KLONING GEN PENYANDI ENDO-1,4-β ... - UNAIR …repository.unair.ac.id/25781/1/MPK 88 - 12 Rah...

KLONING GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT A BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH

PADA E.coli Top10 (pET-30a(+))

SKRIPSI

PREVITA ZEIZAR RAHMAWATI

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA

2012

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

Skripsi Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+))

Previta Zeisar Rahmawati

KLONING GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT A BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH

PADA E.coli Top10 (pET-30a(+))

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Bidang Kimia Pada Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga

Oleh:

PREVITA ZEIZAR RAHMAWATI NIM 080810623

Tanggal Lulus: 7 Agustus 2012

Disetujui Oleh:

Pembimbing I Pembimbing II Prof. Dr. Ni Nyoman Tri P., M.Si Dr. Sri Sumarsih, M.Si NIP. 19630615 198701 2 001 NIP. 19600110 198810 2 001




LEMBAR PENGESAHAN NASKAH SKRIPSI

Judul : Kloning Gen Penyandi Endo-1,4-β-Xilanase Asal Isolat A Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Pada E. coli Top10 (pET30a(+))

Penyusun : Previta Zeizar Rahmawati NIM : 080810623 Tanggal ujian : 7 Agustus 2012

Disetujui oleh :

Pembimbing I,

Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si NIP. 19630615 198701 2 001

Pembimbing II,

Dr. Sri Sumarsih, M.Si NIP. 19600110 198810 2 001

Mengetahui,

Ketua Departemen Studi Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga

Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA NIP. 19671115 199102 2 001




PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI

Skripsi ini tidak dipublikasikan, namun tersedia di perpustakaan dalam lingkungan Universitas Airlangga. Diperkenankan untuk memakai sebagai referensi kepustakaan, tetapi pengutipan seijin penulis dan harus menyebutkan sumbernya sesuai dengan kebiasaan ilmiah. Dokumen skripsi ini merupakan hak milik Universitas Airlangga




KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya,

sehingga penyusun dapat menyelesaikan proposal skripsi dengan judul Kloning

Gen Penyandi Endo-1,4-β-Xilanase Asal Isolat A Bakteri Xilanolitik Sistem

Abdominal Rayap Tanah Pada E.coli Top10 [pET-30a(+)] dengan tepat waktu.

Penulisan proposal skripsi ini tidak akan selesai tanpa bantuan dan dukungan dari

berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si selaku dosen

pembimbing I dan Ibu Dr. Sri Sumarsih, M.Si selaku pembimbing II

yang telah memberikan waktu, saran, doa dan bimbingan kepada

penulis sampai terselesaikan skripsi ini.

2. Ibu Dr. Hartati, MS selaku Dosen Wali yang senantiasa membimbing

serta memberikan banyak masukan.

3. Seluruh staf pengajar program studi S1 Departemen Kimia Fakultas

Sains dan Teknologi yang telah memberikan bekal ilmu yang

bermanfaat kepada penulis.

4. Papa, Mama, Kakak dan Adik yang memberikan kasih sayang, doa,

semangat kepercayaan, dan dukungan baik secara moril maupun materi

kepada penulis selama penyusunan proposal skripsi.

5. Ibu A.A. Istri Ratnadewi, terima kasih telah mempercayakan penulis

untuk mengerjakan sebagian dari riset proyek penelitiannya.




6. Tim proteomik TDC, mbak One, mbak Nita, mbak Laura dan mbak

Titin, mas Fanani terima kasih atas segala masukan-masukan dan

semangat yang diberikan kepada penulis.

7. Para staf TDC di lab. Lepra dan lab. Malaria mbak dinar, mbak ratna,

mbak agnes dan mbak wahyu, terima kasih atas bantuan dalam analisis

nanodrop, PCR, dan geldoc.

8. Teman – teman kelompok penelitian biokim blast (Tea, Amal, Amel,

Luluk, Nadya, Dita, Siska, Rohis, Jo, Resti, Mumun, Ryan) yang

saling memberikan semangat selama proses penelitian dan penyusunan

skripsi ini

9. Serta pihak – pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang

banyak memberikan saran, masukan dan pengalamannya.

Penyusun menyadari bahwa dalam penulisan proposal skripsi ini masih

banyak kekurangan, sehingga penyusun mengharapkan kritik dan saran yang

membangun demi perbaikan proposal skripsi ini selanjutnya. Penyusun berharap

proposal skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan

khususnya ilmu bahan alam.

Surabaya, Agustus 2012

Penyusun

Previta Zeizar R.




Rahmawati, Previta Zeisar., 2012, Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)). Skripsi ini dibawah bimbingan Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si. dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si, Departeman Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya.

ABSTRAK

Endo-1,4- ß-xilanase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis hidrolisis ikatan glikosida pada xilan yang berpotensi dalam proses industri pangan, pakan, pulp dan pengolahan limbah pertanian. Penelitian ini bertujuan untuk mengamplifikasi dan kloning gen penyandi endo-1,4- ß-xilanase asal bakteri sistem abdominal rayap tanah ke dalam E.coli Top10 [pET-30a(+)] serta menentukan urutan basa nukleotida dan tingkat homologinya terhadap gen endo-1,4-β-xilanase lain yang ada di GenBank. Proses amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase isolat A dilakukan dengan menggunakan PCR dengan 30 siklus dan pada kondisi denaturasi 940C, annealing 580C, extension 72oC. Amplikon yang diperoleh kemudian dilakukan transformasi ke dalam plasmid pET-30a(+) dan di klon kan kedalam E.coli Top 10 dan mendapatkan rekombinan yang dinamakan pEXyl06. Dari hasil analisis sekuensing, di dapatkan urutan basa dari gen penyandi endo-1,4- ß-xilanase pada plasmid pET-30a(+) rekombinan dengan ukuran gen 642 bp. Fragmen gen endo-1,4-β-xilanase asal isolat A mempunyai tingkat homologi 99% dengan gen endo-1,4-β-xilanase Bacillus subtilis strain MWO dan termasuk ke dalam kelompok glikosida hidrolase famili 11. Kata kunci : Bacillus subtilis, endo-1,4-β-xilanase, kloning gen, sekuensing,

homologi, PCR




Rahmawati, Previta Zeisar., 2012, Cloning of Genes encoding endo-1,4-β-xilanase from xilanolytic bacterial isolate A of soil termite abdominal system in E.coli Top10 (pET-30a(+)). Script is under the guidance of Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si. dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si, Department of Chemistry, Faculty of Science and Technology, Airlangga University, Surabaya.

ABSTRACT Endo-1,4-ß-xylanase is an enzyme that can catalyze the hydrolysis of the glycoside bond on xylan that industrial processes of food, feed, pulp and agricultural waste. This study aims to amplification and cloning of genes encoding endo-1,4-ß-xylanase from abdominal system termite soil bacteria into E. coli Top10 [pET-30a (+)] and determine the sequence of nucleotide bases and the level of they homology of the else endo-1,4-β-xylanase genes in GenBank. The process of amplification of the gene encoding endo-1,4-β-xylanase from isolate A were performed using PCR with 30 cycle and the conditions of denaturation at 940C, 580C annealing, extension 72oC. Then, amplicon was transformed into the plasmid pET-30a (+) and clone it into E. coli Top 10. The result showed that recombnant namely pEXyl06. From the results of sequencing analysis, in order to get bases of the gene encoding endo-1,4-ß-xylanase in the plasmid pET-30a (+) recombinants with gene size 642 bp. Gene fragments of endo-1 ,4-β-xylanase from isolate A has 99% homology with the gene endo-1 ,4-β-xylanase Bacillus subtilis strain MWO and belongs to the group of glycoside hydrolase family 11. Keywords: Bacillus subtilis, endo-1,4-β-xylanase, gene cloning, sequencing,

homology, PCR




DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .................................................................................... i LEMBAR PERNYATAAN .......................................................................... ii LEMBAR PENGESAHAN ........................................................................... iii LEMBAR PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI ..................................... iv KATA PENGANTAR ................................................................................... v ABSTRAK ..................................................................................................... vii DAFTAR ISI ................................................................................................. ix DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xii DAFTAR TABEL ......................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xv BAB I PENDAHULUAN ............................................................................. 1

1.1 Latar Belakang Masalah ............................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ......................................................................... 4 1.3 Tujuan Penelitian .......................................................................... 4 1.4 Manfaat Penelitian ........................................................................ 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................... 6 2.1 Rayap ........................................................................................... 6 2.2 Xilan ............................................................................................ 8 2.3 Enzim-enzim xilanolitik .............................................................. 9 2.3.1 Enzim endo-β-xilanase ........................................................ 9 2.3.2 Enzim endo-β-xilosidase ..................................................... 10 2.3.2 Enzim α-L-arabinofuranosidase........................................... 11

2.4 Enzim-enzim antara untuk memanipulasI DNA ............................ 12 2.5 Polymerase chain reaction (PCR) ................................................ 15 2.6 Vektor kloning ............................................................................. 16 2.6.1 Plasmid pET-30a(+) .......................................................... 17 2.7 Kloning gen ................................................................................. 18 2.8 Tahapan kloning gen .................................................................... 21 2.8.1 Amplifikasi DNA sisipan ................................................... 21 2.8.2 Proses restriksi DNA insert dan DNA plasmid.................... 21 2.8.3 Ligasi DNA insert dengan plasmid ..................................... 22 2.8.4 Transformasi DNA rekombinan.......................................... 23 2.8.5 Sekuensing DNA ................................................................ 24

BAB III METODE PENELITIAN ............................................................... 26 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ....................................................... 26 3.2 Sampel penelitian ......................................................................... 26

3.3 Bahan dan Alat Penelitian ............................................................. 26 3.2.1 Bahan penelitian ................................................................. 26 3.2.2 Alat penelitian .................................................................... 27

3.4 Diagram alir penelitian ................................................................. 28




3.5 Prosedur penelitian ...................................................................... 29 3.5.1 Pembuatan larutan ............................................................... 29 3.5.1.1 Pembuatan larutan buffer TE 500mM ....................... 29 3.5.1.2 Pembuatan larutan lisosim ........................................ 29 3.5.1.3 Pembuatan larutan STEP 500 µL.............................. 29 3.5.1.4 Pembuatan larutan Na-asetat 3M .............................. 29

3.5.2 Pembuatan media ................................................................ 30 3.5.2.1 Pembuatan media cair untuk koloni E.coli ................ 30 3.5.2.2 Pembuatan media cair untuk koloni E.coli (pET-30a(+)) ............................................................ 30 3.5.2.3 Pembuatan media padat ............................................ 30 3.5.2.4 Pembuatan media padat untuk koloni E.coli (pET-30a(+)) ............................................................ 31 3.5.3 Peremajaan isolat bakteri xilanolitik (isolat A) .................... 31 3.5.4 Isolasi DNA kromosom isolat A ......................................... 31 3.5.5 Peremajaan E.coli (pET-30a(+)) ......................................... 32 3.5.6 Isolasi DNA plasmid pET-30a(+) ....................................... 33 3.5.7 Pemurnian DNA plasmid pET-30a(+) ................................. 34 3.5.8 Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase menggunakan teknik PCR ................................................... 35 3.5.9 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa ................. 35 3.5.10 Pemurnian amplikon .......................................................... 36 3.5.11 Restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+) ...................... 37 3.5.12 Ligasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dan plasmid pET-30a(+) ....................................................................... 37 3.5.13 Kloning pET-30a(+) rekombinan kedalam E.coli Top10 .... 37 3.5.13.1 Peremajaan isolat E.coli Top10 dari stok gliserol.. 37 3.5.13.2 Pembuatan sel kompeten E.coli Top10 ................. 38 3.5.13.3 Transformasi plasmid pET-30a(+) ke E.coli Top10 ........................................................ 39 3.5.14 Seleksi transforman koloni E.coli Top10 pembawa plasmid rekombinan pET-30a(+) ....................................... 39

3.6 Sekuensing dengan metode sanger ............................................... 40 3.7 Analisis homologi hasil rekombinan dengan gen lain yang telah

dipublikasikan dalam database GenBank menggunakan program BLAST ......................................................................................... 40

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 41

4.1 Isolasi DNA kromosom isolat A...................................................... 41 4.2 Isolasi DNA plasmid pET-30a(+) .................................................... 42 4.3 Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dengan teknik PCR . 44 4.4 Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase ..................................... 49 4.4.1 Restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+) .......................... 49 4.4.2 Ligasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dan plasmid pET- 30a(+) ................................................................................... 50 4.4.3 Transformasi plasmid pET-30a(+) rekombinan ke E.coli




Top10 .................................................................................... 51 4.4.4 Seleksi transforman E.coli Top10 pembawa plasmid pET- 30a(+) rekombinan ................................................................ 54 4.5 Analisis urutan basa nukleotida dan homologi DNA plasmid pET-

30a(+) rekombinan pembawa gen penyandi endo-1,4-β-xilanase ..... 56

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 62 5.1 Kesimpulan ..................................................................................... 62 5.2 Saran............................................................................................... 62

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 63 LAMPIRAN




DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Gambar Halaman 2.1 Koloni rayap ............................................................................ 7

2.2 Struktur xilan dan sisi pemotongannya. .................................... 9

2.3 Reaksi yang dikatalisis oleh eksonuklease dan endonuklease.... 12

2.4 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA ligase......................... 13

2.5 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA polimerase................. 14

2.6 Reaksi-reaksi yang oleh enzim yang memodifikasi DNA......... 14

2.7 Langkah-langkah dasar dalam PCR .......................................... 16

2.8 Peta plasmid pET-30a(+) ........................................................ 17

2.9 Langkah-langkah dasar dalam kloning gen ............................... 19

4.1 Elektroforesis hasil isolasi DNA kromosom ............................. 42

4.2 Elektroforesis hasil isolasi DNA plasmid pET-30a(+) .............. 44

4.3a Elektroforesis hasil amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase

isolat A dengan primer xynF dan xynR ................................... 48

4.3b Hasil elektroforesis amplikon yang telah dimurnikan ............... 48

4.4 Analisis restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+) ................ 50

4.5 Pengikatan dan pengambilan plasmid oleh sel kompeten dengan

larutan CaCl2........................................................................... 51

4.6 Hasil transformasi ................................................................... 53




DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Gambar Halaman

4.7 Hasil elektroforesis DNA dari transforman plasmid pembawa

pET-30a(+) .............................................................................. 55

4.8 Alignment hasil sekuensing DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan 57




DAFTAR TABEL

Nomor Judul Tabel Halaman

4.1 Beberapa gen yang mempunyai homologi yang tinggi dengan gen

penyandi endo-1,4-β-xilanase isolate A bakteri xilanolitik asal rayap

tanah…………………………………………………………… 60




DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Lampiran

1. Pembuatan Larutan TE

2. Pembuatan Larutan Lisosim

3. Pembuatan Larutan STEP

4. Pembuatan Na-Asetat 3 M

5. Pembuatan Larutan dan Bahan Untuk Elektroforesis

6. Electropherogram hasil sekuensing




BAB I

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Indonesia merupakan salah satu Negara tropis di dunia yang memiliki

berbagai jenis flora dan fauna. Fauna yang mempunyai tipe hidup di daerah tropis

juga sangat bermacam-macam, salah satunya adalah rayap yang tergolong dalam

kelas insekta. Di Indonesia, rayap mempunyai berbagai macam sebutan nama,

sebagian besar menyebutnya dengan semut putih, di Sumatera digunakan istilah

anai-anai, di Jawa disebut rangas, sedangkan beberapa jenis rayap di daerah Jawa

Barat disebut rinyuh, sumpiyuh. Bergantung jenisnya, panjang tubuh rayap antara

4 - 11 mm. Di alam bebas, rayap berperan penting sebagai penjaga keseimbangan

alam dengan cara menghancurkan kayu dan mengembalikannya sebagai "hara" ke

dalam tanah. Namun di pemukiman rayap menjadi hama yang sangat merugikan

dan menimbulkan kerugian ekonomis. Rayap dapat merusak bahan-bahan yang

mengandung selulosa yang merupakan sumber makanan bagi rayap, karena rayap

merupakan satu-satunya kelompok serangga yang mampu memanfaatkan selulosa

sebagai sumber makanannya, seperti: kayu, kertas dan kain (Johnson, 1992).

Komponen penyusun dinding sel kayu yaitu hemiselulosa, selulosa dan

lignin. Kelimpahan selulosa dalam kayu adalah sebesar 40-55%, hemiselulosa

sebesar 24-40% dan lignin sebesar 18-25% (Howard et al., 2003). Hemiselulosa

tersusun atas xilan, sedangkan pada kayu lunak, komponen penyusunnya adalah

glukomanan (Kumar et al, 2008). Karena kemampuan rayap sebagai pemakan

1




kayu, pada sistem abdominal rayap terdapat mikroba yang bisa menghasilkan dan

mensekresi enzim pendegradasi hemiselulosa seperti enzim xilanolitik. Enzim

xilanolitik merupakan enzim kompleks yang terdiri atas endo-1,4-β-xilanase, β-

xilosidase, α-L-arabinofuranosidase, α-glukuronidase, asetil xilan esterase dan

asam ferulat esterase (Collins et a.l, 2005). Enzim xilanolitik ini dapat digunakan

untuk biobleching pada industri kertas, penjernihan dan meningkatkan aroma jus

dan anggur, industri makanan dan pakan ternak (Jiang et al., 2009). Xilanase

merupakan kelompok enzim yang memiliki kemampuan menghidrolisis

hemiselulosa dalam hal ini ialah xilan atau polimer dari xilosa dan xilo-

oligosakarida. Xilanase dapat diklasifikasikan berdasarkan substrat yang

dihidrolisis, yaitu β-xilosidase, eksoxilanase, dan endoxilanase (Richana, 2002).

Gen penyandi xilanase dari berbagai sumber, telah dikloning ke dalam

berbagai sel inang misalnya, Kloning gen penyandi xilanase termostabil dari

Actinomandura sp. S14 diekspresikan ke E.coli dan Pichia pastoris (Sriyapai et

al. 2011), gen xilanase dari Bacillus subtillis strain R5 (Jalal et al., 2009), xilanase

dari Bacillus strain B10 di E.coli (Huang et al., 2006), xilanase dari Paecilomyces

thermophilia di E.coli dan mengkarakterisasi xilanase rekombinan (Zhang et al,

2010).

Ratnadewi dkk (2009) telah melakukan: isolasi bakteri-bakteri pensekresi

komponen enzim xilanolitik dari rayap tanah dan mendapatkan salah satu dari

kelompok enzim xilanolitik yaitu enzim endo-1,4-β-xilanase yang dapat diperoleh

melalui overekspresi gen penyandi enzim xilanolitik dari bakteri sistem abdominal




rayap. Enzim endo-1,4-β-xilanase yang diperoleh dimanfaatkan untuk produksi

prebiotik xilooligosakarida dari xilan.

Enzim endo-1,4-β-xilanase sangat penting di dunia industri dan dunia

penelitian, maka perlu dilakukan adanya suatu kemampuan untuk produksi enzim

endo-1,4-β-xilanase. Sehingga pada penelitian ini dilakukan kloning gen penyandi

enzim endo-1,4-β-xilanase sehingga akan diperoleh gen penyandi endo-1,4-β-

xilanase yang murni dalam jumlah yang relatif besar.

Pada penelitian ini dilakukan amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-

xilanase yang berasal dari isolat A yang kemudian di lakukan kloning ke E. coli

Top10 (pET-30a(+)) dan menentukan urutan basa nukleotida dan tingkat

homologi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal sistem abdominal rayap tanah.

Proses amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dilakukan dengan teknik

Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer forward yang digunakan adalah

berdasarkan dari sekuen primer yang telah berhasil untuk mengamplifikasi gen

penyandi xilanase dari Bacillus strain B10 di E.coli (Huang et al., 2006) dan

primer reverse yang digunakan adalah berdasarkan penelitian skripsi oleh

Amaliah labiqah tentang amplifikasi gen penyandi endo xilanase pada rayap

tanah.

Proses amplifikasi gen endo-1,4-β-xilanase dilakukan proses denaturasi

pada suhu 94oC, annealing menggunaka gradien suhu yaitu 40oC; 48oC; 52,oC; 58

oC dan extension pada suhu 72oC dengan jumlah siklus 30 kali. Amplikon yang

diperoleh kemudian diklon ke dalam plasmid pET-30a(+). Plasmid rekombinan




tersebut kemudian di transformasi ke dalam sel inang Escherichia coli dengan

jenis E.coli yang digunakan disini adalah E.coli Top10.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang permasalahan maka dapat diambil suatu

rumusan masalah sebagai berikut :

1. Apakah gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal bakteri sistem abdominal

rayap tanah dapat di amplifikasi dan diklon ke dalam E.coli Top10 (pET-

30a(+))?

2. Bagaimanakah urutan basa nukleotida dan tingkat homologi gen penyandi

endo-1,4-β-xilanase rekombinan asal bakteri sistem abdominal rayap

tanah?

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Melakukan amplifikasi dan kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal

bakteri sistem abdominal rayap tanah ke dalam E.coli Top10 (pET-

30a(+)).

2. Menentukan urutan basa nukleotida dan tingkat homologi gen penyandi

endo-1,4-β-xilanase asal bakteri sistem abdominal rayap tanah.




1.4 Manfaat Penelitian

Dengan melakukan kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase pada sistem

abdominal rayap tanah pada E. coli Top10, diharapkan akan mendapatkan suatu

rekombinan penghasil enzim endo-1,4-β-xilanase yang murni, selanjutnya enzim

endo-1,4-β-xilanase dapat dimanfaatkan di dalam dunia industri makanan,

peternakan dan lain-lain. Selain itu di penelitian ini juga memberikan informasi

urutan basa nukleotida gen penyandi enzim endo-1,4-β-xilanase asal bakteri

sistem abdominal rayap tanah.




BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Rayap

Rayap adalah jenis serangga pemakan selulosa yang berukuran sedang,

yang termasuk dalam ordo Isoptera, secara relatif kelompok kecil dari serangga

yang terdiri dari kurang lebih 1900 jenis di dunia. Hidup dalam jumlah kecil atau

besar dengan organisasi yang sangat baik, komunitasnya membuat sejumlah

kasta-kasta khusus yang memiliki pekerjaan khusus untuk kelangsungan hidup

koloni. Rayap memiliki bentuk dan ukuran sayap depan yang sama dengan sayap

belakang, sehingga ordonya disebut Isoptera (Iso = sama, ptera = sayap)

(Johnson, 1992). Rayap mempunyai taksonomi sebagai berikut :

Kerajaan : Animalia

Filum : Arthropoda

Kelas : Insekta

Subkelas : Pterygota

Ordo : Isoptera

Famili : Mastotermitidae

Kalotermitidae

Termopsidae

Hodotermitidae

Rhinotermitidae

Termitidae

6




Diseluruh dunia telah dikenal sekitar 2000 spesies rayap (diidentifikasi

dan dideskripsikan sekitar 120 spesies merupakan hama), sedangkan di Indonesia

dari sejumlah 200 spesies yang dikenal baru sekitar 20 spesies yang diketahui

berperan sebagai hama perusak kayu serta hama hutan atau pertanian

(Tarumingkeng, 2001). Pada Gambar 2.1 rayap hidup di dalam habitat-habitat di

bawah tanah yang lembab dan hidup di daerah kering yaitu diatas tanah. Sarang-

sarang rayap dapat didalam tanah seluruhnya, atau dapat menonjol diatas

permukaan. Rayap-rayap kayu kering yang hidup di atas tanah tanpa kontak

dengan tanah sama sekali hidup di potongan potongan batang pohon, pohon-

pohon dan bangunan yang terbuat dari kayu.

Gambar 2.1. Koloni Rayap (Anonim)

Sumber utama kelembabannya adalah air metabolik, yaitu air yang berasal

dari oksidasi makanan. Pada awalnya rayap diyakini tidak dapat mencerna lignin

secara baik, akan tetapi dari perbandingan oleh Seifert (1962) dari kontens lignin

pada kayu dan feses menunjukkan bahwa rayap setidaknya bisa mendemilasi

lignin (Kato, 1998). Selulosa dalam makanan rayap dicerna oleh berbagai macam




protista flagella yang berjumlah ribuan yang hidup didalam saluran pencernaan

rayap (Johnson, 1992).

2.2 Xilan

Xilan merupakan suatu heteropolisakarida, yaitu suatu komponen

struktural utama dari hemiselulosa dari dinding sel tumbuhan. Endoxilanase (1,4-

β-D-xilan xilanohidrolase; EC 3.2.1.8) (Sriyapai et al,. 2010). Xilanase adalah

Komponen utama hemiselulosa yang memiliki tulang punggung rantai D-

xilopiranosa dengan ikatan glikosidik β-1,4. Xilan memiliki residu O-asetil,

arabinosil dan 4-O-metil-D-asam glukoronat yang terikat pada tulang

punggungnya. Hidrolisa lengkap xilan menjadi monomernya memerlukan kerja

sinergi beberapa enzim xilanolitik (Zhou, et.,al., 2008). Xilanase banyak diketahui

milik dari famili GH10 dan GH11 (Howard, 2003).

Hidrolisis total xilan membutuhkan beberapa enzim yang berbeda, yaitu

endo-1,4-β-xilanase (1,4-β-D-xilan xilanohidrolase, EC.3.2.1.8) yang

menghidrolisis struktur dasar xilan secara acak menjadi xilooligosakarida; 1,4-β-

D-xilosidase (1,4-β-D-xilanxilohidrolase, EC.3.2.1.37) dan memutus

xilooligosakarida menjadi xilosa. Gugus samping yang menyusun xilan akan

dibebaskan oleh α-L-arabinofuranosidase, β-D-glukuronidase, galaktosidase dan

asetil xilan esterase menjadi arabinosa, glukuronat, galaktosa dan asetat (Lee et

al., 2009).




Gambar 2.2. Struktur xilan dan sisi pemotongannya (Shallom, 2003)

2.3 Enzim enzim xilanolitik

Enzim-enzim pendegradasi xilan disebut enzim xilanolitik atau enzim

xilanase. Macam-macam enzim xilanase yang bermanfaat antara lain: enzim

endo-β-xilanase (EC.3.2.1.8), enzim β-xilosidase (EC.3.2.1.37), enzim α-L-

arabinofuranosidase (EC.3.2.1.55) dan enzim ekstra, yang mampu memotong

rantai sisi kelompok heteroxilan . Produk akhir hidrolisis xilan adalah xilosa dan

oligosakarida, dimana mempunyai aplikasi yang potensi di industri produksi

makanan, farmasi, kertas, produk pertanian dan bahan bakar terbarukan (Sriyapai

et al,. 2010).

2.3.1 Enzim endo-β-xilanase

Endo xilanase mampu memutus ikatan β 1-4 pada bagian dalam rantai

xilan secara teratur. Ikatan yang diputus ditentukan berdasarkan panjang rantai

substrat, derajat percabangan, ada atau tidaknya gugus subtitusi, dan pola

pemutusan dari enzim hidrolase tersebut. Enzim endo-β-xilanase (EC.3.2.1.8)




telah banyak dideteksi pada mikroorganisme seperti bakteri dan jamur dan

masing masing telah di karakterisasi dengan baik, mikroba mikroba penghasil

xilanase biasanya memiliki pH optimum asam atau netral (Gupta et al, 2000).

Famili GH10 (disebut juga Famili F) merupakan kelompok endo xilanase dengan

massa molekul relatif tinggi dengan harga pI yang rendah. Sebaliknya Famili

GH11 (disebut juga Famili G) mempunyai massa molekul relatif rendah dengan

harga pI yang tinggi. Kedua famili tersebut berbeda dalam hal sifat katalitiknya.

Famili 10 mampu menyerang ikatan glikosidik di sebelah titik cabang dan

mengarah ke ujung non-pereduksi dengan menggunakan dua residu xilopiranosil

non-substitusi antara cabang-cabang, sedangkan famili 11 menggunakan tiga

residu xilopiranosil non-substitusi. Berdasarkan hal tersebut, famili 10

mempunyai beberapa aktivitas katalitik yang sesuai dengan β-xilosidase (Kartika

Ayu, 2006). Enzim xilanase GH famili 11, didapatkan dari Bacillus subtilis, dan

Bacillus licheniformis. Untuk enzim xilanase GH famili 10 dijumpai pada

Bacillus sp. (http://www.CAZy.org).

2.3.2 Enzim endo-β-xilosidase

Endo-β-xilosidase, yaitu enzim xilanase yang mampu menghidrolisis xilo-

oligosakarida rantai pendek menjadi xilosa. Aktivitas enzim akan menurun

dengan meningkatnya rantai xilo-oligosakarida (Reilly, 1991). Xilosa selain

merupakan hasil hidrolisis juga merupakan inhibitor bagi enzim endo-β-

xilosidase. Sebagian besar enzim endo-β-xilosidase yang berhasil dimurnikan

masih menunjukkan adanya aktivitas transferase yang menyebabkan enzim ini

kurang dapat digunakan industri penghasil xilosa.




2.3.3 Enzim α-L-arabinofuranosidase

Arabinosa residu ditemukan di pektin atau hemiselulosa seperti sebagai

arabinans, arabinogalaktan, atau arabinoxylans di banyak dinding sel tumbuhan.

Dalam gula bit arabinan, L-arabinosa residu terkait dalam membentuk α-1,5-L-

arabinan dari L arabinofuranose unit yang terpasang pada posisi 2 atau 3 dalam

konfigurasi α sebagai rantai samping (Sakamoto et al., 2010).

Arabinofuranosidase (EC3.2.1.55) mengkatalisis hidrolisis α-1,2 dan α-1 ,3-

arabinofuranosidik obligasi di hemiselulosa seperti arabinoxylan, arabinan, dan

lainnya yang mengandung arabinosa polisakarida (Canakci et al., 2008).

Enzim ini merupakan bagian dari glikosida hidrolase yang berperan dalm

proses degradasi hemiselulosa seperti arabinoxilan, arabinogalaktan, dan L-

arabinan. Adanya substituen L-arabinofuranosida dalam struktur xilan dapat

secara kuat menghambat aktivits endo-xilanase dan β-xilosidase yang berakibat

menghalangi degradasi total dari polimer xilan (Shallom et al, 2003). Hal ini

disebabkan oleh struktur L-arabinofuranosida yang cukup besar, sehingga akan

terjadi halangan ruang bagi aktivitas endo-xilanase dan xilosidase. Oleh karena

itu, keberadaan enzim arabinofuranosidase sangat penting dalam degradasi total

xilan (Shallom et al, 2003).

Arabinofuranosidase telah menerima banyak perhatian dalam beberapa

tahun terakhir karena aplikasi potensi mereka dalam proses industri agro, seperti

pengolahan buah-buahan, sayuran, dan sereal dan konversi hemiselulosa untuk

bahan bakar dan bahan kimia. Arabinofuranosidase mungkin diterapkan untuk




meningkatkan aroma anggur dan jus buah serta produksi arabinosa, yang telah

dilaporkan untuk menunjukkan efek antiglsemik (Canakci et al,. 2008).

2.4 Enzim-enzim Untuk Manipulasi DNA

Di dalam kloning gen diperlukan enzim-enzim untuk memanipulasi DNA.

Enzim-enzim ini dikelompokkan berdasarkan jenis reaksi yang dikatalisis (Brown,

2010), yaitu:

1. Nuklease, yaitu enzim yang memotong atau memendekkan atau

mendegradasi molekul asam nukleat. Berdasarkan cara pemotongannya,

nuklease dibedakan atas dua macam yaitu eksonuklease yang

menghilangkan nukleotid satu persatu dari ujung molekul DNA dan

endonuklease yang memecah ikatan fosfodiester internal pada molekul;

DNA.

Gambar 2.3 Reaksi yang dikatalisis oleh eksonuklease dan endonuklease




2. Ligase, untuk menyambungkan antar asam nukleat satu dengan yang lain

seperti pada DNA insert dengan plasmid dalam salah satu tahapan kloning

gen.

Gambar 2.4 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA ligase

3. Polimerase, untuk membuat kopi dari molekul DNA. Polimerase

digunakan pada proses PCR, yaitu penggandaan DNA secara invitro yang

dilakukan dalam tabung eppendorf dengan pencampuran yang

membutuhkan satu set reagen tertentu yang salah satunnya enzim

polimerase. Macam-macam reaksi yang dikatalis oleh enzim polymerase

meliputi 4 macam jenis reaksi, yang pertama adalah basic reaction atau

reaksi perpanjangan untai DNA pada umumnya, yaitu dengan mensintesis

untai-untai DNA dari 5’ hingga 3’. Kedua adalah DNA polimerase I yaitu

enzim yang menambah basa nukleotida pada daerah untai DNA yang

kosong dan kemudian mengganti urutan basa nukleotida pada untai DNA

selanjutnya dengan komplemennya Ketiga reaksi fragmen klenow yaitu

reaksi penambahan basa DNA hanya di daerah untai DNA yang kosong

saja. Dan yang keempat yaitu reaksi DNA reverse transcriptase yaitu

reaksi yang dapat mensintesis untai DNA yang berasal dari untai RNA.




Gambar2.5 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA polimerase

4. Enzim modifikasi (modifying enzymes) yaitu suatu enzim untuk

menghilangkan gugus fosfat pada ujung 5’ molekul DNA, menambah

gugus fosfat dari ujung 5’ atau menambah satu atau lebih deoksinukleotida

pada ujung 3’ molekul DNA. Dan yang terakhir adalah topoisomerisme,

yaitu suatu enzim yang mampu membentuk dan mengubah lilitan DNA

dari suatu DNA sirkuler.

. Gambar2.6 Reaksi-reaksi yang oleh enzim yang memodifikasi DNA




2.5 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) sangat berbeda dari kloning gen yaitu

Serangkaian dari pada proses penggandaan DNA secara invitro yang dilakukan

dalam tabung Eppendorf dengan pencampuran yang membutuhkan satu set reagen

seperti DNA template, primer forward dan primer reverse, Taq DNA polymerase,

buffer PCR, dNTP, MgCl, ddH2O dan ditempatkan pada suatu cycler secara

terprogram dengan serangkaian suhu yang bervariasi. Langkah-langkah dasar

dalam proses PCR adalah sebagai berikut (Brown, 2010).

1. Denaturasi DNA dilakukan pada suhu 94° C, di mana pada suhu tersebut

ikatan hidrogen yang pada struktur DNA semula double-standed

terdenaturasi berubah menjadi struktur DNA yang single-stranded.

2. Annealing (penempelan) primer dilakukan pada suhu 50-600 C. Dua untai

tiap molekul single-stranded dapat bergabung kembali pada suhu ini.

yaitu dengan cara proses penempelan primer yang dapat menempel ke

molekul DNA pada posisi yang spesifik.

3. Proses sintesis DNA menggunakan suhu 74° C. Pada suhu 740C, Taq DNA

polimerase bekerja dengan proses Taq DNA polimerase menempel pada

ujung masing-masing primer forward dan reverse, kemudian mensintesis

basa basa nukleotida sampai terbentuk untai molekul DNA yang baru

4. Suhu di naikkan kembali ke 94° C. molekul DNA double-stranded,

masing-masing terdiri dari satu untai molekul DNA asli dan salah satu

untai DNA baru, kembali ke proses denaturasi ke untai tunggal untuk

siklus yang kedua.




Gambar 2.7. Langkah-langkah dasar dalam PCR (Brown, 2010)

2.6 Vektor Kloning

Vektor kloning adalah konsep molekul DNA artifisial yang mampu

bereplikasi dalam organisme inang dimana sepotong DNA dipelajari secara

khusus dan dapat disisipkan pada posisi yang dikenal, molekul DNA rekombinan

dimasukkan ke sel inang seperti E.coli, ragi, sel hewan, atau sel tumbuhan

(Russell, 1994). Dalam proses kloning, gen atau DNA yang akan diklon kedalam




sel inang diperlukan suatu wahana atau vektor. Vektor ini yang akan

mengantarkan DNA target untuk masuk kedalam sel inang. Terdapat tiga jenis

utama dari vektor yang digunakan untuk kloning DNA dalam sel bakteri: plasmid,

bagteriophage, dan Kosmid. Syarat sebuah vektor yang paling penting adalah

bahwa wahana ini mampu mengadakan replikasi dalam sel tuan rumah sehingga

menghasilkan banyak kopi molekul DNA rekombinan dan diturunkan pada sel

anak saat terjadi pembelahan sel (Russell, 1994).

2.6.1 Plasmid pET30a(+)

Gambar 2.8. Peta plasmid pET-30a(+) (Novagen)

Diagram dari vektor plasmid pET30a(+). Vektor ini berukuran 5422bp, vektor ini

memiliki beberapa fitur berikut sehingga berguna untuk kloning DNA

1. Origin of replicalion (ori) pada Plasmid pET30a(+) mengandung pBR322

sehingga, copy number pada pET30a(+) adalah 15-20 kopi per sel E. coli.




2. Selectable marker pada plasmid pET30a(+) berupa kanamisin (kan).

3. Terdapat daerah sisi restriksi yang unik dan berguna untuk memasukkan

DNA sekuen yang disebut polylinker atau Multiple Cloning Sites (MCS)

yang digunakan untuk membuat plasmid rekombinan.

4. Terdapat lacI (lac repressor), dimana lacI adalah suatu gen yang dapat

menghasilkan repressor. Repressor adalah suatu protein yang dapat

menghalangi RNA polimerase menterjemahkan urutan gen dalam proses

transkripsi. Bila RNA polymerase terhalangi oleh suatu repressor, maka

DNA tidak bisa diterjemahkan oleh RNA polimerase dan protein tidak

terekspresikan dalam sel inang. lacI yang bersifat alloserik dapat di non

aktifkan oleh isopropil-β-D-thiogalaktopiranosida (IPTG) dan memicu

ekspresi lac operon (Wall, 2009).

2.7 Kloning Gen

Antara tahun 1971 sampai 1973 penelitian mengenai genetika mengalami

revolusi dalam biologi modern. Suatu metode baru yang dikembangkan sehingga

eksperimen eksperimen yang sebelumnya tidak dilakukan lagi. Metode- metode

ini disebut teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetik yang inti dari

prosesnya adalah kloning gen.

Langkah-langkah dasar dalam kloning gen menurut Brown (2010) adalah

sebagai berikut Fragmen DNA yang mengandung gen target di insersikan pada

vektor kloning sehingga menghasilkan suatu molekul DNA rekombinan. Vektor

bertindak sebagai alat transportasi gen kedalam sel inang. Sel inang dapat berupa




bakteri, ragi, jamur, tanaman tingkat tinggi, dan sel-sel mamalia. Vektor

mengadakan replikasi di dalam sel inang, sehingga menghasilkan banyak kopi

atau turunan yang identik dari vektor dan gen yang dibawanya. Ketika sel inang

membelah, Kopi molekul DNA rekombinan diwariskan pada progeni dan diikuti

replikasi vektor selanjutnya. Sel inang terus melakukan pembelahan sel, hingga

terbentuk koloni pada media padat dan dihasilkan klon sel inang yang identik

dimana tiap sel dalam satu koloni mengandung satu kopi atau lebih molekul DNA

rekombinan.

Gambar 2.9. Langkah langkah Dasar dalam Kloning Gen (Brown, 2010)

Molekul DNA rekombinan perlu dimasukkan ke dalam suatu sel inang

untuk dapat mengekspresikan produk DNA sisipan. Beberapa komponen yang

perlu diperhatikan dalam memilih sel inang yang baik untuk pengklonan adalah

sebaiknya sel inang memiliki tingkat pertumbuhan yang cepat, dapat tumbuh pada

Vektor Fragmen DNA

Molekul DNA rekombinan

2. Transport kedalam sel host

3. Perbanyakan molekul DNA rekombinan

Bakteri

Bakteri yang membawa DNA rekombinan

4. pembelahan sel host

5. pembelahan sel banyak yang menghasilkan klon

Koloni bakteri yang tumbuh pada media padat




medium kultur, tidak bersifat patogen, dapat ditransformasi oleh DNA dan stabil.

Sel inang dalam pengklonan umumnya berupa mikroorganisme, misalnya

Escherichia coli, Bacillus subtilis, dan Saccharomyces cerevisiae (Brock et al.,

1994).

Eksperimen kloning gen pada umumnya dilakukan dalam 5 langkah: (1)

generasi fragmen DNA yang cocok untuk kloning. (2) keterkaitan fragmen yang

akan di kloning ke vektor plasmid atau genom virus oleh pengobatan DNA

fragmen / vektor campuran dengan DNA ligase. (3) pengenalan produk ligasi

DNA ke dalam sistem sel inang yang cocok, seperti E.coli, dengan transformasi,

transfeksi atau infeksi. (4) diubah pembelotan klon DNA yang mengandung

spesies hibrida yang dibutuhkan: dan (5) isolasi dan karakterisasi DNA dari

spesies hibrida pada hasil klon (Timmis, 1984).

Kloning merupakan suatu dorongan bagi para ilmuan karena dapat

melakukan seleksi dan pemurnian suatu gen dalam jumlah besar yang bebas dari

kontaminasi oleh urutan DNA lain. Kunci keberhasilan atau kegagalan suatu

eksperimen kloning adalah kemampuan melakukan seleksi terhadap gen target

yang akan dikloning. Bila suatu gen berhasil diklon, maka tidak akan lagi terdapat

kesulitan untuk memperoleh informasi tentang struktur, fungsi, dan ekspresi pada

gen tersebut (Brown, 2010).

2.8 Tahapan Kloning Gen

2.8.1 Amplifikasi DNA sisipan

Sintesis dan amplifikasi DNA sisipan yang akan diklon kan menggunakan

teknik PCR (Polymerase Chain Reaction), Prosedur ini digunakan untuk proses




amplifikasi enzimatik secara invitro dari DNA sisipan dengan cara mensintesis

DNA tersebut sehingga menghasilkan jumlah salinan dari fragmen DNA dengan

jumlah banyak dan spesifik (Ausubel et al, 1995). Proses PCR dibutuhkan sampel

DNA yang digunakan sebagai DNA cetakan (template) dan reagen-reagen seperti

Taq DNA polymerase, buffer PCR, dNTP, MgCl, ddH2O juga primer forward dan

reverse (Huang et al., 2006).

Reaksi amplifikasi suatu fragmen DNA diawali dengan denaturasi DNA

cetakan sehingga yang awalnya DNA dalam bentuk untai ganda (double stranded)

akan mengalami denaturasi menjadi untai tunggal (single stranded). Berikutnya

adalah proses annealing pada suhu sekitar 55 °C. Primer akan menempel pada

cetakan yang telah terpisah menjadi untai tunggal. Proses dilakukan selama 1-2

menit, kemudian pada proses sintesis DNA, suhu inkubasi dinaikkan menjadi 72

°C selama 90 detik agar terjadi proses polimerisasi untai DNA yang baru

berdasarkan informasi dari DNA cetakan. DNA untai ganda yang terbentuk

selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi menjadi 95

°C untuk tahap siklus berikutnya (Brown, 2010).

2.8.2 Proses Restriksi DNA Insert dan DNA plasmid

Dalam kloning gen tahap yang paling penting adalah proses restriksi

molekul DNA dan vektor dengan ukuran yang tepat. Tiap vektor harus dipotong

pada posisi tunggal untuk membuka lingkaran sehingga molekul DNA baru dapat

diinsersikan. Fitur yang paling penting dari sebuah enzim restriksi adalah bahwa

enzim restriksi mampu membelah molekul untai ganda DNA pada suatu pasangan

sekuen nukleotida tertentu yang disebut situs restriksi (Russell, 1994).




Enzim restriksi dibagi menjadi 3 tipe yaitu berdasarkan komposisi subunit,

posisi pemotongan, spesifisitas sekuens dan kofaktor yang diperlukan

(Sasnauskas, 2006). Ada dua jenis utama dari enzim restriksi: enzim restriksi tipe

I, yang mengenali sekuen tertentu namun memotong di tempat lain, dan enzim

restriksi tipe II, dapat memotong hanya dalam situs pengenalan. enzim tipe II

adalah kelas yang paling penting. enzim restriksi di semua kelas ini membuat dua

potongan untai tunggal, satu potong di masing-masing untai. ada dua pengaturan

pemotongan: (1) potongan di pusat simetri (menghasilkan ujung tumpul) atau (2)

potongan yang simetris, ditempatkan di sekitar garis simetri (menghasilkan ujung-

ujung kohesif atau ujung lengket) (Freifelder, 1987). Pada proses kloning gen,

enzim restriksi endonuklease yang digunakan umumnya adalah tipe II karena

dapat memotong DNA pada sisi spesifik, sehingga dihasilkan pola potongan

spesifik. Sisi pengenalan enzim restriksi endonuklease tipe II berupa inverted

repeats, yaitu sekuen dapat dibaca sama dari arah manapun, atau disebut

palindrome (Brown, 2010).

2.8.3 Ligasi antara DNA Insert dengan Plasmid

DNA vektor dan DNA target yang telah dipotong dengan menggunakan

enzim restriksi, kemudian digabungkan untuk membentuk DNA rekombinan

(Snustad and Simmons, 2006). Proses tersebut dinamakan proses ligasi, sebab

dilakukan dengan menggunakan enzim DNA ligase. DNA ligase mengkatalisis

pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5' fosfat dan 3'-hidroksil terminal

dalam DNA dupleks (Ausubel et al, 1995). Nama enzim biasanya yang di

gunakan adalah T4 ligase.




T4 ligase ini adalah nama enzim DNA ligase yang lain yang efisien

bergabung ujung tumpul Terminal di bawah kondisi reaksi normal. Ligasi ujung

lengket yang pada umumnya dilakukan pada suhu 12oC sampai 15oC, sedangkan

ligasi ujung tumpul biasanya dilakukan pada suhu kamar (<30oC) dengan 10

sampai 100 kali lebih enzim dari ligasi ujung lengket. T4 DNA ligase dihambat

kuat oleh konsentrasi NaCl > 150 mM. (Ausubel et al, 1995).

2.8.4 Transformasi DNA Rekombinan

Transformasi DNA rekombinan adalah proses transfer DNA plasmid

rekombinan ke dalam sel inang (Mulis, 1990). Syarat utama dalam transformasi

DNA rekombinan adalah sel inang harus dibuat kompeten terlebih dahulu. Sel

kompeten tersebut yang kemudian dicampur dengan plasmid rekombinan untuk

proses transformasi ke dalam sel inang, proses ini yang disebut elektroporasi yaitu

mendorong DNA ke dalam sel dengan dialiri arus listrik (Mulis, 1990).

Elektroporasi merupakan metode transformasi paling cepat, mudah dan efisien.

Efisiensi transformasi diperoleh dapat mencapai 1010 transforman/µg DNA

(Sambrook, 1989).

Metode transformasi dilakukan dengan kejutan panas (heat shock) yang

diawali dengan pemberian CaCl2 untuk menghasilkan sel bakteri yang kompeten,

molekul DNA, misalnya plasmid, dimasukkan ke dalam sel kemudian akan

bereplikasi di dalam sel. Sel kemudian diinkubasi dalam medium pertumbuhan

non-selektif untuk memulihkan kondisi sel (membran sel kembali utuh). Sel

bakteri yang umum digunakan dalam proses transformasi DNA rekombinan

adalah Escherichia coli (Sambrook &Russell, 2001).




2.8.5 Sekuensing DNA

sekuensing DNA adalaah suatu metode yang digunakan untuk membaca

urutan basa nukleotida yang terdapat dalam suatu molekul gen. dalam dunia

kedokteran manfaat dari sekuensing DNA adalah dapat digunakan untuk

mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatan penyakit

genetik. Dalam sekuensing DNA terdapat dua metode yang sering digunakan,

yaitu metode secara enzimatik oleh Fredrick Sanger dan metode Metode kimiawi

oleh Maxam - Gilbert (Brown, 2010; Devor, 2005).

1. Metode kimiawi oleh Maxam - Gilbert

Metode yang dikembangkan adalah untuk sekuensing DNA untai tunggal

dengan mengambil keuntungan dari proses dua langkah katalitik yang

melibatkan Piperidina dan dua bahan kimia yang selektif menyerang purin

dan pirimidin (Devon, 2005). Selain itu sulfat, dimetil dan piperidina secara

selektif akan membelah nukleotida guanin namun dimetil sulfat dan

Piperidina di asam formiat akan membelah baik nukleotida guanin maupun

adenin. Fragmen DNA untai ganda yang akan ditentukan urutannya mula-

mula dilabel menggunakan gugus fosfor radioaktif pada ujung 5’ tiap

untai. reaksi-reaksi akan di muat pada gel poliakrilamida dengan

persentase tinggi dan fragmen diselesaikan oleh elektroforesis.

2. Metode enzimatik oleh Frederick Sanger

Rantai pemutusan sekuensing DNA yang didasarkan pada prinsip bahwa

molekul DNA untai tunggal yang berbeda panjang dengan hanya satu

nukleotida tunggal dapat dipisahkan dari satu lain oleh elektroforesis gel




poliakrilamida. Bahan awal untuk percobaan sekuensing terminasi rantai

merupakan persiapan molekul DNA untai tunggal yang identik. Langkah

pertama adalah untuk penempelan oligonukleotida pendek ke posisi yang

sama pada setiap molekul. Langkah kedua adalah sintesis untai reaksi,

yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase dan membutuhkan empat

trifosfat deoksiribonukleotida (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP) sebagai

substrat. (Brown, 2010). Untuk mengetahui urutan DNA hasil analisis,

adalah mengidentifikasi dideoksinukleotida diakhir setiap rantai molekul-

terminasi.




BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Proteomik, Institute

Tropical Desease, Universitas Airlangga, Surabaya . Penelitian ini dimulai pada

bulan Januari 2012 sampai bulan Juli 2012.

3.2 Sampel Penelitian

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat A dari bakteri

asal sistem abdominal rayap tanah yang diperoleh dari A. A. Istri Ratnadewi S,Si.

M,Si (Universitas Jember, Indonesia) dan plasmid pET-30a(+) (Novagen).

3.3 Bahan dan Alat Penelitian

3.3.1 Bahan Penelitian

Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: buffer TE,

bacto-agar, lisozim, tris Cl, SDS, HCl, EDTA, proteinase K, kloroform, fenol,

isoamilalkohol, natrium asetat, etanol absolut, etanol 70%, NaOH, dNTP, Taq

DNA polimerase, primer forward xynF, primer reverse xynR, buffer PCR,

MgCl2, ddH2O, agarosa, tripton, yeast extract, NaCl, buffer TAE, etidium

bromida, DNA purification kit, kanamisin (100µg/mL), enzim restriksi SacI dan

XhoI, T4 Ligase, buffer ligasi, NaOH, asam asetat glasial, Glukosa.

26




3.3.2 Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan adalah autoklaf (OSK 6508 Steam pressure

apparatus Ogawa Seiki Co., LTD), laminair air flow cabinet (Kottermann 8580),

sentrifuga Beckman (tipe TJ-6), timbangan analitik (Mettler Toledo), pH meter

(Metro-ohm 744), oven (Memmert, Jerman), rotary shaker, lemari pendingin -20

0C (Royal Chest Freezer BD195), pipet mikro (Eppendorf), waterbath (sansat type

syk-382-M), shaker incubator (Heidolph Polymax 1040), Spektrofotometer UV-

VIS (Shimadzu UV-1700), Polymerase Chain Reaction (BioRad), UV

transluminator, Sequencer (Applied Biosystems) dan alat-alat gelas yang lazim

digunakan di laboratorium.




Isolasi DNA kromosom

Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-

xilanase dengan primer xynF dan xynR +

Pemurnian amplikon

Restriksi dengan SacI dan XhoI

3.4 Diagram alir penelitian

bakteri xilanolotik Isolat A

DNA kromosom Isolat A

Restriksi dengan SacI dan XhoI, dan pemurnian plasmid

Gen endo-1,4-β-xilanase

Plasmid pET-30a(+) dalam E.coli rekombinan

Isolasi DNA plasmid

Plasmid pET30a(+)

Ligasi

Plasmid Rekombinan

E.coli Dengan molekul DNA rekombinan (Transforman)

Transformasi ke E.coli Top10

E.coli Top10 rekombinan

Seleksi transforman

Urutan basa nukleotida gen endo-1,4-β-xilanase rekombinan

Sekuensing




3.5 Prosedur Penelitian

Teknik molekuler ini dilakukan berdasarkan metode dari Smbrook et, al (1989).

3.5.1 Pembuatan Larutan

3.5.1.1 Pembuatan larutan buffer TE 500mM

Larutan stok Tris Cl 500 mM sebanyak 50 mL dibuat dengan cara

menimbang secara kuantitatif 3,0285 gram tris Cl, diadd kan dalam 50 mL H2O.

Dibuat dalam dua pH. Yaitu pH 7,5 dan pH 8. Larutan stok EDTA 500 mM

sebanyak 25 mL, ditimbang secara kuantitatif 4,653 gram EDTA, dilarutkan

dalam 25 mL H2O, dibuat dalam pH 8 dengan cara menambahkan sedikit demi

sedikit larutan NaOH.

3.5.1.2 Pembuatan larutan lisosim

Stok lisosim 10 mg/mL ditimbang secara kuantitatif 0.01 gram

dimasukkan kedalam tabung Eppendorf 1,5 mL lalu ditambahkan akuades hingga

1 mL

3.5.1.3 Pembuatan larutan STEP 500 µL

Ke dalam tabung Eppendorf, ditimbang secara kuantitatif SDS 0,5 %

sebanyak 0,0025 gram, ditambahkan Tris Cl 50 mM pH 7,5 sebanyak 50 µL, 400

µL EDTA 0,4 M dan proteinase K dari stok 20 mg/mL diambil 25 µL, semua

dicampur dalam tabung Eppendorf dan dihomogenkan.

3.5.1.4 Pembuatan larutan Na-Asetat 3M

Di timbang secara kuantitatif 2,4609 gram natrium asetat dan dimasukkan

dalam gelas beker lalu diadd kan 10 mL akuades.




3.5.2 Pembuatan Media

3.5.2.1 Pembuatan Media Cair untuk pemeliharaan E.coli

Media cair yang digunakan adalah media Luria Bertani. Media ini dibuat

dengan melarukan 1% tripton, 1% NaCl, dan 0,5% yeast extract dalam akuades.,

media cair yang dituangkan kedalam erlenmeyer sebaiknya mengisi 1/5 dari

bagian Erlenmeyer. Hal ini dilakukan untuk mencukupi kebutuhan udara pada

pertumbuhan bakteri.

3.5.2.2 Pembuatan Media Cair untuk pemeliharaan E.coli (pET-30a(+))

Media cair yang digunakan adalah media Luria Bertani kanamisin. Media

ini dibuat dengan melarukan 1% tripton, 1% NaCl, dan 0,5% yeast extract dalam

akuades serta 0,5 µL kanamisin, yaitu antibiotik yang digunakan untuk

menumbuhkan plasmid pET-30a(+), media cair yang dituangkan kedalam

Erlenmeyer sebaiknya mengisi 1/5 dari bagian Erlenmeyer. Hal ini dilakukan

untuk mencukupi kebutuhan udara pada pertumbuhan bakteri.

3.5.2.3 Pembuatan Media Padat

Media padat yang digunakan merupakan media LB (Luria Bertani) yang

digunakan untuk meremajakan koloni Bacillus subtilis. Ditimbang 1 gram bacto-

agar, 0,5 gram tripton, 0,5 gram NaCl, dan 1 gram yeast extract, kemudian semua

bahan di atas dilarutkan dalam 50 mL akuades. Selanjutnya media tersebut

dipindahkan ke dalam erlenmeyer dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu

121oC selama 15 menit. Media steril yang masih hangat-hangat kuku

dihomogenkan kemudian dituang ke dalam cawan petri sebanyak 20 mL. Media

yang telah memadat disimpan dalam lemari pendingin.




3.5.2.4 Pembuatan Media Padat untuk koloni E.coli (pET-30a(+))

Media yang digunakan merupakan media Luria Bertani (LB). Media padat

digunakan untuk meremajakan koloni E. coli Top10 yang mengandung

pET30a(+). Dibuat media padat 20 mL, ditimbang 0,4 g agar, 0,2 g pepton, 0,2 g

NaCl , dan 0,1 g yeast extract, dilarutkan dalam 20 mL aquades, disterilkan

dengan autoklaf suhu 1210C selama 15 menit. Media steril yang telah hangat-

hangat kuku ditambah dengan 10 µL kanamisin (100 mg/mL), dihomogenkan

kemudian dituang ke dalam cawan petri.

3.5.3 Peremajaan isolat bakteri xilanolitik (isolat A)

Proses peremajaan bakteri dimulai dari mengambil biakan isolat A dari

kultur sebelumnya. Isolat diambil dengan menggunakan kawat ose. Lalu kawat

yang mengandung biakan ini digoreskan pada media padat yang baru. Selanjutnya

biakan diinkubasi pada oven dengan suhu 370C selama 18 jam.

3.5.4 Isolasi DNA kromosom isolat A

Koloni tunggal isolat A diinokulasikan ke dalam 5 ml media cair dan

diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 370C dengan kecepatan 150 rpm

selama 18 jam. Kemudian sebanyak 5 ml suspensi sel disentrifuge selama 2 menit

dengan kecepatan 10.000rpm pada suhu 4oC. Setelah terpisah, supernatan dibuang

kemudian pellet sel diresuspensi dengan 250 µl buffer TE (50 mM tris HCl pH 8

dan 50 mM EDTA). Larutan tersebut dibekukan pada suhu -20oC selama 30

menit. kemudian ditambahan 250 µL lisozim 10mg/ml ke dalam sel beku dan

dibiarkan mencair pada suhu kamar. Larutan sel yang sudah mencair dimasukkan

ke dalam penangas es selama 45 menit. Lalu menambahkan larutan STEP (SDS




1%, Tris Cl, EDTA pH 8, proteinase K) sebanyak 50µL ke dalam suspensi dan

dicampur rata. Campuran ini selanjutnya dipanaskan dalam waterbath pada suhu

50oC selama 1 jam sambil sesekali digoyang perlahan. Kemudian ditambahkan

300µL larutan fenol jenuh ke dalam campuran lalu dikocok sampai terbentuk

emulsi. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 12.000rpm selama 5 menit

sampai terpisah dua lapisan. DNA yang diinginkan berada pada lapisan atas.

Lapisan atas dipipet secara hati-hati dan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf

yang steril. Selanjutnya ditambahkan larutan natrium asetat 0,3 M sebanyak 0,1

kali dari volume total hasil pemipetan DNA, lalu dicampur perlahan. Kemudian

ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali volume larutan kemudian

tabung dibolak-balik untuk pencampuran. Setelah itu, campuran diinkubasi pada

suhu -20oC selama 2 jam sampai semalam. Campuran disentifugasi pada 12000

rpm selama 5 menit, kemudian supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan 0,6

ml etanol 70%. Sentrifuge kembali campuran pada 12000 rpm selama 5 menit.

Pelet diambil kemudian ditambahkan 30 µL ddH20

3.5.5 Peremajaan E.coli (pET-30a(+))

Proses peremajaan bakteri dimulai dari mengambil koloni E. coli yang

mengandung plasmid pET-30a(+) dari kultur sebelumnya. Koloni diambil dengan

menggunakan kawat ose. Lalu kawat yang mengandung biakan ini digoreskan

pada media padat yang baru. Selanjutnya biakan diinkubasi pada oven dengan

suhu 370C selama 16 jam.




3.5.6 Isolasi DNA plasmid pET-30a(+)

Koloni tunggal transforman E.coli diinokulasikan ke dalam 5 mL media

LB cair yang mengandung 2.5 µL kanamisin dan diinkubasi pada shaker

incubator pada suhu 370C dengan kecepatan 150 rpm selama 16 jam. Kemudian

sebanyak 5 ml suspensi sel di sentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan

10.000 rpm pada suhu 40C, pellet disuspensi dengan larutan I (Glukosa 50 mM,

Tris-Cl 2.5 mM pH 8, Na2EDTA 10 mM pH 8) 100 µL dan dihomogenkan lalu

didiamkan 5 menit. Ditambahkan 200 µL larutan II (NaOH 0.2 N 20 µL, SDS 1%

100 µL, aquades steril 880 µL) dan dihomogenkan dengan cara membolak balik

tabung Eppendorf, larutan di inkubasi di es selama 15 menit, setelah 15 menit

ditambahkan 150 µL larutan III (Kalium asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O

dingin), di inkubasi dalam es selama 10 menit. campuran tersebut disentrifugasi

selam 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm suhu 40C, supernatan yang diperoleh

dipindah secara perlahan dengan menggunakan pipet kedalam tabung Eppendorf

baru yang steril dan ditambahkan campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol

(25:24:1) 1 kali volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian

disentrifugasi lagi 12.000 rpm 2 menit. dihasilkan 3 lapis, fasa paling bawah

adalah fasa organik, fasa tengah adalah suatu emulsi putih dan fasa paling atas

adalah fasa cair, fasa cair di pindah dengan cara mempipet secara hati-hati

kedalam tabung eppendorf baru yang steril, fasa cair tersebut dipekatkan dengan

penambahan etanol absolut dingin 2 kali volume total, dan diinkubasi dalam es

selama 1 jam. Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, pellet dicuci

dengan etanol dingin 70% sentrifugasi lagi dan tabung eppendorf di keringkan




dari etanol dengan cara membalikkan tabung dan didiamkan 5 menit. Kemudian

pellet dilarutkan dalam 30 µL ddH2O.

3.5.7 Pemurnian DNA plasmid pET-30a(+)

Purifikasi DNA plasmid menggunakan Kit QS Aquick Gel Extraction kit

50, Pertama-tama gel agarosa yang mengandung pita DNA plasmid dipotong

dengan menggunakan cutter bersih dan dimasukkan dalam tabung Eppendorf,

berat total gel dan Eppendorf maksimal 1,3 gram. Pada tabung tersebut

ditambahkan buffer QG 3X volume, dan diinkubasi dalam waterbath suhu 500C

selama 10 menit yang setiap 5 menit tabung eppendorf dibolak balik untuk

penghomogenan larutan. Setelah gel larut dengan sempurna, tabung eppendorf

tersebut si spin sebentar dan di pindah kedalam sebanyak 800µL ke kolom

QIAquick yang dilengkapi dengan tabung pengumpul lalu disentrifugasi 12.000

rpm selama 1 menit. Air pada tabung pengumpul dibuang dan pada kolom dicuci

dengan buffer PE sebanyak 750 µL dan didiamkan selam 30 menit. Lalu

disentrifugasi 12.000 rpm 1 menit, air pada tabung pengumpul dibuang dan

dilakukan lagi sentrifugasi 12.000 rpm 1 menit. Kemudian ditambah ddH20 30 µL

pada kolom, sedangkan tabung pengumpul di ganti dengan tabung eppendorf baru

yang steril dan didiamkan 30 menit baru dilakukan sentrifugasi 12.000 rpm

selama 1 menit. kemudian mengulangi langkah ini sekali lagi. Larutan yang

berada dalam tabung eppendorf disimpan dalam freezer suhu -200C.




3.5.8 Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase menggunakan teknik

PCR

Proses amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase menggunakan teknik

PCR. Komponen reaksi PCR yang digunakan komposisinya adalah 6,5 L ddH2O

steril, 1µL MgCl2, 1 L primer xynF (50 pmol), 1L primer xynR (50 pmol) dan

3 L DNA kromosom (hasil isolasi DNA) yang digunakan sebagai template,

mastermix 12,5 µl. Total volume PCR sebanyak 25 L. Proses amplifikasi gen

endo-1,4-β-xilanase dilakukan pada kondisi denaturasi pada suhu 94oC selama 1

menit, annealing pada variasi suhu 40oC; 48oC; 52,oC; 58 oC selama 1 menit dan

extension pada suhu 72oC selama 1 menit dengan jumlah siklus 30 kali. Proses

amplifikasi diawali dengan predenaturasi pada suhu 94oC selama 5 menit dan

diakhiri dengan post extension yang dilakukan pada suhu 72oC selama 10 menit

3.5.9 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa

Analisis DNA plasmid menggunakan elektroforesis gel agarosa (1%).

Sebelumnya dilakukan persiapan pada perangkat elektroforesis yaitu dengan

menambahkan buffer TAE 0,5x sampai gel agarose tercelup. Campuran DNA dan

loading dye yang telah homogen kemudian dimasukkan dalam sumur pada gel

agarosa. Kemudian perangkat alat elektroforesis tersebut dialiri arus listrik sebesar

80 V dan dibiarkan sampai loading dye berjalan kurang lebih 2/3 gel agarosa. Gel

kemudian dipindah dan dilakukan proses staining dengan direndam dalam larutan

TAE yang telah diberi 20 µL Etidium Bromida (EtBr) selama 30-45 menit.

Kemudian untuk menghilangkan sisa EtBr pada gel dilakukan dengan




memasukkan gel kedalam akuades steril. Untuk memvisualisasi DNA yang telah

dielektroforesis digunakan sinar UV dan kemudian didokumentasikan dengan

kamera polaroid atau menggunakan geldoc.

3.5.10 Pemurnian amplikon

Pemurnian DNA kromosom hasil dari PCR menggunakan Kit QS A Quick

Gel Extraction kit 50, Pertama-tama gel agarosa yang mengandung pita DNA

kromosom dipotong dengan menggunakan cutter bersih dan dimasukkan dalam

tabung eppendorf, berat total gel dan eppendorf maksimal 1.3 gram. Pada tabung

tersebut ditambahkan buffer QG 3X volume, dan diinkubasi dalam waterbath suhu

500C selama 10 menit yang setiap 5 menit tabung eppendorf dibolak balik untuk

penghomogenan larutan. Setelah gel larut dengan sempurna, tabung eppendorf

tersebut si spin sebentar dan di pindah kedalam sebanyak 800µL ke kolom

QIAquick yang dilengkapi dengan tabung pengumpul lalu disentrifugasi 12.000

rpm selama 1 menit. Air pada tabung pengumpul dibuang dan pada kolom dicuci

dengan buffer PE sebanyak 750 µL dan didiamkan selam 30 menit. Lalu

disentrifugasi 12.000 rpm 1 menit, air pada tabung pengumpul dibuang dan

dilakukan lagi sentrifugasi 12.000 rpm 1 menit. Kemudian ditambah ddH20 30 µL

pada kolom, sedangkan tabung pengumpul di ganti dengan tabung eppendorf baru

yang steril dan didiamkan 30 menit baru dilakukan sentrifugasi 12.000 rpm

selama 1 menit. kemudian mengulangi langkah ini sekali lagi. Larutan yang

berada dalam tabung eppendorf disimpan dalam freezer suhu -200C.




3.5.11 Restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+)

Amplikon yang telah dimurnikan dan plasmid yang telah di isolasi

dilakukan proses restriksi yaitu proses pemotongan DNA oleh enzim restriksi

yang digunakan yaitu SacI dan XhoI dan reagen-reagen tertentu. kedalam tabung

eppendorf 1.5 mL, DNA plasmid sebanyak 21.7 µL, dicampur dengan 3µL buffer

10X, BSA 0.3 µL, enzim restriksi SacI 2µL dan XhoI 3µL sehingga volume total

adalah 30µL. Campuran tersebut di inkubasi dalam waterbath suhu 370C selama 1

jam dan setiap 30 menit di lakukan penghomogenan campuran dengan cara tabung

eppendorf dibolak balik secara perlahan.

3.5.12 Ligasi Gen Penyandi endo-1,4-β-xilanase dan Plasmid pET-30a(+)

Dimasukkan kedalam tabung Eppendorf baru dan steril ddH2O 7,6 µL, lalu

gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dan DNA plasmid pET-30a(+) yang telah

dipurifikasi dan direstriksi, 3µL DNA plasmid dan 7µL gen penyandi endo-1,4-β-

xilanase, kemudian ditambahkan buffer ligasi 2µL, spin campuran tersebut dan

terakhir ditambahkan T4 ligase 0,4µL. Inkubasi dalam pengangas es yang

kemudian ditaruh dalam suhu 4oC selama 18 jam.

3.5.13 Kloning pET-30a(+) rekombinan kedalam E. coli Top10

3.5.13.1 Peremajaan Isolat E. coli Top10 dari Stok Gliserol

Proses peremajaan E. coli Top10 dimulai dari mengambil isolat E. coli

Top10 dari stok gliserol suhu -80 oC. isolat dalam keadaan beku, diambil dengan

menggunakan kawat ose lalu kawat yang mengandung biakan ini digoreskan pada




media padat yang baru. Selanjutnya biakan diinkubasi pada oven dengan suhu

370C selama 18 jam.

3.5.13.2 Pembuatan Sel Kompeten E. coli Top10

E.coli Top10 yang telah diremajakan diinokulasikan dalam 4 mL media

LB cair overnight (16-18 jam). Diambil 1% dari E.coli yang telah dikulturkan

selama 18 jam dan diinokulasikan kedalam media LB cair 50mL diinkubasi pada

shaker incubator pada suhu 370C dengan kecepatan 150 rpm selama 2-2,5 jam

dengan syarat kultur ditumbuhkan sampai OD600 nm =0,4. Setelah kultur mencapai

optical density nya sama dengan 0,4, kultur diletakkan di penangas es selama 10

menit. di ambil dengan menggunakan mikropipet sebanyak 1mL kultur yang telah

dingin dan dimasukkan kedalam tabung eppendorf 1,5mL yang baru dan steril.

Sentrifugasi 1 menit kecepatan 12000 rpm suhu 4oC, buang supernatannya dan

diulangi kembali dengan menambahkan lagi 1mL kultur yang telah dingin

kedalam tabung Eppendorf dan di sentrifugasi lalu supernatannya dibuang.

Kemudian kultur dilarutkan pada 1mL CaCl2 0,1M. Larutan CaCl2 tersebut harus

dalam keadaan dingin dan dihomogenkan dengan cara membolak balikkan

tabung. Campuran tersebut diinkubasi dalam es selama 30 menit lalu

disentrifugasi selama 1 menit 12000 rpm suhu 4oC supernatannya dibuang. Pellet

yang didapat diresuspensikan dengan menggunakan 50 µL larutan CaCl2 0,1M

dingin dan fresh. Untuk membuat stok gliserol, larutan sel setelah diberi larutan

CaCl2 dingin, ditambahkan 14,5% 50µL gliserol, kemudian dihomogenkan

dengan cara membolak balik tabung dan disimpan dalam suhu -80oC




3.5.13.3 Transformasi Plasmid pET-30a(+) ke E.coli Top10

Proses transformasi dilakukan dengan mencampurkan 10 µL hasil ligasi

gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dan plasmid pET30a(+) ke dalam 100 µL sel

kompeten E.coli Top10. Campuran diinkubasi pada suhu 4 °C selama 30 menit.

Heat shock dilakukan dengan menginkubasi campuran sel dalam waterbath pada

suhu 420C selama 1 menit, kemudian segera dipindah ke icebath selama 2 menit.

Tahap selanjutnya adalah penambahan 200 µL media LB cair ke dalam masing-

masing campuran sel, selanjutnya diinkubasi dalam shaker incubator suhu 370C

selama 1 jam. Tahap terakhir adalah menumbuhkan sel hasil transformasi ke

media agar plate yang mengandung kanamisin, yaitu dengan cara memipet 100

µL suspensi sel kemudian disebar ke permukaan media, lalu diinkubasi pada suhu

370C selama 16 jam. Plasmid yang ada dalam sel inang E.coli Top10

ditumbuhkan pada media agar LB (Luria Bertani) yang mengandung kanamisin,

karena plasmid pET30a(+) memiliki gen resisten kanamisin sedang inang E.coli

Top10 tidak memiliki gen resisten kanamisin.

3.5.14 Seleksi transforman koloni E.coli Top10 pembawa plasmid

rekombinan pET-30a(+)

Seleksi transforman untuk mendapatkan koloni pembawa plasmid yang

mengandung gen endo-1,4-β-xilanase dilakukan dengan restriksi plasmid dengan

enzim XhoI. Dari koloni yang tumbuh hasil transformasi produk ligasi antara gen

endo-1,4-β-xilanase dan plasmid pET-30a(+) diambil koloni yang tumbuh dan

dilakukan isolasi plasmid dengan metode alkali dan dilakukan secara

konvensional. Dari hasil isolasi plasmid kemudian dilakukan restriksi dengan




enzim XhoI untuk mengetahui adanya gen insert yang telah masuk dalam plasmid

pET30a(+) lalu dilakukan analisis dengan elektroforesis gel agarosa.

3.6 Sekuensing dengan metode Sanger

Proses sekuensing dilakukan dengan menggunakan alat Applied

Biosystems di laboratorium 1st Base dengan menggunakan primer T7 promotor

dan T7 terminator.

3.7 Analisis homologi hasil rekombinan dengan gen lain yang telah dipublikasikan dalam database Genbank menggunakan program BLAST

Sekuens rekombinan pembawa gen endo-1,4-β-xilanase yang telah didapatkan

kemudian dianalisis homologinya dengan gen lain yang juga menyandi gen endo-

1,4-β-xilanase dengan menggunakan program BLAST. Program ini diakses

melalui alamat website yaitu http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ selanjutnya dilakukan

langkah-langkah seperti di bawah ini

1. Klik nucleotide blast

2. Dimasukkan hasil sekuens ke dalam kotak yang bertuliskan ”Enter accession

number, gi, or FASTA sequence”

3. Pada kotak bertuliskan “Choose Search Set” dipilih “Others (nr etc)” sebagai

database.

4. Klik BLAST

Setelah melakukan langkah di atas, kemudian ditunggu selama beberapa detik dan

hasil analisis homologi akan muncul.




BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi DNA kromosom isolat A

Hasil analisis elektroforesis gel agarosa (1%) di dapatkan kadar kemurnian

DNA kromosom isolat A yaitu 267,7 ng/µL dan rasio 1,88. Teknik isolasi DNA

kromosom isolat A berdasarkan dengan metode pengendapan etanol (Sambrook et

al,. 1989). Kultur isolat A yang telah ditumbuhkan pada suhu 370C selama 18 jam

disentrifugasi dan mendapatkan pelet sel. Pelet sel kemudian diresuspensi dengan

buffer TE dan dilisis. Teknik-teknik pemecahan sel bakteri dilakukan melalui 3

macam metode, (1) cara mekanik atau fisik, yaitu sel dipechkan dengan cara

sonikasi, grinding, dan homogenisasi. (2) cara kimiawi yaitu dengan

menambahkan senyawa kimia seperti EDTA dan SDS. Dan (3) proses enzimatis

menggunakan larutan lizosim atau kitinase (Brown, 2010). Pada penelitian ini

proses lisis sel untuk DNA kromosom yaitu dengan metode enzimatis dan

kimiawi, yaitu penambahan larutan lisozim yang berfungsi untuk proses lisis

membran sel bakteri. Sedangkan proses lisis secara kimiawi menggunakan SDS

pada tahapan pemberian larutan STEP yang terdiri atas SDS, tris Cl, EDTA dan

proteinase K berfungsi untuk menyempurnakan kerusakan dinding dan membran

sel bakteri saat proses lisis secara kimiawi dan enzimatis, selain itu, EDTA

ditambahkan untuk menghilangkan ion magnesium yang penting dalam

mempertahankan struktur sel dan untuk menghambat enzim- enzim seluler yang

dapat merusak DNA (ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang

41




10000 bp 8000 bp 6000 bp 5000 bp 4000 bp 3000 bp

bisa “memakan” DNA) (Brown, 2010). Penambahan SDS berguna untuk

menghilangkan molekul lipid pada membran sehingga menyebabkan kerusakan

sel. Kedalam suspensi sel kemudian ditambahkan larutan fenol jenuh yang

berfungsi untuk mendenaturasi protein. Larutan fenol jenuh berperan untuk

mendenaturasi sehingga terjadi pengendapan protein, sehingga DNA akan larut

dalam fasa air atau supernatan yang berada di lapisan atas. DNA selanjutnya

diendapkan dengan natrium asetat dan etanol absolut, endapan DNA di larutkan

dalam ddH2O. Analisis DNA dilakukan menggunakan elektroforesis gel agarosa

(1%).

Gambar 4.1 Elektroforesis hasil isolasi DNA kromosom. (A) Marker GeneRulerTM 1 kb DNA ladder, (B) Hasil isolasi DNA kromosom

4.2 Isolasi DNA plasmid pET-30a(+)

DNA plasmid pET-30a(+) diisolasi dari E.coli dengan menggunakan

metode alkali (Sambrook et al,. 1989). Kultur dari E.coli yang membawa plasmid

pET-30a(+) yang telah ditumbuhkan pada suhu 370C selama 18 jam dilakukan

sentrifugasi untuk didapatkan pellet sel. Pelet sel yang telah didapatkan

A B




diresuspensi dengan larutan I atau larutan GTE (Glukosa, Tris-HCl dan EDTA)

yang digunakan sebagai agen pengkhelat logam. Proses denaturasi pada plasmid

dilakukan pada tahap penambahan larutan 0,2 N NaOH dan 1 % SDS. proses

denaturasi ini dinamakan denaturasi alkali, SDS berfungsi untuk merusak

membran sel bakteri dengan cara menghancurkan lemak yang terdapat dalam

membran sel bakteri, sedangkan NaOH berperan sebagai pemberi suasana basa

pada proses denaturasi sehingga pH yang semula normal akan berubah naik

menjadi antara 12,0-12,5. Pada saat pH antara 12,0-12,5 ikatan hidrogen pada

molekul DNA non-supercoiled atau DNA kromosom dari bakteri akan

terdenaturasi dan menyebabkan ikatan double-helix terurai dan kedua rantai

polinukleotida memisah sehingga menjadi single-helix sedangkan DNA plasmid

tidak mengalami denaturasi (Brown, 2010). Dengan penambahan larutan III atau

larutan garam tinggi, yang terdiri atas kalium asetat, asam asetat glasial, dan

ddH2O, ekstrak sel mengalami penurunan pH dari basa ke asam sehingga untai

DNA kromosom yang telah terdenaturasi akan mengalami renaturasi acak

sehingga DNA kromosom akan mengelompok dan beragregasi membentuk suatu

emulsi dan diendapkan dengan cara sentrifugasi sehingga DNA kromosom akan

mengendap sebagai pellet sedangkan DNA plasmid akan berada pada supernatan

dan tidak ikut mengendap. Sedangkan protein dihilangkan dengan cara denaturasi

protein pada penambahan campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1).

Pada proses penambahan campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1),

DNA plasmid akan larut dalam fasa air atau supernatan yang berada di lapisan

atas sedangkan protein akan mengendap. Setelah fasa air dipipet secara hati-hati,




10000 bp

8000 bp

4000 bp

3000 bp

2000 bp

1500 bp

larutan DNA plasmid ditambah dengan etanol absolut untuk proses presipitasi

DNA. Untuk menganalisis DNA plasmid pET-30a(+) hasil isolasi dilakukan

analisis menggunakan elektroforesis gel agarosa (1%).

Gambar 4.2 Elektroforesis hasil isolasi DNA plasmid pET-30a(+). (A) hasil isolasi DNA plasmid pET-30a(+), (B) Marker GeneRulerTM 1 kb

DNA ladder

Gambar 4.2 hasil elektroforesis dari DNA plasmid pET-30a(+) menunjukkan

adanya 3 pita yang secara topologi merupakan bentuk supercoil, linier dan open

circular (Clowes, 1972). Plasmid pET-30a(+) mempunnyai ukuran 5422 bp

(Novagen), namun demikian untuk menentukan ukuran pasang basa plasmid

ditentukan dengan analisis sekuensing

4.3 Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dengan teknik PCR

PCR adalah serangkaian reaksi pada proses penggandaan DNA secara

invitro yang dilakukan dalam tabung Eppendorf dengan mencampurkan reagen-

reagen yang terdiri dari cetakan DNA, primer forward dan primer reverse, Taq

A B




DNA polymerase, buffer PCR, dNTP, MgCl2, ddH2O, campuran reaksi

ditempatkan pada suatu cycler secara terprogram dengan serangkaian suhu yang

bervariasi (Brown, 2010). Cetakan DNA yang digunakan adalah DNA kromosom

yang mengandung gen penyandi endo-1,4-β-xilanase yang akan diamplifikasi.

Untuk penelitian ini, digunakan master mix yaitu suatu campuran dari dNTP, Taq

polymerase dan buffer PCR. dNTP berisi basa-basa nukleotida dan dengan

bantuan enzim DNA polymerase basa-basa nukleotida tersebut akan

dipolimerisasi sehingga diperoleh DNA target. Dalam teknik PCR diperlukan

DNA polimerase yang termostabil seperti Taq polimerase. Taq DNA polimerase

memiliki kemampuan resisten terhadap denaturasi oleh panas, sehingga Taq DNA

polimerase sesuai untuk proses PCR. Penambahan MgCl2 dalam reaksi PCR

berfungsi sebagai kofaktor (Sambrook and Russel, 2001). Salah satu faktor

penentu perolehan gen target dalam teknik PCR adalah proses desain primer

oligonukleotida. Dalam penelitian ini, primer didesain dengan cara mengambil

data basa nukleotida dari gen penyandi endo-1,4-β-xilanase kelompok glikosida

hidrolase famili 11 dari Bacillus subtilis yang telah dipublikasikan dalam

GenBank melalui website www.CAZy.org.

Primer merupakan suatu oligonukleotida yang akan menempel pada

cetakan DNA sehingga memungkinkan terjadinya proses amplifikasi. Primer

hanya menempel pada daerah tertentu dari DNA sehingga amplifikasi DNA hanya

terjadi pada daerah yang dibatasi oleh primer forward dan reverse (Brown, 2010)

Suatu primer dalam PCR merupakan kunci utama dari proses PCR. Primer yang




didesain dengan benar, akan menghasilkan amplifikasi oleh fragmen DNA

tunggal yang sesuai dengan wilayah target molekul cetakan (Brown, 2010).

Pada penelitian ini. primer forward yang digunakan didesain berdasarkan

dari sekuen primer yang telah berhasil untuk mengamplifikasi gen penyandi

xilanase dari Bacillus strain B10 di E.coli (Huang et al,. 2006) yaitu dengan

urutan basa sepanjang 39 basa nukleotida dari arah 5’ ke 3’ pada urutan start

kodon (ATG). Primer forward yang digunakan memiliki panjang nukleotida 39

basa. Primer reverse yang digunakan adalah yang di desain berdasarkan penelitian

skripsi tentang amplifikasi gen penyandi endo xilanase asal isolate 7 bakteri

xilanolitik sistem abdominal rayap tanah oleh Amaliah Labiqah (2012) dengan

urutan dari 3’ ke 5’ dengan panjang 23 basa nukleotida dan berakhir di stop kodon

(TAA). Primer digunakan dengan menambahkan sisi restriksi dari enzim SacI

untuk primer forward pada ujung 5’ dan XhoI untu primer reverse pada ujung 3’

Primer yang digunakan pada penelitian ini yaitu:

xynF: 5’- GGGGAGCTCATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTT -3’

xynR: 5’- GCCTCGAGTTACCACACTGTTAC -3’

Pada teknik PCR ada tiga langkah utama, yaitu denaturasi, annealing

(penempelan) dan extension (perpanjangan). Proses denaturasi terjadi pada suhu

940C, pada proses ini DNA cetakan mengalami denaturasi dari untai ganda

menjadi untai tunggal. Denaturasi DNA terjadi akibat adanya pemanasan yang

terjadi pada suhu tinggi sehingga merusak ikatan hidrogen yang menghubungkan

antara untai-untai basa nukleotida. Proses denaturasi ini memudahkan primer

untuk menempel pada DNA pada proses selanjutnya yaitu annealing. Annealing




merupakan proses penempelan primer pada DNA template yang mempunyai

pasangan basa yang komplemen dengan primer. Annealing dilakukan pada suhu

yang tepat karena jika suhu yang digunakan terlalu rendah maka primer akan

menempel ke daerah yang kurang spesifik sehingga dimungkinkan akan terjadi

amplifikasi lebih dari satu gen yang diinginkan. Namun, apabila suhu yang

digunakan terlalu tinggi kemungkinan pimer tidak akan menempel pada sisi

manapun dari cetakan DNA (Dieffenbach et al, 1993) oleh karena itu, dalam

proses PCR selalu digunakan variasi suhu saat annealing. Proses terakhir adalah

extension dilakukan pada suhu 72oC yang merupakan suhu optimum dari Taq

polimerase. Extension merupakan proses perpanjangan untai DNA oleh DNA

polimerase dimana perpanjangan rantai ini telah dibatasi oleh kedua buah primer

yang menempel. Pada proses ini DNA polimerase berperan sangat penting, yaitu

suatu enzim yang bertugas memperpanjang rantai DNA dengan menambahkan

basa nukleotida yang berasal dari dNTP.

Proses amplifikasi gen endo-1,4-β-xilanase dari isolat A dilakukan dengan

memvariasi suhu annealing pada suhu 40oC; 48oC; 52,oC; 58 oC. Variasi suhu

dilakukan dengan tujuan untuk menentukan suhu optimal dari primer agar dapat

menempel pada DNA template secara sempurna. Dari hasil variasi tersebut, gen

penyandi endo-1,4-β-xilanase dari isolat A dapat teramplifikasi dengan suhu

annealing 58oC sedangkan pada suhu 40oC; 48oC; 52,oC DNA target tidak

teramplifikasi. Amplikon yang didapatkan berasal dari pasangan primer xynF dan

xynR dengan ukuran nukleotida sebesar ±600bp yang menunjukkan bahwa ukuran

basa nukleotida gen endo-1,4-β-xilanase adalah ±600bp.




10000 bp

3000 bp

1000 bp

250 bp

10000 bp 3000 bp

1000 bp

250 bp

±600 bp

±600 bp

Gambar 4.3a Elektroforesis hasil amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase isolat A dengan primer xynF dan xynR. (A) Marker, (B) hasil amplifikasi xynF dan xynR suhu 58oC

Amplikon yang telah diperoleh dari proses PCR, kemudian dimurnikan dengan

tujuan untuk menghilangkan sisa-sisa zat dari reagen PCR, sehingga hanya

tertinggal DNA saja. Pemurnian DNA dilakukan dengan menggunakan kit

pemurnian Gene Clean dari QIAGEN.

Berikut adalah hasil elektroforesis hasil pemurnian amplikon

Gambar 4.3b Hasil elektroforesis amplikon yang telah dimurnikan. (A) Marker GeneRulerTM 1 kb DNA ladder, (B) DNA dari larutan amplikon pada suhu 58 oC.

A B

A B




4.4 Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase

4.4.1 Restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+)

Pada kloning gen tahap yang paling penting adalah proses restriksi

molekul DNA dan vektor dengan ukuran yang tepat. Vektor harus dipotong pada

posisi tunggal untuk membuka lingkaran sehingga molekul DNA dapat

diinsersikan. Tipe pemotongan pada enzim restriksi sangat berpengaruh dalam

kloning gen yang digunakan umumnya adalah tipe II yaitu enzim yang memotong

pada tempat yang spesifik pada molekul DNA pada urutan pengenal dan tidak

pada tempat lain. Endonuklease restriksi tipe II digunakan dengan alasan karena

dapat memotong DNA pada sisi spesifik, sehingga dihasilkan pola potongan

spesifik. Enzim restriksi yang digunakan pada penelitian ini adalah SacI dan XhoI

dengan model pemotongan yaitu ujung tumpul (sticky end). Amplikon yang telah

di purifikasi dan plasmid pET-30a(+) masing-masing di restriksi dengan SacI dan

XhoI kemudian untuk menjaga pH pada DNA ketika terjadi proses restriksi agar

stabil ditambahkan buffer restriksi. Dalam proses pemotongan DNA, enzim

restriksi perlu dilindungi supaya kerja enzim dalam memotong tidak mengalami

kesalahan sehingga ditambahkan BSA atau Bovine Albumin Serum yang bertugas

sebagai penstabil enzim sehingga kerja enzim restriksi dalam memotong DNA

tidak mengalami kesalahan. Campuran tersebut di inkubasi dalam waterbath suhu

370C selama 1 jam. Hasil analisis dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa

(1%).




10000 bp

8000 bp

5000 bp

3000 bp

2000 bp

1500 bp

500 bp ampliko

pET-

Gambar 4.4 Analisis restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+). (A) Hasil restriksi amplikon dengan enzim SacI dan XhoI (B) Hasil restriksi plasmid pET-30a(+) dengan enzim SacI dan XhoI (C) Marker

berdasarkan Gambar 4.6 pada plasmid pET-30a(+) setelah dilakukan restriksi

dengan menggunakan enzim SacI dan XhoI, pada analisis gel elektroforesis tidak

didapatkan lagi tiga pita seperti semula, melainkan hanya satu pita yang muncul.

Hal ini dikarenakan pada plasmid yang berbentuk sirkuler, pada sisi pemotongan

plasmid telah dilakukan pemotongan dengan menggunakan enzim SacI dan XhoI

sehingga plasmid terbuka dan membentuk linier sehingga plasmid dengan

diketahui berapa ukuran yang sebenarnya. Dalam hal ini plasmid pET-30a(+)

berukuran 5422 bp.

4.4.2 Ligasi Gen Penyandi endo-1,4-β-xilanase dan Plasmid pET-30a(+)

Plasmid pET-30a dan amplikon dari gen penyandi endo-1,4-β-xilanase

isolat A yang telah dipotong dengan menggunakan enzim restriksi, kemudian

digabungkan untuk membentuk DNA rekombinan, proses ini dinamakan dengan

ligasi (Snustad and Simmons, 2006). Proses ligasi menggunakan enzim T4 ligase

A B




yaitu suatu enzim yang dapat mengkatalisis ujung 5’-fosfat dan ujung 3’-hidroksil

antara plasmid pET-30a dengan gen penyandi endo-1,4-β-xilanase isolat A. Untuk

menjaga pH saat proses ligasi ditambahkan buffer ligasi. Sedangkan untuk

mengoptimalkan proses ligasi diperlukan inkubasi selama 18 jam dan enzim T4

ligase akan bekerja secara optimal pada suhu 40C.

4.4.3 Transformasi Plasmid pET-30a(+) rekombinan ke E.coli Top10

Dalam menganalisis adanya klon dapat dilakukan setelah DNA plasmid

pET-30a(+) rekombinan ditransformasi ke sel E.coli Top10 sebagai inangnya. Sel

inang ini merupakan sel inang yang khusus dirancang untuk penggandaan dan

penyimpanan plasmid rekombinan. Sel inang E.coli Top10 sebelum dipakai untuk

transformasi, terlebih dahulu diperlakukan secara fisik atau kimiawi yaitu dengan

penambahan CaCl2, atau garam lain sehingga akan memudahkan untuk masuknya

DNA dari luar sel bakteri. Dalam penelitian ini sel Bakteri diperlakukan dengan

penambahan larutan CaCl2 yang berfungsi melemahkan dinding sel sehingga

memudahkan masuknya plasmid rekombinan ke dalam sel bakteri (Gambar 4.6).

Sel-sel yang telah mengalami perlakuan ini disebut sebagai sel kompeten (Brown,

2010).

Gambar 4.5 Pengikatan dan pengambilan plasmid oleh sel kompeten dengan larutan CaCl2 ( Brown, 2010)




Proses transformasi diawali dengan mencampurkan plasmid rekombinan

dengan sel kompeten E.coli Top10 dan ditempatkan dalam wadah es yang

bertujuan untuk membuat plasmid berada menempel pada dinding sel kompeten

E.coli Top10. Heat shock dilakukan pada suhu 420C selama 1 menit bertujuan

untuk membuat kejutan sehingga plasmid rekombinan yang telah menempel pada

dinding sel masuk ke dalam sel kompeten E.coli Top10. Campuran langsung

dimasukkan ke dalam wadah berisi es segera setelah heat shock. Hal ini bertujuan

untuk mencegah plasmid yang sudah masuk ke dalam sel kompeten E.coli Top10

keluar kembali (Brown, 2010).

Pada penelitian ini teknik transformasi yang digunakan untuk mentransfer

plasmid pET-30a(+) rekombinan ke dalam sel inang E. coli Top10 dengan metode

heat shock. Setelah proses heat shock ke dalam sel-sel bakteri tersebut

ditambahkan medium LB dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 1 jam kemudian

di spreader pada media LB padat yang mengandung kanamisin, karena pEXyl06

merupakan suatu plasmid rekombinan yang memiliki gen resisten terhadap

kanamisin sedangkan E.coli Top10 tidak memiliki gen resisten terhadap

kanamisin, dan diinkubasi pada suhu 37 °C semalam




Gambar 4.6 Hasil transformasi. (A) kontrol positif (E. coli Top10), (B) kontrol negatif (plasmid pET-30a dalam E. coli Top10), (C) kontrol transformasi restriksi plasmid pET-30a tanpa gen insert dalam E. Coli Top10 (D) E. coli Top10 (pEXyl06)

Untuk melihat keberhasilan dari transformasi, dilakukan dengan

menggunakan suatu kontrol negatif dan kontrol positif. Sebagai kontrol negatif

adalah E. coli Top10 yang hasilnya sama sekali tidak tumbuh koloni pada media

LB kanamisin, hal ini dikarenakan pada kontrol negatif hanya terdapat E. coli

Top10 yang tidak memiliki plasmid yang resisten terhadap kanamisin. Sedangkan

kontrol positif adalah plasmid pET-30a(+) non-insert yang di klon kan kedalam E.

coli Top10, hasilnya tumbuh koloni dalam media LB kanamisin, hal ini

dikarenakan pada kontrol positif terdapat plasmid pET-30a(+) yang memiliki

penanda resisten kanamisin sehingga E. coli Top10 bisa tumbuh. Selain itu juga

digunakan kontrol restriksi yaitu plasmid pET-30a(+) yang direstriksi oleh enzim

A B

D C




SacI dan XhoI kemudian diklon kan kedalam E.coli Top10 dengan metode heat

shock. Kontrol restriksi ini, jika tidak tumbuh koloni pada media LB kanamisin

menunjukkan bahwa efisiensi proses restriksi adalah 100 % maka kemungkinan

koloni pembawa plasmid tanpa gen insert tidak akan ditemukan dalam hasil

transformasi. Tetapi pada kontrol restriksi yang telah dilakukan pada penelitian

ini, menunjukkan bahwa ada atau tumbuh koloni pada dalam media LB +

kanamisin, hal ini menandakan bahwa koloni pembawa plasmid tanpa gen insert

akan ditemukan dalam hasil transformasi. Dan dari plate hasil transformasi yang

mengandung E. coli Top10 (pEXyl06) dalam media LB + kanamisin hasilnya

tumbuh 20 koloni.

4.4.4 Seleksi transforman E.coli Top10 pembawa plasmid pET-30a(+)

rekombinan

Suatu rekombinan adalah sel yang telah mengalami transformasi yang

mengandung plasmid rekombinan yaitu suatu plasmid yang telah diinsersikan

oleh suatu gen target (Brown, 2010). Seleksi transforman dilakukan untuk

mengetahui adanya plasmid rekombinan pembawa gen insert dari gen penyandi

endo-1,4-β-xilanase dalam plasmid pET-30a(+). Seleksi transforman dilakukan

dengan metode restriksi plasmid pET-30a rekombinan secara single digest dengan

enzim XhoI. Tahapan awal untuk proses seleksi transforman ini dilakukan isolasi

plasmid terhadap semua koloni yang tumbuh pada agar plate. Kemudian hasil

isolasi plasmid ini dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa. Setelah itu

dilakukan proses restriksi dengan menggunakan enzim XhoI. Untuk hasil

pembanding, dilakukan juga isolasi plasmid pET-30a(+) yang non-insert




10000 bp 8000 bp 6000 bp 5000 bp 3000 bp

kemudian dari hasil isolasi plasmid pET-30a(+) yang non-insert ada sebagian

yang dilakukan restriksi secara single degest dengan enzim XhoI dan ada yang

tanpa dilakukan restriksi. Setelah itu plasid pET-30a(+) rekombinan dan plasmid

pET-30a(+) non-insert dilakukan analisis dengan elektroforesis gel agarosa dan

ditempatkan pada satu gel untuk hasil sebagai perbandingan. Jika positif terdapat

plasmid pET-30a rekombinan pita yang muncul dalam gel agarosa akan tampak

sedikit berada diatas dibandingkan pita pada plasmid pET-30a(+) yang non-insert,

jika dilihat dengan menggunakan perbandingan marker DNA, pita pada plasmid

pET-30a(+) mempunyai ukuran 5422 bp sedangkan pita pada plasmid pET-30a(+)

rekombinan mempunyai ukuran ± 6022 bp.

Gambar 4.7 Hasil elektroforesis DNA dari transforman plasmid pembawa pET-30a(+). (A) Plasmid pET-30a uncut, (B) Plasmid pET-30a yang direstriksi dengan enzim XhoI, (C) Marker, (D) DNA plasmid pET-30a rekombinan (pEXyl06)

Gambar 4.7 menunjukkan pada lajur (A) yaitu hasil isolasi plasmid pET-30a(+)

yang tanpa dilakukan proses restriksi, ini digunakan sebagai kontrol atau

pembanding restriksi, pita yang nampak pada hasil gel elektroforesis yaitu

terdapat 3 pita dan lajur (B) yaitu plasmid pET-30a(+) yang telah direstriksi

A B C




dengan menggunakan enzim XhoI, yang dengan tujuan untuk mengetahui ukuran

dari plasmid pET-30a(+). Plasmid pET-30a(+) memiliki ukuran sebesar 5422 bp.

Sedamgkan pada lajur (D) adalah DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan

(pEXyl06) yang juga telah direstriksi dengan menggunakan enzim XhoI. Dilihat

pada hasil tersebut, pita DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan yang muncul

dalam gel agarosa tampak sedikit berada diatas dibandingkan pita pada plasmid

pET-30a(+) non-insert, jika dilihat dengan menggunakan perbandingan marker

DNA, pita pada plasmid pET-30a(+) mempunyai ukuran 5422 bp sedangkan pita

pada plasmid pET-30a(+) rekombinan mempunyai ukuran ± 6022 bp.

4.5 Analisis urutan basa nukleotida dan homologi DNA plasmid pET-30a(+)

rekombinan pembawa gen penyandi endo-1,4-β-xilanase

Urutan basa nukleotida gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A

bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah yang terdapat dalam plasmid

pET-30a(+) rekombinan dibaca dengan teknik Sekuensing. Pada penelitian ini

sekuensing dilakukan dengan menggunakan primer T7 promotor dan T7

terminator, sehingga hasil urutan basa yang didapatkan merupakan seluruh bagian

dari gen target dari start kodon (ATG) hingga stop kodon (TAA). Sekuensing

dilakukan dengan alat Applied Biosystems 3730XL squenser. Hasil sekuensing

DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan, menunjukkan ukuran nukleotida dari gen

yang didapatkan dengan menggunakan primer T7promoter yaitu didapatkan 1392

bp dan dengan primer T7terminator didapatkan 1455bp.




Untuk mencari urutan basa dari gen insert gen penyandi endo-1,4-β-

xilanase dari hasil sekuensing DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan, ada dua

tahapan yang dilakukan. Pertama adalah alignment antara sekuens DNA plasmid

pET-30a(+) rekombinanan yang telah di sekuensing menggunakan primer

T7promoter dengan DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan yang telah di

sekuensing dengan primer T7terminator. Sehingga didapatkan daerah yang

conserve.




Gambar 4.8 Alignment hasil sekuensing DNA plasmid pET-30a(+) Rekombinanan

Berdasarkan hasil alignment tersebut, daerah yang conserve tersebut masih terdiri

dari urutan basa His Tag, basa enzim-enzim restriksi yang terdapat di plasmid

pET-30a(+) dan urutan basa gen insert gen penyandi endo-1,4-β-xilanase. langkah

kedua untuk mencari gen insert gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dari daerah

yang conserve tersebut. Dengan mencari letak His Tag coding sequence dan letak

urutan basa enzim restriksi yang digunakan dalam penelitian ini yaitu SacI dan

XhoI pada hasil sekuensing tersebut, maka di peroleh urutan basa nukleotida gen

penyandi endo-1,4-β-xilanase dari hasil sekuensing DNA plasmid pET-30a(+)

rekombinan yaitu dengan ukuran sebesar 642bp yang dimulai dari start kodon

(ATG) berakhir di stop kodon (TAA). Urutan nukleotida gen penyandi endo-1,4-

β-xilanase yang terdapat dalam plasmid pET-30a(+) rekombinan adalah sebagai

berikut:

1 ATGTTTAAGT TTAAAAAGAA TTTCTTAGTT GGATTATCGG CAGCTTTAAT GAGTATTAGC

61 TTGTTTTCGG CAACCGTCTC TGCAGCTAGC ACAGACTACT GGCAAAATTG GACTGATGGG

121 GGCGGTATAG TAAACGCTGT CAATGGGTCT GGCGGGAATT ACAGTGTTAA TTGGTCTAAT

181 ACCGGAAATT TTGCTGTTGG TAAAGGTTGG ACTACAGGTT CGCCATTTAG GACGATAAAC

241 TATAATGCCG GAGTTTGGGC ACCGAATGGC AATGGATATT TAACTTTATA TGGTTGGACG

301 AGATCACCGC TCATAGAATA TTATGTAGTG GATTCATGGG GTACTTATAG ACCTACTGGA

361 ACGTATAAGG GTACTGTAAA AAGTGATGGG GGTACATATG ACATATATAC AACTACACGT

421 TATAACGCAC CTTCCATTGA TGGCGATCGC ACTACTTTTA CGCAGTACTG GAGTGTTCGC




481 CAGTCGAAGA GACCAACCGG AAGCAACGCT ACAATCACTT TCAGCAATCA TGTGAACGCA

541 TGGAAGAGCC ATGGAATGAA TCTGGGCAGT AATTGGGCTT ACCAAGTCAT GGCGACAGAA

601 GGATATCAAA GTGGTGGAAG TTCTAACGTA ACAGTGTGGT AA

Data nukleotida hasil sekuensing tersebut, kemudian dianalisis dengan

menggunakan BLAST, yaitu untuk menentukan homologi dengan database gen

penyandi endo-1,4-β-xilanase lain yang telah dipublikasikan di GenBank serta

untuk memastikan benar atau tidaknya gen insert yang terdapat di DNA plasmid

pET-30a(+) rekombinan tersebut adalah gen penyandi endo-1,4-β-xilanase yang

diinginkan. Gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dianalisis dengan memasukkan

urutan basa nukleotidanya ke dalam kotak query yang ada dalam website BLAST.

Berdasarkan hasil analisis homologi BLAST, gen penyandi endo-1,4-β-

xilanase mempunyai tingkat homologi 99% dengan gen endo-1,4-β–xilanase

Bacillus subtilis strain MW10, gen xilanase Bacillus subtilis strain R5, dan

Bacillus subtilis 168 trpC2. Hal ini menunjukkan bahwa gen insert yang terdapat

dalam plasmid pET-30a(+) rekombinan yang didapatkan adalah benar gen

penyandi endo-1,4-β-xilanase.

Berikut ini adalah tabel hasil analisis dan tingkat homologi gen penyandi

endo-1,4-β-xilanase dengan database gen penyandi endo-1,4-β-xilanase lain yang

telah dipublikasikan di GenBank:

Accession Description Max ident

DQ100307.1 Bacillus subtilis strain MWO endo-1,4-β-xilanase (xylB) gene, complete cds

99%

M36648.1 B.subtilis xylanase gene, complete cds 99%

Z34519.1 Bacillus subtilis 168 trpC2 xynA 99%




gene encoding xylanase

AB457186.1 Bacillus subtilis Xyl gene for xylanase, complete cds, strain: R5 99%

JF312739.1 Bacillus subtilis strain ATF-27 xylanase A gene, complete cds 98%

EU848308.1 Bacillus subtilis strain G1 xylanase gene 97%

Tabel 4.1 Beberapa gen yang mempunyai homologi yang tinggi dengan gen

penyandi endo-1,4-β-xilanase isolat A asal rayap tanah

Berikut adalah urutan basa nukleotida yang homolog antara gen penyandi endo-

1,4-β-xilanase isolat A dan Bacillus subtilis strain MWO endo-1,4-β-xilanase

(xylB) gene, complete cds

> gb|DQ100307.1| Bacillus subtilis strain MW10 endo-1,4-beta-xylanase (xylB) gene, complete cds Length=642 Score = 1153 bits (624), Expect = 0.0 Identities = 636/642 (99%), Gaps = 0/642 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 ATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTTGGATTATCGGCAGCTTTAATGAGTATTAGC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1 ATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTTGGATTATCGGCAGCTTTAATGAGTATTAGC 60 Query 61 TTGTTTTCGGCAACCGTCTCTGCAGCTAGCACAGACTACTGGCAAAATTGGACTGATGGG 120 |||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 61 TTGTTTTCGGCAACCGCCTCTGCAGCTAGCACAGACTACTGGCAAAATTGGACTGATGGG 120 Query 121 GGCGGTATAGTAAACGCTGTCAATGGGTCTGGCGGGAATTACAGTGTTAATTGGTCTAAT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 121 GGCGGTATAGTAAACGCTGTCAATGGGTCTGGCGGGAATTACAGTGTTAATTGGTCTAAT 180 Query 181 ACCGGAAATTTTGCTGTTGGTAAAGGTTGGACTACAGGTTCGCCATTTAGGACGATAAAC 240 ||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 ACCGGAAATTTTGTTGTTGGTAAAGGTTGGACTACAGGTTCGCCATTTAGGACGATAAAC 240 Query 241 TATAATGCCGGAGTTTGGGCACCGAATGGCAATGGATATTTAACTTTATATGGTTGGACG 300 |||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 241 TATAATGCCGGAGTTTGGGCGCCGAATGGCAATGGATATTTAACTTTATATGGTTGGACG 300 Query 301 AGATCACCGCTCATAGAATATTATGTAGTGGATTCATGGGGTACTTATAGACCTACTGGA 360 |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 301 AGATCACCTCTCATAGAATATTATGTAGTGGATTCATGGGGTACTTATAGACCTACTGGA 360 Query 361 ACGTATAAGGGTACTGTAAAAAGTGATGGGGGTACATATGACATATATACAACTACACGT 420 |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 361 ACGTATAAAGGTACTGTAAAAAGTGATGGGGGTACATATGACATATATACAACTACACGT 420 Query 421 TATAACGCACCTTCCATTGATGGCGATCGCACTACTTTTACGCAGTACTGGAGTGTTCGC 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 421 TATAACGCACCTTCCATTGATGGCGATCGCACTACTTTTACGCAGTACTGGAGTGTTCGC 480 Query 481 CAGTCGAAGAGACCAACCGGAAGCAACGCTACAATCACTTTCAGCAATCATGTGAACGCA 540 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||




Sbjct 481 CAGTCGAAGAGACCAACCGGAAGCAACGCTACAATCACTTTCAGCAATCATGTGAACGCA 540 Query 541 TGGAAGAGCCATGGAATGAATCTGGGCAGTAATTGGGCTTACCAAGTCATGGCGACAGAA 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 541 TGGAAGAGCCATGGAATGAATCTGGGCAGTAATTGGGCTTACCAAGTCATGGCGACAGAA 600 Query 601 GGATATCAAAGTGGTGGAAGTTCTAACGTAACAGTGTGGTAA 642 |||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 601 GGATATCAAAGTAGTGGAAGTTCTAACGTAACAGTGTGGTAA 642

Berdasarkan gen endo-1,4-β-xilanase asal Bacillus subtilis strain MWO,

mempunyai ukuran 642 bp, sementara gen endo-1,4-β-xilanase isolat A bakteri

xilanolitik asal rayap tanah hasil transformasi dalam E.coli Top10 (pET-30a(+))

juga mempunyai ukuran sebesar 642 bp. Hal ini dikarenakan pada urutan basa

nukleotida gen endo-1,4-β-xilanase isolat A dijumpai kodon start (ATG) dan

diakhiri dengan stop kodon (TAA), sehingga gen yang didapatkan adalah gen

secara utuh dari start hingga stop kodon.




BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa :

1. Gen penyandi endo-1,4-β-xilanase bakteri xilanolitik isolat A asal

sistem abdonminal rayap tanah dapat teramplifikasi dengan ukuran

± 600bp menggunakan teknik PCR dan dapat diklon ke dalam

pET-30a(+)/E.coli Top10 dan didapatkan plasmid pET-30a(+)

rekombinan (pEXyl06)

2. Dari hasil sekuensing, rekombinan yang diperoleh adalah fragmen

gen endo-1,4-β-xilanase yang mempunyai tingkat homologi

sebesar 99% terhadap gen endo-1,4-β-xilanase famili 11 dari

GenBank.

5.2 Saran

Diharapkan penelitian ini dapat diteruskan dengan melakukan ekspresi gen

penyandi endo-1,4-β-xilanase sehingga dapat diperoleh enzim endo

xilanase rekombinan dan bisa diketahui karakteristik dan aktifitas enzim

xilanase yang dihasilkan.




DAFTAR PUSTAKA Ahsan, M. M., Kimura, T., Karita, S., Sakka, K., and Ohmiya, K. 1996. Cloning,

DNA Sequencing, and Expression of the Gene Encoding Clostridium thermocellum Cellulase CelJ, the Largest Catalytic Component of the Cellulosome. Journal of Bacteriology 178, p. 5732-5740.

An Yingfeng, Wu, W,. Lv, A., 2010 A PCR-after-ligation method for cloning

of multiple DNA inserts. Analytical Biochemistry 402, p. 203–205 Ausubel, Frederick, M., Brent, Roger., Kingston, Robert, E,. Moore, David, D,.

Seidman, J, G,. Smith, John, A,. and Struhl, Kevin,. 1995, Short Protocols in Molecular Biology, Third Edition, John Wiley & Sons Inc., Canada.

Brown, T.A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis : An Introduction. 6th Ed.,

Weley-Blackwell Publishing, United Kingdom Canakci, S., Kacagan, M., Inan, K., Belduz, A. O., and Saha, B. C., 2008,

Cloning, purification, and characterization of a thermostable α-L-arabinofuranosidase from Anoxybacillus kestanbolensis AC26Sari, J Appl Microbiol Biotechno, Vol. 81, p. 61-68.

Clowes, R, C., 1972, Molecular Structure of Bacterial Plasmids, Microbiology

and Molecular Biology Reviews, 36(3):361 Devor, E.J., 2005, IDTutorial: DNA Sequencing, Integrated DNA technologies Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., and Dveksler, G. S., 1993, General Concepts

for PCR primer Design, Genome Res., Vol. 3, p. S30-S37 Dwijayanthi, I., 2010, Amplifikasi dan Sekuensing Gen Penyandi Endo-1,4-β-

Xilanase Asal Bacillus subtillis PC-01, Skripsi-S1 UNAIR Surabaya. Erlich, H, A, 1992, PCR Technology Principles and Aplications for DNA

Amplification, W., H., Freeman and Company, United States of America, Page 13-14

Freifelder, David, 1987, Molecular Biology: Second Edition, Jones and Bartlett

publishers, Boston. Gupta, S., Bhushan, B., and Hoondal, G. S. 2000. Isolation, Purification and

Characterization of Xylanase from Staphylococcus sp. SG-13 and its Application in Biobleaching of Kraft Pulp. Journal of Applied Microbiology 88 (2, February) : 325–334.




Huang, J., Wang, G., Xiao, L., 2006, Cloning, sequencing and expression of the

xylanase gene from a Bacillus subtilis strain B10 in Escherichia coli, Journal Bioresource Technology, Vol. 97, p. 802–808.

Howard, R. L., Abotsi, E., Jansen van Rensburg E.L., and Howard, S., 2003,

Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production, African Journal of Biotechnology, Vol. 2 (12), p. 602-619

Ito, K., Iwashita, K., and Iwano, K. 1992. Cloning and Sequencing of the XynC

Gene Encoding Acid Xylanase of Aspergillus kawachii. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol. 56, p. 1338-1340.

Jalal, A., Rashid, N., Rasool, N., and Akhtar, M., 2009. Gene cloning and

characterization of a xylanase from a newly isolated Bacillus subtilis strain R5. Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.107 No.4, p. 360–365.

Johnson, T., 1992, Pengenalan Pelajaran Serangga, Edisi keenam,

diterjemahkan oleh soetiyono Partosoedjono, Yogyakarta, Gajahmada University Press

Kato, K., Kozaki, S., and Sakuranaga, M., 1998, Degradation of lignin

compounds by bacteria from termite guts, Journal Biotechnology Letters, Vol. 20, No. 5, p. 459-462.

Kulkarni, N., Shendye, A., and Rao, M. 1999. Molecular and Biotechnological

Aspects of Xylanases. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Reviews 23 p. 411–456

Lehninger, A.L., 1997, Dasar-Dasar Biokimia, Jilid III Penerjemah Maggy

Thenawijaya, Penerbit Erlangga, Jakarta. Lee, J.W., Park, J.Y., Kwon, M., and Choi, I.G., 2009, Purification and

Characterization of a Thermostable Xylanase from the Brown-Rot Fungus Laetiporus sulpureus, Journal of Bioscience and Bioengineering, VOL. 107 No. 1, 33-37.

Meryandini, A., Widhyastuti, N., dan Lestari, Y., 2008, Permurnian dan

Karakterisasi Xilanase Streptomyces sp. SKK1-8, Makara, Sains, Vol. 12, No. 2, p. 55-60.

Mullis, B, Kary., 1990, Recombinant DNA Technology and Molecular

Cloning, Scientific American 262:36




Nandika, D., Adijuwana, H., dan Rizal, E. S. 1995. Karakteristik Saluran Pencernaan Rayap Kayu Kering Cryptotermes cynochepalus Light. (Isoptera : Kalotermitidae). Jurnal Biosains 1 (2, Juli) : 7-10.

Pühler, Alfred, and Timmis, Kenneth, N,. 1984, Advanced Molecular Genetics,

Springer-Verlag, Berlin Heidelberg Puspaningsih, N.N.T., 2004, Gen Penyandi Xilosidase dari Bacillus

thermoleovorans IT-08, Disertasi S3-IPB, Bogor. Russell, Peter, J, 1994, Fundamentals of Genetics, HarperColins Collage

Publishers, New York. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A

Laboratory Manual, Second Edition, Volume 1, Cold Spring Harbor Laboratory Pres, New York.

Sambrook, J., Russel, I., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,

Third Edition, Volume 2, Cold Spring Harbor Laboratory Pres, New York.

Sasnauskas G, Connolly BA, Halford SE, Siksnys V. 2007. Site-specific DNA

transesterification catalyzed by a restriction enzyme, Proc Natl Acad Sci USA 104(7): 2115-20.

Seifert, K., 1962, Holzforschung, Vol 19, p. 105-111 Shallom, D,. and Shoam, Y,. 2003, Microbial Hemicellulase, Journal Ecology

and Industrial microbiology, Vol. 6, p. 219-228 Sriyapai, T., Somyoonsap, P., Matsui, K., Kawai, F., and Chansiri, K., 2011,

Cloning of a thermostable xylanase from Actinomadura sp. S14 and its expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol 111, p. 528-536.

Stryer L, Tymoczko JL, and Berg JM. 2002. Biochemistry, Edisi ke-5, New York

: WH Freeman. Tarumingkeng, R. C. 2001. Biologi dan Perilaku Rayap. Bogor : Program Studi

Ilmu Hayati Institut Pertanian Bogor (diakses online dari url http : //tumoutou.net/biologi_&_perilaku_rayap.htm/).

Wall, D., 2009, Recombinant DNA, Basic Procedures, Elsevier Inc. All rights

reserved University of Wyoming, Laramie, WY, USA




Yamani, L.N. 2011. Konstruksi Sekresi Ekstraseluler Dan Peningkatan pH Optimum α-L-Arabinofuranosidase dari Geobacillus thermoleovorans IT 08, penelitian S2-UNAIR, Surabaya.

Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase chain reaction. Andi offset.

Yogyakarta Zhang, M,. Jiang, Z,. Yang, S,. Hua, C,. Li, L,. 2010. Cloning and expression of

a Paecilomyces thermophila xylanase gene in E.coli and characterization of the recombinant xylanase, Journal Bioresource Technology, Vol. 101, p. 688-695

Zhou, C., Bai J., Deng S., Wang J., Zhu J., Wu, M., Wang, W., 2007, Cloning of Xilanase Gene from Aspergillus usamii anf its Expression in Escherichia coli. Bioresource Technology 99, p. 831–838

Zhou, J., Huang, H., Meng, K., Shi, P., Wang, Y., Luo, H., Yang, P., Bai, Y., and Yao, B., 2010, Cloning of a New Xylanase Gene from Streptomyces sp. TN119 Using a Modified Thermal Asymmetric Interlaced-PCR Specific for GC-Rich Genes and Biochemical Characterization, Journal Appl Biochem Biotechnol, Vol. 160, p. 1277–1292.

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, tanggal akses 21 Juli 2012 http://www.CAZy.org, tanggal akses 5 september 2011




KLONING GEN PENYANDI ENDO-1,4-β ... - UNAIR …repository.unair.ac.id/25781/1/MPK 88 - 12 Rah...

Documents

Transcript of KLONING GEN PENYANDI ENDO-1,4-β ... - UNAIR …repository.unair.ac.id/25781/1/MPK 88 - 12 Rah...