par un lien peptidique (amide).
3.1 Définition - Conventions :
Par convention, à gauche l'acide aminé N terminal et à droite l'acide C terminal :
AAN-AA-AA-AAC Acide N terminal - - - Acide C terminal
R
COO-N
O
HR'
H3N+
Lien peptidique Acide aminé N terminal Acide aminé C terminal
Ex : Glycyl-alanine Alanyl-glycine
!!!!! Complexité des enchaînements possibles !!!!
Gly-Ala Ala-Gly
Tripeptide constitué de Gly Ala et Val
6 possibilités Gly-Ala-Val Gly-Val-Ala Ala-Gly-Val Ala-Val-Gly Val-Ala-Gly Val-Gly-Ala
(tétrapeptide 24 possibilités, pentapeptide 120 , octapeptide 40 320)
CH3
COO-N
O
H
H3N+COO-N
O
H
H3N+
CH3
CH 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PROTEINES
1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides
3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines
Une protéine est un polypeptide particulier de poids moléculaire élevé (15 000 à 1 000 000) et constitué à partir des 20 acides aminés (120 à 8000 par molécule)
La structure primaire d'une protéine : quels sont les acides aminés? combien ?
quelle est la séquence?
3.2.1 Déterminer la composition L'hydrolyse complète de la protéine (par HCl-H2O 6N à 110°, 24 heures) fournit un mélange des acides aminés. Ces derniers sont analysés (par chromatographie à échange d'ions) : la chromatographie les sépare par passage à travers une colonne et "élution" par des mélanges tampons à pH croissants (analyseur d'acides aminés). On enregistre, à la sortie de la colonne, la succession des acides aminés qui sont identifiés et dosés par comparaison avec des acides de référence.
HCl 6N
110°C 24 H
Le temps de séjour dans la colonne, caractéristique pour chaque acide aminé et fonction du pH imposé, est le "temps de rétention"
Mélanges tamponà pH croissant
Détecteur
Identificationet dosage
Hydrolysat
Ninhydrine
Détection par la ninhydrine:
Réaction spécifique de détection des acides aminés : la coloration violette apparaît pour toute solution qui contient un acide aminé à groupe NH2 primaire.
R
NH3+
COO-
O
O
OHOH2 +
+ RCHO CO2 H2O
O
O
N
O
O-
3+ + +H+
violet
Résine avantaddition del'échantillon
Addition dumélange de
Asp, Ser, Lys
Elution dutampon 1à pH 3,25
Elution dutampon 2à pH 4,25
Elution dutampon 3à pH 5,25
Elution de Asp Elution de Ser Elution de Lys
3.2.2 Détermination de la séquence A. L'acide terminal est identifié par la réaction de SANGER :
L'acide aminé N terminal est reconnu par son produit de condensation avec le réactif de Sanger et l'ensemble des produits est analysé par chromatographie.
F
NO2
O2N H2NO
NHNH
R
R'
O
+
NO2
O2N NHO
NHNH
R
R'
O
H2N
R'
O
OH
NO2
O2N NHO
ROH + H2N
R"
O
OH+ + .....
HCl/H2O
B. Dégradation d'EDMAN :
H2NO
NHNH
R
R'
O
+N C S
HNO
NHNH
R
R'
OS
NH
NHN
S
OR
+ NHR'
OH2N
HCl/H2O (conditions acides)
Isothiocyanate de phényle (conditions basiques)
Peptide
Peptide - acide N terminal
N C S
etc...
L'isothiocyanate se fixe sur l'acide N terminal du peptide en milieu basique, et après une réaction de cyclisation, se décroche en milieu acide, en formant une hydantoïne qu'on peut identifie par son temps de rétention sur une colonne de chromatographie. Le reste du peptide peut recommencer la réaction avec une nouvelle molécule d'isothiocyanate pour identifier l'acide aminé suivant.
Cette opération est applicable environ 60 fois de suite et permet de déterminer la séquence de peptides courts.
C. Coupure sélective de liens peptidiques :
Pour les peptides à longue chaîne, on fragmente en morceaux plus petits qui sont ensuite séquencés par d'autres méthodes (par exemple Edman).
Les réactifs de fragmentation, parmi lesquels des enzymes appelés protéases, catalysent la rupture de la chaîne protéique en des endroits spécifiques.
Ala-Ala-Lys-Cys-Met-Cys-Arg-Tyr-Ile-Phe-Gly-Trp-Ile-Pro
Carboxypeptidase
Chymotrypsine BrCN
Trypsine
Points de rupture: Chymotrypsine : le CO de Tyr, Phe et Trp Trypsine : le CO de Lys et Arg BrCN : le CO de Met Carboxypeptidase : identifie le C terminal
Exemple de détermination de séquence
Un échantillon du peptide inconnu est d'abord hydrolysé totalement (HCl 6N, 110°, 24 H) et par l'analyseur d'acides aminés fournit la composition suivante :
20 acides aminés
Ala Arg Cys Glu Gly Leu Lys Phe Pro Thr Tyr Val 2 1 2 1 2 2 1 2 1 1 2 3
La chaîne totale (30 acides aminés) est séquençable par Edman. Pour cet exemple, nous procédons cependant à la fragmentation par la chymotrypsine:
A, B et C sont séquencés par la méthode d'Edman: A = Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe B = Val-Cys-Ala-Leu-Tyr C = Thr-Pro-Lys-Ala
Peptide Chymotrypsine
Phe Tyr A B C
2 acides aminés isolés
3 peptides
La chymotrypsine ne coupe pas à droite de Ala: le fragment C est donc la séquence terminale. La carboxypeptidase confirme que Ala est bien l’acide C terminal
Un nouvel échantillon du peptide initial est soumis au clivage par la trypsine et il en sort 3 fragments :
Peptide Trypsine Ala
D E
(=Ala30) puisqu'il est à droite de Lys29
2 peptides
1 27 28 29 30 ????? - Thr-Pro-Lys-Ala C
D est séquencé par méhode d'Edman et on trouve :
D = Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys E = Val-Cys-Ala-Leu-Tyr-Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg Comme D se termine par Lys, il s'agit de Lys29 et la comparaison des séquences de C et D permet de mieux préciser l'extrémité du peptide
La reconstitution de la séquence complète est aisément réalisée en partant du peptide porteur du C terminal et en cherchant les recouvrements des fragments.
Thr-Pro-Lys-Ala
Val-Cys-Ala-Leu-Tyr
Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-PhePhe
TyrGly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
Ala
Val-Cys-Ala-Leu-Tyr-Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg
Val-Cys-Ala-Leu-Tyr-Val-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala
Chymotrypsine
Trypsine
CH 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PROTEINES
4. Synthèse des peptides
1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides
3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines
4.1 L'activation
DCC dicyclohexylcarbodiimide N C N
Un réactif activant ce couplage (DCC) est nécessaire: acide et amine ne réagissent pas spontanément pour donner un lien peptidique.
4.1 L'activation Créer un lien peptidique c'est faire réagir la fonction amine d'un acide aminé avec le groupe carboxyle d'un autre.
NH2
R1
R2HOOC+
dicyclohexylurée
NHCO
R1
R2 + NH CO NH
CH 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PROTEINES
4. Synthèse des peptides
1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides
3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines
4.1 L'activation 4.2 La chémosélectivité:
La double fonctionnalité pose le problème de la chémosélectivité.
4.2 La chémosélectivité: L'activation n'est pas suffisante pour construire un peptide: il faut associer les deux acides aminés dans un ordre précis.
HOOC
NH2
R1 R2
NH2
HOOC+ DCC
HOOC
NHCO
R1
R2
NH2
HOOC
NHCO
R2
R1
NH2
+
HOOC
NHCO
R1
R1
NH2
+
HOOC
NHCO
R2
R2
NH2
+
+ tripeptides + tétra...
+ dicyclohexylurée
On bloque la fonction A par un groupe protecteur P.
RA
BR
C
D
Q
RA
BR
A
B
PR
A
D
P QR
A
D
P+ P
Réaction parasite
Réaction souhaitée
Protection Réaction Déprotection
La chémosélectivité peut se résoudre par la protection des groupements dont on veut bloquer la réaction
Le problème
La solution
La protection NH-Pam :
Le groupe tBoc: (t.butoxycarbonate) La fonction amino est transformée en fonction carbamate dont le groupe t.butyle sera éliminé, lors de la déprotection, sous forme d'isobutène.
dicarbonate de ditertiobutyle
R
COO-
NH3+O
O
O
O
O+
R
COOH
NH COO
(déprotection) HCl CH3COOH
R
COOH
NH3++ +CO2
Produits gazeux
(Pam = groupe protecteur de la fonction amine)
Mécanisme de déprotection :
R
COOH
NH COO C CH3
CH3
CH2HH+
R
COOH
NH COOH +
R
COOH
NH2+ CO2
La protection CO-Pac :
La fonction acide est transformée en ester de méthyle, éthyle ou benzyle et la déprotection utilise la saponification
R
NH3+
COO-
+
HO R
NH2
COO
+R
COO-
NH2
HO
NaOH H2Odéprotection
(Pac = groupe protecteur de la fonction acide)
CH 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PROTEINES
4. Synthèse des peptides
1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides
3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines
4.1 L'activation 4.2 La chémosélectivité: 4.3 Synthèse des peptides
4.3.1. En 3 étapes: 4.3 Synthèse des peptides • la protection des acides aminés
R1
NH2
COOH+ Pam
R1
NHPam
COOH
R2
NH2
COOHPac+
R2
NH2
COPac
R1
NHPam
CONH COPac
R2
R1
NH2
CONH COOH
R2
• le couplage, avec activation, des dérivés protégés :
• la déprotection du peptide :
R1
NHPam
COOH+R2
NH2
COPac R1
NHPam
CONH COPac
R2
DCC
4.3.2. La technique : Synthèse sur support solide MERRIFIELD
Un polymère contenant 1% de noyaux aromatiques chlorométhylés sert de point d'ancrage pour la synthèse
CH2Cl
P CH2ClProduits
Polymère
réactifs
La synthèse :
P CH2Cl + -OOC
NHPam
R1 P CH2OOC
NHPam
R1 + Cl-
déprotection
P CH2OOC
NH2
R1
R2
NHPam
HOOC+
P CH2OOC
NHCO
R1
R2
NH2
déprotection P CH2OOC
NHCO
R1
R2
NHPam
DCC couplage activé
HBr CF3COOH
P CH2Br +H2N CONH
R2
COOH
R1
4.3.3 Un exemple complet: la synthèse du dipeptide Ala-Phe :
Cette synthèse comporte 7 étapes. (La synthèse de la ribonucléase, enzyme de 124 acides aminés, demande 369 réactions et 6 semaines de travail).
Ala est l'acide N terminal et Phe est l'acide C terminal qui doit être accroché au polymère en premier lieu.
Phe COO-
NH3+
O
O
O
O
O+
Phe-tBoc COOH
NH COO
P CH2Cl
Poly-Phe-tBoc
P CH2OOC
NH COO
Poly-Phe
HClCH3COOH+
P CH2OOC
NH2 + CO2
Ala +
O
O
O
O
OCOO-
NH3+
Ala-tBoc COOH
NH COOPoly-Phe
P CH2OOC
NH2+
N C N
Poly-Phe-Ala-tBoc P CH2OOC
NH CO
NH COO
NH CO NH+
Poly-Phe-Ala-tBoc HClCH3COOHP CH2OOC
NH CO
NH COO
Poly-Phe-Ala ++ CO2
P CH2OOC
NH CO
NH2
HBrCF3COOH
Ala-Phe P CH2Br
COOH
NH CO
NH3+
+
La chimie des groupes protecteurs demande : - de hauts rendements de protection et déprotection - la sélectivité de la protection : ne faire réagir que la fonction visée - la sélectivité de la déprotection : ne pas toucher au lien peptidique et éventuellement ne déprotéger qu'une fonction.
CH 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PROTEINES
4. Synthèse des peptides
1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides
5. Structure des protéines:
3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines
4.1 L'activation 4.2 La chémosélectivité: 4.3 Synthèse des peptides
5.1 Structure primaire
5.1 Structure primaire des protéines
A la fin de la biosynthèse, les chaînes polypeptidiques subissent un reploiement en structures complexes qui créent des cavités dans lesquelles viendront se loger de petites molécules, par exemple des antigènes, s’il s’agit d’anticorps, des substrats, s’il s’agit d’enzymes. Cette structure dépend d’abord de la séquence et de la composition (nombre et nature des acides aminés) de la protéine, c.à d. de sa structure primaire. Cette structure est obtenue par le séquençage de la protéine.
5.1.1. Le lien peptidique :
La conjugaison donne au lien C-N un caractère de liaison double: C-N a une longueur de 1.32 Å dans le lien peptidique. C-N a une longueur de 1.47 Å normalement. 6 atomes sont dans le même plan, N et C sont sp2.
C NO
R
H
R'C N
O
R
H
R'
(+)(-)
5.1.2. Les liaisons hydrogène :
Dans une même chaîne ou entre deux chaînes différentes, les liens hydrogènes créent rigidité et organisation de la protéine. Chaque lien apporte environ 5 Kcal de stabilisation.
N C
H O
O H
C N
5.1.3. Les liaisons disulfure :
Entre 2 cystéines de la chaîne polypeptidique, un lien disulfure peut former une boucle. Deux chaînes peuvent aussi s'accrocher par ce lien.
HN
SH
C
O
NH
SH
C
O
HN
S
C
O
NH
S
C
O
Ox.
Red.
CH 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PROTEINES
4. Synthèse des peptides
1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides
5. Structure des protéines:
3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines
4.1 L'activation 4.2 La chémosélectivité: 4.3 Synthèse des peptides
5.1 Structure primaire 5.2 Structure secondaire
5.2 Structures secondaires des protéines
Dans la forme reploiée, on trouve des structures régulières facilement reconnaissables : des hélices et des feuillets. On appelle celles-ci des structures secondaires.
Les hélices α sont caractérisées par :
un pas de 5.4 Å 3,6 acides aminés par tour d'hélice
en moyenne. Des liens hydrogène contribuent à cette structuration en hélice
Hélice α :
Feuillets plissés β :
Certaines protéines contiennent des éléments de structure en feuillets plissés, à nouveau ordonnés entre autre grâce à des liens hydrogène.
CH 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PROTEINES
4. Synthèse des peptides
1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides
5. Structure des protéines:
3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines
4.1 L'activation 4.2 La chémosélectivité: 4.3 Synthèse des peptides
5.1 Structure primaire 5.2 Structure secondaire 5.3 Structure tertiaire
5.3 Structure tertiaire des protéines
Les protéines se présentent sous plusieurs aspects en raison de leur forme qui est réglée par les interactions de type liens H ou S-S et par la solubilité et la polarité de leurs différentes zones. La répartition dans l’espace de tous les atomes d’une chaîne polypeptidique constitue sa structure tertiaire.
Kératines (peau, cheveux , griffes) La kératine du cheveu est constituée de 3 hélices α juxtaposées et unies par des ponts disulfures La kératine des ongles a la même structure mais est plus riche en cystéine dans les hélices, donc avec plus de liens S-S et de rigidité. Collagène : tissus conjonctifs (cartilages, tendons, veines) Le collagène est constitué de 3 hélices entrelacées. Soies: (fibroïne des cocons) La soie est un empilement de feuillets plissés
5.3.1 Protéines fibreuses (insolubles dans l'eau)
Les enzymes : catalyseurs biologiques spécifiques, comportant une cavité de forme particulière, le site actif. Hormones peptidiques, telles que l'insuline et certains messagers chimiques peptidiques. Protéines de transport comme l'hémoglobine ou la myoglobine Protéines de stockage: Ex: caséine du lait ovalbumine du blanc d'oeuf ferritine
5.3.2 Protéines globulaires (solubles dans l'eau et de forme à peu près sphériques).
CH 14. ACIDES AMINES, PEPTIDES ET PROTEINES
4. Synthèse des peptides
1. Acides aminés naturels 2. Propriétés acide - base 3. Peptides
5. Structure des protéines:
3.1 Définition - Conventions 3.2 Composition et séquence des protéines
4.1 L'activation 4.2 La chémosélectivité: 4.3 Synthèse des peptides
5.1 Structure primaire 5.2 Structure secondaire 5.3 Structure tertiaire 5.4 Structure quaternaire
5.4 Structure quaternaire des protéines
Ceci relève de l'agglomération de sous unités entre elles : l'hémoglobine est un agrégat de 4 polypeptides sphériques.
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