Luciana Sartori - teses.usp.br · Ficha Catalográfica elaborada eletronicamente pelo autor,...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Programa de Pós-Graduação em Farmácia (Fisiopatologia e Toxicologia)

Área de Análises Clínicas

Caracterização molecular de Escherichia coli produtora de β-

lactamases de amplo espectro em bovinocultura leiteira

Luciana Sartori

Tese para obtenção do Título de DOUTOR

Orientador: Prof. Dr. Nilton Lincopan

São Paulo

2018

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Programa de Pós-Graduação em Farmácia (Fisiopatologia e Toxicologia)

Área de Análises Clínicas


lactamases de amplo espectro em bovinocultura leiteira

Luciana Sartori

Versão corrigida da Tese conforme resolução CoPGr 6018.


Orientador: Prof. Dr. Nilton Lincopan

São Paulo

2018

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

Ficha Catalográfica elaborada eletronicamente pelo autor, utilizando o

programa desenvolvido pela Seção Técnica de Informática do ICMC/USP e adaptado para a Divisão de Biblioteca e Documentação do Conjunto das Químicas da USP

Bibliotecária responsável pela orientação de catalogação da publicação:

Marlene Aparecida Vieira - CRB - 8/5562

Sartori, Luciana

S251c Caracterização molecular de Escherichia coli

produtora de beta-lactamases de amplo espectro em

bovinocultura leiteira / Luciana Sartori. - São

Paulo, 2018.

64 p.

Tese (doutorado) - Faculdade de Ciências

Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.

Departamento de Farmácia.

Orientador: Lincopan, Nilton

Coorientador: Gregory, Lilian

1. Escherichia coli. 2. ESBL. 3. CTX-M. 4.

ceftiofur. 5. gado de leite. I. T. II. Lincopan,

Nilton, orientador. III. Gregory, Lilian , coorientador.

Luciana Sartori


lactamase de amplo espectro em bovinocultura leiteira

Comissão Julgadora da


Prof. Dr. Nilton Erbert Lincopan Huenuman

Orientador/presidente

_________________________________________________

1o. examinador

Prof. Dr. Alessandro Conrado de Oliveira Silveira

_________________________________________________

2o. examinador

Prof. Dra. Helenice de Souza Spinosa

__________________________________________________

3o. examinador

Dra. Quézia Moura da Silva

São Paulo, 06 de setembro de 2018.

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus pais Eli e Geni, sem eles nada disso seria possível.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Eli e Geni, pelo amor incondicional e apoio constante às minhas decisões.

Aos meus irmãos, em especial à você Rafael, finalmente compreendi tudo o que você passou e

sempre aplaudiu minhas conquistas.

Ao meu namorado Luis, que nos momentos mais difíceis esteve ao meu lado, e escutou

pacientemente tudo sobre meu projeto.

Ao meu orientador, Prof. Nilton Lincopan pela oportunidade e ensinamentos que me

proporcionou nesses quatro anos de convivência.

Ao departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas e às agências

de fomento (Capes e Cnpq) pelo auxílio concedido durante estes quatro anos.

À minha co-orientadora, Prof. Lilian Gregory por me aceitar, pela convivência e ensinamentos

que tivemos juntas.

Ao meu amigo/irmão Mário pela ajuda na coleta das amostras e pelo companheirismo.

Aos funcionários da fazenda, pela ajuda na coleta das amostras e pela recepção sempre educada

e paciente.

Aos animais, que são a fonte da minha paixão na medicina veterinária, que me proporcionam o

brilho nos olhos em estudar e sempre pensar em trabalhar em benefício deles.

À Milena Dropa, minha conterrânea, pela ajuda inestimável na execução deste trabalho.

Ao Prof. Jorge Sampaio e ao grupo Fleury, pela disponibilidade de uso do equipamento de

MALDI-TOFF.

À Prof. Kelly Ishida pela disponibilização do programa Bionumerics.

Ao Thiago pela ajuda no preparo das bibliotecas para o sequenciamento de genoma completo.

À colega Louise pelas montagens dos genomas e ajuda nas análises de bioinformática.

Às minhas queridas amigas e companheiras de laboratório Miriam, Quézia, Lucianne, Luana,

Tatiane e Lívia pelo convívio diário, risadas, choros e ensinamentos que tivemos juntas.

Aos demais colegas de laboratório Fernanda, Daniel, Fábio, Ralf, Marcos, Maria, Carolina,

Caetano e Juan.

Ao meu querido amigo Jefferson, que a pós graduação uniu para a vida toda.

À minha amada amiga Ludmila, que me sugeriu vir a São Paulo e encarar este desafio, obrigada

pela compreensão e amizade.

Aos meu caros amigos Ricardo, Sandro, Thiago, Tatiana e Felipe que torcem por mim e

acompanharam esta jornada.

E por fim, obrigada por todos que direta ou indiretamente contribuíram para que este trabalho

se realizasse.

But I would like to sound one note of warning. Penicillin is to all intents

and purposes non-poisonous so there is no need to worry about giving

an overdose and poisoning the patient. There may be a danger,

though, in underdosage. It is not difficult to make microbes resistant

to penicillin in the laboratory by exposing them to concentrations not

sufficient to kill them, and the same thing has occasionally

happened in the body. The time may come when penicillin can be

bought by anyone in the shops. Then there is the danger that the ignorant man

may easily underdose himself and by exposing his microbes

to non-lethal quantities of the drug make them resistant.

Here is a hypothetical illustration. Mr. X. has a sore throat.

He buys some penicillin and gives himself, not enough to kill

the streptococci but enough to educate them to resist penicillin.

He then infects his wife. Mrs. X gets pneumonia and is treated with penicillin.

As the streptococci are now resistant to penicillin the treatment fails.

Mrs. X dies. Who is primarily responsible for Mrs. X’s death?

Why Mr. X whose negligent use of penicillin changed the nature of the microbe.

Moral: If you use penicillin, use enough…

Discurso de Fleming quando recebeu o Prêmio Nobel em 1945

RESUMO

SARTORI, L. Caracterização molecular de Escherichia coli produtora de β-lactamases de

amplo espectro em bovinocultura leiteira. 2018. 64f. Tese (Doutorado) – Faculdade de

Ciências Farmacêuticas (Fisiopatologia e Toxicologia)- Área de Análises Clínicas,

Universidade de São Paulo, São Paulo, 2018.

O uso excessivo de antimicrobianos em medicina veterinária e humana tem contribuído para o

surgimento e seleção de bactérias multirresistentes (MR) em animais de produção, sendo que a

presença de resíduos de antibióticos em alimentos derivados constitui uma predisposição para

o estabelecimento de reações alérgicas para o consumidor, e altera as características

organolépticas dos alimentos. No Brasil, embora a presença de Escherichia coli produtora de

β-lactamase de espectro estendido (ESBL) em avicultura, bubalinocultura e suinocultura tenha

sido documentada recentemente, não há informações sobre sua prevalência em bovinocultura,

que é um setor importante do agronegócio no país. Assim, o presente estudo teve como objetivo

investigar a presença de linhagens de Escherichia coli produtoras de ESBLs na microbiota

intestinal de bovinos de leite, em uma fazenda comercial com prática de uso rotineiro de

cefalosporinas na forma terapêutica. Amostras de suabe retal foram coletadas em 95 ruminantes

(lactantes e adultos saudáveis), na presença de um regime de tratamento com ceftiofur

terapêutico, em uma fazenda no estado de São Paulo. As amostras foram triadas para a presença

de bactérias Gram-negativas produtoras de ESBL, onde os isolados positivos foram

identificados por MALDI-TOF, com posterior identificação dos genes codificando variantes

ESBL, por PCR e sequenciamento. A presença de cepas de E. coli multirresistentes (resistência

a ≥ 3 classes de antibióticos) foi confirmada em 45 ruminantes (47,3%). Adicionalmente, foram

identificadas 68 cepas de E. coli produtoras de ESBL (71,5%), sendo 7 portadoras do gene

blaCTX-M-2, 11 portadoras do gene blaCTX-M-8, e 50 portadoras do gene blaCTX-M-15. As cepas de

E. coli produtoras de CTX-M-15 foram clonalmente relacionadas por ERIC-PCR e PFGE,

confirmando-se a presença de linhagens clonais em diferentes animais, na mesma propriedade.

Quatro cepas representativas deste clone tiveram seus genomas sequenciados, demonstrando

pertencer ao complexo clonal 23 (ST90), mundialmente reportado em animais e humanos. Estes

resultados denotam uma alta prevalência de E. coli produtora de ESBL do tipo CTX-M na

microbiota intestinal do gado leiteiro, com predominância de clones de importância clínica

humana e veterinária, que hipoteticamente possuem uma genética que favorece sua adaptação

(provavelmente favorecida pela pressão seletiva de antibióticos) na interface animal-humana,

o que representa um potencial zoonótico de importância para a saúde pública.

Palavras-chaves: E. coli, ESBL, CTX-M, ceftiofur, gado de leite.

ABSTRACT

SARTORI, L. Molecular caracterization of Escherichia coli producing broad-spectrum β-

lactamases in dairy cattle. 2018. 64 f. Faculdade de Ciências Farmacêuticas (Fisiopatologia e

Toxicologia)- Área de Análises Clínicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2018.

The excessive use of antimicrobials in veterinary medicine has contributed to the emergence

and selection of multiresistant (MR) bacteria in livestock animals, and the presence of residues

of antibiotics in food products is a predisposition for the establishment of allergic reactions to

the consumer, changing the organoleptic characteristics of food. In Brazil, although the

presence of Escherichia coli-producing extended-spectrum β-lactamase (ESBL) in poultry,

buffalo and swine farming has been documented recently, there is no information on its

prevalence in cattle breeding, which is an important sector of agribusiness in the country. Thus,

the present study aimed to investigate the presence of Escherichia coli strains producing ESBLs

in the intestinal microbiota of dairy cattle in a commercial farm with routine practice of

cephalosporins in the therapeutic form. Rectal swab samples were collected from 95 ruminants

(healthy calf and adults) in the presence of a treatment regimen with ceftiofur therapeutic, on a

farm in the state of São Paulo. The samples were screened for the presence of ESBL-producing

Gram-negative bacteria, where positive isolates were identified by MALDI-TOF, with

subsequent identification of genes encoding ESBL variants, by PCR and sequencing. The

presence of multiresistant strains of E. coli (resistance to ≥ 3 classes of antibiotics) was

confirmed in 45 ruminants (47.3%). In addition, 68 ESBL-producing E. coli strains (71.5%)

were identified, 7 of which were carriers of the blaCTX-M-2 gene, 11 carriers of the blaCTX-M-8

gene, and 50 carriers of the blaCTX-M-15. The E. coli strains producing CTX-M-15 were clonally

related by ERIC-PCR and PFGE, confirming the presence of clonal lineages in different

animals, on the same property. Four representative strains of this clone had their genomes

sequenced, demonstrating belonging to the clonal complex 23 (ST90), worldwide reported in

animals and humans. These results indicate a high prevalence of E. coli producing CTX-M

ESBL in the intestinal microbiota of dairy cattle, with a predominance of clones of human and

veterinary clinical importance, which hypothetically have a genetics that favors their adaptation

(probably favored by the selective pressure of antibiotics) at the animal-human interface, which

represents a zoonotic potential of public health importance.

Keywords: E. coli, ESBL, CTX-M, ceftiofur, dairy catlle.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Infográfico de disseminação de bactérias multirresistentes na produção leiteira ..... 17

Figura 5. Representação da molécula de ceftiofur. .................................................................. 18

Figura 2. Locais de permanência de E. coli Patogênicas em bovinos adultos ......................... 20

Figura 3. Locais de permanência de E. coli patogênicas em bezerros ..................................... 21

Figura 4. Mapa demonstrando presença de Enzimas beta-lactamases de espectro

estendido(ESBL) do tipo CTX-M em animais de produção. ................................................... 23

Figura 6. Organograma de coleta de amostras realizado na fazenda........................................ 29

Figura 7. Fotos dos antibiogramas mostrando a presença de ESBL (zona fantasma) (A),

antibiograma mostrando cepa resistente a quinolonas (B) e E-test® realizado em cepa produtora

de ESBL. ................................................................................................................................... 30

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Exemplos de E. coli ST90 na interface humana-animal identificada por país ......... 25

Tabela 2. Iniciadores para pesquisa de genes ESBL ................................................................ 32

Tabela 3. Iniciadores para identificação de genes de virulência do tipo stx ............................ 32

Tabela 4. Iniciadores para identificação do grupo filogenético de E. coli ............................... 33

Tabela 5. Perfil de resistência de isolados de E. coli produtores de ESBL isolados de fezes de

bezerros ..................................................................................................................................... 36


vacas secas (VS) ....................................................................................................................... 37

Tabela 7. Perfil de resistência de isolados de E. coli produtores de ESBL isolados de fezes em

lactação (VL) ............................................................................................................................ 38

Tabela 8. Resultados do sequenciamento das cepas E. coli 47 VL, 13B, 34VL e 16VS ......... 43

LISTA DE ABREVIATURAS

AMC- amoxicilina/ ácido clavulânico

AMO- amoxicilina

AMI- amicacina

ATM- aztreonam

BHI- Brain Heart Infusion

bla- gene codificador de enzima β-lactamase

CAZ- ceftazidima

CFO- cefalotina

CTF- ceftiofur

CLO- cloranfenicol

CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute

CTX- cefotaxima

DNA- ácido desoxirribonucléico

ENO- enrofloxacino

ESBL- Extended-Spectrum β-lactamase

ETP- ertapenem

FOS- fosfomicina

GEN- gentamicina

Inc- grupo de incompatibilidade de plasmídeo

IPM- imipenem

IS- insertion sequence

LB- Luria Broth

LVX- levofloxacino

MLST- Multilocus Sequence Typing

MR- Multiresistant bacteria

NA- ácido nalidíxico

NCBI - National Center for Biotechnology Information

OFX- ofloxacino

PEF- pefloxacino

PCR- Polymerase Chain Reaction

PFGE- Pulsed Field Gel Electophoresis

ST- Sequence Type

SUT- sulfazotrim

TET- tetraciclina

TZ /TZL -ceftazidima/ ceftazidima+ácido clavulânico

WGS – Whole genome sequence

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 15

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................... 16

2.1 O cenário atual da bovinocultura leiteira no Brasil ....................................................... 16

2.2 A resistência antimicrobiana na bovinocultura leiteira ...................................................... 16

2.3 Utilização de cefalosporina de terceira geração (ceftiofur) em bovinos leiteiros ......... 18

2.4 Dinâmica das infecções por Escherichia coli em Bovinos Leiteiros ............................ 19

2.5 Panorama das β-lactamases de espectro estendido do tipo CTX-M no Brasil e no mundo 21

2.6 Clones de Escherichia coli em bovinos leiteiros: ST90 na interface humana-animal ....... 24

3. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................... 26

4. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 27

4.1 Objetivo Geral ............................................................................................................... 27

4.2 Objetivos Específicos .................................................................................................... 27

5. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 28

5.1 Amostras ............................................................................................................................. 28

5.2 Isolamento e cultivo bacteriano ..................................................................................... 29

5.3 Antibiograma e triagem para produção de ESBL .......................................................... 29

5.4 Extração de DNA bacteriano ......................................................................................... 31

5.5 Testes genotípicos confirmatórios para ESBL .............................................................. 31

5.6 Identificação de genes de virulência .............................................................................. 32

5.7 Determinação dos grupos filogenéticos ......................................................................... 33

5.8 Avaliação da relação clonal por ERIC-PCR ................................................................. 34

5.9 Tipagem molecular por Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) das cepas de CTX-M-

15 ....................................................................................................................................... 34

5.10 Purificação e sequenciamento do DNA cromossomal de cepas representativas de E. coli

produtora de ESBL do tipo CTX-M-15 .................................................................................... 35

6. RESULTADOS ................................................................................................................... 36

6.1 Identificação dos isolados de E. coli .................................................................................. 36

6.2 Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos ................................................................... 36

6.3 Identificação de perfil de ESBL e genes blaCTX-M .............................................................. 39

6.4 Determinação do grupo filogenético de virulência............................................................. 39

6.5 Detecção de genes de virulência ......................................................................................... 39

6.6 Relação clonal por ERIC-PCR ........................................................................................... 40

6.7 Análise da relação clonal dos isolados de E. coli por PFGE .............................................. 41

7. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 44

9. REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 52

15

1. INTRODUÇÃO

____________________________________________________________________

As infecções causadas por bactérias multirresistentes (MRs) tem sido de grande

preocupação na saúde pública mundial. Essas bactérias estão presentes tanto na microbiota

humana quanto em animais. A identificação destas bactérias em animais produtores de

alimentos tem sido um desafio, que denota um risco para a saúde humana. Embora animais

produtores de alimento (como o gado leiteiro) sejam considerados principais reservatórios de

Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC), a qual causa grandes surtos de diarréias em

humanos, apresentando-se inócua para bovinos (Caratolli, 2008), sua contribuição como

reservatórios de bactérias MRs tem sido negligenciada, enquanto a utilização de

antimicrobianos nesses animais pode aumentar a pressão seletiva contribuindo, assim, para o

estabelecimento de uma microbiota MR.

Em bovinocultura, o uso de antibacterianos tem sido direcionado principalmente para o

tratamento da mastite, a qual é uma doença infecciosa de grande preocupação na produção

leiteira. Consequentemente, esta conduta terapêutica exacerbada suporta o estabelecimento de

uma microbiota resistente, com subsequente geração de resíduos em alimentos derivados como

carne e leite (Han et al., 2017). De fato, animais em lactação tratados com antimicrobianos

devem ser ordenhados e seu leite não pode ser utilizado para o consumo humano. Porém, uma

prática comum no manejo de gado leiteiro tem sido a utilização deste leite de descarte na

alimentação de bezerros, exercendo uma pressão seletiva na microbiota destes animais em

desenvolvimento (Maynou et al., 2017).

O Brasil é um dos grandes produtores de alimentos de origem animal, e embora alguns

estudos de vigilância de bactérias resistentes aos antimicrobianos já tem sido realizados em

avicultura, suinocultura, bubalinocultura, reportando a presença de bactérias produtoras de β-

lactamases de amplo espectro (ESBLs) (Ferreira et al., 2014; Silva et al., 2016; Aizawa et

al.,2014), sua presença em bovinocultura não tem sido investigada. Assim, o presente estudo

teve como objetivo investigar a presença de linhagens de Escherichia coli produtoras de ESBLs

na microbiota intestinal de bovinos de leite, em uma fazenda comercial com prática de uso

rotineiro de cefalosporinas na forma terapêutica, elucidando a priori como a cadeia leiteira no

Brasil pode contribuir para a disseminação de MRs.

16

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

______________________________________________________________________________________

2.1 O cenário atual da bovinocultura leiteira no Brasil

O leite representa uma das grandes fontes de alimentação humana, não só pelo seu

consumo in natura, mas também pela grande variedade de produtos que podem ser feitos na

indústria e na culinária. No Brasil, o rebanho bovino compreende mais de 215 milhões de

cabeças (ANUALPEC, 2015), dentre estas 23 milhões são vacas leiteiras. A produção de leite

brasileira atingiu 35 bilhões de litros em 2016, sendo a produção média por vaca de 1.609 litros

por ano, colocando o país em quarto lugar mundial. Neste setor a região Sul possui a maior

produtividade, seguida pela região Sudeste (IBGE, 2016). Estes dados mostram a importância

deste setor no agronegócio brasileiro. Os bovinos representam 55,3% do mercado de produtos

de saúde animal, onde os antimicrobianos são 15,2% do faturamento anual das empresas

(SINDAN, 2018). O maior problema em gado de leite é o uso excessivo de antimicrobianos na

produção. A utilização se faz necessária em alguns momentos, como para o tratamento de

diarréia em bezerros e de mastites em vacas leiteiras. Atualmente tem-se demonstrado uma

grande preocupação da exposição de resíduos de antimicrobianos no leite frente à saúde do

consumidor. Por isso, práticas conscientes devem ser necessárias para evitar a utilização

excessiva na produção e diminuir ao máximo os níveis de resíduos no leite. Esta prática vem

ao encontro ao conceito de “Saúde Única”, onde se tem a preocupação de envolver todos os

ecossistemas (ambiental, humano e animal), tendo por objetivo diminuir riscos para a saúde

(OIE, 2016). No manejo de gado leiteiro temos um exemplo de ecossistema que deve trabalhar

em conjunto: o homem ordenha o leite da vaca, entrando em contato direto com este animal

que pode transmitir patógenos e vice-versa. Este animal por sua vez tem contato com o ambiente

em que vive e pode tanto espalhar quanto servir de reservatório de patógenos nocivos ao

homem. Um equilíbrio nesta cadeia se faz necessário para uma produção de leite livre de

ameaças à saúde tanto animal quanto humana.

2.2 A resistência antimicrobiana na bovinocultura leiteira

Neste contexto, também se relaciona a resistência microbiana. Na produção animal faz-

se necessário à utilização de antimicrobianos no tratamento e profilaxia de doenças infecciosas

e para o aumento da produção animal. Os antimicrobianos podem ser classificados como:

antissépticos, desinfetantes, quimioterápicos e antibióticos. Outra classificação pode ser

17

utilizada quanto a sua utilização: terapêutico (utilizados quando o animal apresenta uma doença

infecciosa), profilático (quando a utilização é feita em animais sadios para secagem do leite,

por exemplo), metafilático ( a utilização é feita em animais sadios que podem estar em contato

com animais doentes) e aditivo zootécnico/melhorador de desempenho (utilizados em animais

sadios para diminuir a competição de bactérias na microbiota intestinal e melhorar a conversão

alimentar) (Spinosa e Tárraga, 2016). O uso excessivo destes medicamentos pode contribuir

para o aumento da população de bactérias multirresistentes (MR), assim como, a disseminação

de genes de resistência. Estes genes podem ser transferidos entre bactérias que colonizam

humanos e animais. O leite pode ser consumido in natura e desta forma pode transmitir

diretamente bactérias MRs para a população, assim como o leite de descarte pode ser jogado

nos rios e contaminar fontes de água. O contato direto com os animais pode facilitar esta

transmissão e a utilização das fezes (esterco) como adubo pode disseminar bactérias MRs em

lavouras e estes alimentos contaminados podem ser consumidos pelo homem. Assim como a

população também pode contaminar rios e estes, que servem de fonte de água de consumo aos

animais, pode ser uma via de contaminação para os mesmos (Téllez et al., 2015). Esta cadeia

de disseminação pode ser visualizada na Figura 1.

Figura 1. Infográfico de disseminação de bactérias multirresistentes na produção leiteira

Fonte: Sartori, 2018

18

2.3 Utilização de cefalosporina de terceira geração (ceftiofur) em bovinos leiteiros

As cefalosporinas são antimicrobianos beta-lactâmicos originadas de um fungo

chamado Cephalosporium acremonium e sua estrutura não só se assemelha às penicilinas, como

seu mecanismo de ação, isto é, ambas impedem a síntese da parede do microrganismo. As

cefalosporinas são classificadas em quatro gerações conforme a ordem cronológica de suas

sínteses. O uso das cefalosporinas na medicina veterinária vem crescendo nos últimos anos,

embora o alto custo do tratamento seja um fator limitante (Spinosa, 2016). O aumento da

utilização deve-se a sua ampla atividade antibacteriana e baixa toxicidade. As cefalosporinas

de terceira geração possuem menor atividade contra bactérias Gram-positivas, porém maior

atividade contra bactérias Gram-negativas, sendo o antimicrobiano de escolha na maioria das

infecções em animais (Prescott, 2010). O ceftiofur, uma cefalosporina de terceira geração,

possui alta atividade antibacteriana, principalmente contra Enterobacteriaceae e outras bactérias

Gram-negativas. Por esta razão, o ceftiofur (Figura 5) vem sendo o antimicrobiano de escolha

para várias infecções em bovinos. A apresentação do ceftiofur para a utilização em bovinos

leiteiros pode ser da forma intramamária ou injetável. O tratamento com ceftiofur é

recomendado nos casos de mastites clínicas, infecções bacterianas como endometrites e

infecções sistêmicas agudas. No Brasil encontram-se disponíveis para venda 12 produtos

registrados para uso em bovinos (SIDAN, 2018).

Figura 2. Representação da molécula de ceftiofur.

Fonte: Wang et al., 2018

A presença de resíduos de ceftiofur no leite constitui uma grande preocupação para a

saúde pública. Além do risco à saúde do consumidor, a presença de resíduos de antimicrobianos

pode interferir na indústria láctea, alterando a produção de alimentos. A persistência destes

resíduos pode ser influenciada pelo agente administrado, dose e via de administração. A

19

presença do processo inflamatório na glândula mamária influencia a eliminação de resíduos

após o tratamento, sendo importante na decisão do médico veterinário em fazer cumprir o

período de descarte do leite (Spinosa, 2016). Não existem dados oficiais de uso e

comercialização do ceftiofur no país, apesar da sua grande utilização não se compara á

utilização muito maior nos Estados Unidos, onde o fator do baixo custo deste medicamento

também é levado em consideração.

2.4 Dinâmica das infecções por Escherichia coli em Bovinos Leiteiros

A bactéria mais presente em bovinos leiteiros é a Escherichia coli, tanto como

causadora de doenças como parte da microbiota residente destes animais. A colonização do

trato gastrointestinal nos mamíferos ocorre logo após o nascimento, sendo membros

importantes da microbiota ao longo da vida. Muitas linhagens de E. coli pertencem ao grupo

de baixa virulência, mas podem causar infecções oportunistas na glândula mamária e no trato

urinário dos animais. Fatores como baixa imunidade, idade e dieta podem predispor a estas

infecções (Quinn, 2005). As cepas patogênicas de E. coli podem ser classificadas de acordo

com sua patogenia como extraintestinais ou entérica. Doenças extraintestinais resultam em

infecções com cepas que causam condições invasivas, tais como septicemia (SPEC),

uropatogenia (UPEC) e podem estar relacionadas às E. coli patogênicas extraintestinais

(ExPEC). Outras cepas podem causar doenças entéricas, tais como E. coli enterotoxigênica

(ETEC), E. coli enteropatogênica (EPEC) e E. coli produtora de toxina Shiga (VTEC ou STEC)

(Markey et al., 2013).

Escherichia coli pode causar diversas enfermidades em bovinos, como mastites e

diarréias, sendo a mastite a principal delas por causar grande prejuízo econômico ao produtor

de leite. Mastite é definida como a inflamação da glândula mamária que pode ser classificada

como clínica ou subclínica; contagiosa ou ambiental, e pode ser causada por agentes físicos ou

químicos. A maioria das mastites são causadas por bactérias e a E. coli é a maior causa de

mastite ambiental. A bactéria está presente tanto no ambiente (cama e fezes) como nos animais

(doentes ou sadios) e provoca a chamada “mastite por coliformes” que pode apresentar sinais

clínicos agudos, como toxemia, ou crônicos, como aumento na contagem de células somáticas

e fibrose do quarto mamário (Markey et al., 2013). Bradley et al. (2001) sugerem em seu estudo

uma possível adaptação da bactéria E. coli no quarto mamário influenciando uma mastite

recorrente, algo que implica grandes gastos com antimicrobianos na pecuária leiteira, assim

20

como perdas na produção. A classificação adicional de E. coli MPEC (Mammary Pathogenic

E. coli) foi realizada por pesquisadores, visto sua importância em casos de mastites (Köhler e

Dobrindt, 2011). No Brasil, a frequência de mastite subclínica por E. coli é de 2,1%, apesar

disso pode causar grandes perdas econômicas (Guimarães, 2011).

Outra enfermidade de grande importância causada por E. coli é a endometrite, uma

inflamação do útero que pode ocorrer após o parto e que causa prejuízos ao animal, tanto pela

doença em si como pela administração de antimicrobianos o que resulta em descarte do leite

(Gilbert, 2013). E. coli causadoras de infecções no útero foram classificadas como EnPEC

(Endometrial Pathogenic E. coli) (Köhler e Dobrindt ,2011). A Figura 2 representa os locais

onde E. coli pode estar presente em vacas de leite e causando infecções.

Figura 3. Locais de permanência de E. coli Patogênicas em bovinos adultos


A diarréia por E. coli é uma das doenças mais frequentes em bezerros nos seus primeiros

dias de vida e causa grande preocupação também pelo prejuízo econômico que causa, tanto pela

administração de medicamentos, quanto pela demora na recuperação do animal, atrasando

assim seu desenvolvimento. Vários patótipos de E. coli foram associados à diarreia em bezerros,

como E. coli Enterotoxigênica (ETEC) e produtora de toxina Shiga (STEC) (Coura et al., 2014).

A diarreia em bezerros é explicada pela adesão de toxinas nos receptores no intestino, os quais

21

vão diminuindo ao longo do crescimento do animal (Markey et al., 2013). Outra enfermidade

importante é a infecção nas articulações dos joelhos, onde a via de entrada pode ser pelo

umbigo, o qual possui uma abertura pelo momento do nascimento e pode deve ser tratado até

sua completa cicatrização. A Figura 3 mostra os locais de permanência de E. coli em bezerros.

Importante descrever que o bezerro nasce com os quatro compartimentos do estômago,

mas inicialmente ele se comporta como um monogástrico e somente com seu crescimento e de

quão cedo ele entra em contato com alimentos fibrosos ocorrerá o desenvolvimento da sua

capacidade ruminal. Animais que alimentados quase que exclusivamente com leite por um

longo período podem ter este desenvolvimento atrasado e consequentemente ter impactos no

seu crescimento (Feitosa, 2008). Este conceito é importante se considerarmos o estabelecimento

da microbiota residente, a qual pode sofrer mudanças conforme o crescimento do animal.

Figura 4. Locais de permanência de E. coli patogênicas em bezerros


2.5 Panorama das β-lactamases de espectro estendido do tipo CTX-M no Brasil e no

mundo

O mecanismo mais importante de resistência às cefalosporinas é a produção de enzima

do tipo beta-lactamase de espectro estendido, que hidrolisa o anel beta-lactâmico desses

antimicrobianos. A grande quantidade de diferentes beta-lactamases selecionadas pelo uso

22

indiscriminado de cefalosporinas de amplo espectro, e a frequente transmissão de genes de

resistência entre as bactérias tem sido demonstrado pelo fracasso no tratamento de doenças

infecto contagiosas em animais (Prescott, 2010). Existem diversas beta-lactamases de espectro

estendido (ESBL) sendo as mais importantes as do tipo CTX-M, TEM e SHV, todas mediadas

por plasmídeos. As enzimas do tipo CTX-M têm sido descritas em todo mundo, tanto em

humanos quanto em animais (Caratolli, 2008). A primeira descrição de ESBL do tipo CTX-M

foi realizada em um isolado clínico de E. coli em Munique, Alemanha, em 1989, denominada

CTX-M-1 (Bauernfeind et al., 1990). Na América Latina, a primeira descrição de enzima do

tipo CTX-M foi em Buenos Aires em 1990, e por apresentarem algumas diferenças do primeiro

relato, foi denominada de CTX-M-2 (Bauernfeind et al.,1992).

A disseminação de enzimas CTX-M já supera o número de outros tipos de enzimas

ESBL no mundo (D’Andrea et al., 2013). Isto vem ocorrendo não somente no ambiente

hospitalar, mas também atinge animais de companhia, animais de produção, animais selvagens,

meio ambiente e o solo através das fezes dos animais de produção (Conte et al., 2017; Ewers et

al., 2012; Guenther et al., 2011; Trott, 2013; Graham et al.,2016). Atualmente são conhecidas

172 variantes de CTX-M, divididas em cinco grupos: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-

M-9 e CTX-M-25 (Lahey, 2016). Frequentemente as variantes CTX-M-14 (pertencente ao

grupo 9) e CTX-M-15 (grupo 1) são encontradas em animais e humanos (Lahlaqui et al.,2014).

O uso de antimicrobianos e fatores de risco (como idade dos animais, estado imune e

doenças infecciosas) em diferentes áreas geográficas tem contribuído para disseminação destas

enzimas. Dentre os diversos tipos de CTX-M, o CTX-M-15 tem sido demonstrado como um

dos mais importantes, disseminados tanto no homem, animais e no ambiente (Cantón et al.,

2012).

A primeira descrição da enzima CTX-M-15 foi realizada em um isolado de E. coli num

paciente no hospital de Nova Déli, Índia (Karim et al., 2001). A partir desta descrição, vários

estudos demonstraram a disseminação do gene blaCTX-M-15 em vários países, tanto em humanos

quanto em animais (Mushtaq et al., 2003; Livermore et al., 2005; Garcia-Fernández et al.,2008).

A incidência em animais foi descrita em animais de companhia (cães e gatos), animais de

produção (frangos, suínos e bovinos) e animais selvagens, evidenciando a transmissão de genes

de resistência entre espécies (Ewers et al., 2010; Harada et al.,2012; Trott, 2013). No Brasil, a

descrição do gene blaCTX-M-15 foi realizada em suínos e equinos (Silva et al., 2016; Leigue et

al., 2016), enquanto o gene blaCTX-M-2 foi descrito em frangos e o gene blaCTX-M-8 foi descrito

em búfalos (Silva et al., 2013; Aizawa et al., 2014).

23

A primeira descrição no Brasil de enzima produtora de ESBL foi realizada em 1997

(Gales et al., 1997). No ano de 2000 foi identificada a variante CTX-M-2 e a variante CTX-M-

8, pela primeira vez, em diferentes enterobactérias isoladas em diferentes hospitais (Bonnet et

al., 2000). As ESBLs da família CTX-M são as mais frequentemente identificadas no Brasil,

onde CTX-M-2 e CTX-M-15, são as variantes mais detectadas no sudeste do país (Rocha et al.,

2016).

A Figura 4 foi baseada nos seguintes trabalhos: Rio Grande do Sul (Fernades et al.,

2009); Santa Catarina (Silva et al., 2013); Paraná (Silva et al., 2016; Cunha et al., 2017); Minas

Gerais (Hoepers et al., 2018; Silva et al., 2016); Rio de Janeiro (Botelho et al., 2015); e São

Paulo (Leigue et al.,2015; Sartori et al., 2017; Ferreira et al., 2014; Aizawa et al., 2014).

Figura 5. Mapa demonstrando presença de Enzimas beta-lactamases de espectro

estendido(ESBL) do tipo CTX-M em animais de produção.


A morbidade e a mortalidade associadas a surtos de doenças gastrintestinais são

causadas pela E. coli produtora de toxina Shiga (STEC). O trato gastrointestinal de ruminantes

tem sido relatado como o principal reservatório de STEC (Paton & Paton, 1998). As principais

toxinas do tipo Shiga são classificadas em subtipos stx-1 e stx-2. A presença destas toxinas tem

24

sido associada a doenças severas em humanos. No Brasil, a presença de genes de virulência foi

confirmada em amostras de carne bovina, humanos e fezes de bovinos de leite (Cergolle-

Novella et al., 2006).

2.6 Clones de Escherichia coli em bovinos leiteiros: ST90 na interface humana-animal

A técnica de Multi Locus Sequence Typing (MLST) usa sequências de nucleotídeos de

fragmentos internos de genes selecionados como unidades de comparação e assim, os dados de

sequência são facilmente comparados e altamente reproduzíveis (Enright e Spratt, 1999). O

MLST utiliza uma variação de sequências de genes conservados já conhecidos nas espécies

bacterianas. No caso da E. coli são os alelos adk, fumC, gyrB, icd, mdh, pura e recA. Além

disso, o formato digital de dados de MLST auxiliou o estabelecimento de bancos de dados

globais, contribuindo para a compreensão da distribuição clonal de agentes infecciosos. Os

programas mais utilizados são os que usam a variação genética em genes conservados. O MLST

é uma ferramenta de longo prazo para a vigilância de MRs (Maiden et al., 1998). Além disso,

esta ferramenta tem sido utilizada para estudo epidemiológicos e identificação de surtos

atribuídos à E. coli patogênicas (Eichhorn et al., 2015). A sequência de cada isolado

éidentificada conforme gerado a partir das sequências de cada gene analisado e denomina-se

Sequence Type (ST).

Os Sequence Types (ST) são agrupados em Complexos Clonais (CC), definido como

um cluster de STs primários posicionado em um diagrama, em que todos os STs estão ligados

como variantes de um locus único (Han et al., 2017). O MSLT já demonstrou linhagens

internacionais de grande importância como o ST10 e o ST131. A relação de clones específicos

com variantes de CTX-M pode explicar a disseminação destes genes, uma vez que estudos

utilizando a técnica de MLST tem demonstrado que estas enzimas são frequentemente

relacionadas a poucos tipos de STs, como por exemplo, CTX-M-15 relacionada ao ST131

(Mathers et al., 2015).

Os STs mais frequentemente encontrados em amostras de origem animal são os STs 10,

648, 23, 58 e 361(Poirel et al., 2018). No Brasil já foram relatados os seguintes STs em animais

de produção: ST224, ST2179, ST2308 em búfalos (Aizawa et al.,2014); ST93, ST155 e ST2309

em frangos (Ferreira et al., 2014); ST2179 em cavalos (Leigue et al., 2015) e ST90 em vacas

de leite (Sartori et al., 2017). Em bovinos os STs descritos são os ST10 e ST38 (Lifshitz et al.,

2018), ST1817 (Shridhar et al., 2018) e ST410 (Ali et al., 2017). O ST90 tem sido descrito em

25

várias amostras, conforme Tabela1 abaixo, pesquisada na plataforma Warwick

(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/GetTableInfo_html).

Tabela 1. Exemplos de E. coli ST90 na interface humana-animal identificada por país

ANO ISOLAMENTO ANO PUBLICAÇÃO FONTE PAÍS

1975 2016 Suíno EUA 1975 2015 Suíno EUA 1982 2016 Suíno EUA 1983 2016 Suíno EUA 1985 2015 Suíno EUA 1998 2015 Suíno Canadá 2000 2016 Suíno EUA 2005 2015 Suíno Alemanha 2002 2015 Humano Espanha 2005 2015 Humano Brasil 2007 2015 Humano Canadá 2009 2015 Humano Espanha 2016 2016 Humano Reino Unido 2010 2016 Humano Reino Unido 2014 2016 Humano Alemanha 2016 2016 Humano Reino Unido 1989 2016 Equino EUA 2016 2017 Cão China 2006 2015 Bovino Egito


No Brasil não existem estudos mostrando a prevalência de bactérias MRs em bovinos

de leite, e poucos trabalhos no mundo também são insuficientes para mostrar a distribuição

destas bactérias nesta cadeia produtiva. Faz-se necessário uma elucidação das linhagens

encontradas em bovinos para podermos mapear a disseminação de E. coli nesses animais.

http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/GetTableInfo_html

26

3. JUSTIFICATIVA

_____________________________________________________________________

O aumento da prevalência da resistência aos antimicrobianos é uma preocupação

mundial. Nos animais produtores de alimentos esta preocupação deve ser redobrada, visto que

atingem a saúde humana que é o consumidor final. Resíduos de antibióticos podem influenciar

o preparo dos produtos e causar graves alergias aos consumidores. No Brasil, o uso

indiscriminado de antimicrobianos tanto na medicina humana quanto na veterinária, tem

contribuído para a disseminação de cepas MRs, que caracteriza um sério problema de saúde

contribuindo para a falha nos tratamentos. No manejo de bovinos de leite, após um período de

produção de leite que dura em média 9 meses, recomenda-se um período de descanso do animal

na ordenha, chamado de período seco. Assim se busca preservar a glândula mamária enquanto

a vaca está gestante e prepará-la para uma nova lactação. Neste momento a vaca pode estar

sendo um reservatório de bactérias MRs, podendo disseminar estas bactérias assim que começar

a ser ordenhada novamente. O uso de leite de descarte, ou seja, leite com resíduos de

antimicrobianos, na alimentação de bezerros, pode contribuir para que estes animais alberguem

uma microbiota resistente por um longo período de tempo e se tornem disseminadores destas

bactérias. Estudos que demonstram a presença de genes de resistência em animais de produção

tem sido realizado, mas ainda não foi realizado um estudo em bovinos de leite, sendo este uma

grande parcela do agronegócio brasileiro. O monitoramento destes grupos de manejo (bezerros

lactantes, vacas em lactação e vacas secas) é importante para entender a sobrevivência e a

disseminação de bactérias no ambiente. Estes dados só reforçam a importância da realização,

em nosso país, de estudos de identificação e monitoramento dessas cepas resistentes em

amostras de bovinos leiteiros, que até o momento, não parece ter sido realizado por nenhum

grupo de pesquisa brasileira. Ainda, a caracterização molecular destes mecanismos de

resistência e o entendimento das formas de disseminação são de fundamental relevância, pois

estes dados visam auxiliar no estabelecimento de condutas terapêuticas apropriadas, permitindo

implementações de estratégias de controle na transmissão destes agentes, além de prevenir ou

controlar uma possível fonte de disseminação para os seres humanos e até em perdas

econômicas.

27

4. OBJETIVOS

_______________________________________________________________________

4.1 Objetivo Geral

O presente estudo teve como objetivo investigar a presença de linhagens de Escherichia

coli produtoras de ESBLs na microbiota intestinal de bovinos de leite, em uma fazenda

comercial com prática de uso rotineiro de cefalosporinas na forma terapêutica.

4.2 Objetivos Específicos

4.2.1. Avaliar a presença de E. coli resistente a cefalosporinas de amplo espectro na

microbiota intestinal de vacas em lactação, vacas secas, e bezerros alimentados com leite de

descarte.

4.2.2. Investigar a presença de E. coli resistente a cefalosporinas de amplo espectro em

amostras coletadas de água de bebedouro e de camas de bovinos de leite.

4.2.3. Determinar o perfil de suscetibilidade aos antibacterianos de uso veterinário e

humano, nos isolados de E. coli.

4.2.4. Identificar a produção de ESBL em isolados de E. coli resistente às cefalosporinas

de amplo espectro.

4.2.5. Identificar os genes responsáveis pela produção de ESBL (blaESBL variantes) em

isolados de E. coli.

4.2.6. Identificar Escherichia coli produtora de toxina shiga entre isolados produtores

de ESBL.

4.2.7. Determinar os grupos filogenéticos de virulência dentre os isolados de E. coli

produtores de ESBL.

4.2.8. Avaliar a relação clonal entre isolados de E. coli produtores de ESBL.

4.2.9. Caracterizar o genoma de linhagens clonais predominantes de E. coli produtoras

de ESBL.

28

5. MATERIAL E MÉTODOS

_______________________________________________________________________

5.1 Amostras

As amostras foram coletadas no período de novembro de 2014 a janeiro de 2015 em

uma fazenda comercial de exploração leiteira localizada na cidade de Bragança-SP. Esta

fazenda possui um plantel de boa qualidade genética, com vacas da raça Holandesa. Atualmente

possui 300 vacas em lactação e uma ordenha mecânica diária em três horários. O leite

ordenhado é direcionado automaticamente ao resfriador e conservado até a coleta para o

laticínio. O manejo de vacas em lactação doentes que estão em tratamento é de separar o animal,

medica-lo conforme a necessidade (intramamário ou sistêmico) e descartar o leite ordenhado.

Este leite de descarte é armazenado e enviado ao galpão dos bezerros e utilizado em sua

alimentação.

Foram selecionados 30 bezerros lactantes (n= 30) com idade de 3 dias a 3 meses que se

alimentavam de leite de descarte proveniente de vacas em tratamento com ceftiofur. Trinta

vacas secas (n= 30), ou seja, fora do período de lactação, foram selecionadas para este estudo.

Trinta e cinco vacas em lactação (n= 35) também foram selecionadas, as quais já tinham sido

tratadas com ceftiofur e estavam fora do período de carência. No momento da coleta todos os

animais estavam sadios. Amostras de fezes de todos os animais (n= 95) foram coletadas através

de swab retal, amostras de leite individuais das vacas em lactação foram coletadas em tubos

cônicos do tipo Falcon® estéril, bem como foi coletada uma amostra do tanque de leite de

descarte fornecido aos bezerros. O leite foi transportado em isopor com gelo até o laboratório

e mantido refrigerado até ser semeado no dia seguinte. Amostras das camas de areia (n=3) das

vacas foram coletadas através de swab estéril. Amostras da água destes bebedouros (n=3) foram

coletadas em tubos cônicos do tipo Falcon® estéril. A coleta está representada no organograma

da Figura 6 abaixo. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da FCF-USP

(CEUA514) (ANEXO I).

29

Figura 6. Organograma de coleta de amostras realizado na fazenda


5.2 Isolamento e cultivo bacteriano

As amostras de fezes, das camas (swabs) e as amostras de leite foram cultivadas em

placas de Ágar MacConkey suplementadas com ceftiofur (1mg/mL) para uma pré-seleção de

cepas potencialmente produtoras de ESBL, sendo incubadas a 35°C por 24 horas. As amostras

de água foram filtradas através de um microfiltro (0,45 µm) e este foi depositado em placas de

Ágar MacConkey suplementadas com ceftiofur e incubadas a 35°C por 24 horas. As colônias

selecionadas foram cultivadas em caldo Mueller Hinton (MH) para caracterizar o perfil de

susceptibilidade aos antimicrobianos de uso humano e animal. A identificação dos isolados foi

realizada pela técnica de MALDI TOFF (Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-

flight), utilizando o aparelho MALDI Biotyper (Bruker Daltonik) e o software MALDI

Biotyper OC versão 3.1.66.

5.3 Antibiograma e triagem para produção de ESBL

A triagem fenotípica para avaliar a produção de ESBL foi determinada pelo método de

disco aproximação (Jarlier et al., 1988). Para a confirmação de fenótipo de ESBL foi realizada

a metodologia por disco aproximação ou dupla difusão em disco (Kirby-Bauer) preconizada

pelo CLSI (CSLI, 2013). Foram selecionadas colônias bacterianas isoladas puras que cresceram

no meio seletivo e foram suspendidas em 3ml de caldo MH, a fim de se obter um inóculo

ajustado em espectofotômetro na escala 0,5 de MacFarland (108 UFC/mL). Após o ajuste da

turvação do inóculo, foi introduzido um swab estéril no tubo, que foi pressionado nas paredes

a fim de remover o excesso de líquido e, em seguida foi semeado em uma placa de Muller-

30

Hinton. Após 3 a 5 minutos em temperatura ambiente para diminuição da umidade da placa, os

discos foram colocados sobre a superfície do meio de cultura com auxílio de uma pinça estéril.

A disposição dos discos foi realizada a fim de se observar a chamada “zona fantasma”, que é a

demonstração do sinergismo entre os discos de amoxacilina/ácido clavulânico e ceftazidima,

indicando uma bactéria produtora de ESBL. As placas foram incubadas a 35-37°C por 16-18

horas. Após o período de incubação foi realizada a medição do diâmetro dos halos de inibição

de crescimento, conforme Figura 7A. Os seguintes antimicrobianos foram utilizados: cefoxitina

(CFO), fosfomicina (FOS) (critério adaptado), amoxacilina (AMO), amoxacilina+ácido

clavulânico (AMC), cefotaxima (CTX), ceftazidima (CAZ), ceftriaxona (CRO), cefepima

(CPM), ciprofloxacino (CIP), sulfametoxazol/trimetoprim (SUT), gentamicina (GEN),

ertapenem (ETP), imipenem (IPM), amicacina (AMI), tigeciclina (TIG), ofloxacino (OFX),

moxifloxacino (MFX), ácido nalidíxico (NAL), levofloxacino (LVX), pefloxacino (PEF). As

quinolonas foram testadas separadamente (Figura 7B). Adicionalmente um novo inócuo das

cepas resistentes foi preparado em caldo MH em escala 0,5 de MacFarland e estriadas em placas

de Muller-Hinton onde foram utilizadas fitas E-test® (Biomerieux) contendo

ceftazidima/ceftazidima+ácido clavulânico (TZ/TZL), formuladas para confirmar a presença

de enzimas produtoras de ESBL e para determinar a concentração inibitória mínima (CIM). As

placas foram incubadas por 24 horas a 35°C. A CIM foi interpretada como o ponto de

intersecção entre a elipse de inibição com a borda da fita de E-test® (Figura 7C).

Figura 7. Fotos dos antibiogramas mostrando a presença de ESBL (zona fantasma) (A),

antibiograma mostrando cepa resistente a quinolonas (B) e E-test® realizado em cepa

produtora de ESBL.


31

5.4 Extração de DNA bacteriano

O DNA bacteriano foi extraído através do método de fervura descrito por Chapman e

colaboradores (2001), o qual consiste em utilizar 1,5mL de cultura em meio LB com incubação

de 18 a 24 horas. O volume foi acondicionado em um microtubo e foi centrifugado a 3500 rpm

por 3 minutos em Centrífuga Eppendorf®. Depois de descartado o sobrenadante, foram

adicionados 100 µL de água Milli-Q estéril e a solução foi homogeneizada, fervida por 10 min

para posterior incubação em banho frio (gelo) por 5 min. Após serem centrifugados a 9000

rpm por 15 min, 100 µL do sobrenadante foram transferidos para um microtubo estéril, sendo

armazenado a -20ºC.

5.5 Testes genotípicos confirmatórios para ESBL

A identificação dos genes codificadores de ESBLs blaCTX-M (incluindo blaCTX-M-2,

blaCTX-M-8 e blaCTX-M-15) foi realizada pela reação em cadeia da polimerase em cadeia (PCR).

Foram utilizados os iniciadores descritos na Tabela 2. A amplificação dos genes alvo foi

realizada em reações de 25 μL contendo 100 ng de DNA; tampão de PCR 10X [Tris-HCl (pH

8,4), 50 mM de KCl] (Fermentas, USA), 1,5 mM de MgCl2 (Fermentas); 200 μM de cada

dNTP (Fermentas); 25 pmol de cada iniciador e 1 U de Taq DNA polimerase (Fermentas). As

condições de amplificação foram as seguintes: 1) desnaturação inicial a 94 ºC, por 5 minutos;

2) desnaturação a 94 ºC, por 1 minuto; 3) anelamento com temperatura específica para cada

iniciador, por 1 minuto; 4) extensão a 72 ºC, por 1 minuto; 5) repetição das etapas 2, 3 e 4, por

29 vezes; 6) extensão final a 72 ºC, por 5 minutos. Posteriormente, os produtos da PCR foram

analisados por eletroforese em gel de agarose a 1%. Foi utilizado um marcador de peso

molecular de DNA 100 bp Plus (Thermo Fisher Scientific) e corado com Gel Red Nucleic Acid

Stain (Biotium), visualizado em UV (312nm) com auxílio de um transiluminador (Spectroline).

Foram utilizados também, controles positivos e negativos para cada gene, a fim de validar as

reações de PCR.

32

Tabela 2. Iniciadores para pesquisa de genes ESBL

Gene alvo (ESBL) Sequência 5’-3’ Pb* T (°C)** Referência

blaCTX-M F5’-GCTTTGCGATGTGCAG-3’

R5’-ACCCGCATATGCTTGTG-3’

544 56 Edelstein et al.,

2003

blaCTX-M-2 F5’-GCGACCTGGTTAACTACAATC-3’

R5’-CGGTAGTATTGCCCTTAAGCC-3’

351 55 Tollentino, et al.,

2011

blaCTX-M-8 F5’-CTGGAGAAAAGCAGCGGGGG-3’

R5’- ACCCAGGATGTGGGTAGCCC-3’

320 55 Bonnet et al, 2000

blaCTX-M-15 F5’-CACACGTGGAATTTAGGGACT-3’

R5’- GCCGTCTAAGGCGATAAACA-3’

550 56 Muzaheed et al.,

2008

*Pb: pares de base; T**: temperatura de anelamento

5.6 Identificação de genes de virulência

Para identificação de genes de virulência foram utilizados os primers para identificação

de sxt-1 e sxt-2, descritos na Tabela 3, e o seguinte ciclo: desnaturação inicial de 94°C por 10

segundos, seguido por 30 ciclos de desnaturação de 94°C por um segundo cada, anelamento de

52°C por um segundo, extensão de 72°C por 8 segundos, e extensão final de 72°C por 16

segundos. O produto da PCR foi visualizado em gel de agarose 1,5% corado com Gel Red

Nucleic Acid Stain (Biotium) e visualizado em UV (312nm) com auxílio de transiluminador

(Spectroline).

Tabela 3. Iniciadores para identificação de genes de virulência do tipo stx

Gene Sequência 5’-3’ Pb* T (°C)** Referência

sxt-1 F5’-CGCTGAATGTCATTCGCTCTGC-3’

R5’-CGTGGTATAGCTACT GTCACC-3’

302 55 Blanco et al.,

1996

sxt-2 F5’-CTTCGGTATCCTATTCCCGG-3’

R5’-CTGCTGTGACAGTGACAAAACGC-3’

516 55 Blanco et al.,

1996

*Pb: pares de bases; **T: temperatura de anelamento.

33

5.7 Determinação dos grupos filogenéticos

A determinação dos grupos filogenéticos das cepas de E. coli produtoras de ESBL foi

realizada através de PCR, conforme metodologia descrita por Clermont et al. (2013) e

representada na Figura 8. Os primers de anelamento estão descritos na Tabela 4.

Tabela 4. Iniciadores para identificação do grupo filogenético de E. coli

Gene Sequência 5’-3’ Pb* T (°C)** Referência

chuA F5´-ACGAACCAACGGTCAGGAT-3´

R5´-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3´

279 57 Clermont et

al., 2013

yjaA F5´-TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3’

R5´-ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3´

211 55 Clermont et

al., 2013

TspE4C2 F5´-GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3´

R5´-CGCGCCAACAAAGTATTACG-3´

152 55 Clermont et

al.,2013

*Pb: pares de base; T**: temperatura de anelamento.

Figura 8. Árvore de classificação filogenética que diferencia grupos filogenéticos de virulência

de E. coli.

Fonte: Clermont et al., 2013

34

5.8 Avaliação da relação clonal por ERIC-PCR

A relação clonal entre as cepas de E. coli produtoras de ESBL foi determinada por

ERIC-PCR. Esta tipagem é baseada na amplificação de fragmentos de DNA conservados em

Enterobactérias. O único primer utilizado foi ERIC-2 (5’-

AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’) (Sneath, 1973) e o seguinte ciclo: desnaturação

inicial de 94°C por 10 segundos, seguido por 30 ciclos de desnaturação de 94°C por um segundo

cada, anelamento de 52°C por um segundo, extensão de 72°C por 8 segundos, e extensão final

de 72°C por 16 segundos. O produto da PCR foi visualizado em gel de agarose 1,5% corado

com Gel Red Nucleic Acid Stain (Biotium) e visualizado em UV (312nm) com auxílio de

transiluminador (Spectroline) e analisado pelo software Bionumerics (Applied Maths, Kortrij,

Belgium), cepas com pelo menos 90% de similaridade foram considerados clones. Para análise

do perfil ERIC foi construído um dendrograma com auxílio do software Bionumerics

(tolerância 2%, otimização 1%).

5.9 Tipagem molecular por Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) das cepas de

CTX-M-15

A avaliação de clonalidade genética das cepas foi realizada por PFGE. Uma colônia

pura isolada foi colocada em 15 mL de caldo Luria (0,5% NaCl), por 18-24h a 37°C.

Posteriormente as células foram ressuspensas em 1 mL de solução tampão TE I (Tris-HCl

10mM, pH 7,5; EDTA 1mM, pH 8,0), transferidas para microtubos tipo Eppendorf® e foram

centrifugados a 12.000 RPM por cinco minutos a 24°C. Depois foram acrescentadas 400µL de

TE I, e desta suspensão, 80µL foram adicionados a 320µL de agarose de baixo ponto de fusão

a 1%, a 55-60°C. Os moldes para confecção dos plugs foram preenchidos e incubados por 15

minutos a 4°C para solidificar. Os plugs foram retirados dos moldes e colocados em 5mL de

uma solução de lise (EDTA 50mM, pH 8,0; Tris-HCl 50mM, pH 7,5; SDS 1%, Sarkosyl 1%,

proteinase K 0,1mg/mL e enzima de restrição Xbal) em tubos tipo Falcon®, e incubados por

2h a 55°C. Após a incubação, duas lavagens dos plugs foram realizadas em 10mL de água Milli

Q® e 4 lavagens em 10mL de TE I com intervalos de 15 min a 55°C. Os plugs foram

transferidos para um microtubo e estocados em 1mL de TE I a 4°C até o momento do uso. Os

plugs e os marcadores de peso molecular foram acondicionados em gel de agarose 1% em

solução tampão e submetidos á eletroforese em campo pulsado (Chef Mapper Bio-Rad

Laboratories, Hercules, CA), voltagem de 6V/cm, a 14°C por 22h, com intervalos de pulsos de

1s a 40s. O gel de PFGE foi corado em brometo de etídeo 1µg/ml durante 1h e visualizado em

35

luz ultravioleta. Para análise do perfil PFGE foi construído um dendrograma no software

Bionumerics ( tolerância 2%, otimização 1%).

5.10 Purificação e sequenciamento do DNA cromossomal de cepas representativas

de E. coli produtora de ESBL do tipo CTX-M-15

O DNA total genômico das cepas de E. coli (47VL, 13B, 34VL e 16VS) foram

sequenciados usando a plataforma MiSeq (Illumina, Inc., San Diego, CA). O DNA foi extraído

usando um kit de purificação (PureLink™ Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo

Kit Life Technologies, Carlsbad, CA), de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante.

A qualidade e quantidade do DNA genômico foi determinada por eletroforese em Gel Agar e

usando um fluorômetro (Qubit® 2.0 fluorometer, Life Technologies). Uma biblioteca de 300-

bp foi construída para o Illumina paired-end sequencing, usando um kit (Paired-End DNA

Sample Prep Kit, Illumina Inc., Cambridge, UK), de acordo com as instruções do fabricante. A

montagem da sequência de DNA foi realizada usando a plataforma A5-Miseq (Coil et al.,

2015). Os contigs foram curados manualmente usando a ferramenta Geneious v.R9 (Biomatters

Ltd, New Zealand). A sequência do genoma foi anotada no NCBI Prokaryotic Genome

Annotation Pipeline v.3.2 com as identificações: LYPE01000000 (cepa 47VL), PRJNA374675

(cepa 13B), PRJNA374699 (cepa 34VL) e PRJNA473553 (cepa 16VS)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/). Os genes de resistência, assim como

genes de virulência, grupos de incompatibilidade de plasmídeos, sorotipo e MLST foram

avaliados a plataforma disponível o pelo Center for Genomic Epidemiology

(https://cge.cbs.dtu.dk/services), com 99,5% de limite para identificação de genes. Genes

codificando resistência para metais pesados e desinfetantes foram identificados por análises in

silico.

36

6. RESULTADOS

_______________________________________________________________________

6.1 Identificação dos isolados de E. coli

Dentre as amostras de leite provenientes de vacas em lactação (n= 35), não foi observado

crescimento de colônias bacterianas em meio seletivo (MacConkey suplementado com

ceftiofur), assim como nas amostras de água de bebedouro (n=3) e da cama dos animais (n=3).

No entanto, observou-se que 95 amostras fecais coletadas dos animais (100%) apresentaram

crescimento positivo em ágar MacConkey suplementado com ceftiofur. Todas as culturas

positivas foram identificadas como E. coli.

6.2 Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos

Nas 95 amostras estudadas, 80 isolados de E. coli (84,2%) apresentaram resistência a

uma ou mais classes de antimicrobiano, além do ceftiofur. Foram identificados 45 isolados

(47,3%) com perfil de multirresistência (MR), ou seja, resistência a três ou mais classes de

antimicrobianos.

A Tabela 5 mostra as cepas isoladas de bezerros sadios com perfil de resistência a mais

de um antimicrobiano e presença do gene blaCTX-M-8 e blaCTX-M-15. Foram encontradas 4 cepas

pertencendo ao gene blaCTX-M-8 e quatro pertencentes ao blaCTX-M-15. Os isolados mostram um

perfil de multirresistência, ou seja, são resistentes a mais de três classes de antimicrobianos.

A Tabela 6 mostra os isolados de vacas secas, os quais apresentaram também um perfil

de multirresistência a vários antimicrobianos, sendo 15 isolados positivos para o gene blaCTX-

M-15.

A Tabela 7 mostra os isolados de vacas em lactação, onde além de perfil

multirresistente, foi confirmada a presença dos genes blaCTX-M-2 em dois isolados, o gene

blaCTX-M-8 em cinco isolados e o gene blaCTX-M-15 em 31 isolados.


bezerros

Isolado Perfil de Resistência*

Fenótipo

ESBL

CIM

TZ/TZL

blaCTM-

M Filogrupo

8B GEN, CFO, AMI, SUT, CIP, MFX, PEF, LVX, OFX Positivo 4/0,125 15 A

9B GEN, CFO, AMI, SUT, CIP, MFX, PEF, LVX, OFX Positivo 4/0,125 15 A

13B NAL, CIP, SUT,GEN, CTX, CPM,CAZ, MFX, PEF, LVX, OFX Positivo 4/0,125 15 B1

16B CTX, NAL,AMI,GEN,MFX, PEF, LVX, OFX Positivo 4/0,125 8 A

37

18B NAL, CIP, SUT,CFO, AMI,GEN, CTX, CAZ, MFX, PEF, LVX,

OFX

Positivo 4/0,125 8 A

19B CTX, NAL, CIP,AMI, GEN, AMC, CRO, CPM, MFX, PEF,

LVX, OFX


20B NAL, SUT,AMI, GEN, CTX, CPM, MFX, LVX, PEF, OFX Positivo 4/0,125 8 D

29B AMC, CTX, NAL, CFO, CIP,SUT, CPM, IPM, MFX, LVX,

PEF, OFX


*CIP(Cirpofloxacino), GEN (Gentamicina), CFO(Cefoxitina), AMI (Amicacina), SUT (Sulfametoxazol+trimetoprim), MFX (Moxifloxacino),

PEF (Pefloxacino), LVX (Levofloxacino), OFX (Ofloxacino), NAL (Ácido Nalidíxico), CPM (Cefepima), CRO (Cefotriaxona), CTX

(Cefotaxima), CAZ (Ceftazidima), AMC ( Amoxicilina+clavulanato).


vacas secas (VS)


Fenótipo

ESBL

CIM

TZ/TZL

blaCTM-

M Filogrupo

1VS NAL, CIP,SUT, CTX, AMC, CPM, CAZ, CRO, LVX, MFX,

OFX, PEF

Positivo 8/0,25 15 B1

2VS NAL, SUT, GEN, CIP, AMC, CAZ, CRO, LVX, MFX, OFX,

PEF

Positivo 8/0,25 15 B1

3VS NAL, CIP,SUT, CFO, FOS, ETP, AMC, LVX, MFX, PEF, OFX Positivo 0,5/0,19 15 B1

14VS NAL, CIP,CFO, FOS, ETP, IPM, CTX, AMC, CPM, CRO, LVX,

MFX, OFX, PEF

Positivo 0,5/0,94 15 B1

15VS NAL, SUT,PEF, LVX, MFX, OFX Positivo 0,5/0,064 15 B1

16VS NAL, CIP, SUT, AMC, LVX, MFX, PEF, OFX Positivo 0,5/0,125 15 B1

17VS NAL, SUT, CFO, FOS, CIP, ETP, CTX, AMC, CRO, LVX,

MFX, OFX, PEF

Positivo 0,5/0,125 15 B1

18VS FOS, CFO, NAL,LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 0,5/0,125 15 B1

19VS NAL, SUT, GEN, CIP, ETP, CTX, AMC, COM, CAZ, CRO,

LVX, MFX, PEF, OFX

Positivo 0,5/0,094 15 B1

20VS FOS, AMC, LVX, MFX, PEF, OFX Positivo 0,5/0,94 15 B1

21VS NAL,LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 0,5/0,94 15 B1

22VS SUT, CIP, AMC, LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 0,5/0,94 15 B1

23VS CFO, FOS, LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 0,5/0,94 15 B1

24VS LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 0,5/0,94 15 B1

25VS LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 0,5/0,94 15 B1

*CIP(Ciprofloxacino), GEN (Gentamicina), CFO(Cefoxitina), AMI (Amicacina), SUT (Sulfamatoxazol+trimetoprim), MFX (Moxifloxacino),

PEF (Pefloxacino), LVX (Levofloxacino), OFX (Ofloxacino), NAL (Ácido Nalidíxico), CPM ( Cefepima), CRO (Cefotriaxona), CTX

(Cefotaxima), CAZ (Ceftazidima), AMC ( Amoxicilina+clavulanato), IPM (Imipenem), ETP (Ertapenem), FOS (Fosfomicina).

38

Tabela 7. Perfil de resistência de isolados de E. coli produtores de ESBL isolados de fezes em

lactação (VL)


Fenótipo

ESBL

blaCTX-M Filogrupo

26VL CTX, LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 15 A

27VL GEN, SUT, ETP, CIP, CTX, CRO, NAL, LVX, MFX, OFX,PEF Positivo 15 A

28VL CTX, LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 15 A

29VL GEN, SUT, ETP, CIP, CTX, CRO, NAL, LVX, OFX, MFX, PEF Positivo 15 A

30VL GEN, SUT, ETP, CIP, AMC, CTX, CRO,NAL, LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 8,15 A

34VL GEN, SUT, ETP, CIP, CTX, CPM, CRO, NAL, LVX, MFX, PEF, OFX Positivo 15 A

36VL GEN, SUT, ETP, CIP, CTX, CRO, NAL, LVX, MFX, PEF, OFX Positivo 8,15 A

38VL GEN, SUT, ETP, CIP,CTX, CPM, CRO, NAL, LVX, MFX, PEF, OFX Positivo 8, 15 A

39VL GEN, DUT, ETP, CIP, CTX, CRO, NAL, LVX, PEF, MFX, OFX Positivo 15 A

40VL GEN, SUT, ETP, CIP, AMC, NAL, LVX, MFX, PEF, OFX Positivo 15 A

41VL GEN, SUT, ETP, CIP, CTX, COM, CAZ, CRO, NAL, LVX, OFX, PEF,

MFX

Positivo 15 A

42VL GEN, SUT, ETP, CIP, CTX, COM, CAZ, CRO, NAL, LVX, MFX, PEF,

OFX

Positivo 15 A

43VL GEN, SUT, ETP, CIP, CTX, CRO, NAL, LVX, MFX, PEF, OFX Positivo 15 A

47VL GEN, SUT,CIP, ETP, CTX, CPM, CAZ, CRO, LVX, MFX, PEF, OFX,

NAL

Positivo 15 B1

53VL CTX, GEN, SUT, CIP, COM, CAZ, CRO, LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 15 A

54VL CAZ, LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 15 A

57VL GEN, SUT, IPM, CIP, NAL, LVX, MFX, PEF, OFX Positivo 15 A

58VL GEN, SUT, CIP, CTX, CRO, NAL, LVX, PEF, OFX, MFX Positivo 15 A

61VL GEN, CTX, CRO, NAL, MFX, LVX, OFX, PEF Positivo 8,15 A

65VL GEN, CTX, CRO, NAL, MFX, OFX, LVX, PEF Positivo 15 A

66VL GEN, SUT, CIP, CTX, CRO, NAL, LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 15 A

67VL CTX, CRO, NAL, MFX, PEF, OFX, LVX Positivo 15 A

68VL CRO, CTX, LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 15 A

69VL CTX, CRO, CAZ, NAL, LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 15 A

71VL GEN, SUT, CIP, NAL, LVX, OFX, PEF, MFX Positivo 8,15 B1

72VL GEN, SUT, CIP, NAL,LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 2,15 A

73VL AMC, CRO, NAL, LVX, PEF, OFX, MFX Positivo 15 A

75VL CRO, CTX, CAZ, LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 15 A

76VL AMC, NAL, LVX, OFX, MFX, PEF Positivo 15 A

77VL LVX, NAL, MFX, OFX, PEF Positivo 15 A

79VL CTX, CRO. CAZ, NAL, LVX, MFX, OFX, PEF Positivo 2,15 A

*CIP(Ciprofloxacino), GEN (Gentamicina), CFO(Cefoxitina), AMI (Amicacina), SUT (Sulfametoxazol+trimetoprim), MFX (Moxifloxacino),

PEF (Pefloxacino), LVX (Levofloxacino), OFX (Ofloxacino), NAL (Ácido Nalidíxico), CPM ( Cefepima), CRO (Cefotriaxona), CTX

(Cefotaxima), CAZ (Ceftazidima), AMC ( Amoxicilina+clavulanato), IPM (Imipenem), ETP (Ertapenem), FOS (Fosfomicina).

39

6.3 Identificação de perfil de ESBL e genes blaCTX-M

A produção de ESBL foi confirmada em 68 isolados de E. coli (71,5 %), os quais foram

testados genotipicamente por PCR para confirmação de genes codificadores de ESBL do tipo

CTX-M. Todos os isolados foram positivos para blaCTX-M (6 isolados blaCTX-M-2, 10 blaCTX-M-8

e 50 blaCTX-M-15). A Figura 9 demonstra a separação de cada lote na fazenda, o número de

amostras e o resultado do perfil de enzimas encontrado.

Figura 9. Esquema representativo da fazenda leiteira onde foram coletadas as amostras


6.4 Determinação do grupo filogenético de virulência

Dentre as 68 cepas de E. coli produtoras de ESBL, 49 foram classificadas dentro do

grupo de baixa virulência A (72,1%) e 18 (26,5%) dentro do grupo B1, sendo que 1 cepa foi

classificada como pertencente ao grupo de alta virulência D (1,5%).

6.5 Detecção de genes de virulência

Na análise de virulência para os genes stx-1 e stx-2, todos os isolados foram negativos.

40

6.6 Relação clonal por ERIC-PCR

Através da análise do ERIC-PCR pode-se observar variabilidade clonal, sendo que

houve 100% de similaridade entre as cepas 19B e 20B (produtoras de CTX-M-8) dos isolados

de bezerros (Figura 10). O dendrograma foi construído com auxílio do software Bionumerics

(tolerância 2%, otimização 1%).

Figura 10. Dendrograma, construído a partir da análise de ERIC-PCR, das cepas de E. coli

isoladas de bezerros.

Isolados de E. coli recuperados de amostras coletadas de vacas em lactação, e

submetidas a ERIC-PCR, foram agrupadas em diferentes clusters, sendo que as cepas 34VL e

40VL possuem 95,7% de similaridade; as cepas 29VL e 30VL 97,7% de similaridade; e, as

cepas 26VL e 27VL, 97,7% de similaridade (Figura 11). Adicionalmente, foi possível observar

um cluster predominante que com 82,4% de similaridade, agrupou 21 cepas de E. coli

produtoras de CTX-M-15.

88.9

71.8

63.5

83.3

80.0

67.4

48.0

27.2

ERIC Bezerros

10

0

80

60

40

ERIC Bezerros

29/#1

8

13

9

19

20

16

6

18

10

41

6.7 Análise da relação clonal dos isolados de E. coli por PFGE

Na análise do PFGE, demonstrado na Figura 12, podem-se observar isolados

geneticamente relacionados. Utilizando um critério de agrupamento baseado em 90% de

similaridade é possível definir 6 clusters, com predomínio dos clusters definidos como A e B,

agrupando 18 e 17 isolados de E. coli produtora de CTX-M-15, respectivamente.

92.3

94.1

74.1

94.1

83.8

79.4

69.5

95.7

93.8

95.2

88.2

94.7

91.5

84.1

97.7

89.3

95.2

87.9

84.1

82.4

95.7

87.3

79.4

90.0

73.0

60.4

47.1

66.7

82.4

51.3

42.2

ERIC Bezerros

10

0

90

80

70

60

50

ERIC Bezerros

47

50

52

53

51

55

59

57

58

34

40

36

33

39

73

69

71

67

68

26

27

29

30

32

41

74

75

31

66

65

42

43

44

46

60

61

63

38

72

62

76

77

78

79

Figura 11. Dendrograma, construído a partir da análise de ERIC-PCR, das cepas de E.

coli isoladas de vacas em lactação

42

Figura 12. Dendrograma construído a partir da análise de PFGE.

A

B

43

6.7 Análise do sequenciamento de quatro cepas representativas de E. coli

Os resultados dos genes de resistência encontrados no sequenciamento das cepas de E.

coli (47VL, 13B, 34VL e 16VS), representativas no PFGE estão descritos na Tabela 8 a seguir.

Os resultados mostram que as cepas pertencem ao ST90 do CC23, mesmo sendo isolados de

animais diferentes e alojados em locais distintos da fazenda.

Tabela 8. Resultados do sequenciamento das cepas E. coli 47 VL, 13B, 34VL e 16VS

Características

E. coli produtora de CTX-M-15

47 VL 13B 34VL 16VS

Fonte Vaca leiteira Bezerro Vaca leiteira Vaca seca

Amostra Suabe fecal Suabe fecal Suabe fecal Suabe fecal

Serotipo O8:H9 O8:H9 O8:H9 O8:H9

Genoma (bp) 5,162,368 5,227,130 6,212,766 4,991,545

GC content (%) 50.6 50.7 48,8 50,6

tRNA 81 89 89 47

rRNA 23 20 20 3

No code RNA 16 9 9 9

Números de CDS 4,992 7,769 7,291 5,205

CRISP R 2 2 2 2

ST/CC 90/23 90/23 90/23 90/23

Lineage AxB1 AxB1 AxB1 AxB1

cgMLST 51329 51330 51329 51329

rMLST 29301 29301 29301 29301

wgMLST 54404 54405 61711 61712

Genes de resistência a:

Aminoglicosídeos

aac(3)-IId, aadA5,

aph(3')-Ia, strA,

strB

aac(3)-IId, aadA5,

strA, strB

aac(3)-IId, aadA5,

aph(3')-Ia, strA, strB

aph(3')-Ia, aadA5,

aac(3)-IId, aph(3')-Ib,

aph(6)-Id

β-lactâmicos blaCTX-M-15, blaTEM-

1B blaCTX-M-15, blaTEM-1B blaCTX-M-15, blaTEM-1B

blaCTX-M-15, blaTEM-1B

Macrolideos mph(A) mph(A) mph(A) mph(A)

Quinolonas gyrA mutations

(C248T, C255T,

G259A, C273T,

T300C)

gyrA mutations

(C248T, C255T,

G259A, C273T,

T300C)

QnrB 19, gyr A

mutations (S83L,

D87N)

gyrA mutations (S83L

and D87N), parC

Sulfonamidas sul2, sul1 sul2, sul1 sul2, sul1 sul2, sul1

Tetraciclinas tetB tetA, tetB tetB tetB

Trimetoprim dfrA17 dfrA8, dfrA17 dfrA17 dfrA17

Plasmídeos IncY, IncFIA,

IncQ1, IncFIB IncQ1

IncY, IncFIA, IncQ1,

IncFII, Inc

FIB(AP001918)

IncFIA, Inc

FIB(AP001918),

IncQ1, IncY, IncFII

(pAMA1167- NDM-

5)

44

7. DISCUSSÃO

_____________________________________________________________________

Animais de produção são considerados um dos principais reservatórios de E. coli

causadoras de infecções entéricas em humanos. Estes patógenos considerados zoonóticos

podem ser transmitidos através de alimentos contaminados. Além do risco da contaminação

para o homem, a presença de linhagens de E. coli resistente às cefalosporinas de amplo espectro

pode contribuir para o fracasso terapêutico dos animais infectados, com o subsequente aumento

do índice de morbidade e mortalidade, principalmente em crias (Caratolli, 2008).

Os ruminantes, em particular, possuem uma interação diferenciada da sua microbiota

intestinal, que é extremamente influenciada pela sua dieta. De fato, o trato intestinal de bovinos

é muito diferente dos monogástricos, tendo uma relação simbiótica única entre sua microbiota

residente e bactérias patogênicas (Téllez et al.,2015).

Seiffert e colaboradores (2013) propuseram duas estratégias de sobrevivência utilizadas

por bactérias resistentes que chegam a constituir a microbiota intestinal de bovinos: i) seleção

decorrente da pressão continua do uso de antimicrobianos; e ii) auto-inoculação e disseminação

dinâmica de bactérias resistentes pela contaminação cruzada entre os animais, através das fezes.

Adicionalmente, estes mecanismos poderiam contribuir para a contaminação ambiental nos

diferentes lugares de uma mesma propriedade, assim como para a contaminação acidental de

seres humanos em contato com estes animais.

Com relação ao uso profilático e/ou terapêutico de antibacterianos, outro fator

importantes de ser considerado no estabelecimento da microbiota resistentes é que o uso

sistêmico destes compostos possui maior impacto na pressão seletiva do que o uso local (ex.

uso intramamário), sendo que diferentes populações bacterianas nos diferentes locais do corpo

do animal são expostas após uso sistêmico, aumentando o risco de seleção de bactérias

resistentes nos diferentes tratos e tecidos do animal (Seiffert et al.,2013).

O ceftiofur é uma das cefalosporinas de escolha terapêutica na medicina veterinária,

para diversas infecções em bovinos de leite. Com relação a isto, Dolejska e colaboradores

(2011), comparando uma fazenda com uso convencional do antimicrobiano com outra fazenda

orgânica que não fazia uso do mesmo medicamento, relataram uma correlação estatística

45

significante entre uso de cefalosporinas de amplo espectro e a prevalência de E. coli produtora

de blaCTX-M-1.

Na propriedade utilizada como modelo, no presente estudo, o uso de ceftiofur tem sido

recorrente, como informado pelo profissional veterinário, sendo utilizado tanto na via

intramamária quanto sistêmica. Nesta condição de uso, o período de descarte é respeitado como

indicado na bula, ou seja, o leite ordenhado das vacas em tratamento é separado do leite para

consumo humano. Portanto, no período da coleta todas as vacas em lactação estavam fora do

período de descarte.

Baseado em modelos matemáticos, alguns estudos têm sugerido que em uma fazenda

onde existe uma circulação dinâmica de isolados entre o gado e o ambiente, cepas de E. coli

resistentes podem persistir na microbiota comensal de bovinos devido à pressão do ceftiofur,

tornando-se prevalentes através da transmissão vertical/horizontal de plasmídeos ou pela

ingestão de isolados de E. coli resistentes (Volkova et al., 2012).

Embora, alguns trabalhos têm demonstrado a presença de bactérias carregando genes de

resistência às cefalosporinas de amplo espectro aos antibióticos em bezerros alimentados com

leite de descarte (Brunton et al., 2014; Pereira et al., 2014), este tipo de associação não tem sido

investigada no Brasil. Brunton e colaboradores (2014) no Reino Unido demonstraram o impacto

do fornecimento de leite de descarte com resíduos de antibióticos para bezerros, onde em uma

fazenda estudada, 82,8% dos bezerros foram colonizados por cepas de E. coli portadoras de

genes blaCTX-M. Este mesmo estudo demonstrou que os genes de resistência encontrados podem

ser menos prevalentes conforme a idade dos animais vai aumentando. Isto pode ser respondido

pelo aumento da área física onde os animais permanecem em função do período de crescimento

(i.e., primeiramente em baias individuais quando jovens, e depois em piquetes mais extensos

quando adultos), dificultando a transmissibilidade dos genes de resistência quando as áreas

físicas são mais extensas e propiciam um distanciamento entre os animais.

Com relação ao estado de portador, Lowrance e colaboradores (2007) demonstraram

que a administração de uma única dose de ceftiofur favoreceu a colonização intestinal

transitória por E. coli MR em novilhos, sendo que a presença destas bactérias MRs foi negativa

após duas semanas do uso do antibiótico.

Outro estudo feito por Roesch e colaboradores (2006) demonstrou que a prevalência de

patógenos resistentes a antibióticos em úberes de vacas criadas em fazendas orgânicas (onde o

46

uso de antibióticos é restrito), não difere da prevalência encontrada em úberes de vacas criadas

no sistema convencional, suportando a necessidade de estudos adicionais para determinar os

fatores de riscos entre o uso de antibióticos e a presença de bactérias resistentes, em bovinos de

leite.

Quanto à resistência a antimicrobianos, tem sido demonstrado que 30% dos isolados de

E. coli em bezerros apresentam resistência ao ceftiofur (Pereira et al., 2011). Em nosso estudo

a investigação foi direcionada para isolar seletivamente cepas resistentes a este antimicrobiano,

porém, outra informação importante de destacar é a identificação da alta resistência para

gentamicina (39,7%) entre isolados de E. coli resistentes ao ceftiofur. A gentamicina é um

antimicrobiano do tipo aminoglicosídeo de uso tópico muito utilizado em casos de mastite em

bovinos de leite (Freitas et al., 2018). Adicionalmente, a alta resistência a quinolonas e

tetraciclinas, encontrada em este estudo, confirma um perfil de multirresistência (Magiorakos

et al., 2012), que denota o uso de outros antibióticos, muito provavelmente associados ao

ceftiofur, o que tem contribuído com a aquisição de outros genes de resistência que poderiam

ser mobilizados por um mesmo ou diferentes plasmídeos.

A investigação molecular foi direcionada especificamente para a identificação de genes

que conferiram resistência para cefalosporinas de amplo espectro, uma vez que este tipo de

antibiótico é praticamente a última alternativa de tratamento em medicina veterinária, onde a

produção de ESBL é uma urgência clínica e epidemiológica. Assim, a análise molecular dos

isolados resistentes a ceftiofur revelou a presença de genes ESBL em 68 cepas (71,57%) do

total de amostras, sendo que a prevalência de genes que codificaram para ESBL foi blaCTX-M-15

> blaCTX-M-8 > blaCTX-M-2. Dentre os escassos trabalhos que tem investigado a prevalência de

ESBLs em bovinocultura, um estudo desenvolvido na Alemanha por Eller e colaboradores

(2014) reportou uma alta prevalência de blaCTX-M-8, enquanto este trabalho detectou uma maior

prevalência de blaCTX-M-15. Interessantemente, o nosso resultado é condizente com o reportado

em medicina humana, onde nos últimos anos a prevalência de CTX-M-15 tem aumentado entre

produtores de ESBL (Rocha et al., 2016).

Na análise do ERIC-PCR pode-se observar que os isolados 19B e 20B são

geneticamente idênticos, mas pertencem a animais diferentes que estavam alojados em baias

diferentes, comprovando a disseminação de E. coli resistente nestes animais. Os genes

encontrados em bezerros são semelhantes aos encontrados nas vacas em lactação (CTX-M-8 e

CTX-M-15), mostrando uma possível transferência através do leite descartado.

47

Baseado no WGS, no resultado da resistência à quinolonas podemos observar que clones

circulantes possuem genes de resistência (mutação de gyrA e QnrB), também tem sido relatados

em humanos destacando a presença na interface humana-animal (Qiu et al., 2018). Apesar da

presença do plasmídeo IncQ1 nas cepas sequenciadas, o qual tem sido identificado como

elemento mobilizável, não foi elucidado qual plasmídeo carrega o gene blaCTX-M-15 nas amostras

estudadas, sendo relacionado a presença de ESBL. Neste aspecto, a utilização de

antimicrobianos pode influenciar a transferência de genes de resistência a bactérias residentes

na microbiota intestinal, sendo de grande importância principalmente em animais de produção,

onde a suplementação de antimicrobianos faz parte do manejo alimentar, aumentando assim o

risco de disseminação de bactérias MRs (Zeng e Lin, 2017).

A caracterização de linhagens patogênicas é fundamental para fins epidemiológicos,

sendo o PFGE uma das técnicas mais aceitas e utilizadas. Esta informação é válida para

entendermos a distribuição de cepas em uma população. Neste estudo, o PGFE mostrou

linhagens bacterianas adaptadas e colonizando diferentes animais agrupados dentro de um

mesmo cluster, suportando uma origem clonal, onde linhagens predominantes têm adaptação

em bovinos. Na análise do MLST, foi demonstrada que quatro cepas representativas do clusters

relacionados pelo PFGE (cepas 47VL, 34VL, 13B e 16VS) pertenceram ao complexo clonal 23

(ST90), anteriormente identificado em pacientes humanos na Ásia e Europa, e associado aos

genes blaNDM e blaCTX-M (Diab et al., 2009; Oteo et al., 2016). Adicionalmente, foram

identificadas cepas de E. coli produtoras de CTX-M-15 pertencentes ao ST90 em amostras de

animais selvagens na Suécia (Bonnedahl et al., 2010). O complexo clonal 23 também foi

reportado recentemente em amostras de alimentos de origem animal e amostras animais na

Alemanha (Irrgang et al, 2017). De fato, O ST90 agrupa linhagens patogênicas de E. coli

responsáveis por infecções em humanos e animais (incluindo de produção, suínos e bovinos),

como reportado em bancos de dados internacionais de E. coli

(http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/GetTableInfo_html).

Com relação à possível fonte de contaminação, no presente estudo investigamos a água

de bebedouro e ambientes de descanso dos animais colonizados, porém, não foram obtidos

resultados positivos. Uma possível hipótese da origem da resistência a ceftiofur mediada por

CTX-M, não descarta a possibilidade de uma origem humana, uma vez que os genótipos de

ESBL encontrados, assim como as linhagens identificadas, já têm sido reportados em seres

humanos. Neste ponto, existe a possibilidade que os próprios funcionários poderiam ser

responsáveis pela fonte de aquisição e/ou disseminação destas bactérias e/ou seus genes de

http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/GetTableInfo_html

48

resistência. Por outro lado, outras fontes ambientais antropogênicamente contaminadas

poderiam ser uma potencial fonte de contaminação e disseminação, como é o caso de ambientes

aquáticos impactados que são utilizados para abastecimento de águas de bebida. De fato, no

Brasil, tem sido documentada a contaminação de diversos ambientes aquáticos por bacterias

produtoras de beta-lactamases, incluindo ESBL e carbapenemases (Nascimento et al, 2017;

Fernandes et al., 2017; Sellera et al., 2018).

Em todo este cenário, o leite de descarte pode ser considerado um fator de pressão de

seleção, contribuindo para o aparecimento de bacterias MRs em bezerros. O leite contendo

resíduos de antimicrobianos contribui para o aumento de genes de resistência a beta-lactâmicos,

sulfonamidas e aminoglicosídeos, contudo esses genes alguns destes genes já são considerados

comuns em bactérias isoladas do gado de leite, sugerindo que outros fatores além da ingestão

de leite de descarte podem contribuir para sua prevalência (Maynow et al., 2017b).

A ingestão de leite contendo resíduos de antimicrobianos pode contribuir para a

modificação da microbiota de bezerros, mesmo em níveis baixos de concentração (VanVleck

Pereira et al., 2016), enquanto que na colonização, bactérias MRs podem estar presentes nas

mucosas nasais e retais de bezerros alimentados com leite de descarte, contribuindo para

disseminação das mesmas no ambiente (Maynow et al., 2017a).

Apesar de todas as cepas terem sido negativas para os genes de virulência, o que

demonstra uma origem comensal, o perfil MDR causa grande preocupação, principalmente em

bovinos de leite que são frequentemente expostos a antimicrobianos devido à incidência de

mastite nesses animais. Os grupos filogenéticos de virulência de E. coli mais encontrados neste

estudo foram os grupos A e B1, demonstrando serem cepas de baixa virulência, confirmando

uma origem commensal.

Uma resposta efetiva ao combate às MRs é necessária, e para isso deve-se monitorar a

presença dessas bactérias em gado de leite e formular programas multidisciplinares de

vigilância, como já ocorrem em outros países. Além disso, requer investimentos na pesquisa

para encontrar alternativas seguras e econômicas e estratégias inovadoras paralelas ao

desenvolvimento de novos antibióticos (Sharma et al., 2018). Outra estratégia que pode ser

adotada seria um programa de redução de uso de antimicrobianos, como o existente na

Dinamarca, onde o consumo destes produtos diminuiu 10% entre os anos de 2013 e 2016

(DANMAP, 2018).

49

No Brasil se faz necessário mais estudos sobre a disseminação de bactérias MRs em

bovinos de leite. Algumas limitações em nosso estudo podem ser enumeradas, tais como a

realização de uma única coleta que somente mostra um período de colonização e não identifica

se esta microbiota é transitória ou permanente, ou quanto tempo dura a colonização.

Independente disto fica evidente que as linhagens encontradas podem chegar a serem parte da

microbiota de bovinos nas diferentes faixas etárias e categoria animal (vaca em lactação ou

vaca seca). Outra limitação foi à falta de identificação da possível fonte de origem de linhagens

de E. coli produtoras de CTX-M, visto que não foram encontradas bactérias resistentes nas

amostras ambientais (cama e bebedouro), mas nosso estudo se mostrou como um piloto para a

elaboração de projetos futuros que visem elucidar a origem e disseminação de bactérias

multirresistentes em bovinos de leite.

50

8. CONCLUSÕES

_____________________________________________________________________

A partir dos resultados obtidos, concluímos que as cepas apresentando resistência a

diversos antimicrobianos estão disseminadas em ruminantes produtores de leite, e o

fornecimento de leite de descarte a ruminantes jovens poderia influenciar na persistência dessas

cepas resistentes. Apesar de encontrarmos cepas resistentes nos animais, não foram encontradas

cepas resistentes em amostras ambientais (cama e bebedouro), o que poderia ser explicado pela

adaptação das cepas de E. coli na microbiota de ruminantes, visto que nenhum animal estudado

estava com doença clínica. O tratamento com antibióticos para doenças infecciosas em bovinos

de leite, principalmente a mastite, poderia contribuir para a persistência de bactérias resistentes,

pois o produtor precisa de uma solução imediata para que o animal continue produzindo leite e

não tenha tanto prejuízo com a infecção. Todas as vacas tiveram um tratamento com ceftiofur

em algum momento da vida (sistêmico ou intramamário), mas devido ao manejo dos animais,

no momento da coleta nenhum animal estava em tratamento. A população estudada mostrou

um perfil de MRs que podem estar adaptadas à sua microbiota, e também mostrou clones

representativos de CTX-M-15 circulando na propriedade em animais de diferentes idades.

Apesar de pertencerem ao mesmo ST (90), as amostras foram negativas aos genes de virulência

(stx-1 e stx-2), e todos os animais apresentavam-se sadios. Foi demonstrado que a maioria das

cepas pertenciam ao grupo A e B1 de baixa virulência. Entretanto o perfil MRs mostra

preocupação pelo potencial de disseminação no leite e no ambiente.

Os resultados das cepas sequenciadas demonstram que as diferentes categorias animais

(vaca de leite, vaca seca e bezerros) compartilham de genes de resistência. A utilização empírica

de cefalosporinas pode contribuir para o aumento destes genes. Um exemplo é que a amostra

coletada de bezerro (13B) demonstra possuir mais genes de resistência em comparação às

outras, visto que este animal recebeu uma pressão seletiva de antimicrobianos, principalmente

o ceftiofur, através da ingestão do leite de descarte o que o deixa em desvantagem em um

possível tratamento para doenças infecciosas. Este estudo modifica a nossa visão quanto à

disseminação dessas cepas, que estão sendo cada vez mais detectadas em animais de produção

e meio ambiente, e pode contribuir para conscientizar sobre a necessidade da elaboração de um

programa de vigilância e de utilização consciente de antibióticos em bovinocultura, como já

ocorre em alguns países. Esses fatos alarmam a saúde pública e também o agronegócio, pois

além de dificultar o tratamento de infecções, a presença de resíduos de antibióticos interfere na

produção de lácteos, chegando ao consumidor final.

51

E finalmente, deve-se conscientizar não somente a população, mas também os

profissionais veterinários quanto ao uso consciente desses fármacos em ruminantes,

desenvolver novas estratégias de vigilância com a finalidade de monitorar a prevalência dessas

bactérias e tomar medidas profiláticas para evitar futuros problemas de saúde para o Brasil e

para o mundo.

52

9. REFERÊNCIAS

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61

ANEXO I

62

ANEXO II

Publicações:

SARTORI, L.; FERNANDES, MIRIAM R ; Ienne, S. ; SOUZA, T. A. ; GREGORY, L. ;

CERDEIRA, L. ; LINCOPAN, N. . Draft genome sequences of two fluoroquinolone-resistant

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147, 2017

FERNANDES, MIRIAM R ; MOURA, QUEZIA ; SARTORI, LUCIANA ; SILVA, KETRIN

C ; CUNHA, MARCOS PV ; ESPOSITO, FERNANDA ; LOPES, RALF ; OTUTUMI,

LUCIANA K ; GONÇALVES, DANIELA D ; DROPA, MILENA ; MATTÉ, MARIA H ;

MONTE, DANIEL FM ; LANDGRAF, MARIZA ; FRANCISCO, GABRIELA R ; BUENO,

MARIA FC ; DE OLIVEIRA GARCIA, DOROTI ; KNÖBL, TEREZINHA ; MORENO,

ANDREA M ; LINCOPAN, NILTON . Silent dissemination of colistin-resistant in South

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2016.

FERNANDES, MIRIAM R. ; MCCULLOCH, JOHN A. ; VIANELLO, MARCO A. ;

MOURA, QUÉZIA ; PÉREZ-CHAPARRO, PAULA J. ; ESPOSITO, FERNANDA ;

SARTORI, LUCIANA ; DROPA, MILENA ; MATTÉ, MARIA H. ; LIRA, DÉBORA P. A. ;

MAMIZUKA, ELSA M. ; LINCOPAN, NILTON . First Report of the Globally Disseminated

IncX4 Plasmid Carrying the Gene in a Colistin-Resistant ST101 isolated from a Human

Infection in Brazil. Antimicrobial Agents and Chemotherapy (Print), v. 60, p. AAC.01325-16,

2016

SELLERA, FÁBIO P. ; FERNANDES, MIRIAM R. ; SARTORI, LUCIANA ; CARVALHO,

MARCELO P. N. ; ESPOSITO, FERNANDA ; NASCIMENTO, CRISTIANE L. ; DUTRA,

GUSTAVO H. P. ; MAMIZUKA, ELSA M. ; PÉREZ-CHAPARRO, PAULA J. ;

MCCULLOCH, JOHN A. ; LINCOPAN, NILTON . Escherichia coli carrying IncX4 plasmid-

mediated mcr-1 and bla CTX-M genes in infected migratory Magellanic penguins ( Spheniscus

magellanicus ). Journal of Antimicrobial Chemotherapy (Print), v. 12, p. dkw543, 2016.

Luciana Sartori - teses.usp.br · Ficha Catalográfica elaborada eletronicamente pelo autor,...

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