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Doctoral Thesis

HIF1α ubiquitination and deubiquitination activities regualteendocytic recycling and primary cilia formation

Author(s): Troilo, Albino

Publication Date: 2012

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-007618926

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ETH Library

DISS. ETH Nr. 20867

HIF1α ubiquitination and deubiquitination activities regulate endocytic recycling and primary cilia formation

A dissertation submitted to

ETH ZURICH

for the degree of

Doctor of Sciences

Presented by

ALBINO TROILO

Laurea Specialistica in Biologia Molecolare

Università degli studi di Parma, Italy

born October 6, 1983

citizen of Gessopalena, Italy

Accepted on the recommendation of

Prof. Dr. Wilhelm Krek

Prof. Dr. Ari Helenius

Prof. Dr. Patrick Meraldi

2012

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2 Abstract Primary cilia are evolutionarily conserved sensory organelles that protrude from the

surface of quiescent cells. The vast majority of cell types in mammals have primary

cilia. They play important roles in the organization of epithelial cell architecture and cell

proliferation. Defects in the formation or function of primary cilia are associated with a

spectrum of human diseases, so-called ciliopathies. Primary cilia formation

(ciliogenesis), maintenance and resorption (disassembly) represent distinct aspects of

cilia dynamics and are regulated in response to growth factor availability. The

regulatory network underlying this dynamics remains to be defined. In order to uncover

potential ubiquitin-based networks that contribute to ciliogenesis, we previously

performed a siRNA-based screen targeting ubiquitin specific proteases (USPs). This

screen identified USP8 as an important ciliogenesis factor, which functions together

with pVHL in regulating the formation of primary cilia. Here we show that the

requirement of USP8 for ciliogenesis is directly linked to its ability to stabilize HIF1α

that in turn represses, at transcriptional level, Rabaptin5, a positive effector of the early

endosome marker RAB5. In the absence of USP8, increased levels of Rabaptin5

cause abnormal RAB5-mediated early endosome fusion impairing endocytic recycling,

a required process for primary ciliogenesis. Together, our results highlight the

importance of the ubiquitin-proteasome pathway in the process of ciliogenesis, at least

in part, through USP8-driven regulation of HIF1α-dependent vesicular trafficking.

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3 Riassunto Le ciglia primarie sono appendici cellulari che si estendono dalla superficie della

maggior parte delle cellule del nostro organismo. Sono veri e propri organelli sensoriali

della cellula che garantiscono una corretta trasmissione di segnali utili per

l’organizzazione del tessuto epiteliale e la proliferazione cellulare. Alterazioni nella

formazione e nella funzione delle ciglia primarie sono associate a numerose patologie

meglio conosciute come cigliopatie. La formazione delle ciglia (cigliogenesi), il loro

mantenimento e retrazione rappresentano aspetti diversi della dinamicità di questi

organelli, i quali risultano essere strettamente dipendenti dalla presenza di fattori di

crescita nell’ambiente circostante. I meccanismi molecolari che regolano questi

processi sono tuttavia ancora in fase di studio. Nell’intento di approfondire i

meccanismi molecolari regolati da ubiquitina e coinvolti nel processo di cigliogenesi,

abbiamo in precedenza eseguito uno screening basato sull’utilizzo di siRNA specifici

per una classe di deubiquitinasi chiamate USP. Grazie a questo screening abbiamo

scoperto USP8, una proteina essenziale per la formazione delle ciglia, la cui funzione

dipende da pVHL. In questo studio mostriamo che la funzione di USP8 nel processo di

cigliogenesi si basa sulla sua capacità di stabilizzare HIF1α. HIF1α, a sua volta,

reprime la trascrizione di Rabatin5, l’ effettore di una proteina degli endosomi precoci,

Rab5. In assenza di USP8 i livelli proteici di Rabaptin5 aumentano causando la

formazione di enormi endosomi precoci. Questo fenomeno inibisce il trasporto degli

endosomi di reciclo verso la membrane citoplasmatica, un processo essenziale per la

formazione delle ciglia. Il nostro studio mette in evidenza l’importanza del traffico

vescicolare nella formazione delle ciglia, regolato da meccanismi molecolari basati

sull’ubiquitinazione di proteine e controllato in parte da HIF1α.