BIOTRANSFORMACIN DE LIMONENO, -PINENO Y ACEITES ESENCIALES DE NARANJA Y MANDARINA EMPLEANDO Aspergillus niger

FABIN ENRIQUE CASTELLANOS MOLINA

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE QUMICA BUCARAMANGA 2007

BIOTRANSFORMACIN DE LIMONENO, -PINENO Y ACEITES ESENCIALES DE NARANJA Y MANDARINA EMPLEANDO Aspergillus niger

FABIN ENRIQUE CASTELLANOS MOLINA

Trabajo de investigacin presentado como requisito parcial para optar al ttulo de Magster en Qumica

Directora Janeth Aid Perea V. Qumica, MSc. Doctora en Qumica

Codirectora Claudia Ortz Lpez. Bacteriloga. Doctora en Biocatalisis

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE QUMICA BUCARAMANGA 2007

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Dedico este trabajo a Adela, Nelly, Aid y Julin, mis guas en el camino.

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AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Aid Perea Villamil, por su excelente direccin y su amistad. A la Dra. Claudia Ortz por su direccin y su acompaamiento en mi trabajo. A la Dra. Elena Stashenko, por la oportunidad de trabajar con CENIVAM, por su apoyo constante y su confianza en mi trabajo. Al Centro Excelencia CENIVAM por el financiemiento de este trabajo y a sus integrantes, quienes me asistieron en las actividades realizadas. Al laboratorio de Cromatografa, Catlisis y CINTROOP por la gran colaboracin de sus directores e integrantes. A mis compaeros y amigos del CICTA, con quienes compart momentos realmente agradables, especialmente con Luis K. A la Universidad Industrial de Santander, a la cual manifiesto gran cario y respeto.

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Para extinguir el sufrimiento, el ctuple sendero debemos seguir:

Correcto entendimiento (samyag-di) Correcto pensamiento (samyak-sakalpa) Correcta palabra (samyag-vc) Correcta accin (samyak-karmnta) Correcta ocupacin (samyag-jva) Correcto esfuerzo (samyag-vyyma) Correcta atencin (samyak- smti) Correcta concentracin (samyak-samdhi)

Enseanzas del Budismo

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TABLA DE CONTENIDO pg.

INTRODUCCIN 1.1 Biotransformacin y biocatlisis aplicadas Aspectos generales, situacin actual y aplicaciones industriales Biotransformaciones oxidativas y oxigenasas Uso de clulas completas

18 22 22 29 33 35 36 36 41 44 44 45 46 48 50 50 50 50 50 51 52

1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.2

Biooxidacin de monoterpenos: limoneno y -pineno Procesos de transformacin Limoneno -pineno

1.2.1

1.2.2 Aplicaciones especiales de algunos derivados Alcohol perlico Carvona -terpineol 1.3 Consideraciones finales

2. METODOLOGA 2.1 Materiales Reactivos Equipos Medios de cultivo Microorganismos Otros materiales

2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5

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2.2

Procedimientos Limpieza, desinfeccin y esterilizacin Activacin , crecimiento y mantenimiento del hongo Curva de crecimiento y evolucin del pH Biotransformacin General Ensayos iniciales: evaluacin del medio de cultivo y de la edad del hongo Evaluacin de la volatilidad de sustratos Ensayos en medios seleccionados a condiciones fijas: extraccin L-L y evaluacin de productos Ensayos con aceites esenciales: extraccin SPME y evaluacin de productos

52 52 52 53 54 54 55 55 56 57 58 58 59 61 61 62 64 64 64 64 71 72 72 74 75 76 77

2.2.1 Biolgicos

2.2.2

Analticos e instrumentales Condiciones Preparacin de patrones, calibracin y validacin del mtodo Extraccin lquido-lquido (L-L) y concentracin de productos Microextraccin en fase slida (SPME) Extraccin de aceites esenciales ctricos

3. ANLISIS DE RESULTADOS 3.1 3.1.1 Parte analtica e instrumental Validacin de mtodos Calibracin y determinacin de la precisin (repetibilidad) Clculo del LOD y LOQ Eficiencia de extraccin lquido-lquido (L-L) 3.1.2 3.1.3 Anlisis de los aceites esenciales Optimizacin de la extraccin HS-SPME de monoterpenos Efecto de la temperatura Efecto del tiempo 3.2 Ensayos biolgicos

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3.2.1 3.2.2

Crecimiento del hongo y variacin del pH

77 78 80 84 88 88 89 93 99 101 103

Evaluacin del medio de cultivo y de la edad del hongo: identificacin de productos Medio YMPG Medio PDA Medio SS (suspensin de esporas)

de inters

3.2.3 3.2.4 3.2.5 4. 5.

Evaluacin de la evaporacin de sustratos y del tipo de sello Ensayos en medios seleccionados a condiciones fijas: extraccin L-L y Ensayos con aceites esenciales y determinacin de productos por HS-SPME

evaluacin de productos

CONCLUSIONES RECOMENDACIONES

BIBLIOGRAFIA

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LISTA DE TABLAS pg.

Tabla 1. Ensayos de biotransformacin de limoneno y -pineno variando el medio de cultivo y la edad del hongo A. niger DSM 821 (parmetros fijos: 6 das de reaccin, extraccin L-L) Tabla 2. Ensayos para la evaluacin de la volatilidad de sustratos (limoneno y pineno) empleando dos sistemas de cierre: tapn de algodn y sello PTFE/silicona (parmetros fijos: 6 das de contacto, extraccin L-L) Tabla 3. Ensayos de biotransformacin de limoneno y -pineno en medios seleccionados a condiciones fijas: A. niger DSM 821 (3 das de edad), 6 das de reaccin, sello de PTFE/Silicona, extraccin L-L Tabla 4. Ensayos de biotransformacin empleando aceites esenciales de mandarina y naranja como sustratos. A. niger DSM 821 (3 das de edad), medio YMPG, 6 das de reaccin, sello de PTFE/Silicona, extraccin HS-SPME Tabla 5. Evaluacin de la precisin para el anlisis del limoneno, sistema LL-GCFID Tabla 6. Evaluacin de la precisin para el anlisis del -pineno, sistema LL-GCFID Tabla 7. Resumen de la regresin y ANOVA para el anlisis del limoneno, sistema LL-GC-FID Tabla 8. Resumen de la regresin y ANOVA para el anlisis del -pineno, sistema LL-GC-FID Tabla 9. Evaluacin de la precisin para el anlisis del alcohol perlico, sistema LL-GC-MS Tabla 10. Evaluacin de la precisin para el anlisis del limoneno, sistema LLGC-MS Tabla 11. Resumen de la regresin y ANOVA para el anlisis del limoneno, sistema LL-GC-MS Tabla 12. Resumen de la regresin y ANOVA para el anlisis del alcohol perlico, sistema LL-GC-MS

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Tabla 13. Evaluacin de la precisin para el anlisis del limoneno, sistema SPME-GC-FID Tabla 14. Resumen de la regresin y ANOVA para el anlisis del limoneno, sistema SPME-GC-FID Tabla 15. Resumen comparativo de los anlisis de regresin para los diferentes sistemas emplead Tabla 16. Valores de LOD y LOQ calculados para los diferentes analitos (en ppm) en cada sistema evaluado Tabla 17. Composicin relativa de los aceites esenciales de naranja y mandarina (en porcentaje) Tabla 18. Compuestos obtenidos por la oxidacin de limoneno y -pineno de acuerdo al medio empleado (porcentaje mximo, %). Parmetros fijos: 6 das de reaccin, extraccin L-L Tabla 19. Evaluacin de la evaporacin del limoneno y -pineno de acuerdo al tipo de cierre empleado en los biorreactores a microescala (parmetros fijos: 6 das de contacto, extraccin L-L) Tabla 20. Compuestos obtenidos por la biotransformacin de limoneno y -pineno en medios seleccionados (% del producto). Condiciones fijas: A. niger DSM 821 (3 das de edad), 6 das de reaccin, sello de PTFE/Silicona, extraccin L-L Tabla 21. Factores de respuesta calculados para la cuantificacin de diferentes monoterpenos empleando HS-SPME Tabla 22. Resultados obtenidos de los ensayos de biotransformacin de aceites esenciales de naranja y mandarina. Condiciones fijas: A. niger DSM 821 (3 das de edad), medio YMPG, 6 das de reaccin, sello de PTFE/Silicona, extraccin HSSPME. Tabla 23. Concentraciones relativas de los compuestos oxigenados obtenidos en los ensayos de biotransformacin de aceites esenciales de naranja y mandarina. Parmetros fijos: A. niger DSM 821 (3 das de edad), medio YMPG, 6 das de reaccin, sello de PTFE/Silicona, extraccin HS-SPME

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LISTA DE FIGURAS pg. Figura 1. Obtencin biocataltica de acrilamida a partir de acrilonitrilo Figura 2. Vanilla planifolia y estructura qumica de la vainillina Figura 3. Esquema de la sntesis de vainillina a partir del catecol, glucosa y otros sustratos terpenoides Figura 4. Estructura qumica de compuestos aromatizantes de inters obtenidos biocataliticamente Figura 5. Reacciones generales de oxidacin catalizadas por oxigenasas Figura 6. Estructura del grupo hemo y su ubicacin en una oxigenasa P450: estructura de cintas y lazos de la oxigenasa P450-Terp (CYP108) de una forma recombinante de Pseudomonas sp. expresada en E. coli que cataliza la oxidacin de - terpineol (Hasemann et al., 1994) Figura 7. Representacin del mecanismo de oxidacin catalizado por oxigenasas P450 (ciclo cataltico) Figura 8. Representacin de la estructura qumica optimizada en 3D del limoneno y algunos de sus productos oxidados ms importantes, indicando los sitios de oxidacin (no se ha definido la estereoqumica) Figura 9. Representacin de la estructura qumica optimizada en 3D del -pineno y algunos de sus productos oxidados ms importantes, indicando los sitios de oxidacin (no se ha definido la estereoqumica) Figura 10. Estructura qumica del alcohol perlico Figura 11. Estructura qumica de la carvona Figura 12. Estructura qumica del -terpineol Figura 13. Estructura qumica de los xidos de limoneno: a) 1,2 y b) 8,9 Figura 14. Microorganismos obtenidos de DSMZ Figura 15. Crecimiento del A. niger DSM 821 en medios a) MEA y b) PDA 25 25 27 27 30

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41 44 45 46 47 52 53

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Figura 16. Ensayos de biotransformacin a microescala empleando medio lquido Figura 17. Ensayos de biotransformacin a microescala empleando medio slido Figura 18. Montaje realizado para la microextraccin en fase slida (SPME) de los analitos Figura 19. Montaje realizado para la extraccin de los aceites esenciales de naranja y mandarina empleando hidrodestilacin asistida por microondas Figura 20. Perfil cromatogrfico (TIC) obtenido por GC-MS, del aceite esencial de cscara de naranja. Columna HP-5 (60 m x 0,25 mm x 0,25 m). Relacin de split 1:30 Figura 21. Perfil cromatogrfico (TIC) obtenido por GC-MS, del aceite esencial de cscara de mandarina. Columna HP-5 (60 m x 0,25 mm x 0,25 m). Relacin de split 1:30 Figura 22. Efecto de la temperatura ( C) sobre la eficiencia de la extraccin por HS-SPME (DVB/Carboxen/PDMS, 50/30 m) de la mezcla de monoterpenos, durante 20 min de exposicin del recubrimiento Figura 23. Efecto del tiempo (min) sobre la eficiencia de la extraccin por HSSPME (DVB/Carboxen/PDMS, 50/30 m) de la mezcla de monoterpenos, a 30C Figura 24. Curva de crecimiento y de variacin del pH para el A. niger DSM 821 en medio YMPG (5 mL) Figura 25. Evaluacin de los productos obtenidos en la biotransformacin de acuerdo con el medio de cultivo y la edad del hongo A. niger DSM 821, para los sustratos A. -pineno, B. Limoneno (6 das de reaccin, extraccin L-L) Figura 26. Perfil cromatogrfico (TIC) de los productos obtenidos en la bioconversin de limoneno empleando medio YMPG (6 das de reaccin, extraccin L-L). GC-MS: columna HP-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 m). Inyeccin 1 L (split 30:1) Figura 27. Perfil cromatogrfico (TIC) de los productos obtenidos en la bioconversin de -pineno empleando medio YMPG (6 das de reaccin, extraccin L-L). GC-MS: columna HP-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 m). Inyeccin 1 L (split 30:1) Figura 28. Espectro de masas obtenido por GC-MS (EIMS, 70 eV) del 2-feniletanol, compuesto obtenido en la biotransformacin de los monoterpenos en medio YMPG Figura 29. Esquema de las rutas qumicas posibles para la degradacin de L-

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fenilalanina hasta 2-feniletanol Figura 30. Perfil cromatogrfico (TIC) de los productos obtenidos en la bioconversin de limoneno empleando medio PDA (6 das de reaccin, extraccin LL). GC-MS: columna HP-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 m). Inyeccin 1 L (split 30:1) Figura 31. Perfil cromatogrfico (TIC) de los productos obtenidos en la bioconversin de -pineno empleando medio PDA (6 das de reaccin, extraccin LL). GC-MS: columna HP-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 m). Inyeccin 1 L (split 30:1) Figura 32. Estructura qumica del -terpineol, borneol y fenchol Figura 33. Estructura del conversiones/transposiciones catin -terpinilo y sus posibles

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Figura 34. Estructuras qumicas de los dos posibles ismeros (p-mentanodioles) obtenidos del limoneno y -pineno Figura 35. Espectro de masas obtenido por GC-MS (EIMS, 70 eV) del p-mentano3,8-diol, compuesto predominante obtenido en la biotransformacin de los monoterpenos en medio PDA Figura 36. Perfil cromatogrfico (TIC) de los productos obtenidos en la bioconversin de limoneno empleando medio PDB (6 das de reaccin, extraccin LL). GC-MS: columna HP-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 m). Inyeccin 1 L (split 30:1) Figura 37. Espectro de masas obtenido por GC-MS (EIMS, 70 eV) del alcohol perlico, compuesto predominante obtenido en la biotransformacin de los monoterpenos en medio PDB Figura 38. Perfil cromatogrfico de los productos obtenidos en la bioconversin de aceite esencial de naranja empleando A. niger DSM 821 en medio YMPG (6 das de reaccin, extraccin HS-SPME). GC-FID: columna HP-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 m). split 30:1 Figura 39. Perfil cromatogrfico de los productos obtenidos en la bioconversin de aceite esencial de mandarina empleando A. niger DSM 821 en medio YMPG (6 das de reaccin, extraccin HS-SPME). GC-FID: columna HP-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 m). split 30:1

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LISTA DE ABREVIATURAS, ACRNIMOS Y SMBOLOS

3D ADN ANOVA Carboxen CO CVTST DSMZ DTF DVB EE EI EIMS EtOH FID Fr FTIR GC GC-FID GC-MS

Tridimensional Acido Desoxirribonucleico Analysis of variance (Anlisis de varianza) Carbon based adsorbent resin (Resina adsorbente con base en carbono) Company (Compaa) Canonical Variational Transition State Theory (Teora cannicavariacional del estado de transicin) Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleccin Alemana de microorganismos y cultivos celulares) Density Functional Theory (Teora del funcional de densidad) Divinyl Benzene (Divinilbenceno) Eficiencia de extraccin Electron impact (Impacto de electrones) Electron impact mass spectrometry (Espectrometra de masas con impacto de electrones) Etanol Flame Ionization Detector (Detector de ionizacin en llama) Factor de respuesta Fourier Transform Infrared Spectroscopy (Espectroscopa infrarroja de transformada de Fourier) Gas Chromatography (Cromatografia de gases) Gas Chromatography Flame Ionization Detector (Cromatografia de gases acoplada al detector de ionizacin en llama) Gas Chromatography-Mass Spectrometry (Cromatografia de gases acoplada al detector espectromtrico de masas)

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GRAS HCN H-DTF HS-SPME INC kW L-L LOD LOQ MCM-41 MEA MYB NADH NADPH NMR P450 pA PA PAHs PDA PDB ppm

Generally Recognized as Safe (Reconocidos generalmente como seguros) Acido cianhdrico Hybrid Density Functional Theory (Teoria hbrida del funcional de densidad) Headspace Solid Phase Microextraction (Microextraccin en fase slida en el espacio de cabeza) Incorporated (Incorporada) Kilowatt (Kilovatio) Lquido-Lquido Limit of Detection (Lmite de deteccin) Limit of Quantitation (Lmite de cuantificacin) Mobile Crystalline Material Number 41 (Material mvil cristalino nmero 41) Malt Extract Agar (Extracto de malta y agar) Extracto de malta-glucosa-peptona-extracto de levadura Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced form (Dinucletido de nicotinamida adenina en forma reducida) Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, reduced form (Fosfato del dinucletido de nicotinamida adenina en forma reducida) Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Espectroscopa de resonancia magntica nuclear) Enzimas oxigenasas de la familia Citocromo P450 picoAmpere (picoAmperio) Polyacrylate (Poliacrilato) Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (Hidrocarburos aromticos policclicos) Potato Dextrose Agar (Agar de papa y dextrosa) Potato Dextrose Broth (Caldo de papa y dextrosa) Partes por milln

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psi PTFE R RMSE RSD% SPME SS TIC Tr US FDA USA USD YMPG

Pound per square inch (Libras por pulgada cuadrada) Polytetrafluoroethylene (Politetrafluoroetileno o Tefln) Coeficiente de correlacin de Pearson Root Mean Squared Error (Raz del error promedio cuadrado) Relative Standard Deviation as percent (Desviacin estndar relativa, como porcentaje) Solid Phase Microextraction (Microextraccin en fase slida) Spore Suspension (Suspensin de esporas) Total ion chromatogram (Cromatograma inico total) Tiempo de retencin United States Food and Drug Administration (Administracin de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos de Amrica) United States of America (Estados Unidos de Amrica) United States dollar (Dlar de los Estados Unidos) Yeast Extract-Malt Extract-Peptone-Glucose (Extracto de levaduraExtracto de malta-Peptona-Glucosa)

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RESUMEN

TTULO: BIOTRANSFORMACIN DE LIMONENO, -PINENO Y ACEITES ESENCIALES DE NARANJA Y MANDARINA EMPLEANDO Aspergillus niger * Autor: Fabin E. Castellanos ** Palabras clave: limoneno, -pineno, aceite esencial de naranja, biotransformacin, biocatalizador El limoneno y -pineno son los monoterpenos ms abundantes en la naturaleza, presentes en aceites esenciales extrados de la cscara de frutos ctricos, incluyendo los aceites esenciales de naranja y mandarina. Estos monoterpenos son susceptibles de oxidacin para generar compuestos de mayor valor agregado. Puesto que en nuestra regin existe una produccin relativamente alta de dichos frutos, es posible obtener cantidades abundantes de aceites ctricos a un bajo costo para usar en procesos biocatalticos, obteniendo derivados oxigenados de alto valor por sus aplicaciones cosmticas/farmacuticas y por su clasificacin como productos naturales. En el presente trabajo se realiz un estudio preliminar de la biotransformacin de limoneno, pineno y aceites esenciales de naranja y mandarina con alto contenido de limoneno (>70 %). Las reacciones se hicieron a escala laboratorio en frascos de 20 mL con sello PTFE/Silicona, empleando como biocatalizador el hongo filamentoso Aspergillus niger DSM 821, obtenido de la Coleccin Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, DSMZ. Se estudiaron diferentes parmetros del sistema: medio de cultivo, concentracin de sustratos y disponibilidad de oxgeno. Los productos formados fueron identificados y cuantificados por cromatografa de gases con detectores FID y MSD. Para la extraccin se estudiaron dos tcnicas disponibles que fueron comparadas posteriormente: extraccin lquido-lquido y microextraccin en fase slida - SPME. Se logr la biooxidacin de los monoterpenos (limoneno y -pineno) en la mayora de los experimentos para obtener como productos principales -terpineol, p-mentano-1,8-diol (terpino) y alcohol perlico, en cantidades relativas mximas de 55,1 %, 46,5 % y 14,7 %, respectivamente. Segn estos resultados es posible considerar a futuro un proceso de biotransformacin a nivel industrial y realizar su optimizacin logrando as aprovechar subproductos agroindustriales de fcil adquisicin.

*

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Trabajo de Investigacin y Tesis de Maestra en Qumica Universidad Industrial de Santander, Facultad de Ciencias, Escuela de Qumica. Directora, Aid Perea Villamil

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ABSTRACT

TITLE: BIOTRANSFORMATION OF LIMONENE, -PINENE, ORANGE AND MANDARIN ESSENTIAL OILS USING Aspergillus niger Author: Fabin E. Castellanos ** Keywords: limonene, -pinene, orange essential oil, biotransformation, biocatalyst Limonene and -pinene are the most abundant monoterpenes in nature, present in essential oils extracted from peel of citrus fruits, including orange and mandarin. These monoterpenes are susceptible of oxidation to generate oxygenated compounds of greater added value. Since in our region exists the production of citrus fruits, it is possible to obtain high amounts of these oils at low cost for use on biocatalytic processes to obtain derivatives with interesting cosmetical and pharmaceutical applications, additionally considered like natural products. In the present work, a study for the biotransformation of limonene, -pinene, orange and mandarin essential oils with high limonene content (> 70 %) was carried out. The reactions were made at laboratory scale in 20 mL vials with PTFE/Silicone seals and using as biocatalyst filamentous fungi Aspergillus niger DSM 821, obtained from German Collection - DSMZ. Different reaction and culture conditions like substrates concentration, oxygen availability and types of growth media were studied. The formed products were resolute and its characterization was made by gas chromatography coupled to FID and MSD type detectors. For the extraction, two methods were used and later compared: solvent liquid-liquid extraction and headspace solid phase microextraction (HS-SPME). The main conversion products obtained were -terpineol, p-menthane-1,8-diol and perillyl alcohol with the highest relative percents of 55,1 %, 46,5 % y 14,7 %, respectively. According to results, we consider possible developing industrial bioprocesses to take advantage of agroindustrial available by-products.

Research Work and MSc. Thesis Universidad Industrial de Santander, Science Faculty, Chemistry Department. Directed by Aid Perea Villamil**

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INTRODUCCIN

Los procesos biocatalticos se han fortalecido mundialmente en las ltimas dcadas debido a grandes tendencias de la sntesis qumica actual como el desarrollo sostenible, la qumica verde y los procesos ambientalmente benignos. Las diversas industrias que buscan seguir e implementar estas pautas se encuentran dedicadas a la elaboracin continua de productos farmacuticos, alimenticios y agroindustriales en su gran mayora (Bommarius y Riebel, 2004; Pinheiro y Marsaioli, 2007) Entre la diversidad natural de componentes promisorios susceptibles de biotransformacin se destacan los compuestos poliaromticos, esteroides, alcaloides, cumarinas y terpenoides. Desde el punto de vista industrial es deseable emplear sustancias de alta biodisponibilidad, econmicas y de fcil obtencin, por esta razn los monoterpenos son sustratos valiosos para la produccin biotecnolgica de compuestos aromatizantes y productos farmacuticos (Giri et al., 2001) En este trabajo se realiz la exploracin de un proceso de biotransformacin cscaras de frutos ctricos. en

microescala que permitiera la oxidacin del limoneno y -pineno, predominantes en las La idea de esta transformacin qumica naci como una alternativa viable para la explotacin y el aprovechamiento de subproductos que son fuentes abundantes de monoterpenos. Como biocatalizador se emple una cepa certificada de Aspergillus niger, debido a su abundancia, facilidad de obtencin y desempeo comprobado en diferentes tipos de biotransformaciones. Adicionalmente, el futuro de estos procesos es alentador si se tiene en cuenta que los ctricos conforman el 34,5 % de la produccin total de frutas en Colombia. En el 2004 se alcanz una produccin total de ctricos de 989 539 Ton, con un crecimiento promedio anual del 6,7 %. Algunos departamentos como Santander, Norte de Santander, Boyac, Cundinamarca, Tolima y Huila contribuyen con el 47 % de la produccin nacional total de

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ctricos en el pas (450 351 Ton), siendo los principales productores de naranja los departamentos de Tolima, Antioquia, Cesar, Santander y Cauca, con el 97,9 % de la produccin de esta especie. Con respecto a la produccin de mandarina el principal departamento productor es Santander, con un 85,5 % del total nacional segn la produccin acumulada 2000-2004 (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2005). Este trabajo de investigacin fue financiado por COLCIENCIAS a travs del Centro de Excelencia CENIVAM (contrato N 432-2004) y se desarroll en el Centro de Investigacin en Ciencia y Tecnologa de Alimentos (CICTA). Los resultados parciales obtenidos en este trabajo fueron presentados en modalidad Oral en el IX Congreso Colombiano de Fitoqumica realizado en Pereira, Colombia entre el 8-11 de Mayo de 2007 y publicados en la Edicin Especial de la revista Scientia et Technica, Ao XIII, N 33, Mayo de 2007 (ISSN 0122-1701)

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1. MARCO TERICO 1.1 Biotransformacin y biocatlisis aplicadas 1.1.1 Aspectos generales, situacin actual y aplicaciones industriales

Los procesos de biotransformacin se definen como aquellos en los cuales se emplean sistemas biolgicos para llevar a cabo transformaciones qumicas de cualquier tipo. Estos sistemas se denominan biocatalizadores y se caracterizan por ser enzimas o clulas completas, ya sean de microorganismos naturales o recombinantes (Hanson, 1998; Doble et al., 2004). Aunque comnmente se aplican enzimas libres, es preferible el uso de clulas completas ya que son de fcil obtencin y bajo costo. Adems, las membranas celulares protegen las enzimas de fuerzas de cizalla, de la toxicidad de solventes y permiten el abastecimiento de cofactores necesarios para la consecucin de las reacciones intracelulares (Duetz et al., 2001; Ishige et al., 2005) En diversas publicaciones se han hecho revisiones acerca de las ventajas, mitos y realidades del uso de biocatalizadores como tecnologas alternativas emergentes, en comparacin con los catalizadores sintticos convencionales (Rozzell, 1999; Held et al., 2000; Thomas et al., 2002), segn las cuales, es de aceptacin general que los biocatalizadores, en la mayora de casos, funcionan adecuadamente bajo condiciones suaves de reaccin, poseen alta actividad cataltica y permiten superior regio y estereoselectividad. En algunos casos es posible observar menor selectividad cuando se trabaja con microorganismos completos debido a que las clulas contienen diferentes grupos de enzimas capaces de transformar al sustrato. De cualquier forma, y por fortuna, la selectividad puede ser alterada variando el medio, adicionando solventes orgnicos o inhibidores de enzimas no deseadas, entre otros. Actualmente existe una tendencia creciente hacia el uso de biocatalizadores aplicados en la obtencin de molculas complejas de inters industrial, especialmente en el sector farmacutico, donde son requisitos fundamentales las propiedades de selectividad y

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especificidad en un proceso de sntesis (Schulze y Wubbolts, 1999; Pollard y Woodley, 2006). La estereoselectividad es un tema trascendente, por ejemplo en los frmacos, cuya actividad depende del enantimero presente. Estos productos nicamente se consideran enantimeros puros cuando uno de ellos est en exceso del 98%. Aunque la mayora de productos farmacuticos son racmicos, usualmente solo uno de los enantimeros presenta la actividad biolgica deseada; el otro puede ser inactivo o incluso tener actividad nociva. La US FDA estableci su poltica frente al tema desde el ao 1992, definiendo que, en una droga quiral, deben ser estudiados los efectos biolgicos de ambos enantimeros (US Food and Drug Administration, 1992). La quiralidad tambin es importante en perfumera ya que la percepcin del sabor y olor (flavor) dependen de la conformacin absoluta del estereoismero presente. Diferentes ismeros del mismo compuesto pueden tener diferentes caractersticas organolpticas. Algunas revisiones publicadas por Frater et al. (1998), Brenna et al. (2003), McConathy y Owens (2003) y Leffingwell (2003) realizan el anlisis qumico/biolgico de la quiralidad en las molculas y su relacin con la actividad en frmacos y perfumes. En otros trabajos se destacan aspectos sobre la importancia en la seleccin de la tcnica usada para identificar diferentes estereoismeros; al respecto, Maier et al. (2001), Schurig (2001) y Zhang et al. (2005), discuten sobre las tcnicas de separacin de enantimeros, especialmente de la cromatografa quiral. La gran mayora de compuestos aromatizantes se preparan por sntesis qumica convencional, sin embargo, en las ltimas dcadas se ha incrementado considerablemente su obtencin a travs de nuevos procesos biotecnolgicos. Esto se debe en parte a que las legislaciones de USA y Europa han definido como sustancias naturales nicamente a aquellas que pueden prepararse por procesos fsicos, enzimticos o microbianos a partir de precursores aislados de la naturaleza. Esta clasificacin ha creado una competencia en el mercado ya que los compuestos etiquetados como naturales presentan alta demanda, mientras que otros compuestos producidos por mtodos qumicos, a pesar de ser

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denominados como idnticos al natural, son menos apreciados por los consumidores (Serra et al., 2005). Mundialmente numerosos procesos comerciales emplean enzimas o microorganismos como catalizadores, los cuales demuestran la importancia de las reacciones de biotransformacin aplicadas a la industria. Al respecto Thomas et al. (2002) hacen una interesante discusin acerca de las aplicaciones de la biocatlisis a escala industrial. Aunque las biotransformaciones industriales se usan principalmente en la elaboracin de qumicos finos, existe un aumento de casos en la produccin de commodities. El proceso de biotransformacin a gran escala ms exitoso es la fabricacin de acrilamida a partir de acrilonitrilo, usando una enzima nitrilo-hidratasa (Fig. 1). La acrilamida se forma con productividad de 100 L/h, logrando concentraciones finales de producto superiores a 400 g/L. Mientras que el proceso enzimtico opera a 10 C, con rendimiento del 100 % y no genera subproductos, su contraparte, el proceso qumico convencional, est basado en un catalizador de Cobre que opera a 100 C, produciendo HCN y cido acrlico como subproductos (Liese y Filho, 1999; Straathof et al., 2002). Este sistema se comercializa en Japn por MITSUBISHI RAYON CO. (anteriormente NITTO CHEMICAL INDUSTRY CO.) cuya escala reportada es aproximadamente de 20 000 ton producto/ao. Esta compaa ha patentado varios procesos para la produccin continua de acrilamida (o metacrilamida) a partir de acrilonitrilo (o metacrilonitrilo) empleando microorganismos solubles con actividad nitrilasa (Watanabe, 1982; Yamaguchi et al., 1984; Watanabe et al., 1989) y microorganismos inmovilizados en polmeros catinicos en forma de gel (Watanabe et al., 1983).

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Nitrilo hidratasa

N

NH2

H2O

O

Figura 1. Obtencin biocataltica de acrilamida a partir de acrilonitrilo

Con respecto a los procesos finos, la sntesis de vainillina es de gran inters industrial. La fuente natural de vainillina (Fig. 2), la Vanilla planifolia, solo suple en 20 000 kg/ao la demanda mundial de vainillina, estimada en 1,2 x107 kg/ao, por esta razn es necesaria su produccin sinttica. Este compuesto se encuentra en las vainas de orqudeas tropicales de V. planifolia en concentracin del 2 % en peso, sin embargo, menos del 1 % del mercado global es cubierto por el compuesto extrado de la planta (Liese y Filho, 1999). El valor de la vainillina extrada (natural) se calcula entre USD 1200-4000/kg mientras que la vainillina sinttica preparada a partir del guayacol tiene un precio menor a los USD 15/ kg (Serra et al., 2005). Esta gran diferencia de precio, es generada por la preferencia de los consumidores hacia los productos naturales.

O O

HO

Vainillina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldehdo)

Figura 2. Vanilla planifolia y estructura qumica de la vainillina

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La sntesis qumica de la vainillina se logra por metilacin del catecol para obtener guayacol, que por reacciones subsiguientes se transforma en vainillina (Fig. 3). Una nueva alternativa en desarrollo hacia la vainillina natural se basa en biocatlisis partiendo de glucosa, que es convertida en cido vainllico por una cepa recombinante de E. coli. Posteriormente el cido se reduce a vainillina por una deshidrogenasa de Neurospora crassa (Fig. 3). Gracias al diseo de esta ruta biocataltica se logran dos poderosas ventajas, el producto se considera como vainilla natural y el proceso de manufactura es ambientalmente benigno: no involucra intermediarios o solventes txicos ni carcinognicos y no esta basado en derivados del petrleo (Liese y Filho, 1999). Tambin existen otros procesos biotecnolgicos en desarrollo para la produccin de vainillina a partir sustratos naturales como lignina y de terpenoides como anisol, eugenol e isoeugenol (Walton et al., 2000, 2003; Serra et al., 2005). Adems de la vainillina, otros compuestos usados como ingredientes aromatizantes despiertan inters, como es el caso del mentol, la cetona de frambuesa y el 2-feniletanol (Fig. 4). Estos compuestos estn presentes en tan baja cantidad en las plantas, que su extraccin no es viable y el principal modo de obtencin es a partir de precursores naturales abundantes. El caso ms importante es el mentol, usado como aditivo en alimentos, cosmticos, frmacos, cremas dentales y gomas de mascar. Las propiedades organolpticas de este monoterpeno estn relacionadas a su configuracin absoluta y de sus ocho posibles ismeros nicamente es adecuado como agente odorante el natural, (-)-(1R, 3R, 4S)mentol. En 1998 la produccin mundial estimada de (-)-mentol fue de 11800 ton (Serra et al., 2005), la gran mayora obtenido por congelamiento del aceite de Mentha arvensis. nicamente las compaas HAARMANN & REIMER GmbH (Alemania) y TAKASAGO INTERNATIONAL CO (Japn) han desarrollado procesos qumicos y biocatalticos que son fuentes comerciales del mentol.

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OH HOMe2SO4 180CO

Acido glioxlico

O

OH

HO

HO

O

Catecol

Guayacol

HO

Acido vainillinmandlico

O

O

[O]

-CO2

Anisol

HO

Eugenol Ruta biocataltica

O O

O

HO

VainillinaHO

IsoeugenolAril aldehdo deshidrogenasa

H OH H HO HO H H H OH OH O

OH O

E. coli recombinante

O

HO

d-glucosa

cido vainllico

Figura 3. Esquema de la sntesis de vainillina a partir del catecol, glucosa y otros sustratos terpenoides

OOH

OHHO

Mentol

Cetona de frambuesa

2-feniletanol

Figura 4. Estructura qumica de compuestos aromatizantes de inters obtenidos biocataliticamente

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HAARMANN & REIMER posee patentes para la

separacin de ismeros del mentol,

neometol e isomentol pticamente puros por esterificacin cida no biocataltica (Fleischer, 1976) y para la produccin de mentol y sus derivados empleando lipasas en separaciones enzimticas enantioselectivas (Gatfield et al., 2002). Tambin posee una patente para la preparacin de -terpineol por hidratacin acuosa de -pineno con catalizadores cidos (sulfrico y fosfrico) en presencia de agentes emulsificantes (Moelleken, 1992). Por su parte, TAKASAGO INTERNATIONAL CO. posee patentes para la obtencin de (-)mentol de alta pureza por esterificacin/hidrlisis enzimtica y selectiva (Nakayama et al., 1978), por hidrogenacin de piperitenona empleando complejos de metales de transicin (Noboru y Takaji, 2004), y por aislamiento bioqumico empleando hidrlisis asimtrica de steres de mentol con hidrolasas de microorganismos de diferentes gneros, Absidia (Moroe et al., 1970; Takasago, 1972) La produccin de 2-feniletanol tambin se encuentra patentada por la compaa HUABAO INTERNATIONAL HOLDINGS (Tu et al., 2003) a travs de un proceso microbiano que usa el tabaco como precursor, con el cual bajo ciertas condiciones, se lleva a cabo la degradacin de lignina, pectina y polifenoles para la produccin del 2-feniletanol que posteriormente es purificado por adsorcin en una resina de intercambio inico. Tambin se destacan otros casos extraordinarios que aprovechan enzimas isomerasas e hidrolasas en procesos industriales. Por ejemplo, la produccin de jarabe de maz de alta fructosa a partir de glucosa empleando la enzima glucosa-isomerasa, en un proceso que genera hasta 6 millones de toneladas de producto por ao (Zhang et al, 2004; Borges da Silva et al, 2006; Tomotani y Vitolo, 2007) o la produccin de leche deslactosada, por hidrlisis de lactosa a glucosa y galactosa empleando una -galactosidasa, con producciones superiores a los 250 000 L/da. La mayora de estos procesos son bastante eficientes y han sido optimizados, por lo tanto no son propensos a innovacin tecnolgica inmediata, sin embargo, muchos procesos en desarrollo necesitan ser mejorados para como Penicillium, Gliocladium, Trichoderma, Geotrichum, Aspergillus, Pullularia, Fusarium y

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hacerlos tcnicamente viables y econmicamente competitivos. Estos y otros ejemplos de bioconversiones a gran escala son descritos por Gavrilescu y Chisti, 2005, quienes plantean los procesos biotecnolgicos como alternativas sostenibles para la industria qumica. 1.1.2 Biotransformaciones oxidativas y oxigenasas

Desde su descubrimiento y durante mucho tiempo despus, las oxigenasas se consideraron enzimas inusuales, cuya presencia se limitaba nicamente a organismos vivientes primitivos como bacterias del suelo u hongos (Hayaishi et al., 1955; Itada, 1965; Nakasawa, et al., 1967). Posteriormente, se fueron encontrando en todos los reinos de la naturaleza, la vida. Las enzimas oxigenasas comprenden varias familias de protenas que catalizan la insercin de uno o dos tomos de oxgeno en diversos sustratos (Fig. 5). El aire sirve como fuente de oxgeno molecular y los equivalentes de reduccin son obtenidos del NADH o NADPH gracias a protenas de transferencia de electrones. Las oxigenasas catalizan reacciones con alta regio- y estereo- selectividad y se destacan particularmente las reacciones de hidroxilacin y epoxidacin (Hayaishi, 2004). Las monooxigenasas ms estudiadas hasta ahora pertenecen al grupo Citocromo P450 (Fig. 6), una verstil superfamilia de enzimas que contienen grupo hemo y catalizan reacciones oxidativas en sustratos que van desde pequeos alcanos hasta molculas complejas como los esteroides y cidos grasos. Las P450 han sido sometidas a numerosos estudios de ingeniera gentica con el fin de comprender sus funciones y propiedades para convertirlas en catalizadores ms eficientes (Cirino et al., 2002). Las P450 catalizan preferiblemente la monoxigenacin de compuestos hidrfobos y tienen la extraordinaria capacidad de introducir oxgeno en enlaces C-H no activados (Urlacher y Schmid, 2006). y actualmente se reconoce su papel fundamental en el metabolismo de nutrientes, hormonas, neurotransmisores y la biosntesis de compuestos indispensables para

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SUSTRATO

+ O2

Dioxigenasa

SUSTRATO-O2

Monooxigenasa

SUSTRATO +

O2 + H +

+ NAD(P)H

SUSTRATO-O + NAD(P)+ + H2O

Figura 5. Reacciones generales de oxidacin catalizadas por oxigenasas

N Fe N

N

N

HO

O

O

OH

Figura 6. Estructura del grupo hemo y su ubicacin en una oxigenasa P450: estructura de cintas y lazos de la oxigenasa P450-Terp (CYP108) de una forma recombinante de Pseudomonas sp. expresada en E. coli que cataliza la oxidacin de - terpineol (Hasemann et al., 1994)

Se ha comprobado que los sistemas P450 estn involucrados en ms de 20 diferentes clases de reacciones qumicas, de las cuales, algunas son muy inusuales. La estructura y funcin qumica de las enzimas P450 todava es motivo de controversia y de constante investigacin. En general es aceptado que el ciclo cataltico de estas oxigenasas (Fig. 7) se inicia con su enlace al sustrato (A), seguido por la introduccin del primer electrn del NAD(P)H a travs de una cadena de transferencia de electrones (B). En el siguiente paso (C), se enlaza el oxgeno, el cual es capaz de aceptar el segundo electrn para producir un anin peroxi-frrico (D). En los siguientes pasos el anin se protona para formar un

30

complejo hidroperoxifrrico (E), el cual decae por un rompimiento heteroltico con la formacin de la especie ferrilo, conocida como Compuesto I (F). Esta especie ataca al sustrato formando el producto hidroxilado (G), que se disocia para regenerar la enzima y dar lugar a un nuevo ciclo. Los aspectos mecansticos, estructurales y biotecnolgicos de las P450 son revisados extensamente por Denisov et al. (2005), Ortiz de Montellano (2005), Sligar et al. (2005) y Bernhardt (2006).OH2

G R-OHN

N

N

R-H A

Fe O +.(IV)

(III)

N S

N

FN

N

N Fe N S(III)

N

Fe

N

N

eB

S

H2 O H+

OH O(1-)

N Fe N S O O N Fe(III) (II)

N

EN

N Fe(III)

N

N

N S O N Fe N S N S(III)

OH(1-)

(2-)

N

N

O2 C

H+

N

N

D

e-

Figura 7. Representacin del mecanismo de oxidacin catalizado por oxigenasas P450 (ciclo cataltico)

Durante mucho tiempo se crey que las oxigenasas requeran cofactores para la catlisis, sin embargo, en trabajos recientes se han identificado algunas que no necesitan iones metlicos ni cofactores para su activacin (Fetzner, 2007). La gran mayora de oxigenasas presentes en microorganismos, que son de inters en biotransformacin, son enzimas P450 a excepcin de algunas oxigenasas no hemo, conocidas como alcanooxigenasas e

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hidroxilasas.

Las enzimas P450 frecuentemente se presentan como sistemas complejos

con estructura cuaternaria formados por 2 componentes: una hidroxilasa y una reductasa. Adems, siempre estn enlazadas a la membrana celular lo cual genera dificultad en su manipulacin y produccin a gran escala (Ayala y Torres, 2004). Por otra parte, los sistemas de alcano-hidroxilasas no hemo, presentan tres componentes: una hidroxilasa, una rubredoxina y una rubredoxin-reductasa, donde la hidroxilasa est enlazada a la membrana mientras que los otros dos componentes son protenas citoplasmticas. En particular el sistema de metano-oxigenasas es sumamente interesante ya que permite la oxidacin directa de sustratos difciles, poco reactivos y muy abundantes, derivados de la industria del petrleo, como los alcanos de cadena corta desde C1 hasta C5 (Lange y Que .Jr, 1998; Van Beilen y Funhoff, 2005). Las oxigenasas tambin permiten las sntesis de compuestos que no son accesibles por otras rutas qumicas, por ejemplo, la hidroxilacin regioespecfica de esteroides, lo cual hace que sus aplicaciones a escala industrial presenten enorme potencial (Holland y Weber, 2000; Ayala y Torres, 2004). En la actualidad es tan importante el estudio de las oxigenasas P450 en la activacin de diversos compuestos, que existen estudios puramente tericos para desentraar los mecanismos y reactividad del oxgeno, como ejemplos se tienen trabajos de aplicacin de la Teora del Funcional de Densidad Hbrida (H-DFT) para el anlisis de diferentes mecanismos del rompimiento de la molcula de oxgeno (Blomberg et al., 2000; Hata et al., 2005 ), modelado molecular empleando estructuras 3D para estudio de mecanismos de la activacin del enlace O-O (Hlavica, 2004; Kirton et al., 2002) y estudios computacionales tericos de la hidroxilacin de alcanos y la epoxidacin de alquenos (Shaik et al., 2002). Los estudios de la oxidacin de monoterpenos y otros hidrocarburos afines, tambin abarcan la qumica terica computacional en trabajos como el modelado de la formacin de aerosoles en la atmsfera por oxidacin de -pineno, -pineno y limoneno (Chen y Griffin, 2005), el modelado terico de la hidroxilacin por oxigenasas empleando aproximaciones DFT (Chen y Chan, 2006), determinacin de geometras ptimas de los radicales que se forman por la adicin de OH al -pineno y -pineno usando la teora del estado de

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transicin cannico variacional, CVTST ( Fan et al., 2005), estudios tericos de la adicin de OH al limoneno y al -pineno en fase gaseosa empleando calculos Ab initio (RamirezRamirez y Nebot-Gil, 2005; Ramirez-Ramirez et al., 2004) y estudios de la activacin del enlace C-H en alcanos usando DFT (Yoshizawa, 2002). Debido este conjunto de razones, el nmero de procesos para la fabricacin de qumicos finos que involucran biocatlisis se est incrementando considerablemente. De hecho, se estima que la biocatlisis y la biotransformacin podran abarcar hasta el 30% de la sntesis de qumicos para el ao 2050 (Van Beilen et al., 2003) 1.1.3 Uso de clulas completas

Las enzimas monooxigenasas microbianas involucradas en el metabolismo de compuestos endgenos y xenobiticos poseen potenciales aplicaciones en reas como la sntesis orgnica, la biorremedacin y la produccin de frmacos. Las fuentes microbianas de estas enzimas corresponden a especies bacterianas, levaduras y hongos en su gran mayora. La bsqueda continua de nuevas fuentes de enzimas es una labor que aun se mantiene en pie con la esperanza de encontrar propiedades catalticas nicas e inusuales (Pinheiro y Marsaioli, 2007; Vatsyayan et al., 2007). Para que un microorganismo sea viable como biocatalizador, idealmente debera cumplir un conjunto de condiciones: ser de fcil adquisicin, inocuo, ambientalmente abundante, susceptible a modificacin gentica, resistente ante condiciones adversas y, adems, que posea alta selectividad hacia los sustratos de inters. Difcilmente una clase de microorganismos llenara todos los requisitos descritos, sin embargo, algunas bacterias y hongos renen caractersticas que los hacen excelentes biocatalizadores. Entre las bacterias, algunas especies de Rhodococcus y Pseudomonas parecen ser las ms promisorias, sin embargo, tambin se ha reportado la aplicacin eficiente Mycobacterium sp. y Bacillus sp., con las cuales se han logrado transformaciones oxidativas. Los hongos

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y levaduras con ms aplicaciones reportadas pertenecen a los gneros Aspergillus, Penicillium y Botrytis, aunque tambin se han probado con xito diferentes especies de Candida, Cunninghamella, Beauveria, Pleurotus, Hormonema y Cladosporium (Onken y Berger, 1999; De Carvalho y Da Fonseca, 2006). En muchos casos se prefieren los hongos debido a su produccin de enzimas P450 con un amplio espectro de sustratos, aunque pueden presentar actividades celulares menores con respecto a las bacterias. Gracias a los avances biotecnolgicos y al aumento creciente del conocimiento acerca de la expresin heterloga de enzimas P450, actualmente se realiza manipulacin gentica de diferentes microorganismos para adaptarlos a nuevos procesos biocatalticos con eficiencia mejorada. La manipulacin con tcnicas de ADN recombinante es un rea interesante de estudio gracias a la cual se puede mejorar un microorganismo (o sus enzimas) y cambiar su selectividad o capacidad metablica, que se traduce en mayor productividad. Este es un tema de trascendencia mundial y es tratado por autores como Bell et al. (2001), Li et al. (2002) y Robertson y Steer (2004). Entre las bacterias, el Rhodococci se destaca por su amplia versatilidad gentica y metablica as como por la habilidad para ocupar diferentes nichos ecolgicos, siendo uno de los candidatos preferidos para la biotransformacin y biorremedacin (Duetz et al., 2001). El Rhodococci ha sido detectado en muchos ambientes inhspitos, incluidos sedimentos de desechos altamente radiactivos donde otras bacterias difcilmente sobreviviran. Entre las especies interesantes se encuentran el Rhodococcus opacus y Rhodococcus erythropolis, bacterias Gram-positivas (orden Actinomycetales, familia Nocardiaceae) capaces de diferenciacin morfolgica en respuesta al ambiente y, aunque algunas especies son patgenas, la mayora suelen ser habitantes inocuos del suelo (Van der Geize y Dijkhuizen, 2004; Larkin et al., 2005). El gnero Pseudomonas (orden Pseudomonadales, familia Pseudomonadaceae), pertenece al grupo de bacterias Gram-negativas de importancia por su resistencia ante adversas condiciones ambientales creciendo en lugares casi imposibles para otras bacterias. Aunque

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se considera patgeno, algunas especies son relativamente seguras para su empleo en biotransformaciones, como Pseudomonas cepacia o Pseudomonas putida (De Bont, 1998; Walsh et al., 2001). En cuanto a los hongos, Pencicillium y Aspergillus presentan superioridad, ya que ningn otro gnero tiene un potencial de adaptacin tan elevado. Aspergillus es un gnero de hongos filamentosos encontrado en la naturaleza, aislado comnmente del suelo, plantas y aire en ambientes cerrados. Pertenece al orden de Eurotiales, familia Trichocomaceae y se conocen cerca de 185 especies de las cuales 20 se han reportado como agentes causantes de infecciones oportunistas en el hombre. El Penicillium es un hongo filamentoso cercanamente emparentado con el Aspergillus, siendo muy similares en sus caractersticas y morfologa. Entre las especies de stos hongos empleadas para biotransformaciones de terpenos se encuentran A. niger, A. cellulosae, A. fumigatus, P. digitatum y P. italicum (Demyttenaere y De Pooter, 1996; Demyttenaere y Willemen, 1998; Demyttenaere y De Kimpe, 2001; Demyttenaere et al., 2000, 2001, 2004). Otro gnero de gran inters es Botrytis, un hongo filamentoso que se asla de plantas moribundas y predomina en zonas tropicales, por ejemplo, la especie Botrytis cinerea aunque se considera un agente fitopatgeno, es inocua en los humanos y se ha reportado en interesantes casos de biotransformacin de diferentes monoterpenos y otros sustratos (Aleu y Collado, 2001; Farooq et al., 2002) 1.2 Biooxidacin de monoterpenos: limoneno y -pineno

Las oxidaciones catalticas selectivas de molculas orgnicas se encuentran dentro de los procesos tecnolgicos ms importantes en la industria qumica. Principalmente la oxidacin selectiva de alcanos y alquenos son objetivos clave en la actualidad y aunque son procesos termodinmicamente favorecidos, son difciles de lograr de una manera controlada (Costas et al., 2000). Dentro de los compuestos naturales susceptibles a transformaciones biocatalticas se encuentran los monoterpenos, principalmente el limoneno y el -pineno,

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que por ser los ms abundantes en las especies vegetales, se convierten en candidatos ideales para la generacin de oxi-derivados. 1.2.1 Procesos de transformacin

Limoneno

Los dos enantimeros del limoneno son los monoterpenos monocclicos ms abundantes en la naturaleza. El (S)-(-)-limoneno se encuentra principalmente la Mentha spicata, mientras que el (R)-(+)-limoneno es el componente principal (hasta un 95%) del aceite esencial obtenido del exocarpo de frutos ctricos (naranja, limn, mandarina, pomelo) y del aceite esencial de alcaravea (Carum carvi). El limoneno es separado por un proceso de desterpenacin, as que se emplea con frecuencia como sustrato enantiopuro para la sntesis qumica de aromatizantes (Ager, 1999; Duetz et al., 2003). El limoneno presenta enlaces dobles entre los carbonos C1-C2 y C8-C9, siendo ms probable la oxidacin (hidroxilacin) en las posiciones allicas (C3, C6) y la epoxidacin en los dobles enlaces por razones de estabilidad y reactividad qumica, sin embargo, puede oxidarse en otros carbonos menos reactivos. Debido a que la reactividad en los metilos y metilenos allicos es muy similar, la selectividad se dificulta cuando se emplean catalizadores convencionales, por esta razn se prefiere el uso de biocatalizadores. En la Figura 8 se indican los posibles sitios de oxidacin y algunos de los compuestos oxidados ms importantes (Duetz et al., 2003).

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OH

O

7

epoxi-1,2-limonenoO

alcohol perlico1 6 2OH

perilaldehdo

O

3 4

5

carveol

carvona

-terpineol8OH

9 10O

epoxi-8,9-limoneno

Figura 8. Representacin de la estructura qumica optimizada en 3D del limoneno y algunos de sus productos oxidados ms importantes, indicando los sitios de oxidacin (no se ha definido la estereoqumica)

Desde el punto de vista comercial es interesante destacar que la industria de jugos ctricos aporta una gran cantidad de cscaras como residuos, tiles para la obtencin del limoneno. El bajo costo del limoneno enantiopuro extrado (USD 1-2 /kg) de estos residuos, ha generado inters en la industria qumica, debido a que una serie de compuestos medicinales y aromatizantes poseen el mismo esqueleto carbonado del limoneno, lo cual sugiere un gran potencial de sntesis (Duetz et al., 2003). Los derivados ms notables del limoneno por sus aplicaciones son compuestos oxigenados como -terpineol, alcohol perlico, carveol, carvona y mentol cuyos precios aproximados son hasta 100 veces mayores que el del limoneno (Duetz et al., 2003). El limoneno se ha logrado transformar en diversas ocasiones empleando preferiblemente hongos. Se destaca el trabajo realizado por Demyttenaere et al. (2001) donde se ensayaron ms de 60 cepas fungales y se evalu la tcnica SPME por su rapidez y eficiencia en la extraccin e identificacin de compuestos oxigenados. Una de las cepas que present buen desempeo fue el Penicillium digitatum, para la obtencin de -terpineol como principal

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componente y como metabolitos minoritarios cis/trans p-ment-2-en-1-ol, neodihidrocarveol y xido de limoneno. Con Corynespora cassiicola se obtuvo como producto principal limoneno-1,2-diol, pero la mejor conversin de limoneno para la obtencin de -terpineol fue lograda con Penicillium digitatum luego de 8 horas y con un rendimiento del 100%. Los sondeos rpidos en los productos de biotransformacin son comnmente realizados para seleccionar microorganismos, por ejemplo, Chatterjee y Bhattacharyya (2001) En dicha con estudiaron tres cepas fungales y 15 cepas bacterianas, concluyendo que la Pseudomonas putida MTCC 1072 presenta alta eficiencia en la oxidacin de limoneno. identificndolos como alcohol perlico y p-ment-1-eno-6,8-diol, conversin los productos fueron aislados y caracterizados mediante FTIR y NMR, obtenidos rendimientos de 36 % y 44 % respectivamente. Adems de Pseudomonas, algunas especies poco convencionales se han probado en la biotransformacin., por ejemplo Houjin et al. (2006) investigaron la biotransformacin de limoneno por las bacterias marinas Vibrio cholerae, Listonella damsela y Vibrio alginolyticus. Los ensayos se hicieron a 28C durante 6 das en agitador rotatorio, obteniendo una mezcla de diversos productos como epxidos, alcoholes, cetonas, aldehdos y steres derivados del limoneno. La gran mayora de trabajos se han enfocado al uso de hongos, quizs por las razones mencionadas con anterioridad. Entre los casos ms destacados se encuentra el de Menendez et al. (2002) quienes lograron la biooxidacin de limoneno por una cepa de Aspergillus niger con produccin de alcohol perlico (28,5 %) y cidos grasos de cadena corta. Este es uno de los casos donde se han reportado productos no monoterpnicos como los cidos grasos y donde se ha empleado el ketoconazol como inhibidor de oxidasas P450, que permite mejorar la selectividad ya que interrumpe la produccin de cidos grasos sin afectar la produccin del alcohol perlico (100 %).

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Diferentes especies de Aspergillus presentan gran actividad en la oxidacin, tal es el caso del Aspergillus cellulosae, en la transformacin de R-(+)-limoneno a isopiperitenona, limoneno-1,2-diol, carveol y alcohol perlico, mientras que el S-(-)- limoneno es transformado a alcohol perlico, trans-limoneno-1,2-diol y neodihidrocarveol como productos principales (Noma et al., 1992). En este caso se aprecia claramente la estereoespecificidad de las enzimas transformadoras. Por su parte, Tan y Day (1998) han reportado el uso del micelio de Penicillium digitatum para la obtencin de R-(+)--terpineol (0,83 mg/mL). Curiosamente la bioconversin nicamente ocurre en fases temprana y media de crecimiento del hongo sin importar la edad del inoculo empleado. Tambin se concluye la posibilidad de emplear concentraciones hasta del 1 % de limoneno sin inhibir la conversin. La temperatura ptima reportada es 28 C con un pH de 4,5; logrando la ms alta concentracin del producto luego de 48 h de reaccin. Para las bioconversiones no solo se han empleado monoterpenos aislados sino tambin desechos vegetales ricos en monoterpenos, tal es el caso de la biotransformacin de aceite esencial de naranja con un 94 % de limoneno, usando residuos agroindustriales de yuca (Cassava) como medio de cultivo. Una de las cepas probadas, Fusarium oxysporum 152B, permiti la produccin de -terpineol (450 mg/L) despus de 3 das de reaccin (Marostica y Pastore, 2007). Adems de bacterias y hongos, las clulas vegetales parecen promisorias para este tipo de bioprocesos, de las cuales Picea abies (en suspensin) ha permitido la conversin de R(+)-limoneno hasta limoneno-1,2-epxido, carveol, alcohol perlico y 1,8-cineol (Lindmark-Henriksson et al., 2004). Tambin se han usado clulas de Solanum aviculare y Dioscorea deltoidea, para la obtencin de carveol y carvona con produccin mxima de 34 % de carvona (Vanek et al, 1999)

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Dentro de las oxidaciones de monoterpenos se destacan algunos procesos catalticos limpios y ambientalmente benignos que no involucran biocatalizadores pero que vale la pena mencionar ya que estn basados en qumica verde. Por ejemplo Cagnoli et al. (2005) describen la epoxidacin limpia de limoneno con H2O2 como agente oxidante, empleando un catalizador de Ti-MCM-41 (tipo tamiz molecular mesoporoso). Este catalizador presenta actividad cataltica hacia los epxidos de limoneno, logrando conversiones del 52 % en 7 h con selectividad del 60 % hacia los xidos (1,2 y 8,9) de limoneno. En otro proceso limpio descrito por Oliveira et al, 2006, se emplean catalizadores heterogneos de vanadio/titanio (V2O5/TiO2) preparados por procedimientos sol-gel, para la oxidacin en fase lquida del limoneno obteniendo como productos de oxidacin polmeros de limoneno, xido de limoneno, carveol y carvona . Diferentes grupos tienen en funcionamiento procesos comerciales de transformacin del limoneno; por ejemplo, la BIOTECHNOLOG FORSCHUNG GMBH (Alemania) ha patentado (Stumpf et al., 1984) la produccin de -terpineol por conversin microbiolgica del limoneno. Tambin posee patentes la KAO CO. para la obtencin de -terpineol pero esta vez por catlisis qumica no biocataltica en reacciones de una etapa con alta eficiencia y diferentes catalizadores cidos como el sulfrico, fosfrico, p-toluensulfnico y clorhdrico (Yamamoto et al., 1997), o catalizadores heterogneos como triflatos de escandio, itrio , neodimio o disprosio (Tanaka et al., 1997) Para la obtencin de carvona la compaa PFIZER INC. ha patentado un proceso microbiolgico a partir de alfa o beta pineno usando como biocatalizador una cepa de Pseudomonas (Rhodes y Winskill, 1985). Tambin existen patentados mtodos qumicos no biocatalticos que parten de limoneno y emplean cloruro de nitrosilo y sales de paladio como catalizadores (Mulder et al., 1999; Chelariu, 2000). Para la produccin de alcohol perlico y perilaldehido a partir de limoneno la UNIVERSIDAD DE MICHIGAN (USA) ha patentado un proceso bacteriano con una cepa de Bacillus stearothermophilus (Chang-Hae y Oriel, 1997). En otros procesos para

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preparar alcohol perlico y acetato de perililo a partir de limoneno, se emplean cepas microbianas cuya identidad se mantiene en secreto (Jourdat et al., 2002; Duetz et al., 2003). Existe tambin una patente registrada para la preparacin de alcohol perlico y acetato de perililo por catlisis qumica cida a partir de oxido de -pineno (Chastain et al., 1999) -pineno

Despus del limoneno, el -pineno es el monoterpeno ms abundante y el principal componente del aceite de trementina, obtenido de las resinas de plantas conferas, que pueden contener hasta un 50% de pinenos (Wang et al., 1997). El ismero ms abundante es el R-(+)--pineno, extrado de fuentes naturales con pureza ptica mxima de 91%, mientras que el S-(-)--pineno se extrae con pureza del 81%. Los pinenos son de gran valor como precursores de fragancias y la mayora de sus derivados (el 84 %) se producen por sntesis qumica (Ager, 1999; Yoo et al., 2001). Sus productos de oxidacin ms frecuentes (Fig. 9) son verbenol, verbenona y aldehdo camfolnico, ya sea para su uso directo o como intermediarios de otros qumicos finos, por ejemplo, citral, mentol , taxol y vitaminas A y E (Maksimchuk et al., 2005).

HO

10

epxido de -pineno

pinocarveol

mirtenol2 3

HOO

HO

O

1 4 7 5 6

8OH

verbenol

verbenona

-terpineol9

Figura 9. Representacin de la estructura qumica optimizada en 3D del -pineno y algunos de sus productos oxidados ms importantes, indicando los sitios de oxidacin (no se ha definido la estereoqumica)

41

El verbenol se usa directamente como aditivo o para producir variedad de compuestos fragantes y vitaminas. Uno de los mtodos promisorios en la actualidad es su obtencin por oxidacin de -pineno empleando oxgeno molecular, aunque son escasos los trabajos dedicados a la oxidacin de -pineno y a la identificacin detallada de sus productos. Este tipo de oxidaciones comnmente se llevan a cabo a travs de mecanismos que involucran formacin de radicales libres y -pineno-hidroperxidos como intermediaros (Ancel et al., 2004). La verbenona es otro compuesto aromatizante de alto valor. Es el principal constituyente de fresas, frambuesas, hierbabuena y eneldo, y en estado puro posee notas fuertes de alcanfor y menta. La verbenona es de gran demanda en la industria de alimentos, con un costo promedio de USD 3000/ kg y es obtenida por extraccin de aceites de pino y eucalipto. Agrawal y Joseph (2000) han logrado la conversin de -pineno a verbenona empleando clulas en reposo de una cepa nativa de A. niger. La mxima formacin de verbenona fue de 3,28 mg /100 mL, equivalente a un rendimiento molar del sustrato de 16,5 %. Las condiciones ptimas obtenidas fueron: pH 7,0; concentracin del sustrato de 20 mg/ 100 mL y un tiempo de incubacin de 6 horas. Se ha logrado tambin la conversin de -pineno empleando Botrytis cinerea para obtener verbenona y tres nuevos metabolitos no descritos con anterioridad: 3-hidroxi-(-)--pineno, 9-hidroxi--pineno y 3-hidroxi-()--pinen-6-ona (Farooq et al., 2002). Para la obtencin de verbenona se han empleado otros mtodos limpios aunque no biocatalticos, por ejemplo, McMorn et al. (2000) obtuvieron verbenona con un 60 % de selectividad empleando un catalizador tipo gel de slice/titanio y como agente oxidante el terbutil hidroperxido. En este estudio tambin se han evidenciado mecanismos de formacin a travs de radicales libres e intermediarios de tipo hidroperxido. Dentro de las patentes registradas para la produccin de verbenol y verbenona a partir de -pineno, se encuentra el empleo de tamiz molecular mesoporoso tipo MCM-41 como catalizador, en un medio alcalino y con ayuda de surfactantes catinicos de amonio (Wang, 2006).

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Tambin se destacan algunos procesos catalticos que emplean metaloporfirinas (catalizadores biomimticos de estructura afn al grupo hemo de las P450) y agentes oxidantes limpios que generan mnima o ninguna contaminacin. Por ejemplo, Guo et al. (2005) han usado metaloporfirinas simples para la oxidacin de -pineno con oxgeno molecular en ausencia de co-catalizadores y solventes. Sus resultados indican que en dicho proceso, la temperatura de reaccin, el ncleo metlico y los sustituyentes perifricos de las metaloporfirinas tienen influencia marcada en la selectividad de la reaccin. El desarrollo de mtodos catalticos selectivos empleando procesos verdes de oxidacin es un reto en la actualidad y una tendencia en la qumica fina. La mayora de tales procesos emplean H2O2 como agente oxidante y diferentes catalizadores slidos de silicatos mesoestructurados con inclusin de metales como Ti (IV) , Zr (IV) y Fe (III) (Maksimchuk et al., 2005) Las biotransformaciones de -pineno se han llevado a cabo satisfactoriamente empleando hongos, bacterias y clulas vegetales. Dentro de los hongos se ha reportado el A. niger en diferentes formas y estados de crecimiento, libre o inmovilizado en polmeros y adicionando el sustrato en fase lquida o gaseosa, para obtener productos como verbenona y -terpineol (Rozenbaum et al., 2006). En algunos casos el A. niger ha sido modificado usando ingeniera gentica con resultados mejorados, tal es el caso de una cepa superproductora de verbenol generada por fusin de dos cepas de A. niger, alcanzando un rendimiento mximo de conversin de 48,6 % en solo 6 h (Vidya y Agrawal, 2003). No solo A. niger ha sido un eficiente oxidante de -pineno, algunas especies menos conocidas como Hormonema sp. han catalizado la formacin de verbenona y trans-verbenol en concentraciones aproximadas de 0,4 g/L despus de 96 horas de reaccin (Van Dyk et al., 1998) Dentro del grupo de las bacterias se destaca la Pseudomonas sp. PIN aislada del suelo y adaptada al sustrato en cultivos enriquecidos con - y - pineno. Con ella se ha logrado la bioconversin con 33,5 % de rendimiento, para obtencin de limoneno, p-cimeno y terpinoleno (Yoo y Day, 2001, 2002). Algunas bacterias termfilas aerbicas como Bacillus pallidus tambin presentan alta capacidad transformadora para la obtencin de metabolitos

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como -pineno, limoneno, pinocarveol, pinocarvona, carveol y carvona (Savithiry et al., 1998) Vanek et al. (2005) han reportado biotransformaciones eficientes de ambos enantimeros de -pineno empleando clulas vegetales de Picea abies inmovilizadas en alginato. Los productos principales fueron cis/trans verbenol y verbenona. La transformacin empleando clulas vegetales libres ha demostrado ser ms rpida que el empleo de clulas inmobilizadas. 1.2.2 Aplicaciones especiales de algunos derivados

Alcohol perlicoOH

Figura 10. Estructura qumica del alcohol perlico

El alcohol perlico (Fig. 10) es el derivado oxigenado con mayor valor farmaceutico y comercial. Es el monoterpeno con la ms potente actividad anticancer y se encuentra en baja concentracin en aceites esenciales de Lavandula hybrida, Mentha piperita, Mentha spicata, Prunas sp., Carum carvi y Perilla frutescens (Belanger, 1998; Gupta y Myrdal, 2004). Es un agente con baja toxicidad, propiedades teraputicas y actividad quimiopreventiva y/o quimioteraputica contra una amplia variedad de cnceres. Recientemente se ha estudiado su efecto como agente teraputico en el tratamiento de tumores de prstata (Peffley et al., 2007; Chung et al., 2006), carcinognesis inducida por PAHs (Chan et al., 2006), dendrogliomas malignos (da Fonseca et al., 2006), tumores de pulmn (Xu et al., 2004) y cncer de mama (Yuri et al., 2004). Tambin se ha sometido a pruebas preclnicas de estudio fase II para el tratamiento

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de cncer de ovario (Bailey et al., 2002), fase II para el tratamiento oral del cncer de prstata (Liu et al., 2003) y fase I en el tratamiento de tumores slidos avanzados (Azzoli et al., 2003). Carvona

OFigura 11. Estructura qumica de la carvona

La carvona (Fig. 11) es uno de los componentes principales en plantas como Alcaravea (Carum carvi), Eneldo (Anethum graveolens) e Hierbabuena (Mentha spicata). Se han descrito diferentes aplicaciones de la carvona, situndola como un compuesto atractivo para produccin. Algunas de sus aplicaciones, detalladas por De Carvalho y Da Fonseca (2006) son: - Inhibicin del brote en papas. La (4S)-(+)-carvona se considera un buen inhibidor del brote (sprout) en tubrculos como la papa. Cuando se compara con qumicos tradicionales antibrote como isopropilfenilcarbamato y 3-isopropilclorofenilcarbamato, la carvona muestra igual o mejor comportamiento durante el almacenamiento a largo plazo, manifestando tambin actividad antifngica contra Fusarium sulphureum, Phoma exigua y Helminthosporium solana. De hecho, la carvona es superior si se compara a otros qumicos considerando su baja toxicidad e inocuidad con la capa de ozono. La carvona se comercializa por la compaa LUXAN V.B (Elst, Pases Bajos) como un agente antibrote bajo el nombre de Talent. - Agente antimicrobiano. Se ha comprobado que ambos ismeros pticos de la carvona son efectivos contra un amplio espectro de hongos y bacterias patgenos en humanos. Se destaca el hecho de que algunos aceites esenciales de Anethum graveolens con alto

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contenido de carvona, aun guardados por ms de 35 aos, muestran excelente actividad microbiana contra hongos como Aspergillus niger y levaduras como Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans. - Repelente. La carvona se ha empleado tambin como un insecticida natural para la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster y se ha probado con xito contra el Aedes aegypti, uno de los principales vectores de enfermedades como la fiebre amarilla, dengue y dengue hemorrgico. -terpineol

Figura 12. Estructura qumica del -terpineol

OH

El -terpineol (Fig. 12) es el alcohol terpnico monocclico comercialmente ms importante, con un consumo anual superior a los 13000 kg/ao, que lo ubica entre los 30 compuestos saborizantes con mayor demanda mundial. Ambos enantimeros tienen olor diferente, el R-(+)- - terpineol tiene un aroma floral a lilas mientras que el S-(-)-terpineol tiene un aroma a madera de conferas. Es usado como perfume, repelente de insectos, antifngico, desinfectante, agente para flotacin de metales (Tan y Day, 1998; Marostica y Pastore, 2007) y para fabricacin de copolmeros funcionales (Yadav y Srivastava, 2002, 2004). El proceso comercial para su produccin se hace por hidratacin (en medio cido) de aceite de trementina para obtener el cis-hidrato de terpinol, que luego es deshidratado a terpineol. De esta forma est disponible a un bajo costo y un proceso microbiano debe asegurar altos rendimientos para ser competitivo con el proceso convencional. Una ventaja

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a favor del proceso biocataltico, es la posibilidad de generar -terpineol con alto exceso enantiomrico (Adams et al., 2003; Romn-Aguirre et al., 2005) Epxidos de limoneno

a)

O

b)

Figura 13. Estructura qumica de los xidos de limoneno: a) 1,2 b) 8,9

O

A partir del limoneno se pueden obtener dos epxidos (Fig. 13), el epxi-1,2-limoneno y el epxi-8,9-limoneno, los cuales se han encontrado naturalmente, en trazas, en algunas especies vegetales como Micromeria silicica (Duru et al., 2004) y Michelia alba (Shang et al., 2002), aunque tambin se han detectado en alimentos como mandarina y jengibre (Van der Werf et al., 2000). El epxido-8,9-limoneno por ser terminal puede ser transformado en el aldehdo, p-menten-9-al, el cul se usa en la industria de aromas y es reconocido como un aditivo alimentario seguro, GRAS. Debido a la reactividad del anillo epxido, son intermediarios de alto valor en la produccin de compuestos pticamente activos y en la resolucin cintica de mezclas racmicas. Los productos de hidrlisis de los epxidos, los dioles vecinales, tambin son compuestos con uso creciente (de Vries y Janssen, 2003). En estudios realizados por Van der Werf et al. (2000) se han logrado producir los epxidos (0,1 g/L) a partir de los dos enantimeros del limoneno empleando Xanthobacter sp. Aunque su obtencin se logra comnmente con catalizadores qumicos heterogneos (Cagnoli et al., 2005; Saikia et al., 2006), su produccin reportada por mtodos biolgicos es casi nula.

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1.3

Consideraciones finales

Adems de los compuestos mencionados, la gama de productos derivados del limoneno y -pineno es amplia ya que pueden ocurrir sobreoxidaciones o dihidroxilaciones que conllevan a la formacin de aldehdos, cidos, cetonas y dioles, los cuales tambin poseen diferentes aplicaciones en las reas alimenticia y farmacolgica. En la Universidad Industrial de Santander se han realizado trabajos anteriores de oxidacin de limoneno empleando como catalizadores complejos de cobalto con bases de Schiff (Crdenas y Paez, 1998), complejos de Fe y Mn encapsulados (Vargas et al., 1998) y zeolitas tipo Y (Blanco et al., 1998). Sin embargo, las transformaciones biocatalticas de monoterpenos solo se han iniciado recientemente a travs del Centro de Excelencia CENIVAM, que adems del presente trabajo, tiene en desarrollo otros similares como la biooxidacin de citronelol y la esterificacin de citronelol con cidos grasos empleando hongos filamentosos. En la Universidad de Antioquia (Grupo de Catlisis Ambiental) tambien existe investigacin activa en la oxidacin de terpenos empleando procesos limpios aunque no biocatalticos, haciendo uso de catalizadores como molibdatos de niquel (Gallego et al., 2007), y metaloftalocianinas soportadas en materiales mesoestructurados tipo MCM-41 (Ariza et al., 2007), trabajos orientados a la obtencin de epxidos de limoneno. El grupo de investigacin en Fitoqumica (GIFUJ) de la Pontificia Universidad Javeriana ha dedicado ya varios aos a la investigacin activa en biotransformaciones de compuestos terpenoides obtenidos de diferentes especies vegetales nativas empleando hongos filamentosos como catalizadores. Mundialmente, el inters que ha retomado el uso y aplicacin de terpenos en procesos de biotransformacin es tan fuerte en la actualidad que la publicacin Nature Chemical Biology (parte del Nature Publishing Group) en su edicin de Julio del 2007 presenta un

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enfoque especial en productos naturales, particularmente en terpenos. Segn esta publicacin, Las investigaciones en productos naturales han ganado recientemente ms importancia debido al incremento de la comprensin de su significado biolgico y al incremento del reconocimiento del origen y funcin de su diversidad estructural.Los productos naturales son tema central de investigacin en la interfase entre qumica y biologa. Aunque todos los productos naturales inspiran investigacin intelectual, una de las ms intrigantes clases de molculas son los terpenos. La coleccin de artculos en esta edicin especial demuestra que las investigaciones de productos naturales, en particular de terpenos, son muy prsperas. (Traduccin al espaol del Editorial de Nature Chemical Biology, 2007)

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2. METODOLOGA 2.1 Materiales 2.1.1 Reactivos

Los patrones y reactivos para sntesis empleados fueron R-(+)-limoneno (94 %), (1R)(+)--pineno (97 %) y -terpineol (98 %) obtenidos de Merck (Hohenbrunn, Alemania); (-)-alcohol perlico (98 %) y (R)-(-)-carvona (98 %) obtenidos de Sigma-Adrich (Steinheim, Suiza). Los solventes etanol (>99,9 %) y diclorometano (98 %) fueron obtenidos de Merck (Darmstadt, Alemania) y los gases de alta pureza empleados en cromatografa de AGA-Fano (Bucaramanga, Colombia). 2.1.2 Equipos

Para la ejecucin de procedimientos se emplearon los siguientes equipos: placa de calentamiento MR Hei-TEc marca Heidolph (Schwabach, Alemania), incubador ultravioleta SI-950 marca UVP (Cambridge, Reino Unido), agitador orbital Vibramax 100 marca Heidolph (Schwabach, Alemania), balanza analtica AB204-S marca Mettler-Toledo (Schwerzenbach, Suiza), centrfuga Rotofix 32 marca Hettich (Kirchlengern, Alemania), microcentrfuga 1-14 marca Sigma (Osterode, Alemania), autoclave de vapor No.25X marca All American (Hempstead, New York) y medidor de pH HI 223 marca Hanna Instruments (Cluj-Napoca, Rumania). 2.1.3 Medios de cultivo

Los medios de cultivo y nutrientes empleados fueron dextrosa (glucosa), extracto de levadura, extracto de malta, cloruro de sodio, peptona especial, extracto de malta-agar (MEA), papa-dextrosa-agar (PDA) obtenidos de Oxoid (Hampshire, Inglaterra) y Tween

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80 obtenido de Merck (Hohenbrunn, Alemania). Los medios se prepararon de la siguiente manera segn las recomendaciones de Oxoid y DSMZ (porcentajes en p/v): PDA (Potato Dextrose Agar - 0,4 % extracto de papa, 2,0 % glucosa, 1,5 % agar): 39 g de medio en polvo PDA (Oxoid) se diluyeron con agua destilada hasta completar 1 L. MEA (Malt Extract Agar - 3,0 % extracto de malta, 0,5 % peptona micolgica, 1,5 % agar): 50 g de medio en polvo MEA (Oxoid) se diluyeron con agua destilada hasta completar 1 L. YMPG (Yeast Malt Peptone Glucose): Se prepar un litro de solucin acuosa que contena 0,5 % extracto de levadura, 0,5 % extracto de malta, 0,5 % peptona bacteriolgica y 1,0 % glucosa. PDB (Potato Dextrose Broth): Se tomaron 200 g de papas peladas, cortadas en pequeos trozos, y se adicionaron a 1 L de agua destilada. Se llev a ebullicin durante una hora, se dej enfriar y se filtr. Con el lquido de filtrado se prepar el medio al 2 % de glucosa. SS (Spore Suspension): Se prepar una solucin acuosa estril que contenia NaCl (0,85 %) y Tween 80 (0,1 %), de la cual se tomaron 10 mL y se adicionaron en la superficie del A. niger esporulado, luego se transfirieron las esporas a la solucin frotando con esptula y se ajust la concentracin final a 107 esporas/mL empleando la tcnica de recuento en cmara de Neubauer. 2.1.4 Microorganismos

Se emple una cepa certificada de Aspergillus niger (DSM 821) obtenida de DSMZ GmbH-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Alemania). La cepa en forma liofilizada (Fig. 14) fue reactivada de acuerdo al protocolo recomendado por DSMZ en medio lquido de papa (PDB) y fue guardada a 5 C para su uso posterior.

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Figura 14. Microorganismos obtenidos de DSMZ

2.1.5

Otros materiales

Los bioensayos se realizaron en viales transparentes de 20 mL tipo headspace con tapa de encapsulado de aluminio y sello de PTFE/Silicona de 20 mm, marca Agilent (Santa Clara, USA). Para el almacenamiento de las muestras se emplearon viales mbar de 15 mL con tapa de rosca y sello de PTFE/Silicona, viales transparentes de 22 mL con tapa encapsulado y sello de PTFE/Silicona marca Supelco (Bellefonte, USA) y microtubos de 1,5 mL marca Brand (Wertheim, Alemania). Para la microextraccin se emple un Holder manual y un juego de fibras de 50/30 m, DVB/Carboxen/PDMS (StableFlex) marca Supelco (Bellefonte, USA) 2.2 Procedimientos 2.2.1 Biolgicos

Limpieza, desinfeccin y esterilizacin Todos los medios, excepto la suspensin de esporas, fueron esterilizados a 121 C (15 psi) durante 15 minutos antes de realizar los ensayos. El material de vidrio y plstico fue limpiado por inmersin en una solucin de Extrn al 5% durante 1 hora, enjuagado completamente con agua destilada y secado a 60 C durante 3 horas. El material de vidrio

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se someti a esterilizacin seca en horno a 160 C durante 3 horas y se guard en un lugar limpio hasta su uso. Las asas y agujas de inoculacin se esterilizaron antes y despus de cada aplicacin por exposicin directa a la llama hasta el rojo vivo. Las superficies de metal, cemento, loza o granito fueron desinfectadas por aplicacin de etanol comercial al 95% y/o solucin de hipoclorito de sodio a 5000 ppm. Los medios para desecho y el material contaminado fueron sometidos a esterilizacin por vapor a 121 C (15 psi) durante 40 minutos y sumergidos en solucin de hipoclorito de sodio a 5000 ppm durante una hora. Activacin , crecimiento y mantenimiento del hongo Para el crecimiento del A. niger DSM 821 se probaron los medios PDA y MEA, de los cuales se tomaron 25 mL en cajas de Petri, que fueron inoculados con la cepa (Fig. 15). Para su reactivacin, se abri la cabeza de la ampolla externa, calentando la punta directamente en la llama y quebrndola. Cuidadosamente se separ la punta de vidrio, removiendo el material aislante y retirando el vial interior. Se flame en llama la cabeza del vial y luego se adicion 1 mL del medio de cultivo PDB. Se dej rehidratar por 30 minutos y luego se agit el contenido, transfiriendo la mezcla a un tubo de ensayo con 10 mL de PDB. De este medio final se tomaron 100 L para preparar los cultivos definitivos en PDA y MEA. Una vez inoculado el hongo fue incubado a 30 C por 24 horas, luego a temperatura ambiente por 3 das y finalmente almacenado a 5 C. El hongo fue mantenido por subcultivos peridicos en MEA y PDA realizados cada 15 das. a) b)

Figura 15. Crecimiento del A. niger DSM 821 en medios a) MEA y b) PDA

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Curva de crecimiento y evolucin del pH Para realizar la curva de crecimiento y la medicin del pH, se tomaron muestras homogneas del medio con el hongo (5 mL) cada 24 horas durante 8 das. Cada muestra fue filtrada y lavada con 10 mL de agua destilada a 60 C, se determin el pH del filtrado y el residuo hmedo (biomasa) fue secado a 105 C por 24 h e introducido en el desecador durante 1 hora antes de realizar la medicin del peso seco. Todas las determinaciones se hicieron por duplicado. Biotransformacin General Los bioensayos a microescala se realizaron en 5 mL del medio de cultivo seleccionado y empleando viales tipo headspace de 20 mL que fueron inoculados con 20 L de la suspensin de esporas, SS (excepto cuando SS funcionaba como medio), y tapados con algodn/gasa. Los medios lquidos (Fig. 16) fueron sometidos a agitacin orbital (300 rpm) a temperatura ambiente. Los medios slidos (Fig. 17) en forma de slant se mantuvieron a temperatura ambiente en posicin horizontal. En diferentes estados de crecimiento del hongo (1-8 das) a cada vial se adicionaron 10 l de solucin del sustrato [R-(+)-limoneno, R-(+)--pineno, aceite esencial de naranja o aceite esencial de mandarina] al 40% en EtOH y se dej reaccionar durante el tiempo requerido. Una vez finalizadas las reacciones se efectu la extraccin de productos (lquido-lquido o SPME) y el anlisis por GC-FID/MS.

Figura 16. Ensayos de biotransformacin a microescala empleando medio lquido

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Figura 17. Ensayos de biotransformacin a microescala empleando medio slido

Ensayos iniciales: evaluacin del medio de cultivo y de la edad del hongo Se probaron dos medios lquidos (YMPG y SS) y un medio slido (PDA) en la oxidacin del limoneno y -pineno, empleando el procedimiento de biotransformacin general. El sustrato fue adicionado en diferentes estados de crecimiento (edad) del hongo. Una vez transcurrido el tiempo de reaccin que fue mantenido constante en todos los casos (8 das), se procedi a la extraccin (L-L) y anlisis de productos oxigenados empleando GC-FID. En la Tabla 1 se describen las condiciones experimentales.SUSTRATO -pineno YMPG YP1 YP2 YP3 YP4 YL1 YL2 YL3 YL4 MEDIO PDA PP1 PP2 PP3 PP4 PL1 PL2 PL3 PL4 SS SP1 SP2 SP3 SP4 SL1 SL2 SL3 SL4 Edad del hongo (das) 1 2 4 8 1 2 4 8

limoneno

Tabla 1. Ensayos de biotransformacin de limoneno y -pineno variando el medio de cultivo y la edad del hongo A. niger DSM 821 (parmetros fijos: 6 das de reaccin, extraccin L-L)

Evaluacin de la volatilidad de sustratos Se evalu la volatilizacin de los sustratos en los medios de reaccin YMPG y PDA usando viales con dos formas diferentes de cierre: tapones permeables de algodn y tapas hermticas de encapsulado de aluminio con sello de PTFE/Silicona. En estas determinaciones se emple

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el procedimiento general de biotransformacin pero sin inoculacin del hongo (incluyendo ensayos blancos, B). Una vez transcurridos 6 das luego de la aplicacin del sustrato, se realiz la extraccin (L-L) y el anlisis cuantitativo por GC-FID. Las condiciones experimentales se resumen en la Tabla 2.Experimento E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 B1 B2 Sustrato -pineno limoneno -pineno limoneno -pineno limoneno -pineno limoneno ----Medio YMPG YMPG PDA PDA YMPG YMPG PDA PDA PDA YMPG Tipo de cierre Tapn de algodn Tapn de algodn Tapn de algodn Tapn de algodn Sello PTFE/silicona Sello PTFE/silicona Sello PTFE/silicona Sello PTFE/silicona Sello PTFE/silicona Sello PTFE/silicona

--- No se adicion sustrato

Tabla 2. Ensayos para la evaluacin de la volatilidad de sustratos (limoneno y -pineno) empleando dos sistemas de cierre: tapn de algodn y sello PTFE/silicona (parmetros fijos: 6 das de contacto, extraccin L-L)

Ensayos en medios seleccionados a condiciones fijas: extraccin L-L y evaluacin de productos Para estos experimentos fueron seleccionados 2 medios diferentes, YMPG y PDA, con base en los ensayos iniciales de prueba. Adicionalmente se prob el medio PDB, similar al PDA pero en estado lquido. El A. niger DSM 821 fue usado como biocatalizador y se efectu el procedimiento general de biotransformacin. El sustrato fue adicionado al tercer da de edad del hongo e inmediatamente los frascos fueron cerrados hermticamente (sello PTFE/Silicona). Una vez transcurridos 6 das luego de aplicar el sustrato, se realiz la extraccin (L-L) y el anlisis de los productos empleando GC-FID/MS. Las condiciones experimentales se resumen en la Tabla 3, donde se han incluido diferentes blancos denominados TB. El tiempo de adicin del sustrato, el tipo de sello y el tiempo de reaccin fueron seleccionados de acuerdo a los resultados obtenidos en las fases anteriores de prueba y se explican en el captulo de anlisis de resultados.

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Experimento T1 T2 T3 T4 T5 T6 TB1 TB2 TB3--- No se adicion sustrato

Sustrato -pineno limoneno -pineno limoneno -pineno limoneno -------

Medio YMPG YMPG PDA PDA PDB PDB YMPG PDA PDB

Tabla 3. Ensayos de biotransformacin de limoneno y -pineno en medios seleccionados a condiciones fijas: A. niger DSM 821 (3 das de edad), 6 dias de reaccin, sello de PTFE/Silicona, extraccin L-L

Ensayos con aceites esenciales: extraccin SPME y evaluacin de productos Los experimentos con aceites esenciales se realizaron en medio YMPG, con el fin de lograr la produccin de alcohol perlico. El A. niger DSM 821 fue usado como biocatalizador y se efectu el procedimiento general de biotransformacin empleando como sustratos los aceites esenciales de naranja y mandarina. El sustrato fue adicionado al tercer da de edad del hongo e inmediatamente los frascos fueron cerrados hermticamente (sello PTFE/Silicona). Una vez transcurridos 6 das luego de aplicar el sustrato, se realiz la extraccin (SPME) y el anlisis de los productos empleando GC-FID, bajo las condiciones optimizadas descritas. Las condiciones experimentales se muestran en la Tabla 4, donde se han incluido diferentes blancos denominados AB. El tiempo de adicin del sustrato, el tipo de sello y el tiempo de reaccin fueron seleccionados de acuerdo a los resultados obtenidos en las fases anteriores de prueba y se explican en el captulo de anlisis de resultados.

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Experimento AE1 AE2 AB1 AB2 AB3 AB4

Catalizador Si Si Si -------

Aceite esencial( sustrato) Mandarina Naranja -- (Etanol como solvente) Mandarina Naranja ---

--- No se adicion sustrato, reactivo o catalizador

Tabla 4. Ensayos de biotransformacin empleando aceites esenciales de mandarina y naranja como sustratos. A. niger DSM 821 (3 das de edad), medio YMPG, 6 das de reaccin, sello de PTFE/Silicona, extraccin HS-SPME

2.2.2

Analticos e instrumentales

Condiciones Los anlisis GC-FID se realizaron en un cromatgrafo de gases HP 6890 Series (Paloalto, CA, USA) usando una columna con fase estacionaria de polietilenglicol, HP-INNOWAX (30 m x 0,32 mm dimetro interno x 0,25 m grosor de pelcula). Las condiciones cromatogrficas del horno fueron las siguientes: temperatura mantenida a 80 C durante 2 min luego de la inyeccin e incrementada a una velocidad de 15 C/min hasta 230 C y mantenida durante 5 min a 230 C. La relacin de split fue 1:30, el inyector fue mantenido a 250 C y el detector a 250 C. La identificacin de componentes se realiz comparando los tiempos de retencin obtenidos de los patrones disponibles analizados bajo las mismas condiciones cromatogrficas. Los anlisis GC-MS fueron realizados en un cromatgrafo de gases modelo Agilent 6890N (Paloalto, CA, USA). Para la separacin de los analitos se emple una columna capilar de slice fundida DB-WAX (60 m x 0,25 mm dimetro interno x 0,25 m grosor de pelcula). La programacin de temperatura fue desde 45 C mantenidos por 10 min, con velocidad de calentamiento de 3 C /min hasta 220 C y mantenida por 30 min a 220 C. Se emple

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un detector selectivo de masas modelo Agilent 5975C (Paloalto, CA, USA) con sistema de ionizacin por impacto de electrones (70 eV) y analizador de masas cuadrupolar operado en modo de barrido completo desde 40 hasta 400 Dalton (m/z). La relacin de split fue de 1:13 y se us un inyector automtico modelo HP 7683 Series. La identificacin de componentes se realiz empleando el sistema de datos HP Enhanced Chemstation G1701BA y comparando los espectros de masas de los productos con aquellos contenidos en las bases de datos espectrales NBS 75K, NIST 05 y WILEY 138. Preparacin de patrones, calibracin y validacin del mtodo Para los anlisis GC-FID/MS (extraccin L-L) se prepararon soluciones stock de R-(+)limoneno, R-(+)--pineno y alcohol perlico en diclorometano, con concentracin de 84000 ppm cada una. A partir de cada stock se prepararon cuatro soluciones patrn de diferentes concentraciones para el R-(+)--pineno (172, 430, 860 y 1720 ppm), para el R-(+)limoneno (168, 420, 840 y 1680 ppm) y para el alcohol perlico (840, 1680, 4200 y 8400 ppm), las cuales se emplearon para realizar cada curva de calibracin, inyectando 1 L bajo las condiciones descritas de anlisis. Para el anlisis por SPME-GC-FID se emple el medio YMPG como matriz y se utilizaron cuatro soluciones patrn de concentraciones 0,84 ; 1,68; 4,21 y 8,41 ppm de limoneno en el medio de cultivo. La extraccin se realiz bajo las condiciones descritas para SPME. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.

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Los lmites de deteccin (LOD) y cuantificacin (LOQ) se calcularon con base en los parmetros de la regresin lineal empleando la metodologa RMSE, recomendada por la US EPA (Corley, 2003) y expresados en unidades de concentracin definidos como: LOD = (3*RMSE)/ m LOQ = (10*RMSE)/ m Para el anlisis de regresin lineal se us el programa estadstico Statgraphics Centurin XV y las curvas de calibracin se definieron segn la ecuacin, X = m*C + b, donde, X: rea del pico, m: pendiente calculada, C: concentracin del patrn en ppm, b: constante calculada. El RSME fue calculado segn la definicin:

RMSE =

Donde n: numero de patrones, E: error de cada medicin Para cada anlisis fueron obtenidos tres datos de reas y tiempos de retencin con los cuales se analiz la precisin (repetibilidad) de la respuesta con base en la desviacin estndar relativa expresada como porcentaje (RSD%). componente de acuerdo con las siguientes relaciones: La cuantificacin se hizo empleando las curvas de calibracin obtenidas y usando los factores de respuesta de cada

Am Cm = fr

Ap fr = Cp