Zellbiologie

• Lichtmikroskopie

• Elektronenmikroskopie

• Biologische Membranen

• Membranverbindungen

• Lichtmikroskopie

• Elektronenmikroskopie

• Biologische Membranen

• Membranverbindungen

• 1924 erkannte der Belgier L. de Broglie den Wellencharakter von Elektronenstrahlen

• M. Knoll und E. Ruska bauten 1931 den ersten Prototyp in Berlin

• Das erste EM-Bild war die Darstellung des Tabakmosaikvirus

• Das erste EM-Bild einer Zelle wurde 1945 von K.R. Porter, A. Claude und E.F. Fullam am Rockefeller Institut, New York, veröffentlicht

Elektronenmikroskopie

Ernst Ruska(1906-1988)

Dr. Max Knoll und Ernst Ruska entwickelten 1931 an der Uni Berlin das erste Transmissions-Elektronenmikroskop („Übermikroskop“)

Physik-Nobelpreis 1986

Auflösung

dmin = λAObj + AKond.

Lichtmikroskop

dmin = λAElektronenmikroskop

Auflösungsvermögen:LM ~ 200 nmEM ~ 1 nm

(Dicke einer Biomembran: ~ 10 nm)

Kathode

Anode

• die konventionelle Elektronenmikroskopie ist die Transmissionsslektronenmikroskopie (TEM)

• der Elektronenstrahl wird an einer aufgeheizten Kathode (z.B. Wolframdraht) erzeugt

• an der Anode wird eine Beschleunigungsspannung (50-100 kV) angelegt

• durch einen Kondensor wird der Strahl gebündelt

• der Grad der Ablenkung am Präparat hängt von der Elektronendichte der Atome ab

• bei biologischen Präparaten (C, H, N, O) ergibt sich nur ein geringer Kontrast

• vom Objektiv wird ein Zwischenbild erzeugt, das durch ein Projektiv nachvergrößert wird

• das Bild wird auf einem Leuchtschirm sichtbar gemacht

• der Schwärzungsgrad spiegelt die Elektronendichte im durchstrahlten Präparat wider

Elektronenmikroskopie

• Das Präparat wird in Glutaraldehyd oder Formaldehyd fixiert

• Mit einem Phosphatpuffer wird das Fixiermittel abgewaschen

• Anschließend wird mit Osmiumtetroxid (OsO4, zur Festigung von Membranen) nachfixiert

• In einer aufsteigenden Alkoholreihe wird das Präparat entwässert

• Mit Uranylacetat, Phosphorwolframsäure, Bleiacetat oder Uranylformiat wird das Präparat kontrastiert

• Mit reinem Kunstharz (meist auf Epoxidbasis) erfolgt die Einbettung

Chemische Fixierung

• Schnittdicken < 100 nm werden mit Ultramikrotomen hergestellt

• Mit Glas- (Anfänger) oder Diamantmessern (Profis) werden in die Apparatur eingespannt und schneiden das Präparat faltenfrei

• Die Schnitte werden im „Messertrog“ gesammelt

Mikrotomschnitte

Mikrotomschnitte

Zellwand einer Hefezelle(31.500fache Primärvergrößerung)

Myelinscheide im Kleinhirn(100.000fache Primärvergrößerung)

Chlamydomonas(5.000fache Primärvergrößerung)

Rauhes ER (Chlamydomonas)(25.000fache Primärvergrößerung)

Negative Staining

Herpesvirus

Orthopockenvirus

positive negative staining

• die Probe wird in der Druckkammer zwischen zwei Kupferplättchen gespannt

• in der Druckkammer wird die Probe bei 2000 bar und einer Temperatur von -192°C eingefroren

• die tiefgefrorene Probe wird in einem Vakuumbehälter im Hochvakuum mechanisch aufgebrochen

• an Luft würde an den kalten Bruchflächen sofort Wasserdampf kondensieren

• der Bruch erfolgt genau in der Mitte der Doppelmembranen, da zwischen den Fettsäuren der Membranen nur relativ schwache Wechselwirkungen auftreten

• im Vakuum wird Platin so verdampft, dass Pt-Atome in einem Winkel von 45° auftreffen

• anschließend wird reiner Kohlenstoff aufgedampft

• nach Auflösen der Probe im Säurebad wird der Abdruck mit Kohlenstoffverstärkung im TEM betrachtet

Kryofixierung

• die Probe wird in der Druckkammer zwischen zwei Kupferplättchen gespannt

• in der Druckkammer wird die Probe bei 2000 bar und einer Temperatur von -192°C eingefroren

• die tiefgefrorene Probe wird in einem Vakuumbehälter im Hochvakuum mechanisch aufgebrochen

• an Luft würde an den kalten Bruchflächen sofort Wasserdampf kondensieren

• der Bruch erfolgt genau in der Mitte der Doppelmembranen, da zwischen den Fettsäuren der Membranen nur relativ schwache Wechselwirkungen auftreten

• im Vakuum wird Platin so verdampft, dass Pt-Atome in einem Winkel von 45° auftreffen

• anschließend wird reiner Kohlenstoff aufgedampft

• nach Auflösen der Probe im Säurebad wird der Abdruck mit Kohlenstoffverstärkung im TEM betrachtet

Kryofixierung

Zellkern & Vakuole einer Hefezelle(25.000fache Primärvergrößerung)

Vakuole einer Hefezelle(12.500fache Primärvergrößerung)

Zellkern einer Hefezelle(proto- und extraplasmatische Bruchfläche)

Plasmamembran von Hefezellen(li: proto-; re: extraplasmatisch)

Nomenklatur der durch Gefrierbruch freigelegten Membranflächen

E.coli OmpA mit 15 nm Gold(40.000fache Primärvergrößerung)

Immuno-EM

Saccharase-Isomaltase auf den Mikrovillivon Enterozyten mit 30 nm Gold

(10.000fache Primärvergrößerung)

Raster- (Scanning-) Elektronenmikroskop (REM)

• wie beim Transmissions-Elektronenmikroskop wird auch beim REM der Elektronenstrahl von einer beheizten Kathode als Strahlungsquelle erzeugt

• im REM wird jedoch nicht das ganze Objekt ausgeleuchtet, sondern der Elektronenstrahl wird auf einen kleinen Punkt an der Oberfläche des Objekts fokussiert

• Das dabei entstehende Signal wird verstärkt und auf einer Bildröhre als Punkt abgebildet

• Ein Punkt auf dem Leuchtschirm der Bildröhre entspricht also einem Punkt auf der Oberfläche des Objekts

• Ein Rastergenerator führt den Elektronenstrahl des Mikroskops Punkt für Punkt über die Oberfläche des Objekts wobei auf dem Leuchtschirm ein Bild der Oberfläche entsteht

• Ein Vergrößerungseffekt entsteht dadurch, daß über dem Elektronenstrahl der Bildröhre ein stärkeres elektrisches Feld angelegt wird als über den Strahl im Mikroskop

Raster- (Scanning-) Elektronenmikroskop (REM)

• wie beim Transmissions-Elektronenmikroskop wird auch beim REM der Elektronenstrahl von einer beheizten Kathode als Strahlungsquelle erzeugt

• im REM wird jedoch nicht das ganze Objekt ausgeleuchtet, sondern der Elektronenstrahl wird auf einen kleinen Punkt an der Oberfläche des Objekts fokussiert

• Das dabei entstehende Signal wird verstärkt und auf einer Bildröhre als Punkt abgebildet

• Ein Punkt auf dem Leuchtschirm der Bildröhre entspricht also einem Punkt auf der Oberfläche des Objekts

• Ein Rastergenerator führt den Elektronenstrahl des Mikroskops Punkt für Punkt über die Oberfläche des Objekts wobei auf dem Leuchtschirm ein Bild der Oberfläche entsteht

• Ein Vergrößerungseffekt entsteht dadurch, daß über dem Elektronenstrahl der Bildröhre ein stärkeres elektrisches Feld angelegt wird als über den Strahl im Mikroskop

Raster- (Scanning-) Elektronenmikroskop (REM)