Unicamprepositorio.unicamp.br/.../256400/1/HozUrrejola_LuciadelCarmendel… · ii FICHA...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS E NUTRICcedilAtildeO

EFEITOS DA RADIACcedilAtildeO GAMA NA β-LACTOGLOBULINA MODIFICACcedilOtildeES ESTRUTURAIS E

AGREGACcedilAtildeO

Luciacutea del Carmen de la Hoz Urrejola Doutoranda

Profa Dra Flaacutevia Maria Netto Orientadora

Tese apresentada agrave Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de

Campinas para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo

Campinas-SP

2006

ii

FICHA CATALOGRAacuteFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA FEA ndash UNICAMP

Titulo em inglecircs Gamma radiation effects on β-lactoglobulin structural modifications and aggregation Palavras-chave em inglecircs (Keywords) Circular dichroism Proteins ndash Aggregation X-ray ndash Small-angle scattering Whey ndash Proteins Aacuterea de concentraccedilatildeo Nutriccedilatildeo Experimental Aplicada agrave Tecnologia de Alimentos Titulaccedilatildeo Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo Banca examinadora Flaacutevia Maria Netto Valdemiro Carlos Sgarbieri Iacuteris Torriani Francisco Teixeira Pessine Maria Teresa Bertoldo Pacheco Susy Frei Sabato Programa de Poacutes Graduaccedilatildeo Programa em Alimentos e Nutriccedilatildeo

Hoz Urrejola Luciacutea del Carmen de la H856e Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-lactoglobulina modificaccedilotildees

estruturais e agregaccedilatildeo Luciacutea del Carmen de la Hoz Urrejola -- Campinas SP [sn] 2006

Orientador Flaacutevia Maria Netto Tese (doutorado) ndash Universidade Estadual de CampinasFaculdade

de Engenharia de Alimentos 1 Dicroiacutesmo circular 2 Proteiacutenas ndash Agregaccedilatildeo 3 Raios X ndash

Espalhamento a baixo acircngulo 4 Soro do leite ndash Proteiacutenas I Netto Flaacutevia Maria II Universidade Estadual de CampinasFaculdade de Engenharia de Alimentos III Tiacutetulo

iii

Luciacutea del Carmen de la Hoz Urrejola


AGREGACcedilAtildeO

Tese apresentada agrave Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade

Estadual de Campinas para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo

Profa Dra Flaacutevia Maria Netto

Orientadora

Campinas -SP 2006

iv

v

BANCA EXAMINADORA


(ORIENTADORA) ndash DEPANFEAUNICAMP

Prof Dr Valdemiro Carlos Sgarbieri (MEMBRO) ndash DEPANFEAUNICAMP

Profa Dra Iacuteris Torriani (MEMBRO) ndash IFGWUNICAMP

Prof Dr Francisco Teixeira Pessine (MEMBRO) ndash IQMUNICAMP

Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco MEMBRO) ndash ITAL

Dra Susy Frey Sabato (MEMBRO) ndash IPEN

vi

vii

Em especial dedico

As minhas filhas como siacutembolo de um novo

recomeccedilo na minha vida

viii

ix

AGRADECIMENTOS

Aos professores e funcionaacuterios da Faculdade de Engenharia de Alimentos pela

oportunidade de aprendizado e apoio na realizaccedilatildeo de meu trabalho

Agrave Profa Flavia Maria Netto pela orientaccedilatildeo pelo apoio constante e pela confianccedila e

oportunidade de desenvolver a minha tese

Agrave Profa Dra Iacuteris Torriani pela sua paciecircncia atenccedilatildeo e ajuda no propoacutesito da utilizaccedilatildeo

do Laboratoacuterio de luz Siacutencrotron pela sua colaboraccedilatildeo no projeto e pelos ensinamentos

sobre a teacutecnica de SAXS

Agrave Cristiano de Oliveira pela sua valiosa colaboraccedilatildeo nas anaacutelises de SAXS e pelas

discussotildees esclarecedoras

Ao Prof Dr Francisco Pessine pela sua pronta disposiccedilatildeo para esclarecer duacutevidas e pela

ajuda indispensaacutevel na correccedilatildeo da tese

Agrave Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco pela sua cooperaccedilatildeo na preparaccedilatildeo e discussatildeo

do projeto de tese

Ao Prof Dr Valdemiro Sgarbieri pelos ensinamentos e por partilhar comigo suas ideacuteias e

opiniotildees

A todos os membros da banca examinadora pelas valiosas correccedilotildees e sugestotildees que

permitiram aperfeiccediloar este trabalho

Agrave Profa Deacutebora Tavares pela amizade confianccedila e pelos seus conselhos e constante

apoio durante o tempo da realizaccedilatildeo de meu trabalho Obrigada pelas jornadas musicais

disfrutadas juntas

Ao Prof Carlos Grosso pelo estiacutemulo e pela atenccedilatildeo dispensada em todo momento que

precisei de sua experiecircncia e conhecimentos

x

xi

Ao IPEN na pessoa de Elizabeth Somessari e Carlos Gaia pela atenccedilatildeo e

responsabilidade em atender ao nosso pedido de realizar a irradiaccedilatildeo de nossas

amostras

Ao CENA-USP ESALQ na pessoa do Prof Dr Julio Walder que disponibilizou os

equipamentos para a irradiaccedilatildeo e agrave Gilberto Furlan pela sua pronta colaboraccedilatildeo na

irradiaccedilatildeo de nossas amostras

Agrave Profa Dra Eneida de Paula do Instituto de Biologia- Unicamp por disponibilizar o seu

laboratoacuterio para as determinaccedilotildees de fluorescecircncia

Agrave Daniel Rezza pela sua disposiccedilatildeo e ajuda na realizaccedilatildeo das anaacutelises de dicroiacutesmo

circular e discussotildees afins

Agraves colegas do laboratoacuterio de Bioquiacutemica Eliana Beth Duda Soninha Liz Andreacuteia

Mariza Bete pelos bons momentos partilhados pelo apoio amizade e carinho que me

permitiram uma estadia inesqueciacutevel e proveitosa enquanto a realizaccedilatildeo de meu trabalho

Agrave Suzi pela amizade bons momentos partilhados e pela ajuda nas anaacutelises estatiacutesticas

Ao Chico pelo apoio nas anaacutelises no laboratoacuterio central de instrumentaccedilatildeo e pelas


Aacute Florencia Bia Maria Ineacutes Nonoacute mis queridas amigas gracias por la amistad incentivo

y lindos momentos compartidos

Agrave meu amigo Guillermo pelo incentivo e constante apoio obrigada pelos ensinamentos e

pelos cafezinhos disfrutados e ldquodiscutidosrdquo juntos

Agraveo CNPq pela bolsa de doutorado concedida

Agrave Davisco por ternos proporcionado a mateacuteria prima para nosso trabalho

A todos os que de alguma forma contribuiacuteram direta ou indiretamente para a realizaccedilatildeo

desta tese

Agrave minhas filhas que me compreenderam e apoiaram nesta nova empreitada

xii

xiii

IacuteNDICE

LISTA DE TABELAS xix

LISTA DE FIGURAS xxi

RESUMO xxix

ABSTRACT xxxiii

1 INTRODUCcedilAtildeO 1

2 OBJETIVOS 5

21 Geral 6

22 Especiacuteficos 6

3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 7

31 Proteiacutenas de soro de leite 8

32 β-lactoglobulinahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9

321 Caracteriacutesticas estruturais 9

3211 Estrutura primaacuteria e secundaacuteria 9

3212 Estrutura terciaacuteria 9

322 Relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo 10

3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas 10

3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas 13

323 Digestibilidade da β-LG 14

324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas 14

33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG 15

331 Influecircncia do pH 17

332 Efeito do aquecimento 18

333 Influecircncia da alta pressatildeo hidrostaacutetica 19

334 Efeitos da irradiaccedilatildeo gama 20

xiv

xv

34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo 22

341 Dicroiacutesmo Circular (CD) 23

Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD 24

Espectro de CD no UV-longiacutenquo 25

Espectro de CD no UV-proacuteximo 26

342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 27

343 Fluorescecircncia 29

Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos 30

4 MATERIAL E MEacuteTODOS 33

41 Material e reagentes 34

42 Meacutetodos 35

421 Delineamento experimental 35

422 Irradiaccedilatildeo 35

423 Proteoacutelise enzimaacutetica 36

424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 36

Dicroiacutesmo Circular (CD) 36

Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 37

Grupos tiol (-SH) livres totais 37

Fluorescecircncia 37

Espectrofotometria de UV e Visiacutevel 38

425 Meacutetodos cromatograacuteficos 39

Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de fase reversa 39

Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular 39

426 Eletroforese em gel de poliacrilamida 40

427 Isotermas de sorccedilatildeo 40

428 Anaacutelises estatiacutesticas 40

5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 41

51 Caracterizaccedilatildeo da β-LGhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42

xvi

xvii

52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG 44

521 Mudanccedilas estruturais 44

Fluorescecircncia intriacutenseca 44

Dicroiacutesmo circular 48

Grupos sulfidrila livre 59

522 Agregaccedilatildeo 61

Turbidez medida pela transmitacircncia a 550 nm 61

Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 62

Cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) 64

SAXS 67

523 Mecanismos de agregaccedilatildeo 83

Eletroforese em gel (SDS-PAGE) 84

Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil 85

524 Mudanccedilas na funcionalidade 87

Poder ligante do retinol 87

Susceptibilidade agraves proteases 88

6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 93

7 CONCLUSOtildeES 99

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 101

xviii

xix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras

35

Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras

35

Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do seu espectro de UV-longiacutenquo

49

Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na literatura

49

Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida 52 Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e 10mgmL)

56

Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de radiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG

60

Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL) lida nestas mesmas concentraccedilotildees

62

Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama na forma soacutelida

71

Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama em soluccedilatildeo

78

xx

xxi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas isoformas A e B

10

Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemero 24 Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas

25

Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente

29

Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 125 Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG-022

42

Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05 mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40degC A eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mLmin em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm

43

Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC 44 Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras (aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) (aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw 074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3

45

Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A) (10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3 C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm

46

Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)

51

Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)

51


52

Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1))

53

Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)

53

xxii

xxiii


54

Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)

54


55

Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevelable (3) oligocircmeros (4) agregados Ref Carrota et al (2001)

57

Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)

58

Figura 20Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)

58

Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves amostras de β-LG irradiadas com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2 corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy

63

Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy

64

Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy

65

Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy (C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)

66


67

Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva de ajuste com dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e C0A3

69

Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama

70

xxiv

xxv

Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo

72

Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 250 kGy

73

Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama

74

Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias C graacutefico de Kratky e D curva de ajuste com dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo irradiada

75

Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 5 kGy

76

Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy

77

Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 80 Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10 80 Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10 81 Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10 81 Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 82 Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG-L3 irradiada com 5 kGy 83 Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e (B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)

84

Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)

85

Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondentes a uma mesma dose de radiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)

86

xxvi

xxvii

Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm

88

Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC

89

Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC

90

Figura 46 Aacutereas dos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes dose (0 10 25 e 50 kGy) Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (corre spondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)

91

Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)

91

xxviii

xxix

Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-lactoglobulina modificaccedilotildees estruturais e agregaccedilatildeo

RESUMO

Amostras de β-lactoglobulina (β-LG) no estado soacutelido com diferentes atividades de

aacutegua (aw) (022 053 074) ou em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 e 10

mgmL foram irradiadas (1-50 kGy) utilizando uma fonte de Cobalto-60 Espalhamento de

raios-X a baixos acircngulos (SAXS) dicroiacutesmo circular (CD) e fluorescecircncia foram as

teacutecnicas utilizadas para estudar as mudanccedilas conformacionais da β-LG por efeito da

irradiaccedilatildeo A proteiacutena irradiada foi tambeacutem examinada por eletroforese em gel de

poliacrilamida (PAGE) e desnaturante (SDS-PAGE) sob condiccedilotildees redutoras e natildeo

redutoras cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) e ndashSH livre A β-LG no estado

soacutelido nas diferentes aw estudadas natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo As amostras natildeo

apresentaram diminuiccedilatildeo na digestibilidade sob accedilatildeo da pepsina e tripsina e natildeo

mudaram seu poder ligante de retinol quando irradiadas com doses ateacute 10 kGy Nas

amostras irradiadas em soluccedilatildeo houve modificaccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura

terciaacuteria enquanto a estrutura secundaacuteria parece ter sido preservada como indicado pela

quantificaccedilatildeo das estruturas obtidas a partir da deconvoluccedilatildeo dos espectros de CD no

UV-longiacutenquo Os dados de SE-HPLC e espalhamento de raios-X mostraram que a

irradiaccedilatildeo promoveu a formaccedilatildeo de oligocircmeros e agregados que resultaram ser

altamente soluacuteveis como mostrado pelas medidas de turbidez Da anaacutelise dos dados de

SAXS e a construccedilatildeo de modelos pode ser mostrado que os oligocircmeros eram muacuteltiplos

de diacutemeros de β-LG (tetracircmeros e hexacircmeros etc) linearmente ordenados Ligaccedilotildees

cruzadas intermoleculares entre radicais tirosil teriam participaccedilatildeo na agregaccedilatildeo e as

ligaccedilotildees dissulfeto pelo contraacuterio natildeo teriam sido relevantes para a formaccedilatildeo dos

agregados O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG mediante ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil

contraacuterio ao que acontece em outros tratamentos fiacutesicos como o teacutermico ou de alta

pressatildeo hidrostaacutetica poderia estar gerando agregados com caracteriacutesticas e propriedades

diferentes O efeito da irradiaccedilatildeo na proteiacutena foi maior nas amostras mais diluiacutedas e com

maior dose de radiaccedilatildeo indicaccedilatildeo da ocorrecircncia do chamado ldquoefeito indiretordquo da

irradiaccedilatildeo Considerando que natildeo houve alteraccedilotildees estruturais nem perda de

funcionalidade ou de digestibilidade da β-LG irradiada no estado soacutelido ateacute com 10 kGy

em diferentes aw o tratamento com radiaccedilatildeo gama poderia ser usado para melhorar a

xxx

xxxi

qualidade microbioloacutegica da proteiacutena e aumentar as condiccedilotildees de seguranccedila se for

aplicada uma radiaccedilatildeo na faixa geralmente utilizada no processamento de alimentos (lt10

kGy)

Palavras chave Dicroiacutesmo circular complexo β-lactoglobulina-retinol agregaccedilatildeo de

proteiacutena espalhamento de raios-X a baixos acircngulos proteiacutenas do soro de leite

xxxii

xxxiii

Gamma radiation effects on β-lactoglobulin structural modifications and aggregation

ABSTRACT

β-lactoglobulin (β-LG) in solution at different protein concentrations (3 and 10 mgmL)

and in solid state with different water activity (aw) (022 053 074) was irradiated using a

Cobalt-60 radiation source at a dose level of 1-50 kGy Small-angle X-ray scattering

(SAXS) Circular Dichroism (CD) and Fluorescence spectroscopy were used to study the

conformational changes of β-LG due the irradiation treatment The irradiated protein was

also examined by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and sodium dodecyl sulfate

(SDS) PAGE under reducing and nonreducing conditions size exclusion chromatography

(SE-HPLC) and free SH β-LG in the solid state at different aw was not significantly

affected by gamma radiation The digestibility of these samples under pepsin or trypsin

action was not diminished and the retinol binding property was not changed by irradiation

up to 10 kGy The irradiation of β-LG in solution promoted structural changes at the tertiary

structure level but the secondary structure seemed to be maintained as indicated by the

quantification of structures from the deconvolution of the far-UV CD spectra The SE-

HPLC and X-rays scattering data showed that irradiation of β-LG solutions promoted

oligomers and aggregates formation which proved to be highly soluble as shown by

turbidity measurements From the SAXS data analyses and the model building it could be

shown that the formed oligomers were linear molecules built by linear combinations of β-

LG dimers (tetramers hexamers etc) Formation of intermolecular cross-linking between

tyrosil radicals are proposed to be at least partially responsible by this occurrence and the

disulphide bonds in contrast do not appear to be relevant to the formation of these

aggregates The mechanism of aggregation of β-LG through bityrosil cross-links

differently from the mechanism occurring in other physical treatments as heating or high

pressure could form aggregates with special and different characteristics The radiation

effect was more significant at low protein concentration and higher irradiation dose being

consistent with the occurrence of the ldquoindirect effectrdquo when proteins are irradiated in

solution Considering that neither structural changes or loss of functionality and digestibility

of β-LG irradiated in the solid state at different aw with dose up to 10 kGy was detected

the gamma radiation treatment could be used for improving the microbiological quality of

xxxiv

xxxv

the protein enhancing the safety conditions when applying the radiation range generally

used in food processing (lt10kGy)

Keywords Circular dichroism retinol-β-lactoglobulin complex aggregation of protein

small-angle X-ray scattering protein digestibility whey

xxxvi

1 Introduccedilatildeo 1

1 INTRODUCcedilAtildeO



O soro de leite bovino foi considerado em deacutecadas passadas como resiacuteduo

industrial altamente poluente proveniente da fabricaccedilatildeo do queijo Atualmente eacute uma

fonte proteica de grande importacircncia que possui excelentes propriedades nutritivas e

funcionais Como resultado de inuacutemeros estudos realizados novos conhecimentos sobre

as propriedades tecnoloacutegicas e fisioloacutegicas de suas proteiacutenas constituintes tecircm

contribuiacutedo para incrementar a sua aplicaccedilatildeo como ingrediente alimentiacutecio Os

concentrados de proteiacutena do soro constituem uma importante fonte de ingredientes

funcionais utilizados em diversas formulaccedilotildees alimentares incluindo carnes processadas

produtos laacutecteos e de panificaccedilatildeo (KINSELLA WHITEHEAD 1989 DE WIT 1998

HUFFMAN HARPER 1999)

A β-lactoglobulina (β-LG) eacute a principal proteiacutena do soro de leite bovino

constituindo ao redor de 50 do seu total pelo que tende a comandar o comportamento

geral do sistema de proteiacutenas de soro (PALAZOLO et al 2000) A sua estrutura

particular do tipo lipocalina apresenta uma espeacutecie de caacutelice de caraacuteter hidrofoacutebico o

qual lhe confere propriedades funcionais de grande importacircncia para a induacutestria de

alimentos como a capacidade de emulsificaccedilatildeo formaccedilatildeo de espuma geleificaccedilatildeo e de

ligaccedilatildeo com aromatizantes (MORR FOEGEDING 1990) Com o desenvolvimento do

processo de ultrafiltraccedilatildeo com membranas ela pode ser obtida na sua forma nativa em

grandes quantidades e com alto grau de pureza (MAUBOIS et al 1987 IMAFIDON

FARKYE SPANIER 1997 HUFFMAN HARPER 1999)

A estrutura da β-LG contribui para que ela seja uma proteiacutena bastante estaacutevel em

soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH apresentando no entanto diferentes estados de

associaccedilatildeo (TAULIER CHALIKIAN 2001) Pela sua caracteriacutestica estrutural a β-LG eacute

uma proteiacutena especialmente resistente agrave proteoacutelise pela pepsina e quimotripsina (REDDY

KELLA KINSELLA 1988) A β-LG eacute considerada como a proteiacutena com maior potencial

alergecircnico dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985

SEacuteLO et al 1999)

A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e o aquecimento geralmente utilizado no

processamento de alimentos com diversas finalidades pode ocasionar desnaturaccedilatildeo

Alteraccedilotildees na estrutura da proteiacutena podem alterar sua funcionalidade e tratamentos

aplicados no processamento tecircm o potencial de transformar a estrutura nativa em estados

natildeo nativos (FARREL et al 2002) Alguns efeitos indesejaacuteveis podem surgir como a

perda de solubilidade poreacutem um tratamento controlado pode tambeacutem originar efeitos


desejaacuteveis tais como uma melhora nas propriedades funcionais de superfiacutecie (espumante

e emulsificantes) (IBRAHIM KOBAYASHY KATO 1993)

A descontaminaccedilatildeo de alimentos pela radiaccedilatildeo ionizante eacute um processo seguro

eficiente e ambientalmente limpo (FARKAS 1998) Tem sido uma das tecnologias mais

discutidas e polecircmicas dos uacuteltimos anos no entanto estaacute aprovada em 37 paiacuteses

(BRENNNAND 1995) A irradiaccedilatildeo com raios gama eacute um tratamento que vem sendo

utilizado como meio de diminuir a carga microbiana de diversos alimentos

proporcionando maior vida de prateleira A radiaccedilatildeo gama em dose que atenda ao

requisito de pasteurizaccedilatildeo poderia levar vantagem sobre o tratamento teacutermico ao evitar a

exposiccedilatildeo da proteiacutena a temperaturas que conhecidamente estariam causando efeitos

deleteacuterios afetando suas propriedades funcionais Aleacutem disso o tratamento permite a

aplicaccedilatildeo direta da radiaccedilatildeo na sua embalagem final (FARKAS 1998)

Existe tambeacutem grande potencial de aplicaccedilatildeo da radiaccedilatildeo para propoacutesitos

tecnoloacutegicos como por exemplo a obtenccedilatildeo de melhorias na cor de produtos caacuterneos

(BYUN et al 1999) e das propriedades mecacircnicas de filmes comestiacuteveis biodegradaacuteveis

desenvolvidos com proteiacutenas (BRAULT DrsquoAPRANO LACROIX 1997 SABATO et al

2001 LETENDRE et al 2002) Biofilme obtido de soluccedilotildees de proteiacutenas de soro de leite

irradiadas exibiu melhores propriedades que os obtidos por tratamento teacutermico (LE TIEN

et al 2000) A radiaccedilatildeo ionizante tambeacutem tem sido estudada como meio para reduzir a

imunogenicidade de alguns aleacutergenos do leite como a β-lactoglobulina (LEE et al 2001)

No entanto faltam estudos sobre o efeito da irradiaccedilatildeo na estrutura e processo de

agregaccedilatildeo essenciais para o entendimento e controle de suas propriedades tecnoloacutegicas

e nutricionais Para explicar a mudanccedila conformacional e o comportamento na

desnaturaccedilatildeo da proteiacutena eacute necessaacuterio o conhecimento completo da sua estrutura No

caso da β-LG tem-se informaccedilotildees detalhadas da sua estrutura seja por difraccedilatildeo de raios-

X da proteiacutena cristalizada ou por Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica (NMR) da proteiacutena em

soluccedilatildeo As macromoleacuteculas em soluccedilatildeo apresentam importantes efeitos de

espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) que permitem determinar vaacuterias

caracteriacutesticas geomeacutetricas tais como raio de giro dimensatildeo maacutexima volume superfiacutecie

molecular e curvas de distribuiccedilatildeo de distacircncias intramoleculares relacionadas com a

forma da moleacutecula (PESSEN KUMOSINSKI TIMASHEFF 1971 WITZ TIMASHEFF

LUZZATI 1964) Estes efeitos permitem caracterizar o estado conformacional da proteiacutena

e suas alteraccedilotildees decorrentes dos diversos tratamentos


As teacutecnicas de SAXS e de dicroiacutesmo circular tecircm sido utilizadas com sucesso nas

anaacutelises dos estados de associaccedilatildeo da β-LG induzidos por sais (BALDINI et al 1999) e

das caracteriacutesticas de oligocircmeros isolados resultantes de tratamento teacutermico da β-LG

(CARROTA et al 2001 2003) A desnaturaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da β-LG induzida por

pressatildeo e temperatura foram tambeacutem monitoradas por SAXS em estudo de Panick

Malessa e Winter (1999)

Este estudo tem como objetivo avaliar as mudanccedilas conformacionais da proteiacutena

por efeito da radiaccedilatildeo gama e tentar delinear o possiacutevel processo de agregaccedilatildeo utilizando

as teacutecnicas analiacuteticas de espalhamento de raios-X a baixos acircngulos dicroiacutesmo circular

fluorescecircncia cromatografia de exclusatildeo molecular e eletroforese em gel de

poliacrilamida Nestas circunstacircncias mostra-se interessante a irradiaccedilatildeo da β-LG tanto

no estado soacutelido como em diferentes graus de atividade de aacutegua e em soluccedilatildeo para

melhor avaliar a magnitude do efeito produzido na proteiacutena em estudo

2 Objetivos 5

2 OBJETIVOS

2 Objetivos 6

2 OBJETIVOS

21 Objetivo Geral

Estudar as alteraccedilotildees estruturais o processo de agregaccedilatildeo e a funcionalidade da β-LG submetida agrave radiaccedilatildeo gama

22 Objetivos especiacuteficos

Estudar as alteraccedilotildees nas estruturas secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG tratada

com radiaccedilatildeo gama utilizando dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia

Delinear o processo de formaccedilatildeo de oligocircmeros e de agregaccedilatildeo utilizando a

teacutecnica de SAXS e cromatografia de exclusatildeo molecular

Estudar o mecanismo envolvido na oligomerizaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da proteiacutena e

propor modelos para os oligocircmeros formados

Estudar a funcionalidade da proteiacutena irradiada mediante estudo da sua

capacidade ligante de retinol e de sua digestibilidade

3 Revisatildeo Bibliograacutefica 7

3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA



31 Proteiacutenas do soro de leite

Historicamente as proteiacutenas do soro de leite foram consideradas produto residual

na induacutestria de fabricaccedilatildeo do queijo Nas uacuteltimas deacutecadas ganharam o status de produto

de alto valor agregado ao serem obtidas na forma de concentrados proteacuteicos com

diferentes teores de proteiacutenas As proteiacutenas do soro incluem α-lactalbumina β-

lactoglobulina albumina seacuterica bovina lactoferrina lactoperoxidase imunoglobulinas e

uma variedade de fatores de crescimento

As proteiacutenas de soro cumprem papel importante na nutriccedilatildeo por serem uma fonte

excepcionalmente rica e balanceada de aminoaacutecidos (REGESTER et al 1996) aleacutem de

apresentarem accedilotildees fisioloacutegicas especiacuteficas in vivo (McINTOSH et al 1998) Entre as

accedilotildees fisioloacutegicas a elas atribuiacutedas estatildeo estimulante do sistema imunoloacutegico

antioxidante antihipertensiva antitumoral protetora da mucosa gaacutestrica contra a

agressatildeo de agentes ulcerogecircnicos protetora contra vaacuterios tipos de cacircncer antiviral e

antibacterial Importantes artigos de revisatildeo abordando as variadas propriedades

fisioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido publicados (MARSHALL 2004 SGARBIERI 2004)

Por outro lado elas apresentam boas propriedades funcionais tecnoloacutegicas que derivam

principalmente da sua elevada solubilidade em uma ampla faixa de pH Destacam-se o

poder geleificante a propriedade formadora de espuma e a capacidade de emulsificar

quantidades significantes de lipiacutedeos (MARSHALL HARPER 1988)

A β-lactoglobulina eacute a principal proteiacutena do soro do leite bovino perfazendo de 7 a

12 do total de proteiacutenas no leite desnatado (WONG CAMIRAND PAVLATH 1996) Sua

funccedilatildeo bioloacutegica ainda natildeo estaacute totalmente elucidada no entanto vaacuterios experimentos

tecircm revelado que a proteiacutena nativa eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas

como retinol e aacutecidos graxos (PANICK MALESSA WINTER 1999) Sua estrutura do tipo

lipocalina lhe confere a caracteriacutestica de ser a principal proteiacutena alergecircnica do leite

(SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985 KURISAKI et al 1982 CLEMENT et al

2002)


32 β-Lactoglobulina

321 Caracteriacutesticas estruturais

A estrutura da β-LG eacute responsaacutevel pela sua estabilidade em soluccedilatildeo em um amplo

intervalo de pH e tambeacutem pelas suas propriedades funcionais capacidade geleificante

emulsificante formadora de espuma e ligante de pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas

(MORR FOEGEDING 1990)

3211 Estruturas primaacuteria e secundaacuteria

A β-LG eacute uma pequena proteiacutena globular constituiacuteda por 162 aminoaacutecidos

apresentando duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre A estrutura secundaacuteria consiste

de folhas-β antiparalelas formadas por nove filamentos-β (β-strands) A estrutura cristalina

mostra que o monocircmero consiste predominantemente de folhas-β (50) e uma pequena

porccedilatildeo de heacutelices-α (15) estruturas ao acaso ou desordenadas (15) e estruturas turns

(20) (PAPIZ et al1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al 1997)

Diversas variantes foram identificadas no leite bovino mas as duas principais satildeo

a β-LG A e B que apresentam diferenccedilas nos aminoaacutecidos na posiccedilatildeo 64 e 118 sendo

Asp64 e Val118 para β-LG A e Gly64 e Ala118 para a β-LG B A massa molar da variante

geneacutetica A eacute 18362 Da e da variante B 18276 Da O ponto isoeleacutetrico da β-LG eacute ao

redor de 52 levemente mais alto para a variante B que para a variante A (FOX

McSWEENEY 1998)

3212 Estrutura terciaacuteria

A conformaccedilatildeo espacial da β-LG foi completamente elucidada por Brownlow et al

(1997) Possui oito filamentos β denominadas de A agrave G (Figura 1) formando folhas-β

antiparalelas que se arranjam formando uma espeacutecie de caacutelice ou barril achatado capaz

de ligar e acomodar pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas no seu interior A β-LG eacute entatildeo

categorizada como um membro da famiacutelia das lipocalinas que compreende as proteiacutenas

com funccedilatildeo de transporte (ROUVINEN et al 1999) A estrutura tambeacutem conteacutem um curto

filamento-β (I) (em vermelho na Figura 1) uma heacutelice 310 entre os filamentos A e B uma

heacutelice-α entre os filamentos H e I (cor laranja na Figura 1) e uma heacutelice 310 C-terminal A

Figura 1 apresenta a estrutura da β-LG baseada em dados cristalograacuteficos de raios-X do

Banco de Dados de Proteiacutenas e produzida usando MOLSCRIPT (KRAULIS 1991)


Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas

isoformas A e B (Ref BOTELHO et al 2000)

322 Relaccedilatildeo estrutura- funccedilatildeo

3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas Alteraccedilotildees conformacionais da proteiacutena a partir do seu estado nativo tecircm levado agrave

elucidaccedilatildeo da relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo em estudo da capacidade de formaccedilatildeo e de

estabilizaccedilatildeo de espuma (PHILLIPS HAWKS GERMAN 1995) ou na propriedade de

formaccedilatildeo de geacuteis da β-LG (STADING LANGTON HERMANSSON 1993)

A capacidade da β-LG de ligar-se aos aacutecidos graxos tem sido explorada em seu

uso como agente emulsificante na induacutestria de alimentos (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI

1985) As propriedades emulsificantes da β-LG mudam dependendo do pH Menor

atividade emulsificante e de superfiacutecie foi observada em meio aacutecido (pH 3) quando

comparada a meio neutro possivelmente devido agrave baixa flexibilidade das moleacuteculas neste

pH (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI 1985)

A formaccedilatildeo de filme interfacial e a de espuma satildeo predominantemente

dependentes da hidrofobicidade superficial e da flexibilidade da proteiacutena Qualquer

mudanccedila que altere um destes fatores resultaraacute em mudanccedila nas propriedades de

formaccedilatildeo de espuma do sistema Phillips Hawks e German (1995) observaram forte

correlaccedilatildeo entre a estrutura secundaacuteria da β-LG em soluccedilatildeo e as propriedades

espumantes


Proteiacutenas globulares formam dois tipos de geacuteis dependendo da quantidade de

carga que a proteiacutena nativa carrega A β-LG que eacute uma proteiacutena globular forma geacuteis

particulados brancos na regiatildeo de pH 4-6 e geacuteis transparentes constituiacutedos por uma rede

de filamentos finos abaixo e acima deste intervalo de pH (LANGTON HERMANSSON

1992)

A estrutura conformacional do tipo lipocalina eacute a responsaacutevel pela interaccedilatildeo da β-

LG com o retinol e pequenos aacutecidos graxos Em 1972 Futterman e Heller usando teacutecnica

de fluorescecircncia demonstraram que a β-LG bovina assim como a proteiacutena ligante de

retinol (RBP) formam complexos com retinol soluacuteveis em aacutegua A ligaccedilatildeo de retinol com

β-LG envolve principalmente interaccedilotildees hidrofoacutebicas (FUGATE SONG 1980 JANG

SWAISGOOD 1990) Assim a porccedilatildeo apolar do ligante eacute amplamente responsaacutevel pela

ligaccedilatildeo e o siacutetio de ligaccedilatildeo provavelmente inclui resiacuteduos de triptofano que servem para

fixar o anel da β-ionona do retinol (FUGATE SONG 1980) Vaacuterios estudos tecircm sido feitos

com o propoacutesito de definir os siacutetios de ligaccedilatildeo existentes na β-LG para o retinol mas um

consenso natildeo tem sido atingido Para Papiz et al (1986) e Cho Batt e Sawyer (1994) o

retinol liga-se na regiatildeo interna do caacutelice hidrofoacutebico Jaacute para Monaco et al (1987) e

Lange et al (1998) o siacutetio de ligaccedilatildeo estaria na regiatildeo externa da estrutura proteica na

fenda de entrada do caacutelice Moleacuteculas como porfirinas e bilirubinas se ligam na entrada da

cavidade localizada atraacutes da heacutelice-α (ZSILA 2003)

Eacute conhecido que in vitro a β-LG liga fortemente uma moleacutecula de retinol por

monocircmero mas observaccedilotildees de Dufour e Haertle (1990) apontam que a estequiometria

pode ser dobrada quando a β-LG estaacute no estado molten globule que pode ser induzido

por mudanccedilas na polaridade do meio

Estudos sobre a ligaccedilatildeo da β-LG com ligantes em soluccedilatildeo tem sido realizados

utilizando diversas teacutecnicas espectroscoacutepicas incluindo Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica

(NMR) cromatografia de afinidade e equiliacutebrio de diaacutelise (WANG ALLEN SWAISGOOD

1997 CURLEY et al 1999 RAGONA et al 2000 SAWYER KONTOPIDIS 2000

MURESAN VAN DER BENT DE WOLF 2001) A maioria dos estudos cristalograacuteficos

com ligantes (palmitato retinol e colesterol) tem mostrado que estes se ligam dentro da

cavidade central da proteiacutena (QIN et al 1998 WU et al 1999 SAWYER KONTOPIDIS

2000) O efeito desta ligaccedilatildeo eacute um aumento na estabilizaccedilatildeo da proteiacutena agrave desnaturaccedilatildeo

teacutermica e pela ureacuteia (DUFOUR BERTRAND-HARB HAERTLEacute 1993 PUYOL et al

1994 JAMESON ADAMS CREAMER 2002) Calorimetria Diferencial de Varredura

(DSC) foi usada para estudo da estabilidade teacutermica da β-LG ligada ao retinol (PUYOL et


al 1994) O pico de temperatura maacutexima e a entalpia aparente de desnaturaccedilatildeo da β-LG

mostraram um leve aumento quando comparada agrave β-LG natildeo ligada (795plusmn 05degC e

2675plusmn265 kJmol respectivamente)

A percepccedilatildeo de aromatizantes em alimentos eacute altamente influenciada pelas

interaccedilotildees entre eles e outros componente da matriz A forccedila e natureza das interaccedilotildees

afetam a liberaccedilatildeo do aroma durante o processamento ou consumo de alimentos

(GUICHARD LANGOURIEUX 2000) Em soluccedilatildeo aquosa a presenccedila de β-LG induz

diminuiccedilatildeo da volatilidade da maioria dos compostos aromatizantes hidrofoacutebicos

principalmente devido agraves interaccedilotildees na cavidade central da proteiacutena diminuindo

significativamente a percepccedilatildeo do odor Em emulsotildees a presenccedila de β-LG na interface

oacuteleo-aacutegua aumenta a resistecircncia agrave transferecircncia de massa para a maioria dos compostos

hidrofoacutebicos o que pode induzir a alguma persistecircncia do aroma durante a degustaccedilatildeo

(GUICHARD LANGOURIEUX 2000)

A propriedade da β-LG de se ligar a um sem nuacutemero de pequenas moleacuteculas

hidrofoacutebicas passa a ser de grande interesse para a induacutestria farmacecircutica e de

alimentos Dentre os ligantes mais estudados com relaccedilatildeo a β-LG estatildeo o retinol

(DUFOUR MARDEN HAERTLEacute 1990 FUGATE SONG 1980 BYCHKOVA et al 1992

CHO BATTS SAWYERS 1994) aacutecido retinoacuteico (ZSILA BIKAacuteDI SIMONYI 2002) retinil

acetato β-caroteno (DOUFOUR HAERTLEacute 1991) colesterol protoporfirina (DUFOUR

MARDEN HAERTLEacute 1990) bilirubina (ZSILA 2003)

Em estudo de Moller Stapelfeldt e Skibsted (1998) o tratamento com alta pressatildeo

hidrostaacutetica (ateacute 400 MPa) levou a β-LG a apresentar propriedades antioxidantes

relacionadas ao grupo tiol da β-LG Na proteiacutena desnaturada pela accedilatildeo da alta pressatildeo o

grupo sulfidrila livre fica mais exposto e ativo Este grupo atuaria como antioxidante

interrompendo a propagaccedilatildeo da cadeia de peroxidaccedilatildeo do aacutecido linoleacuteico em emulsotildees

oacuteleo em aacutegua formando radicais estaacuteveis na reaccedilatildeo com grupos peroxi de lipiacutedeos

ROO + R-SH ROOH + R-S

A β-LG apresenta efeito protetor na destruiccedilatildeo teacutermica do aacutecido ascoacuterbico em

soluccedilatildeo aquosa (DAI-DONG NOVAK HARDY 1990) O efeito protetor pode ser devido

ao efeito antioxidante do grupo tiol presente nos resiacuteduos de cisteiacutena da proteiacutena


3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas da β-LG

Estudos sobre propriedades fisioloacutegicas da β-LG mostram os diversos efeitos que

esta proteiacutena poderia causar no organismo enquanto manteacutem em parte sua conformaccedilatildeo

nativa ou quando hidrolisada pela accedilatildeo das enzimas proteoliacuteticas digestivas Alguns

exemplos satildeo apresentados a seguir

Puyol et al (1995) utilizaram monocamadas de ceacutelulas Caco-2 (cultura de tecido

como enteroacutecito de carcinoma de coacutelon humano) para estudar o efeito da β-LG na

absorccedilatildeo e transporte do retinol e aacutecido palmiacutetico Esta linha de ceacutelulas possui

caracteriacutesticas morfoloacutegicas e bioquiacutemicas similares agraves das ceacutelulas intestinais absortivas

como a polarizaccedilatildeo e a expressatildeo de vaacuterias enzimas da borda de escova O estudo

demonstrou que a β-LG como proteiacutena ligante pode facilitar a entrada de aacutecido palmiacutetico e

retinol por essas ceacutelulas

Neurath et al (1996) verificaram que a β-LG ligada ao anidrido 3-hidroxiftaacutelico

forma um composto (3-HP-β-LG) que bloquea o viacuterus HIV ligando-se ao receptor do viacuterus

Ouwehand et al (1997) descreveram o poder da β-LG em inibir a adesatildeo de

enteropatoacutegenos agraves glicoproteiacutenas de ileostomia humana impedindo a infecccedilatildeo em um

primeiro estagio da colonizaccedilatildeo Quando as pontes dissulfeto eram reduzidas a proteiacutena

natildeo mais apresentava esta atividade sugerindo que sua estrutura com as pontes

dissulfeto e aacutereas circundantes preservadas eram cruciais para ela apresentar esta

atividade

Em estudo realizado por Nagaoka et al (2001) foi observado que peptiacutedeos

triacutepticos derivados da β-LG bovina induziram a supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol

evidenciado tanto pelas medidas de absorccedilatildeo de colesterol in vivo como pelo estudo in

vitro com ceacutelulas Caco-2 O peptiacutedeo derivado da β-LG IIAEK pode influenciar

poderosamente o niacutevel de colesterol seacuterico e a sua atividade hipocolesterolecircmica foi maior

que a do medicamento β-sitosterol em ratos O estudo sugere que haveria uma interaccedilatildeo

direta no epiteacutelio intestinal entre o colesterol misturado agraves micelas e o hidrolisado triacuteptico

da β-LG Esta interaccedilatildeo causaria inibiccedilatildeo da solubilidade micelar de colesterol levando

assim agrave supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol

A digestatildeo proteoliacutetica por tripsina gera alguns peptiacutedeos com atividade bactericida

(PELLEGRINI et al 2001) A atividade bactericida dos fragmentos de β-LG que eram

negativamente carregados foi restrita a bacteacuterias Gram-positivas


Mullaly Meisel e Fitzgerald (1997) analisaram a atividade antihipertensiva de

hidrolisados enzimaacuteticos de β-LG determinada pela capacidade de inibiccedilatildeo da enzima

conversora da angiotensina I Os autores reportaram que permeados de 3 kDa de

hidrolisados triacutepticos apresentaram maior atividade que os hidrolisados triacutepticos natildeo

fracionados e maior atividade que a proteiacutena natildeo hidrolisada equivalente a 87 de

inibiccedilatildeo e com um C50 de 130 mgL (mg de proteiacutena por litro de hidrolisado)

323 Digestibilidade da β-LG

A estrutura compacta da β-LG estabilizada por duas pontes dissulfeto faz desta

proteiacutena um substrato pobre para muitas enzimas A β-LG nativa eacute hidrolisada facilmente

pela tripsina mas eacute resistente agrave digestibilidade peacuteptica e quimiotriacuteptica O aquecimento

ateacute 70degC natildeo altera sua resistecircncia agrave digestibilidade peacuteptica e somente o tratamento

teacutermico agrave temperatura entre 80 - 90degC diminui sua resistecircncia agrave hidroacutelise (REDDY KELLA

KINSELLA 1988)

Outros tratamentos como o de alta pressatildeo hidrostaacutetica ou o uso de diferentes

solventes podem aumentar sua susceptibilidade agrave hidroacutelise enzimaacutetica (DIB et al 1996

STAPELFELDT et al 1996)

Os efeitos da radiaccedilatildeo gama na digestibilidade in vitro e na liberaccedilatildeo de

aminoaacutecidos da β-LG foram investigados por Voisine Parent e Savoie (1990) em

amostras liacutequidas ou congeladas (ambas com aw 093) ajustadas a pH 52 ou 70 e em

amostras secas (aw 013) e irradiadas com doses de 1-50 kGy A composiccedilatildeo

aminoaciacutedica a digestibilidade in vitro e a liberaccedilatildeo de aminoaacutecidos natildeo foram diminuiacutedas

pela irradiaccedilatildeo ateacute as mais altas doses (50 kGy) Os autores concluiacuteram que a qualidade

nutricional da β-LG natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo nas doses recomendadas para o

processamento de alimentos (lt10 kGy)

324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas

A atividade antigecircnica de proteiacutenas refere-se ao reconhecimento de alguns

epiacutetopos nas proteiacutenas por anticorpos especiacuteficos (ABBAS LITCHMAN 2005) e o termo

ldquoalergiardquo refere-se agraves condiccedilotildees cliacutenicas causadas por resposta imune improacutepria e

prejudicial em pessoas geneticamente predispostas A alergia alimentar eacute definida como

uma reaccedilatildeo adversa a um alimento devido a um mecanismo imunoloacutegico envolvendo

principalmente reaccedilotildees mediadas pelas imunoglobulinas E (Ig-E) (BUSINCO BRUNO

GIAMPIETRO 1998)


Quase todas as proteiacutenas do leite satildeo antigecircnicas e embora nem todas as

substacircncias antigecircnicas tenham sido caracterizadas como alergecircnicas elas devem ser

consideradas como alergecircnicas potenciais (SPIES 1973) A atividade alergecircnica das

proteiacutenas β-LG α-lactalbumina (α-La) albumina de soro bovina (BSA) e caseiacutena tem sido

as mais estudadas dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973)

A β-LG se apresenta como particularmente alergecircnica devido a sua caracteriacutestica

conformacional Em anos recentes tem se evidenciado que praticamente todos os

aleacutergenos respiratoacuterios caracterizados a niacutevel molecular do tipo animal pertencem a

famiacutelia das lipocalinas agrave qual tambeacutem pertence a β-LG (MAumlNTYJAumlRVI RAUTIAINEN

VIRTANEN 2000)

Estudos reportados inicialmente por Otani Uchio e Tokita (1985) e Kurisaki et al

(1982) mostraram que a estrutura terciaacuteria da β-LG era necessaacuteria para sua

imunoreatividade Recentemente CLEMENT et al (2002) realizaram um estudo completo

da antigenicidade da β-LG utilizando anticorpos monoclonais (mAb) Eles reportaram que

natildeo somente na heacutelice-α e laccedilos externos havia regiotildees antigecircnicas mas que tambeacutem as

folhas β continham epiacutetopos (CLEMENT et al 2002)

Ao que parece segundo Seacutelo et al (1999) nenhuma forma estrutural em particular

eacute responsaacutevel por um grau maior de alergenicidade na β-LG Os epiacutetopos satildeo numerosos

e amplamente difundidos ao longo da moleacutecula Eles podem estar localizados nas partes

hidrofoacutebicas da moleacutecula inacessiacuteveis para os anticorpos IgE na conformaccedilatildeo nativa da

proteiacutena mas chegam a ser bio-acessiacuteveis depois do processo digestoacuterio Hidrolisados de

β-LG retecircm a maior parte da immunoreatividade da proteiacutena nativa Vaacuterios peptiacutedeos

triacutepticos capazes de ligar-se especificamente agraves IgsE em humanos tecircm sido

identificados

33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG

As alteraccedilotildees estruturais da β-LG satildeo de grande interesse jaacute que suas

propriedades funcionais e bioloacutegicas satildeo altamente afetadas pela sua conformaccedilatildeo e pelo

seu estado de associaccedilatildeo (MORGAN et al 1999)

Meacutetodos de obtenccedilatildeo da proteiacutena na forma nativa permitem maior exploraccedilatildeo das

propriedades funcionais no processamento de produtos alimentiacutecios (DE JONGH

GROumlNEVELD DE GROOT 2001) Teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo satildeo utilizadas para a

obtenccedilatildeo de concentrados de proteiacutenas do soro natildeo desnaturadas (MAUBOIS et al


1987) A ultrafiltraccedilatildeo apresenta vaacuterias vantagens sobre outros processos de separaccedilatildeo jaacute

que natildeo envolve mudanccedila de fases pode ser conduzido a baixas temperaturas e pressatildeo

hidrostaacutetica natildeo afetando substacircncias termosensiacuteveis e natildeo precisa de reagentes

quiacutemicos (PORTER MICHAELS 1970)

A ultrafiltraccedilatildeo eacute a teacutecnica preferida para a fabricaccedilatildeo dos concentrados proteacuteicos

de soro com gt50 de proteiacutena (MORR FOEGEDING 1990) De acordo com Morr e Ha

(1993) a ultrafiltraccedilatildeo eacute um processo industrial utilizado para o fracionamento do soro

com o objetivo de produzir um concentrado proteacuteico de soro com alto teor de proteiacutena

Geralmente o processo eacute seguido de uma diafiltraccedilatildeo com aacutegua desionizada para a

remoccedilatildeo de lactose residual e dos minerais do retentado antes da secagem A diafiltraccedilatildeo

aumenta a pureza do concentrado proteacuteico e a funcionalidade dos ingredientes

(HUFFMAN 1996)

Na obtenccedilatildeo de proteiacutenas normalmente o processo de liofilizaccedilatildeo eacute utilizado para

conseguir maior estabilidade da proteiacutena na estocagem Em geral as proteiacutenas liofilizadas

satildeo mais estaacuteveis em meios com menor conteuacutedo de aacutegua (LAI TOPP 1999) Liu

Langer e Klibanov (1991) reportaram um estudo sobre agregaccedilatildeo de proteiacutenas liofilizadas

no estado soacutelido induzidas pela umidade A umidade residual normalmente eacute considerada

a responsaacutevel pela instabilidade quiacutemica de proteiacutena e peptiacutedeos no estado soacutelido (LIU

LANGER KLIBANOV 1991)

A interaccedilatildeo aacuteguaproteiacutena eacute bem representada pelas isotermas de sorccedilatildeo Uma

isoterma de sorccedilatildeo se define como a representaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua em um alimento

(g de aacutegua por g de mateacuteria seca) como funccedilatildeo da pressatildeo de vapor em equiliacutebrio (pp0)

a uma temperatura constante (FENNEMA 1996) As isotermas de sorccedilatildeo fornecem

informaccedilotildees importantes para otimizar formulaccedilotildees nos processos de concentraccedilatildeo e de

desidrataccedilatildeo empacotamento condiccedilotildees de crescimento microbiano e a estabilidade

fiacutesica e quiacutemica do produto como uma funccedilatildeo de seu conteuacutedo de aacutegua (HARDY

SCHER BANON 2002)

As isotermas de sorccedilatildeo de umidade das proteiacutenas e biomoleacuteculas geralmente

exibem forma sigmoidal Vaacuterios modelos teoacutericos tecircm sido propostos para descrever

isotermas de sorccedilatildeo de biomoleacuteculas ou proteiacutenas Entre eles estatildeo o modelo simplificado

de Langmuir o de Brunauer e colaboradores e o meacutetodo de GAB desenvolvido por

Guggenheim Anderson e De Bocircer (HAGEMAN et al 1992 HARDY SCHER BANON

2002) Ainda que os paracircmetros de hidrataccedilatildeo avaliados por estes modelos sejam de

limitado significado fiacutesico (KUNTZ KAUZMANN 1974) estas teorias satildeo ainda


empregadas para predizer mudanccedilas na mobilidade em aacutegua e estabilidade da proteiacutena

(IGLESIAS BUENO 1999)

Os diferentes graus de hidrataccedilatildeo ou quantidade de aacutegua na proteiacutena pode ser um

indicativo da flexibilidade de sua moleacutecula podendo resultar num comportamento diferente

frente aos tratamentos Moleacuteculas da proteiacutena hidratada poderatildeo ser mais susceptiacuteveis a

mudanccedilas estruturais pela diferente atividade da aacutegua nos vaacuterios graus de hidrataccedilatildeo

(RUPLEY CARERI 1991)

331 Influecircncia do pH

A β-LG eacute uma proteiacutena bastante estaacutevel em soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH

apresentando no entanto diferentes estados de associaccedilatildeo A β-LG experimenta cinco

transiccedilotildees induzidas por pH que podem ser identificadas no intervalo de pH 1-13

(TAULIER CHALIKIAN 2001)

A primeira transiccedilatildeo comeccedila em pH 2 mas natildeo eacute completada mesmo em pH 1

Neste pH a β-LG retem a maior parte de sua estrutura secundaacuteria mas satildeo evidentes

algumas alteraccedilotildees na estrutura terciaacuteria A segunda transiccedilatildeo ocorre entre pH 25 e 4 e

tem sido identificada como uma transiccedilatildeo de diacutemero a monocircmero A terceira transiccedilatildeo

ocorre entre pH 45 e pH 6 e resulta em uma leve mudanccedila na sua estrutura terciaacuteria mas

sem qualquer alteraccedilatildeo significativa na secundaacuteria (TAULIER CHALIKIAN 2001)

Timasheff et al (1966) qualificaram a transiccedilatildeo da forma nativa e compacta (N)

existente em pH 6 para a forma aciacutedica (Q) em pH ~45 como ldquomudanccedila conformacional

da β-LG induzida por pHrdquo Alguns autores mencionam que em pH ~45 a β-LG estaacute

propensa a formar octacircmeros (TIMASHEFF et al 1966 McKENZIE SAWYER 1967)

mas em estudo de Taulier e Chalikian (2001) anaacutelises de anisotropia de fluorescecircncia e

anaacutelises volumeacutetricas natildeo revelaram nenhum indiacutecio de octamerizaccedilatildeo da proteiacutena neste

pH

A quarta transiccedilatildeo ocorre entre pH 65 e pH 85 e eacute conhecida como transiccedilatildeo de

Tanford (TAULIER CHALIKIAN 2001) Ela eacute acompanhada por alteraccedilotildees na estruturas

secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG que sendo alteraccedilotildees mais bem localizadas natildeo causam

uma mudanccedila global na conformaccedilatildeo da proteiacutena A principal alteraccedilatildeo estrutural da

proteiacutena estaacute relacionada com o deslocamento da alccedila EF que abre o interior do caacutelice

acima de pH 75 A transiccedilatildeo eacute tambeacutem acompanhada por uma mudanccedila no

microambiente da Tyr42 causando uma alteraccedilatildeo de 5 graus na orientaccedilatildeo relativa dos

monocircmeros no diacutemero (OLIVEIRA et al 2001 BROWNLOW et al 1997)


A quinta transiccedilatildeo ocorre entre pH 9 e pH 125 identificada tambeacutem como

desnaturaccedilatildeo induzida por aacutelcalis Ela resulta em ruptura de toda e qualquer estrutura de

tipo dimeacuterica nativa em monocircmeros desnaturados No estado desnaturado em pH 125 haacute

uma diminuiccedilatildeo significativa da estrutura secundaacuteria e pouca rigidez da estrutura terciaacuteria

No entanto estima-se que aproximadamente 20 das folhas-β e 10 das heacutelice-α satildeo

preservadas (CASAL KOumlHLER MANTSCH 1988 TAULIER CHALIKIAN 2001) A

desnaturaccedilatildeo da β-LG induzida por aacutelcalis eacute irreversiacutevel (TAULIER CHALIKIAN 2001)

332 Efeito do aquecimento A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e vaacuterios efeitos satildeo produzidos nela pela

accedilatildeo da temperatura Estudos sobre sensibilidade teacutermica da β-LG em pH neutro

mostram que modificaccedilotildees estruturais da proteiacutena representam os passos iniciais das

subsequumlentes mudanccedilas macroscoacutepicas Entre elas perda de solubilidade e exposiccedilatildeo

de regiotildees adequadas para diferentes tipos de interaccedilatildeo com outros componentes em

sistemas complexos (IAMETTI et al 1996)

A desnaturaccedilatildeo teacutermica ocorre em diferentes estaacutegios caracteriacutesticos e em

temperaturas relativamente definidas Estes passos podem levar agrave modificaccedilotildees

reversiacuteveis (ao redor de 50oC) ou irreversiacuteveis (acima de 65-70oC) Em meio neutro o

aquecimento origina em primeiro lugar a monomerizaccedilatildeo da proteiacutena dimerizada (nativa)

(CROGUENNEC et al 2003) seguida por perda da conformaccedilatildeo globular compacta

Forma-se um estado intermediaacuterio de maior flexibilidade da estrutura terciaacuteria e maior

volume onde haacute aumento de grupos hidrofoacutebicos expostos denominado de estado

moltem globule (CARROTA et al 2001) Em seguida ocorre a associaccedilatildeo (intermolecular

de estruturas folhas-β) e agregaccedilatildeo atraveacutes de pontes dissulfeto e interaccedilotildees hidrofoacutebicas

(SHIMADA CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 PRABAKARAN DAMODARAN 1997

PALAZOLO et al 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999 PHOTCHANACHAI

KITABATAKE 2001)

Estudos sobre a β-LG tratada termicamente utilizando espalhamento de luz

estaacutetico e hidrodinacircmico apontam como primeira etapa a formaccedilatildeo de oligocircmeros

soluacuteveis metaestaacuteveis linearmente interligados por ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares

(HOFFMANN et al 1996 ELOFSSON DEJMEK PAULSSON 1996)


Durante o processamento do leite em escala industrial a β-LG eacute apontada como

responsaacutevel pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo que conduz agrave obstruccedilatildeo e

consequumlente ineficiecircncia dos trocadores de calor (SAWYER KONTOPIDIS 2000)

333 Influecircncia de alta pressatildeo hidrostaacutetica

O tratamento de alta pressatildeo tem sido muito estudado como meacutetodo alternativo ao

processo teacutermico tanto para preservaccedilatildeo como para melhorar a funcionalidade do

alimento (BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000) O uso de alta pressatildeo no leite

induz agrave inativaccedilatildeo microbiana e enzimaacutetica assim como tambeacutem modifica as

caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas dos componentes do leite (MESSENS VAN CAMP

HUYGHEBAERT 1997)

O tratamento de alta pressatildeo tem sido investigado como alternativa para a

formaccedilatildeo de geacuteis de proteiacutenas do soro do leite no lugar do aquecimento principalmente

porque alimentos processados por alta pressatildeo reteacutem as propriedades sensoriais e

nutricionais do produto fresco e porque os geacuteis assim formados tecircm texturas uacutenicas

(KANNO et al 1998 DUMOULIN OZAWA HAYASHI 1998)

A investigaccedilatildeo dos efeitos da pressatildeo nas reaccedilotildees de desnaturaccedilatildeo e

procedimentos de geleificaccedilatildeo eacute guiada pela relativa importacircncia da β-LG no

processamento de alimentos e tambeacutem em parte pela possibilidade de extrair β-LG do

soro por meio de alta pressatildeo (PANICK MALESSA WINTER 1999)

Nos estudos sobre tratamentos a alta pressatildeo da β-LG verifica-se que haacute

similaridade com os fenocircmenos ocorridos no tratamento teacutermico Dependendo da pressatildeo

aplicada mudanccedilas reversiacuteveis e irreversiacuteveis acontecem (BOTELHO et al 2000

BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999

FUNTENBERGER DUMAY CHEFTEL 1997 YANG et al 2001) Em geral pode-se

dizer que entre 100-150 MPa haacute um comeccedilo da monomerizaccedilatildeo Jaacute entre 140 e 250 MPa

haveria modificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria mas as estruturas β natildeo satildeo completamente

quebradas ateacute pressatildeo de 330 MPa Entre 300-400 MPa a estrutura da β-LG apresenta

grande flexibilidade e retiradas as condiccedilotildees de pressatildeo ela se re-natura (monocircmero

modificado) Ao aumentar a pressatildeo para 600 e 900 MPa haacute formaccedilatildeo de agregados

estabilizados por interaccedilotildees hidrofoacutebicas e principalmente por ligaccedilotildees de intercacircmbio

tiol-dissulfeto Em estudo por NMR do efeito da alta pressatildeo na β-LG Belloque Lopez-


Fandintildeo e Smith (2000) concluiacuteram que os agregados resultantes seriam poliacutemeros de

proteiacutenas bem estruturadas

Valores de pressatildeo de 600 e 900 MPa estatildeo acima dos requeridos para a

preservaccedilatildeo de alimentos (IAMETTI et al1997)

334 Efeitos da radiaccedilatildeo gama No processo de irradiaccedilatildeo gama utiliza-se como fonte de energia o Cobaltondash60

(60Co) Durante o processo de decaimento o 60Co emite raios gama que satildeo aproveitados

para tratar diversos produtos meacutedicos farmacecircuticos cosmeacuteticos e alimentos com o

objetivo de inativar ou eliminar organismos indesejaacuteveis (microacutebios patoacutegenos insetos e

parasitas) (DELINCEacuteE 1998 FARKAS 1998 GROLICHOVAacute DVORAacuteK MUSILOVAacute

2004)

No caso dos alimentos no Brasil as normas gerais para irradiaccedilatildeo aprovadas

pela Divisatildeo Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria de Alimentos (DINAL) em 080385

estabeleciam que a dose meacutedia global absorvida natildeo deveria exceder os 10kGy com a

finalidade de assegurar a sua inocuidade sob os pontos de vista toxicoloacutegico nutricional e

microbioloacutegico Esta legislaccedilatildeo foi revisada e atualizada pela Resoluccedilatildeo RDC n21 de 26

de janeiro de 2001 da Diretoria Colegiada da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria

publicada no DOU de 29 de janeiro de 2001 (ANVISA 2001) Trata-se de um

ldquoRegulamento teacutecnico para irradiaccedilatildeo de alimentosrdquo Segundo a Resoluccedilatildeo RDC n 21

fica liberada a irradiaccedilatildeo de qualquer tipo de alimento observadas as seguintes

condiccedilotildees a dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade

pretendida a dose maacutexima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometeria as

propriedades funcionais e ou atributos sensoriais do alimento

Comparada com outras tecnologias de esterilizaccedilatildeo a irradiaccedilatildeo com raios gama

apresenta uma evidente vantagem ambiental sem emissotildees toacutexicas sem impacto sobre

a qualidade da aacutegua e do ar e sem resiacuteduos nocivos (FARKAS 1998)

A aplicaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo gama em concentrados ou isolados proteacuteicos de soro de

leite obtidos por teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo por membranas pode fornecer a garantia de

qualidade bacterioloacutegica (ausecircncia de geacutermes) requerida dada agrave facilidade com que uma

contaminaccedilatildeo microbiana pode vir a acontecer no processo de obtenccedilatildeo destes materiais

(DIAS 2003)


Embora a pasteurizaccedilatildeo seja considerada como tratamento satisfatoacuterio para a

descontaminaccedilatildeo de alimentos liacutequidos ela natildeo eacute tatildeo adequada para alimentos soacutelidos

ou ingredientes secos (FARKAS 1998)

Os procedimentos de sanitizaccedilatildeo quiacutemica tecircm problemas inerentes no que

concerne a resiacuteduos e poluiccedilatildeo ambiental (FARKAS 1998) Neste sentido eacute que a

irradiaccedilatildeo de alimentos surge como alternativa de descontaminaccedilatildeo para o futuro

(CORRY et al 1995)

Moleacuteculas de proteiacutena irradiada no estado soacutelido absorvem diretamente a

radiaccedilatildeo produzindo vaacuterios radicais O chamado ldquoefeito diretordquo pode levar agrave modificaccedilatildeo

parcial ou total da configuraccedilatildeo da proteiacutena Em soluccedilotildees aquosas de proteiacutena a radiaccedilatildeo

atua primeiro sobre as moleacuteculas de aacutegua produzindo espeacutecies ativas como radicais

hidroxila (bullOH) e eleacutetrons hidratados (eaq-) que iratildeo reagir com resiacuteduos de aminoaacutecidos

num processo chamado de ldquoefeito indiretordquo da radiaccedilatildeo O grau de modificaccedilatildeo no estado

soacutelido eacute muito menor se comparado ao observado no estado aquoso Esta diferenccedila pode

ser atribuiacuteda agrave recombinaccedilatildeo dos radicais (RHrarr Rbull + bullH rarrRH) devido agrave baixa mobilidade

das espeacutecies no estado soacutelido (YAMAMOTO 1992)

Os resiacuteduos de aminoaacutecidos que conteacutem enxofre (cisteiacutena cistina e metionina) e

os que contecircm anel aromaacutetico (fenilalanina tirosina triptofano) e histidina satildeo as partes

das proteiacutenas mais sensiacuteveis agrave radiaccedilatildeo particularmente quando em soluccedilatildeo aquosa

Estes resiacuteduos de aminoaacutecidos facilmente formam radicais livres por reaccedilatildeo com bullOH e

satildeo mais adiante facilmente oxidados ou ligados ao anel de resiacuteduos de aminoaacutecidos

aromaacuteticos resultando em ligaccedilotildees cruzadas ou agregaccedilatildeo (YAMAMOTO 1992

SEVILLA BECKER YAN 1990)

A radiaccedilatildeo gama natildeo eacute a uacutenica capaz de produzir transformaccedilotildees quiacutemicas e

nutricionais nos alimentos Estudos demonstraram que ateacute 10 kGy estas transformaccedilotildees

na maioria dos alimentos satildeo pequenas e raramente exclusivas de produtos irradiados

sendo semelhantes ao resultado de outros processos de conservaccedilatildeo como cozimento

secagem extrusatildeo e outros (DIEHL 1995)

Natildeo obstante alguns alimentos como leite e produtos laacutecteos natildeo satildeo adequados

para serem irradiados devido ao desenvolvimento de aromas indesejaacuteveis Tambeacutem

alguns vegetais e frutas frescas natildeo toleram doses acima de 2-3 kGy pela destruiccedilatildeo das

vitaminas A esterilizaccedilatildeo pode tambeacutem afetar o sabor e textura em muitos produtos

(CRAWFORD RUFF 1996)


A produccedilatildeo de radicais livres tem sido a principal razatildeo do questionamento sobre a

seguranccedila dos produtos irradiados No entanto produtos radioliacuteticos natildeo satildeo exclusivos

da irradiaccedilatildeo pois tambeacutem satildeo produzidos em outros tratamentos de alimentos como o

teacutermico ao tostar patildeo fritar ou secar alimentos por liofilizaccedilatildeo (ICGFI 1991)

A maioria das alegaccedilotildees sobre os aspectos adversos da irradiaccedilatildeo natildeo se aplicam

agraves doses tiacutepicas aprovadas para pasteurizaccedilatildeo e sim agraves doses mais elevadas requeridas

para esterilizaccedilatildeo Haacute trecircs niacuteveis de dosagem comumente recomendados dependendo

da finalidade de aplicaccedilatildeo dose baixa (ateacute 1 kGy) para desinfecccedilatildeo e demora no

processo de amadurecimento dose meacutedia (1-10 kGy) para pasteurizaccedilatildeo e dose alta

(10-50 kGy) para esterilizaccedilatildeo (CRAWFORD RUFF 1996 WHO 1999)

Lee et al (2001) avaliaram a aplicaccedilatildeo da tecnologia de irradiaccedilatildeo alimentar como

meacutetodo para reduzir a alergia provocada pelo leite Tratando caseiacutena e β-LG com

radiaccedilatildeo gama os autores observaram diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas e

antigecircnicas in vitro utilizando o meacutetodo ELISA Os autores sugeriram que esta diminuiccedilatildeo

das propriedades alergecircnicas seria resultado de mudanccedilas estruturais das proteiacutenas e

possivelmente de mascaramento dos epiacutetopos devido agrave agregaccedilatildeo molecular

A teacutecnica claacutessica utilizada para descontaminaccedilatildeo de alimentos eacute o aquecimento

mas outras tecnologias estatildeo ganhando popularidade e a alta pressatildeo hidrostaacutetica tem

sido proposta como alternativa aos jaacute estabelecidos procedimentos de sanitizaccedilatildeo teacutermica

(IAMETTI et al 1997) O efeito da radiaccedilatildeo gama e de uma combinaccedilatildeo de alta pressatildeo

e irradiaccedilatildeo sobre a qualidade microbioloacutegica de carne de porco fresca foi descrito por

Paul et al (1997) O estudo mostrou um efeito sinergiacutestico ao ser aplicada uma

combinaccedilatildeo de radiaccedilatildeo e alta pressatildeo melhorando a qualidade sensorial e a seguranccedila

microbioloacutegica do produto

34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo

Pesquisas utilizando espectroscopia de UVVis fluorescecircncia dicroiacutesmo circular

(CD) espectroscopia de ressonacircncia nuclear magneacutetica (NMR) calorimetria diferencial de

varredura (DSC) dispersatildeo oacuteptica rotatoacuteria (ORD) espectroscopia de infravermelho com

transformada de Fourier assim como dispersatildeo de luz e espalhamento de raios-X a

baixos acircngulos tecircm conseguido desvendar as mais diversas mudanccedilas de estrutura em

estudo de enovelamento (folding) e desenovelamento (unfolding) de proteiacutenas aleacutem de


permitir o monitoramento das diferentes propriedades fiacutesico-quiacutemicas de proteiacutenas em

soluccedilatildeo

Cada uma destas teacutecnicas investiga diferentes alteraccedilotildees estruturais A

espectroscopia UVVis e fluorescecircncia por exemplo monitora as interaccedilotildees de um grupo

prosteacutetico ou um fluoroacuteforo como triptofano com seu microambiente Dicroiacutesmo circular eacute

sensiacutevel principalmente agrave estrutura secundaacuteria (KAUFFMANN et al 2001)

Espectroscopia de NMR pode fornecer informaccedilotildees sobre determinados resiacuteduos de

aminoaacutecidos (DYSON WRIGHT 1996) contudo os espectros sobre estados

desnaturados satildeo difiacuteceis de interpretar A espectroscopia de infravermelho com

transformaccedilatildeo de Fourier (FTIR) por outro lado eacute capaz de distinguir claramente entre

todos os tipos de estrutura secundaacuteria eacute sensiacutevel agrave estrutura terciaacuteria e capaz de detectar

reaccedilotildees de um soacute resiacuteduo numa escala de tempo de um nanosegundo Jaacute a teacutecnica de

espalhamento de raios X a baixos acircngulos (SAXS) permite obter informaccedilotildees do tamanho

e forma de uma moleacutecula (proteiacutena) em soluccedilatildeo (ARAI et al1998) A teacutecnica denominada

de ldquostopped-flowrdquo utilizando SAXS eacute relevante em estudos relacionados com o

enovelamento e desenovelamento de proteiacutenas

341 Dicroiacutesmo Circular (CD)

O Dicroiacutesmo Circular (CD) eacute uma teacutecnica oacuteptica que permite a detecccedilatildeo e

quantificaccedilatildeo da quiralidade das estruturas moleculares Denomina-se de CD a absorccedilatildeo

diferencial das componentes circularmente polarizadas agrave esquerda e agrave direita da radiaccedilatildeo

polarizada plana Este efeito ocorre quando um cromoacuteforo eacute opticamente ativo (quiral)

situaccedilatildeo alcanccedilada em trecircs condiccedilotildees (1) intrinsecamente por razatildeo estrutural ou (2) por

estar ligado covalentemente a um centro quiral ou (3) por ser colocado num ambiente

assimeacutetrico Na praacutetica o instrumento de CD (espectropolariacutemetro) natildeo recombina os

componentes apenas detecta os dois componentes separadamente e em seguida

apresenta o dicroiacutesmo a um dado comprimento de onda expresso como a diferenccedila em

absorbacircncia dos dois componentes ( ∆A = Aesq- Adirei) ou como a elipticidade em graus (θ)

(θ = tan-1(ba) onde b e a satildeo o os eixos menor e maior da elipse resultante Haacute uma

relaccedilatildeo numeacuterica simples entre ∆A e θ (θ em graus) θ = 3298∆A (KELLY PRICE 1997)

A elipcidade molar por resiacuteduo de aminoaacutecido (θmr) eacute a unidade mais usada para

descrever o dicroiacutesmo circular em pesquisas envolvendo proteiacutenas e peptiacutedeos Eacute


necessaacuterio considerar o caminho oacuteptico l a concentraccedilatildeo c a massa molar M e o nuacutemero

de resiacuteduos nr da proteiacutena

A Figura 2 mostra um esquema simplificado de um sistema para medir dicroiacutesmo

circular

Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemetro (Ref LORENZI 2002)

A maioria dos espectropolariacutemetros convencionais fornece dados espectrais

confiaacuteveis entre ~190 e 300 nm Em anos recentes o uso da radiaccedilatildeo siacutencrotron como

fonte de luz intensa levou ao desenvolvimento da teacutecnica de espectroscopia de dicroiacutesmo

circular por radiaccedilatildeo siacutencrotron (SRCD) que permite obter espectros em menores

comprimentos de onda no ultravioleta no vaacutecuo (VUV) incluindo a faixa entre 160 e 190

nm (WALLACE 2000)

Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD Um espectro de CD eacute obtido quando o sinal eacute medido como funccedilatildeo do

comprimento de onda Geralmente dividem-se os espectros gerados para proteiacutenas em

duas regiotildees UV-proacuteximo e UV-longiacutenquo Na regiatildeo do UV-proacuteximo as cadeias laterais

de resiacuteduos aromaacuteticos (fenilalanina tirosina e triptofano) absorvem na faixa 250-290 nm

Na regiatildeo do UV-longiacutenquo (tipicamente de 180-190 a 240 nm) absorve principalmente o

grupo peptiacutedico Em compostos modelos que contecircm ligaccedilotildees dissulfeto o acircngulo

rdmr nlc

Msdotsdot

sdotθ=θ (1)


diheacutedrico desta ligaccedilatildeo pode ser deduzido do espectro de CD na regiatildeo 240-290 nm

(KELLY PRICE 1997)

Espectro de CD no UV-longiacutenquo Eacute conhecido desde muitos anos que as diferentes formas de estrutura secundaacuteria

encontradas em peptiacutedeos e proteiacutenas exibem distintos espectros de CD no UV-longiacutenquo

(KELLY PRICE 1997) Foram criados espectros modelos utilizando amostras de

conformaccedilatildeo secundaacuteria ldquopurardquo como os obtidos de soluccedilotildees de poli-L-lisina com

variaccedilotildees de temperatura e pH o que provoca a formaccedilatildeo de 100 de heacutelice α 100 de

folhas β e 100 de estrutura randocircmica

A Figura 3 mostra os espectros caracteriacutesticos das estruturas secundaacuterias

conhecidas

Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas-β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas (Ref

BRAHMS amp BRAHMS 1980)

Os espectros de CD que caracterizam heacutelice α possuem duas bandas negativas

uma em 222nm (nrarrπ) e outra em 208nm (πrarrπparalela) de mesma intensidade e uma

positiva em 190nm (πrarrπperpendicular) Os espectros caracteriacutesticos para folha β apresentam

uma banda negativa em 216nm (πrarrπ) e uma positiva em 195nm (nrarrπ) Por uacuteltimo os

espectros que representam as estruturas randocircmicas apresentam uma banda negativa

intensa em ~200nm (nrarrπ) e uma faixa positiva por volta de 218nm (πrarrπ) (YANG et al

1986)


Os espectros de CD no UV-longiacutenquo satildeo a soma dos muacuteltiplos fracionaacuterios dos

componentes estruturais de uma proteiacutena isto eacute representam o conteuacutedo de estruturas

secundaacuterias de tipo heacutelice α estruturas β e estruturas desordenadas (random coil)

A tarefa de deduzir as contribuiccedilotildees dos diferentes formas estruturais a partir de

qualquer espectro observado natildeo eacute simples Diversas tentativas tecircm sido realizadas com

base em procedimentos sofisticados de ajustes de curvas envolvendo conjuntos de

espectros de proteiacutenas bem caracterizadas de estrutura secundaacuteria conhecida

(geralmente estruturas que tecircm sido determinadas por cristalografia de raios-X de alta

resoluccedilatildeo) Entre os procedimentos mais conhecidos estatildeo CONTIN (PROVENCHER

GLOCKNER 1981) SELCON3 (SREERAMA WOODY 1993 SREERAMA

VENYAMINOV WOODY 1999) CDSSTR (COMPTON JOHNSON 1986) VARSLC

(MANAVALAN JOHNSON 1987) e K2d (ANDRADE et al 1993)

Em estudos da β-LG utilizando dicroiacutesmo circular os resultados encontrados na

quantificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria da forma nativa podem variar dependendo

principalmente das condiccedilotildees de pH e concentraccedilatildeo das amostras e metodologia utilizada

no caacutelculo Na literatura os resultados reportados mostram valores aproximados de 10-

15 para estrutura α-heacutelice 40-50 para folhas-β (GRIFFIN et al 1993 QI et al 1997)

valores estes sustentados em estudos de estrutura cristalina por raios-X (PAPIZ et al

1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al1997 QIN et al 1998 1999) e em

estudos por NMR (BELLOQUE SMITH 1998)

Espectro de CD no UV-proacuteximo Cada um dos aminoaacutecidos aromaacuteticos tem maacuteximo de absorccedilatildeo em comprimento

de onda caracteriacutestico triptofano em 290 nm tirosina entre 275 e 282 nm e fenilalanina

entre 255 e 270 nm

Trecircs fatores tendem a influenciar a intensidade das bandas aromaacuteticas em CD (1)

a rigidez da proteiacutena quanto maior a mobilidade das cadeias laterais menor a

intensidade das bandas (2) interaccedilotildees entre aminoaacutecidos aromaacuteticos que eacute

especialmente significativo se a distacircncia entre eles for menor que 1 nm (3) nuacutemero de

aminoaacutecidos aromaacuteticos Proteiacutenas com grande nuacutemero desses aminoaacutecidos podem

apresentar banda menor que a esperada em CD devido agraves contribuiccedilotildees positivas e

negativas dos mesmos Observa-se tambeacutem que os sinais em UV-proacuteximo e na regiatildeo

do visiacutevel no espectro satildeo muito mais fracos do que aqueles obtidos em UV-longiacutenquo


refletindo uma concentraccedilatildeo molar muito menor de cromoacuteforos comparada com as

ligaccedilotildees peptiacutedicas presentes (KELLY PRICE 1997)

342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS)

O SAXS eacute uma teacutecnica que permite o estudo de macromoleacuteculas em soluccedilatildeo como

as proteiacutenas com dimensotildees tiacutepicas de 1-100 nm A partir desta teacutecnica podem ser

determinados tamanho molecular forma molecular e estrutura terciaacuteria (baixa resoluccedilatildeo)

A teoria de espalhamento a baixos acircngulos pode ser encontrada detalhadamente

descrita em vaacuterios livros texto como o de Guinier e Fournet (1955) Glatter e Kratky

(1982) entre outros

O SAXS pode ser usado para investigar a conformaccedilatildeo global da proteiacutena pela

mediccedilatildeo de seu raio de giro e pela funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) que satildeo

sensiacuteveis agraves dimensotildees e forma da partiacutecula (PANICK MALESSA WINTER 1999)

Geralmente uma soluccedilatildeo monodispersa de proteiacutenas eacute um requisito necessaacuterio para

investigaccedilotildees de SAXS

SAXS eacute tambeacutem muito adequado para visualizar processos de desnaturaccedilatildeo ou de

associaccedilatildeondashdissociaccedilatildeo O desenovelamento espacial da estrutura nativa de uma

proteiacutena sob desnaturaccedilatildeo por exemplo pode ser claramente seguido pelo aumento do

raio de giro (GLATTER KRATKY 1982)

Para uma soluccedilatildeo de partiacuteculas a intensidade do espalhamento I(q) pode ser

escrita em termos da funccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) onde q eacute o vetor de

espalhamento e r a distacircncia entre pares de pontos contidos no volume da partiacutecula

Sendo

θ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ π

= senq1

4 (2)

onde θ eacute a metade do acircngulo de espalhamento e λ eacute o comprimento de onda da radiaccedilatildeo

utilizada

drqr

senqr)r(p)q(I intπ= 4 (3)

A funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) estaacute dada pela transformada de Fourier

da intensidade espalhada medida I(q)


( )( ) ( )dqqrsenqrqI)r(p intinfin

π=

0221

(4)

A funccedilatildeo p(r) fornece informaccedilatildeo essencial sobre a partiacutecula e p(r) 0 para r =

Dmax

O quadrado do raio de giro Rg da partiacutecula espalhadora eacute obtido do segundo

momento normalizado de p(r)

rdr)r(p

drr)r(pR maxR

maxR

g

intint=

0

2

02

2 (5)

Vaacuterias equaccedilotildees para determinaccedilatildeo da massa molar satildeo apresentadas em

diversos trabalhos (GLATTER KRATKY 1982)

Tendo-se dados da intensidade espalhada para q=0 I(0) em escala absoluta

(referida ao espalhamento por um eleacutetron) pode-se obter a massa molar da partiacutecula

espalhadora jaacute que

(6)

_M)()(I νρ∆= 1

21 0 (7)

_)(

)(IMνρ∆

=2

11

0 (8)

sendo _ν o volume parcial especiacutefico da partiacutecula espalhadora e M1 a massa molar (em

gramas) da partiacutecula espalhadora Sabendo que a massa molar MM eacute definida como MM =

M1 NA sendo NA o nuacutemero de Avogadro tem-se para a massa molar da partiacutecula

espalhadora

νρ∆

=)()(INM A

M 21 0

(9)

221 0 V)()(I ρ∆=


Um graacutefico de Kratky (KRATKY 1982) q2 x I(q) vs q eacute muito uacutetil para descrever

caracteriacutesticas estruturais dos variados estados conformacionais Um maacuteximo no graacutefico

de Kratky ou curva em forma de sino corresponde a uma estrutura globular compacta

da proteiacutena (KATAOKA et al 1993 1995 LATTMAN FIEBIG DILL 1994)

Devido ao tamanho relativamente pequeno da partiacutecula o espalhamento de

raios-X a baixos acircngulos de uma soluccedilatildeo de proteiacutena pode dar informaccedilatildeo valiosa do

estado de agregaccedilatildeo e do formato da proteiacutena (GLATTER KRATKY 1982 GUINIER

FOURNET 1955)

343 Fluorescecircncia

Todas as moleacuteculas absorvem luz No entanto um nuacutemero relativamente

pequeno de espeacutecies moleculares (geralmente hidrocarbonetos poliaromaacuteticos

conjugados ou heterociacuteclicos) emite luz como resultado da absorccedilatildeo da luz Se essa

emissatildeo eacute imediata isto eacute tem origem em um estado de excitaccedilatildeo eletrocircnica singlete

esse fenocircmeno eacute denominado de fluorescecircncia (LAKOWICZ 1983)

Estes fenocircmenos estatildeo ilustrados no diagrama de estados eletrocircnicos na Figura

4

Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente (Ref ATVARS e MARTELLI 2002)

Fosforescecircncia

S0

S1


Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos

Dentre os 20 aminoaacutecidos usualmente encontrados em proteiacutenas os aromaacuteticos

fenilalanina tirosina e triptofano satildeo os uacutenicos com intensidade de fluorescecircncia suficiente

para ser medida diretamente em soluccedilatildeo A fluorescecircncia destes resiacuteduos eacute uma

ferramenta altamente especiacutefica e sensiacutevel no estudo de enovelamento e conformaccedilatildeo de

proteiacutenas Mudanccedilas na fluorescecircncia intriacutenseca podem ser usadas para monitorar

alteraccedilotildees estruturais numa proteiacutena (LAKOWICZ 1983 CHEN BARKLEY 1998)

A fluorescecircncia de uma proteiacutena enovelada eacute o resultado da fluorescecircncia de cada

resiacuteduo aromaacutetico Os trecircs resiacuteduos tecircm distintos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e

emissatildeo Eles diferem enormemente nos seus rendimentos quacircnticos e tempos de vida

Devido a estas diferenccedilas e agrave transferecircncia de energia por ressonacircncia de uma

fenilalanina proacutexima para a tirosina e de uma tirosina para o triptofano o espectro de

fluorescecircncia de uma proteiacutena contendo os trecircs resiacuteduos eacute parecido com o espectro do

triptofano (EFTINK 1991)

A fluorescecircncia e o rendimento quacircntico do triptofano satildeo muito maiores que dos

outros dois aminoaacutecidos aromaacuteticos A intensidade rendimento quacircntico e comprimento

de onda de maacutexima emissatildeo de fluorescecircncia do triptofano satildeo muito dependentes do

solvente Quando a polaridade do solvente ao redor do resiacuteduo de triptofano diminui o

espectro de fluorescecircncia eacute deslocado para comprimentos de onda menores (blue-shift) e

a intensidade da fluorescecircncia aumenta Resiacuteduos que estatildeo ldquoenterradosrdquo no centro

hidrofoacutebico de proteiacutenas podem ter um deslocamento no seu espectro de 10 a 20nm

comparado a triptofanos da surperfiacutecie da proteiacutena A fluorescecircncia desse resiacuteduo pode

ser suprimida por grupos aciacutedicos protonados vizinhos como aacutecido aspaacutertico ou glutacircmico

(CHEN BARKLEY 1998)

A tirosina como o triptofano apresenta alta absorccedilatildeo agrave 280nm e quando excitada

por luz nesse comprimento de onda tem tambeacutem o mesmo perfil de emissatildeo O resiacuteduo

de tirosina eacute um emissor mais fraco que o triptofano mas ela ainda assim pode contribuir

significativamente para a fluorescecircncia de proteiacutenas pois geralmente estaacute presente em

grande nuacutemero A fluorescecircncia da tirosina pode ser facilmente suprimida por um resiacuteduo

de triptofano proacuteximo devido agrave transferecircncia de energia Aleacutem disso a tirosina sofre

ionizaccedilatildeo no estado excitado o que pode resultar na perda do proacuteton do grupo hidroxila

aromaacutetico levando agrave supressatildeo da fluorescecircncia deste resiacuteduo

A fenilalanina com apenas um anel benzecircnico e um grupo metila eacute pouco

fluorescente A sensibilidade experimental (produto entre rendimento quacircntico e


absorvidade molar maacutexima) eacute muito baixa para este resiacuteduo A fluorescecircncia da

fenilalanina eacute observada somente na ausecircncia de tirosina e triptofano (MOCZ 2006)

O comprimento de onda do maacuteximo na intensidade de fluorescecircncia (λmaacutex) eacute

universalmente e inquestionavelmente usado como um indicador de exposiccedilatildeo agrave aacutegua

Por exemplo como indicador de quanto profundamente o Trp estaacute enterrado na proteiacutena

Um deslocamento do maacuteximo da intensidade de fluorescecircncia para comprimentos de

onda maiores (red shift) eacute garantido num ambiente polar somente se haacute suficiente

mobilidade dos grupos polares para relaxar ao redor do dipolo apresentado pelo Trp

(CALLIS 1997)

A β-LG conteacutem dois resiacuteduos de triptofano Trp 19 e Trp 61 O exame da estrutura

da β-LG determinada por cristalografia por raios-X mostra que o Trp 19 estaacute enterrado no

caacutelice hidrofoacutebico e eacute essencialmente inacessiacutevel ao solvente enquanto o Trp 61 estaacute em

uma posiccedilatildeo substancialmente exposta ao solvente e tambeacutem muito proacuteximo agrave ponte

dissulfeto formada entre Cys 66 e Cys 160 (BROWNLOW et al 1997) A fluorescecircncia

intriacutenseca da proteiacutena eacute quase exclusivamente atribuiacuteda ao Trp 19 (CHO BATT

SAWYER 1994 MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999a) No entanto o Trp 19

pode ter sua fluorescecircncia intriacutenseca diminuiacuteda pela proximidade do Arg 124 que se

localiza a somente 30-40 Aring do anel indol do Trp 19 (BROWNLOW et al 1997) Tem sido

demonstrado que a Arginina conduz a uma eficiente supressatildeo da fluorescecircncia em

outras proteiacutenas (YU et al 1992)

32

4 Material e meacutetodos 33

4 MATERIAL E MEacuteTODOS



41 Material e reagentes

Material β-LG BioPURE Betalactoglobulina (variantes A e B ~95 de

proteiacutena aw= 022) foi doada pela Davisco Foods International Inc (Le Sueur MN USA)

Reagentes

Acetonitrila grau cromatograacutefico (J T Baker Mallinckrodt Baker Xalostoc

Meacutexico) metanol grau cromatograacutefico (JT Baker Mallinckrodt Baker Phillipsburg USA)

Outros reagentes utilizados foram de grau analiacutetico reagente de Ellman 5 5rsquo-

dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Sigma (D-8130) da Sigma-Aldrich Chemie

(Steinheim Germany) β-mercaptoetanol (Merck Hohenbrunn Germany) ureacuteia foi obtida

da Merck (Darmstadt Germany) o dodecilsulfato de soacutedio (SDS) (Sigma L5750) as

enzimas pepsina e tripsina sal soacutedica do aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico (EDTA)

(Sigma ED2SS) e o retinol todo-trans (Sigma R7632) com pureza miacutenima de 95 foram

comprados da Sigma Chemical Co (St Louis MO USA)

Aacutegua ultra pura (182 MΩ) foi obtida em purificador Maxima ultra pure water Elga

(Elga High Wycombe England)

Preparaccedilatildeo de amostras de β-LG soacutelida com diferentes aw

Para obter β-LG com diferente aw β-LG em poacute (aw =022) foi rapidamente passada

atraveacutes de uma fina nuvem de aacutegua atomizada gerada por um vaporizador de ultrasom

(MOD US-2000 ICEL Manaus AM Brasil) Porccedilotildees da proteiacutena hidratada foram

colocadas em dessecadores em atmosfera de umidade relativa (UR) constante de 529

utilizando soluccedilatildeo saturada de Mg(NO3)2 e de 751 com soluccedilatildeo saturada de NaCl

a 25 degC ateacute alcanccedilar o equiliacutebrio As medidas de aw das amostras foram feitas apoacutes 2

dias usando um aparelho AquaLab Modelo Serie 3TE (Decagon Devices IncPullman

WA USA) A aw das amostras apoacutes o equiliacutebrio foi 053 para as amostras equilibradas agrave

UR de 529 e 074 para as equilibradas agrave UR de 751

Preparaccedilatildeo de amostras em soluccedilatildeo

Soluccedilotildees de β-LG (aw=022) em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de proteiacutena foram

preparadas em tampatildeo fosfato 10 mM pH 70 com aacutegua ultra pura para serem irradiadas

Soluccedilotildees de β-LG em concentraccedilotildees de 1 mgmL e 01 mgmL foram preparadas em

tampatildeo fosfato 10 mM e pH 70 a partir de β-LG sem irradiar e irradiadas na forma soacutelida

e em soluccedilatildeo para anaacutelise por Dicroiacutesmo Circular no UV proacuteximo e longiacutenquo

respectivamente Para anaacutelise de fluorescecircncia intriacutenseca as amostras tinham uma

concentraccedilatildeo de 1 mgmL em tampatildeo fosfato 10 mM


42 Meacutetodos

421 Delineamento experimental

No presente trabalho foi utilizada a proteiacutena β-LG comercial BioPURE da Davisco

fornecida em poacute em embalagem de papel aluminizado impermeaacutevel O tratamento de

irradiaccedilatildeo da proteiacutena foi realizado nas amostras soacutelidas e nas amostras em soluccedilatildeo As

amostras de β-LG no estado soacutelido foram preparadas em trecircs atividades de aacutegua 022

053 e 074 e as amostras em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3 e 10 mg mL como

explicado em Material e Meacutetodos na seccedilatildeo Material e reagentes

A irradiaccedilatildeo das amostras no estado soacutelido e em soluccedilatildeo foi efetuada no Centro

de Tecnologia das Radiaccedilotildees do IPEN-CNENSP e no Departamento de Irradiaccedilatildeo de

Alimentos do CENA na ESALQ-Piracicaba As amostras foram submetidas a diferentes

doses de radiaccedilatildeo (0 10 25 50 100 250 e 500 kGy)

Nas Tabelas 1 e 2 podem ser visualizados o delineamento experimental e a

nomenclatura utilizada para as amostras

Tabela 1Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras


Tratamento Dose kGy

Concentraccedilatildeo de proteiacutena (mgmL)

Nomenclatura das amostras

Sem tratamento 0 3 10 C0S3 C0S10 Tratada em soluccedilatildeo 1 3 10 C1S3 C1S10 25 3 10 C25 S3 C25S10 5 3 10 C5S3 C5S10 10 3 10 C10S3 C10S10 25 3 10 C25S3 C25S10 50 3 10 C50S3 C50S10

422 Irradiaccedilatildeo

As amostras foram irradiadas em irradiador de Co-60 Gamma cell 220 GC220

AECL (Ottawa Canadaacute) com atividade cia 12500ci taxa de dose 434 kGyh e Gamma

Tratamento Dose kGy

Atividade de aacutegua A1 A2 A3


Sem tratamento 0 022 053 074 C0A1 C0A2 C0A3 Tratada solida 1 022 053 074 C1A1 C1A2 C1A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 5 022 053 074 C5A1 C5A2 C5A3 10 022 053 074 C10A1 C10A2 C10A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 50 022 053 074 C50A1 C50A2 C50A3


cell 220 Excel (Northern Canadaacute) com atividade cia 2600ci taxa de dose 0974 kGyh

com doses de radiaccedilatildeo entre 1 e 50 kGy agrave temperatura ambiente

As amostras irradiadas no estado soacutelido (atividade de aacutegua 022 053 e 074)

foram acondicionadas em saquinhos de papel laminado (internamente plastificado)

selados agrave vaacutecuo As irradiadas em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL em fosfato de soacutedio 10 mM)

foram acondicionadas em tubos de vidro Pyrex (14 x 15 cm) com tampa de rosca sob

atmosfera normal As amostras foram mantidas a 4degC ateacute anaacutelises

423 Proteoacutelise enzimaacutetica

Foi realizada segundo Bertrand-Harb et al (2002) Amostras de β-LG foram

preparadas em concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo citrato de soacutedio 0015 M pH 25 e

incubadas a 37degC com pepsina em uma relaccedilatildeo de ES (pp) de 1100 por 17 horas Ao

final desse tempo a reaccedilatildeo foi interrompida ajustando-se o pH para 70 por adiccedilatildeo de

quantidades apropriadas de soluccedilatildeo tampatildeo de TRIS-HCl 1 M pH 89

Para a hidroacutelise com tripsina amostras de β-LG foram preparadas na

concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo Tris-HCl 02 M pH 80 e incubadas a 37degC em uma

relaccedilatildeo de ES (pp) de 1200 por 17 horas A hidroacutelise foi interrompida por abaixamento

do pH a 20 com a adiccedilatildeo de HCl 02 N As amostras hidrolisadas foram mantidas

congeladas (-18 degC) ateacute anaacutelise por RP-HPLC eou por espectrometria

424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos

Dicroiacutesmo Circular (CD) Os espectros de CD foram registrados em um espectropolariacutemetro JASCO J-720

acoplado com banho de aacutegua RD306 (Japan Spectroscopic Co Japan) nas seguintes

condiccedilotildees temperatura 225degC velocidade de varredura = 100 nmmin largura de

banda=10 nm resoluccedilatildeo=1 nm (para UV-longiacutenquo) 02 nm (para UV-proacuteximo) tempo de

resposta= 1 seg (no UV-longiacutenquo) 025 seg (no UV-proacuteximo) e 9 acumulaccedilotildees As

amostras de β-LG foram analisadas em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato 10 mM a pH 70 em

concentraccedilatildeo de 01 mgmL and 1 mgmL para UV-longiacutenquo e UV-proacuteximo

respectivamente A concentraccedilatildeo de proteiacutena foi estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1

ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984) Os espectros da proteiacutena foram obtidos

usando cubetas de quartzo ciliacutendricas de caminho oacuteptico de 01 cm (para UV-longiacutenquo

185-260 nm) e 10 cm (para UV-proacuteximo 250-350 nm) Para caacutelculo da estrutura

secundaacuteria foi utilizado o meacutetodo baseado em algoritmos CDSSTR como descrito por

Whitmore e Wallace (2004) na DICHROWEB (httpwwwcrystbbkacukcdweb)


Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) As medidas de espalhamento a baixos acircngulos foram realizadas na linha SAXS do

Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron do Brasil (LNLS) Os experimentos foram feitos

usando um porta-amostra capilar (Oslash 15 mm) (CAVALCANTI et al 2004) a 20 degC

comprimento de onda do raio-X =1488 Aring e distacircncia amostra-detector de 7449 mm

Amostras de β-LG (3 e 10 mgmL) foram avaliadas em tampatildeo de fosfato de soacutedio 10 mM

Para cada amostra quatro frames de 10 min foram coletados O tratamento dos dados foi

feito usando o programa TRAT1D (OLIVEIRA 2003) Correccedilotildees padratildeo e caacutelculos de

erros estatildeo incluiacutedos nesta rotina Para a anaacutelise de dados foi usado o programa GNOM

(SEMENYUK SVERGUN 1991) Este programa permite o ajuste teoacuterico e o caacutelculo da

funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) O programa CRYSOL (SVERGUN

BARBERATO KOCH 1995) foi usado para efetuar o caacutelculo das curvas teoacutericas de

SAXS a partir das coordenadas cristalograacuteficas e permitiu o ajuste dos dados

experimentais de espalhamento

Grupos tiol (-SH) livres totais Os grupos SH totais foram determinados usando o reagente de Ellman (55rsquo-

ditiobis (2-acido nitrobenzoico)) (DTNB) de acordo com Yang et al (2001) O DTNB

usado em concentraccedilatildeo 25 mM foi preparado em tampatildeo fosfato (10 mM pH 70)

contendo ureacuteia 80 M e sal dissoacutedico de aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) 1 mM

Uma aliacutequota de 05 mL de soluccedilatildeo de β-LG em concentraccedilatildeo de 5 mgmL em tampatildeo

fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi misturada com 195 mL de tampatildeo fosfato de soacutedio

(10 mM pH70) contendo ureacuteia 80 M e EDTA 1 mM e adicionados 005 mL da soluccedilatildeo

de DTNB (25 mM) Depois de 15 minutos foi medida a absorbacircncia a 412 nm e estimado

o nuacutemero de moles de SH por mol de β-LG utilizando um coeficiente de extinccedilatildeo de

13600 M-1 cm-1 para caacutelculo dos moles de SH (YANG et al 2001 ELLMAN 1959) A

concentraccedilatildeo da β-LG foi medida pela absorbacircncia das amostras a 280 nm usando o

coeficiente de extinccedilatildeo molar de 17600 M-1cm-1 (DUFOUR HOA HAERTLEacute 1994 EIGEL

et al 1984)

Fluorescecircncia Medidas de fluorescecircncia Intriacutenseca e de fotometria de fluorescecircncia foram obtidas

utilizando um Espectrofluoriacutemetro Hitachi F-4500 (Hitachi Tokyo Japan)

Fluorescecircncia Intriacutenseca do Trp foi medida para avaliar o grau de desnaturaccedilatildeo

da proteiacutena Foram utilizadas amostras de β-LG (1 mgmL) em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de


soacutedio 10 mM pH 70) Foram usadas λexc=280 nm e λemiss=350-450 nm largura de banda

de 5 nm fendas de excitaccedilatildeo=25 nm e de emissatildeo=5 nm velocidade de varredura =240

nmmin e PMT voltagem =700 V

Fotometria de fluorescecircncia das bitirosinas foi realizada para estimar o conteuacutedo

de ligaccedilotildees cruzadas entre radicais tirosil formados no tratamento de irradiaccedilatildeo da

proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987) Amostras de β-LG diluiacutedas a 05 mgmL

em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram utilizadas Utilizou-se

comprimento de onda de excitaccedilatildeo de 325 nm e as medidas de intensidade de

fluorescecircncia foram obtidas no comprimento de onda de emissatildeo de 416 nm Foi fixada

uma velocidade de varredura de 240 nmmin e uma fenda de excitaccedilatildeo e de emissatildeo em

5 nm

Fotometria de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG realizada para avaliar o grau

do poder ligante de β-LG irradiada segundo meacutetodo empregado por Subramaniam Steel

e Gafni (1996) Neste meacutetodo monitora-se o aumento da fluorescecircncia do retinol a 470

nm apoacutes ligaccedilatildeo a β-LG Aliacutequotas de retinol (15 microL) dissolvido em etanol em

concentraccedilatildeo 3 mM satildeo adicionados agrave uma cubeta contendo 3 mL de proteiacutena 10 mgmL

em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) Os componentes satildeo cuidadosamente

misturados e deixados para equilibrar durante 3-4 minutos antes de fazer a leitura de

fluorescecircncia logo adiciona-se mais uma aliacutequota e assim sucessivamente ateacute os valores

da leitura ficarem constantes Utiliza-se excitaccedilatildeo a 330 nm e emissatildeo a 470 nm A

velocidade de varredura se fixou em 240 nmmin e as fendas de emissatildeo e excitaccedilatildeo em

10 e 5 nm respectivamente

Espectrofotometria de UV e Visiacutevel

Transmitacircncia

A transmitacircncia das amostras de β-LG dissolvidas em tampatildeo fosfato de soacutedio (10

mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 10 mgmL de proteiacutena (com exceccedilatildeo das amostras

irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL) foi medida a 550 nm Foi utilizado

um espectrofocirctometro UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Fullerton CA USA)

Absorbacircncia

As medidas de absorbacircncia a 280 nm de soluccedilotildees de β-LG foram efetuadas

utilizando espectrofotocircmetro de UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Beckman Fullerton CA


USA) A concentraccedilatildeo de β-LG em soluccedilotildees preparadas para as diversas anaacutelises foi

estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1 ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984)

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo proteica nos hidrolisados de β-LG com

pepsina foram retiradas aliacutequotas de 2 mL e misturadas com 2 mL de soluccedilatildeo 20 de

aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) e centrifugadas a 10000 g por 10 min agrave temperatura ambiente

Foi medida a absorbacircncia a 280 nm para avaliar o grau de degradaccedilatildeo da proteiacutena Para

caacutelculo do teor proteacuteico foram utilizados os mesmos coeficientes de extinccedilatildeo molar

usados para caacutelculo da concentraccedilatildeo de proteiacutena acima mencionada (REDDY KELLA

KINSELLA 1988)

425 Meacutetodos cromatograacuteficos

Cromatografiacutea Liquida de Alta Eficiecircncia de fase reversa (RP-HPLC) Esta teacutecnica foi utilizada para avaliar o grau de pureza da β-LG utilizada no

trabalho Foi tambeacutem utilizada para estudo do perfil cromatograacutefico dos proteolisados

triacutepticos e peacutepticos utilizando o meacutetodo descrito por Croguennec et al (2003) O caacutelculo

das aacutereas dos peptiacutedeos no cromatograma foi realizado como indicado por Otte et al

(1997)

Em todas as anaacutelises um volume de 20 microL de amostra foi injetado manualmente

no cromatoacutegrafo liacutequido de marca Varian (Varian Walnut Creek CA USA) que inclui

bomba Varian 9012 detector de absorbacircncia UV-VIS de duplo comprimento de onda

Varian 9050 e o software Star Chromatography Workstation munido de coluna Varian C18

(250 mm x 45 mm DI) As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram temperatura da coluna 40degC

fluxo de 10 mLmin A fase moacutevel foi composta de solvente A aacuteguaaacutecido trifluoroaceacutetico

(991) e solvente B acetonitrila aacutegua e aacutecido trifluoroaceacutetico (65351) Os solventes

foram filtrados atraveacutes de membrana 045 microm (Millipore) e sonicados por 10 min em

ultrasom Foi aplicado um sistema de gradiente iniciado com 20 de solvente B

passando para 100 em 30 min decrescendo para 20 aos 40 min O detector foi fixado

em 214 nm

Cromatografia liquida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC)

A anaacutelise de exclusatildeo molecular foi realizada em um sistema de cromatografia

liacutequida de alta eficiecircncia consistindo de uma bomba Varian 9012 um detector de

absorbacircncia de duplo comprimento de onda Varian 9050 e o software Star

Chromatography Workstation (todos da Varian Walnut Creek CA USA) que permite a


obtenccedilatildeo e processamento da informaccedilatildeo cromatograacutefica Volume de 20 microL de β-LG 05

mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi aplicado a uma coluna RES-

ELUT-SEC 3000 (300 x 775 mm di) (Varian Palo Alto CA USA) e eluiacuteda com tampatildeo

fosfato de soacutedio (50 mM NaCl 015 M pH 68) a um fluxo de 08 mLmin e monitorada por

absorccedilatildeo a 280 nm A massa molar aparente correspondente aos picos eluiacutedos foi

estimada a partir de uma curva de calibraccedilatildeo construiacuteda usando marcadores da Bio-Rad

(Hercules CA USA) tiroglobulina bovina (670 kDa) gama globulina bovina (158 kDa)

ovalbumina (44 kDa) mioglobulina (17 kDa) e vitamina B-12 (135 kDa)

426 Eletroforese em gel de poliacrilamida em condiccedilotildees nativa

desnaturante e redutora

As anaacutelises de PAGE e SDS-PAGE da β-LG sem tratamento e da β-LG irradiada

foram realizadas como descrito por Laemmli (1970) utilizando equipamento Phast

System Pharmacia Biotech (Pharmacia LKB Biotechnology Uppsala Sweden) usando

geacuteis Phast-System de 125 (Amersham Bioscience Uppsala Sweden)

As amostras foram preparadas em tampatildeo de amostra contendo SDS contendo

ou natildeo 5 β-mercaptoetanol e aquecidas a 95degC por 5 min Os geacuteis foram corados com

Comassie Brilliant Blue R250 Um kit de marcadores de baixa massa molar (144-94 kDa)

da Pharmacia (Upsala Sweden) foi usado para calibraccedilatildeo

427 Isoterma de sorccedilatildeo

A isoterma de sorccedilatildeo foi obtida segundo meacutetodo proposto por Labuza Kaanane e

Chen (1985) As amostras de β-LG com umidade inicial de 43 foram colocadas em

sistemas fechados contendo soluccedilotildees saturadas de sais de LiCl MgCl2 K2CO3 Mg(NO3)2

NaCl KCl e BaCl2 a 25degC por 12 dias tempo em que o equiliacutebrio foi alcanccedilado Os dados

foram analisados pelo modelo GAB (Guggenheim ndash Anderson ndash de Bocircer) utilizando o

programa Water Analyzer Series ndash IsothermBETGAB Versatildeo 205p As anaacutelises foram

feitas em triplicata

428 Anaacutelises Estatiacutesticas

As anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas pelo programa SASreg Statistical

Analysis System (Cary North Carolina USA SAS Institute Inc SAS Campus Drive)

Version 80 2000 Os resultados experimentais foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e

as meacutedias comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de significacircncia de 5

5 Resultados e Discussatildeo 41

5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO



51 Caracterizaccedilatildeo da β-LG

A β-LG apresentou teor de proteiacutena de 936plusmn06 umidade de 429plusmn002 e

atividade de aacutegua de 022plusmn 001 medida agrave 25degC

O grau de pureza foi avaliado por eletroforese em gel com e sem desnaturante e

por cromatografia liacutequida de fase reversa

A Figura 5 mostra o perfil eletroforeacutetico da β-LG com aw inicial de 022 no sistema

PAGE (A) e no SDS-PAGE (B)

Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 12

Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG

Na eletroforese em gel PAGE (Figura 5 A) observa-se a presenccedila de duas bandas

na parte inferior do gel a inferior correspondendo agrave β-LG variante A e a superior agrave

variante B (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 YANG et al 2001) Jaacute na

eletroforese SDS-PAGE (Figura 5B) observa-se apenas uma banda pois as cargas de

ambas as variantes se igualam dando origem a uma banda uacutenica correspondente agrave β-LG

monocircmero de massa molar ~184 kDa que corresponde ao valor aproximado para uma

mistura das variantes A e B da β-LG

A

B

β-LG Var B Var A

β-LG Var A e B

M(kDa) 94 67 43 30 201 144

1 2 1 2


No cromatograma de fase reversa (Figura 6) observa-se um pico no tempo de

~46-47 minutos de eluiccedilatildeo dividido em dois maacuteximos que correspondem agrave β-LG variante

B o primeiro e agrave variante A o segundo (CAESSENS et al1999 ELGAR et al 2000)

Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05

mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40 degC A

eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mL min em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm

A anaacutelise de eletroforese e a cromatografia de fase reversa sugerem que a β-LG

possui alto grau de pureza indicado pela presenccedila exclusiva do pico da β-LG no

cromatograma (Figura 6) e pela uacutenica banda na regiatildeo que corresponde ao monocircmero da

proteiacutena em meio desnaturante com SDS (Figura 5 B)

A isoterma obtida para a β-LG (Figura 7) tem a forma caracteriacutestica das isotermas

da maioria dos alimentos O conteuacutedo de aacutegua na monocamada (M0) foi de 00728 g por 1

g de soacutelidos (corresponde a ~74 moleacuteculas de aacutegua por mol de β-LG monocircmero)

No presente experimento amostras de β-LG soacutelida com aw de 022 053 e 074

foram submetidas a tratamento de irradiaccedilatildeo e segundo a isoterma de sorccedilatildeo mostrada

na Figura 7 estes valores de aw correspondem aproximadamente a 6 12 e 18 g de aacutegua

100 g de produto seco respectivamente Estes valores de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem

garantir sua estabilidade enquanto natildeo for submetida a tratamento (LAI TOPP 1999 LIU

LANGER KLIBANOV 1991 RUPLEY CARERI 1991)

Tempo de eluiccedilatildeo (min)

β-LG Var B

β-LG Var A Abs

(UA)


Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC

Diferentes graus de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem significar diferentes

susceptibilidades aos tratamentos como o de irradiaccedilatildeo onde reaccedilotildees ou alteraccedilotildees

poderatildeo ocorrer e afetar a sua estabilidade Eacute conhecido que agrave baixa atividade de aacutegua

fatores importantes como a falta de flexibilidade conformacional e resistecircncia a reaccedilotildees

envolvendo ligaccedilotildees covalentes contribuem para uma maior estabilidade da proteiacutena

(ZAKS 1992)

52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG

Os resultados foram agrupados considerando trecircs aspectos importantes (1)

mudanccedilas estruturais (2) agregaccedilatildeo e (3) mecanismo de agregaccedilatildeo para explicar melhor

a amplitude dos efeitos da irradiaccedilatildeo gama na proteiacutena β-LG

521 Mudanccedilas estruturais

As mudanccedilas estruturais foram avaliadas por anaacutelises de fluorescecircncia intriacutenseca

dicroiacutesmo circular e grupos sulfidrila livre Embora as anaacutelises de SAXS tambeacutem forneccedilam

dados estruturais estes seratildeo expostos no item sobre agregaccedilatildeo

Fluorescecircncia intriacutenseca

Amostras irradiadas soacutelidas

Foram feitas medidas de fluorescecircncia intriacutenseca para avaliar modificaccedilotildees

estruturais da proteiacutena irradiada As amostras irradiadas soacutelidas (aw 022 053 e 074) com

doses ateacute 50 kGy natildeo mostraram diferenccedilas com respeito agrave amostra natildeo irradiada (Figura

8 A B C) apresentando a mesma intensidade e igual maacuteximo (333 nm) na curva de

Kb = 085 C = 870 Mo = 00728 g H2O g solids 1281 cal mole H2O


fluorescecircncia As pequenas variaccedilotildees na intensidade entre as amostras estatildeo dentro do

erro experimental de ~10 (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)

280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000

A

C0A1 C10A1 C25A1 C50A1

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)

comprimento de onda (nm)

280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

C0A2 C10A2 C25A2 C50A2

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000C

C0A3 C10A3 C25A3 C50A3

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras

(aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) ( aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw

074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3


Amostras irradiadas em soluccedilatildeo

As amostras de proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com exceccedilatildeo da irradiada a 10 kGy

e concentraccedilatildeo de 10 mgmL (C10S10) apresentaram diminuiccedilatildeo da intensidade de

fluorescecircncia em conjunto com deslocamento do maacuteximo da intensidade para

comprimentos de onda maiores (red-shift) (Figura 9)

280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000A

343nm

339nm

336nm333nm

C0S10 C10S10 C25S10 C50S10

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

345nm

348nm

333nm

C0S3 C10S3 C25S3 C50S3

Inte

nsid

ade

fluor

escecirc

ncia

(UA

)


Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A)

(10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3

C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm


As curvas correspondentes agrave β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo 10

mgmL (C10S10 C25S10 e C50S10) (Figura 9A) apresentaram maacuteximos de intensidade

de fluorescecircncia em 336 339 e 343 nm respectivamente A amostra natildeo irradiada

(C0S10) apresentou maacuteximo de intensidade em 333 nm indicando a ocorrecircncia de um

deslocamento para o vermelho (red-shift) de 3 6 e 10 nm para as amostras irradiadas

com 10 25 e 50 kGy respectivamente

As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL com 10 e 25 kGy

(C10S3 e C25S3) apresentaram maacuteximos de intensidade de fluorescecircncia nos

comprimentos de onda 348 e 345 nm respectivamente (Figura 9B) Para a dose de 50

kGy (C50S3) o maacuteximo natildeo foi definido exatamente devido aos baixos valores de

intensidade de fluorescecircncia mas estima-se que esteja entre 351-359 nm Considerando

o maacuteximo da curva da β-LG sem irradiar em 333 nm houve um deslocamento para o

vermelho de 15 12 e ~18 nm para as amostras irradiadas com 10 25 e 50 kGy

respectivamente

O deslocamento para o vermelho eacute decorrente da maior estabilizaccedilatildeo do estado

excitado do Trp ao passar de um meio apolar para outro mais polar ou mais exposto ao

solvente o que poderia ser uma indicaccedilatildeo de desnaturaccedilatildeo da proteiacutena (CHEN

BARKLEY 1998 CALLIS 1997) Os valores de deslocamento para o vermelho relatados

na literatura satildeo de ~13 nm para a desnaturaccedilatildeo da β-LG pela accedilatildeo da ureacuteia 8M (YANG

et al 2001) 18 nm na presenccedila de ureacuteia 948 M (CRAEMER 1995) e de 20 nm na

presenccedila de cloreto de guanidiacutenio 6M (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996) Outros

valores de deslocamento para o vermelho encontrados na literatura satildeo 4 nm quando a

β-LG eacute submetida a pressatildeo de 600 MPa (YANG et al 2001) e ~8 nm quando a β-LG eacute

submetida ao aquecimento ateacute 85degC (MANDERSON HARDMAN CRAMER 1999b)

Embora o deslocamento para o vermelho tenha sido observado para algumas

amostras irradiadas em soluccedilatildeo ele natildeo eacute suficiente para caracterizar desnaturaccedilatildeo pois

deve ser analisado juntamente com a intensidade da fluorescecircncia

Observou-se diminuiccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca do Trp nas

amostras C25S10 C50S10 C10S3 C25S3 e C50S3 (Figura 9A e B) o que natildeo seria

esperado para amostras de β-LG que apresentam deslocamento para o vermelho ou

desnaturaccedilatildeo Para a β-LG ao contraacuterio do que ocorre para a maioria das proteiacutenas

globulares que apresentam desnaturaccedilatildeo por aquecimento ou por reagentes quiacutemicos

desnaturantes o deslocamento para o vermelho vem acompanhado de aumento na

intensidade da fluorescecircncia (YANG et al 2001 VALENTE-MESQUITA BOTELHO


FERREIRA 1998) devido possivelmente agrave diminuiccedilatildeo da supressatildeo da fluorescecircncia do

triptofano na proteiacutena desnaturada A diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia

observada nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo neste experimento poderia ser explicada

ao menos parcialmente pela ocorrecircncia de perda de Trp devido agrave irradiaccedilatildeo ou porque o

Trp passou a ocupar uma posiccedilatildeo com maior supressatildeo que na estrutura nativa devido agrave

nova conformaccedilatildeo ou agregaccedilatildeo da proteiacutena

Com respeito ao deslocamento para o vermelho apresentado pelas amostras

irradiadas em soluccedilatildeo duas observaccedilotildees satildeo relevantes a primeira eacute que as bandas de

fluorescecircncia apresentam alargamento indicando que espeacutecies fluorescentes diferentes

do Trp podem estar interferindo no espectro de fluorescecircncia e consequumlentemente o

deslocamento para o vermelho mostrado natildeo corresponda exclusivamente ao Trp

mudando de ambiente A segunda eacute que com a irradiaccedilatildeo pode ter ocorrido

desestabilizaccedilatildeo do estado singlete fundamental (S0) do Trp para um valor de energia

mais alto mais proacuteximo do estado excitado (S1) Ao sofrer excitaccedilatildeo o Trp emitiraacute

fluorescecircncia de menor energia ao voltar a este estado singlete fundamental alterado

gerando um deslocamento para o vermelho que natildeo teria como causa a mudanccedila de

ambiente do Trp de um meio apolar para um ambiente mais polar

Desta forma embora a ordem de grandeza dos valores de deslocamento para o

vermelho observados nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo seja similar aos encontrados

em caso de desnaturaccedilatildeo por calor ou por desnaturantes quiacutemicos natildeo representa o

mesmo grau de alteraccedilatildeo estrutural A possibilidade de ter ocorrido desestabilizaccedilatildeo do

estado singlete fundamental do Trp e do surgimento de outras espeacutecies fluorescentes nas

amostras irradiadas em soluccedilatildeo que influenciariam nos valores de deslocamento para o

vermelho levam a supor uma alteraccedilatildeo estrutural maior da que realmente aconteceu

Dicroiacutesmo Circular (CD) Foram analisadas por dicroiacutesmo circular as amostras irradiadas soacutelidas e em

soluccedilatildeo com doses de irradiaccedilatildeo de 0 10 e 50 kGy


Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo

Para o caacutelculo da estrutura secundaacuteria das amostras foi utilizado o programa

CDSSTR (WHITMORE WALLACE 2004 COMPTON JOHNSON 1986)

(httpwwwcrystbbkacukcdweb) do servidor DICHROWEB e os resultados encontram-


se na Tabela 5 Antes de definir o meacutetodo de caacutelculo do conteuacutedo de estrutura

secundaacuteria foram testados diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de CD para

a amostra C0A1 com o propoacutesito de visualizar as diferenccedilas no conteuacutedo da estrutura

secundaacuteria inerentes ao meacutetodo de caacutelculo Para esta amostra (C0A1) os valores obtidos

utilizando os trecircs meacutetodos de caacutelculo apresentaram boa concordacircncia Foi escolhido o

meacutetodo CDSSTR por apresentar maiores facilidades de entrada dos dados no software

correspondente

Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por

diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de UV-longiacutenquo

meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas

CDSSTR 13 33 23 29

SELCON 143 341 226 269

CONTIN 166 329 221 286 A faixa de comprimento de onda analisado foi de 190-240 nm em todos os meacutetodos

Na literatura encontram-se diferentes valores para o conteuacutedo de estrutura

secundaacuteria da β-LG nativa (Tabela 4) que satildeo influenciados principalmente pela faixa de

comprimento de onda utilizada na anaacutelise Destaca-se por exemplo as diferenccedilas

encontradas para a mesma amostra analisada utilizando o meacutetodo SELCON (valores em

negrito na Tabela 4) ao considerar faixas diferentes de comprimento de onda

Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na

literatura

meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas autor

X-rays 68 512 99 321 Brownlow et al 1997

PROSEC 12 51 11 26 Phillips et al 1995

CONTIN 166 452 123 258 Griffin et al 1993

Regressatildeo 15 54 12 19 De Jongh 2001

SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997

SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997

Todas amostras foram analisadas a pH 70 com exceccedilatildeo de amostra analisada a pH 68 analisada a pH 675 e na faixa de 170-260 nm mesma amostra que em analisada a pH 675 e na faixa de 200-260 nm


Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras de proteiacutena natildeo irradiadas e

das irradiadas no estado soacutelido (com diferente aw) satildeo mostrados nas Figuras 10 11 e 12

Para as amostras natildeo irradiadas o espectro de CD mostrou um extremo negativo ao

redor de 216 nm um cruzamento no dicroiacutesmo zero a 203 nm e um extremo positivo ao

redor de 195 nm caracteriacutesticas que sinalizam um alto conteuacutedo de filamentos-β (CHANG

WU YANG 1978) A deconvoluccedilatildeo de espectro mostrou conteuacutedo de 13 de heacutelices-α

33 de filamentos-β 23 de turns e 30 de estrutura desordenadas confirmando a

predominacircncia de estruturas β (Tabela 5) Os valores calculados estatildeo na faixa do

conteuacutedo da estrutura secundaacuteria reportada por outros autores que tambeacutem utilizaram

dicroiacutesmo circular no caacutelculo para β-LG nativa como alguns jaacute mostrados na Tabela 4

(GRIFFIN et al 1993 KUWAJIMA YAMAYA SUGAI 1996 QI et al 1997

PRABAKARAN DAMODARAN 1997 CROGUENEC et al 2004)

Os espectros de CD das amostras irradiadas com doses de 10 e 50 kGy (Figuras

10 11 e 12) foram quase idecircnticos na forma e intensidade aos das amostras natildeo

irradiadas ressaltando que nas amostras irradiadas com 50 kGy o maacuteximo negativo em

216 nm (indicaccedilatildeo de estrutura folhas-β) (KELLY PRICE 1997) deslocou-se para um

comprimento de onda mais baixo ~207- 209 nm indicando efeito batocrocircmico Este efeito batocrocircmico junto com o aumento na intensidade negativa do dicroiacutesmo

no espectro caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas (MATSUURA

MANNING 1994) No entanto como o aumento de intensidade somente observado para

as amostras C50A2 e C50A3 foi muito pequeno a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas

natildeo ocorreu nestas amostras como avaliado pelo caacutelculo das estruturas secundaacuterias ao

utilizar o meacutetodo de CDSSTR (Tabela 5)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A1 C10A1 C50A1

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)

comprimento de onda

Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose

de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)

180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A2 C10A2 C50A2

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)


Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10kGy

(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A3 C10A3 C50A3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)


Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy

(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)

Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida

Amostra heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas Total C0A1 13 33 23 29 98

C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100

C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100

C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100

A deconvoluccedilatildeo dos espectros de UV-longiacutenquo indicou que natildeo ocorreram

alteraccedilotildees no conteuacutedo de heacutelices-α (~13) ou filamentos-β (~33) nas amostras de β-

LG irradiadas no estado soacutelido independente da aw ou das doses de irradiaccedilatildeo

Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo

Os espectros de CD no UV-proacuteximo das amostras irradiadas no estado soacutelido

estatildeo apresentados nas Figuras 13 14 e 15 Independente da aw os espectros de CD

foram similares aos espectros de CD no UV-proacuteximo reportados na literatura para a β-LG

na forma nativa mostrando picos negativos em 260 266 275 285 292 nm sinais

associados com a riacutegida estrutura terciaacuteria da β-LG nativa (KUWAYIMA YAMAYA


SUGAI 1996 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b) Somente uma pequena

diminuiccedilatildeo na intensidade do dicroiacutesmo foi observada ao ser aumentada a dose de

radiaccedilatildeo

240 260 280 300 320 340 360

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-05

00

05

C0A1 C10A1 C50A1

CD


Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy

(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)

240 260 280 300 320 340 360

-4

-3

-2

-1

0

C0A2 C10A2 C50A2

CD


Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e

com 50 kGy (C50A2)


240 260 280 300 320 340 360-5

-4

-3

-2

-1

0

C0A3 C10A3 C50A3

CD



com 50 kGy (C50A3)



As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL e 3 mgmL

apresentaram o dicroiacutesmo no UV-longiacutenquo mostrados nas Figuras 16 e 17

180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S10 C10S10 C50S10


Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo

irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)

[θ]

(deg

cm

2 dm

ol-1

)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270

-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S3 C10S3 C50S3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)

Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras C10S10 e C50S10 foram

similares ao espectro da amostra controle natildeo irradiada mas exibiram aumento negativo

da elipticidade e um deslocamento dos maacuteximos negativos para comprimentos de onda

mais curtos de 219 para ~207 nm (Figura 16) Nas amostras C10S3 e C50S3 (Figura 17)

estas mudanccedilas foram mais draacutesticas com alteraccedilatildeo na forma e na intensidade relativa

do CD e tambeacutem deslocando a banda negativa para uma posiccedilatildeo de comprimento de

onda mais baixo 202-205 nm Isto sugere que tanto a dose de irradiaccedilatildeo como a

concentraccedilatildeo de proteiacutena das amostras irradiadas foram as responsaacuteveis pelas

alteraccedilotildees estruturais que originaram a diferenccedila entre os espectros de UV-longiacutenquo

Para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a concentraccedilatildeo menor gerou alteraccedilotildees mais

significativas

Apesar destas alteraccedilotildees as amostras apresentam apenas pequenas diferenccedilas

no conteuacutedo de folhas-β e heacutelices-α que a proteiacutena natildeo irradiada (Tabela 6)


Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e

10mgmL)

Amostra heacutelices- α filamentos-β turns desordenadas Total C0S3 12 34 23 30 99

C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99

C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100

Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras irradiadas em soluccedilatildeo

mostraram as mesmas caracteriacutesticas espectrais da β-LG submetida a tratamento teacutermico

ou a alta pressatildeo hidrostaacutetica

Nos estudos sobre alteraccedilotildees estruturais por CD da β-LG submetida a tratamento

teacutermico as principais caracteriacutesticas aumento da intensidade negativa da banda que

caracteriza uma estrutura β e o seu desvio para comprimentos de onda mais baixos satildeo

geralmente mantidas ainda que sejam utilizadas diferentes condiccedilotildees de pH

concentraccedilatildeo de proteiacutena ou tempo de aquecimento (GRIFFIN et al 1993 MATSUURA

MANNING 1994 QI et al 1997 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b

CARROTA et al 2001 CHEN et al 2005) O mesmo eacute observado para tratamentos com

alta pressatildeo (YANG et al 2001) Diferenccedilas nos resultados entre estes estudos devem-

se principalmente agraves diferenccedilas na metodologia analiacutetica (diferente faixa de comprimento

de onda analisada) na interpretaccedilatildeo ou no caacutelculo do conteuacutedo das diversas estruturas

secundaacuterias a partir dos espectros

Um estudo interessante de Carrota et al (2001) mostra que os espectros de CD

no UV-longiacutenquo do diacutemero da β-LG nativa (Figura 18(a) espectro 1) eacute diferente do

diacutemero natildeo nativo e dos oligocircmeros da β-LG formados no primeiro estaacutegio do tratamento

teacutermico (Figura 18 (a) espectros 2 e 3) O espectro correspondente ao diacutemero natildeo nativo

e aos oligocircmeros eacute praticamente o mesmo e similar aos obtidos para as soluccedilotildees de β-LG

irradiadas (Figuras 16 e 17)

Com base no estudo de Carrota et al (2001) e nos resultados obtidos no presente

trabalho conclui-se que (1) a mudanccedila estrutural de diacutemero nativo para natildeo nativo pode

ser capaz de causar a mudanccedila no espectro de CD comum para todos os tratamentos por

aquecimento no primeiro estaacutegio (lt65degC) onde ocorre a formaccedilatildeo de oligocircmeros (2) as

propriedades dos diacutemeros natildeo nativos que originam tais caracteriacutesticas espectrais podem

ser atribuiacutedas tambeacutem a outros oligocircmeros como triacutemeros ou tetracircmeros produzidos por


aquecimento da β-LG (Carrota et al 2003) jaacute que apresentam o mesmo tipo de espectro

e (3) que os oligocircmeros formados por irradiaccedilatildeo devem apresentar alguma propriedade

similar aos oligocircmeros produzidos por aquecimento jaacute que tambeacutem apresentam espectro

de CD no UV-longiacutenquo muito parecidos

Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na

sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e

isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevel (3) oligocircmeros (4) agregados (Ref CARROTA et al

2001)

O diacutemero natildeo nativo e estaacutevel da β-LG caracterizado por Carrota et al (2001) por

dicroiacutesmo circular parece corresponder ao mesmo diacutemero caracterizado por Croguenec et

al (2003 2004) e conhecido como estado de molten globule diacutemero estaacutevel gerado pelo

aquecimento da β-LG Por esta razatildeo poder-se-ia concluir que as propriedades estruturais

da forma molten globule poderiam ser as responsaacuteveis pela geraccedilatildeo do espectro

caracteriacutestico de CD no UV-longiacutenquo No molten globule a estrutura secundaacuteria

permanece praticamente inalterada mas a estrutura terciaacuteria diferente da nativa

apresenta maior mobilidade ou flexibilidade das cadeias laterais mas ainda mantendo

certo grau de compactaccedilatildeo (PTITSYN 1995)

Nas amostras C10S10 C50S10 C10S3 e C50S3 a mudanccedila para λ menor bem

como o aumento da intensidade do maacuteximo negativo do dicroiacutesmo no espectro de UV-

longiacutenquo foram significativas o que caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas

desordenadas (MATSUURA MANNING 1994) No entanto o caacutelculo da estrutura

secundaacuteria natildeo mostrou aumento destas estruturas (Tabela 6) o que parece indicar que a

1 2

3

4

123

4


avaliaccedilatildeo apenas destes dois paracircmetros natildeo eacute suficiente para caracterizar a formaccedilatildeo

de estruturas desordenadas



As amostras irradiadas em soluccedilatildeo (Figuras 19 e 20) apresentaram grande

diminuiccedilatildeo na magnitude dos picos maior nas doses mais altas de radiaccedilatildeo e

concentraccedilatildeo de proteiacutena mais baixa indicando perda do dicroiacutesmo aromaacutetico Esta perda

de dicroiacutesmo pode representar perda de estrutura terciaacuteria da proteiacutena (PTITSYN 1995

DOLGIKH et al 1981 MATSUURA MANNING 1994)

240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

C0S10 C10S10 C50S10

C D

comprimento de onda

Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo


240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

1

C0S3 C10S3 C50S3C

D


Figura 20 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo



Reduccedilatildeo substancial da intensidade dos picos foi observada na amostra de β-LG

C10S10 (10 mgmL irradiada com 10 kGy) sendo maior a diminuiccedilatildeo no pico em ~292nm

correspondente ao Trp enquanto o completo desaparecimento dos picos foi observado na

amostra C50S10 (Figura 19) Amostras com menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL)

apresentaram reduccedilatildeo quase total do sinal de dicroiacutesmo jaacute em dose de 10 kGy (C10S3)

(Figura 20)

As medidas de fluorescecircncia das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo

sugerem que natildeo somente pode ter ocorrido a mudanccedila no ambiente do Trp mas

tambeacutem perda deste aminoaacutecido Este fato indicaria que nas anaacutelises de CD no UV-

proacuteximo os sinais diminuiacutedos do dicroiacutesmo podem ter sido causados em parte pela perda

do Trp No entanto natildeo se descarta a possibilidade de ter havido modificaccedilatildeo no

ambiente do Trp originado por alguma modificaccedilatildeo estrutural que permitiu uma maior

mobilidade dos grupos laterais sem prejuiacutezo da perda estrutural do caacutelice hidrofoacutebico e

estruturas β e α

Os resultados de CD no UV-longiacutenquo sinalizaram a manutenccedilatildeo da estrutura

secundaacuteria dos produtos gerados (oligocircmeros) na soluccedilatildeo irradiada e que estes produtos

tendo as mesmas caracteriacutesticas de CD no UV-longiacutenquo que os produzidos por

aquecimento poderiam ter igualmente uma estrutura terciaacuteria semelhante agrave de molten

globule No entanto se compararmos os espectros de CD no UV-proacuteximo (Figuras 19 e

20) com os obtidos em estudo de tratamento da β-LG com aquecimento (Figura 18)

pode-se observar que no tratamento com radiaccedilatildeo os espectros natildeo mostraram as

bandas tiacutepicas atribuiacutedas a ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares (sinalizadas por uma seta

no graacutefico (b) da Figura 18 espectros 2 e 3) na faixa de comprimento de onda 260-290

nm (CARROTA et al 2001 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b KUWAJIMA

YAMAYA SUGAI 1996) Isto indica que a β-LG irradiada em soluccedilatildeo natildeo apresenta

exatamente as caracteriacutesticas que configuram o estado de molten globule dos oligocircmeros

produzidos nos primeiros estaacutegios do aquecimento da proteiacutena

Grupos sulfidrila livres

A β-LG apresenta duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre teoricamente um

grupo SH por monocircmero de β-LG Este grupo SH livre se encontra protegido na

superfiacutecie interdimeacuterica (BROWNLOW et al 1997 BRITTAN et al 1997)

Os grupos sulfidrila livres determinados com reagente Ellman estatildeo reportados na

Tabela 7 Nas amostras irradiadas no estado soacutelido os grupos sulfidrila livres diminuiacuteram


significativamente em algumas amostras agrave medida que a dose de irradiaccedilatildeo foi

aumentando ateacute um maacuteximo de ~11 de perda na dose de 50 kGy

Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada

irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de

irradiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG

Moles SH mol de β-LG β-LG

00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy

aw 022

090plusmn001ab1 090plusmn001a1 088plusmn001abc1 086plusmn000abc1 085plusmn001bcd1 083plusmn004cd1 080plusmn001d1

aw 053

090plusmn002a1 090plusmn001a1 089plusmn001ab1 089plusmn002a1 087plusmn002ab1 085plusmn003ab1 081plusmn003b1

aw 074

090plusmn003a1 088plusmn001ab1 086plusmn001ab1 086plusmn002ab1 087plusmn002ab1 084plusmn001b1 084plusmn003b1

3 mgmL

090plusmn001a1 059plusmn002b3 051plusmn002c3 043plusmn001d3 025plusmn001ef3 028plusmn000e3 022plusmn002f2

10 mgmL

092plusmn001a1 073plusmn002b2 069plusmn002bc2 064plusmn002c2 051plusmn003d2 038plusmn000e2 026plusmn001f2

Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)

Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo no entanto a perda de sulfidrila livre foi muito

maior A proteiacutena em concentraccedilatildeo de 3mgmL teve uma perda de ~75 quando irradiada

com 10kGy enquanto as amostras em concentraccedilatildeo de 10 mgmL somente tiveram esse

iacutendice de perda com 50 kGy A maior sensibilidade do grupo tiol em amostras com baixa

concentraccedilatildeo de proteiacutena sugere que a degradaccedilatildeo deste grupo esta relacionada com a

maior interaccedilatildeo com espeacutecies ativas resultantes da radioacutelisis da aacutegua que seriam

produzidas em maior quantidade nas amostras mais diluiacutedas configurando a ocorrecircncia

do efeito indireto da radiaccedilatildeo

Quando a proteiacutena eacute desnaturada por tratamento teacutermico ou por alta pressatildeo

hidrostaacutetica o grupo SH livre fica mais exposto e se torna mais reativo promovendo

reaccedilotildees de intercacircmbio tiol-dissulfeto que conduzem agrave formaccedilatildeo de agregados ligados

por pontes dissulfeto intermoleculares verificando-se entatildeo diminuiccedilatildeo na quantidade de

grupos SH livres (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 SHIMADA CHEFTEL 1989

IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997) No presente estudo embora tenha sido


verificada diminuiccedilatildeo dos grupos SH a formaccedilatildeo de agregados da proteiacutena e a

contribuiccedilatildeo dos grupos SH na formaccedilatildeo de ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares precisou

ser estudada e os resultados seratildeo apresentados posteriormente Destaca-se no entanto

que como as amostras irradiadas apresentaram cheiro caracteriacutestico de produtos

sulfurados mais evidente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo e com doses maiores eacute

possiacutevel que tenha ocorrido algum grau de decomposiccedilatildeo dos resiacuteduos de aminoaacutecidos

que conteacutem sulfidrilas como a cisteiacutena Sabe-se que a cisteiacutena eacute um dos aminoaacutecidos

mais sensiacuteveis agrave irradiaccedilatildeo podendo sofrer oxidaccedilatildeo por accedilatildeo de radicais livres

(GARRISON 1987)

522 Agregaccedilatildeo

Agregaccedilatildeo da β-LG devido agrave irradiaccedilatildeo foi avaliada mediante anaacutelises de turbidez

eletroforese em gel PAGE SE-HPLC e SAXS

Turbidez As amostras irradiadas na forma soacutelida e em soluccedilatildeo apresentaram-se liacutempidas e

transluacutecidas apoacutes a radiaccedilatildeo com todas as doses (1-50 kGy) e a turbidez medida por

transmitacircncia a 550nm praticamente natildeo foi alterada (Tabela 8) indicando natildeo haver

formaccedilatildeo de agregados visiacuteveis como mostrado pelos valores de transmitacircncia mantidos

na ordem de 90 A leitura da transmitacircncia da amostra irradiada em concentraccedilatildeo de 3

mgmL foi feita nesta mesma concentraccedilatildeo e apresentou valores de transmitacircncia

comparativamente maiores que os das amostras lidas na concentraccedilatildeo de 10 mgmL

Estes resultados parecem indicar que prevaleceu o efeito de diluiccedilatildeo frente a qualquer

outro esperado pelo tratamento por irradiaccedilatildeo


Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida

(aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM

pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL)

lida nestas mesmas concentraccedilotildees

Transmitacircncia

β-LG


aw 022

9095plusmn087a3 9162plusmn015a2 8973plusmn014a3 8980plusmn085a3 9068plusmn148a2 9284plusmn049a2 9122plusmn124a34

aw

053 8875plusmn175c4 9226plusmn092a2 9197plusmn042ab2 9230plusmn074a2 9318plusmn006a2 9160plusmn020ab2 9045plusmn151bc4

aw 074

9258plusmn136a23 9330plusmn171a2 9194plusmn076ab2 8958plusmn136b3 9333plusmn078a2 9161plusmn284ab2 9276plusmn021a23

3 mgmL


10 mgmL



Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) As amostras irradiadas soacutelidas com ateacute 10 kGy independente da aw natildeo

mostraram diferenccedilas na eletroforese natildeo desnaturante (PAGE) apresentando o mesmo

perfil que a amostra correspondente natildeo irradiada (linha 6 nos geacuteis A B e C Figura 21)

As amostras com aw 053 (Figura 21D) e 074 (Figura 21E) irradiadas com dose de 50 kGy

apresentaram pequeno aumento da densidade corada na regiatildeo do gel (marcada como r

acima das 2 bandas correspondentes a β-LG (variantes A e B) indicando a presenccedila de

produtos de carga e massa diferentes da nativa


Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-

LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa

molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves

amostras de β-LG irradiadas com dose de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2

corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy

A B C

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

1 2 3

F

1 2 3

β-LG

D

1 2 3

β-LG

r

E

β-LG

r r


Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada

em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo

de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses

de 10 5 25 1 e 0 kGy

Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo o perfil eletroforeacutetico obtido em condiccedilotildees

natildeo desnaturantes (PAGE) (Figura 22A e B) mostrou diminuiccedilatildeo das bandas

correspondentes agrave β-LG (variantes A e B) e aumento da densidade corada nas regiotildees

acima destas bandas com o aumento da dose de radiaccedilatildeo Isto sugere a formaccedilatildeo de

produtos com carga diferente da nativa eou com maior massa molar O efeito eacute mais

acentuado nas amostras de β-LG irradiada em concentraccedilatildeo menor (3 mgmL) (Figura

22A) melhor evidenciado na linha 2 onde se observa que a proteiacutena concentra-se quase

que integralmente na parte superior do gel de separaccedilatildeo e natildeo em toda a faixa da linha 2

como na Figura 22B indicando que houve maior agregaccedilatildeo da proteiacutena na amostra mais

diluiacuteda (3 mgmL)

Cromatografia de Exclusatildeo Molecular Os perfis cromatograacuteficos de SE-HPLC da amostra de β-LG irradiada com doses

de 0 5 10 25 e 50 kGy no estado soacutelido (aw = 022) e em soluccedilatildeo nas concentraccedilotildees 3 e

10 mgmL satildeo mostradas nas Figuras 23 24 e 25

β-LG irradiada soacutelida com doses de 5 10 25 e 50 kGy (C5A1 C10A1 C25A1 e

C50A1) (Figura 23) exibe perfil cromatograacutefico similar ao obtido para a amostra natildeo

irradiada (C0A1) (Figura 23) Para todas as amostras a eluiccedilatildeo se deu em ~93 minutos

A B

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

β-LG Var B Var A


sob forma de um pico uacutenico com um maacuteximo que corresponde agrave massa molar meacutedia

aparente (MM) de 35 kDa calculada a partir de uma curva padratildeo de massa molar

previamente construiacuteda Esta eacute uma indicaccedilatildeo de que sob estas condiccedilotildees a β-LG existe

como diacutemero e natildeo foi modificada pela radiaccedilatildeo gama em doses de ateacute 50 kGy

0 2 4 6 8 10 12

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10 35kDa

Abs

orbacirc

ncia

a 2

80nm

(UA

)


C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1


O perfil do SE-HPLC da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (10 mgmL) (Figura 24)

mostrou que o pico correspondente ao diacutemero observado na amostra controle (C0S10)

diminuiu quando a dose de irradiaccedilatildeo aumentou e novos picos correspondentes a

produtos de maior massa molar que 35 kDa eluiram em tempos menores entre 45 a 9

minutos Agrave medida que se aumentou a dose de radiaccedilatildeo houve aumento da massa molar

dos produtos para ~60kDa MM ~90 kDa e MM~300 kDa e outros de massa maior eluiram

no volume morto


Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy

(C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)

Os perfis das amostras irradiadas em concentraccedilatildeo menor da proteiacutena (3 mgmL)

(Figura 25) mostraram que houve formaccedilatildeo de agregados por efeito da radiaccedilatildeo como foi

no caso da amostra irradiada na concentraccedilatildeo de 10 mgmL (Figura 24) Em geral para

uma mesma dose de radiaccedilatildeo os produtos resultantes da irradiaccedilatildeo da amostra de

concentraccedilatildeo 3 mgmL satildeo de maior massa molar que os formados a partir da amostra de

concentraccedilatildeo 10 mgmL A exceccedilatildeo seria a amostra C50S3 cujo perfil mostra que

contraacuterio ao observado na amostra C50S10 mostra produtos de massa menor que a

amostra C25S3

Em nenhum caso nas amostras irradiadas soacutelidas ou em soluccedilatildeo houve indiacutecios

de ter ocorrido monomerizaccedilatildeo da β-LG jaacute que natildeo foi observado nos cromatogramas

nenhum pico ou maacuteximo no tempo de eluiccedilatildeo em ~10 minutos


Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3)

10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)

SAXS Os resultados mostrados a seguir foram agrupados por dose de radiaccedilatildeo e pelo

estado da amostra quando foi irradiada (soacutelida ou em soluccedilatildeo) As amostras natildeo

irradiadas foram consideradas controle As amostras irradiadas soacutelidas foram estudadas

nas doses 0 5 10 25 e 50 kGy e as amostras irradiadas em soluccedilatildeo nas doses 0 5 e 10

kGy

A partir das medidas de SAXS foram obtidos a curva de intensidade de

espalhamento SAXS a funccedilatildeo (pr) obtida da transformada de Fourier da intensidade de

espalhamento o graacutefico de Kratky e a curva da intensidade de espalhamento com base

na estrutura cristalograacutefica sendo apresentadas dentro de cada figura com as letras A B

C e D respectivamente

Amostras irradiadas na forma soacutelida

As intensidades de espalhamento e ajuste teoacuterico realizado com o programa

GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991) para a proteiacutena natildeo irradiada com aw 022 053 e

074 satildeo mostradas na Figura 26A Para as trecircs amostras os dados foram muito

similares com boa relaccedilatildeo sinalruiacutedo apresentando modulaccedilatildeo nas curvas de

espalhamento tiacutepica de partiacuteculas globulares


A transformada de Fourier da intensidade de espalhamento fornece a curva de

distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) (GUINIER FOURNET 1955) a qual provecirc

indicaccedilotildees sobre a forma da partiacutecula Na Figura 26B estatildeo apresentadas as curvas da

funccedilatildeo p(r) calculadas a partir do ajuste dos dados experimentais com o programa

GNOM

A forma das curvas de intensidade (Figura 26A) e da funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de

distacircncias p(r) (Figura 26B) indicam que as amostras natildeo irradiadas independente da

atividade de aacutegua apresentaram a mesma conformaccedilatildeo Pela forma da funccedilatildeo p(r)

(Figura 26B) verifica-se que a partiacutecula possui uma conformaccedilatildeo ligeiramente prolata

(GUINIER FOURNET 1955 GLATTER KRATKY 1982)

Das medidas de SAXS obtiveram-se os valores para o raio de giro (Rg) por ajuste

teoacuterico da intensidade utilizando o programa GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991)

Deste ajuste verificou-se que as proteiacutenas natildeo irradiadas C0A1 C0A2 e C0A3 possuem

raios de giro com valores de 240plusmn03 235plusmn04 e 254plusmn08 Aring respectivamente Os

valores estatildeo um pouco acima dos encontrados para a proteiacutena dimeacuterica nativa que pode

ser calculada da estrutura cristalina (215 Aring) (SVERGUN BARBERATO KOCH 1995) e

dos valores encontrados em experimentos com β-LG nativa em soluccedilatildeo (PANICK

MALESSA WINTER 1999 WITZ TIMASHEFF LUZZATI 1964 GREEN et al 1979)

Valores similares aos obtidos em nosso estudo foram encontrados por Carrota et al

(2003) (254plusmn04 Aring) e no estudo por espalhamento de necircutrons a baixo-acircngulo (SANS)

realizado por Verheul et al (1999) (236plusmn02 Aring)

Do ajuste teoacuterico tem-se tambeacutem a extrapolaccedilatildeo dos dados para q=0 Com a

intensidade na origem (I(0)) eacute possiacutevel determinar a massa molar da proteiacutena Os valores

da massa molar para as diferentes amostras natildeo irradiadas junto com as maacuteximas

dimensotildees obtidas das curvas p(r) encontram-se na Tabela 9


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001In

tens

idad

e (U

A)

q [Aring-1]

C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT

0 20 40 60 80

0

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C0A1 C0A2 C0A3

00 01 02 03 0400

20x10-5

40x10-5

60x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]

C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT Dro0025 Ra1800 C0A2 FIT Dro0025 Ra1800 C0A3 FIT Dro0043 Ra1800

Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de

intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva

teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e

C0A3

A informaccedilatildeo sobre o grau de compactaccedilatildeo das proteiacutenas pode ser obtido atraveacutes

da anaacutelise dos graacuteficos de Kratky (Iq2 vs q) (GLATTER KRATKY 1982) Na Figura 26C

estatildeo apresentados os graacuteficos de Kratky para as amostras natildeo irradiadas Observa-se

que todas elas apresentam conformaccedilatildeo globular compacta indicada pela forma de sino

(GLATTER KRATKY 1982)

A conformaccedilatildeo da proteiacutena se mostrou idecircntica agrave da proteiacutena cristalizada como eacute

visto do ajuste na Figura 26D Neste caacutelculo utiliza-se a estrutura cristalograacutefica da

proteiacutena β-lactoglobulina (1BEBPDB) a partir da qual o caacutelculo teoacuterico da intensidade de

espalhamento eacute feito e os dados experimentais satildeo ajustados tendo-se como paracircmetros

de ajuste a largura da camada de aacutegua no entorno da proteiacutena e o contraste de densidade

eletrocircnica desta camada de aacutegua Observa-se que em todos os casos houve bom ajuste

dos dados experimentais A anaacutelise conjunta mostrou que as amostras soacutelidas estudadas

A

C

B

D


nas trecircs diferentes aw antes de serem irradiadas (C0A1 C0A2 e C0A3) estavam

monodispersas e com a proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo

As amostras que foram irradiadas na forma soacutelida com diferentes aw e dose de 5

kGy natildeo mostraram diferenccedilas entre elas (Figura 27A) nem com as natildeo irradiadas A

conformaccedilatildeo geral da proteiacutena foi a mesma conforme indica a forma da funccedilatildeo p(r)

(Figura 27B) A irradiaccedilatildeo tambeacutem natildeo alterou a compactaccedilatildeo da proteiacutena indicada pela

forma do graacutefico de Kratky (Figura 27C) A manutenccedilatildeo da forma estrutural eacute confirmada

pelo oacutetimo ajuste pela estrutura cristalograacutefica (Figura 27D)

Os raios de giro Rg para as amostras C5A1 C5A2 e C5A3 foram 235plusmn04

240plusmn03 e 238plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees

derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da

intensidade para q=0 encontram-se na Tabela 9

00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C5A1 C5A2 C5A3

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

7x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1BEB FIT

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as

amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama

A

C

B

D


Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento

da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama (0 5 10 25 e 50 kGy) na forma

soacutelida com diferentes aw (A1022 A2053 e A3074)

Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmax (Aring) Oligocircmeros

C0A1 0 240plusmn03 36plusmn2 82 Diacutemero















As curvas de espalhamento para a proteiacutena irradiada com 10 kGy mostradas na

Figura 28A satildeo semelhantes agraves apresentadas pelas amostras natildeo irradiadas (Figura

26A) natildeo apresentando diferenccedilas entre as amostras com diferentes aw

As amostras irradiadas com 10 kGy no estado soacutelido natildeo apresentaram mudanccedilas

conformacionais decorrentes da dose de radiaccedilatildeo como tambeacutem foi observado para as

amostras irradiadas com dose de 5 kGy A forma da funccedilatildeo p(r) eacute bastante parecida em

todos os casos (Figura 28B) assim como o grau de compacidade eacute o mesmo indicado

pelo graacutefico de Kratky (Figura 28C) O oacutetimo ajuste dos dados usando a estrutura

cristalograacutefica (Figura 28D) indica que a proteiacutena manteve a forma nativa Os valores das

dimensotildees maacuteximas continuaram a ser de 82 Aring para todas elas O Rg deu os valores de

238plusmn05 242plusmn04 e 235plusmn02 Aring para as amostras C10A1 C10A2 e C10A3

respectivamente


00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C10A1 C10A2 C10A3

00 01 02 03 040

2x10-5

4x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]

C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT Dro0030 Ra1800 C10A2 FIT Dro0028 Ra1800 C10A3 FIT B C

Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as

amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo

Na Figura 29A a 29D observa-se que mesmo com a dose de radiaccedilatildeo de 25 kGy a

proteiacutena manteve sua conformaccedilatildeo nativa Para a amostra com aw 074 observou-se

aumento na regiatildeo final da funccedilatildeo p(r) (Figura 29B) o que pode indicar a presenccedila de

uma pequena fraccedilatildeo de agregados No entanto o oacutetimo ajuste com a estrutura

cristalograacutefica (Figura 29D) indica que natildeo ocorreram mudanccedilas conformacionais na

proteiacutena



C D

A B



intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9

00 01 02 03 04

10-4

10-3

10-2

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

40x10-5

80x10-5

12x10-4

p(r)

r[Aring]

C25A1 C25A2 C25A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

Iq2 (a

rb u

)

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)

C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 Fit C25A2 Fit C25A3 Fit


amostras foram submetidas a 250 kGy

Similarmente ao obtido para as amostras irradiadas com 25 kGy observa-se que a

dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy favoreceu o aparecimento de agregados no sistema

indicados pelo aumento da p(r) a valores maacuteximos de r para a β-LG com aw 074 (Figura

30B) Isto eacute uma indicaccedilatildeo de que o niacutevel de hidrataccedilatildeo da amostra exposta agrave radiaccedilatildeo

pode influenciar na formaccedilatildeo de agregados Verifica-se que em todos os casos houve

bons ajustes com os dados experimentais

B A

C D


00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

20x10-5

40x10-5

60x10-5

80x10-5

10x10-4

12x10-4

14x10-4

p (r)

r[Aring]

C50A1 C50A2 C50A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

I q

2

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)


Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As

amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama


239plusmn02 e 242plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as dimensotildees maacuteximas


intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9 Estes resultados em conjunto indicam

que as amostras irradiadas soacutelidas com dose de 50 kGy estavam monodispersas e com a

proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo

Pelos resultados de SAXS as amostras irradiadas na forma soacutelida natildeo tiveram

mudanccedila estrutural quando comparadas agrave amostra natildeo irradiada Nas condiccedilotildees de pH

estudadas (pH 70) esta estrutura mostrou ser como a nativa na faixa de dose de

radiaccedilatildeo 0-50 kGy

A B

C D



Amostras de β-LG foram irradiadas em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3mgmL e

10 mgmL Nestas mesmas concentraccedilotildees foram analisadas por SAXS

Embora as amostras natildeo irradiadas tenham sido analisadas em diferentes

concentraccedilotildees ambas apresentaram curvas semelhantes com bom ajuste com a

estrutura cristalograacutefica (Figura 31D) indicando que natildeo haacute diferenccedilas estruturais entre

elas e a proteiacutena nativa

00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]

C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT

0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C0S3 C0S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]

C0S3 C0S10 C0S3 FIT Dro0037 Ra1800 C0S10 FIT Dro0025 Ra1780

Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias C graacutefico de

Kratky e D curva teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de

tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo

irradiadas Os raios de giro Rg das amostras C0S3 e C0S10 (natildeo irradiadas) foram 248plusmn07 e

240plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva p(r)

e as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 encontram-se

na Tabela 10

A B

DC


Diferentemente das amostras irradiadas na forma soacutelida as amostras que foram

irradiadas em soluccedilatildeo com dose de 5 kGy apresentaram variaccedilotildees de tamanho Isto eacute

observado pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) na curva p(r) (Figura 32B)

e tambeacutem pela mudanccedila de sua forma Do graacutefico de Kratky (Figura 32C) observa-se que

os agregados formados tambeacutem possuem conformaccedilatildeo compacta como indicado pela

forma da curva Tambeacutem no ajuste com a estrutura cristalograacutefica (Figura 32D) observa-

se que a intensidade espalhada pelas amostras irradiadas em soluccedilatildeo natildeo eacute bem

ajustada pela curva de espalhamento calculada a partir dos dados da estrutura

cristalograacutefica da proteiacutena

00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

1x10-4

p(r)

r[Aring]

C5S3 C5S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo

em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose

de 5 kGy

O raio de giro Rg das amostras C5S3 e C5S10 (irradiadas com 5 kGy) foi 50plusmn02

e 303plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva

DC

BA


p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se

encontram na Tabela 10 Semelhante aos resultados obtidos para a proteiacutena irradiada com 5 kGy

apresentados na Figura 32 as amostras irradiadas em soluccedilatildeo com 10 kGy apresentaram

formaccedilatildeo de agregados indicados pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) da

funccedilatildeo p(r) (Figura 33B) A curva de espalhamento calculada a partir dos dados da

estrutura cristalograacutefica da proteiacutena tambeacutem natildeo consegue descrever corretamente a

intensidade espalhada mesmo para a amostra C10S10 onde houve leve agregaccedilatildeo

(Figura 33D)

00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 50 100 150 200 2500

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C10S3 C10S10

00 01 02 030

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]

C10S10 C10S10 FIT

Dro0075 Ra1400

Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo

fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy

O raio de giro Rg para as amostras C10S3 e C10S10 (irradiadas com 10 kGy) foi

69plusmn5 e 338plusmn06 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da

A

D

B

C


curva p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se

encontram na Tabela 10


da β-LG em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) submetida a diversas doses de irradiaccedilatildeo gama (0 5

e 10 kGy)

Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmaacutex (Aring) Oligocircmero

C0S3 0 248plusmn07 33plusmn5 82 Diacutemero


C5S3 5 50plusmn2 ~100 180 Hexacircmero

C5S10 5 303plusmn04 ~50 100 Tetracircmero

C10S3 10 69plusmn5 ~350 250 Agregados


As amostras de proteiacutena irradiadas em soluccedilatildeo apresentaram alteraccedilatildeo dos

paracircmetros estruturais medidos por SAXS que sugerem mudanccedila estrutural Houve

aumento do raio de giro da moleacutecula e aumento do Dmaacutex que poderia estar indicando a

formaccedilatildeo de agregados Os valores experimentais de intensidade de espalhamento natildeo

se ajustaram agrave curva de intensidade calculada teoricamente a partir dos dados

cristalograacuteficos indicam estrutura diferente da nativa

Devido agrave β-LG ter a estrutura nativa bem definida por anaacutelise cristalograacutefica eacute

possiacutevel estimar aproximadamente a forma das moleacuteculas de proteiacutena aqui analisadas

agregadas ou natildeo atraveacutes de modelagem

Utilizando as amostras puras como padratildeo calculou-se a massa molar equivalente

para as outras amostras A β-lactoglobulina em condiccedilotildees nativas eacute um diacutemero de massa

molar 35340 Da (BROWNLOW et al 1997) Sendo assim a massa molar equivalente

obtida dos experimentos de SAXS forneceraacute indicaccedilatildeo do tamanho dos agregados

formados Do ajuste dos dados de SAXS obtiveram-se os paracircmetros estruturais em cada

caso

Pelos dados mostrados na Tabela 9 observa-se que as amostras irradiadas no

estado soacutelido independente da atividade de aacutegua natildeo sofreram alteraccedilatildeo da

conformaccedilatildeo como evidenciado pelos valores de Rg MM e Dmaacutex mantendo a

conformaccedilatildeo de diacutemero


Diferentemente das amostras irradiadas soacutelidas as amostras irradiadas em

soluccedilatildeo (Tabela 10) apresentaram alteraccedilotildees estruturais evidenciadas pelos valores de

Rg MM e Dmaacutex indicando formaccedilatildeo de oligocircmeros Da Tabela 10 tem-se a indicaccedilatildeo da formaccedilatildeo de vaacuterios tipos de agregados Pela

massa molar equivalente deduz-se que se pode tratar de tetracircmeros hexacircmeros ou

agregados maiores

Para obter mais informaccedilotildees sobre a oligomerizaccedilatildeo da proteiacutena fez-se a

construccedilatildeo de modelos estruturais a partir dos dados experimentais utilizando como

subunidade base a estrutura cristalograacutefica do diacutemero da β-LG (registro em PDB

1BEBPDB) Ainda que a estrutura terciaacuteria da β-LG tenha sofrido alteraccedilotildees com a

irradiaccedilatildeo a utilizaccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica para a construccedilatildeo do oligocircmero pode

ser vista como uma aproximaccedilatildeo para modelar estes oligocircmeros

Vaacuterios modelos foram construiacutedos e combinaccedilotildees lineares foram testadas para

determinar uma possiacutevel polidispersidade de tamanhos

Para estimar a fraccedilatildeo numeacuterica de diacutemeros (x) na mistura faz-se um caacutelculo

assumindo a presenccedila de tetracircmeros e diacutemeros no sistema A massa molar meacutedia (que eacute

dada pelo SAXS) seraacute uma composiccedilatildeo linear de cada parcela

( ) ( ) ( ) ( )222 1 tetracircmerodiacutemero MMxMMxMMmeacutedia sdotminus+sdot= (10)

E assim a fraccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros seraacute

( ) ( )( ) ( )22

22

diacutemerotetracircmero

tetracircmero

MMMMMMMMxDiacutemeros meacutedia

minus

minus=

(11)

)x(Tetracircmeros minus1 (12)

Amostra β LG em soluccedilatildeo (10mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S10)

Para descrever o comportamento da intensidade espalhada atraveacutes de oligocircmeros

da proteiacutena fez-se modelagem utilizando o programa MASSHA (KONAREV

PETOUKHOV SVERGUN 2001) Pelos paracircmetros estruturais apresentados na Tabela

10 para a amostra C5S10 haacute indicaccedilatildeo da presenccedila de tetracircmeros no sistema

Realizando o ajuste para obter o tetracircmero que melhor ajusta os dados experimentais

tem-se como resultado o mostrado na Figura 34


00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]

C5S10 Tetracircmero fit

Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy

Neste caso o modelo tetrameacuterico consegue descrever quase corretamente os

dados experimentais confirmando a presenccedila destes na soluccedilatildeo Fazendo a estimativa

aproximada da populaccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros na mistura obteve-se que 28

devem ser tetracircmeros e ~72 diacutemeros Do ajuste tem-se o modelo mostrado na Figura

35

Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10

A contribuiccedilatildeo dos diacutemeros eacute maior do que a dos tetracircmeros e como este modelo

simplificado apenas leva em conta os tetracircmeros da mistura haacute forte influecircncia da parcela

dimeacuterica gerando distorccedilotildees no modelo tetrameacuterico No entanto o importante aqui eacute que

se pode constatar a presenccedila de tetracircmeros na mistura O raio de giro do modelo e sua

maacutexima dimensatildeo eacute 29 Aring e 113 Aring respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores

obtidos experimentalmente (303plusmn04 Aring e 100 Aring) mas esta diferenccedila dos valores deve-se

agrave influecircncia dos diacutemeros na soluccedilatildeo


Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (10 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy Apesar de os dados de SAXS e paracircmetros estruturais determinados indicarem a

presenccedila de agregados na proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com 10 kGy parece natildeo ter

ocorrido agregaccedilatildeo desordenada Eacute possiacutevel que pequenos agregados tenham sido

formados mas possivelmente ainda existam proteiacutenas no estado monodisperso Pela

massa molar meacutedia e dimensatildeo maacutexima supotildee-se que os oligocircmeros sejam tetracircmeros

000 005 010 015 0201E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10

O ajuste dos dados experimentais foi muito satisfatoacuterio para o modelo tetrameacuterico

indicaccedilatildeo de presenccedila significativa de tetracircmeros no sistema

Testando a polidispersidade utilizaram-se as equaccedilotildees (10) (11) e (12) Para a

amostra C10S10 os resultados indicaram que ~58 das partiacuteculas componentes da

mistura eram tetracircmeros e ~42 ainda continuavam sendo diacutemeros O tetracircmero que

melhor ajustou aos dados experimentais eacute mostrado na Figura 37



A conformaccedilatildeo deste tetracircmero foi ligeiramente diferente da apresentada pela a

amostra irradiada com 5 kGy (Figura 34) Neste caso a contribuiccedilatildeo dos tetracircmeros eacute

maior do que a dos diacutemeros inverso ao que aconteceu com a amostra C5S10 Vale

ressaltar que este eacute um caacutelculo aproximado A intensidade de espalhamento possui

componentes dimeacutericos e tetrameacutericos e o programa ajustou os dados assumindo apenas

tetracircmeros No entanto como a fraccedilatildeo de tetracircmeros eacute maior do que a de diacutemeros

propotildee-se que esta conformaccedilatildeo deva estar bastante proacutexima da real uma vez que a

contribuiccedilatildeo para a intensidade dos diacutemeros acabaraacute sendo menor O raio de giro do

modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 3317 Aring e 1193 Aring respectivamente que estatildeo em

oacutetima concordacircncia com os valores obtidos experimentalmente (338plusmn06 Aring e 115 Aring)

Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S3)

Pela massa molar obtida e tambeacutem pela dimensatildeo maacutexima os agregados

formados podem ser hexacircmeros Das vaacuterias formas de se construir um hexacircmero de

proteiacutenas 1BEB apenas o arranjo sequumlencial (em linha) consegue fornecer um Dmax de

~180Aring O hexacircmero foi a conformaccedilatildeo escolhida e o ajuste eacute mostrado na Figura 38

00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]

C5S3 Hexacircmero fit

Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy

Dos caacutelculos com a massa molar obtida a partir dos dados de SAXS e com os

valores esperados obteve-se uma populaccedilatildeo composta de 80 de hexacircmeros e 20 de

diacutemeros natildeo se descartando a possibilidade de haver tetracircmeros no sistema No entanto

testes com apenas tetracircmeros e oligocircmeros maiores natildeo fornecem resultados tatildeo bons

quanto para o caso de hexacircmeros O hexacircmero mais provaacutevel de estar sendo formado eacute

mostrado na Figura 39


Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG (3mgmL) irradiada com 5 kGy

O raio de giro do modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 43 Aring e 150 Aring

respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores obtidos experimentalmente (50plusmn2 Aring e

180 Aring) Como o obtido pelos dados de SAXS ainda eacute ligeiramente maior pode-se

especular a presenccedila de agregados maiores ainda na mistura mas pelo ajuste a maioria

deve ser de hexacircmeros e diacutemeros

Amostra β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy

Nesta amostra houve formaccedilatildeo de agregados grandes e polidispersos de modo

que natildeo foi possiacutevel obter maiores informaccedilotildees Dos dados de SAXS tem-se apenas uma

informaccedilatildeo geral do tamanho destes agregados maacutexima dimensatildeo de ~250 Aring e massa

molar meacutedia de 350 kDa

Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo observa-se em geral que haacute uma tendecircncia agrave

agregaccedilatildeo com o aumento da dose de radiaccedilatildeo e a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de

proteiacutena

523 Mecanismo de agregaccedilatildeo

Nas anaacutelises apresentadas no item 522 comprovou-se que houve agregaccedilatildeo da

proteiacutena devido agrave irradiaccedilatildeo principalmente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo Para

tentar elucidar o provaacutevel mecanismo envolvido na agregaccedilatildeo foram realizadas anaacutelises

de eletroforese em gel SDS-PAGE em condiccedilotildees redutoras e natildeo redutoras e detecccedilatildeo

de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil


Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) Na Figura 40 observa-se que as amostras irradiadas em soluccedilatildeo (3 mgmL)

apresentaram perfis semelhantes tanto em condiccedilotildees natildeo redutoras (Figura 40A) como

redutoras (Figura 40B) Em ambas as condiccedilotildees verificou-se a presenccedila de produtos de

maior massa molar que a β-LG monocircmero devido agrave irradiaccedilatildeo evidenciado pelas regiotildees

coradas localizadas acima da banda monomeacuterica Para as amostras que receberam

doses de radiaccedilatildeo maiores 10 25 e 50 kGy (linhas 5 6 e 7) e em ambas as condiccedilotildees de

eletroforese observou-se alguns produtos de maior massa que natildeo conseguiram entrar

no gel de separaccedilatildeo No gel em condiccedilotildees redutoras (Figura 40B) observa-se leve

aumento na intensidade e aacuterea na banda monomeacuterica da β-LG em amostras irradiadas

ateacute 5 kGy (linha 4) concomitante agrave diminuiccedilatildeo nas respectivas linhas de produtos de maior

massa possivelmente produto da reduccedilatildeo de algumas pontes dissulfeto entre moleacuteculas

de β-LG agregadas No entanto o meio redutor natildeo resultou na desagregaccedilatildeo da maior

parte dos produtos de maior massa molar que ainda apresentam menor mobilidade que o

monocircmero da β-LG na regiatildeo central do gel ou que ficam retidos no gel de empilhamento

(Figura 40B linhas 5 6 e 7)

Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e

(B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy

Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)

MkDa 940 670 430 300 201 144

β-LG

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

MkDa 940 670 430 300 201 144

B A

β-LG


Estes resultados indicam que a irradiaccedilatildeo teve um efeito importante sobre a

proteiacutena em soluccedilatildeo dando origem agrave formaccedilatildeo de agregados de massa molar variada As

ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares parecem natildeo ser relevantes para a formaccedilatildeo destes

agregados ao contraacuterio do que tem sido relatado para tratamento teacutermico (SHIMADA

CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997)

Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil As anaacutelises de fluorescecircncia foram realizadas para avaliar a possiacutevel participaccedilatildeo

de ligaccedilotildees entre radicais tirosil no processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena devido agrave

irradiaccedilatildeo Segundo Davies Delsignore e Lin (1987) a fluorescecircncia maacutexima das

bitirosinas se daacute entre 410 e 420 nm em amostras submetidas a λexc = 325 nm

Apoacutes realizar um teste de varredura na amostra C25S3 foi verificado que o

espectro apresentava maacuteximo em 411 nm (Figura 41) Este valor foi utilizado para avaliar

o teor de bitirosinas nas amostras


Os valores da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm satildeo mostrados na Figura 42

Aumento significativo da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm caracteriacutestica de ligaccedilotildees

de bitirosinas foi observado nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo em relaccedilatildeo agrave amostra

natildeo irradiada


Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo

irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm

λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas

com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor

(correspondentes a uma mesma dose de irradiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem

significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)

Nas amostras irradiadas soacutelidas a aw natildeo foi fator determinante na formaccedilatildeo de

ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil Natildeo houve diferenccedilas estatiacutesticas (pgt005) entre as

amostras de β-LG com diferentes aw para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a natildeo ser na

amostra natildeo irradiada com aw 074 sugerindo um possiacutevel erro experimental Amostras

com uma mesma aw irradiadas com doses diferentes apresentaram diferenccedila estatiacutestica

com a natildeo irradiada mas natildeo entre elas

Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo numa mesma concentraccedilatildeo de proteiacutena

houve tendecircncia de aumento da fluorescecircncia com o aumento da dose de irradiaccedilatildeo

mostrando diferenccedilas significativas entre elas (plt005) A exceccedilatildeo foi a amostra C50S3

que apresentou menor intensidade de fluorescecircncia que a amostra C25S3 o que pode

sugerir que na irradiaccedilatildeo com doses maiores que 25 kGy o processo de agregaccedilatildeo

sofreu alguma alteraccedilatildeo refletida na diminuiccedilatildeo das ligaccedilotildees de bitirosil Isto eacute

corroborado pelas anaacutelises de SE-HPLC cujos resultados mostram para esta amostra

agregados de massa molar menor que na amostra C25S3

A menor quantidade de ligaccedilotildees bitirosil na amostra C50S3 sugere que enquanto

era atingida a dose de 50 kGy pode ter havido a formaccedilatildeo de agregados maiores que

depois sofreram uma clivagem por efeito da radiaccedilatildeo Uma outra hipoacutetese seria a

0

200

400

600

800

1000

1200

2

1

333

1

2

333

1

2

333 22122

c

a

b

d

a

b

c

daabbaabbabbc

aw=022 aw=053 aw=074 10mgmL 3mgmL

Fluo

resc

enci

a a

411

nm (U

A)

amostras de β-LG

0 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy


destruiccedilatildeo de alguns resiacuteduos de tirosina por efeito da alta dose de radiaccedilatildeo (50 kGy)

diminuindo assim a quantidade de radicais de tirosil disponiacuteveis ou ainda que radicais

tirosil tenham sofrido uma re-reduccedilatildeo pela accedilatildeo de O2- (espeacutecie resultante da radioacutelise da

aacutegua) desta maneira impedindo que ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil ocorressem a 50 kGy

(PRUTZ BUTLER LAND 1983)

A fluorescecircncia de amostras irradiadas em soluccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees

mas com mesma dose foram estatisticamente diferentes (plt005) As amostras com

menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL) apresentaram valores maiores com exceccedilatildeo

novamente da amostra C50S3 que apresentou menor fluorescecircncia de bitirosil que a sua

correspondente C50S10 indicando que a concentraccedilatildeo da proteiacutena irradiada eacute fator

importante para a quantidade de agregados formados independente da dose de radiaccedilatildeo

A presenccedila de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosinas eacute um indiacutecio de que outras ligaccedilotildees

cruzadas mais difiacuteceis de serem identificadas possam tambeacutem estar ocorrendo nas

amostras submetidas agraves condiccedilotildees do estudo (SHINAR NAVOK CHEVION 1983)

524 Mudanccedilas na funcionalidade (poder ligante de retinol e

susceptibilidade agraves proteases)

Poder ligante do retinol

Assim como sua funccedilatildeo bioloacutegica as propriedades funcionais de uma proteiacutena

estatildeo diretamente relacionadas agrave sua estrutura No caso da β-LG sua funccedilatildeo bioloacutegica

natildeo eacute totalmente conhecida mas sabe-se que tem caracteriacutesticas de uma proteiacutena de

transporte e eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas como retinol

(FUGATE SONG 1980 JANG SWAISGOOD 1990) Eacute conhecido que in vitro a β-LG

nativa liga uma moleacutecula de retinol por monocircmero e o siacutetio de ligaccedilatildeo mais provaacutevel eacute no

interior do caacutelice hidrofoacutebico (PAPIZ et al 1986 CHO BATT SAWYER 1994) Como o

retinol fluoresce significativamente quando ligado agrave β-LG a capacidade ligante da β-LG

mostraraacute que eacute maior quanto maior for a quantidade de retinol adicionada capaz de

produzir aumento na fluorescecircncia (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)

As curvas de titulaccedilatildeo da β-LG com soluccedilatildeo de retinol 3 mM satildeo mostradas na

Figura 43 A proteiacutena irradiada soacutelida com 10 kGy que mostrou manter a sua estrutura

como nativa como avaliado por medidas de fluorescecircncia e dicroiacutesmo circular e SAXS

natildeo mostrou perda do poder ligante Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo a capacidade


ligante da β-LG foi diminuiacuteda em ~40 para a amostra C10S10 e em ~80 para a

C10S3 comparada com a amostra natildeo irradiada mostrando que a perda foi maior na que

apresentou alteraccedilotildees mais significativas no dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia intriacutenseca


A perda do poder ligante observado sugere por um lado perda de estrutura

terciaacuteria que em algum grau tenha afetado o caacutelice hidrofoacutebico natildeo dando condiccedilotildees de

ligaccedilatildeo e acomodaccedilatildeo da moleacutecula de retinol ou por outro lado que algum tipo de

agregaccedilatildeo molecular tenha dificultado a entrada da moleacutecula ao siacutetio de ligaccedilatildeo dentro do

caacutelice hidrofoacutebico

Entretanto assim como com os resultados da fluorescecircncia intriacutenseca e de

dicroiacutesmo circular natildeo se descarta a hipoacutetese de que a possiacutevel perda de Trp pela

irradiaccedilatildeo tenha contribuiacutedo para a perda do poder de ligaccedilatildeo do retinol

Susceptibilidade agraves proteases

O estudo da digestibilidade das proteiacutenas pode ser uacutetil para estimar a sua

biodisponibilidade apoacutes terem sido aplicados tratamentos que possam afetar a sua


estrutura Neste caso o tratamento de irradiaccedilatildeo com raios gama Nesta etapa foram

estudadas somente as amostras irradiadas soacutelidas com doses de 0 10 25 e 50 kGy

Ainda que natildeo tenham sido verificadas modificaccedilotildees estruturais na proteiacutena irradiada

soacutelida poderia haver alteraccedilatildeo na susceptibilidade agraves proteases devido agrave modificaccedilotildees

oxidativas em aminoaacutecidos causadas por bullOH ou bullOH + O2- que podem afetar a carga da

proteiacutena provocando alteraccedilotildees que poderiam aumentar a susceptibilidade proteoliacutetica da

proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987 DAVIES LIN PACIFICI 1987)

Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave tripsina

Os cromatogramas de fase reversa mostram o perfil da amostra C25A1 antes

e apoacutes a hidroacutelise com tripsina (Figura 44) O cromatograma da amostra antes da hidroacutelise

apresenta o pico correspondente agrave β-LG intacta (Figura 44(1)) O pico desaparece

completamente apoacutes a hidroacutelise como pode ser observado no cromatograma da Figura

44(2) com aparecimento de picos na regiatildeo mais hidrofiacutelica correspondentes aos

peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Os cromatogramas das amostras com diferentes aw e

doses de irradiaccedilatildeo hidrolisadas com tripsina mostraram perfis similares sem variaccedilatildeo no

nuacutemero eou intensidade relativa dos picos principais Os resultados evidenciaram a

hidroacutelise completa da β-LG pela accedilatildeo da tripsina


Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)


Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina

O perfil cromatograacutefico da amostra da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy e

hidrolisada com pepsina estaacute apresentado na Figura 45 No cromatograma (Figura 45)

observa-se que o pico correspondente agrave proteiacutena intacta ainda estaacute presente e na regiatildeo

mais hidrofiacutelica observam-se os picos dos peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Isto indica

que a pepsina hidrolisou apenas parcialmente a proteiacutena

As amostras com aw 022 053 e 074 irradiadas com diferentes doses de

radiaccedilatildeo mostraram o mesmo tipo de perfil no cromatograma Parte da β-LG que natildeo foi

hidrolisada continua presente ainda que em proporccedilatildeo diferente com respeito aos

peptiacutedeos liberados para cada dose de radiaccedilatildeo como eacute mostrado mais adiante

mediante caacutelculo relativo das aacutereas dos picos nos cromatogramas Na regiatildeo dos

peptiacutedeos peacutepticos os principais picos e intensidade relativa entre eles foram mantidos

(resultados natildeo mostrados)


Quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada maior foi a degradaccedilatildeo da β-LG pela

enzima originando maior quantidade relativa de peptiacutedeos como mostrado pelas aacutereas

dos cromatogramas apresentados na Figura 46 A aw das amostras natildeo foi importante no

aumento da digestibilidade

β-LG Var A Var B

Peptiacutedeos peacutepticos

Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)


Figura 46 Aacutereas nos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes doses (0 10 25 e 50 kGy) Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)

Para melhor avaliaccedilatildeo da accedilatildeo da pepsina sobre a proteiacutena irradiada utilizou-se

tambeacutem o meacutetodo espectrofotomeacutetrico descrito por Reddy Kella e Kinsella (1988) no

qual apoacutes a hidroacutelise separa-se a proteiacutena do material hidrolisado por precipitaccedilatildeo com

TCA O conteuacutedo proteacuteico do hidrolisado no sobrenadante eacute medido por absorbacircncia a

280 nm Os resultados satildeo mostrados na Figura 47

00

01

02

03

04

05

06

1

2

344

1

2

3

4

1

2

3

4

abb

a

aaa

aaaa

aa

Abs

orbacirc

ncia

(UA

)

0 10 25 50

Dose irradiaccedilatildeo (kGy)

aw 022 aw 053 aw 074

Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)

20

30

40

50

60

a

111

2

1231

233

1

3

a

a

a

a

a

baa

a

b

a

0 10 25 50

Pep

tiacutedeo

s (

aacutere

a)

Dose de irradiaccedilatildeo (kGy)

aw022 aw053 aw074


As medidas espectromeacutetricas realizadas para avaliar o conteuacutedo de peptiacutedeos

liberados na proteoacutelise (Figura 47) mostraram semelhanccedila com os resultados obtidos pelo

meacutetodo cromatograacutefico (Figura 46) seguindo a tendecircncia de aumento da quantidade de

peptiacutedeos liberados quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada

A aw das amostras quando irradiadas natildeo foi determinante para as variaccedilotildees

encontradas na susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina O aumento na

digestibilidade pela pepsina foi mais relacionado agrave dose de radiaccedilatildeo aplicada como

observado nas Figuras 46 e 47 Pode-se concluir que a irradiaccedilatildeo da β-LG na forma soacutelida natildeo alterou a

susceptibilidade da proteiacutena agrave accedilatildeo da tripsina na faixa de irradiaccedilatildeo e aw estudadas No

entanto a proteiacutena mostrou-se menos resistente a accedilatildeo da pepsina quanto maior a dose

de radiaccedilatildeo

6 Consideraccedilotildees finais 93

6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS



As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo circular satildeo meacutetodos

geralmente utilizados para avaliar alteraccedilotildees de conformaccedilatildeo das proteiacutenas ao niacutevel de

estrutura terciaacuteria As medidas que satildeo obtidas por estas teacutecnicas estatildeo relacionadas com

o ambiente do Trp na proteiacutena (CALLIS et al 1997) No caso da proteiacutena ser desnaturada

por efeito de tratamento teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica alteraccedilotildees no comprimento

de onda da maacutexima intensidade de fluorescecircncia assim como perda de sinal de

dicroiacutesmo no UV proacuteximo podem ser observadas No presente estudo os resultados de

fluorescecircncia intriacutenseca embora tendo sugerido alteraccedilotildees na conformaccedilatildeo da β-LG

irradiada em soluccedilatildeo por ocorrecircncia de deslocamento para o vermelho do comprimento

de onda do maacuteximo da fluorescecircncia do Trp natildeo representam neste experimento o

mesmo significado no grau de alteraccedilotildees estruturais que em outros tratamentos como o

teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica O deslocamento para o vermelho natildeo foi

acompanhado do aumento da intensidade de fluorescecircncia que normalmente ocorre no

processo de desnaturaccedilatildeo da β-LG (MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L

1999a YANG et al 2001) Os resultados de dicroiacutesmo circular no UV-proacuteximo da

proteiacutena irradiada mostraram perda do sinal de dicroiacutesmo o que sugere uma maior

exposiccedilatildeo do Trp ao solvente geralmente relacionada agrave perda da estrutura terciaacuteria da

proteiacutena (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999b KUWAJIMA YAMAYA SUGAI

1999)

Como os resiacuteduos de aminoaacutecidos aromaacuteticos como o Trp satildeo sensiacuteveis agrave

radiaccedilatildeo gama e podem sofrer degradaccedilatildeo (GARRISON 1987) a perda de resiacuteduos de

Trp resultaria em diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca e do sinal de

dicroiacutesmo Isto sugere que as teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo

circular natildeo conduziram a resultados conclusivos neste estudo pela possibilidade de ter

ocorrido degradaccedilatildeo do resiacuteduo de Trp no processo de irradiaccedilatildeo e consequumlentemente

ter influenciado nos resultados superestimando o grau de alteraccedilatildeo conformacional

A conformaccedilatildeo estrutural ao niacutevel de estrutura terciaacuteria e quaternaacuteria pode

tambeacutem ser avaliada por SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC As anaacutelises das

amostras irradiadas soacutelidas mostraram similaridade nos resultados com relaccedilatildeo agrave amostra

natildeo irradiada (nativa) indicando nenhuma ou pequenas alteraccedilotildees estruturais devido agrave

irradiaccedilatildeo independente do grau de hidrataccedilatildeo das proteiacutenas Os resultados obtidos para

as amostras irradiadas em soluccedilatildeo foram diferentes dos obtidos para a proteiacutena natildeo


irradiada evidenciando a formaccedilatildeo de agregados mesmo considerando-se que os

resultados de dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo tenham sugerido a preservaccedilatildeo das

estruturas secundaacuterias da proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo Os espectros de CD no UV-

longiacutenquo dos oligocircmeros formados na β-LG irradiada em soluccedilatildeo foram em geral muito

semelhantes aos reportados na literatura para os diacutemeros e tetracircmeros originados no

primeiro estaacutegio do aquecimento teacutermico (CARROTA et al 2001) A quantificaccedilatildeo das

estruturas secundaacuterias das amostras irradiadas que apresentaram oligomerizaccedilatildeo natildeo

mostraram diferenccedilas significativas nos conteuacutedos de heacutelices-α estruturas β e

desordenadas (Tabela 6) com respeito as amostras natildeo irradiadas (natildeo oligomerizadas)

A maioria dos relatos na literatura sobre oligocircmeros produzidos por aquecimento mostram

diminuiccedilatildeo das heacutelices-α e das estruturas β em favor do aumento das estruturas

desordenadas quando comparadas as amostras de β-LG sem tratamento Como pode

ser observado resultados conflitantes no conteuacutedo de estruturas secundaacuterias foram

obtidos a partir de espectros muito similares no UV-longiacutenquo o que sugere a

necessidade de explorar convenientemente os comprimentos de onda lt190 nm que

conhecidamente proporcionam dados mais confiaacuteveis das diferentes estruturas (KELLY

PRICE 1997) Medidas deste tipo satildeo possiacuteveis ao utilizar-se luz siacutencrotron que permite

a obtenccedilatildeo de espectros de alta qualidade ateacute comprimentos de onda de 160 nm no ultra-

violeta no vaacutecuo (WALLACE 2000)

A monomerizaccedilatildeo da β-LG natildeo foi observada em niacuteveis que pude-se ser detectada

por SE-HPLC onde natildeo foi observado o pico com massa menor que o diacutemero (~35 kDa)

como mostrado nas Figuras 24 e 25 Pelas medidas de SAXS o menor Rg das moleacuteculas

correspondeu ao estado de diacutemero com Rg ~ 24 Aring similar aos encontrados na literatura

(VERHEUL et al 1999 CARROTA et al 2003) natildeo sendo detectada a conformaccedilatildeo

monomeacuterica Nos agregados os dados de Rg e massa molar tambeacutem natildeo comportaram

composiccedilatildeo de triacutemeros ou pentacircmeros etc sinal da ausecircncia de monocircmeros no

sistema A ausecircncia da β-LG diacutemero em estado desnaturado pode ser constatada pela

observaccedilatildeo da relaccedilatildeo de ambos paracircmetros Rg e massa molecular apresentados na

Tabela 10

Os oligocircmeros formados devido agrave irradiaccedilatildeo mostraram alto grau de compacidade

da sua estrutura possivelmente pela preservaccedilatildeo da maior parte da estrutura terciaacuteria da

proteiacutena com a manutenccedilatildeo do nuacutecleo hidrofoacutebico e pelas ligaccedilotildees cruzadas formadas

entre as moleacuteculas de β-LG Os oligocircmeros formados e analisados por SAXS em

amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 10 kGy parecem ajustar-se bem a modelos de


moleacuteculas linearmente agregadas e bem estruturadas Ligaccedilotildees cruzadas ldquobitirosilrdquo entre

moleacuteculas de diacutemeros de β-LG parecem ser as principais responsaacuteveis pela formaccedilatildeo de

poliacutemeros de alta massa molar muacuteltiplos de diacutemero O tipo de oligomerizaccedilatildeo induzido

pela irradiaccedilatildeo assemelha-se agrave produzida nos primeiros estaacutegios do tratamento teacutermico agrave

temperaturas entre 65-70degC (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 CARROTA et al 2001

CARROTA et al 2003) Nesta faixa de temperatura as moleacuteculas de β-LG natildeo

apresentam desnaturaccedilatildeo suficiente para expor um grande nuacutemero de grupos

hidrofoacutebicos que levem agrave uma agregaccedilatildeo desordenada caracteriacutestica de tratamento

teacutermico mais severo (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 MANDERSON

CREAMER HARDMAN 1999b CARROTA et al 2001) A agregaccedilatildeo ordenada permitiu

que amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 50 kGy em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de

proteiacutena mostraram-se completamente liacutempidas e transluacutecidas sem diferenccedilas

significativas nos valores de transmitacircncia medida agrave 550 nm mostrando que os

agregados formados foram soluacuteveis nestas condiccedilotildees do estudo (tampatildeo fosfato de soacutedio

10 mM e pH 7)

Eacute conhecido que a radiaccedilatildeo com raios gama produz diversas alteraccedilotildees quiacutemicas

como de oxidaccedilatildeo e quebra de alguns grupos nos resiacuteduos de aminoaacutecidos ou ateacute

fragmentaccedilatildeo da cadeia principal e formaccedilatildeo de radicais livres (GARRISON 1981)

Embora nem todos estes efeitos tenham sido avaliados neste experimento eacute possiacutevel que

tenham sido responsaacuteveis pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo ao causar alteraccedilotildees na

distribuiccedilatildeo de carga da proteiacutena com a formaccedilatildeo de radicais livres e contribuiacutedo para

uma maior flexibilidade da moleacutecula Os resultados das anaacutelises indicam que as

alteraccedilotildees conformacionais ocorridas foram menores que as normalmente observadas em

outros tratamentos como teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica onde a desnaturaccedilatildeo da

proteiacutena eacute relevante e agregados insoluacuteveis satildeo formados

Os resultados no presente trabalho mostram que natildeo houve diminuiccedilatildeo da

digestibilidade e nem alteraccedilotildees estruturais que comprometessem a funcionalidade da

proteiacutena irradiada no estado soacutelido com doses de ateacute 10 kGy Estudo anterior (VOISINE

PARENT SAVOIE 1990) tambeacutem mostra que natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo na

composiccedilatildeo aminoaciacutedica e na digestibilidade in vitro da β-LG irradiada ateacute 50 kGy

submetida a proteoacutelise sob accedilatildeo da pepsina e pancreatina avaliada pelo conteuacutedo de

nitrogecircnio e conteuacutedo de aminoaacutecidos no material hidrolisado Como no processamento

de alimentos geralmente satildeo utilizadas doses de radiaccedilatildeo ateacute um maacuteximo de 10 kGy

estes resultados sugerem que a irradiaccedilatildeo da proteiacutena ateacute com dose de 10 kGy poderia


ser aplicada para melhorar a sua qualidade microbioloacutegica e obter β-LG adequada para

ser incluiacuteda em dietas proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade No entanto tratando-

se de proteiacutena proveniente de leite cuidados devem ser tomados para que a dose de

radiaccedilatildeo a ser empregada natildeo cause a formaccedilatildeo de aromas desagradaacuteveis que poderatildeo

surgir principalmente da degradaccedilatildeo de resiacuteduos de aminoaacutecidos que possuem grupo

tiol (CRAWFORD RUFF 1996)

Tendo em vista os resultados obtidos no presente trabalho algumas alteraccedilotildees de

funcionalidade da β-LG pela radiaccedilatildeo reportados em estudos anteriores podem ser

complementados ou melhor explicados No estudo de Lee et al (2001) foi relatado que a

irradiaccedilatildeo com raios gama reduziu a alergenicidade de proteiacutenas do leite Segundo os

autores a diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas avaliadas pelo meacutetodo ELISA era

resultado de possiacuteveis alteraccedilotildees estruturais dos epiacutetopos e aglomeraccedilatildeo das proteiacutenas

por efeito da radiaccedilatildeo gama Os resultados do presente trabalho sugerem que a

diminuiccedilatildeo da alergenicidade da β-LG irradiada reportada por Lee et al (2001) pode ser

decorrente do efeito de recobrimento de alguns siacutetios na superfiacutecie da proteiacutena devido agrave

oligomerizaccedilatildeo das moleacuteculas mascarando assim os epiacutetopos da proteiacutena alergecircnica

sem ter havido no entanto significativas alteraccedilotildees estruturais na proteiacutena

Le Tien et al (2000) relataram que filmes obtidos de soluccedilotildees contendo proteiacutenas

do soro de leite (50 mgmL) na sua formulaccedilatildeo irradiadas com radiaccedilatildeo gama em doses

de 32-64 kGy apresentaram boas propriedades mecacircnicas atribuiacutedas pelos autores ao

tipo de ligaccedilotildees cruzadas produzidas (bitirosinas) o que resultou em filmes com estrutura

mais ordenada (estudo por difraccedilatildeo de raios X) e mais estaacutevel que os obtidos por

aquecimento No presente estudo como anteriormente mostrado (Figura 42) foi

constatada a produccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil na β-LG (principal componente das proteiacutenas

do soro de leite) irradiada em soluccedilatildeo confirmando analiticamente o relatado por Le Tien

et al (2000) Observamos tambeacutem que a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil eacute maior quanto

mais diluiacuteda a proteiacutena Baseado nisso eacute possiacutevel supor que diminuindo a concentraccedilatildeo

de proteiacutena nas soluccedilotildees (lt50 mgmL) menores doses de radiaccedilatildeo poderiam ser

suficientes para obter resultados similares aos de Le Tien et al (2000)

98

7 Conclusotildees 99

7 CONCLUSOtildeES


7 CONCLUSOtildeES

Os resultados do presente trabalho confirmaram que os efeitos da radiaccedilatildeo gama na

proteiacutena dependem das condiccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas na qual a proteiacutena eacute irradiada Neste

trabalho os efeitos da irradiaccedilatildeo na β-LG soacutelida mesmo com diferentes graus de

hidrataccedilatildeo foram despreziacuteveis quando comparados ao observado na proteiacutena irradiada

em soluccedilatildeo

A radiaccedilatildeo em doses de ateacute 10 kGy natildeo promoveu alteraccedilotildees estruturais que

levassem a perda da funcionalidade ou da digestibilidade da β-LG irradiada no estado

soacutelido o que sugere que este tratamento poderia ser aplicado para melhorar a qualidade

microbioloacutegica da proteiacutena eou obter β-LG adequada para ser incluiacuteda em dietas

proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade

Para a β-LG irradiada em soluccedilatildeo o estudo de SAXS mostrou alteraccedilotildees nos

paracircmetros de espalhamento que indicaram a formaccedilatildeo de agregados de moleacuteculas de β-

LG e com ajuda da construccedilatildeo de modelos foi possiacutevel descrever estes agregados como

sendo muacuteltiplos de diacutemeros de β-LG linearmente ordenados (tetracircmeros hexacircmeros

etc)

O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG que inclui formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas de

bitirosil mostrou-se diferente do que tem sido reportado para outros tratamentos fiacutesicos

como o teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica podendo gerar agregados com

caracteriacutesticas e propriedades diferentes o que poderia ampliar a sua aplicabilidade pela

industria de alimentos

As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca e dicroiacutesmo circular no UV proacuteximo natildeo foram

conclusivas na avaliaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura terciaacuteria devido

agrave possiacutevel influecircncia de perdas do cromoacuteforo Trp decorrentes da irradiaccedilatildeo No entanto

as teacutecnicas de SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC foram apropriadas para a

elucidaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais e do processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena

8 Referecircncias Bibliograacuteficas 101

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ii

FICHA CATALOGRAacuteFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA FEA ndash UNICAMP

Titulo em inglecircs Gamma radiation effects on β-lactoglobulin structural modifications and aggregation Palavras-chave em inglecircs (Keywords) Circular dichroism Proteins ndash Aggregation X-ray ndash Small-angle scattering Whey ndash Proteins Aacuterea de concentraccedilatildeo Nutriccedilatildeo Experimental Aplicada agrave Tecnologia de Alimentos Titulaccedilatildeo Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo Banca examinadora Flaacutevia Maria Netto Valdemiro Carlos Sgarbieri Iacuteris Torriani Francisco Teixeira Pessine Maria Teresa Bertoldo Pacheco Susy Frei Sabato Programa de Poacutes Graduaccedilatildeo Programa em Alimentos e Nutriccedilatildeo

Hoz Urrejola Luciacutea del Carmen de la H856e Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-lactoglobulina modificaccedilotildees

estruturais e agregaccedilatildeo Luciacutea del Carmen de la Hoz Urrejola -- Campinas SP [sn] 2006

Orientador Flaacutevia Maria Netto Tese (doutorado) ndash Universidade Estadual de CampinasFaculdade

de Engenharia de Alimentos 1 Dicroiacutesmo circular 2 Proteiacutenas ndash Agregaccedilatildeo 3 Raios X ndash

Espalhamento a baixo acircngulo 4 Soro do leite ndash Proteiacutenas I Netto Flaacutevia Maria II Universidade Estadual de CampinasFaculdade de Engenharia de Alimentos III Tiacutetulo

iii



AGREGACcedilAtildeO




Orientadora

Campinas -SP 2006

iv

v

BANCA EXAMINADORA








vi

vii

Em especial dedico



viii

ix

AGRADECIMENTOS













do projeto de tese


opiniotildees





disfrutadas juntas



x

xi



amostras





















desta tese


xii

xiii

IacuteNDICE



RESUMO xxix

ABSTRACT xxxiii


2 OBJETIVOS 5

21 Geral 6


















xiv

xv











42 Meacutetodos 35


















xvi

xvii










SAXS 67










xviii

xix

LISTA DE TABELAS


35


35


49


49


56


60


62


71


78

xx

xxi

LISTA DE FIGURAS


10


25


29


42


43


45


46


51


51


52


53


53

xxii

xxiii


54


54


55


57


58


58


63


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67


69


70

xxiv

xxv


72


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74


75


76


77


84


85


86

xxvi

xxvii


88


89


90


91


91

xxviii

xxix


RESUMO






























xxx

xxxi



kGy)



xxxii

xxxiii


ABSTRACT





























xxxiv

xxxv





xxxvi






















































































2 Objetivos 5

2 OBJETIVOS

2 Objetivos 6

2 OBJETIVOS

21 Objetivo Geral









































2002)




















McSWEENEY 1998)































espumantes






1992)

















































































atividade


























KINSELLA 1988)



















GIAMPIETRO 1998)











VIRTANEN 2000)














identificados





















(HUFFMAN 1996)















SCHER BANON 2002)

































pH


































KITABATAKE 2001)















HUYGHEBAERT 1997)
































2004)




















(DIAS 2003)








(CORRY et al 1995)





























































soluccedilatildeo


































circular







nm (WALLACE 2000)







rdmr nlc

Msdotsdot

sdotθ=θ (1)



(KELLY PRICE 1997)








conhecidas









1986)
























entre 255 e 270 nm


















(1982) entre outros













Sendo

θ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ π

= senq1

4 (2)


utilizada

drqr






π=

0221

(4)


Dmax



rdr)r(p

drr)r(pR maxR

maxR

g

intint=

0

2

02

2 (5)






(6)

_M)()(I νρ∆= 1

21 0 (7)

_)(

)(IMνρ∆

=2

11

0 (8)




espalhadora

νρ∆

=)()(INM A

M 21 0

(9)

221 0 V)()(I ρ∆=









FOURNET 1955)








4


Fosforescecircncia

S0

S1

























(CHEN BARKLEY 1998)




















(CALLIS 1997)












32








Reagentes































42 Meacutetodos
















Tratamento Dose kGy







Tratamento Dose kGy































































et al 1984)
















5 nm













Transmitacircncia





Absorbacircncia












KINSELLA 1988)






(1997)











em 214 nm


























































A

B

β-LG Var B Var A

β-LG Var A e B

M(kDa) 94 67 43 30 201 144

1 2 1 2






















β-LG Var B

β-LG Var A Abs

(UA)








(ZAKS 1992)



















280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000

A

C0A1 C10A1 C25A1 C50A1

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

C0A2 C10A2 C25A2 C50A2

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000C

C0A3 C10A3 C25A3 C50A3

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)











280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000A

343nm

339nm

336nm333nm

C0S10 C10S10 C25S10 C50S10

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

345nm

348nm

333nm

C0S3 C10S3 C25S3 C50S3

Inte

nsid

ade

fluor

escecirc

ncia

(UA

)



















respectivamente




























































correspondente




CDSSTR 13 33 23 29

SELCON 143 341 226 269








literatura






SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997

SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997


























180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A1 C10A1 C50A1

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)

comprimento de onda



180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A2 C10A2 C50A2

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A3 C10A3 C50A3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)



C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100

C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100

C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100













radiaccedilatildeo

240 260 280 300 320 340 360

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-05

00

05

C0A1 C10A1 C50A1

CD



(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)

240 260 280 300 320 340 360

-4

-3

-2

-1

0

C0A2 C10A2 C50A2

CD



com 50 kGy (C50A2)


240 260 280 300 320 340 360-5

-4

-3

-2

-1

0

C0A3 C10A3 C50A3

CD



com 50 kGy (C50A3)





180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S10 C10S10 C50S10




[θ]

(deg

cm

2 dm

ol-1

)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270

-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S3 C10S3 C50S3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)














significativas





10mgmL)


C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99

C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100



































2001)















1 2

3

4

123

4











240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

C0S10 C10S10 C50S10

C D

comprimento de onda



240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

1

C0S3 C10S3 C50S3C

D










(Figura 20)








estruturas β e α




























aw 022


aw 053


aw 074


3 mgmL


10 mgmL


























(GARRISON 1987)


















Transmitacircncia

β-LG


aw 022


aw


aw 074


3 mgmL


10 mgmL
















A B C

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

1 2 3

F

1 2 3

β-LG

D

1 2 3

β-LG

r

E

β-LG

r r





de 10 5 25 1 e 0 kGy

















A B

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

β-LG Var B Var A






0 2 4 6 8 10 12

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10 35kDa

Abs

orbacirc

ncia

a 2

80nm

(UA

)


C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1








no volume morto











amostra C25S3











kGy

















GNOM






















00 01 02 03 041E-4

1E-3

001In

tens

idad

e (U

A)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80

0

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C0A1 C0A2 C0A3

00 01 02 03 0400

20x10-5

40x10-5

60x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]





C0A3













A

C

B

D














00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C5A1 C5A2 C5A3

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

7x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1BEB FIT

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]




A

C

B

D
































respectivamente


00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C10A1 C10A2 C10A3

00 01 02 03 040

2x10-5

4x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]









proteiacutena



C D

A B




00 01 02 03 04

10-4

10-3

10-2

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

40x10-5

80x10-5

12x10-4

p(r)

r[Aring]

C25A1 C25A2 C25A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

Iq2 (a

rb u

)

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)










B A

C D


00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

20x10-5

40x10-5

60x10-5

80x10-5

10x10-4

12x10-4

14x10-4

p (r)

r[Aring]

C50A1 C50A2 C50A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

I q

2

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)














A B

C D









00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C0S3 C0S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]








na Tabela 10

A B

DC











00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

1x10-4

p(r)

r[Aring]

C5S3 C5S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]




de 5 kGy



DC

BA









(Figura 33D)

00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 50 100 150 200 2500

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C10S3 C10S10

00 01 02 030

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]

C10S10 C10S10 FIT

Dro0075 Ra1400





A

D

B

C






e 10 kGy)






















caso










agregados maiores














( ) ( )( ) ( )22

22


tetracircmero


minus

minus=

(11)










00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]







35















000 005 010 015 0201E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


























00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]























proteiacutena


























MkDa 940 670 430 300 201 144

β-LG

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

MkDa 940 670 430 300 201 144

B A

β-LG


















natildeo irradiada

























0

200

400

600

800

1000

1200

2

1

333

1

2

333

1

2

333 22122

c

a

b

d

a

b

c

daabbaabbabbc


Fluo

resc

enci

a a

411

nm (U

A)

amostras de β-LG





































































Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)




















β-LG Var A Var B


Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)








00

01

02

03

04

05

06

1

2

344

1

2

3

4

1

2

3

4

abb

a

aaa

aaaa

aa

Abs

orbacirc

ncia

(UA

)

0 10 25 50


aw 022 aw 053 aw 074


20

30

40

50

60

a

111

2

1231

233

1

3

a

a

a

a

a

baa

a

b

a

0 10 25 50

Pep

tiacutedeo

s (

aacutere

a)


aw022 aw053 aw074



































1999)











































Tabela 10





















10 mM e pH 7)


















































98


7 CONCLUSOtildeES


7 CONCLUSOtildeES















etc)











































iii



AGREGACcedilAtildeO




Orientadora

Campinas -SP 2006

iv

v

BANCA EXAMINADORA








vi

vii

Em especial dedico



viii

ix

AGRADECIMENTOS













do projeto de tese


opiniotildees





disfrutadas juntas



x

xi



amostras





















desta tese


xii

xiii

IacuteNDICE



RESUMO xxix

ABSTRACT xxxiii


2 OBJETIVOS 5

21 Geral 6


















xiv

xv











42 Meacutetodos 35


















xvi

xvii










SAXS 67










xviii

xix

LISTA DE TABELAS


35


35


49


49


56


60


62


71


78

xx

xxi

LISTA DE FIGURAS


10


25


29


42


43


45


46


51


51


52


53


53

xxii

xxiii


54


54


55


57


58


58


63


64


65


66


67


69


70

xxiv

xxv


72


73


74


75


76


77


84


85


86

xxvi

xxvii


88


89


90


91


91

xxviii

xxix


RESUMO






























xxx

xxxi



kGy)



xxxii

xxxiii


ABSTRACT





























xxxiv

xxxv





xxxvi






















































































2 Objetivos 5

2 OBJETIVOS

2 Objetivos 6

2 OBJETIVOS

21 Objetivo Geral









































2002)




















McSWEENEY 1998)































espumantes






1992)

















































































atividade


























KINSELLA 1988)



















GIAMPIETRO 1998)











VIRTANEN 2000)














identificados





















(HUFFMAN 1996)















SCHER BANON 2002)

































pH


































KITABATAKE 2001)















HUYGHEBAERT 1997)
































2004)




















(DIAS 2003)








(CORRY et al 1995)





























































soluccedilatildeo


































circular







nm (WALLACE 2000)







rdmr nlc

Msdotsdot

sdotθ=θ (1)



(KELLY PRICE 1997)








conhecidas









1986)
























entre 255 e 270 nm


















(1982) entre outros













Sendo

θ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ π

= senq1

4 (2)


utilizada

drqr






π=

0221

(4)


Dmax



rdr)r(p

drr)r(pR maxR

maxR

g

intint=

0

2

02

2 (5)






(6)

_M)()(I νρ∆= 1

21 0 (7)

_)(

)(IMνρ∆

=2

11

0 (8)




espalhadora

νρ∆

=)()(INM A

M 21 0

(9)

221 0 V)()(I ρ∆=









FOURNET 1955)








4


Fosforescecircncia

S0

S1

























(CHEN BARKLEY 1998)




















(CALLIS 1997)












32








Reagentes































42 Meacutetodos
















Tratamento Dose kGy







Tratamento Dose kGy































































et al 1984)
















5 nm













Transmitacircncia





Absorbacircncia












KINSELLA 1988)






(1997)











em 214 nm


























































A

B

β-LG Var B Var A

β-LG Var A e B

M(kDa) 94 67 43 30 201 144

1 2 1 2






















β-LG Var B

β-LG Var A Abs

(UA)








(ZAKS 1992)



















280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000

A

C0A1 C10A1 C25A1 C50A1

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

C0A2 C10A2 C25A2 C50A2

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000C

C0A3 C10A3 C25A3 C50A3

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)











280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000A

343nm

339nm

336nm333nm

C0S10 C10S10 C25S10 C50S10

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

345nm

348nm

333nm

C0S3 C10S3 C25S3 C50S3

Inte

nsid

ade

fluor

escecirc

ncia

(UA

)



















respectivamente




























































correspondente




CDSSTR 13 33 23 29

SELCON 143 341 226 269








literatura






SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997

SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997


























180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A1 C10A1 C50A1

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)

comprimento de onda



180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A2 C10A2 C50A2

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A3 C10A3 C50A3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)



C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100

C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100

C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100













radiaccedilatildeo

240 260 280 300 320 340 360

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-05

00

05

C0A1 C10A1 C50A1

CD



(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)

240 260 280 300 320 340 360

-4

-3

-2

-1

0

C0A2 C10A2 C50A2

CD



com 50 kGy (C50A2)


240 260 280 300 320 340 360-5

-4

-3

-2

-1

0

C0A3 C10A3 C50A3

CD



com 50 kGy (C50A3)





180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S10 C10S10 C50S10




[θ]

(deg

cm

2 dm

ol-1

)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270

-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S3 C10S3 C50S3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)














significativas





10mgmL)


C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99

C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100



































2001)















1 2

3

4

123

4











240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

C0S10 C10S10 C50S10

C D

comprimento de onda



240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

1

C0S3 C10S3 C50S3C

D










(Figura 20)








estruturas β e α




























aw 022


aw 053


aw 074


3 mgmL


10 mgmL


























(GARRISON 1987)


















Transmitacircncia

β-LG


aw 022


aw


aw 074


3 mgmL


10 mgmL
















A B C

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

1 2 3

F

1 2 3

β-LG

D

1 2 3

β-LG

r

E

β-LG

r r





de 10 5 25 1 e 0 kGy

















A B

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

β-LG Var B Var A






0 2 4 6 8 10 12

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10 35kDa

Abs

orbacirc

ncia

a 2

80nm

(UA

)


C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1








no volume morto











amostra C25S3











kGy

















GNOM






















00 01 02 03 041E-4

1E-3

001In

tens

idad

e (U

A)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80

0

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C0A1 C0A2 C0A3

00 01 02 03 0400

20x10-5

40x10-5

60x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]





C0A3













A

C

B

D














00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C5A1 C5A2 C5A3

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

7x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1BEB FIT

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]




A

C

B

D
































respectivamente


00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C10A1 C10A2 C10A3

00 01 02 03 040

2x10-5

4x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]









proteiacutena



C D

A B




00 01 02 03 04

10-4

10-3

10-2

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

40x10-5

80x10-5

12x10-4

p(r)

r[Aring]

C25A1 C25A2 C25A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

Iq2 (a

rb u

)

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)










B A

C D


00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

20x10-5

40x10-5

60x10-5

80x10-5

10x10-4

12x10-4

14x10-4

p (r)

r[Aring]

C50A1 C50A2 C50A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

I q

2

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)














A B

C D









00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C0S3 C0S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]








na Tabela 10

A B

DC











00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

1x10-4

p(r)

r[Aring]

C5S3 C5S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]




de 5 kGy



DC

BA









(Figura 33D)

00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 50 100 150 200 2500

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C10S3 C10S10

00 01 02 030

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]

C10S10 C10S10 FIT

Dro0075 Ra1400





A

D

B

C






e 10 kGy)






















caso










agregados maiores














( ) ( )( ) ( )22

22


tetracircmero


minus

minus=

(11)










00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]







35















000 005 010 015 0201E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


























00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]























proteiacutena


























MkDa 940 670 430 300 201 144

β-LG

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

MkDa 940 670 430 300 201 144

B A

β-LG


















natildeo irradiada

























0

200

400

600

800

1000

1200

2

1

333

1

2

333

1

2

333 22122

c

a

b

d

a

b

c

daabbaabbabbc


Fluo

resc

enci

a a

411

nm (U

A)

amostras de β-LG





































































Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)




















β-LG Var A Var B


Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)








00

01

02

03

04

05

06

1

2

344

1

2

3

4

1

2

3

4

abb

a

aaa

aaaa

aa

Abs

orbacirc

ncia

(UA

)

0 10 25 50


aw 022 aw 053 aw 074


20

30

40

50

60

a

111

2

1231

233

1

3

a

a

a

a

a

baa

a

b

a

0 10 25 50

Pep

tiacutedeo

s (

aacutere

a)


aw022 aw053 aw074



































1999)











































Tabela 10





















10 mM e pH 7)


















































98


7 CONCLUSOtildeES


7 CONCLUSOtildeES















etc)











































iv

v

BANCA EXAMINADORA








vi

vii

Em especial dedico



viii

ix

AGRADECIMENTOS













do projeto de tese


opiniotildees





disfrutadas juntas



x

xi



amostras





















desta tese


xii

xiii

IacuteNDICE



RESUMO xxix

ABSTRACT xxxiii


2 OBJETIVOS 5

21 Geral 6


















xiv

xv











42 Meacutetodos 35


















xvi

xvii










SAXS 67










xviii

xix

LISTA DE TABELAS


35


35


49


49


56


60


62


71


78

xx

xxi

LISTA DE FIGURAS


10


25


29


42


43


45


46


51


51


52


53


53

xxii

xxiii


54


54


55


57


58


58


63


64


65


66


67


69


70

xxiv

xxv


72


73


74


75


76


77


84


85


86

xxvi

xxvii


88


89


90


91


91

xxviii

xxix


RESUMO






























xxx

xxxi



kGy)



xxxii

xxxiii


ABSTRACT





























xxxiv

xxxv





xxxvi






















































































2 Objetivos 5

2 OBJETIVOS

2 Objetivos 6

2 OBJETIVOS

21 Objetivo Geral









































2002)




















McSWEENEY 1998)































espumantes






1992)

















































































atividade


























KINSELLA 1988)



















GIAMPIETRO 1998)











VIRTANEN 2000)














identificados





















(HUFFMAN 1996)















SCHER BANON 2002)

































pH


































KITABATAKE 2001)















HUYGHEBAERT 1997)
































2004)




















(DIAS 2003)








(CORRY et al 1995)





























































soluccedilatildeo


































circular







nm (WALLACE 2000)







rdmr nlc

Msdotsdot

sdotθ=θ (1)



(KELLY PRICE 1997)








conhecidas









1986)
























entre 255 e 270 nm


















(1982) entre outros













Sendo

θ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ π

= senq1

4 (2)


utilizada

drqr






π=

0221

(4)


Dmax



rdr)r(p

drr)r(pR maxR

maxR

g

intint=

0

2

02

2 (5)






(6)

_M)()(I νρ∆= 1

21 0 (7)

_)(

)(IMνρ∆

=2

11

0 (8)




espalhadora

νρ∆

=)()(INM A

M 21 0

(9)

221 0 V)()(I ρ∆=









FOURNET 1955)








4


Fosforescecircncia

S0

S1

























(CHEN BARKLEY 1998)




















(CALLIS 1997)












32








Reagentes































42 Meacutetodos
















Tratamento Dose kGy







Tratamento Dose kGy































































et al 1984)
















5 nm













Transmitacircncia





Absorbacircncia












KINSELLA 1988)






(1997)











em 214 nm


























































A

B

β-LG Var B Var A

β-LG Var A e B

M(kDa) 94 67 43 30 201 144

1 2 1 2






















β-LG Var B

β-LG Var A Abs

(UA)








(ZAKS 1992)



















280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000

A

C0A1 C10A1 C25A1 C50A1

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

C0A2 C10A2 C25A2 C50A2

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000C

C0A3 C10A3 C25A3 C50A3

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)











280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000A

343nm

339nm

336nm333nm

C0S10 C10S10 C25S10 C50S10

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

345nm

348nm

333nm

C0S3 C10S3 C25S3 C50S3

Inte

nsid

ade

fluor

escecirc

ncia

(UA

)



















respectivamente




























































correspondente




CDSSTR 13 33 23 29

SELCON 143 341 226 269








literatura






SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997

SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997


























180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A1 C10A1 C50A1

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)

comprimento de onda



180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A2 C10A2 C50A2

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A3 C10A3 C50A3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)



C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100

C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100

C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100













radiaccedilatildeo

240 260 280 300 320 340 360

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-05

00

05

C0A1 C10A1 C50A1

CD



(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)

240 260 280 300 320 340 360

-4

-3

-2

-1

0

C0A2 C10A2 C50A2

CD



com 50 kGy (C50A2)


240 260 280 300 320 340 360-5

-4

-3

-2

-1

0

C0A3 C10A3 C50A3

CD



com 50 kGy (C50A3)





180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S10 C10S10 C50S10




[θ]

(deg

cm

2 dm

ol-1

)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270

-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S3 C10S3 C50S3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)














significativas





10mgmL)


C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99

C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100



































2001)















1 2

3

4

123

4











240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

C0S10 C10S10 C50S10

C D

comprimento de onda



240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

1

C0S3 C10S3 C50S3C

D










(Figura 20)








estruturas β e α




























aw 022


aw 053


aw 074


3 mgmL


10 mgmL


























(GARRISON 1987)


















Transmitacircncia

β-LG


aw 022


aw


aw 074


3 mgmL


10 mgmL
















A B C

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

1 2 3

F

1 2 3

β-LG

D

1 2 3

β-LG

r

E

β-LG

r r





de 10 5 25 1 e 0 kGy

















A B

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

β-LG Var B Var A






0 2 4 6 8 10 12

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10 35kDa

Abs

orbacirc

ncia

a 2

80nm

(UA

)


C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1








no volume morto











amostra C25S3











kGy

















GNOM






















00 01 02 03 041E-4

1E-3

001In

tens

idad

e (U

A)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80

0

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C0A1 C0A2 C0A3

00 01 02 03 0400

20x10-5

40x10-5

60x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]





C0A3













A

C

B

D














00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C5A1 C5A2 C5A3

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

7x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1BEB FIT

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]




A

C

B

D
































respectivamente


00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C10A1 C10A2 C10A3

00 01 02 03 040

2x10-5

4x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]









proteiacutena



C D

A B




00 01 02 03 04

10-4

10-3

10-2

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

40x10-5

80x10-5

12x10-4

p(r)

r[Aring]

C25A1 C25A2 C25A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

Iq2 (a

rb u

)

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)










B A

C D


00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

20x10-5

40x10-5

60x10-5

80x10-5

10x10-4

12x10-4

14x10-4

p (r)

r[Aring]

C50A1 C50A2 C50A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

I q

2

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)














A B

C D









00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C0S3 C0S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]








na Tabela 10

A B

DC











00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

1x10-4

p(r)

r[Aring]

C5S3 C5S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]




de 5 kGy



DC

BA









(Figura 33D)

00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 50 100 150 200 2500

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C10S3 C10S10

00 01 02 030

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]

C10S10 C10S10 FIT

Dro0075 Ra1400





A

D

B

C






e 10 kGy)






















caso










agregados maiores














( ) ( )( ) ( )22

22


tetracircmero


minus

minus=

(11)










00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]







35















000 005 010 015 0201E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


























00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]























proteiacutena


























MkDa 940 670 430 300 201 144

β-LG

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

MkDa 940 670 430 300 201 144

B A

β-LG


















natildeo irradiada

























0

200

400

600

800

1000

1200

2

1

333

1

2

333

1

2

333 22122

c

a

b

d

a

b

c

daabbaabbabbc


Fluo

resc

enci

a a

411

nm (U

A)

amostras de β-LG





































































Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)




















β-LG Var A Var B


Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)








00

01

02

03

04

05

06

1

2

344

1

2

3

4

1

2

3

4

abb

a

aaa

aaaa

aa

Abs

orbacirc

ncia

(UA

)

0 10 25 50


aw 022 aw 053 aw 074


20

30

40

50

60

a

111

2

1231

233

1

3

a

a

a

a

a

baa

a

b

a

0 10 25 50

Pep

tiacutedeo

s (

aacutere

a)


aw022 aw053 aw074



































1999)











































Tabela 10





















10 mM e pH 7)


















































98


7 CONCLUSOtildeES


7 CONCLUSOtildeES















etc)











































v

BANCA EXAMINADORA








vi

vii

Em especial dedico



viii

ix

AGRADECIMENTOS













do projeto de tese


opiniotildees





disfrutadas juntas



x

xi



amostras





















desta tese


xii

xiii

IacuteNDICE



RESUMO xxix

ABSTRACT xxxiii


2 OBJETIVOS 5

21 Geral 6


















xiv

xv











42 Meacutetodos 35


















xvi

xvii










SAXS 67










xviii

xix

LISTA DE TABELAS


35


35


49


49


56


60


62


71


78

xx

xxi

LISTA DE FIGURAS


10


25


29


42


43


45


46


51


51


52


53


53

xxii

xxiii


54


54


55


57


58


58


63


64


65


66


67


69


70

xxiv

xxv


72


73


74


75


76


77


84


85


86

xxvi

xxvii


88


89


90


91


91

xxviii

xxix


RESUMO






























xxx

xxxi



kGy)



xxxii

xxxiii


ABSTRACT





























xxxiv

xxxv





xxxvi






















































































2 Objetivos 5

2 OBJETIVOS

2 Objetivos 6

2 OBJETIVOS

21 Objetivo Geral









































2002)




















McSWEENEY 1998)































espumantes






1992)

















































































atividade


























KINSELLA 1988)



















GIAMPIETRO 1998)











VIRTANEN 2000)














identificados





















(HUFFMAN 1996)















SCHER BANON 2002)

































pH


































KITABATAKE 2001)















HUYGHEBAERT 1997)
































2004)




















(DIAS 2003)








(CORRY et al 1995)





























































soluccedilatildeo


































circular







nm (WALLACE 2000)







rdmr nlc

Msdotsdot

sdotθ=θ (1)



(KELLY PRICE 1997)








conhecidas









1986)
























entre 255 e 270 nm


















(1982) entre outros













Sendo

θ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ π

= senq1

4 (2)


utilizada

drqr






π=

0221

(4)


Dmax



rdr)r(p

drr)r(pR maxR

maxR

g

intint=

0

2

02

2 (5)






(6)

_M)()(I νρ∆= 1

21 0 (7)

_)(

)(IMνρ∆

=2

11

0 (8)




espalhadora

νρ∆

=)()(INM A

M 21 0

(9)

221 0 V)()(I ρ∆=









FOURNET 1955)








4


Fosforescecircncia

S0

S1

























(CHEN BARKLEY 1998)




















(CALLIS 1997)












32








Reagentes































42 Meacutetodos
















Tratamento Dose kGy







Tratamento Dose kGy































































et al 1984)
















5 nm













Transmitacircncia





Absorbacircncia












KINSELLA 1988)






(1997)











em 214 nm


























































A

B

β-LG Var B Var A

β-LG Var A e B

M(kDa) 94 67 43 30 201 144

1 2 1 2






















β-LG Var B

β-LG Var A Abs

(UA)








(ZAKS 1992)



















280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000

A

C0A1 C10A1 C25A1 C50A1

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

C0A2 C10A2 C25A2 C50A2

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000C

C0A3 C10A3 C25A3 C50A3

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)











280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000A

343nm

339nm

336nm333nm

C0S10 C10S10 C25S10 C50S10

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

345nm

348nm

333nm

C0S3 C10S3 C25S3 C50S3

Inte

nsid

ade

fluor

escecirc

ncia

(UA

)



















respectivamente




























































correspondente




CDSSTR 13 33 23 29

SELCON 143 341 226 269








literatura






SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997

SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997


























180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A1 C10A1 C50A1

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)

comprimento de onda



180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A2 C10A2 C50A2

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A3 C10A3 C50A3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)



C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100

C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100

C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100













radiaccedilatildeo

240 260 280 300 320 340 360

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-05

00

05

C0A1 C10A1 C50A1

CD



(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)

240 260 280 300 320 340 360

-4

-3

-2

-1

0

C0A2 C10A2 C50A2

CD



com 50 kGy (C50A2)


240 260 280 300 320 340 360-5

-4

-3

-2

-1

0

C0A3 C10A3 C50A3

CD



com 50 kGy (C50A3)





180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S10 C10S10 C50S10




[θ]

(deg

cm

2 dm

ol-1

)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270

-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S3 C10S3 C50S3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)














significativas





10mgmL)


C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99

C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100



































2001)















1 2

3

4

123

4











240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

C0S10 C10S10 C50S10

C D

comprimento de onda



240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

1

C0S3 C10S3 C50S3C

D










(Figura 20)








estruturas β e α




























aw 022


aw 053


aw 074


3 mgmL


10 mgmL


























(GARRISON 1987)


















Transmitacircncia

β-LG


aw 022


aw


aw 074


3 mgmL


10 mgmL
















A B C

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

1 2 3

F

1 2 3

β-LG

D

1 2 3

β-LG

r

E

β-LG

r r





de 10 5 25 1 e 0 kGy

















A B

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

β-LG Var B Var A






0 2 4 6 8 10 12

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10 35kDa

Abs

orbacirc

ncia

a 2

80nm

(UA

)


C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1








no volume morto











amostra C25S3











kGy

















GNOM






















00 01 02 03 041E-4

1E-3

001In

tens

idad

e (U

A)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80

0

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C0A1 C0A2 C0A3

00 01 02 03 0400

20x10-5

40x10-5

60x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]





C0A3













A

C

B

D














00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C5A1 C5A2 C5A3

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

7x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1BEB FIT

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]




A

C

B

D
































respectivamente


00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C10A1 C10A2 C10A3

00 01 02 03 040

2x10-5

4x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]









proteiacutena



C D

A B




00 01 02 03 04

10-4

10-3

10-2

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

40x10-5

80x10-5

12x10-4

p(r)

r[Aring]

C25A1 C25A2 C25A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

Iq2 (a

rb u

)

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)










B A

C D


00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

20x10-5

40x10-5

60x10-5

80x10-5

10x10-4

12x10-4

14x10-4

p (r)

r[Aring]

C50A1 C50A2 C50A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

I q

2

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)














A B

C D









00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C0S3 C0S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]








na Tabela 10

A B

DC











00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

1x10-4

p(r)

r[Aring]

C5S3 C5S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]




de 5 kGy



DC

BA









(Figura 33D)

00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 50 100 150 200 2500

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C10S3 C10S10

00 01 02 030

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]

C10S10 C10S10 FIT

Dro0075 Ra1400





A

D

B

C






e 10 kGy)






















caso










agregados maiores














( ) ( )( ) ( )22

22


tetracircmero


minus

minus=

(11)










00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]







35















000 005 010 015 0201E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


























00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]























proteiacutena


























MkDa 940 670 430 300 201 144

β-LG

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

MkDa 940 670 430 300 201 144

B A

β-LG


















natildeo irradiada

























0

200

400

600

800

1000

1200

2

1

333

1

2

333

1

2

333 22122

c

a

b

d

a

b

c

daabbaabbabbc


Fluo

resc

enci

a a

411

nm (U

A)

amostras de β-LG





































































Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)




















β-LG Var A Var B


Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)








00

01

02

03

04

05

06

1

2

344

1

2

3

4

1

2

3

4

abb

a

aaa

aaaa

aa

Abs

orbacirc

ncia

(UA

)

0 10 25 50


aw 022 aw 053 aw 074


20

30

40

50

60

a

111

2

1231

233

1

3

a

a

a

a

a

baa

a

b

a

0 10 25 50

Pep

tiacutedeo

s (

aacutere

a)


aw022 aw053 aw074



































1999)











































Tabela 10





















10 mM e pH 7)


















































98


7 CONCLUSOtildeES


7 CONCLUSOtildeES















etc)











































vi

vii

Em especial dedico



viii

ix

AGRADECIMENTOS













do projeto de tese


opiniotildees





disfrutadas juntas



x

xi



amostras





















desta tese


xii

xiii

IacuteNDICE



RESUMO xxix

ABSTRACT xxxiii


2 OBJETIVOS 5

21 Geral 6


















xiv

xv











42 Meacutetodos 35


















xvi

xvii










SAXS 67










xviii

xix

LISTA DE TABELAS


35


35


49


49


56


60


62


71


78

xx

xxi

LISTA DE FIGURAS


10


25


29


42


43


45


46


51


51


52


53


53

xxii

xxiii


54


54


55


57


58


58


63


64


65


66


67


69


70

xxiv

xxv


72


73


74


75


76


77


84


85


86

xxvi

xxvii


88


89


90


91


91

xxviii

xxix


RESUMO






























xxx

xxxi



kGy)



xxxii

xxxiii


ABSTRACT





























xxxiv

xxxv





xxxvi






















































































2 Objetivos 5

2 OBJETIVOS

2 Objetivos 6

2 OBJETIVOS

21 Objetivo Geral









































2002)




















McSWEENEY 1998)































espumantes






1992)

















































































atividade


























KINSELLA 1988)



















GIAMPIETRO 1998)











VIRTANEN 2000)














identificados





















(HUFFMAN 1996)















SCHER BANON 2002)

































pH


































KITABATAKE 2001)















HUYGHEBAERT 1997)
































2004)




















(DIAS 2003)








(CORRY et al 1995)





























































soluccedilatildeo


































circular







nm (WALLACE 2000)







rdmr nlc

Msdotsdot

sdotθ=θ (1)



(KELLY PRICE 1997)








conhecidas









1986)
























entre 255 e 270 nm


















(1982) entre outros













Sendo

θ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ π

= senq1

4 (2)


utilizada

drqr






π=

0221

(4)


Dmax



rdr)r(p

drr)r(pR maxR

maxR

g

intint=

0

2

02

2 (5)






(6)

_M)()(I νρ∆= 1

21 0 (7)

_)(

)(IMνρ∆

=2

11

0 (8)




espalhadora

νρ∆

=)()(INM A

M 21 0

(9)

221 0 V)()(I ρ∆=









FOURNET 1955)








4


Fosforescecircncia

S0

S1

























(CHEN BARKLEY 1998)




















(CALLIS 1997)












32








Reagentes































42 Meacutetodos
















Tratamento Dose kGy







Tratamento Dose kGy































































et al 1984)
















5 nm













Transmitacircncia





Absorbacircncia












KINSELLA 1988)






(1997)











em 214 nm


























































A

B

β-LG Var B Var A

β-LG Var A e B

M(kDa) 94 67 43 30 201 144

1 2 1 2






















β-LG Var B

β-LG Var A Abs

(UA)








(ZAKS 1992)



















280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000

A

C0A1 C10A1 C25A1 C50A1

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

C0A2 C10A2 C25A2 C50A2

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000C

C0A3 C10A3 C25A3 C50A3

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)











280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000A

343nm

339nm

336nm333nm

C0S10 C10S10 C25S10 C50S10

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

345nm

348nm

333nm

C0S3 C10S3 C25S3 C50S3

Inte

nsid

ade

fluor

escecirc

ncia

(UA

)



















respectivamente




























































correspondente




CDSSTR 13 33 23 29

SELCON 143 341 226 269








literatura






SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997

SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997


























180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A1 C10A1 C50A1

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)

comprimento de onda



180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A2 C10A2 C50A2

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A3 C10A3 C50A3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)



C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100

C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100

C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100













radiaccedilatildeo

240 260 280 300 320 340 360

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-05

00

05

C0A1 C10A1 C50A1

CD



(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)

240 260 280 300 320 340 360

-4

-3

-2

-1

0

C0A2 C10A2 C50A2

CD



com 50 kGy (C50A2)


240 260 280 300 320 340 360-5

-4

-3

-2

-1

0

C0A3 C10A3 C50A3

CD



com 50 kGy (C50A3)





180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S10 C10S10 C50S10




[θ]

(deg

cm

2 dm

ol-1

)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270

-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S3 C10S3 C50S3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)














significativas





10mgmL)


C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99

C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100



































2001)















1 2

3

4

123

4











240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

C0S10 C10S10 C50S10

C D

comprimento de onda



240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

1

C0S3 C10S3 C50S3C

D










(Figura 20)








estruturas β e α




























aw 022


aw 053


aw 074


3 mgmL


10 mgmL


























(GARRISON 1987)


















Transmitacircncia

β-LG


aw 022


aw


aw 074


3 mgmL


10 mgmL
















A B C

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

1 2 3

F

1 2 3

β-LG

D

1 2 3

β-LG

r

E

β-LG

r r





de 10 5 25 1 e 0 kGy

















A B

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

β-LG Var B Var A






0 2 4 6 8 10 12

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10 35kDa

Abs

orbacirc

ncia

a 2

80nm

(UA

)


C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1








no volume morto











amostra C25S3











kGy

















GNOM






















00 01 02 03 041E-4

1E-3

001In

tens

idad

e (U

A)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80

0

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C0A1 C0A2 C0A3

00 01 02 03 0400

20x10-5

40x10-5

60x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]





C0A3













A

C

B

D














00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C5A1 C5A2 C5A3

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

7x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1BEB FIT

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]




A

C

B

D
































respectivamente


00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C10A1 C10A2 C10A3

00 01 02 03 040

2x10-5

4x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]









proteiacutena



C D

A B




00 01 02 03 04

10-4

10-3

10-2

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

40x10-5

80x10-5

12x10-4

p(r)

r[Aring]

C25A1 C25A2 C25A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

Iq2 (a

rb u

)

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)










B A

C D


00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

20x10-5

40x10-5

60x10-5

80x10-5

10x10-4

12x10-4

14x10-4

p (r)

r[Aring]

C50A1 C50A2 C50A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

I q

2

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)














A B

C D









00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C0S3 C0S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]








na Tabela 10

A B

DC











00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

1x10-4

p(r)

r[Aring]

C5S3 C5S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]




de 5 kGy



DC

BA









(Figura 33D)

00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 50 100 150 200 2500

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C10S3 C10S10

00 01 02 030

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]

C10S10 C10S10 FIT

Dro0075 Ra1400





A

D

B

C






e 10 kGy)






















caso










agregados maiores














( ) ( )( ) ( )22

22


tetracircmero


minus

minus=

(11)










00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]







35















000 005 010 015 0201E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


























00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]























proteiacutena


























MkDa 940 670 430 300 201 144

β-LG

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

MkDa 940 670 430 300 201 144

B A

β-LG


















natildeo irradiada

























0

200

400

600

800

1000

1200

2

1

333

1

2

333

1

2

333 22122

c

a

b

d

a

b

c

daabbaabbabbc


Fluo

resc

enci

a a

411

nm (U

A)

amostras de β-LG





































































Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)




















β-LG Var A Var B


Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)








00

01

02

03

04

05

06

1

2

344

1

2

3

4

1

2

3

4

abb

a

aaa

aaaa

aa

Abs

orbacirc

ncia

(UA

)

0 10 25 50


aw 022 aw 053 aw 074


20

30

40

50

60

a

111

2

1231

233

1

3

a

a

a

a

a

baa

a

b

a

0 10 25 50

Pep

tiacutedeo

s (

aacutere

a)


aw022 aw053 aw074



































1999)











































Tabela 10





















10 mM e pH 7)


















































98


7 CONCLUSOtildeES


7 CONCLUSOtildeES















etc)











































vii

Em especial dedico



viii

ix

AGRADECIMENTOS













do projeto de tese


opiniotildees





disfrutadas juntas



x

xi



amostras





















desta tese


xii

xiii

IacuteNDICE



RESUMO xxix

ABSTRACT xxxiii


2 OBJETIVOS 5

21 Geral 6


















xiv

xv











42 Meacutetodos 35


















xvi

xvii










SAXS 67










xviii

xix

LISTA DE TABELAS


35


35


49


49


56


60


62


71


78

xx

xxi

LISTA DE FIGURAS


10


25


29


42


43


45


46


51


51


52


53


53

xxii

xxiii


54


54


55


57


58


58


63


64


65


66


67


69


70

xxiv

xxv


72


73


74


75


76


77


84


85


86

xxvi

xxvii


88


89


90


91


91

xxviii

xxix


RESUMO






























xxx

xxxi



kGy)



xxxii

xxxiii


ABSTRACT





























xxxiv

xxxv





xxxvi






















































































2 Objetivos 5

2 OBJETIVOS

2 Objetivos 6

2 OBJETIVOS

21 Objetivo Geral









































2002)




















McSWEENEY 1998)































espumantes






1992)

















































































atividade


























KINSELLA 1988)



















GIAMPIETRO 1998)











VIRTANEN 2000)














identificados





















(HUFFMAN 1996)















SCHER BANON 2002)

































pH


































KITABATAKE 2001)















HUYGHEBAERT 1997)
































2004)




















(DIAS 2003)








(CORRY et al 1995)





























































soluccedilatildeo


































circular







nm (WALLACE 2000)







rdmr nlc

Msdotsdot

sdotθ=θ (1)



(KELLY PRICE 1997)








conhecidas









1986)
























entre 255 e 270 nm


















(1982) entre outros













Sendo

θ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ π

= senq1

4 (2)


utilizada

drqr






π=

0221

(4)


Dmax



rdr)r(p

drr)r(pR maxR

maxR

g

intint=

0

2

02

2 (5)






(6)

_M)()(I νρ∆= 1

21 0 (7)

_)(

)(IMνρ∆

=2

11

0 (8)




espalhadora

νρ∆

=)()(INM A

M 21 0

(9)

221 0 V)()(I ρ∆=









FOURNET 1955)








4


Fosforescecircncia

S0

S1

























(CHEN BARKLEY 1998)




















(CALLIS 1997)












32








Reagentes































42 Meacutetodos
















Tratamento Dose kGy







Tratamento Dose kGy































































et al 1984)
















5 nm













Transmitacircncia





Absorbacircncia












KINSELLA 1988)






(1997)











em 214 nm


























































A

B

β-LG Var B Var A

β-LG Var A e B

M(kDa) 94 67 43 30 201 144

1 2 1 2






















β-LG Var B

β-LG Var A Abs

(UA)








(ZAKS 1992)



















280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000

A

C0A1 C10A1 C25A1 C50A1

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

C0A2 C10A2 C25A2 C50A2

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000C

C0A3 C10A3 C25A3 C50A3

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)











280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000A

343nm

339nm

336nm333nm

C0S10 C10S10 C25S10 C50S10

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

345nm

348nm

333nm

C0S3 C10S3 C25S3 C50S3

Inte

nsid

ade

fluor

escecirc

ncia

(UA

)



















respectivamente




























































correspondente




CDSSTR 13 33 23 29

SELCON 143 341 226 269








literatura






SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997

SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997


























180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A1 C10A1 C50A1

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)

comprimento de onda



180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A2 C10A2 C50A2

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A3 C10A3 C50A3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)



C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100

C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100

C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100













radiaccedilatildeo

240 260 280 300 320 340 360

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-05

00

05

C0A1 C10A1 C50A1

CD



(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)

240 260 280 300 320 340 360

-4

-3

-2

-1

0

C0A2 C10A2 C50A2

CD



com 50 kGy (C50A2)


240 260 280 300 320 340 360-5

-4

-3

-2

-1

0

C0A3 C10A3 C50A3

CD



com 50 kGy (C50A3)





180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S10 C10S10 C50S10




[θ]

(deg

cm

2 dm

ol-1

)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270

-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S3 C10S3 C50S3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)














significativas





10mgmL)


C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99

C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100



































2001)















1 2

3

4

123

4











240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

C0S10 C10S10 C50S10

C D

comprimento de onda



240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

1

C0S3 C10S3 C50S3C

D










(Figura 20)








estruturas β e α




























aw 022


aw 053


aw 074


3 mgmL


10 mgmL


























(GARRISON 1987)


















Transmitacircncia

β-LG


aw 022


aw


aw 074


3 mgmL


10 mgmL
















A B C

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

1 2 3

F

1 2 3

β-LG

D

1 2 3

β-LG

r

E

β-LG

r r





de 10 5 25 1 e 0 kGy

















A B

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

β-LG Var B Var A






0 2 4 6 8 10 12

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10 35kDa

Abs

orbacirc

ncia

a 2

80nm

(UA

)


C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1








no volume morto











amostra C25S3











kGy

















GNOM






















00 01 02 03 041E-4

1E-3

001In

tens

idad

e (U

A)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80

0

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C0A1 C0A2 C0A3

00 01 02 03 0400

20x10-5

40x10-5

60x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]





C0A3













A

C

B

D














00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C5A1 C5A2 C5A3

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

7x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1BEB FIT

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]




A

C

B

D
































respectivamente


00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C10A1 C10A2 C10A3

00 01 02 03 040

2x10-5

4x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]









proteiacutena



C D

A B




00 01 02 03 04

10-4

10-3

10-2

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

40x10-5

80x10-5

12x10-4

p(r)

r[Aring]

C25A1 C25A2 C25A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

Iq2 (a

rb u

)

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)










B A

C D


00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

20x10-5

40x10-5

60x10-5

80x10-5

10x10-4

12x10-4

14x10-4

p (r)

r[Aring]

C50A1 C50A2 C50A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

I q

2

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)














A B

C D









00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C0S3 C0S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]








na Tabela 10

A B

DC











00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

1x10-4

p(r)

r[Aring]

C5S3 C5S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]




de 5 kGy



DC

BA









(Figura 33D)

00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 50 100 150 200 2500

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C10S3 C10S10

00 01 02 030

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]

C10S10 C10S10 FIT

Dro0075 Ra1400





A

D

B

C






e 10 kGy)






















caso










agregados maiores














( ) ( )( ) ( )22

22


tetracircmero


minus

minus=

(11)










00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]







35















000 005 010 015 0201E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


























00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]























proteiacutena


























MkDa 940 670 430 300 201 144

β-LG

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

MkDa 940 670 430 300 201 144

B A

β-LG


















natildeo irradiada

























0

200

400

600

800

1000

1200

2

1

333

1

2

333

1

2

333 22122

c

a

b

d

a

b

c

daabbaabbabbc


Fluo

resc

enci

a a

411

nm (U

A)

amostras de β-LG





































































Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)




















β-LG Var A Var B


Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)








00

01

02

03

04

05

06

1

2

344

1

2

3

4

1

2

3

4

abb

a

aaa

aaaa

aa

Abs

orbacirc

ncia

(UA

)

0 10 25 50


aw 022 aw 053 aw 074


20

30

40

50

60

a

111

2

1231

233

1

3

a

a

a

a

a

baa

a

b

a

0 10 25 50

Pep

tiacutedeo

s (

aacutere

a)


aw022 aw053 aw074



































1999)











































Tabela 10





















10 mM e pH 7)


















































98


7 CONCLUSOtildeES


7 CONCLUSOtildeES















etc)











































viii

ix

AGRADECIMENTOS













do projeto de tese


opiniotildees





disfrutadas juntas



x

xi



amostras





















desta tese


xii

xiii

IacuteNDICE



RESUMO xxix

ABSTRACT xxxiii


2 OBJETIVOS 5

21 Geral 6


















xiv

xv











42 Meacutetodos 35


















xvi

xvii










SAXS 67










xviii

xix

LISTA DE TABELAS


35


35


49


49


56


60


62


71


78

xx

xxi

LISTA DE FIGURAS


10


25


29


42


43


45


46


51


51


52


53


53

xxii

xxiii


54


54


55


57


58


58


63


64


65


66


67


69


70

xxiv

xxv


72


73


74


75


76


77


84


85


86

xxvi

xxvii


88


89


90


91


91

xxviii

xxix


RESUMO






























xxx

xxxi



kGy)



xxxii

xxxiii


ABSTRACT





























xxxiv

xxxv





xxxvi






















































































2 Objetivos 5

2 OBJETIVOS

2 Objetivos 6

2 OBJETIVOS

21 Objetivo Geral









































2002)




















McSWEENEY 1998)































espumantes






1992)

















































































atividade


























KINSELLA 1988)



















GIAMPIETRO 1998)











VIRTANEN 2000)














identificados





















(HUFFMAN 1996)















SCHER BANON 2002)

































pH


































KITABATAKE 2001)















HUYGHEBAERT 1997)
































2004)




















(DIAS 2003)








(CORRY et al 1995)





























































soluccedilatildeo


































circular







nm (WALLACE 2000)







rdmr nlc

Msdotsdot

sdotθ=θ (1)



(KELLY PRICE 1997)








conhecidas









1986)
























entre 255 e 270 nm


















(1982) entre outros













Sendo

θ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ π

= senq1

4 (2)


utilizada

drqr






π=

0221

(4)


Dmax



rdr)r(p

drr)r(pR maxR

maxR

g

intint=

0

2

02

2 (5)






(6)

_M)()(I νρ∆= 1

21 0 (7)

_)(

)(IMνρ∆

=2

11

0 (8)




espalhadora

νρ∆

=)()(INM A

M 21 0

(9)

221 0 V)()(I ρ∆=









FOURNET 1955)








4


Fosforescecircncia

S0

S1

























(CHEN BARKLEY 1998)




















(CALLIS 1997)












32








Reagentes































42 Meacutetodos
















Tratamento Dose kGy







Tratamento Dose kGy































































et al 1984)
















5 nm













Transmitacircncia





Absorbacircncia












KINSELLA 1988)






(1997)











em 214 nm


























































A

B

β-LG Var B Var A

β-LG Var A e B

M(kDa) 94 67 43 30 201 144

1 2 1 2






















β-LG Var B

β-LG Var A Abs

(UA)








(ZAKS 1992)



















280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000

A

C0A1 C10A1 C25A1 C50A1

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

C0A2 C10A2 C25A2 C50A2

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000C

C0A3 C10A3 C25A3 C50A3

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)











280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000A

343nm

339nm

336nm333nm

C0S10 C10S10 C25S10 C50S10

Inte

nsid

ade

Fluo

resc

ecircnci

a (U

A)


280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

0

2000

4000

6000

8000

10000B

345nm

348nm

333nm

C0S3 C10S3 C25S3 C50S3

Inte

nsid

ade

fluor

escecirc

ncia

(UA

)



















respectivamente




























































correspondente




CDSSTR 13 33 23 29

SELCON 143 341 226 269








literatura






SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997

SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997


























180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A1 C10A1 C50A1

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)

comprimento de onda



180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A2 C10A2 C50A2

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000

1500000

C0A3 C10A3 C50A3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)



(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)



C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100

C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100

C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100













radiaccedilatildeo

240 260 280 300 320 340 360

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-05

00

05

C0A1 C10A1 C50A1

CD



(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)

240 260 280 300 320 340 360

-4

-3

-2

-1

0

C0A2 C10A2 C50A2

CD



com 50 kGy (C50A2)


240 260 280 300 320 340 360-5

-4

-3

-2

-1

0

C0A3 C10A3 C50A3

CD



com 50 kGy (C50A3)





180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S10 C10S10 C50S10




[θ]

(deg

cm

2 dm

ol-1

)


180 190 200 210 220 230 240 250 260 270

-1500000

-1000000

-500000

0

500000

1000000 C0S3 C10S3 C50S3

[θ] (

deg

cm2 d

mol

-1)














significativas





10mgmL)


C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99

C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100



































2001)















1 2

3

4

123

4











240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

C0S10 C10S10 C50S10

C D

comprimento de onda



240 260 280 300 320 340

-4

-3

-2

-1

0

1

C0S3 C10S3 C50S3C

D










(Figura 20)








estruturas β e α




























aw 022


aw 053


aw 074


3 mgmL


10 mgmL


























(GARRISON 1987)


















Transmitacircncia

β-LG


aw 022


aw


aw 074


3 mgmL


10 mgmL
















A B C

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

1 2 3

F

1 2 3

β-LG

D

1 2 3

β-LG

r

E

β-LG

r r





de 10 5 25 1 e 0 kGy

















A B

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

β-LG Var B Var A






0 2 4 6 8 10 12

00

01

02

03

04

05

06

07

08

09

10 35kDa

Abs

orbacirc

ncia

a 2

80nm

(UA

)


C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1








no volume morto











amostra C25S3











kGy

















GNOM






















00 01 02 03 041E-4

1E-3

001In

tens

idad

e (U

A)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80

0

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C0A1 C0A2 C0A3

00 01 02 03 0400

20x10-5

40x10-5

60x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]





C0A3













A

C

B

D














00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C5A1 C5A2 C5A3

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

7x10-5

Iq2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1BEB FIT

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]




A

C

B

D
































respectivamente


00 01 02 03 041E-5

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

p(r)

r[Aring]

C10A1 C10A2 C10A3

00 01 02 03 040

2x10-5

4x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 04

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]









proteiacutena



C D

A B




00 01 02 03 04

10-4

10-3

10-2

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

40x10-5

80x10-5

12x10-4

p(r)

r[Aring]

C25A1 C25A2 C25A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

Iq2 (a

rb u

)

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)










B A

C D


00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]


0 20 40 60 8000

20x10-5

40x10-5

60x10-5

80x10-5

10x10-4

12x10-4

14x10-4

p (r)

r[Aring]

C50A1 C50A2 C50A3

00 01 02 03 0400

30x10-5

60x10-5

90x10-5

12x10-4

I q

2

q(Aring-1)


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q(Aring-1)














A B

C D









00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 800

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C0S3 C0S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]








na Tabela 10

A B

DC











00 01 02 03 04

1E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

1x10-4

p(r)

r[Aring]

C5S3 C5S10

00 01 02 03 040

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

1

Inte

nsid

ade

(UA

)

q[Aring-1]




de 5 kGy



DC

BA









(Figura 33D)

00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


0 50 100 150 200 2500

2x10-5

4x10-5

6x10-5

8x10-5

p(r)

r[Aring]

C10S3 C10S10

00 01 02 030

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

6x10-5

I q

2

q [Aring-1]


00 01 02 03 041E-4

1E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]

C10S10 C10S10 FIT

Dro0075 Ra1400





A

D

B

C






e 10 kGy)






















caso










agregados maiores














( ) ( )( ) ( )22

22


tetracircmero


minus

minus=

(11)










00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]







35















000 005 010 015 0201E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]


























00 01 021E-3

001

01

Inte

nsid

ade

(UA

)

q [Aring-1]























proteiacutena


























MkDa 940 670 430 300 201 144

β-LG

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

MkDa 940 670 430 300 201 144

B A

β-LG


















natildeo irradiada

























0

200

400

600

800

1000

1200

2

1

333

1

2

333

1

2

333 22122

c

a

b

d

a

b

c

daabbaabbabbc


Fluo

resc

enci

a a

411

nm (U

A)

amostras de β-LG





































































Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)




















β-LG Var A Var B


Abs

orbacirc

ncia

a 2

14nm

(UA

)








00

01

02

03

04

05

06

1

2

344

1

2

3

4

1

2

3

4

abb

a

aaa

aaaa

aa

Abs

orbacirc

ncia

(UA

)

0 10 25 50


aw 022 aw 053 aw 074


20

30

40

50

60

a

111

2

1231

233

1

3

a

a

a

a

a

baa

a

b

a

0 10 25 50

Pep

tiacutedeo

s (

aacutere

a)


aw022 aw053 aw074



































1999)











































Tabela 10





















10 mM e pH 7)


















































98


7 CONCLUSOtildeES


7 CONCLUSOtildeES















etc)











































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