par absorption biphotonique Principe de la...

La microscopie à 2 photonsYves Usson

Principe de la microscopiepar absorption biphotonique


L’optique non-linéaireou

1 photon + 1 photon = 1photon !


e1 = hν1

Orbitale basse

Orbitale haute

Principe de la fluorescence

Absorption

Noyau

e2 = hν2

e1 > e2λ1 < λ2

Emission

Noyau


e1 = hν1

e1 = hν1Orbitale basse

Orbitale haute

Principe de la fluorescence à 2 photonsAbsorption de 2 photons

infrarouges

Noyau

e2 = hν2

e1< e2 et e1+e1> e2λ1 > λ2

Noyau

Emission d’un photonvisible


Fluorescence 1 photon

état de base

état excité

σa

σ1ph ~ σs

10-16cm2

section efficace

Fluorescence 2 photons

état de base

état excité

σs

σa

∆τ

∆τ, fenêtre de survie de l’état intermédiaire

σ2ph ~ σsσa∆τ

10-18cm2 10-16cm2 10-15s


E2ph = P2 / (t.F)Probabilité d’excitation bi-photonique :

Absorption Bi-photonique

P = puissance moyennet = durée d’impulsionF= fréquence de répétition

Condition nécessaire pour l’absorption biphotonique :

Une très haute densité en photons que ce soit

d’un point de vue spatial(concentration par focalisation, objectif à grande ouverture numérique)

oud’un point de vue temporel

(utilisation d’une source pulsée laser femto ou pico seconde)


Lasers pulsés

temps

20 W

temps

P

Mode continu

100fs

10ns10ns

100 kW

100fs

10ns

temps

P

Mode pulsé


Lasers accordables

Pompe miroir 99/1miroir

milieu dispersif laser

LASER USUEL

LASER ACCORDABLE (690nm à 1015nm)

Pompe miroir 99/1

miroir

milieu dispersif laserPrisme


Lasers pulsésAspect spectral et gamme d’excitation des fluorochromes

T

E

Oscillation continue, absence de localisation temporelle

Domaine temporel Domaine spectralA

λOscillation continue, forte localisation spectrale

T

E

Oscillation pulsée, localisation temporelle des impulsions Oscillation pulsée, étalement spectral

A

λ

∆λ=5 à 8nm


Compensateur de largeur d’impulsion

Lasers pulsés

ajustement de la largeur 80 fs150 fs

P1 P2


S

LASER PULSE INFRA-ROUGEACCORDABLE (690-1020 nm)

LASERDE

POMPEVERT

MAO

STATIFDE

MICROSCOPEUNITE DEBALAYAGE

ET DEDETECTION

Dispositif de microscopie bi-photonique


L’installation de microscopie confocale etbi-photonique du site IAB

Source laser pulsée Tsunami/MilleniaVIII Microscope confocalZeiss LSM510 NLO



Effet biphotonique

excitation488 nm

cône d’illumination(fluorescence !)

objectif x10

solution de FITC


excitation976 nm

Spot biphotoniqueau foyer

de l’objectif

Spot biphotoniqueau foyer

de l’objectif

cône d’illumination(pas de fluorescence)


Microscopie photonique 3DPropriétés de sectionnement optique

Tache de diffractionen microscopieconventionnelle

AX

E O

PT

IQU

E

Eliminer la lumièrehors focale

Filtrage confocal

Lumière réfléchie - fluorescenceMéthodes optiques

Solution reposant sur laformation de l’image

FluorescenceMéthodes optiques non-linéaires

Solution reposant surl’illumination

Créer de la lumièreuniquement dans

le plan focal

Absorption biphotonique



Photodégradation

objectif

gel de FITC

excitation488 nm

émissionfluorescente

zone photodégradée


excitation976 nm


Photodégradation

Fluorescence 2 photons GFP

section xy

section xzsection xz

Zone de photodégradationZone de photodégradation

Plan photodégradéPlan photodégradé0,6 µm


Coupe optique d’unefibre myocardique

NADHExcitation bi-photonique

λ = 714nm

FlavoprotéinesExcitation mono-photonique

λ = 488nm

Crédits: K. Guerrero, A. Kuznetsov, Y. Usson

Absorption bi-photoniqueVisualisation de molécules métaboliques

par auto-fluorescence dans des cardio-myocytesen culture ‘in vitro’



par auto-fluorescence


λ = 714nmEmission 420nm

Coupe XZ

50 µm

Section optique axiale d’unefibre myocardique ‘in vitro’

La microscopie à 2 photonsYves Usson Crédits: A. Kuznetsov, Y. Usson


par auto-fluorescence dans des hépatocytes enculture ‘in vitro’


λ = 714nm

FlavoprotéinesExcitation mono-photonique

λ = 488nm


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

contrôle

NADH

FLAVO

Respiration mitochondriale dans des hépatocytes en culture ‘in vitro’

contrôle

DHA

substrat DHA

DNP

découpleur complexe I

octanoate

substrat, octanoate

oléate

substrat, oléate

roténone

inhibiteur, roténone



Application en milieu turbide

objectif

mileu diffusant

excitation488 nm

émissionfluorescente

excitation976 nm



Fluorescence 1 photon Fluorescence 2 photons

excitationexcitation

émissionémission

diffusion raman

diffusion raman


Résolution 1P vs 2P

0-0,5 0,5

Intensité duspot à 488 nm≅ Probabilité

d’absorption 1Pà 488 nm

Absorption à 1P : linéairementproportionnelle à la puissance

Intensité du spot à976 nm

≅ Probabilitéd’absorption 1P à

976 nmDistance de résolution à 1P :R976 nm = 2 x R488 nm Probabilité

d’absorption2P à 976 nmAbsorption à 2P :

proportionnelle au carré de la puissance

Distance de résolution :R(2P)976 nm = 1,37 x R(1P)488 nm


ConclusionAvantages de la microscopie à deux photons :

Source laser infrarouge : -> grand pouvoir de pénétration dans les tissusfaible diffusion et faible absorption

Absorption bi-photonique :

-> rayonnement “inoffensif” pour les cellules vivantes-> accordabilité : autorise l’ajustement de l’excitation à un grand nombre de fluorochromes-> confinement de la photodégradation auniveau du plan focal-> amélioration du rapport signal/bruit dans les coupes optiques sériées-> localisation assurée du “photobleaching” dans les expériences de FRAP et autres expérimentations reposant sur le photoblanchiment

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