ELECTROFORESIS

La electroforesis esta basada en la movilidad de las moléculas cuando se encuentran bajo el efecto de un campo eléctrico

Se puede controlar el tamaño del poro efecto de tamiz molecular

Puede llevarse a cabo en:

Solución

Superficie hidratada de un soporte sólido (papel o acetato de celulosa)

Matriz porosa (en gel de poliacrilamida o agarosa)

A su vez,

q = cargaE = intensidad del campo

Si se asume que la partícula es esférica, a partir de la Ley de Stokes se obtiene que,

6

qE

r

rF qE

electrica rozamientoF F

6rF R R = radio de la esferav = velocidad η = viscosidad del fluido

Reordenando

La movilidad electroforética (μ) es una magnitud característica de la partícula o molécula que refleja la velocidad relativa a la fuerza del campo

A partir de la ecuación de velocidad se obtiene que:

6

q

r

E

La movilidad electroforética

depende de la carga y del tamaño de la

partícula

Factores que afectan la electroforesis

La electroforesis depende del campo eléctrico y este depende de distintos parámetros:

V RI Ley de Ohm

V = diferencia de potencial

R = resistencia

I = intensidad

define el campo eléctrico, la velocidad de avance es directamente proporcional a ella

la movilidad de las moléculas es inversamente proporcional a ella

cuantifica el flujo de carga eléctrica, se relaciona directamente con la distancia recorrida por las moléculas

Temperatura es necesario controlar el aumento de temperatura debido al Efecto Joule

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

Electroforesis nativa

¿Las proteínas tienen carga?Excepto en el pI, a cualquier pH las proteínas tienen carga neta

¿Cuál es la concentración de acrilamida óptima para separar una mezcla de proteínas?

Depende de la carga y tamaño de la proteína

Gráfico de Ferguson

Rf = distancia que migró la proteína distancia que migró la referencia

0log log %f f rR R K T

Kr = coeficiente de retardose relaciona con el tamaño molecular

%T

logRf

Determinación del peso molecular mediante gráficos de Ferguson

Se determina el Kr de proteínas estándar de peso molecular conocido y se realiza una curva de calibración

Se determina el Kr de la proteína problema y se interpola en la curva obteniéndose el peso molecular

Inconveniente:

Las proteínas usadas para la curva de calibración deben tener la misma forma, grado de hidratación y volumen específico que la proteína nativa

Electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE)

Dodecil sulfato de sodio (SDS)

Desnaturaliza las proteínas

Confiere cargas negativas uniéndose en proporción al tamaño de la proteína (una molécula de SDS por cada dos aminoácidos, ~1.4 g SDS/g proteína)

Polipéptidos distintos tienen la misma densidad de carga

migran solo según su peso molecular

distancia que migró la proteína

distancia que migró el colorante

X

X

X

X

X

logPM

Rf

Rf = distancia que migró la proteína distancia que migró el colorante de referencia

Dos consideraciones importantes

1. Para una concentración de gel dada, la relación lineal entre el logPM y el Rf es lineal solo en un rango limitado de pesos moleculares

15 % acrilamida: 12000 – 45000 Da10 % acrilamida: 15000 – 70000 Da5 % acrilamida: 50000 – 200000 Da

2. En esta electroforesis la proteína está desnaturalizada, por lo tanto, el peso molecular que se obtiene puede no ser el de la proteína nativa

Proteínas con estructura cuaternaria (formadas por más de una subunidad)

¿ y si las subunidades están unidas por puentes disulfuro?

Agregamos un reductor como el 2-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT)

+ 2-mercaptoetanol

a dcb

- 2-mercaptoetanol

a dc

b

PM (proteína nativa)

Proteína a: 34 KDa

Proteína b: 140 KDa

Proteína c: 64 KDa

Proteína d: 32 KDa

Isoelectroenfoque

Se lleva a cabo en un gradiente de pH que se establece entre dos electrodos

El gradiente de estabiliza utilizando anfolitos

Las proteínas migran hasta alcanzar un pH igual a su punto isoeléctrico

cátodo

ánodo

Es muy útil para estudiar modificaciones postraduccionales en proteínas, trabajar con isoenzimas, etc

Electroforesis en dos dimensiones

Primera dimensión: isoelectroenfoque

Segunda dimensión : SDS-PAGE

Permite analizar mezclas más complejas como extractos celulares, muestras de sangre, etc

Electroforesis capilar

Aumenta la relación superficie-volumen: permite un mejor control de la temperatura y por lo tanto la posibilidad de aplicar voltajes mayores

Las muestras pueden correr en solución o en gel

Se siembran volúmenes pequeños de muestra, pero ésta debe estar concentrada

La detección implica observar las bandas de proteína a medida que estas pasan por una sección de capilar (detección UV, fluorescente, espectrometría de masa)

Solo se puede analizar una muestra a la vez, pero es una técnica rápida, no implica tinción y los datos obtenidos son cuantitativos

Visualización de las bandas en el gel

1. Tinción

Azul de Coomassie:

se une a las proteínas en forma específica (~0.1 µg de proteína)

es necesario un paso de desteñidoPlata: 100 veces más sensible que la tinción con Coomassie

Es necesario en primer lugar fijar las proteínas al gel para minimizar la difusión

Se expone al gel a una solución de nitrato de plata y éste es reducido a plata metálica donde se encuentran las proteínas produciendo la precipitación de granos de plata Puede presentar importantes backgrounds, es más cara e implica más pasos

Azul de Coomassie

Plata

2. Detección de proteínas específicas

a. Medida de actividad

Restringida a enzimas y geles nativos

Purificación de xantina oxidasa a partir de crema de leche

xantina + 2O2 ácido úrico + 2O2.- + 2H+

xantina oxidasa

NBToxidado

Formazáninsoluble

b. Reacción con anticuerpos específicos (Western blot)

Se transfieren las proteínas desde el gel hacia una membrana (nitrocelulosa o polifluoruro de vinildeno PVDF)

La membrana se pone con contacto con una solución de anticuerpos específicos para alguna proteína o modificación proteicaSe detecta la unión antígeno-anticuerpo por fluorescencia, actividad enzimática, etc

Ac-AntiSO2/3H Ac-AntiNO2Y

Randall et al.

3. Otros

Autorradiografía

Si el material a analizar es radiactivo, el gel se pone en contacto con un film fotográfico

También puede visualizarse en forma directa con el equipamiento adecuado

Sondas fluorescentes

Se “pre-tiñen” las proteínas con una sonda fluorescente Gran sensibilidad

Puede ocasionar cambios en la migración en el gel pues reaccionan con grupos amino

Para observar las bandas se expone el gel a luz UV

Detección de glicoproteínas

Se detectan en forma específica usando reactivos que reaccionan con los polisacáridos (dansil hidrazina)

Detección de fosfoproteínas

Marcado (in vivo) con 32P, revelado por autorradiografía

Liberación del grupo fosfato y atrapado en el gel de fosfato de calcio (derivado insoluble)

ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS (ADN, ARN)

Presenta carga negativa debido a los grupos pirofosfato, por lo que el número de cargas negativas es proporcional al tamaño de la molécula

Si se encuentran en conformación lineal migrarán según su tamaño

Generalmente se utilizan geles de agarosa

Su capacidad de resolución depende del porcentaje de agarosa0.7 % (5 – 10 kb) 2% (0.2 – 1 kb)

Para moléculas pequeñas: agarosa 3% o poliacrilamida

Para moléculas muy grandes: electroforesis de campo pulsado. Permite analizar moléculas de ADN de hasta 10000 Kpb (cromosoma de levadura)

Visualización de las bandas

1. Moléculas fluorescentes e intercalantes: bromuro de etidio

¡¡Como agente intercalante puede ser carcinogénico, mutagénico y teratogénico!!

Otras alternativas: SYBR Green, Goldview (agentes intercalantes)

2. Southern (ADN) y Northern (ARN) blot

Requiere transferir desde el gel hacia una membrana

Se hibrida con una sonda marcada capaz de hibridizar con una secuencia de interés