1
Аминокиселине
1. предавање
Природно-математички факултетУниверзитет у Крагујевцу
2
Појам аминокиселине
• Аминокиселине су органске киселине...• Општа формула:
• Као органски молекул то је α-аминокарбонска киселина• Као биомолекул то је α-аминокиселина
полиенске
хидрокси
кето
По положају базне аминогрупе могу бити α, β...
R CH COOH
NH2
1
R CH CH
R CH
OH
R C
O
*
Ar
Rалифатичне
ароматичне
3
α-аминокиселине
• α-аминокиселине су протеинске киселине које на α-С атому увек имају две функционалне групе: карбоксилну и амино
• Постоји преко 200 аминокиселина• Само 20 њих јесу протеинске аминокиселине
4
Неполарне аминокиселине
H3C CH COOH
NH2
HC CH COOH
NH2
H3C
CH3
H2C CH COOH
NH2
HC
CH3
H3C
HC CH COOH
NH2
H2CH3C
CH3
CH2 COOH
NH2
глицин, Gly, G
aланин, Ala, A
валин, Val, V
леуцин, Leu, L
изолеуцин, Ile, I
нема хиралан α-С
5
Аминокиселине са сумпором
H2C CH COOH
NH2SH
H2C CH COOH
NH2
H2CSH3C
цистеин, Cys, C
метионин, Мet, M
6
Аминокиселине са хидроксилном групом
H2C CH COOH
NH2OH
HC CH COOH
NH2OH
H3C
серин, Ser, S
треонин, Thr, S
7
Дикарбоксилне аминокиселине
H2C CH COOH
NH2
HOOC
H2C CH COOH
NH2
HOOC
аспарагинска киселина, Asp, D
глутаминска киселина, Glu, E
8
Амиди дикарбоксилних аминокиселина
H2C CH COOH
NH2
OCH2N
H2C CH COOH
NH2
H2COCH2N
аспарагин, Asn, N
глутамин, Gln, Q
9
Базне аминокиселине
H2C CH COOH
NH2
H2CH2CHN
CHN
NH2
H2C CH COOH
NH2
H2CH2CH2C
NH2
H2C CH COOH
NH2
HN
N
аргинин, Arg, R
лизин, Lys, K
хистидин, His, H
ε
10
Ароматичне аминокиселне
H2C CH COOH
NH2
H2C CH COOH
NH2
HO
H2C CH COOH
NH2NH
фенилаланин, Phe, P
тирозин, Tyr, Y
триптофан, Trp, W
11
Аминокиселине са прстеном
NH
COOHпролин, Pro, P
12
Eсенцијалност аминокиселина• Есенцијалност је више биолошки појам и односи се на биолошку
функцију аминокиселина• Есенцијалне аминокиселине ћелија НЕ МОЖЕ да биосинтетише и
њихова потреба се мора регулистати екстерним путем (исхраном)
Аминокиселина(ознака)
Есенцијалност (g/дневно)
Тип (структура)
Порекло (намирница)
Val 0,8 неполарна месо, соја, пасуљ, легуминозеLeu 1,1 неполарна месо, пилетина, соја, кукуруз, млеко Ile 0,7 неполарна јаја, соја, пилетина, алге, сир
Met 1,1 са сумпором јаја, сусам, риба, цералијеThr 0,5 са -ОН купус, сир, риба, месо, сочивоArg 1,8 базна купус, сир, млеко, свињетина, туна,
брашно, орах, кикирики, сојаLys 0,8 базна риба, пилетина, соја, сочивоHis 0,9 базна месо, риба, пиринач, туна, соја,
кукуруз, парадајз, печурке, банане, цитруси
Phe 1,1 ароматична месо, риба, јаја, орах, кикирикиTrp 0,25 ароматична јаја, соја, сир, свињетина, пилетина,
риба, бресква, банана, парадајз, рижа, млеко
10 аминокиселина је есенцијално
13
Стереохемија аминокиселина• Структура аминокиселина је тетраедарска
• Обзиром да већина аминокиселина (осим Gly!!!) поседује хиралан α-С, оне поседују способност да окрећу раван поларизоване светлости
• Све аминокиселине које имају бар један асиметричан угљеников атом јављају се као L-облик, D-облик и рацемат
R
COOHH2NH
*
R
COOHH2NH
*
R
HOOC NH2
H*
L-изомер D-изомер
14
• 1861. године Emil Fischer је предпоставио да све протеинске аминокиселине имају исту релативну конфигурацију и да припадају L-серији
• То је доказао синтезом L-Ala из L-Ser
H2N C H
R
COOH
*
R
COOHH2NH
*
=
L-аминокиселина
H2N C H
CH2
COOH
OH
CH3OH
HClCl H3N C H
CH2
COOCH3
OH
PCl5Cl H3N C H
CH2
COOCH3
Cl
HClLiOH
H2N C H
CH2
COOH
Cl
Na/Hg
H3OH2N C H
CH3
COOH
L-Ser
L-Ala
15
• Синтезом аминокиселина из других супстрата увек су се добијали рацемати које је било немогуће раздвоји
• Структура L-облика аминокиселина дефинитивно је потврђена синтезом из L-глицералдехида
HO C H
CH2
CHO
OH
OHCH
CH2
CHO
HO
* *
L-глицералдехид D-глицералдехид
16
• Huggens и Ingold су 1950. године дали нови доказ да су све протеинске аминокиселине L-облика синтезом L-(-)-Ala из L-(-)-глицералдехида
L-(-)-глицералдехид L-(-)-млечна киселинаПРЕКУРСОР
D-(+)-α-бромпропионскакиселина
L-(-)-азид пропионскекиселине
L-(+)-Ala
Walden-ова инверзија
Walden-ова инверзија
HO C H
CH2
CHO
OH
HgO
OHO C H
CH2
COOH
OH
Br2
H C Br
CH2
COOCH3
OH
NH3
N3 C H
CH2
COOH
OH
H2/PtH2N C H
CH3
COOH
SN2
SN2
17
• Постоје и протеинске аминокиселине које имају 2 асиметрична угљеникова атома (Thr, Ile, Pro, HyPro) - СТЕРЕОИЗОМЕРИ
• Код тих аминокиселина постоји асиметрија и на α-С* и на β-С*
HC CH COOH
NH2OH
H3C**
CHH2N
HC
CH3
COOH
OH
HC NH2
CH
CH3
COOH
HO
L-Thr D-Thr
CHH2N
CH
CH3
COOH
HC NH2
HC
CH3
COOH
HO OH
L-Allo-Thr D-Allo-Thr
R
COOHH2NH
*
1 2
3
18
Chan-Ingold-Prelog-ово правило стереохемисјког приоритета:SH > OH > NH2 > COOH > CHO > CH2OH > CH3
• Све аминокиселине, изузев L-Cys имају (S) релативну конфигурацију
CH2OH
COOHH2NH
*
1 2
3
CH2SH
COOHH2NH
*
2 3
1
L-Ser L-Cys
(S) (R)
19
Хемијско понашање аминокиселина• Због своје специфичне структуре у којој су на једном С атому везане
киселинска –СООН и базна –NH2, аминокиселине се различито понашају у односу на рН у којој егзистирају
• Структура аминокиселине јесте динамичка равнотежа свих облика у којима она егзистира
обе групе депротонованеZwitter јон
обе групе протоноване
рН
С
20
R CH COOH
NH2
R CH COOH
NH2
R CH COO
NH2
R CH COOH
NH3
R CH COOH
NH2
H
OH
Протоновани парПар киселина
Депротоновани парПар база
R CH COO
NH3
R CH COO
NH2
R CH COOH
NH3
H OH
21
• У чврстом стању (кристали), растворне у јако полараним растварачима
• Енергетски сиромашно стање E = 44.0 – 51.5 KJ/Mol• Висока тачка топљења, на температурама вишим од 80°С се распадају• Слаба растворљивост у неполарним растварачима• Карактеристично понашање у киселој и у базној средини
R CH COO
NH3
Zwitter jon
Егзистирање у облику условљава да:
22
• Све аминокиселине изузев Asp, Glu, His, Tyr су добро растворне у води, NH3 и другим поларним растварачима (ЕtAc, DMSO, THF...)
• У слабо поларним (МеОН, ЕtOH...) и неполарним (ССl4, CHCl3) су нерастворне
R CH COO
NH3
R CH COOH
NH2
Равнотежа потпунопомерена ка енергетскистабилнијој структури
23
• рН = 2 јако сузбијена дисоцијација карбоксилне групе, аминокиселина протонована, аминокиселина као катјон
• рН = 4 дисоцијација није више толико сузбијена, слаби јачина ОН везе
• рН = 7.4 биполарни јон, Zwitter joн• рН = 9 амино група је депротонована и неутрална је, карбоксилна
група је дисосована
R CH COO
NH3
R CH COO
NH2
R CH COOH
NH3
H OH
Ка1 Ка2
24
• Што је могућност дисоцијације протона већа, киселина је јача и њена рКа вредност је мања
• За тачно одређивање киселости аминокиселина потребно је конструисати титрациону криву
ОН-
рН
НАЈМАЊУ РАСТВОРЉИВОСТ У ВОДИАМИНОКИСЕЛИНЕ ПОКАЗУЈУ НА рI
25
Aминокиселина рКа1 рКа2 рКа3 pKI
-COOH -NH3 -R
Gly 2.34 9.60 5.97Ala 2.34 9.69 6.01Val 2.92 9.62 5.97Leu 2.36 9.60 5.98Ile 2.39 9.68 6.02
Cys 1.96 10.28 8.18 5.07Met 2.28 9.21 5.74Ser 2.21 9.15 5.68Thr 2.11 9.62 5.81Asp 1.88 9.60 3.65 2.77Glu 2.19 9.67 4.25 3.22Asn 2.02 8.80 5.41Gln 2.17 9.13 5.56Arg 2.17 9.04 12.48 10.76Lys 2.18 8.95 10.53 9.74His 1.82 9.17 6.00 7.59Phe 1.83 9.13 5.48Tyr 2.20 9.11 10.07 5.66Trp 2.38 9.39 5.89Pro 1.99 10.96 6.48
Табела 2. рКа и рКI вредности аминокиселина
26
Хемијско понашање неутралних аминокиселина
Gly Ala Val Leu Ile
27
CH2 COOH3N CH2 COOH2NCH2 COOHH3N
pKa1 pKa2
Gly0Gly+1Gly-1
рI
OH-
pH
2.34
9.60
5.97
28
pKa1 = 2.34
Jaча киселина од сирћетне због +I NH 3
+групе
pKa = 4.7 pKb = 10.75
pKa2 = 9.60
Смањена базност NH2
групе због -I-COO- групе
29
Хемијско понашање аминокиселина са сумпором
Постоји могућност дисоцијације тиолне групе у јако базној средини.На титрационој кривој постоји и рКа3 = pKaR
Cys
Met
30
Хемијско понашање дикарбонских аминокиселина и амида дикарбонских киселина
Asp Glu Asp Gln
31
CH COOH3N CH COOH3NCH COOHH3N
pKa1 pKa2
Glu0Glu+1Glu-1
CH2
CH2
COOH
CH2
CH2
COOH
CH2
CH2
COO
CH COOH2N
CH2
CH2
COO
pKa3
Glu-2
OH-
рI
pH
2.19
4.25
9.67
3.22
32
Хемијско понашање ароматичних аминокиселина
Phe Tyr Trp
Moгућа дисоција у екстремним рН условима
33
Хемијско понашање аминокиселина са хидроксилном групом
Ser Thr
34
Хемијско понашање базних аминокиселина
35
CH COOH3N CH COOH2NCH COOHH3N
pKa1 pKa2
Lys+1Lys+2Lys0
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH COOH2N
CH2
CH2
CH2
pKa3
Lys-1
CH2
CH2
NH3
CH2
CH2
NH3
CH2
CH2
CH2
NH3
CH2
CH2
NH2
OH-
pH
2.18
8.9510.53
9.74рI
36
CH COOH3N CH COOH2NCH COOHH3N
pKa1 pKa2
Arg+1Arg+2Arg0
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH COOH2N
CH2
CH2
CH2
pKa3
Arg-1
NH NH
C
NH3
CH2
NH
C
NH3
NH
C
NH2
C NH
NH3
NH NH NH
NH2
C NH2
NH2
NH2
C NH2
NH2
NH2
C NH2
NH2
рН < 2 рН ≈ 8 рН ≈ 10.8 рН > 13
CH COOH3N CH COOH3NCH COOHH3N
pKa1 pKa2
His+1His+2His0
CH2CH2 CH2
CH COOH2N
CH2
pKa3
His-1
HN
NH
HN
NH
N
NH
N
NH
1.82 6.00 9.17
2.17 9.04 12.48
pI = 7.59
pI = 10.76
37
Хемијско понашање аминокиселина са прстеном
38
• Oдвајање електрофорезом• Различите АК имају различито pI на различитим рН• При истом рН амино киселине путују различитом брзином
R CH COOH
NH3
R CH COO
NH2
узорак
вијалица
(анода)
(катода)
39
Добијање аминокиселина
• Хемијска синтеза –D, L-AK• Изоловање из биолошког материјала – L-AK• Микробиолошки поступци добијања - D, L-AK
40
Хемијска синтеза – L-, D-AK
• Увек се добија рацемска смеша L- и D-изомера• Изомере је потребно одвојити• Најједноставнији поступак добијања је амонолиза халогенкарбонских
киселина
R CH COOH
Cl
R CH COOH2 NH3
NH2
*
41
Оптичко одабирање: L- и D-облици кристализацијом дају различите полиедарске кристале, па се простим одабирањем под микроскопом кристали могу одвојити. Кристали се разликују по облику и карактеристични су за L- и D-облик. Glu и Asn дају лепе кристале. Модификација овог поступка је калемљење истих антипода
42
Хемијско разлагање: Заснива се на грађењу дијастереоизомерних соли N-ацил-аминокиселина са оптички активним алкалоидима: стрихинин, бруцин, хинин, цинхонин и другим базама: фенил-етил-амин.
Бихемијско разлагање:
Метода 1. Оксидазе и декарбоксилазе неких микроорганизама делују само на L-облике а D-облици остају у подлози. Управо је то недостатак што се добијају D-аминокиселине.
Метода 2. Асиметрична синтеза се заснива на особини неких ензима да катализују грађење амидне везе само L-облика аминокиселина.
Метода 3. Асиметрична хидролиза је заснована на особини ацилаза из бубрега и карбоксипептидаза из панкреаса да брже хидролизује N-ацил-деривате L-аминокиселина од D-изомера. Ослобођена L-аминокиселина се обично таложи са етил-алкохолом.
43
Изоловање из биолошког материјала - L
• Ситњење биолошког материјала• Екстракција• Хидролиза
Биолошки материјал
Хомогемизација(ситњење)
Екстракција погоднимрастварачем
44
Хидролиза протеина
• Добијају се мономерне јединице, протеинске аминокиселине.• Поступци за хидролизу протеина:
a. Кисели поступак
b. Базни поступак
c. Хидролиза под утицајем протеолитичких ензима
H
OH
протеолитички ензими
Казеин из млека
45
Хидролиза протеина помоћу киселина
• Хидролиза се врши у присуству 5-6 M HCl или 5-6 M H2SO4
• инертна атмосфера• 12-72 h, у зависности од стабилности пептидне везе (између Val, Leu, Ile)• Недостатак је распадање појединих АК
Thr, Ser се разлажу 10-20% Аsn, Gln преводе се у Asp, Glu Cys до H2S
Тrp, Thr се потпуно разлажу Phe, Tyr – НЕЕНЗИМСКО ТАМЊЕЊЕ
46
Хидролиза протеина помоћу база
• Хидролиза се врши у присуству 5-6 M Ba(OH)2 или 5-6 M Ca(OH)2
• инертна атмосфера• Под притиском од 5-7 x 107 Pa• 6-7 h, у зависности од стабилности пептидне везе • Недостатак је распадање појединих АК
Ser до Ala и Gly Thr до Ala, Gly и Abu (γ-аминобутерна киселина) Arg до Orn и Cyt Cys до H2S
47
Хидролиза помоћу протеолитичких ензима
• Врши се помоћу протеолитичких ензима и за потпуну хидролизу протеина потребна је сукцесивна хидролиза уз употребу већег броја ензима
• Врши се раскидање тзв. пептидне везе, те су протеолитички ензими по типу С-N хидролазе
• Добијају се високо пречишћени производи и то искључиво L-аминокиселине
• Поступак је скуп али се користи за потребе фармацеутске, козметичке, индустрије хране
N C
O
H Протеазе: пепсин трипсин химотрипсин
папаин
Пептидазе: леуцинаминопептидаза карбоксипептидаза А карбоксипептидаза Б
48
Микробиолошкипоступци добијања
• Коришћење високоспецифичних облика микроорганизама који се развијају на хранљивој подлози
• Извор угљеника је уреа
• Неорганске соли као извор азота, NH4+, NO3
-
• Факори раста: биотин, витамини B1, B2 и B6• Пример: добијање Glu из
• Micrococcus, • Corynebacterium, • Brevibacterium, • Microbacterium
49
Хемијске реакције аминокиселина
декарбоксилација
деаминација
трансминација
естерификација
R CH COOH
NH2
R CH2 NH2
CO2
R CO
H
R CO
OHNH3 CO2
NADH+ + H+ NAD+
R1 C COOH
O
R1 CH COOH
NH2
R C COOH
O
+
R CH COOEt
NH2
EtOH
H
декарбоксилаза
биогени амин
деаминазадекарбоксилаза
дехидрогеназа
трансаминаза
50
Реакције амино групе
R CH COOH
NH2
R CH COOHHNO2
OH
+ H2O + N2
R CH COOH
NH2
(CH3)2SO4R CH COOH
N(CH3)3
R CH COOH
NH2
R CH COOH
NH
OR1
Cl
OR1
оксидација
алкиловање
ациловање
51
Идентификација аминокиселина
• Хроматографија на танком слоју силика-гела (TLC)• Спектрофотометријска идентификација (UV-Vis) • Инфрацрвена спектроскопија (IR)• Нуклеарна магнетна резонанаца (NMR)• Масена спектрометрија (MS)• Ензимско одређивање
52
R CH COO
NH3
O
O
OH
OHR C
O
HNH3 CO2
O
O
H
HO+ + +
O
O
OH
OHN +
O
O
H
HOH
HH
+
O
O
N
O
O
O
O
OH
OH
+HN
COOH
O
O
N
3 H2O
нинхидринхидридантин
λmax = 570 nm
λmax = 440 nm
53
TLC – танкослојна хроматографија
Tанки слојSiO2 наалуминијуму или стаклу
стартна мрља
када за хроматографију
елуент
iButOH:Acc(glac): H2O = 4:1:1
фронт растварача
а1
а2
а6
а3
а4
а5
54
UV-Vis спектрофотометрија
Lambert-Beer-ов законС
А
А
λmax
Добијају се карактеристични апсорбциони спектри који се користе за идентификацију нарочито ароматичних аминокиселина
55
IR спектроскопија
HC CH COOH
NH2OH
H3CHC CH COOH
NH2
H3C
CH3
56
NMR спектоскопија
H2C CH COOH
NH2SH
57
MS (масена спектрометрија)
H2C CH COOH
NH2SH
58
Ензимско одређивање
• Волуметријске методе уз помоћ ензима
• Glu, gекарбоксилаза CO2
• Arg, уреаза карбамид
• Lys, Tyr, Orn, gекарбоксилаза CO2
• His, хистиgиназа NH3
59
КРАЈ
Top Related