Metode molekularne biologije

Metode za analizu hromozoma

Hromozom – χρώμα (hroma) - boja i σώμα (soma) – telo Sposobnost bojenja hromozoma je bila osnov na kojoj su se

bazirale pionirske metode za analizu hromozoma

• Skup svih hromozoma u jednoj ćeliji, sa opisom njihovog broja i morfologije, predstavlja kariotip

• Hromozomi složeni po nekom sistemu, najčešće po veličini i morfologiji, čine kariogram

• Shematski prikaz kariograma označava se kao idiogram

Tehnike bojenja traka

• Uzorci: Sva tkiva čije se ćelije dele ili se mogu stimulisati na deobu

• Metode kariotipizacije

• Analiza hromozoma vrši se u metafazi ćelijske deobe korišćenjem svetlosnog mikroskopa

• G trake - bojenje tripsinom i gimzom

• R trake – reverzna tehnika – suprotni kontrast od G traka

• Q trake – bojenje kao i kod G traka a analiza fluorescentnim mikroskopom

• C trake - za bojenje konstitutivnog heterohromatina, za analizu stukturnih promena u okolini centromera

Tehnike bojenja traka

• Numeričke i strukturne aberacije hromozoma

• Detekcija hromozomskih rearanžmana većih od 2 Mb

• Široka primena za utvrđivanje hromozomskih rearanžmana u ćelijama fetusa (prenatalna dijagnostika) i u dijagnostici hematoloških neoplazmi

Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH

• Detekcija specifičnih regiona molekula DNK u citološkom materijalu fiksiranom na mikroskopskim pločicama

• Proces sparivanja jednolančanih polinukleotida iz dva različita izvora na osnovu komplementarnosti baza naziva se HIBRIDIZACIJA

• U mnogim tehnikama jedan polinukleotid je definisana sekvenca ili hemijski sintetisan molekul – PROBA – FLUORESCENTNO OBELEŽENE PROBE

• In situ znači u mestu (preseci tkiva ili citoloških uzoraka)

Različiti tipovi proba za fluorescentnu in situ hibridizaciju (FISH)

Gen-specifična proba Centromerna proba Telomerna proba Hromozom-specifična proba (Chromosome-painting probe)

Probe za repetitivne DNK sekvence

Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH

• Prednost u odnosu na tehniku bojenja traka: analiza i metafaznih hromozoma i interfaznih jedara

• FISH metodom detektuju se strukturne promene u genomu veće od 0,5kb

• Numeričke aberacije, strukturni hromozomski rearanžmani, genske mutacije

Komparativna genomska hibridizacija

• Konstruisana za analizu strukturnih promena u genomu tumorskih ćelija

• Metoda se bazira na kvantitativnom dvobojnom FISH-u

• Simultana hibridizacija dva različita uzorka genomskih DNK sa normalnim metafaznim hromozomima na mikroskopskoj pločici

• Kontrolna genomska DNK izolovana iz tkiva zdrave osobe i genomska DNK tumorskog tkiva.

• Uzorci genomskih DNK obeležavaju se sa dve različite genomske probe.

• Zelena boja od biotina genomske proba kojom je obeležena tumorska DNK a crvena boja od digoksigena genomske probe kojom je obeležena kontrolna DNK.

Komparativna genomska hibridizacija

• Varijacije u intenzitetu boje čitavih metafaznih hromozoma odražavaju numeričke hromozomske aberacije, dok varijacije u intenzitetu fluoroboja u delovima istih hromozoma reflektuju promene u broju kopija delova hromozoma (duplikacije ili delecije delova hromozoma)

Metode za analizu nukleinskih kiselina

Načini sinteze i obeležavanja proba za hibridizaciju sa nukleunskim kiselinama

Probe

• Jednolančane DNK probe

• Dvolančane DNK probe

• RNK probe

• Oligonukleotidne probe

• Radioaktivno i neradioaktivno probe

Radioaktivno obeležene probe

• Sadrže inkorporisane nukleotide sa radioizotopima (32P, 35S ili 3H) ili mogu biti obeležene na 5’-kraju sa radioaktivnim 32P.

• Obeležavanje na 5’-kraju sa radioaktivnim 32P zasnovano je na korišćenju bakteriofagnog enzima polinukleotid kinaze, koja obeleženu g fosfatnu grupu iz adenozintrifosfata (ATPa) prebacuje na 5’-kraj lanca DNK.

Radioaktivno obeležene probe

• Detekcija radioaktivnog signala vrši se autoradiografijom, koja podrazumeva dovođenje membrane sa radioaktivnom probom vezanom za odgovarajuću sekvencu u blizak fizički kontakt sa rentgen filmom.

• Mesta na kojima je film „osvetljen“ radioaktivnošću vizuelizuju se kao crne trake nakon razvijanja filma.

Neradiaktivno obeležene probe

• Neradioaktivno obeležene probe sadrže inkorporisane nukleotide za koje su vezani reporterski molekuli, kao što su digoksigenin (DIG) ili biotin (vitamin H)

• Reporterski molekuli obično se kovalentno vezuju za pirimidinski prsten dUTP-a ili ddUTP-a.

• Prednosti korišćenja neradioaktivnih obeleživača

Neradiaktivno obeležene probe

• Detekcija signala neradioaktivno obeleženih proba zasnovana je na imunoesejima, originalno razvijenim za detekciju signala u Western blot analizama.

• U zavisnosti od tipa supstrata za enzim konjugovan na antitelo za reporterski molekul, vizuelizacija je kolorimetrijska ili hemiluminiscentna.

Načini sinteze i obeležavanja proba za hibridizaciju nukleinskih kiselina

1. Metoda nasumičnog sparivanja 2. Translacija sa prekidom 3. Obeležavanje DNK proba PCR-om 4. Obeležavanje DNK proba cDNK sintezom 5. Obeležavanje 3’ kraja oligonukleotida 6. Obeležavanje oligonukleotida pomoću 3’ repa

Metoda nasumičnog sparivanja

• Metoda za obeležavanje DNK proba zasnovana je na in vitro sintezi DNK korišćenjem smeše nasumičnih heksanukleotida kao prajmera i Klenovljevog fragmenta DNK polimeraze I E. coli koji nema 3’-5’ egzonukleaznu aktivnost

• Fragmenti DNK koji se obeležavaju veličine su od 100 bp do 10 kb.

Metoda nasumičnog sparivanja

• Smeša nasumičnih heksanukleotida sadrži 4.096 različitih kombinacija heksanukleotida i obezbeđuje da za svaku sekvencu molekula DNK postoji odgovarajući prajmer.

• Obeleženi nukleotidi – DIG–11–dUTP

• Klenow fragment ugrađuje po jedan obeležen nukleotid na svakih 20 do 25 nukleotida.

Translacija sa prekidom Nick translacija

• Koristi se enzim DNazaI koja uvodi jednolančani prekid na dvolančanom DNK fragmentu koji se obeležava.

• Mesto jednolančanog prekida prepoznaje Kornebergov fragment DNK polimeraze I E. coli koji svojom 5’-3’ egzonukleaznom aktivnošću otklanja niz nukleotida sa 5’-kraja prekida i istovremeno nastalu “prazninu” popunjava de novo sintezom DNK koristeći 3’-kraj prekida kao mesto za otpočinjanje sinteze.

Translacija sa prekidom Nick translacija

• U toku sinteze DNK, Kornebergov fragment ugrađuje i obeleženi nukleotid, na primer DIG-11-dUTP .

• Translacijom sa prekidom obeležavaju se probe veličine od 200 do 500 bp koje se koriste za in situ hibridizaciju i FISH.

Obeležavanje oligonukleotida na 3'-kraju

• Zasnovano je na korišćenju enzima terminalne dezoksinukleotidil transferaze i jednog obeleženog dideoksi-nukleotida.

• U reakciji obeležavanja terminalna transferaza na 3’-kraj dodaje jedan DIG-11-ddUTP po jednom oligonukleotidu, s obzirom da dalja reakcija ugradnje nije moguća jer je reč o dideoksi-nukleotidu.

Obeležavanje pomoću 3’-repa

• Podrazumeva dodavanje niza od 10 do 100 nukleotida na 3’-kraj sintetičkih oligonukleotida.

• U reakciji obeležavanja terminalna transferaza dodaje smešu neobeleženih nukleotida i DIG-11-dUTP-a, praveći na taj način „rep” koji sadrži veliki broj DIG-11-dUTP-a.

• Oligonukleotidi sa 3’ obeleženim repom najviše se koriste kao probe za in situ hibridizaciju.

Southern blot hibridizacija

Southern blot hibridizacija

• Metoda za identifikaciju specifičnih sekvenci molekula DNK

• Metodu konstruisao Edwin Mellor Southern (r.1938) 70tih godina 20. veka

Southern blot hibridizacija

• Zasniva se na razdvajanju fragmenata molekula DNK elektroforezom u gelu na osnovu veličine, prenosu razdvojenih fragmenata DNK sa gela na membranu i hibridizaciji sa specifičnom probom

http://www.dnatube.com/video/1512/Southern-blot

Southern blot hibridizacija

• Digestija genomske DNK (najčešći uzorak za Southern blot hibridizaciju) sa jednim ili više restrikcionih enzima, kako bi fragment DNK od interesa bio dostupniji za hibridizaciju sa specifičnom probom.

• Fragmenti DNK se in situ denaturišu u agaroznom gelu

• Razdvajanje fragmenata DNK, na osnovu njihove dužine, elektroforezom u agaroznom gelu

Southern blot hibridizacija

• Gel je inertna podloga koja obezbeđuje kretanje makromolekula pod dejstvom jednosmerne struje. Po sastavu razlikujemo agarozni i poliakrilamidni gel.

• Za elektroforetsko razdvajanje makromolekula konstruisani su aparati za gel elektroforezu. Po položaju gela u aparatu razlikujemo horizontalnu i vertikalnu gel elektroforezu.

Southern blot hibridizacija

• Kako se sa fragmentima DNK koji se nalaze u agaroznom gelu ne može direktno manipulisati, ključni korak za identifikaciju određene sekvence DNK je njihov transfer sa gela na membranu kako bi se omogućila hibridizacija sa specifičnom probom.

Membrane

NITROCELULOZNE • Nukleinske kiseline vezuju se

hidrofobnim interakcijama za ove membrane i direktno zavisi od jonske jačine pufera

NAJLONSKE • Fragmenti DNK vezuju se kovalentno

(ireverzibilno) za najlonsku membranu

Transfer fragmenata DNK sa gela na membranu

• Dobijeni jednolančani fragmenti DNK u toku transfera “prelaze” sa gela na membranu zadržavajući svoje relativne položaje

• Kapilarni transfer

• Elektroforetski transfer

• Vakuum transfer

Kapilarni transfer

Elektroforetski transfer

• Odvija se između dva seta paralelnih elektroda u posebnoj aparaturi

• Nije praktičan za nitrocelulozne membrane jer puferi velike jonske jačine provode struju

Vakuum transfer

• Za transfer koristi vakuum u posebnom aparatu

• Veoma brz transfer

• Za dobro denaturisanu DNK iz 1% agaroznog gela potrebno 30 minuta

Southern blot hibridizacija

• In situ hibridizacija DNK fragmenata sa specifičnim probama

• Detekcija i vizuelizacija stvorenih hibrida DNK-proba

Lančana reakcija polimeraze

• Lančanu reakciju polimeraze (eng. Polymerase Chain Reaction, PCR) 1983. godine osmislio je Kary Mullis (r.1944) i za ovo otkriće dobio Nobelovu nagradu za hemiju 1993. godine.

• PCR je in vitro amplifikacija definisane sekvence DNK i predstavlja imitaciju procesa replikacije DNK.

• Reakcija koristi dva oligonukleotida (prajmera) koji su komplementarni krajevima sekvence DNK koja se umnožava i međusobno su suprotno orijentisani.

• Sinteza DNK je katalizovana termostabilnom DNK polimerazom.

PCR reakciona smeša je volumena od 5 do 100 l i sadrži komponente potrebne za in vitro sintezu DNK

• uzorak DNK, matrica koja se kopira;

• Prajmere, oligonukleotide komplementarane krajevima sekvence koja se kopira;

• Nukleotide, gradivne elemente DNK (dNTP-ovi);

• Taq polimerazu, termostabilnu DNK polimerazu koja katalizuje ugradnju nukleotida po principu komplementarnosti sa DNK matricom;

• Jone Mg (Mg2+), neophodne za

aktivnost Taq polimeraze i sintezu DNK;

• Pufer, koji obezbeđuje optimalnu

aktivnost Taq polimeraze.

DNK uzorak - matrica koja se kopira

• Periferna krv

• Bris bukalne sluznice

• Biološki tragovi

Amnionska tečnost Horionske čupice Tkivo dobijeno biopsijom Autopsijsko tkivo

Prajmeri

• Sintetisani jednolančani oligonukleotidi komplementarni krajevima sekvence DNK koja se kopira.

• Unikalnost sekvenci prajmera omogućava specifičnost same PCR reakcije.

• Tokom PCR reakcije, krajevi amplifikovanog fragmenta molekula DNK definisani su 5'-krajevima prajmera, a njihova veličina određena je rastojanjem između sekvenci koje prajmeri „prepoznaju“.

• Prajmeri u optimalno dizajniranoj PCR reakciji dužine su od 18 do 22 nukleotida sa balansiranim GC sastavom i temperaturom „topljenja“ (Tm) u granicama od 55oC do 65oC.

Prajmeri

• Ne sadrže 3’- kraj komplementaran 3’- kraju drugog prajmera u PCR jer mogu međusobno hibridizovati i poslužiti kao matrica što za rezultat ima prajmer dajmer artefakt.

• Ne sadrži palidromske sekvence koje na nižim temperaturama stvaraju strukture ukosnice stabilizovane intralančanim vodoničnim vezama.

Sparivanje 3'

komplementarnih

krajeva prajmera

Elongacija

5' 3'

3' 5'

Prajmer

1

Prajmer

2

5' 5'

5' 5'

Prajmer-dajmer

artefakt

Prajmer 5' 3'

5' 3'

Palindromska sekvenca

Struktura

ukosnice

Smanjena

efikasnost ili

inhibicijaPCR

Taq polimeraza

• Termostabilna DNK polimeraza od 94 kDa.

• Izolovana iz Archaea Thermus aquaticus.

• Na temperaturi od 95oC ima poluživot od 40 minuta.

• Optimalna temp. za njenu aktivnost od 72oC do 75oC.

DNK zavisna DNK polimeraza sa brzinom polimerizacije od 35-65 nukleotida/sekundi DNK polimeraza bez 3’-5’ egzonukleazne aktivnosti.

Komponente PCR reakcione smeše

Matrica DNK, par prajmera, Taq polimeraza

Nukleotidi – gradivni elementi DNK dATP, dCTP, dGTP, dTTP, ekvimolarni i svaki 200 mM.

Joni Mg2+ - grade komplekse sa dNTP koji kao takvi predstavljaju supstrat za Taq polimerazu i neophodni za rad same Taq polimeraze.

Pufer obezbeđuje optimalan pH za rad termostabilnih polimeraza od 8.3 do 9.2.

Aditivi u cilju da se izvrši kompletna denaturacija molekula DNK, eliminacija sekundarnih struktura matrice i/ili prajmera, snižavanje tačke topljenja prajmera, stabilizacija Taq polimeraze i eliminacija dejstva raznih inhibitora PCR-a.

Mineralno ulje u zavisnosti od tipa mašina za PCR.

PCR reakcija

• PCR reakcija izvodi se u mikrotubi zapremine 0,2 ml gde se u PCR mašinama (eng. thermocycler) podvrgava preciznim, cikličnim promenama temperature. Reakcija se odvija u 25-40 ponovljenih ciklusa sinteze DNK.

• Ponavljanje ciklusa, od kojih se svaki sastoji od denaturacije DNK, hibridizacije prajmera i ekstenzije hibridizovanih prajmera termostabilnom DNK polimerazom, za rezultat ima eksponencijalnu amplifikaciju specifičnog fragmenta DNK.

http://www.youtube.com/watch?v=HMC7c2T8fVk

Svaki PCR ciklus sastoji se iz tri koraka

• Denaturacija DNK koja se izvodi se inkubacijom PCR reakcione smeše na 95C;

• Hibridizacija prajmera sa matricom na temperaturi od 42C do 65C u zavisnosti od dužine i nukleotidne sekvence prajmera;

• Elongacija (ekstenzija) prajmera je proces ugradnje nukleotida na 3-krajevima prajmera (sinteza DNK) katalizovan termostabilnom DNK polimerazom. Odvija se na temperaturi od 72C (optimalna temperatura za rad Taq polimeraze).

• Pre otpočinjanja prvog ciklusa

PCR reakcije, PCR reakcione smeše

inkubiraju se 5 min na temperaturi od 95oC

da bi se izvršila inicijalna denaturacija

molekula DNK matrice.

• Nakon poslednjeg ciklusa

PCR reakcije, najčešće se izvodi korak

u kome se tokom 5 do 15 min PCR

reakciona smeša inkubira na 72oC

u cilju kompletiranja parcijalno

sintetisanih produkata - finalna

elongacija.

Rezultat PCR reakcije • Broj umnoženih fragmenata u

PCR reakciji eksponencijalno raste jer svaki novosintetisani lanac u sledećem ciklusu služi kao matrica za sintezu DNK.

• Za 2 sata dobija se 106-109

kopija određenog fragmenta DNK.

• PCR metodom uspešno se amplifikuju fragmenti DNK dugi do 1 kb (i do 5 kb i 40 kb ali zahteva modifikaciju standardne PCR metode).

http://www.youtube.com/watch?v=ZmqqRPISg0g&feature=related

Prednosti PCR metode

• Visoka senzitivnost koja se pre svega odnosi na minimalnu količinu matrice DNK neophodne za amplifikaciju određenog fragmenta;

• Visoka specifičnost PCR reakcije određena je selektivnom hibridizacijom prajmera sa komplementarnim sekvencama DNK koje ograničavaju fragment DNK koji se amplifikuje;

• Metoda je jednostava, bezbedna, brza i jeftina.

Primena PCR metode

• U bazičnim eksperimentima mol. biologije

• Molekularna filogenija

• Molekularna arheologija

• Forenzička genetika

• Molekularna dijagnostika bolesti čoveka

PCR u realnom vremenu

real – time PCR

PCR u realnom vremenu

• Modifikacije klasične PCR reakcije.

• Zahvaljujući upotrebom fluorescentno obeleženih proba, moguće je odrediti količinu PCR produkata u realnom vremenu odnosno nakon svakog pojedinačnog ciklusa PCR reakcije.

• Na ovaj način omogućena je precizna kvantifikacija PCR produkata a samim tim i precizna informacija o količini DNK matrice koja je bila predmet umnožavanja.

PCR u realnom vremenu

• Količina PCR produkata zavisi od broja izvršenih ciklusa PCR reakcije

Plato Linearna faza Eksponencijalna faza

SYBR green I

• Prva proba korišćena u real-time PCR-u.

• Molekulu SYBER green-a i njenih derivata vezuju se za dvolančanu DNK i na određenoj talasnoj dužini emituju zelenu svetlost.

• Probe koje se hibridizuju za dvolančanu DNK nisu visoko specifične za sekvencu i količina emitovane svetlosti zavisi kako od količine DNK matrice tako i od njene dužine.

Hidrolizne probe

• Sintetisani oligonukleotidi • Taqman probe • Probe su dužine od 20 do 30 nukleotida. • Poseduje sekvencu komplementarnu sekvenci fragmenta DNK

(nizvodno od prajmera) koji se umnožava PCR reakcijom • Obeležene su sa dve fluoroboje: na 5' kraju jednom koja se

naziva reporter i na 3' kraju drugom koja se naziva prigušivač. • Transfer fluorescentne rezonantne energije (eng. Fluorescence

Resonance Energy Transfer, FRET) predstavlja inhibiciju jedne “boje” drugom bez emitovanja fotona.

• Hibridizacija probe, tokom PCR reakcije, dešava se nakon denaturacije ciljne DNK.

• Kada tokom svoje aktivnosti Taq polimeraza naiđe na hibridizovanu probu vrši njenu razgradnju.

• Nakon razgradnje probe fluoroboje se ne nalaze na rastojanju koje blokira emitovanje boje reportera.

Molekularni svetionici • Jednolančane oligonukleotidne probe

koje formiraju strukturu drške i petlje (eng. stem-and-loop).

• Sekvenca koja formira petlje komplementarna je ciljnoj sekvenci i obično je dugačka od 18 do 30 nukleotida. Krajevi petlje su međusobno komplementarni u dužini od 5 do 7 bp i, u nastavku, formiraju dršku.

• Na 5'-kraju probe nalazi se boja reporter, a na 3'-kraju boja prigušivač.

Vezivanje probe za komplementarnu sekvencu u ciljnim molekulim DNK uzokuje konformacionu promenu probe

Prikaz intenziteta fluorescencije u zavisnosti od broja ciklusa u PCR reakciji u realnom vremenu

• Tokom vremena kroz povećanje broja ciklusa intenzitet fluorescencije raste.

• Trenutak kada se intenzitet fluorescencije statistički značajno poveća iznad osnovnog nivoa fluorescencije označava se kao CT vrednost.

• Vrednost CT je obrnuto proporcionalna količini početne DNK u uzorku: što je količina veća manje će ciklusa biti potrebno da fluorescentni signal postane statistički veći od osnovnog nivoa fluorescencije.

PCR u realnom vremenu

• Za određivanje količine DNK uzorka tokom PCR u realnom vremenu potrebno je utvrditi standardnu krivu reakcije.

• Standardna kriva se konstruiše na osnovu određivanja CT vrednosti uzoraka sa poznatom količinom DNK.

• Korišćenjem konstruisane standardne krive i određivanjem CT vrednosti moguće je odrediti i početnu količinu molekula DNK u analiziranim uzorcima.

Upotreba TaqMan® proba u esejima za genotipizaciju polimorfizama

Upotreba TaqMan® proba u esejima za genotipizaciju polimorfizama

Predstavljanje rezultata genotipizacije polimorfizma u vidu dijagrama sa determinisanim genotipovima uzoraka koji konstruiše 7500 Fast System SDS Software (Applied Biosystems, SAD).

Primena PCR u realnom vremenu

• Metoda za analizu i molekula DNK i RNK

• U molekularnoj biologiji, medicini i drugim prirodnim naukama

animacija

http://www.youtube.com/watch?v=kvQWKcMdyS4&feature=related

procedura

http://www.youtube.com/watch?v=TkCBcL_xUUs&feature=related

Molekularno-biološke metode za analizu molekula RNK

• Northern blot hibridizacija

• RT-PCR

• Analiza na genskim čipovima (eng. gene array)

Northern blot hibridizacija

• Metoda za detekciju i kvantifikaciju ciljnog molekula RNK.

• Osmišljena je 1977. godine, a ime je dobila igrom reči kao „odgovor“ na naziv Southern blot metode za analizu molekula DNK.

• To je metoda kojom se vrši razdvajanje denaturisanih molekula RNK iz totalne ćelijske RNK ili poli-A frakcije RNK.

Northern blot hibridizacija

• Razdvajanje molekula RNK elektroforezom u denaturišućem agaroznom gelu.

• Transfer razdvojenih molekula RNK sa gela na membranu.

• Hibridizacija sa obeleženom probom.

• Detekcija hibrida molekul RNK – proba.

http://www.youtube.com/watch?v=KfHZFyADnNg

Northern blot hibridizacija

• Uzorke RNK, pre nalivanja na gel, neophodno denaturisati kako bi se “razbile” sekundarne strukture RNK te omogućilo njihovo razdvajanje u gelu isključivo na osnovu veličine.

• Glioksalom i dimetilsulfoksidom (DMSO) na 50C (pre nanošenja uzoraka na nedenaturišući agarozni gela).

• Formaldehidom i formamidom na 65C (pre nanošenja uzoraka na denaturišući agarozni gel koji takođe sadrži formaldehid i formamid).

Transfer RNK sa gela na membranu

• Kapilarni, vakuum i elektroforetski transfer.

• Nakon transfera, molekuli RNK se za membranu “fiksiraju” primenom visoke temperature ili ultravioletnim zracima na =254 nm.

• Hibridizacija molekula RNK na membrani sa specifičnim probama u hibridizacionom rastvoru.

• Detekcija nagrađenih hibrida RNK-proba.

Primena Northern blot hibridizacije

• Detekcija i relativna kvantifikacija specifične iRNK

• Određivanje veličine transkripta

• Detekcija alternativno splajsovnih transkripata

• Metoda koja se sve češće zamenjuje drugim metodama za analizu molekula RNK

PCR kome prethodi reverzna transkripcija (RT-PCR)

RT-PCR

• PCR kome prethodi reverzna transkripcija (RT-PCR) predstavlja adaptaciju PCR metode kojom je omogućeno kvalitativno i kvantitativno izučavanje molekula RNK, što se pre svega odnosi na analizu retkih iRNK ili drugih RNK prisutnih u maloj količini.

RT-PCR

• Prvi korak u RT-PCR-u je proces reverzne transkripcije (RT reakcija) tokom kojeg molekul RNK služi kao matrica za sintezu komplementarne DNK (cDNK).

• Enzim – reverzna transkriptaza.

• U drugom koraku, cDNK služi kao matrica za klasičnu PCR reakciju.

RT-PCR

• Nasumični heksameri - niz od 6 nukleotida nasumičnog redosleda. Ako se oni koriste kao prajmeri i totalna RNK kao matrica rezultat reakcije biće smeša velikog broja cDNK.

• oligo-dT - niz od 12 do 20 dT, koji se koristi za reverznu transkripciju eukariotskih iRNK koje imaju poli-A rep na 3'-kraju.

• Specifični nizvodni prajmeri - izabran tako da bude komplementaran samo ciljnoj iRNK koju želimo da amplifikujemo. Rezultat je amplifikacija molekula cDNK koji su komplementarni specifičnom molekulu iRNK.

Prajmeri PCR reakcije

• Ako su se u RT reakciji koristili specifični nizvodni prajmeri, u PCR reakciju se uključuju specifični uzvodni prajmeri.

• Ako su se u RT reakciji koristili nasumični hekasameri ili oligo-dT prajmeri, PCR reakcija zahteva par specifičnih prajmera.

Primena RT-PCR-a

• Molekularna dijagnostika (za detekciju RNK virusa i za analizu mutacija na nivou iRNK kod malignih i drugih bolesti čoveka).

• Primena u osnovnim molekularno-biološkim istraživanjima za ekspresione analize na novou iRNK.

Analize na genskim čipovima

Analize na genskim čipovima

• Čvrste podloge na kojima je kolekcija specifičnih nukleinskih kiselina smeštena na definisanim pozicijama.

• To se postiže njihovim istačkavanjem (eng. spotting) ili direktnom sintezom na podlozi čipa.

• Jedan genski čip poseduje hiljade tačaka čiji su dijametri manji od 200 mikrona.

Analize na genskim čipovima

• Istačkavanje sekvenci cDNK dužine od 500 bp do 5 kb ili sintetičkih oligonukleotida dužine od 20 do 80 nukleotida vrši se za tu svrhu konstruisanim robotima.

Analize na genskim čipovima • Kod analiza na genskim čipovima, uzorak koji sadrži nukleinske

kiseline obeležava se i onda hibridizuje sa specifičnim nukleinskim kiselinama na podlozi čipa.

• Na osnovu količine obeleženih uzorka koja hibridizuje za svaku tačku (eng. spot) na čipu dobija se informacija o specifičnom sastavu nukleinskih kiselina u ispitivanom uzorku.

http://www.youtube.com/watch?v=9U-9mlOzoZ8

Analize na genskim čipovima

• Glavna prednost genskih čipova jeste da oni mogu dati informacije o hiljadama gena ili iRNK u samo jednom eksperimentu. Tako je njihovim korišćenjem moguće analizirati ekspresiju hiljade gena istovremeno.

http://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM&feature=related

Analize na genskim čipovima

• Svaku analizu zasnovanu na korišćenju genskih čipova karakteriše veliki broj rezultata za čiju analizu su neophodni

specifični softverski paketi

Primena analize na genskim čipovima

• Za identifikaciju sekvenci (npr. analizu mutacija)

• Za analizu diferencijalne ekspresije gena u dva ili više uzorka