ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ …2.4 Αλυσιδωτή Αντίδραση...

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΙΧΘΥΟΛΟΓΙΑΣ

ΚΑΙ ΥΔΑΤΙΝΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ

ΠΡΟΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

« Φυλογενετική ανάλυση ειδών σπόγγων στη Μεσόγειο Θάλασσα »

ΔΕΔΟΥΣΗ ΒΑΣΙΛΙΚΗ

ΒΟΛΟΣ 2013

Institutional Repository - Library & Information Centre - University of Thessaly09/12/2017 11:49:55 EET - 137.108.70.7

1

«« Φυλογενετική ανάλυση ειδών σπόγγων στη Μεσόγειο Θάλασσα »


2

Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή :

1) Αθανάσιος Εξαδάκτυλος, Επίκουρος Καθηγητής, Γενετική Υδρόβιων Ζωικών

Οργανισμών, Τμήμα Γεωπονίας Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος, Σχολή

Γεωπονικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, Επιβλέπων,

2) Ιωάννα Καστρίτση – Κριθαρίου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Εφαρμοσμένη

Ζωολογία (Ταξινόμηση – Τοξικότητα- Υδατοκαλλιέργειες), Τμήμα Γεωπονίας Ιχθυολογίας

και Υδάτινου Περιβάλλοντος, Σχολή Γεωπονικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας,

Μέλος,

3) Δημήτριος Βαφείδης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Βιοποικιλότητα των Θαλάσσιων

Βενθικών Ασπονδύλων και άμεση - έμμεση χρηστικότητά τους, Τμήμα Γεωπονίας

Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος, Σχολή Γεωπονικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο

Θεσσαλίας, Μέλος.


3

Στους γονείς μου και

στον αδερφό μου Γιώργο


4

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Θα ήθελα να εκφράσω τις ειλικρινείς μου ευχαριστίες σε όλους όσους

συνέβαλαν στο να φέρω σε πέρας την παρούσα Προπτυχιακή Διπλωματική

Εργασία. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Επιβλέποντα της εργασίας αυτής,

Επίκουρο Καθηγητή κ. Αθανάσιο Εξαδάκτυλο για την πολύτιμη βοήθειά του και τη

διαρκή υποστήριξή του, τόσο κατά τη διεξαγωγή του πειράματος όσο και κατά τη

συγγραφή της παρούσας εργασίας, καθώς και τα υπόλοιπα μέλη της εξεταστικής

επιτροπής μου, αποτελούμενη από τους κ Ιωάννα .Καστρίτση- Κάθαρίου,

Αναπληρώτρια Καθηγήτρια η οποία μας χορήγησε και τα 10 δείγματα για την

πειραματική μου διατριβή και τον κ.Δημήτριο Βαδείδη, Αναπληρωτή Καθηγητή για

τις χρήσιμες συμβουλές τους και την καθοδήγησή τους καθ’ όλα τα στάδια

διεκπεραίωσης της εργασίας.

Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον Γιώργο Γκάφα που συνετέλεσε

στη διεκπεραίωση αυτής της εργασίας, με έβγαλε από πολλά αδιέξοδα και με

στήριξε σε προβλήματα που προέκυψαν στο εργαστήριο.

Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στην οικογένειά μου για την

αμέριστη συμπαράσταση, βοήθεια και προ πάντων κατανόηση και ανοχή καθ’ όλο

το χρονικό διάστημα των σπουδών μου.


5

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Στην παρούσα διατριβή έγινε προσπάθεια ταυτοποίησης θαλάσσιων

σπόγγων σε επίπεδο είδους, μέσω άμεσης αλληλούχισης και καταγράφηκαν οι

φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ τους. Για την επίτευξη του σκοπού της μελέτης

αυτής, πραγματοποιήθηκε αρχικά απομόνωση του DNA από τα 10 δείγματα που

δόθηκαν ως αντικείμενο της έρευνας. Έπειτα, έγινε ενίσχυση συγκεκριμένων

γενετικών τόπων του DNA, που επιλέχθηκαν από την υπάρχουσα βιβλιογραφία, με

τη βοήθεια της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης ( PCR ). Στα προϊόντα της

PCR πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση και τα δεδομένα που προέκυψαν

επεξεργάστηκαν με ειδικά στατιστικά προγράμματα και συγκρίθηκαν με βάσεις

δεδομένων (NCBI), προκειμένου να διερευνηθεί η μοριακή ποικιλότητα σε επίπεδο

είδους και δημιουργήθηκαν φυλογενετικά δένδρα για να διαπιστωθεί η

διαφοροποίηση τους γενετικά και εξελικτικά. Επιπλέον, στη παρούσα εργασία

γίνεται και μια μικρή αναφορά στην αλιεία των σπόγγων.

Λέξεις κλειδιά: εμπορικοί σπόγγοι ,απομόνωση DNA, PCR, φυλογενετική ανάλυση,

φυλογενετικά δένδρα


6

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

ΣΕΛ

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 8

1.1 Μοριακοί δείκτες και φυλογένεση 9

1.2 Γενικά στοιχεία της βιολογίας των σπόγγων 13

1.3 Εμπορικά είδη στον Ελλαδικό χώρο 15

1.3.1 Hippospongia communis 17

1.3.2 Spongia officinalis adriatica 18

1.3.3 Spongia officinalis mollissima 20

1.3.4 Spongia zimocca 21

1.4 Αλιεία 22

1.5 Σκοπός εργασίας 23

2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 24

2.1 Δειγματοληψία 24

2.2 Απομόνωση DNA 25

2.3 Ηλεκτροφόρηση DNA 28

2.4 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης PCR 29


7

2.5 Ανάλυση δεδομένων 32

3.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 33

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 37

5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 41

6. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 49


8

1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η επανάσταση στις μοριακές μεθόδους έδωσε νέα και καινοτόμα εργαλεία στους

εξελικτικούς βιολόγους που με περισσότερη ακρίβεια μπορούσαν να αναλύσουν και να

ερευνήσουν ερωτήματα που μέχρι τότε ήταν αδύνατο με τις κλασσικές μεθόδους. Μια

εξ αυτών η φυλογενετική ανάλυση. Η προσπάθεια ταξινόμησης των οργανισμών είναι

πολύ παλιά, πριν ακόμα μάθουμε κάτι στην εξελικτική σχέση των οργανισμών. Η

κατάταξη σε ομάδες με βάση τη μορφολογική ομοιότητα χρονολογείται από την εποχή

του Αριστοτέλη και είναι γνωστή ως φυσικό σύστημα κατάταξης. Αργότερα ο Λινναίος

(18ος αιώνας) ανέπτυξε το πρώτο ολοκληρωμένο ταξινομικό σύστημα, που θεωρείται το

σημείο έναρξης για τη σύγχρονη ταξινόμηση των ζώων.

Η εξελικτική αλληλουχία των οργανισμών, η ιστορία μιας ομάδας, που

περιγράφεται σε μορφή εξελικτικού δέντρου με κοινό πρόγονο, λέγεται φυλογένεια.

(Αλαχιώτης, 2007).

Η αρχή που διέπει τη φυλογενετική συλλογιστική είναι απλή: η ανάλυση των

ομοιοτήτων και των διαφορών μεταξύ των βιολογικών οντοτήτων μπορεί να

χρησιμοποιηθεί για την εξαγωγή των συμπερασμάτων ως προς την εξελικτική ιστορία

των αυτών των οντοτήτων. Ωστόσο, στην πράξη, τα τελικά σημεία της εξέλιξης και της

συναγωγής της ιστορίας τους δεν είναι απλά(Barton et. al., 2013).


9

1.1 Μοριακοί δείκτες και φυλογένεση

Από τους μοριακούς δείκτες που χρησιμοποιούνται ευρέως στις φυλογενετικές

μελέτες είναι το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA). Το mtDNA εμφανίζεται σε μεγάλο

αριθμό αντιγράφων στα κύτταρα, είναι πλήρως χαρακτηρισμένο, ενώ ο μητρικός,

κυρίως, τρόπος κληρονομικότητας (Zhao et al., 2004) δεν αφήνει περιθώρια για

ανασυνδυασμό, με ελάχιστες εξαιρέσεις (Rokas et al., 2003). Συνεπώς θεωρείται μια

απλοειδής γενετική μονάδα. Επιπλέον, το ζωικό μιτοχονδριακό DNA εμφανίζει

γρήγορο εξελικτικό ρυθμό. Εξελίσσεται έως και 10 φορές πιο γρήγορα από το μη

επαναλαμβανόμενο πυρηνικό DNA, ενώ ο εξελικτικός ρυθμός είναι διαφορετικός

ακόμα και ανάμεσα σε διαφορετικά τμήματα του mtDNA. (Gouliaeva et al., 2006).

Υπάρχουν όμως και πρακτικά πλεονεκτήματα, όπως για παράδειγμα το γεγονός ότι

δείγματα mtDNA μπορούν να ληφθούν εύκολα, ενώ δεν είναι απαραίτητη μεγάλη

ποσότητα ιστού. Τέλος, μπορεί εύκολα να μελετηθεί και να πολλαπλασιαστεί, καθώς

έχουν σχεδιαστεί ευρέως χρήσεως εκκινητές για PCR. Το μικρό λοιπόν δραστικό

μέγεθος του mtDNA σε σχέση με τα πυρηνικά γονίδια και ο υψηλός ρυθμός

νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων, καθιστούν το mtDNA πολύτιμο εργαλείο στη μελέτη

φυλογενετικών σχέσεων σε διάφορα ταξινομικά επίπεδα, ανάλογα πάντα με το υπό

μελέτη γονίδιο, ή συνδυασμό γονιδίων. Εκτός όμως, από τις πληροφορίες που μπορεί

να δώσει η αλληλούχιση των γονιδίων του μιτοχονδριακού DNA, η διάταξη των

μιτοχονδριακών γονιδίων είναι δυνατό να παρέχει πληροφορίες για τη «βαθιά»

φυλογένεση (Boore et al,. 1995).

Οι μοριακές φυλογενετικές μελέτες στηρίζονται συνήθως στη χρήση

μιτοχονδριακών γονιδίων (Heise et al., 1995, Burns 1997). Η ευκολία στον

πολλαπλασιασμό και οι σχετικά γρήγοροι εξελικτικοί ρυθμοί έκαναν το mtDNA


10

αναπόσπαστο κομμάτι της συστηματικής και της γενετικής πληθυσμών (Avise 1986,

Simon et al., 2006). Παρόλα αυτά, επειδή το μιτοχονδριακό γονιδίωμα κληρονομείται

ως μονάδα, τα γονίδια που φέρει δεν μπορούν να θεωρηθούν ανεξάρτητες πηγές

φυλογενετικής πληροφορίας. Το πυρηνικό γονιδίωμα περιλαμβάνει περιοχές που

κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, RNA, ενώ φέρει και μη κωδικές περιοχές και προσφέρει

μια πληθώρα ανεξάρτητων δεικτών, οι οποίοι εξελίσσονται με διαφορετικούς ρυθμούς.

Ωστόσο, η χρήση των πυρηνικών γονιδίων στις φυλογενετικές αναλύσεις είναι πιο

δύσκολη σε σχέση με τα μιτοχονδριακά. Οι μη κωδικές περιοχές, καθώς και οι βρόγχοι

των rRNA γονιδίων, εξελίσσονται γρηγορότερα, οπότε μπορούν πιθανώς να

χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη των σχέσεων μεταξύ συγγενών ειδών (Dolman and

Phillips 2004, Willows–Munro et al. 2005).

Άλλοι γενετικοί τόποι που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για μελέτες φυλογένεσης

είναι οι μικροδορυφορικές αλληλουχίες. Πρόκειται για επαναλαμβανόμενες

αλληλουχίες ενός μέχρι πέντε νουκλεοτιδίων που εντοπίζονται σε μεγάλο βαθμό στο

γονιδίωμα των ευκαρυωτικών οργανισμών. Εμφανίζουν υψηλά επίπεδα

πολυμορφισμού, χάρη στον υψηλό ρυθμό μεταλλάξεων. Η συμμετοχή τους σε μελέτες

πληθυσμιακής γενετικής βοήθησαν στον καθορισμό της γενετικής δομής διαφορετικών

ατόμων, συγκρίνοντας τις εξελικτικές σχέσεις και μελετώντας την πρόσφατη ιστορία σε

επίπεδο πληθυσμών (Buburuzan et al., 2007).

Τέλος, στις φυλογενετικές αναλύσεις χρησιμοποιούνται επίσης οι γενετικοί τόποι

που κωδικοποιούν τη σύνθεση του rRNA. Οι γενετικοί αυτοί τόποι βρίσκονται

συγκεντρωμένοι σε γειτονικές περιοχές του γονιδιώματος και οργανώνονται σε μια

ενιαία λειτουργική μονάδα. Κάθε τέτοια μονάδα περιλαμβάνει γονίδια τα οποία


11

κωδικοποιούν τη μεγάλη (28S) και τη μικρή(18S) υπομονάδα του ριβοσώματος, καθώς

και το 5,8S rRNA, τα οποία χωρίζονται από μη κωδικές περιοχές (ETS, ITS1, ITS2).

Το κύριο πλεονέκτημα που καθιστά το πυρηνικό ριβοσωμικό DNA κατάλληλο

φυλογενετικό δείκτη, είναι το μεγάλο μέγεθος της αλληλουχίας που υποδηλώνει το

μεγάλο ποσό της φυλογενετικής πληροφορίας που φέρει. Επίσης δίνεται η δυνατότητα

επιλογής μεταξύ των γενετικών αυτών τόπων για τις μελέτες, ανάλογα με τον

εξελικτικό ρυθμό που παρουσιάζει ο καθένας από αυτούς (Olsen and Woese 1993).

Οι γενετικοί τόποι, όπως φαίνεται πιο πάνω, που κωδικοποιούν για λειτουργικά

μόρια RNA, χρησιμοποιούνται συχνά στις φυλογενετικές μελέτες Τα δέντρα που

προκύπτουν από αυτές τις μελέτες, παρόλα αυτά, έρχονται σε αντίθεση με άλλα

μοριακά δεδομένα σε έρευνες βαθιάς φυλογένεσης. Εφόσον πολλοί από τους

λειτουργικούς περιορισμούς των γονιδιακών προϊόντων (π.χ. των μορίων RNA)

σχετίζονται με την τρισδιάστατη δομή, παρά με την αλληλουχία, οι συσσωρευμένες

μεταλλάξεις στις γονιδιακές αλληλουχίες μπορούν να δημιουργήσουν «θόρυβο» στο

φυλογενετικό σήμα για πολύ μεγάλες, εξελικτικά, χρονολογικές κλίμακες. Η

ποικιλομορφία της δομής, ωστόσο, μπορεί να αποτελέσει κατάλληλο δείκτη για τη

φυλογενετική συμπερασματολογία, ακόμη και κάτω από συνθήκες υψηλής γενετικής

διαφοροποίησης (Fischer and Geard 2002).

Με τη χρήση, λοιπόν, υπολογιστικών προγραμμάτων, τα οποία βασίζονται σε

κατάλληλους αλγορίθμους, είναι δυνατή η πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής RNA

(βάσει της χαμηλότερης τιμής ελεύθερης ενέργειας) (Mathews et al., 2004) και η

σύγκριση των δομών για την εξαγωγή φυλογενετικών συμπερασμάτων. Μέχρι σήμερα

έχουν πραγματοποιηθεί πολλές τέτοιες μελέτες οι οποίες περιλαμβάνουν, μεταξύ


12

άλλων, και τις πυρηνικές ριβοσωμικές υπομονάδες 28S και 18S (Dixon and Hillis 1993,

Ouvrard et al., 2000).

Τα σφουγγάρια (φύλο Porifera) είναι μια διαφορετική ταξινομική ομάδα των

βενθικών των υδρόβιων ζώων με μεγάλη οικολογική, εμπορική, και βιοφαρμακευτική

σημασία. Είναι αναμφισβήτητα η πρώτη ταξονομική διακλάδωση μεταζώων, και ως εκ

τούτου, έχουν μεγάλη σημασία για την ανασυγκρότηση της πρόωρης εξέλιξης των

μεταζώων.

Ωστόσο, η συστηματική και φυλογένεση των σφουγγαριών παραμένουν άλυτα ως

κάποιο βαθμό, και υπάρχει μια συνεχής συζήτηση για την ακριβή μορφή διακλάδωσης

των κύριων κλάδων τους και τις σχέσεις τους με τα άλλα μη-bilaterian ζώα. Αρκετές

μελέτες έχουν δείξει ότι τα σφουγγάρια είναι παραφυλετικά. Ωστόσο, με βάση τις

πρόσφατες αναλύσεις φυλογένειας, προτάθηκαν ότι το φύλο Porifera θα μπορούσε

κάλλιστα να είναι μονοφυλετικό, σύμφωνα με κλαδιστικές αναλύσεις με βάση τη

μορφολογία τους (Wӧrheide,2012).

Για τεχνικούς και ιστορικούς λόγους, το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) είναι ένας

από τους διαδεδομένους μοριακούς μοιακών δεικτών σε φυλογενετικές ζώων, γενετική

του πληθυσμού και βιογεωγραφικές μελέτες, καθώς παρέχει εύκολη πρόσβαση σε μια

σειρά από γονίδια με λίγο ή καθόλου ανασυνδυασμό, συνήθως μονογονεϊκή

κληρονομικότητα και υψηλά ποσοστά εξέλιξης (Moritz et al., 1987).

Παρά το γεγονός ότι υπάρχουν πλήρεις αλληλουχίες του mtDNA των ζώων έχουν

καθοριστεί από τις αρχές της δεκαετίας του 1980 (Anderson et al., 1981), τα πρώτα

ολοκληρωμένα μιτοχονδριακά γονιδιώματα των σφουγγαριών (Lavrov et al., 2005).


13

Από τότε, έχουν καθοριστεί για 30 σφουγγάρια πλήρη μιτοχονδριακές αλληλουχίες

γονιδιώματος και τρέχων έρευνες στοχεύουν να φέρουν τον αριθμό αυτό στο 100.

Τα γένη Spongia και Hippospongia συνήθως καταγράφονται σε όλο τον κόσμο και

θεωρούνται ως κοσμοπολίτικα. Πάνω από 100 είδη έχουν ταξινομηθεί ως το γένους

Spongia, αλλά η αξία αυτής της αφθονίας ειδών πρέπει να εξετάζεται με προσοχή στην

απουσία σε βάθος ταξινομική αναθεώρηση. Υπάρχουν περίπου 30 είδη για το γένους

Hippospongia.. Σε επίπεδο είδους, κάποιες ταξινομικές κατηγορίες, όπως Spongia

officinalis και Spongia agaricina έχουν αναφερθεί σε πολλούς τομείς. Αυτό το ευρύ

γεωγραφικό φάσμα είναι ασαφής, και οι εκθέσεις αυτές πρέπει να επιβεβαιωθού

(Pronzato and Manconi,2008).

1.2 Γενικά στοιχεία της βιολογίας των σπόγγων

Οι σπόγγοι είναι πολυκύτταρα ζώα, τα οποία ανήκουν στο βασίλειο Animalia

και στο φύλο Porifera. Εμφανίστηκαν πριν από την Κάμβριο Περίοδο και πιθανότατα

προήλθαν από χοανομαστιγοφόρα. Κατανέμονται σε τρείς ομοταξίες: Ασβεστόσπογγοι

(Calcarea), με ασβεστολιθικές βελόνες, Εξακτινελλίδες ή Υαλόσπογγοι (Hexactinellida

ή Hyalopongia ), με εξακτινωτές πυριτικές βελόνες και Δημόσπογγοι (Demospongia),

με σκελετό από πυριτικές βελόνες ή σπογγινη ή και τα δύο. Τα σφουγγάρια

διακρίνονται σε “άγρια” και “ήμερα” ή σε εμπορικά και μη εμπορικά (Ruppert et al.,

2004, Hickman et al., 2005).

Η επιφάνειά τους φέρει άφθονους πόρους και χιλιάδες δίοδοι, στόματα,

βρίσκονται στην επιφάνειά τους και επιτρέπουν την είσοδο και την έξοδο του νερού


14

από το κυρίως σώμα του σπόγγου συμπαρασύροντας έτσι και την τροφή τους. Τα

σφουγγάρια αντλούν μεγάλες ποσότητες νερού, η οποία μπορεί να φτάσει τρεις φορές

το συνολικό όγκο του ζώου ανά ώρα. Σε όλη τους τη ζωή ,εκτός από το στάδιο της

προνύμφης, μένουν προσκολλημένα συνήθως σε βράχους, κοράλλια, όστρακα μέχρι να

πεθάνουν ή αναπτύσσονται πάνω σε άλλα ζώα , όπως Μαλάκια, Βραχιονόποδα και

Υδρόζωα. (Castritsi- Catharios 1998).

Οι σπόγγοι εμφανίζονται με μια ποικιλία μορφών που οφείλεται στις διαφορές στο

γενετικό υλικό μεταξύ των ειδών αλλά και με τις συνθήκες του περιβάλλοντος στο

οποίο ζουν. Η μορφή τους είναι συμπαγής, λοβωτή, δενδροειδή, δακτυλοειδή,

επιστρώματος ή λεπτής κρούστας επάνω στο υπόστρωμα (Βουλτσιάδου και

Λαγουτάρη, 2008).

Στα εμπορικά σφουγγάρια η εξωτερική τους συμμετρία δεν επεκτείνεται εσωτερικά

στο υδροφορικό τους σύστημα(Castritsi- Catharios 1998)..

Ένα σφουγγάρι αποτελείται από:

Μία εξωτερική άμορφη μεμβράνη που το περιβάλλει, στην οποία υπάρχουν

ανυψώματα και εκβανθύσεις. Εκεί τελειώνουν οι πρωτογενείς, οι

δευτερογενείς ίνες και οι σωλήνες εισροής και εκροής του νερού.

Μία εξωτερική επιδερμίδα που χωρίζει το σφουγγάρι από το περιβάλλον

του.

Το χοανόσωμα, μέσα στο οποίο υπάρχουν οι θάλαμοι των χοανοκυττάρων,

τα κανάλια εισροής και εκροής του νερού.


15

Τη βασική μεμβράνη, με την οποία το σφουγγάρι προσκολλάται στο

υπόστρωμα

Οι σπόγγοι είναι διηθηματοφάγοι και η τροφή τους είναι άφθονη και βρίσκεται

διαλυμένη στο νερό. Το μέγεθός της πρέπει να είναι πολύ μικρό, (0,1-50μm), για να

διηθηθεί και να κατακρατηθεί από το ζώο (Βουλτσιάδου και Λαγουτάρη, 2008).

Αναπαράγονται είτε αγενώς με εκβλάστηση και με αναγέννηση μετά από

τεμαχισμό, είτε εγγενώς όπου οι σπόγγοι παράγουν γονάδες και το γενετικό υλικό

βρίσκεται στη μεσούλη. Η εμβρυική ανάπτυξη διαδραματίζεται άλλοτε μέσα στο σώμα

του σπόγγου (ζωοτοκία) και άλλοτε στο περιβάλλον (ωοτοκία) (de Vos et al., 1991,

Ruppert et al., 2004).

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν 4 από τα 5 εμπορικά είδη Σπόγγων(5ο:

Spongia officinalis lamella), από τον Ελλαδικό χώρο, τα οποία παρουσιάζονται στον

παρακάτω Πίνακα 1.

Πίνακας 1. Είδη εμπορικών Σπόγγων που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία.

Είδος Τάξη Οικογένεια

Hippospongia

communis

Dictyoceratida Spongidae


16

Spongia officinalis

adriatica

Spongia officinalis

mollissima

Dictyoceratida

Spongidae

Spongia zimocca Dictyoceratida Spongidae

1.3 Εμπορικά είδη στον Ελλαδικό χώρο

Οι εμπορικοί σπόγγοι προτιμούν τα ζεστά νερά γι’αυτό και τα κύρια αλιευτικά

πεδία βρίσκονται στις πιο θερμές περιοχές της Ν.Α Μεσογείου οπού η θερμοκρασία

του νερού δεν κατεβαίνει κάτω από τους 130 C (Arndt, 1937).

Γενικά η Spongia officinalis αλλάζει χρώμα από σκούρο καστανόμαυρο σε λευκό,

ανάλογα εάν είναι εκτεθειμένη στο φώς ή βρίσκεται στη σκιά. Αυτό οφείλεται, κατά

τον Vacelet (1964), σε συγκέντρωση μελανίνης στην επιφάνειά της.

Η εξωτερική μορφολογία των εμπορικών σπόγγων είναι κυρίως γενετικά

καθορισμένη αλλά βρίσκεται σε συνάρτηση με τις περιβαλλοντικές συνθήκες,

παρουσιάζοντας μεγάλη ποικιλία που εκτείνεται μεταξύ των διαφορετικών ειδών αλλά

και μέσα στο ίδιο είδος (Pronzato et al., 1998). Η μεγάλη αυτή ποικιλομορφία μας ωθεί

σε αναζήτηση νέων ταξινομικών χαρακτήρων ανεξάρτητων από τις περιβαλλοντικές

συνθήκες.

Ένας τέτοιος υποψήφιος χαρακτήρας είναι το κωνίδιο, δηλαδή η απόληξη της

πρωτογενούς ίνας σπογγίνης, η οποία μπορεί να διατρυπά ή όχι το πινακόδερμα. Τα


17

κωνίδια μπορεί να είναι ορατά ακόμα και με γυμνό οφθαλμό ως μικρές κωνικές

προεξοχές πάνω στο πινακόδερμα (Καστρίτση-Καθαρίο et al., 1995, Cook and

Bergquist, 2001).

Συχνά, κατά την περιγραφή ενός είδους, οι ερευνητές αναφέρονται στα

μορφολογικά χαρακτηριστικά της επιφάνειας συμπεριλαμβανομένων των κωνιδίων

δίνοντας ενδεικτικές μετρήσεις ύψους, απόστασης μεταξύ τους και παρουσίας ή μη

προεξέχουσας ίνας σπογγίνης (Vacelet 1959, Voultsiadou-Koukoura 1987, Castritsi-

Catharios 1998, Uriz and Maldonado 2000, Kefalas et al. 2007).

1.3.1 Hippospongia communis (Lamark,1813)

Το είδος H. communis , με την κοινή ονομασία Καπάδικο, ζει σε ρηχά νερά,

προτιμά θαλάσσια λιβάδεια Ποσειδωνίας και χαρακτηρίζεται από μεγάλη ποικιλία

μορφών, η οποία είναι συνάρτηση των ρευμάτων του υποστρώματος και τους βάθους

(Sella 1912, Vacelet 1959, Rützler 1976). Η περιγραφή Lamarck δεν αφήνει καμία

αμφιβολία σχετικά με την ερμηνεία. Ωστόσο, διάφορα προβλήματα ταξινόμησης

εξακολουθούν να υπάρχουν. Ο νεότυπος για αυτό το είδος που επιλέχθηκε από τον

Burton (1934) είναι σαφώς δείγμα του Spongia officinalis (de Laubenfels 1948).

Το σχήμα του είναι συμπαγής στρογγυλεμένο και η κάτω επιφάνειά, με την οποία

προσφύεται στο υπόστρωμα, είναι τραχιά. Περιβάλλεται από σκούρα μεμβράνη και

όταν αλιεύεται μέσα σε σπηλιές τότε το χρώμα του είναι ανοιχτό καστανό και λέγεται «

Δροσίτης ». Το νερό συμπαρασύροντας την τροφή περνάει μέσα από μεγάλα κανάλια

που συχνά σχηματίζουν μαιάνδρους (Βουλτσιάδου και Λαγουτάρη, 2008).


18

Σε ορισμένα σημεία τους σχηματίζονται θάλαμοι με χοανοκύτταρα, όπου

κατακρατείται ένα μεγάλο μέρος της τροφής. Στη συνέχεια, το νερό φεύγει από την

αποπύλη και μέσα από τα κανάλια εξόδου και εξωθείται στο περιβάλλον με πίεση.

Αλιεύεται στην Εύβοια, στα Δωδεκάνησα, στη Σάμο και στις Κυκλάδες σε βάθη από 9

– 82,5m (Castritsi- Catharios 1998)

Εικόνα 1 H. communis ή Καπάδικο. Συλλέχθηκε από τη Μύκονο (ακρωτήριο Καλαφάτης).

Μη επεξεργασμένο δέιγμα (Castritsi- Catharios 1998).

1.3.2 Spongia officinalis (Linnaeus,1759) adriatica (Schmidt,1862)

Λέγεται και Ματαπάς όταν προέρχεται από μικρά βάθη ή Φίνο ή ελληνικός σπόγγος

μπάνιου. Έχει ακανόνιστο σχήμα και είναι ιδιαίτερα συμπαγές, ελαστικό και εύκαμπτο.

Το σχήμα του καθορίζεται από διάφορες παραμέτρους, όπως το βάθος που είναι

προσκολλημένα, την κλίση του υποστρώματος, τα ρεύματα που επικρατούν στη


19

συγκεκριμένη θέση, το φως, την ηλικία, τη διαθέσιμη τροφή κτλ. (Castritsi- Catharios

1998, Βουλτσιάδου και Λαγουτάρη, 2008).

Το είδος S.off.adriatica ζει σε ρηχά νερά με σκληρά υποστρώματα και έχει χρώμα

που μεταβάλλεται ανάλογα με τον οικότοπό του από μαύρο σε κιτρινόκγριζο. Πάνω

τους προσφύονται ξένα σωμάτια, όπως κόκκοι άμμου, βελόνες από γειτονικούς

σπόγγους κλπ. Χαρακτηριστικό του γνώρισμα η αίσθηση του βελούδου που δημιουργεί

η λεπτή του υφή (Gaino and Pronzato, 1989; Gaino et al., 1994; Vacelet et al., 1994;

Pronzato, 1999).

Αλιεύεται στην Κρήτη, στα Δωδεκάνησα, στη Σάμο, στις Κυκλάδες και στην

Εύβοια σε βάθη από 9 - 100m, οπού το υπόστρωμα είναι αμμώδες με σκόρπιους

μεγάλους βράχους (Castritsi- Catharios 1998).

Εικόνα 2 Ματαπάς που συλλέχθηκε από το Βαθύ της Σάμου, μετά από κατάλληλη

επεξεργασία (Castritsi- Catharios 1998).


20

1.3.3 Spongia officinalis (Linnaeus,1759) mollissima (Schmidt,1862)

Το είδος S.off.mollisima λέγεται και Ψιλό ή Μελάθη ή Τούρκικο και έχει σχήμα

φλιτζανιού (Βουλτσιάδου και Λαγουτάρη, 2008). Έχει μορφή χοανοειδή και δεν

βρίσκεται ποτέ σε ρηχά νερά, με εξαίρεση τα αλιευτικά πεδία της Ν. Κρήτης. Αν και η

S.off.mollisima έχει ιδιαίτερα χαρακτηριστικά, μέχρι τώρα θεωρήθηκε να είναι ένα υπο-

είδος (Vacelet, 1987, Pronzato et al., 2003).

Αυτό το υποείδος η Μελάθη ξεχωρίζει πολύ εύκολα από το προηγούμενο (Ψιλό).

Παρουσιάζει σημαντικές διαφορές , κυρίως στο σχήμα του και όχι στην υφή του. Οι

έξοδοι νερού τοποθετούνται κυρίως στο εσωτερικό του κυπελλοειδούς σχηματισμού.

Το βάθος που το συναντάμε μπορεί να ξεκινάει από λίγα μέτρα (10m) και να φθάνει τα

100m και πάνω. Το μέσο βάθος που προτιμά να ζει είναι γύρω στα 50m. Βρίσκεται σε

βυθούς με χονδρόκκοκη άμμο, μεγάλα βράχια και σε λιβάδια Ποσειδωνίας( Pronzato et

al. 1998a, Pronzato and Manconi, 2008). Το μέγεθος του φθάνει μέχρι 25-30cm και στο

πάνω μέρος, όπου είναι τοποθετημένα τα στόμια εξόδου, η επιφάνεια του είναι κοίλη

Βουλτσιάδου και Λαγουτάρη, 2008).. Αλιεύεται στην Κρήτη, στα Δωδεκάνησα και στις

Κυκλάδες (Castritsi- Catharios, 1998).

Εικόνα 3. Διαφορετικές μορφές S.off.mollisima που συλλέχθηκαν από διαφορετικές

περιοχές του Αιγαίου Α) μεγάλα βάθη, Β) ρηχά, εύτροφα νερά (Castritsi- Catharios, 1998)


21

1.3.4 Spongia zimocca (Schmidt,1862)

Το είδος S. zimocca, είναι ένα πραγματικό πρόβλημα για τους ταξινομιστές και

αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι παρουσιάζει ποικιλομορφία, καθώς έχει πολλές

ομοιότητες με άλλα είδη του γένους. Ωστόσο, οι επαγγελματίες αλιείς σπόγγων είναι σε

θέση να γνωρίζουν εύκολα το είδος αυτό με βάση τα δικά τους εμπειρικά κριτήρια

(Castritsi- Catharios et al., 2011).

Η κοινή του ονομασία είναι Τσιμούχα. Έχει μαύρο προς γκρι χρώμα εξωτερικά ενώ

στο εσωτερικό του έχει καφέ σκούρο. Έχει μορφή συμπαγή ακανόνιστη ή μορφή

δακτύλων ή μορφή ελάσματος. Γενικά είναι πολύ ποικιλόμορφο είδος

(Βουλτσιάδουκαι Λαγουτάρη, 2008, Pronzato and Manconi, 2008).

Το υδροφορικό της σύστημα είναι πολύ καλά ανεπτυγμένο. Οι θάλαμοι των

χοανοκυττάρων είναι σφαιρικοί, στους οποίους απολήγουν τα κανάλια εισόδου του

νερού. Η θερμοκρασία είναι μια σημαντική παράμετρος για τη μεταβολή της υφής του.

Προτιμά τα κοραλλιογενή υποστρώματα και συναντάται σε βάθη 25-82m. Αλιεύεται

στη Σάμο, στη Κρήτη, στα Δωδεκάνησα και στις Κυκλάδες (Castritsi- Catharios 1998)

Εικόνα 4: Μερικοί τύποι της S. zimocca (από διαφορετικά αλιευτικά πεδία) (Castritsi-

Catharios 1998)


22

1.4 Αλιεία

Η σπογγαλιεία παλιότερα γινόταν από δύτες που φορούσαν σκάφανδρο, το οποίο

εισήχθη στην Ελλάδα το 1866, με καμάκι (από το καΐκι) και με τη γκαγκάβα. Οι

σπογγαλιείς με το ένα χέρι κρατούσαν το καμάκι και με το άλλο το βυθοσκόπιο. Η

σπογγαλιεία με σκάφανδρο άρχιζε Άνοιξη και τελείωνε το Φθινόπωρο. Η μέθοδος

αυτή, αν και η πιο ασφαλής εγκαταλείφτηκε, λόγω λιγότερης αποδοτικότητας από τις

άλλες. (Castritsi- Catharios 1998).

Η σκληρή και θερμή στολή κατάδυσης ήταν μια καινοτόμος συσκευή που επέτρεπε

στους δύτες να βουτήξουν στα βάθη για μεγάλες χρονικές περιόδους και να αναπνέουν

αέρα αντλώντας τον από την επιφάνεια. (Flegel, 1905).

Το σύστημα « Φερνέζ » γύρω στο 1930, ήταν ουσιαστικά η μόνη μέθοδος που

χρησιμοποιούταν για τη συγκομιδή σφουγγαριών. Περιλαμβάνει αεροσυμπιεστή

χαμηλής πιέσεως από όπου τροφοδοτείται με αέρα η αναπνευστική συσκευή του δύτη

μέσω σωλήνα. Μετά τον Δεύτερο Παγκόσμιο Πόλεμο, η τεχνική αυτή εξελίχθηκε σε

τεχνική « Ναργιλέ », η οποία χρησιμοποιείται ακόμα και σήμερα, με μερικές

παραλλαγές (Pronzato and Manconi, 2008). Στο σύστημα « Ναργιλέ » ο δύτης φοράει

στολή βατραχανθρώπου με ειδικά παπούτσια και είναι η πιο ασφαλής μέθοδος. Οι

παραπάνω μέθοδοι ισχύουν για βάθη μεγαλύτερα των 40 – 50m, ενώ για καταδύσεις 20

– 25m. Η όλη διαδικασία διαρκεί 70 – 80 λεπτά. (Castritsi- Catharios, 1998).

Τέλος, ένα άλλο σύστημα το οποίο βρίσκεται ακόμη σε χρήση για πολύ λίγα σκάφη

είναι η « γκαγκάβα ». Είναι συρόμενο εργαλείο, το οποίο αποτελείται από ένα

σιδερένιο ορθογώνιο τελάρο, στις γωνίες του προσαρμόζονται μεταλλικοί ράβδοι, που


23

ενώνονται σε έναν κρίκο. Στο τελάρο εφαρμόζεται ένας διχτυωτός σάκος μήκος 8m και

διάμετρος 3 – 4m. Η γκαγκάβα χρησιμοποιείται μόνο σε ομαλούς βυθούς σε βάθη της

τάξης των 100-200 m (Hennique 1888)

1.5Σκοπός εργασίας

Ο σκοπός της συγκεκριμένης διατριβής είναι η μοριακή ταυτοποίηση, διαφορετικών

ειδών θαλάσσιων εμπορικών σπόγγων με προέλευση από τον Ελλαδικό χώρο. Η

διαδικασία που ακολουθήθηκε για την ανάδειξη των σχέσεων μεταξύ των διαφορετικών

ειδών ήταν η δημιουργία φυλογενετικών δένδρων με τη χρήση μιτοχονδριακών

μοριακών δεικτών. Οι φυλογενετικές αναλύσεις έχουν το εν δυνάμη πλεονέκτημα της

πιο ολοκληρωμένης εξήγησης των εξελεκτικών δυνάμεων και δημογραφικής ιστορίας

των ειδών μέσω της γενετικής διαφοροποίησης. Οι περιβαλλοντικές δυνάμεις και κατά

συνέπεια οι εξελικτικές πιέσεις έχουν ως αποτέλεσμα την διαφοροποίηση των ειδών

είτε με τη μέθοδο της κλαδογένεσης είτε με την αναγέννηση.

Στη παρούσα εργασία μελετήθηκε η συσχέτιση διαφορετικών ατόμων θαλασσίου

σπόγγου σε επίπεδο ταξινομικής ιεραρχίας. Διάφορα άτομα 4 ειδών από την Ανατολική

Μεσόγειο χρησιμοποιήθηκαν με σκοπό την καλύτερη κατανόηση των φυλογενετικών

σχέσεων σε επίπεδο DNA. Για τον σκοπό αυτό αναλύθηκαν περιοχές του

μιτοχονδριακού DNA (mtDNA). Πρώτα εξετάστηκε εάν διαφοροποιείται η ταξινομία

των ειδών (των οποίων η κατάταξη έχει γίνει με μορφολογικά χαρακτηριστικά) και

δεύτερον εάν υπάρχει περαιτέρω διαχωρισμός σε υποείδη.


24

2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

2.1 Δειγματοληψία

Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία είναι 10 από τα οποία τα

5 αλιεύθηκαν στο Αιγαίο (Hippospongia communis, Spongia officinalis adriatica,

Spongia zimocca, Spongia officinalis mollissima), 2 στην περιοχή της Καλύμνου

(Spongia officinalis mollissima) , 1 στη περιοχή Βίκως (Hippospongia communis) και

τα άλλα 2 (Hippospongia communis, Spongia officinalis mollissima) από άγνωστη

περιοχή αλίευσής τους. Τα είδη και οι τοποθεσίες αλίευσής τους δίνονται στην Εικόνα

5 που ακολουθεί.

Εικόνα 5: Ελληνικός χάρτης με τις τοποθεσίες αλίευσης των ειδών.


25

Ιστός βάρους περίπου 2 gr από κάθε δειγμα συλλέχτηκε και μεταφέρθηκε σε

κωνικές πλαστικές φιάλες τύπου Falcon σε αλκοόλη συγκέντρωσης 90%. Τα

δείγματα φυλάχτηκαν σε θερμοκρασια -20 οC μέχρι την περαιτέρω ανάλυση τους.

2.2 Απομόνωση DNA

Η απομόνωση του γενετικού υλικού DNA έγινε ακλουθώντας το πρωτόκολλο με

CTAB (Sambrook et al. 1998) με κάποιες τροποποιήσεις .

Τα στάδια που ακολουθήθηκαν είναι:

1.Μικρό κομμάτι ιστού (~0,01 gr) τοποθετήθηκε σε αποστειρωμένη κυβέττα τύπου

Eppendorf.

2. Στο Eppendorf προστέθηκαν:

10ml H2O

0,2 grl CTAB

0,121 gr Tris HCL ( ph=8 )

0,074 gr EDTA

0,818 gr NaCl

20 μl β – mercaptoethanol

10 μl Πρωτεινάση Κ (Proteinase K) συγκέντρωσης 20 mg/ml

3. Έγινε λιοτρίβιση του ιστού με έμβολο μέσα στο μείγμα παρουσία αζώτου και

τοποθετήθηκε το δείγμα για επώαση σε υδατόλουτρο, στους 55ο C, για τουλάχιστον 2

ώρες (για την απομάκρυνση των πρωτεϊνών).


26

4. Μετά την επώαση προστέθηκαν 4600μl φαινόλης-χλωροφόρμιο-ισομυλική

αλκοόλη σε αναλογία 25:24:1.

5. Ανακινήθηκαν ελαφρώς για 30 λεπτά σε περιστρεφόμενο αναδευτήρα (rotator)

στους 40 κύκλους/min και ακολούθησε φυγοκέντρηση για 10 λεπτά σε 13.000

στροφές σε θερμοκρασία 4 C για να διαχωριστούν σε 2 φάσεις. Μετά την

φυγοκέντρηση απομακρύνθηκε η υπερκείμενη φάση με την βοήθεια πιπέτας και

τοποθετήθηκε σε καινούριο Eppendorf.

6. Στο νέο Eppendorf προστέθηκαν 400 μl χλωροφόρμιο-ισομυλική αλκοόλη σε

αναλογία 24:1.

7. Ακολούθησε ανάδευση για 30 λεπτά σε περιστρεφόμενο αναδευτήρα (rotator)

στους 40 κύκλους/min και φυγοκέντρηση για 10 λεπτά σε 13.000 στροφές σε

θερμοκρασία 4 C.

8. Μετά το τέλος της δεύτερης φυγοκέντρησης αφαιρέθηκε ξανά το υπερκείμενο

και τοποθετήθηκε σε τρίτο Eppendorff στο οποίο προστέθηκε ποσότητα οξικού

νατρίου (Sodium acetate) συγκέντρωσης 3M, ίση με το 10% της ποσότητας του

υπερκείμενου και ίσος όγκος ισοπροπανόλης με το υπερκείμενο που

αφαιρέθηκε.

9. Το Eppendorff τοποθετήθηκε στους -20ο C για 30 min

10. Έγινε φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στις 13.000 στροφές, στους 4ο C.

11. Μετά την φυγοκέντρηση σχηματίστηκε λευκό ίζημα (pellet) (στο κάτω μέρος

του Eppendorff).

12. Αφαιρέθηκε προσεκτικά η αλκοόλη (χωρίς να πέσει η πελέτα) και προστέθηκε

200 ml αιθανόλη.


27

13. Στο δείγμα έγινε ξανά φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στις 13.000 στροφές, στους

4ο C.

14. Η αιθανόλη αφαιρέθηκε τελείως και το Eppendorf τοποθετήθηκε με ανοικτό το

πώμα στον κλίβανο επωάσεως για περίπου 20 λεπτά στους 40 C για να

εξατμιστούν τα υπολείμματα αιθανόλης.

15. Έπειτα διαλύθηκε η πελέτα σε 50 μl TE και αποθηκεύτηκε σε καταψύκτη στους

-20ο C, μέχρι να αναλυθεί.

2.3 Ηλεκτροφόρηση DNA

Μετά την απομόνωση του DNA, προκειμένου να ανιχνευθεί η ποσότητα και η

ποιότητά του, έγινε ηλεκτροφόρηση. Η ηλεκτροφόρηση έγινε με πηκτή αγαρόζης

(Invitrogen) 1% σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ 1% (Tris-HCl, Acetic Acid και ΕDTA,

pH= 8).

Για την παρασκευή της πηκτής αγαρόζης χρησιμοποιήθηκαν:

100 ml ΤΑΕ

1 g στερεής αγαρόζης, και

3 μl Βρωμιούχου Αιθίδιου

Η στερεή αγαρόζη διαλύθηκε μέσα στο διάλυμα ΤΑΕ, με θέρμανση για 3 λεπτά,

στους 90ο C. Στη συνέχεια προστέθηκε 3 μl ποσότητας Βρωμιούχου αιθιδίου και μετά

από σύντομη ανακίνηση το διάλυμα μεταφέρθηκε σε κατάλληλο εκμαγείο, στο οποίο

έχει τοποθετηθεί ειδική “χτένα” για τη δημιουργία θέσεων. Έπειτα αφού το πήκτωμα


28

έπηξε, αφαιρέθηκε το “χτενάκι” και τοποθετήθηκε μέσα στην συσκευή

ηλεκτροφόρησης (SCIE-PLAS).

Από τα δείγματα του DNA φορτώθηκαν 6 μl μαζί με την προσθήκη 2 μl χρωστικής

βρωμοφαινόλης (Blue-bromophenol) σε κάθε μια θέση, για το διαχωρισμό των

προϊόντων του DNA. Στη συνέχεια διοχετεύθηκε τάση, 80 Volt, στην συσκευή

ηλεκτροφόρησης μέσω του τροφοδοτικού (CONSORT E143) για 30 λεπτά. Μετά το

τέλος της ηλεκτροφόρησης η πηκτή τοποθετήθηκε στο μηχάνημα DNR, Mini Bis Bio-

Imaging Systems, με το οποίο λήφθηκε φωτογραφία της πηκτής με την χρήση

υπεριώδους ακτινοβολίας (UV).

2.4 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)

Από το γενομικό DNA, για το σκοπό της εργασίας, επιλέχθηκαν για ενίσχυση οι

περιοχές 18SrRNA ( Peterson et al., 2000) με την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης

πολυμεράσης (PCR). Η αλληλουχία των εκκινητών φαίνεται στον Πίνακα 2.

Πίνακας 2: Αλληλουχία των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του DNA.

Περιοχή Εκκινητής Αλληλουχία Πηγή

18SrRNA R

F

5'-TTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-

3'

5'- CTGGTGCCAGCAGCCGCGG -3'

Peterson

, 2000

Peterson

, 2000


29

Οι συνθήκες της PCR, για κάθε εκκινητή, καθορίστηκαν με πειραματικό

σχεδιασμό αλλάζοντας μια συνθήκη κάθε φορά .

Οι συνθήκες θερμοκρασιακών κύκλων που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση

του DNA είναι οι ακόλουθες: Μετά από μια δεκάλεπτη αποδιάταξη στους 94ο C,

ακολουθούν 40 κύκλοι: αποδιάταξης στους 94ο C για 2:50 min, υβριδισμού στους 59

ο C

για 18SrRNA, για 45 sec και επιμήκυνσης (extention) στους 72ο C για 1:20 min. Τέλος

ακολουθεί η τελική επιμήκυνση στους 72ο C για 5 min.

Τα προγράμματα συνθηκών θερμοκρασιακών κύκλων που χρησιμοποιήθηκαν για την

PCR δίνονται αναλυτικά στον Πίνακα 3.

Πίνακας 3. Προγράμματα που χρησιμοποιήθηκαν στην PCR.

Προγραμματισμός

Βήμα 18SrRNA

1

94o C /

2:50 min

2

94ο C / 45

sec

40 κύκλους 3

59οC / 45

sec

4

72ο C /

1:20 min

6 72o C / 5


30

min

7 10ο C / 0

Η αντίδραση της PCR έγινε σε συνολικό όγκο 25 μl και αποτελούταν από 5 μl

PCR buffer (10X), 3 μl MgCl2(25mM),, 0,6 μl dNTPs (10 mM από κάθε νουκλεοτίδιο:

dATP, dCTP, dGTP και dTTP), 1 μl από κάθε εκκινητή (10μM) (forward-reverse), 0,3

μl Taq DNA πολυμεράση (5 unit/μl) και 1 μl DNA. Ο υπόλοιπος όγκος μέχρι τα 25 μl

συμπληρώθηκε με υπερκάθαρο νερό. Στον Πίνακα 4 δίνονται αναλυτικά οι

συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν για την PCR. Τα προϊόντα

της PCR ελέγχθηκαν σε ηλεκτροφόρηση με πηκτή αγαρόζης (1gr), χρησιμοποιώντας

5μl από το προϊόν. Στο τέλος έγινε ο καθαρισμός των δειγμάτων, με την παρακάτω

διαδικασία προκειμένου να αποσταλούν για αλληλούχιση.

200 μl ΝΤΙ για 10 min στους 55οC σε υδατόλουτρο

Μεταφέρεται όλο το υγρό στα tubes με τα φιλτράκια

Γίνεται φυγόκεντρος για 30 sec σε 11:000 στροφές

Προστίθεται στα προηγούμενα tubes 700μl ΝΤ3

Γίνεται πάλι φυγόκεντρος για 30 sec σε 11:000 στροφές

Τα βήματα 4-5 επαναλαμβάνονται 2 φορές

Ξανά φυγόκεντρος για 1min σε 11:000 στροφές

Σε καινούργια tubes τοποθετείται 15-30μl ΝΕ

Αφήνεται 1minσε θερμοκρασία δωματίου

Τέλος γίνεται φυγόκεντρος για 1min σε 11:000 στροφές

Πίνακας 4. Συγκεντρώσεις αντιδραστηρίων για τελικό όγκο PCR 50 μl.


31

Αντιδραστήριο Ποσότητα

(μl)

10X PCR Buffer 5

MgCl2(25mM) 3

dNTPs(10 mM dATP,

10 mM dCTP, 10 mM

dGTP και 10 mM

dTTP)

0,6

Εκκινητής Forward 1

Εκκινητής Reverse 1

Taq DNA

πολυμεράση(5

unit/μl)

0,3

DNA 1

H2O 15,7

Σύνολο 25

2.5 Ανάλυση δεδομένων

Τα αποτελέσματα των αλληλουχήσεων αρχικά ελέγχθηκαν για τυχών λάθη από

τα χρωματογραφήματά τους με τη βοήθεια του προγράμματος ChromasPro Version

1.7.4 και διορθώθηκαν στο πρόγραμμα BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall,

1999). Με το ίδιο λογισμικό έγινε και η ευθυγράμμιση των τελικών αλληλουχιών

χρησιμοποιώντας την επιλογή ClustalW Alignment (Thompson, 1994). Για την

ταυτοποίηση των αλληλουχιών έγινε έλεγχος ομολογίας, με λογισμικό ΒLAST σε


32

δυκτιακή βάση δεδομένων (NCBI). H φυλογενετική ανάλυση έγινε με την χρήση του

λογισμικού MEGA 5.10 (Tamura et al., 2011). Για τη δημιουργία των φυλογενετικών

δένδρων ακολουθήθηκε η μέθοδος Construct / Test Μaximum Likelihood Tree με το

μοντέλο Tamura-Nei model. Ο υπολογισμός των γενετικών αποστάσεων έγινε επίσης

με το λογισμικό ΜΕGA 5.10 συνολικά για όλες τις αλληλουχίες. Μετρήθηκαν οι

παρακάτω παράμετροι: Ανά ζεύγος γενετική απόσταση (Pairwise distance), ανάλυση

ομοιογένειας με βάση το πρότυπο υποκαταστάσεων (Estimate Substitution Matrix).


33

3.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

3.1 Εύρεση ομολογίας και νουκλεοτιδική ευθυγράμμιση

αλληλουχιών

Όπως προαναφέρθηκε για την ταυτοποίηση των αλληλουχιών έγινε έλεγχος

ομολογίας, με λογισμικό ΒLAST και στον Πίνακα 5 απεικονίζοντα τα είδη που

εμφάνισαν τη μεγαλύτερη ταυτοποίηση με τις αλληλουχίες των δειγμάτων που

μελετήθηκαν και τα ποσοστά Homology.

Πίνακας 5: Είδη που εμφάνισαν τη μεγαλύτερη ταυτοποίηση με τις αλληλουχίες των

δειγμάτων που μελετήθηκαν και τα ποσοστά Homology.

Είδος Ποσοςοστό (%) Συγγενικά είδη

Hippospongia

communis

99% H. communis 18S ribosomal RNA

gene, partial sequence

99% S. officinalis 18S ribosomal RNA

gene, complete

Spongia officinalis

adriatica


gene, comlete sequence




34

Spongia officinalis

mollissima


gene, complete sequence



Spongia zimocca

91% S. officinalis 18s ribosomal RNA

gene, complete sequence



3.2 Φυλογενετικά δένδρα

Το φυλογενετικό δένδρο που προέκυψε από την επεξεργασία των αλληλουχιών

φαίνεται παρακάτω, Εικόνα 6.

Εικόνα 6: Δενδρόγραμμα γενετικής απόστασης με την χρήση της μεθόδου Construct / Test

maximum Likelihood Tree με το μοντέλο Tamura-Nei model.


35

3.3 Πρότυπο υποκατάστασης

Κάθε καταχώρηση είναι η πιθανότητα υποκατάστασης (r) από μία βάση

(γραμμή) προς μια άλλη βάση (στήλη). Το σχέδιο υποκατάστασης και οι τιμές

υπολογίστηκαν σύμφωνα με την Tamura-Nei (1993) μοντέλο [1]. Οι τιμές των

διαφόρων μεταβατικών αντικαταστάσεις εμφανίζονται με έντονους χαρακτήρες και τις

αντικαταστάσεις των μεταστροφών εμφανίζονται με πλάγια γράμματα. Σχετική τιμές

των στιγμιαίων r πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την αξιολόγηση τους. Για

απλότητα, άθροισμα των τιμών r γίνεται ίση με 100, είναι οι συχνότητες νουκλεοτιδίων

Α = 25,44%, Τ / U = 27,79%, C = 22,29%, και G = 24,48% (Πίνακας 6).

Πινάκας 6: Μέγιστη εκτίμηση πιθανοτήτων του Πίνακας Υποκατάστασης (Maximum

Likelihood Estimate of Substitution Matrix).

A T/U C G

A - 6.01 4.82 13.55

T/U 5.50 - 12.96 5.29

C 5.50 16.15 - 5.29

G 14.09 6.01 4.82 -

3.4 Ανάλυση ομοιογένειας με βάση το πρότυπο υποκαταστάσεων

Μελετήθηκε η πιθανότητα απόρριψης της μηδενικής υπόθεσης, δηλαδή ότι οι

αλληλουχίες έχουν εξελιχθεί με την ίδια μέθοδο υποκατάστασης, με βάση το μέγεθος

των διαφορών στην σύσταση σε βάσεις που διαφοροποιείται μεταξύ των αλληλουχιών

(Display index test). Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Maximum Composite Likelihood για

να υπολογιστούν οι τιμές των πιθανοτήτων, οι οποίες φαίνονται στον Πίνακα 7.


36

Πίνακας 7: Τεστ ομοιογένειας της μεθόδου υποκατάστασης μεταξύ των αλληλουχιών.

1.S.zimmoca 2.H.communis 3.S.off.adriatica 4.S.off.mollissima

1.S.zimmoca

2.H.communis 0,848

3.S.off. adriatica 0,047 0,838

4.S.off.mollissima 0,041 0,847 0,006


37

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Στην παρούσα εργασία επιχειρήθηκε να γίνει σε διάφορα είδη σπόγγων

ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους, μέσω άμεσης αλληλούχισης και να βρεθούν οι

φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ τους. Σε πρώτη φάση πραγματοποιήθηκε ενίσχυση

(PCR) του DNA που είχε απομονωθεί από τα δείγματα και προέκυψε ένα προϊόν για

κάθε δείγμα. Τα προϊόντα αυτά των PCR μας έδειξαν από μόνα τους πολυμορφισμό σε

επίπεδο είδους, καθώς είχαν διαφορετικό μήκος βάσεων (σύμφωνα με τον ζυμόγραμα -

agaroze gel), ο οποίος ήταν ικανός να διαχωρίσει σε κάποιο βαθμό ορισμένα από τα

είδη. Από την ευθυγράμμιση των αλληλουχιών που έγινε με το πρόγραμμα BioEdit,

όπως φαίνεται στο Παράρτημα, βλέπουμε ότι σε πολλές περιοχές των

ευθυγραμμισμένων αλληλουχιών παρατηρείται μεγάλη συντηρητικότητα των βάσεων.

Αρκετές διαφοροποίησεις μεταξύ των αλληλουχιών παρατηρούνται στο γονίδιο

18SrRNA, οι οποίες μας δείχνουν ότι το γονίδιο αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για

ενδοπληθυσμιακή και διαειδική ανάλυση.

Στο φυλογενετικό δένδρο που δημιουργήθηκε από την επεξεργασία των

αλληλουχιών και φαίνεται στην Εικόνα 6 φαίνεται ότι δημιουργήθηκαν 3 ομάδες ειδών

με βάση τις γενετικές τους αποστάσεις. Η πρώτη ομάδα αποτελείται από S. off.

mollisimma και S. off. adriatica, η δεύτερη από τη S. zimocca και η τρίτη από την H.

communis.

Σύμφωνα με το φυλογενετικό δέντρο η υπόθεση της ύπαρξης υποείδους στο είδος

officinalis επαληθεύεται, δημιουργώντας δύο διαφορετικά κλαδιά για τα S.οff.

mollisima και S. off. adriatica.

Από την άλλη μεριά ο υπολογισμός των γενετικών αποστάσεων που έγινε ανά

ζεύγος, δείχνει ότι τα είδη που αποκλίνουν περισσότερο είναι το H. communis και S.


38

zimocca (0,848), το H. communis και η S. off. mollisimma (0,847) και το H. communis

και η S. off. adriatica (0,838) και επίσης τα είδη με την μικρότερη απόσταση μεταξύ

τους είναι τα S. off. mollisimma και S. off. adriatica, το οποίο υποστηρίζει την

παραπάνω υπόθεση. Ο υπολογισμός της γενετικής απόστασης με βάση τη σύσταση σε

βάσεις (Πίνακας 7) μας κατέδειξε ότι το είδος H.communis φαίνεται να διαφέρει

περισσότερο από τα υπόλοιπα Τα είδη S. off. mollisima και S.off.adriatica

παρουσιάζουν μικρή αλλά ικανή εξελικτική απόσταση (0,1), έτσι ώστε να μπορούν να

θεωρηθούν ως υποείδη του S. officinalis. Τέλος από τον υπολογισμό των τιμών

υποκατάστασης των βάσεων, που παρουσιάζονται στον Πίνακα 6, βρέθηκε ότι η

μεγαλύτερη πιθανότητα υποκατάστασης υπήρξε ανάμεσα στις βάσεις C – T/U με

πιθανότητα 16.15%, ενώ οι υποκαταστάσεις με την μικρότερη πιθανότητα εμφάνισης

ήταν ανάμεσα στις βάσεις A - C και G – C με τιμή 4,82 %.

Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν τα δύο είδη H. communis και S.zimocca,

διαφέρουν στατιστικώς (0,848) με βάση τις γενετικές αποστάσεις και την φυλογένεια,

από τα υπόλοιπα είδη σπόγγων, όπως υποθέταμε, καθώς ανήκουν σε διαφορετική τάξη

από τα υπόλοιπα δείγματά μας. Το σημαντικό αποτέλεσμα στην παρούσα εργασία είναι

η επαλήθευση των S. off. mollisimma και S. off. adriatica ως υποείδη. Το H.communis

και το S.zimocca καλώς έχουν μεγάλη διαφορά, το οποίο επαληθεύει και τον

διαχωρισμό τους σε διαφορετικα είδη, (Hippospongia το ένα και Spongia το άλλο).

Στην εργασία των Peterson and Addis (2000), ένα νέο γένος και είδος σπόγγου

του γλυκού νερού, Clypeatula cooperensis, συλλέγεταιι από τρεις λίμνες της Βόρειας

Βραχώδη Όρη της Μοντάνα, ΗΠΑ. Ο σπόγγος μεγαλώνει ως ένα σκληρό, με σχήμα

δίσκου, επιχρίοντας την κάτω επιφάνεια των βράχων. Στο πείραμά τους έγιναν

φυλογενετικές αναλύσεις πλήρους 18S rDNA αλληλουχιών του C. cooperensis,


39

Ephydatia muelleri, Spongilla lacustris και Eunapius fragilis και τα αποτελέσματά τους

έδειξαν ότι C. cooperensis είναι πιο στενά συνδεδεμένη με Ephydatia muelleri παρά με

Spongilla lacustris ή Eunapius fragilis. Τα δεδομένα ωστόσο, δεν απόκλειαν το

ενδεχόμενο ότι η C. Cooperensis είναι πιο στενά συνδεδεμένη με τα μη gemmulating

σφουγγάρια από τη λίμνη Baikal (Ρωσία) από ό,τι είναι Ephydatia muelleri. Οι

φυλογενετικές αναλύσεις υποστηρίζουν την ανέγερση ενός νέου γένους, η μονοφυλίας

σφουγγαριού του γλυκού νερού που ανήκουν στις οικογένειες Spongillidae και

Lubomirskiidae, και της μονοφυλίας των demosponges.

Αντίθετα στην εργασία των Addis and Peterson (2005), αναλύονται οι

φυλογενετικές σχέσεις των σπόγγων γλυκού νερού (Porifera, Spongilla) που

προκύπτουν από την ανάλυση των 18S rDNA, COI mtDNA, και ITS2 rDNA

αλληλουχιών και συλλέχθηκαν από τον Pachaug ποταμό, Connecticut, στις ΗΠΑ. Οι

φυλογενετικές σχέσεις των εννέα ειδών σπόγγων του γλυκού νερού, που εκπροσωπούν

τις οικογένειες Spongillidae, Lubomirskiidae και Metaniidae, έχουν προκύψει από τις

αναλύσεις των 18S rDNA, COI mtDNA, και ITS2 rDNA αλληλουχίες. Τα είδη αυτά

αποτελούν μια ισχυρή υποστήριξη μονοφυλετικής ομάδας στο πλαίσιο της

Demospongiae, με τις Vetulina stalactites ως αδελφική ταξινομική ομάδα. Εντός του

στελέχους σπόγγου του γλυκού νερού, η βασική ταξινομική ομάδα δεν έχει επιλυθεί.

Ανάλογα με τη μέθοδο ανάλυσης και αλληλουχίας, τα metaniid είδη, Corvomeyenia sp.,

ή τα είδη spongillid, Trochospongilla pennsylvanica, αναδεικνύεται ως το βασικό είδος.

Ανάμεσα στα υπόλοιπα είδη σπόγγου του γλυκού νερού, τα spongillids, Spongilla

lacustris και Eunapius fragilis, αποτελούν μια αδελφική ομάδα που αποτελείται από τα

είδη spongillid, Clypeatula cooperensis, Ephydatia fluviatilis, και Ephydatia muelleri,

και τα lubomirskiid είδη, Baikalospongia bacillifera και Lubomisrkia baicalensis. C.


40

cooperensis είναι ταξινομικά συγγενικά του Ε. fluvialitis, και Ε. muelleri. Η οικογένεια

Spongillidae και το γένος Ephydatia είναι επομένως παραφυλετικά σε σχέση με τα είδη

lubomirskiid, το Ephydatia είναι επίσης παραφυλετική σε στο C. cooperensis. Έτσι

πρότειναν το C. cooperensis να μεταφερθεί στο γένος Ephydatia και ότι η οικογένεια

Lubomirskiidae να ενταχθούν στα Spongillidae.

Τέλος στην εργασία των Chombard et al., (1998), έγινε επαναξιολόγηση της

ομολογίας των μορφολογικών χαρακτηριστικών των Tetractinellid σφουγγάρια με βάση

μοριακά δεδομένα. Η φυλογενετική ανάλυση των νουκλεοτιδίων έγινε με την

αλληλουχία 28S rRNA για να εκτιμηθεί η ομολογία των βελονοειδών κρυστάλλων που

χρησιμοποιούνται στη κατάταξη της υποκατηγορίας Tetractinellida. Ένα ενιαίο και

καλά υποστηριζόμενο δέντρο MP ελήφθη. Μελετήθηκε η μονοφυλία των εννέα

σπόγγων του είδου Tetractinellida. SEM μικρογραφήματα της Stryphnus microscleres

δείχνουν ότι η μορφολογία των sanidasters είναι συμβατή με την υπόθεση ότι είναι

ομόλογο με streptoscleres. Οι microscleres streptosclere δεν μπορούν να αξιολογηθούν

από την άποψη της ομολογίας, διότι Streptosclerophorida μπορεί να είναι παραφυλετική

σε αντίθεση με την επικρατούσα σήμερα κατάταξη.

Τα συμπεράσματα στα οποία καταλήξαμε από τα αποτελέσματα της διατριβής

είναι ότι: Είναι εφικτή η ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους μέσω μοριακών τεχνικών,

μπορούν τα είδη να ταξινομηθούν με βάση τις αλληλουχίες των γονιδίων τους, με τα

φυλογενετικά δένδρα μπορούμε να προσδιορίσουμε σε μεγάλο βαθμό τις γενετικές

αποστάσεις μεταξύ των διαφορετικών ειδών και περισσότεροι γενετικοί τόποι θα

δώσουν πιο ευκρινή αποτελέσματα όσον αφορά την διαφοροποίηση σε υποείδη για τα

mollisima και adriatica.


41

5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Ξένη βιβλιογραφία

Addis S. J. and Peterson J. K. (2005). Phylogenetic relationships of freshwater

sponges ( Porifera, Spongillina ) inferred from analyses of 18S rDNA, COI mtDNA,

and ITS2 Rdna seguences. Zoologica Scripta, 34: 549-557.

Anderson, S., Bankier, A., Barrell, B., de Bruijn, M., Coulson, A., Drouin, J.,

Eperon, I., Nierlich, D., Roe, B., Sanger, F., Schreier, P., Smith, A., Staden, R., and

Young, I. (1981). Sequence and organization of the human mitochondrial genome.

Nature 290, 457–465.(μονο στον Η/Υ)

Arndt, W. (1937). Porifera im Tierwelt der Nord –und Oostzee. Grimpe und

Wagler edit. 1-140. Schwamme Die Rohstoffe des Tierreichs, pp. 1577-2000.

Avise J.C. (1986). Mitochondrial-DNA and the evolutionary genetics of higher

animals. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 312: 325–342.

Barton H.N., Briggs E.G.D., Eisen A.J., Goldstein B.D.and Patel H.N. (2013).

Εξέλιξη. Εκδόσεις Utopia,Αθήνα, σελ.1037.

Boore J.L., Collins T.M., Stanton D., Daehler L.L., Brown W.M. (1995).

Deducing the pattern of arthropod phylogeny from mitochondrial DNA rearrangements.

Nature 376:163–165.

Buburuzan L., Gorgan L.D., Băra I.I. (2007). Types of DNA used in speciation

and phylogeny studies. Analele Ştiinţifice ale Universităţii, Alexandru Ioan Cuza”,

Secţiunea Genetică şi Biologie Moleculară, TOM VIII.


42

Burns K.J. (1997). Molecular systematics of tanagers (Thraupinae): evolution

and biogeography of a diverse radiation of neotropical birds. Mol. Phylogenet. Evol. 8:

334–348.

Castritsi- Catharios J. (1998). Kalymnos and the secrets of the sea.

Contribution to the sponge fisheries, pp: 37 - 39, 45 - 46, 49 - 51, 55, 56 - 57, 60, 61, 64

- 69, 70 - 71, 78, 81 - 85, 96, 98, 100, 106, 113, 117.

Castritsi- Catharios J., Rob W. M. Van Soest, Kefalas E. and Vavelet J. (2011).

Revised description of a poorly known Mediterranean Dictyoceratid bath sponge,

Spongia (Spongia) zimocca (Schmidt, 1862) (Porifera: Demospongiae: Dictyoceratida)

Zootaxa 2812:pp. 41–62.

Cook S.C. and Bergquist P.R. (2001). New species of Spongia (Porifera:

Demospongiae: Dictyoceratida) from New Zealand, and a proposed subgeneric

structure. New Zealand Journal of Marine and Freshwater Research, 35:33-58.

Chombard C., Boury-Esnault N., Tillier S. (1998). Reassessment of Homology

of Morphological Characters in Tetractinellid Sponges Based on Molecular Data. Syst.

Biol. 47(3): 351- 366.

Dixon M.T., Hillis D.M. (1993). Ribosomal RNA Secondary Structure:

Compensatory Mutations and Implications for Phylogenetic Analysis. Mol. Bio. Evol.

10(1):256-267.

Dolman G., Phillips B. (2004). Single copy nuclear DNA markers characterized

for comparative phylogeography in Australian wet tropics rainforest skinks. Mol. Ecol.

Notes 4: 185–187.


43

Fischer W., Geard N. (2002). Reconstructing phylogeny from RNA secondary

structure via simulated evolution. In: Santa Fe Institute Complex Systems Summer

School 2002, Santa Fe, NM.

Flegel C. (1905). La question des pecheurs d’éponges de la Méditerranée.

Imprimerie du Gouvernement, La Cannee, p. 63.

Folmer O., Black M, Hoeh W., Lutz R, and Vrijenhoek R. (1994). DNA primers

for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse

metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology, 3(5): 294-299.

Gaino E., Pronzato, R., (1989). Ultrastructural evidence of bacterial damage to

Spongia officinalis fibres (Porifera Demospongia). Disease Aquatic Organisms 6: 67–

74.

Gaino, E., Corriero, G. and Pronzato, R. (1994). La spongocoltura in

Mediterraneo. Quaderno 14: 41–62.

Gibbs R.A. (1990). DNA Amplification by the Polymerase Chain Reaction.

Analytical Chemistry 62: 1202-1214.

Gouliaeva N.A., Kuznetsova E.A., Gaziev A.I. (2006). Proteins associated with

mitochondrial DNA protect it against X-rays and hydrogen peroxide. Biophysics 51(4):

620–623.

Hall T.A., 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor

and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.

Heise P.J., Maxson L.R., Dowling H.G., Hedges S.B. (1995). Higher level snake

phylogeny inferred from mitochondrial-DNA sequences of 12S ribosomal-RNA and

16S ribosomal-RNA genes. Mol. Biol. Evol. 12: 259–265.


44

Hennique P.A. (1888) Une page d’archéologie navale. Les Caboteurs et

Pêcheurs de la Côte de Tunisie. Pêche des éponges, Gauthier-Villars et Fils Libraire,

Paris, p. 83.

Kefalas E., Castritsi-Catharios J. (2007). Taxonomy of some sponges (Porifera:

Demospongiae) collected from the Aegean Sea and description of a new species.

Journal of the Marine Biological Association of the United Kindom, 87:1527-1538.

Lavrov, D. V., Forget, L., Kelly, M., and Lang, B. F. (2005). Mitochondrial

genomes of two demosponges provide insights into an early stage of animal evolution.

Molecular Biology and Evolution 22, 1231–1239.

de Laubenfels M.W. (1948). The order Keratosa of the Phylum Porifera. A

Monographic Study. Allan Hancock Foundation, Occasional Paper 3. University South

California Press, Los Angeles: p. 217.

Mathews D.H., Disney M.D., Childs J. L., Schroeder S.J., Zuker M., Turner

D.H. (2004). Incorporating chemical modification constraints into a dynamic

programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proceedings of the

National Academy of Sciences, USA 101: 7287- 7292.

Moritz, C., Dowling, T. E., and Brown, W. M. (1987). Evolution of the animal

mitochondrial DNA: Relevance for population biology and systematics. Annual Review

of Ecology and Systematics 18, 269–292.

Olsen G. J. and Woese C. R. (1993). Ribosomal RNA: a key to phylogeny.

FASEB.Journal 7: 113-123.

Ouvrard D., Campbell B.C., Bourgoin T., Chan K.L. (2000). 18S rRNA

Secondary Structure and Phylogenetic Position of Peloridiidae (Insecta, Hemiptera).

Molecular Phylogenetics and Evolution 16(3): 403–417.


45

Peterson J. Kevin and Addis S. John (2000). Clypeatula cooperensis gen. n., sp. n., a

new freshwater sponge ( Porifera ,Spongillidae ) from the Rocky Mountains of

Montana, USA. Zoologica Scripta, 29: 265-274.

Pronzato R., Bavestrello G. and Cerrano C. (1998a). Morpho-functional adaptations

of three species of Spongia (Porifera, Demospongiae) from a Mediterranean cliff.

Bulletin of Marine Science, 63(2): 317–328.

Pronzato R. ( 1999). Sponge-fishing, disease and farming in the Mediterranean Sea.

Aquatic Conserv.: Marine Freshwater Ecosyst. 9: 485–493.

Pronzato R., Sidri M., Dorcier M. and Manconi R. (2003). Morphotypes of Spongia

officinalis (Demospongiae, Dictyoceratida) in two Mediterranean populations. Italian

Journal of Zoology, 70: 327–332.

Pronzato R. and Manconi R. (2008). Mediterranean commercial sponges: over 5000

years of natural history and cultural heritage. Marine Ecology 29:146-166.

Rokas A., Ladoukakis E., Zouros E. (2003). Animal mitochondrial DNA

recombination revisited. TRENDS in Ecology and Evolution 18(8): 411-417.

Ruppert E.E., Fox R.S., Barnes R.D. (2004). Invertebrate Zoology. A functional

evolutionary approach. Thomson Brooks / Cole.

Rützler K. (1976) Ecology of Tunisian commercial sponges. Tethys, 7(2–3): 249–

264.

Sella M. (1912). La pesca delle spugne in Libia. Memorie del Regio comitato

Talassografico Italiano, 13: 1–154.

Simon C., Buckley T.R., Frati F., Stewart J.B., Beckenbach A.T. (2006).

Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of


46

conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA. Annu.

Rev. Ecol. Evol. Syst. 37: 545–579.

Tamura K. and Nei M. (1993). Estimation of the number of nucleotide substitutions

in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular

Biology and Evolution 10:512-526.

Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., and Kumar S. (2011).

MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood,

Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and

Evolution 28: 2731-2739.

Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J., 1994. CLUSTALW: improving the

sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,

position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research.

Uriz M.J., Maldonado M. (2000). The genus Acanthodedrilla in the Mediterranean

Sea with description of new species. Zoosystema, 22:.401-410.

Vacelet J. (1959). Répartition générale des éponges et systématique des éponges

cornées de la région de Marseille et de quelques stations Méditerranéennes. Recueility

des Travaux de la Station Marine d’Endoume, 26 (16): 39-101.

Vacelet, J. (1964). Etude monographique de l’Eponge calcaire Pharetronide de

Mediterranee ,Petrobiona massiliana Vacelet et Levi. Les Pharetronides actuelles et

fossils. Rec. Trav. St. Mar. Endoume, 34: 1-125.

Vacelet J. (1987). Éponges. In: Fischer H., Schneider J., Bauchot F. (Eds), Fiches

FAO d’identification des espèces pour les besoins de la pêche, Méditerranée et Mer

Noire, I. Végétaux et Invertébrés. FAO-CEE, Brussels: 139–146.


47

Vacelet, J., Gaino, E., Gallissian, M.F. and Vacelet, E. (1994). Bacterial attack of

sponging skeleton during the 1986–1990 Mediterranean sponge disease. In: van Soest,

R.W.M., van Kempen, T.M.G., Braekman, J.C. (Eds.), Sponges in Time and Space.

Balkema, Rotterdam, pp. 355–362.

de Vos L., Rützler K. (1997). Thesaurus of Sponge Morphology. Smithsonian

Contributions to Zoology, 596:1-55.

Voultsiadou- Koukoura E. (1987). Some remarks on the Mediterranean species of

the genus Aplysina (Demospongiae, Verongida). Taxonomy of Porifera, 13: 275-278.

Willows-Munro S., Robinson T.J., Matthee C.A. (2005). Utility of nuclear DNA

intron markers at lower taxonomic levels: phylogenetic resolution among nine

Tragelaphus spp.. Mol. Phylogenet. Evol. 35: 624–636.

Wӧrheide G., Dohrmann M.,Erpenbeck D., Larroux C., Maldonado M., Voig O., C.,

Borchiellini and Lavrov D.V.(2012). Deep Phylogeny and Evolution of Sponges

(Phylum Porifera). Advances in Marine Biology, Volume 61, pp.1-78.

Zhao X., Li N., Guo W., Hu X., Liu Z., Gong G., WangA., Feng J., Wu C. (2004).

Further evidence for paternal inheritance of mitochondrial DNA in the sheep (Ovis

aries). Heredity 93: 399–403.

Ελληνική βιβλιογραφία

Αλαχιώτης Ν. Σ. (2007). Εισαγωγή στην εξέλιξη.εκδοτικός οργανισμος Λιβάνη,

Αθήνα, σσ. 320 - 321.


48

Βουλτσιάδου Ε. και Λαγουτάρη Ε., (2008). Σπογγοκαλλιέργεια. Βιοτεχνολογία

– Αειφόρος χρήση του θαλάσσιου πλούτου. University studio press, Θεσσαλονίκη, σσ.

19,24-25, 40 – 41.

Καστρίτση-Καθαρίου Ι., Κεφαλάς Μ. και Φασσέας Κ. (1995). Μορφολογικοί

χαρακτήρες εμπορικών ειδών σπόγγων προερχόμενων από το Αιγαίο Πέλαγος. 17ο

Επιστημονικό Συνέδριο, Πάτρα.

Hickmann, Roberts and Larson (2005). Ολοκληρωμένες Αρχές Ζωολογία, Α’:

σελ. 298-299.


49

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ


S.zimocca C T C T A A G T A T G A A T G T C T C T A T A C G T T G C A A A G T A A A C T

H.commu

nis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T G . . - - - - - - . . . . .

S of mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T G . . - - - - - - . . . . .

S zimocca G C G A A T G G C T C A T T A A A T C A G T G A T A G T T T A C T T G A T G G

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . .

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca T A A G C G C A C A C T G T C G G A T A A C T G T A C C A A T T G T A G A G C

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of

adriatica . . . . . . . . . - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca T A A T A C - - - - A C C A A G T C C C G A C T T C T G G A A G G G A T A T A

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of adriatica . . . . . . G T G C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . .

S of

mollissima . . . . . . - - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca T T T A T T A G A T A C A A A G C C A A T G C G A G C T C G G C T C G G T A C

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .


51

S zimocca A G T T G G C G A G T C A T G A T A A C T G C T C G A A T C G C A T G G C C T

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca T T G T C C C C G G C G A T G G T T C A T G C G - - - - C T T C T C C T A T C

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of adriatica . . . - . G . . . . . . . . . . . . . . . T . A A A T T T C . G C . . . . . .

S of

mollissima . . . - . G . . . . . . . . . . . . . . . - - - - - - - - C . G C . . . . . .

S zimocca A A C T C C T T G A T G G T A G G G T A T T G G C C T A C C G T T C G A A C A

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of

adriatica . . . . T - . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . G G T T . . .

S of mollissima . . . . T - . C - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . C . T T . . .

S zimocca A C G G G T A A C G G A G A A T T A G G G T T C G A T T C C G G A G A G G G A

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca G C C C G A G A A A C G G C T A C C A C A T C C A A G G A A G G C A G C C C -

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A G G

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A G G


52

S zimocca T G G G C A A A T T A C C - - - G T T C G A A - C G G G G A G G T A G T G A C

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of

adriatica C . C . . . . . . . . . . C A A T C C . . . C T . . . . . . . . . . . . . . .

S of mollissima C . C . . . . . . . . . . C A A - - - . . . C T . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca A A T A A A T A A C A A T G C - A G G C T A T T T T G G T C T G G C A A T T G

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of adriatica . . . . . . . . . . . . . . . T G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca G A A T G A G A A C T A T A T A A A T C C C T T A A C G C C A A A C A A T T G

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of

adriatica . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . A G G . . . . . . . .

S of mollissima . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca G A G G G C A A G T C T G G T G C C A G C A G C C - - - - - - - - - - - A G C

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G C G G T A A T T C C . . .

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - - - - - - - - - . . .

S zimocca T C C A A T A G C G T A T A T T A A A G T C G T T G C A G T T A A T A A G C T

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . A . . . . .

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . A . . . . .


53

S zimocca C G T A G T T G G G T T T C G G A G C G G T C A G G C T G G T C C C C C G A G

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . .

S of mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . .

S zimocca A G G C G A G T A C T G G C C G G C C G C T C T T C C A C T C G G A G T C C C

H

communis - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

S of adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . .

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . .

S zimocca T G T C T G C T C C C T A T T G C A G T G G G C A G G G A A C T C G G G A C G

H

communis - - - - - - - - - - - - - - C C . C . G A A C . C A A A . . . . T T . A T T T

S of

adriatica . . . . . . . . . T T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . .

S of mollissima . . . . . . . . . T T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . .

S zimocca T T T A C T T T G A A A A A A T T A G A G T G T T - - - - A C T G T A G G C G

H

communis C . C . T A A G . T G C C . . C G G A G T C A . . C A A T . A C A . C C . A R

S of adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C - - - . A A . C . . . . .

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C - - - . A A . C . . . . .

S zimocca A T T G C T T G A A T A C - - T G A T T A G G T G G T C A T A A T G G A A T A

H

communis G A . C . C . A G T C G G C A . A G . . T A T G . T . A G G . C . A . G . C G

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . A T . A G C A T . . A - - - - . . . . . . . . . . .

S of mollissima . . . . . . . . . . . . . A T . A G C A T . . . . . . . . . . . . . . . . . .


54

S zimocca G C T A G T A G G T T C C C T C G G T C C T A T T T C G T T G G A T T C T T C

H

communis . T A T C . G A T C G T . T . . . A A . . C C . A A . T . . C . - - . T C . T

S of

adriatica . - - - - - - . A - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - T . . .

S of mollissima . - - - - - - . A - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca C A G G A C C G A A G T A A T G A T T A A T A G G G A C A G T T G G G G G C A

H

communis G . T T . A T . . . A A C . . C C . . G G C . A A T G . T T . C . C A . T T G

S of adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca T T C G T A T T T A A T T G T C A G A G G T G A A A T T C T T G G A T T T A T

H

communis . . . . . C . . . C . . - - - - . A . T C C A . G . A . T . C - - . C C . C .

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca G A G T A C T G A A A A C A A C T G C G A A A G C A T T T G C C A A G G A T G

H

communis . . C A . T . A . . - - - - - - . A . . . . T . . C C C C A A . - - - - - . .

S of adriatica . . A A G A C . . . - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of

mollissima . . A A G A C . . . - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca T A A T C A T T A A T C A A G A A C G A A A G T T A G G G T T T C G A A G A C

H

communis . C C C T . . . . . . . . T T . C - - - - - - . . C . . T C C . G . . . A C .

S of

adriatica . T T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of

mollissima . T T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .


55

S zimocca G A T C A G A T A C C G T C C T A G T C C T A C A C C A T A A A - C T A T G C

H

communis A . C G . A . . . G G A C . G A G . . . . . . T T . . . . T . T T . C . . . .

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . - . . . . . .

S of mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . - . . . . . .

S zimocca C G A C T A G G T T C C T G T T C C G G T A A T A T T G A A T G A C T C C G T

H

communis T A . T G T A T . C A A G C A A T . . C C T G C T . . . . . C - . . . . T A -

S of adriatica . . . . . . . . G A T . A - - . . G . A . G T . . . . . . . . . . . . . . . .

S of

mollissima . . . . . . . . G A T . A - - . . G . A . G T . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca T G G C A C C T T A T G A G A A A T C A A A G T T T T T G G G T T C C G G G G

H

communis - - - - . T T . . T . C . A . G - - T . . . C G . C C C . A A . . . . C T . C

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca G G A G T A T G G T C G C A A G - - - G C T G A A A C T T - A A A G G C A T T

H

communis C C . C . G C A A . A A A G . . C A G A . A . G G . . . C C G . G A . G . A G

S of adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . - - - . . . . . . . . . . - . . . . . A . . .

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . - - - . . . . . . . . . . - . . . . . A . . .

S zimocca G A C G G A A G G G C A C C A C C A G G A C T T G G T G G A G C C T G C G C T

H

communis A G . . . C C . . C . . G T . . T C . C C T C . C . G C . G A . . A . . C T G

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - - - . . . . . . . . . . . . G C

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G C


56

S zimocca T T T G T C T A - - G A C T C A A C A C G G G A A A A C T C A C C A G G T C C

H

communis A C C . C T C C G A A . . C . . . . T A C . A G C T T T . T . A . T . C A A .

S of

adriatica . . A A . T . - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of mollissima . . A A . T . - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca A G A C A T G G T A A G G A T T G A C A G A T T G A G A G C T C T T T C - - T

H

communis . A C T T . A A . . T A C G C . A T T G . . G C T G . . A T . A C C G . G G C

S of adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - .

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - - .

S zimocca T G A T T C T A T G G G T G G T G G T G C A T G G C C G T T C T T A G T T G G

H

communis . . C . G G C . C C A . A C T . . C C C T C C A A T T . . . . C . C . . . A A

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca T G G A G T A A T - T T G T C T G G T T A A T T C C G T T A A C G A A C T A G

H

communis G . . . T . T . . A . . . . T C - - . C . T . C . A A . . G C . A G . . C . A

S of adriatica . . . . . . G . . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . .

S of

mollissima . . . . . . G . . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . .

S zimocca A C - - - C T T A A C - C T G C T A C T T G C T A G T T A C G C C A T T C T C

H

communis . A T A G . C C . G . A T . . T . . T . . A T . - . . C . . T A . C . C . C .

S of

adriatica . . - - - . . . . . . - . . . . . . - - - A . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of

mollissima . . - - - . . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .


57

S zimocca G A A T G G T G G C C A A A T - C T T A G A G G G A C T A T C G G T G T T C -

H

communis . . G . C . G . A T T G G G . A A . . T . C . C . C . . G C T . C C T . C . T

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . C . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -

S of mollissima . . . . . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -

S zimocca - - - A A C C G A T G G A A G T T T G A G G C A A T A A C A G G T C T T T G A

H

communis T G G . T G T . G . A . C C . . . . C T C A G G C . C C . T C T C . G G A A T

S of adriatica - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . .

S of

mollissima - - - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . .

S zimocca T G C C C T T A G A T G T T C T G G G C C A C A C G C G C G C T A C A C T G A

H

communis C . A A . C C T A . . T C . . C . - - T T . . C . . T T T . T A . . C A . . G

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca T C G A G C C A G C G A G C C T G T C A C T C - - - G C C G G T A G G T G C G

H

communis . - A G . . . . A T A C C . T . A C . . T C G A A A . T T . A . . . . - . . A

S of adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . - - - . . . . . . . . . . . . .

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . - - - . . . . . . . . . . . . .

S zimocca G A T A A T C T T G T G A A A C - T C G A T C G T G C T G A G G G T A G A C C

H

communis . . A . T . T G A A . . . . C . A . . . C C G . C . . A A . . . C C . T G . G

S of

adriatica . G . . . . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . . . . . G . . A . . . . . .

S of

mollissima . G . . . . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .


58

S zimocca A T T - - - G C A A T T A T T G G T C C T C A A C G A G G A A T T C C T A G T

H

communis . . . C G A . . . G . . . . C A T G A . . . G C . A . - - - - - C T G . . C C

S of

adriatica . . . - - - . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of mollissima . . . - - - . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca A A G C T G G C A A G T - C A T C A G C T T - G C C T G A A T T G A T T A C G

H

communis G . . . C . A A G C T C G . . . T G . . . . T . T A . C T . A . A . A . . . A

S of adriatica . . . . - - . . . . . . - . . . . . . . . . - . . - - - - G . . . . . . . . .

S of

mollissima . . . . - - . . . . . . - . . . . . . . . . - . . - - - - G . . . . . . . . .

S zimocca T C C C T G C C C T T T G T A C A C A C C G C C C G T C G C T A C T A C C G A

H

communis . . . . . - - - T C C A . A . G T . G G G A . T T . G T . . A C G . . T T A G

S of

adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S of mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

S zimocca T T G A A T G G T T T A G T G A G A T C T T C G G A T T G G A G T C C T C C C

H

communis C . C T . C A A . . - G . . A C A G . T A . . C . . G . . C G . . T A C . A T

S of adriatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G G

S of

mollissima . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G G

S zimocca T T G G C G G C G A C G C C A C C T T G G C T C A A C C G A G A A G A T G A C

H

communis C A A . T A A - - - - - - - . . T A . A A Y . G . T T T A . T G . . C C A T T

S of

adriatica . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G - . . . . . . . . . . . T . . . .

S of

mollissima . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G - . . . . . . . . . . . T . . . .


59

S zimocca C - T A A C T G A A T T A T T T A G A G G A A G T T A A - G T C G T A A C A A

H

communis . G C . G T . T C . C A G . A . . . . . A C . T . C . T A C . T A - G . . . T

S of

adriatica . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . A . . . . . . . . . .

S of mollissima . - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - . . . . . . . . . .

S zimocca - -

H

communis G C

S of adriatica - -

S of

mollissima - -


ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ …2.4 Αλυσιδωτή Αντίδραση...

Documents

Transcript of ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ …2.4 Αλυσιδωτή Αντίδραση...