GARDENIA MARTINS DE SOUSA PRODUÇÃO E ... -...
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GARDENIA MARTINS DE SOUSA PRODUÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOLÓGICO DOS ENANTIÔMEROS DE α-TERPINEOL CAMPINAS 2018 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
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GARDENIA MARTINS DE SOUSA
PRODUÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOLÓGICO DOS ENANTIÔMEROS DE
α-TERPINEOL
CAMPINAS
2018
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
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GARDENIA MARTINS DE SOUSA
PRODUÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOLÓGICO DOS ENANTIÔMEROS DE
α-TERPINEOL
Orientador: Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas
CAMPINAS
2018
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia
de Alimentos da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos exigidos
para obtenção do título de Doutora em
Ciência de Alimentos
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA
GARDENIA MARTINS DE SOUSA E ORIENTADA
PELO PROF. DR. JULIANO LEMOS BICAS
3
4
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________
Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas
Orientador – FEA/UNICAMP
______________________________________________________
Dra. Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz
Membro Titular – FCF/UNICAMP
______________________________________________________
Profa. Dra. Elisa de Almeida Jackix
Membro Titular – PUC-Campinas
______________________________________________________
Dra. Jane Cristina de Souza
Membro Titular – IB/UNICAMP
______________________________________________________
Profa. Dra. Semíramis Martins Álvares Domene
Membro Titular – UNIFESP
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida
acadêmica do aluno.
5
Dedico esse trabalho aos meus pais,
Maurílio e Aldina, e minhas irmãs, Kamila e
Letícia, que sempre me envolveram de amor
e coragem, e que mesmo longe sempre me
incentivaram com sua torcida e confiança...
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AGRADECIMENTOS
A Deus e a Nossa Senhora Aparecida, por estarem sempre comigo, abrindo portas
e dando-me força, saúde, fé e inspiração para seguir em busca de meus sonhos, e também
pelos obstáculos que me fizeram crescer. Porque concluo esta etapa importante da minha vida
e por me amar.
Aos meus maravilhosos pais, Maurílio e Aldina, pelo amor, apoio, incentivo e
orações. Por aceitarem que eu escolhesse meu caminho, me apoiando e acreditando na minha
capacidade. Amo vocês!
Às minhas queridas irmãs, Kamila e Letícia, pelo carinho, amizade e todo o apoio
dispensado, principalmente nos momentos mais difíceis;
Ao Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas pela oportunidade e orientação deste trabalho,
sua enorme paciência, competência, dedicação e ensinamentos a mim e aos demais colegas;
Aos colegas e funcionários dos laboratórios de Bioaromas e de Biotecnologia,
Nadir, Angélica, Dora, Tatiana, Adones, Leonardo, Gustavo, Henrique, Ana Paula e Bruno,
pelo companheirismo, amizade e auxílio na condução dos experimentos.
Ao Departamento de Alimentação e Nutrição (DEPAN/UNICAMP), pela parceria
e realização dos ensaios biológicos. Agradeço especialmente ao Prof. Dr. Mário Roberto
Maróstica Junior e à Profa. Dra. Cinthia Baú Betim Cazarin pela acolhida, apoio e
ensinamentos que tanto contribuíram para a realização deste trabalho.
À Maria Susana Corrêa Cunha, do Laboratório de Ensaios Biológicos
(LEB/FEA/UNICAMP), na execução dos ensaios biológicos, pela amizade e momentos de
alegria proporcionados.
À Dra. Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz (CPQBA/UNICAMP), pelo auxílio nos
ensaios antiproliferativos.
À Universidade Estadual de Campinas, à Faculdade de Engenharia de Alimentos
e, em especial, ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos, pela acolhida e
oportunidade de realizar meu doutorado e poder concluir mais uma meta.
A todos os professores do Departamento de Ciência de Alimentos
(DCA/UNICAMP) pela dedicação, empenho e conhecimentos transmitidos.
Aos funcionários do Departamento de Ciência de Alimentos pela convivência e
prestabilidade.
Aos amigos e familiares, ainda que longe, sempre tão perto e unidos, nunca
deixaram de me apoiar e confiar em mim;
7
À Comunidade Santa Teresinha do Menino Jesus (OCDS) e às monjas do
Carmelo de Campinas pela acolhida, amizade e orações. Uma bela família que ganhei! Em
especial, agradeço à Lygia Therezinha de Araújo Linardi pela acolhida em sua casa, em
minha mudança para Campinas, e pela amizade.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pelo apoio financeiro, e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela concessão da bolsa de pós-graduação.
Aos membros da banca examinadora por, gentilmente, aceitarem o convite,
cedendo tempo e conhecimento em favor deste trabalho;
A todos que colaboraram direta ou indiretamente para que essa tese acontecesse,
desde o início, e que torceram por mim. Muito obrigada!
8
“Sei que sou sustentada e aqui está a minha tranquilidade e segurança; não a segurança
sábia do homem que está num terreno seguro com as próprias forças, mas a doce e feliz
segurança da criança sustentada por um braço forte...”
(Edith Stein)
9
RESUMO
Aromas naturais que apresentam grande importância comercial e ampla gama de atividades
biológicas têm despertado a atenção dos pesquisadores. O α-terpineol é um monoterpenóide
encontrado em vários óleos essenciais, sendo um dos mais utilizados na indústria de
alimentos, cosméticos e em produtos de limpeza, e apresenta propriedades biológicas bastante
promissoras. Este trabalho de doutorado teve como objetivos produzir, por biotransformação,
os enantiômeros R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol, a partir do limoneno, utilizando a
linhagem Sphingobium sp., e avaliar as diferenças em termos de efeitos biológicos destes
enantiômeros. Para a biotransformação foram utilizadas, na proporção de 3:1, biomassa
congelada e óleo de soja contendo R-(+)-limoneno ou S-(‒)-limoneno (350 g.L-1
). Os frascos
foram incubados a 28°C e 200 rpm por 72 horas, para produção de R-(+)-α-terpineol, ou 120
horas, para produção de (-)-α-terpineol. A produção de R-(+)-α-terpineol chegou a 151,0 g.L-1
e a de S-(-)-α-terpineol chegou a 91,0 g.L-1
, e com pureza enantiomérica superior ao dos
padrões comerciais. O α-terpineol foi isolado do óleo resultante da biotransformação por
cromatografia em coluna de vidro, contendo sílica gel como fase estacionária e mistura de
hexano: acetato de etila (9:1) como fase móvel. Na sequência, o seu potencial biológico foi
testado em 48 ratos Sprague-Dawley, durante 12 semanas experimentais. Nas cinco semanas
iniciais, os animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos experimentais: controle
magro (AIN; n=6), que recebeu dieta padrão, e grupo hiperlipídico (n=42), que recebeu dieta
hiperlipídica para o desenvolvimento da obesidade e indução da inflamação. Após este
período, o grupo hiperlipídico foi subdividido em sete grupos (n=6): controle hiperlipídico
(HF), e grupos hiperlipídicos suplementados de 25, 50 e 100 mg.kg-1
de R-(+)-α-terpineol ou
(-)-α-terpineol, e mantidos por mais 6 semanas. Durante este período foram avaliados o peso
corporal, consumo alimentar, testes de tolerância à glicose e resistência à insulina. Após a
exsanguinação dos animais, sob anestesia, amostras de sangue foram coletadas para análises
bioquímicas e alíquotas de tecido hepático foram encaminhadas para análise histológica. Os
animais do grupo HF apresentaram maior consumo de dieta e ganho de massa corporal,
associados à maior resistência à insulina, elevação dos níveis séricos das aminotransferases
AST e ALT e maior acúmulo de gordura hepática. TBARS, ALT e citocinas TNF-α e IL-1β
foram positivamente modulados pela suplementação com os enantiômeros de α-terpineol. Os
melhores resultados de TBARS no soro e sensibilidade à insulina foram observados nos
animais que consumiram α-terpineol em concentrações superiores a 50 mg.kg-1
de dieta. O
tratamento com os enantiômeros de α-terpineol reduziu o acúmulo de gordura hepática. A
10
propriedade antiproliferativa in vitro dos enantiômeros de α-terpineol foi avaliada em células
tumorais. Os resultados foram semelhantes para ambos os enantiômeros, destacando o efeito
citostático para as linhagens U251 (glioma), K562 (leucemia), PC-3 (próstata) e MCF7
(mama). Os resultados deste estudo indicam que a ingestão dos enantiômeros de α-terpineol
pode influenciar, de maneira positiva, na inibição do crescimento das células tumorais, e em
parâmetros como dano oxidativo, resistência à insulina, citocinas pró-inflamatórias e esteatose
hepática, relacionados com a obesidade induzida por dieta hiperlipídica.
Palavras chave: α-terpineol, biotransformação, limoneno, Sphingobium sp., aromas naturais,
atividade biológica, obesidade.
11
ABSTRACT
Natural flavors that present great commercial importance and wide range of biological
activities have attracted attention of researchers. α-terpineol is a monoterpenoid found in
many essential oils, being one the most used in food and cosmetic industries and cleaning
products, and presents promising biological properties. This work aimed to produce, by
biotransformation, R-(+)-α-terpineol and (-)-α-terpineol enantiomers from limonene using the
strain Sphingobium sp. and to evaluate the differences in biological effects of these
enantiomers. For biotransformation, frozen biomass and soybean oil containing R-(+)-
limonene or S-(-)-limonene (350 g.L-1
), in the proportion of 3:1, were used. Flasks were
incubated at 28° C and 200 rpm for 72 hours for R-(+)-α-terpineol production, or 120 hours
for (-)-α-terpineol production. R-(+)-α-terpineol production reached 151.0 g. L-1
and 91.0 g.L-
1 for S-(-)-α-terpineol and with higher enantiomeric excess than commercial standards. The α-
terpineol was isolated from resulting oil of biotransformation by glass column
chromatography containing silica gel as stationary phase and ethyl hexane: ethyl acetate (9:1)
mixture as the mobile phase. Subsequently, its biological potential was tested in 48 Sprague-
Dawley rats for 12 experimental weeks. In the first five weeks, the animals were randomly
divided in two experimental groups: normolipidic control (AIN; n=6), who received a
standard diet and the hyperlipidemic group (n=42) who received a high-fat diet for the obesity
development and inflammation induction. After this period, the hyperlipidemic group was
subdivided into seven groups (n=6): hyperlipidemic control (HF), and supplemented
hyperlipidic groups of 25, 50 and 100 mg.kg-1
diet of R-(+)-α-terpineol or (-)-α-terpineol and
maintained for another 6 weeks. During this period, the body weight and diet intake, glucose
tolerance and insulin resistance tests were evaluated. After exsanguination of the animals, in
anesthesia, blood samples were collected for biochemical analyzes and liver tissue aliquots
were sent for histological analysis. Rats of HF group had higher dietary intake and body mass
gain, associated with higher insulin resistance, elevated serum levels of AST and ALT
aminotransferases, and greater accumulation of liver fat. TBARS, ALT, TNF-α and IL-1β
cytokines were positively modulated by supplementation with α-terpineol enantiomers. The
best results of serum TBARS and insulin sensitivity were observed in animals that consumed
α-terpineol at concentrations higher than 50 mg.kg-1
diet. α-terpineol enantiomers treatments
reduced the accumulation of hepatic fat. The in vitro antiproliferative property of α-terpineol
enantiomers was evaluated in tumor cells. Results were similar in both enantiomers,
highlighting cytostatic effect for the strains U251 (glioma), K562 (leukemia), PC-3 (prostate)
12
and MCF7 (breast). These results indicate that ingestion of α-terpineol enantiomers may
positively influence tumor cell growth inhibition, and in parameters such as oxidative
damage, insulin resistance, proinflammatory cytokines and hepatic steatosis, related diet-
induced obesity.
Keywords: α-terpineol, biotransformation, limonene, Sphingobium sp., natural flavors,
biological activity, obesity.
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação da formação estrutural do limoneno.............................. 29
Figura 2. Subdivisão dos isômeros........................................................................ 32
Figura 3. Diagrama esquemático da interação de moléculas quirais com
enzimas receptoras. Teoria dos três pontos............................................ 33
Figura 4. Estruturas enantioméricas do limoneno................................................. 35
Figura 5. Estruturas enantioméricas do α-terpineol............................................... 36
Figura 6. Principais rotas envolvidas na biotransformação do limoneno.............. 38
Figura 7. Ratos Sprague-Dawley mantidos em gaiolas individuais em sala, sob
condições ambientais controladas..........................................................
53
Figura 8. Representação gráfica da distribuição das amostras na placa de 96
compartimentos utilizada no teste de atividade antiproliferativa in
vitro........................................................................................................
62
Figura 9. Curvas de separação de R-(+)-limoneno e R-(+)-α-terpineol (A), e S-
(–)-limoneno (–)-α-terpineol (B) do óleo resultante da
biotransformação do limoneno, obtidas por cromatografia em coluna
de vidro contendo sílica gel e eluida com hexano e acetato de etila
(9:1)........................................................................................................
66
Figura 10. Consumo alimentar (A) e ingestão calórica semanal dos animais
(B)..........................................................................................................
68
Figura 11. Ingestão semanal de α-terpineol, em relação ao peso corporal dos
animais...................................................................................................
69
Figura 12. Evolução semanal do peso corporal de ratos Sprague Dawley
submetidos a diferentes tratamentos durante 12 semanas
experimentais (A) e ganho total de peso dos animais (B)......................
70
Figura 13. Peso relativo do coração (A), fígado (B), rins (C), baço (D), ceco
intestinal (E), tecido adiposo marrom (F), tecido adiposo epididimal
(G), corrigido em relação ao peso corporal total dos animais...............
72
Figura 14. Teste de tolerância à glicose. Curva de controle da glicemia durante
120 minutos (A), em µM de glicose, após injeção de solução de
glicose e área sob a curva da glicemia durante o GTT (B)....................
74
Figura 15. Índice de decaimento da glicose, KITT, calculada a partir das
glicemias coletadas no teste de tolerância à insulina.............................
75
Figura 16. Níveis séricos de Colesterol total (A), Colesterol LDL (B) e
Triglicerídeos (C) de ratos Sprague-Dawley.........................................
76
Figura 17. Níveis séricos da alanina aminotransferase (A) e aspartato
aminotransferase (B), em ratos Sprague-Dawley que receberam dieta
normolipídica, hiperlipídica e hiperlipídica suplementadas com
enantiômeros de α-terpineol...................................................................
78
Figura 18. Níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em
soro (A) e homogenato hepático (B) de ratos Sprague-Dawley que
14
receberam dietas normolipídica e hiperlipídica e dieta hiperlipídica
suplementados com R-(+) e (–)-α-terpineol...........................................
79
Figura 19. Efeitos dos enantiômeros de α-terpineol nos níveis das citocinas pro-
inflamatórias TNF-α (A) e IL-1β (B) dos diferentes grupos
experimentais.........................................................................................
81
Figura 20. Análise histológica do fígado: AIN (A); HF (B); S25 (C); S50 (D);
S100 (E); R25 (F); R50 (G); R100 (H). Setas pretas: sinusóides; setas
amarelas: gotículas lipídicas. As seções histológicas foram coradas
com hematoxilina e eosina. Aumento de 40X.......................................
83
Figura 21. Efeito antiproliferativo da Doxorrubina frente um painel de células
humanas, após 48 horas de exposição. Linhagens tumorais: Glioma
(U251), Mama (MCF-7), Ovário com fenótipo resistência multidroga
(NCI-ADR/RES), Rim (786-0), Pulmão (NCI-H460), Próstata (PC-
3), Ovário (OVCAR-3), Cólon (HT-29), Melanoma (UACC-62) e
Leucemia (K562). Linhagem não tumoral: Queratinócitos
imortalizados (HaCaT)...........................................................................
85
Figura 22. Efeito antiproliferativo de S-(-)-limoneno (A) e R-(+)-limoneno (B)
frente um painel de células humanas, após 48 horas de exposição.
Linhagens tumorais: Glioma (U251), Mama (MCF-7), Ovário com
fenótipo resistência multidroga (NCI-ADR/RES), Rim (786-0),
Pulmão (NCI-H460), Próstata (PC-3), Ovário (OVCAR-3), Cólon
(HT-29), Melanoma (UACC-62) e Leucemia (K562). Linhagem não
tumoral: Queratinócitos imortalizados (HaCaT)....................................
86
Figura 23. Efeito antiproliferativo de (-)-α-terpineol (A) e R-(+)-α-terpineol (B)
frente um painel de células humanas, após 48 horas de exposição.
Linhagens tumorais: Glioma (U251), Mama (MCF-7), Ovário com
fenótipo resistência multidroga (NCI-ADR/RES), Rim (786-0),
Pulmão (NCI-H460), Próstata (PC-3), Ovário (OVCAR-3), Cólon
(HT-29), Melanoma (UACC-62) e Leucemia (K562). Linhagem não
tumoral: Queratinócitos imortalizados (HaCaT)....................................
88
15
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classificação dos terpenos, com base no número de subunidades de
isopreno..................................................................................................
30
Tabela 2. Principais constituintes de alguns óleos vegetais................................... 31
Tabela 3. Composição das dietas (g. kg-1
de dieta)................................................ 55
Tabela 4. Composição centesimal das dietas (g. 100g-1
)...................................... 56
Tabela 5. Descrição dos grupos experimentais...................................................... 57
Tabela 6. Linhagens celulares utilizadas nos estudos in vitro............................... 61
Tabela 7. Tempo de retenção e concentrações de produtos após 72 horas (no
caso do R-(+)-limoneno) e 120 horas (no caso do S-(–)-limoneno) de
biotransformação dos enantiômeros do limoneno.................................
64
Tabela 8. Valores de GI50 (μg. mL-1
) após o tratamento com R-(+)-α-terpineol e
S-(-)-α-terpineol frente às linhagens tumorais e não tumorais no
ensaio antiproliferativo .........................................................................
89
Tabela 9. Valores de TGI (μg. mL-1
) após o tratamento com R-(+)-limoneno, S-
(-)-limoneno, R-(+)-α-terpineol e S-(-)-α-terpineol frente às linhagens
tumorais e não tumorais no ensaio antiproliferativo..............................
89
Tabela 10. Resultados de consumo alimentar (g. dia-1
) dos ratos Sprague-Dawley
alimentados com diferentes dietas.........................................................
121
Tabela 11. Ingestão calórica (kcal. dia-1
) dos ratos Sprague Dawley alimentados
com diferentes dietas..............................................................................
122
Tabela 12. Ingestão semanal (mg. kgpc-1
) dos enantiômeros de -terpineol, em
relação ao peso corporal dos animais.....................................................
123
Tabela 13. Peso corporal médio (g) de ratos Sprague Dawley para os diferentes
tratamentos, durante 12 semanas experimentais....................................
124
Tabela 14. Peso bruto (g) dos orgãos extraídos dos ratos Sprague-
Dawley...................................................................................................
125
Tabela 15. Peso relativo dos órgãos (g. 100 g-1
), corrigido em relação ao peso
corporal total..........................................................................................
126
Tabela 16. Resultados dos testes de tolerância à glicose e insulina (GTT e KITT)
dos animais dos diferentes grupos estudados.........................................
127
Tabela 17. Efeito das diferentes concentrações dos enantiômeros de -terpineol
(25, 50 e 100 mg. kg-1) nas dietas sobre os parâmetros bioquímicos e
níveis de citocinas TNF-α e IL-1β nos diferentes grupos de ratos
Sprague Dawley estudados....................................................................
128
16
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
AIN American Institute of Nutrition
AOAC Association of Official Analytical Chemists
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
DMSO Dimetilsulfóxido
ERO Espécies reativas de oxigênio
GC-FID Gas Chromatography - Flame Ionization Detector (Cromatógrafo a gás com
detector de ionização de chama)
GTT Glucose tolerance test (Teste de tolerância à glicose)
HF High-fat
IL-1β Interleucina 1β
IL-6 Interleucina 6
IMC Índice de massa corporal
ITT Insuline tolerance test (Teste de tolerância à insulina)
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
MBC Minimum bactericidal concentration (Mínima concentração bactericida)
MDA Malonaldeído
MIC Minimum inhibitory concentration (Mínima concentração inibitória)
NOAEL No Observed Adverse Effect Level
NF-κB Nuclear Factor-Kappa B
PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1 (Fator ativador de plasminogênio-1)
PPARs Peroxisome proliferator-activated receptor (Receptores ativados por
proliferadores de peroxissoma)
RI Resistência à insulina
SFB Soro fetal bovino
SRB Sulforrodamina B
TBARS Thiobarbituric acid reactive substances (substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico)
TGI Total Growth Inhibition
TNF-α Tumor necrosis factor-alpha (Fator de necrose tumoral-alfa)
WHO World Health Organization (Organização Mundial de Saúde)
YM Yeast Mold (Agar)
17
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................... 19
2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 22
2.1. OBJETIVO GERAL .......................................................................................................... 22
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................ 22
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................... 23
3.1. AROMAS .......................................................................................................................... 23
3.2. OBTENÇÃO DE COMPOSTOS DE AROMAS NATURAIS POR VIA
BIOTECNOLÓGICA ............................................................................................................... 25
3.3. COMPOSTOS TERPÊNICOS .......................................................................................... 28
3.3.1. Definição geral .............................................................................................................. 28
3.3.2. Importância da estereoisomeria no estudo de compostos terpênicos ...................... 31
3.3.3. Limoneno ....................................................................................................................... 34
3.3.4. α-terpineol ..................................................................................................................... 36
3.4. BIOTRANSFORMAÇÃO DE LIMONENO EM α-TERPINEOL ................................... 37
3.5. OBESIDADE .................................................................................................................... 40
3.5.1. Obesidade: uma epidemia mundial ............................................................................ 40
3.5.2. Obesidade e inflamação ............................................................................................... 41
3.5.3. Modelos experimentais de obesidade induzida por dieta hiperlipídica ................... 44
3.6. POTENCIAL BIOLÓGICO DO α-TERPINEOL ............................................................. 46
4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 50
4.1. PRODUÇÃO DE R-(+)-α-TERPINEOL E (-)-α-TERPINEOL POR
BIOTRANSFORMAÇÃO ....................................................................................................... 50
4.1.1. Micro-organismos e reagentes ..................................................................................... 50
4.1.2. Preparo da pré-cultura ................................................................................................ 50
4.1.3. Produção do biocatalisador ......................................................................................... 51
4.1.4. Procedimentos de biotransformação em sistema bifásico ........................................ 51
4.1.5. Purificação dos produtos da biotransformação ......................................................... 52
4.2. ENSAIO BIOLÓGICO ..................................................................................................... 53
4.2.1. Animais .......................................................................................................................... 53
4.2.2. Dietas ............................................................................................................................. 54
4.2.3. Procedimento experimental ......................................................................................... 57
4.2.4. Ganho de peso e consumo alimentar .......................................................................... 58
4.2.5. Testes de tolerância à glicose e à insulina ................................................................... 58
18
4.2.6. Parâmetros bioquímicos............................................................................................... 59
4.2.7. Peroxidação lipídica (TBARS) .................................................................................... 59
4.2.8. Análise histológica em tecido hepático........................................................................ 60
4.2.9. Análise estatística ......................................................................................................... 60
4.3. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA IN VITRO DE R-(+)-α-
TERPINEOL E (-)-α-TERPINEOL ......................................................................................... 60
4.3.1. Preparo das suspensões celulares e aplicação das amostras ..................................... 60
4.3.2. Análise dos resultados .................................................................................................. 62
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 64
5.1. PRODUÇÃO DE R-(+)-α-TERPINEOL E (-)-α-TERPINEOL POR
BIOTRANSFORMAÇÃO ....................................................................................................... 64
5.2. AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DOS ANIMAIS ................................................................. 67
5.2.1. Consumo alimentar dos animais ................................................................................. 67
5.2.2. Peso corporal dos animais ............................................................................................ 70
5.2.3. Pesos dos tecidos ........................................................................................................... 71
5.2.4. Testes de tolerância à glicose e sensibilidade à insulina ............................................ 73
5.2.5. Análises bioquímicas .................................................................................................... 75
5.2.6. Peroxidação lipídica (TBARS) .................................................................................... 79
5.2.7. Determinação dos níveis de citocinas TNF-α e IL-1β ................................................ 80
5.2.8. Análise histológica ........................................................................................................ 82
5.3. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA EM CULTURA DE
CÉLULAS ................................................................................................................................ 84
CONCLUSÃO GERAL ......................................................................................................... 91
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 93
APÊNDICE ........................................................................................................................... 121
ANEXO .................................................................................................................................. 129
19
1. INTRODUÇÃO GERAL
O aroma é um dos mais importantes atributos sensoriais dos alimentos, bebidas e
cosméticos. Correlaciona-se diretamente com o sabor e tem grande influência na seleção,
aceitação e ingestão dos produtos pelo consumidor (FISHER; SCOTT, 1997; WRIGHT,
2010). Ampla variedade de compostos orgânicos está associada ao aroma, compreendendo
compostos voláteis (individuais ou em misturas complexas em diferentes proporções) de
inúmeras classes químicas, como aldeídos, alcoóis, ésteres, ácidos carboxílicos de cadeia
curta, compostos fenólicos e de enxofre, cetonas e lactonas. Estes compostos podem ser
obtidos por meio de extrações de recursos naturais, e também podem ser produzidos por via
química ou biotecnológica (LONGO; SANRÓMAN, 2006; D’ACAMPORA ZELLNER et
al., 2008; BICAS; DIONÍSIO; PASTORE, 2009; WRIGHT, 2010).
O setor de aromas e fragrâncias, em suas diversas aplicações, representa não
somente um mercado global multibilionário, mas também uma fonte de desenvolvimento
científico e de inovação constante. No ano de 2017, a indústria de aromas e fragrâncias rendeu
um montante estimado de 26,3 bilhões de dólares (LEFFINWELL AND ASSOCIATES,
2017). Atualmente, o mercado de aromas é dominado por aromas artificiais;
aproximadamente 80% dos aromas e fragrâncias são produzidos sinteticamente. No entanto,
devido à alta demanda e maior conscientização do consumidor por produtos com apelo de
saudabilidade, tem-se percebido uma tendência crescente ao uso de aromas naturais
(SPEZIALI, 2012; ANDRADE et al., 2013). Nesse contexto, a biotecnologia se mostra como
uma das maiores tendências da indústria em produzir ingredientes naturais para substituir
aqueles que são utilizados em forma sintética (DHILLON; KAUR; BRAR, 2013).
Os compostos de aroma podem ser produzidos por via biotecnológica a partir de
substratos de baixo custo. A utilização de subprodutos agroindustriais com alto teor desses
substratos como, por exemplo, materiais ricos em monoterpenos, são de grande interesse na
biotecnologia de produção de aromas. Assim, vários pesquisadores vêm estudando o
aproveitamento de subprodutos da indústria de alimentos, pois além de contribuírem com a
diminuição de impactos ambientais, estes subprodutos podem gerar renda colaborando com a
economia do país e sendo promissor pra a obtenção de insumos de alto valor agregado, como
compostos de aroma e fármacos (COELHO; VIANA; AZEVEDO, 2014; CAO et al., 2015).
O limoneno, monoterpeno mais abundante na natureza, é o constituinte
majoritário de óleos essenciais de laranja e limão, sendo encontrado nos subprodutos
industriais do processamento de frutas cítricas e tem sido utilizado como precursor para a
20
produção biotecnológica de monoterpenóides bioativos e de maior valor agregado, como α-
terpineol, carvona e álcool perílico (DUETZ et al., 2003; VAN BEILEN et al., 2005;
BADEE; HELMY; MORSY, 2010; MARMULLA; HARDER, 2014). O limoneno se
apresenta quimicamente como dois enantiômeros, sendo que o R-(+)-limoneno é o mais
abundante no óleo da casca da laranja (até 90%) enquanto que o isômero S-(-) é encontrado
em óleos da casca de limão e nas espécies Mentha e coníferas, em baixas concentrações
(BAUER; GARBE; SURBURG, 2001; RESENDE; AMAURO; RODRIGUES FILHO,
2016).
Mais de 60 mil toneladas de R-(+)-limoneno são recuperadas ao ano como
subproduto da indústria cítrica mundial. A disponibilidade de grandes quantidades de
limoneno e o seu baixo custo (US$ 5–7/kg) tem despertado o interesse dos pesquisadores e da
indústria. Além disso, o fato de alguns compostos medicinais e de aroma possuírem fórmulas
estruturais semelhantes ao limoneno, há um indicativo do grande potencial de utilização
industrial desse produto subaproveitado (CARVALHO; FONSECA, 2006; LAWRENCE,
2009; LANGE, 2015; ALICEWEB, 2016).
Um interessante produto da biotransformação do limoneno é o α-terpineol. Este
monoterpenóide possui duas formas enantioméricas: R-(+)-α-terpineol, de aroma floral
intenso, e S-(-)-α-terpineol, presente na espécie Pinus palustris Mill., que possui um odor
caracteristicamente conífero. A bioconversão do limoneno para α-terpineol tem sido descrita,
utilizando ampla variedade de fungos oriundos de diversas fontes como, por exemplo, solo,
resíduos agroindustriais, frutos exóticos, sementes, como biocatalisadores (BICAS;
DIONÍSIO; PASTORE, 2009; MOLINA et al., 2013; ABRAHÃO; MOLINA; PASTORE,
2013). O processo biotecnológico de produção apresenta a vantagem de ser regido por reações
enzimáticas, as quais se diferenciam da síntese química por serem enantio e regioespecíficas
(RUIZ, FLOTATZ, 2014; LANGE, 2015).
O apelo comercial dos produtos biotecnológicos é um fator que influencia as
pesquisas, uma vez que esses produtos são considerados naturais e tem-se comprovado que
muitos deles apresentam atividades biológicas relevantes. Além de suas propriedades relativas
a aromas e fragrâncias, α-terpineol vem sendo reconhecido por suas propriedades funcionais
(BICAS et al., 2011). A comprovação do α-terpineol como possível composto biologicamente
ativo gera novas possibilidades para sua utilização, em alimentos e bebidas, uma vez que a
comprovação da atividade biológica dessas substâncias adere à demanda do mercado
consumidor por produtos que possuam papel na prevenção de doenças. Estudos revelam que o
α-terpineol apresenta atividade antiproliferativa in vitro, atividades antimutagênica e
21
antimicrobiana (HASSAN et al., 2010; BICAS et al., 2011; PARK et al., 2009; 2012). Outras
propriedades atribuídas ao α-terpineol são as capacidades anti-inflamatória e antioxidante, às
quais estão intimamente relacionadas, por exemplo, com a proteção contra os mecanismos
fisiopatológicos envolvidos com a gênese da obesidade (MARÓSTICA JÚNIOR et al., 2009;
BICAS et al., 2011; FRANÇA et al., 2013).
A obesidade é reconhecida hoje como um dos mais importantes problemas de
saúde pública em todo o mundo devido a sua contribuição para o aumento significativo de
morte prematura e invalidez precoce, uma vez que esta condição está intimamente relacionada
a um maior risco para o desenvolvimento de uma série de doenças crônicas não
transmissíveis, como resistência à insulina, diabetes tipo 2, hipertensão arterial, dislipidemias,
doenças hepáticas e cardiovasculares e certos tipos de câncer (HALLIWELL, 2007; GALIC;
OAKHILL; STEINBERG, 2010; JOHNSON; MILNER; MAKOWSKI, 2012). Dentre as
principais causas da obesidade, destacam-se o consumo excessivo de produtos de alta
densidade energética e com alto teor de gorduras e/ou açúcares, além da redução da prática de
atividades físicas associado a mudanças de estilo de vida geradas pela urbanização
(MATTES, 2013; 2014).
Diante do exposto, o presente estudo investigou a hipótese de que as respostas
fisiológicas promovidas pela ingestão de R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol, produzidos por
biotransformação a partir dos enantiômeros de limoneno, em modelos experimentais de
obesidade, poderiam atenuar eventuais distúrbios metabólicos provocados por consumo de
dieta hiperlipídica.
22
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
O principal objetivo deste trabalho foi produzir os enantiômeros R-(+)-α-terpineol
e (-)-α-terpineol, a partir da biotransformação do limoneno, e estudar os efeitos biológicos
destes dois enantiômeros.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Produção, por biotransformação, de R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol, a partir
de limoneno, pela linhagem Sphingobium sp., partindo de condições otimizadas em estudos
anteriores;
- Separação do α-terpineol e do limoneno remanescente do processo de
biotransformação por cromatografia em coluna aberta;
- Caracterização química e determinação do excesso enantiomérico dos
enantiômeros de α-terpineol por cromatografia gasosa;
- Determinação da atividade antiproliferativa in vitro do R-(+)- e do (-)-α-
terpineol contra nove linhagens de células tumorais;
- Produção das dietas para os estudos in vivo e sua caracterização, com relação ao
conteúdo de umidade, proteínas, cinzas e lipídeos;
- Avaliação o potencial da suplementação de R-(+)- e do (-)-α-terpineol em
modelo experimental de dieta hiperlipídica em ratos machos Sprague Dawley, sobre os
seguintes parâmetros biológicos: peso do fígado, teor de tecido adiposo e soro, peso corporal,
ingestão alimentar, níveis de triglicerídeos e colesterol, tolerância à glicose (GTT),
sensibilidade à insulina (ITT), citocinas inflamatórias (TNFα e IL-1β) e níveis das enzimas
alanina aminotransferase (ALT), e aspartato aminotransferase (AST); perfil oxidativo do
plasma e tecido hepático, além de análise histológica do fígado.
23
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. AROMAS
Os aromas sempre foram parte integrante da evolução da humanidade e com o
desenvolvimento tecnológico dos materiais, eles se destinam a melhorar a qualidade sensorial
e aprimorar os produtos. Os compostos de aroma são amplamente utilizados em formulações
de alimentos, rações, bebidas, cosméticos, detergentes, produtos químicos e farmacêuticos,
entre outros produtos. Com o desenvolvimento tecnológico na área de alimentos, os aromas
assumem a função de melhorar a qualidade sensorial dos alimentos, sendo considerado um
dos atributos mais importantes na aceitação do produto pelo consumidor (LONGO;
SANROMÁN, 2006; GUPTA; PRAKASH; GUPTA, 2015).
Em 1994, a indústria de aromas e fragrâncias rendeu um montante estimado em
aproximadamente US$ 9,7 bilhões. Até esta época, em torno de 6.400 voláteis naturais e
10.000 fragrâncias sintéticas eram conhecidos. Entretanto, apenas em torno de 400 compostos
de aroma foram comercializados em escala superior a uma tonelada por ano (SOMOGYI,
1996; KRINGS; BERGER, 1998). Outros dados mostram que, em 2013, a indústria de
aromas e fragrâncias apresentou um faturamento estimado em torno de US$ 23,9 bilhões, e
subiu para US$ 26,3 bilhões em 2017 (LEFFINGWELL AND ASSOCIATES, 2017).
A Resolução-RDC n° 2, de 15 de janeiro de 2007, da Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (BRASIL, 2007), dispõe acerca do Regulamento Técnico sobre Aditivos
Aromatizantes. Os aromas, ou aromatizantes, são definidos como “substâncias ou misturas
de substâncias com propriedades odoríferas e/ou sápidas, capazes de conferir ou intensificar
o aroma e/ou sabor aos alimentos”. Excluem-se desta definição “as substâncias que conferem
exclusivamente sabor doce, salgado ou ácido; as substâncias e produtos alimentícios com
propriedades odoríferas e/ou sápidas consumidas sem transformação, com ou sem
reconstituição” e “as matérias de origem vegetal ou animal que possuam propriedades
aromatizantes intrínsecas, quando não sejam utilizadas exclusivamente como fonte de aromas”.
Dentro da classificação dos aromas, encontram-se os aromas naturais, que são “obtidos
exclusivamente por métodos físicos, microbiológicos ou enzimáticos, a partir de matérias-
primas aromatizantes naturais”, as quais são “produtos de origem animal ou vegetal aceitáveis
para consumo humano, que contenham substâncias odoríferas e/ou sápidas, seja em seu estado
natural ou após um tratamento adequado, como: torrefação, cocção, fermentação,
enriquecimento, tratamento enzimático ou outros”.
24
Os aromas de produtos naturais são geralmente formados por misturas complexas
de centenas de substâncias, representantes de várias classes de compostos como
hidrocarbonetos, ésteres, aldeídos, cetonas, lactonas, alcoóis e outras moléculas complexas
resultantes do metabolismo secundário de plantas e de micro-organismos, que possuem
potencial para produzir aromas (FRANCO, 2004; LONGO; SANROMÁN, 2006). Apesar de
não representarem nenhuma função nutritiva ao alimento, estes compostos são
frequentemente utilizados como aditivos na indústria de alimentos, bebidas, perfumes e
cosméticos para conferir, intensificar e melhorar o aroma do produto, e até mesmo o sabor,
como o caso dos alimentos (BERGER, 1995; GAVA; SILVA; FRIAS, 2009).
Muitos compostos de aromas disponíveis no mercado ainda são produzidos
sinteticamente ou extraídos de fontes naturais. Devido ao aumento do interesse e
conscientização do consumidor em produtos naturais, há uma maior procura por fragrâncias
obtidas a partir de fontes naturais sendo, portanto, mais valorizados no mercado do que os
aditivos químicos artificiais. A preferência do consumidor por alimentos ou produtos cujos
ingredientes possam ser rotulados como “naturais” dão suporte ao desenvolvimento da área
biotecnológica para produção de aromas, visto que o custo de produção é significatimente
menor se comparado à extração a partir de fontes naturais (DUBAL et al., 2008; GUPTA;
PRAKASH; GUPTA, 2015).
Neste sentido, há um grande interesse pela bioprodução e aplicação de compostos
de aroma naturais de origem microbiana, resultando nos chamados bioaromas. O termo
bioaromas é utilizado para designar aromas de origem enzimática ou fermentativa. Avanços
na biotecnologia de plantas, na tecnologia enzimática, na engenharia genética, no
monitoramento de bioprocessos e nas técnicas de recuperação de produtos proporcionam
novas oportunidades em potencial para a biotecnologia de produção de aromas. Além de
serem menos agressivos ao meio ambiente – por gerar menos resíduos não biodegradáveis -
os processos biotecnológicos produzem aromas considerados naturais (BICAS; DIONÍSIO;
PASTORE, 2009; BICAS et al., 2010a; FELIPE; OLIVEIRA; BICAS, 2017).
Por isso, torna-se interessante o desenvolvimento de aromas naturais por parte dos
grupos de pesquisa acadêmicos e industriais, já que sua produção apresenta menores impactos
ambientais e custos de produção, pela utilização de matérias-primas de baixo custo que são
produzidas em maior escala e em geral subaproveitadas, resultantes principalmente da
industrialização de alimentos, indicando a importância desses processos no desenvolvimento
futuro de novos compostos naturais.
25
3.2. OBTENÇÃO DE COMPOSTOS DE AROMAS NATURAIS POR VIA
BIOTECNOLÓGICA
Os compostos de aroma podem ser obtidos por três processos, a saber, a extração
de fontes naturais, transformações químicas e por via biotecnológica (biotransformações
microbiológicas e enzimáticas). Esta última é bastante atrativa por oferecer vários produtos e
por ser um processo mais limpo (CALAZANS, 2012; MOLINA et al., 2015; FELIPE;
OLIVEIRA; BICAS, 2017). A obtenção de aromas da natureza é realizada pela extração de
plantas, embora apresentem desvantagens como a obtenção do produto de interesse com
baixos rendimentos, o alto custo do processo, a sazonalidade, problemas envolvendo a
extração como possíveis fatores ecológicos e variações na qualidade do produto final
(BICAS; DIONÍSIO; PASTORE, 2009; GALVÃO, 2014; FELIPE; OLIVEIRA; BICAS,
2017). Já os aromas obtidos por síntese química apresentam vantagens como rendimentos
satisfatórios e bons índices de produção. No entanto, possuem também muitos obstáculos,
como geração de resíduos não biodegradáveis e de produção de misturas de substâncias que
alteram sensorialmente o aroma desejado reduzindo seu interesse econômico (BICAS;
DIONÍSIO; PASTORE, 2009; AKACHA; GARGOURI, 2015).
Estas desvantagens fazem com que a produção de aromas por processos
biotecnológicos seja bastante interessante, pelo fato de que, em geral, resultam em menor
impacto ambiental, utilizam condições brandas de processo e não estão sujeitos a variações
sazonais. Outra vantagem é a alta enantioseletividade do processo, que permite a obtenção de
aromas de alta pureza óptica, impactando positivamente nas características sensoriais do
produto. Além de serem mais valorizados no mercado que os aditivos químicos artificiais, por
serem “naturais”, já que produtos com estas características têm sido bastante procurados
devido à conscientização dos consumidores em relação à alimentação e saúde (CALAZANS,
2012; AKACHA; GARGOURI, 2015; BERGER, 2015; FELIPE; OLIVEIRA; BICAS, 2017).
Os métodos biotecnológicos para a produção de aromas incluem a síntese de novo
(fermentação) e a biotransformação (biocatálise de precursores de aroma), sendo que ambos
podem ser apoiados pela engenharia genética. A síntese de novo, termo originário do latim,
significa síntese “do zero”, “do início”. Os micro-organismos são capazes de produzir uma
ampla variedade de compostos de aroma - álcoois de cadeia curta, ésteres, aldeídos, cetonas,
metilcetonas e ácidos, bem como pirazinas e lactonas - por vias metabólicas complexas, a
partir de moléculas simples (açúcares e aminoácidos) e sem a adição de substratos ao meio.
No entanto, os níveis de produção são muito pobres (< 100 mg. L-1
) bem como as dificuldades
enfrentadas no processo de purificação dada a complexidade da amostra, constituem um
26
limite para a exploração industrial. Apesar disso, algumas empresas de biotecnologia estão
investindo em biologia sintética para produzir compostos de aroma. A empresa americana
Amyris, Inc., por exemplo, está usando bioprocessos para a síntese de novo de sesquiterpenos
como o farneseno (Biofene™) e patchouli (Clearwood™) com Saccharomyces cerevisiae
geneticamente modificada em grande escala usando cana-de-açúcar como substrato (FERON;
WACHÉ, 2006; MARÓSTICA JÚNIOR; PASTORE, 2007a; BICAS; DIONÍSIO;
PASTORE, 2009; RENNINGER et al., 2010; GALLAGE; MØLLER, 2015; SCHALK;
DEGUERRY, 2015; FELIPE; BICAS, 2017; FELIPE; OLIVEIRA; BICAS, 2017). Já a
biotransformação gera rendimento mais elevado e possibilita a utilização de substratos com
baixo valor agregado, como os subprodutos agroindustriais (BERGER, 2009).
A biotransformação pode ser definida como o uso de sistema químico catalisado
por micro-organismos ou enzimas para produzir mudanças químicas em compostos que não
são seus substratos originais. Pode ser realizada pela adição do substrato durante o
crescimento das células e, nesse caso, a transformação ocorre ao mesmo tempo em que o
micro-organismo cresce, ou pela adição do substrato às células previamente crescidas. É
possível, ainda, utilizar enzimas isoladas e, nesse caso, a reação geralmente ocorre em meio
aquoso tamponado. Tanto as células íntegras quanto as enzimas podem ser utilizadas na sua
forma livre ou imobilizadas. Sistemas bifásicos (fase aquosa contendo biocatalisador e fase
oleosa contendo substratos/produtos) apresentam vantagens para os casos em que o substrato
é tóxico ou pouco solúvel em água (TONIAZZO et al., 2005; BICAS; DIONÍSIO;
PASTORE, 2009; BIER, 2011).
A biotransformação utilizando células previamente crescidas pode eliminar ou
minimizar a inibição pelo substrato. Consiste de duas etapas: na primeira, o micro-organismo
é crescido em meio adequado, com elevada formação de biomassa e separado do meio por
centrifugação ou filtração. Na segunda etapa, a biomassa é transferida para um meio próprio
para a biotransformação. Este processo apresenta algumas vantagens, como menor tempo de
transformação, maior concentração de substrato (efeitos tóxicos do substrato podem ser
minimizados), controle mais fácil de reações e facilidade na extração e purificação do
produto. A reutilização de biocatalisadores também é possível, especialmente se estiverem
imobilizados (MEDEIROS; AVERY; AVERY, 2002). No entanto, alguns desafios e
limitações precisam ser superados para obtenção de alta produtividade na biotransformação
como a instabilidade química, baixa solubilidade em água, alta volatilidade e inibição do
processo por substratos xenobióticos, metabólitos intermediários e produtos finais. Estas
substâncias geralmente interferem em importantes processos metabólicos, incluindo
27
transporte celular, geração de energia, síntese e reparo de DNA, síntese de proteínas e danos
na membrana celular, levando a uma diminuição da viabilidade celular. Além disso, os
rendimentos obtidos na maioria dos processos ainda são insuficientes para uma aplicação em
escala industrial (VAN DE WERF; DE BONT; LEAK, 1997; BERGER, 2009; LING et al.,
2013; LO et al., 2013).
A seleção das condições de cultivo e do método de biotransformação deve ser
realizada buscando sempre a melhor condição para crescimento do micro-organismo e a
realização da reação. O fator crucial para a execução da biotransformação é identificar cepas
de micro-organismos resistentes às condições deste processo e que possam utilizar diferentes
substratos como fonte de carbono para a produção de metabólitos desejáveis e em quantidades
satisfatórias. Fungos filamentosos, bactérias e leveduras oriundos de diversas fontes como,
por exemplo, solo, resíduos agroindustriais, frutos exóticos e sementes podem ser utilizados
para a produção de aromas. Nos últimos anos tem-se dado especial importância aos micro-
organismos endofíticos, pois são potenciais fontes de produtos naturais de interesse na
medicina, agricultura e indústria (STROBEL et al., 2004; BICAS; DIONÍSIO; PASTORE,
2009; MOLINA et al., 2013; ABRAHÃO; MOLINA; PASTORE, 2013). Além disso, as
condições de processo como composição do meio de cultura, pH, temperatura de incubação,
aeração e agitação são fatores importantes que vão influenciar no tipo e na quantidade de
aroma produzido (ROTTAVA et al., 2010).
A inclusão de etapas de biotransformação usando micro-organismos ou enzimas
isoladas (lipases, proteases, glicosidases, isomerases etc.) propiciou um aumento significativo
das sínteses realizadas em escala laboratorial. A utilização da biotransformação permitiu a
introdução de reações catalizadas por enzimas com controle régio e estereoquímico, gerando
compostos opticamente puros, além do desenvolvimento de rotas mais eficientes. As
biotransformações empregando micro-organismos, ou seja, células íntegras, como bactérias,
leveduras e fungos filamentosos, apresentam vantagens em relação ao uso de enzimas
isoladas, pois os micro-organismos apresentam rápido crescimento e fácil formação do
sistema multienzimático, além da facilidade de desenvolvimento experimental e possibilidade
de reutilização das células microbianas. As células íntegras destes micro-organismos contêm
enzimas com diferentes estruturas, responsáveis por catalisar diversas reações, destacando-se
as hidrolases como a mais utilizada para produção de aromas (FABER, 2004).
Apesar dos elevados custos da aplicação de enzimas isoladas na produção de
aromas, estas podem oferecer alta seletividade para a conversão de um determinado substrato.
Reações que são efetuadas por enzimas isoladas de células - oxidação, redução, reações
28
hidrolíticas, formação de novas ligações C-C e reações de degradação - são altamente
específicas ao substrato, permitindo reconhecê-lo de formas régio e enantioseletiva, sendo,
portanto, capazes de realizarem reações não acessíveis por processos químicos clássicos
(PETERSEN, 2006; PANDEY et al., 2008). Desta forma, os produtos obtidos por
biotransformação, em geral, apresentam maior pureza enantiomérica em função da capacidade
enantioseletiva apresentada por sistemas biológicos (WACHÉ; DIJON, 2013).
3.3. COMPOSTOS TERPÊNICOS
3.3.1. Definição geral
Os vegetais sintetizam substâncias que são divididas, didaticamente, em dois
grandes grupos: metabólitos primários, como a celulose, lignina, proteínas e outras
substâncias, que são originadas do metabolismo primário, que realizam suas principais
funções vitais e que fazem parte da atividade celular de praticamente todos os seres vivos e os
metabólitos secundários, originados do metabolismo secundário, que são substâncias de baixo
peso molecular, geralmente produzidas em pequenas quantidades, que possuem características
químicas muito variadas e, às vezes, bem complexas, mas nem por isso menos importante
(DEWICK, 2002). Os metabólitos secundários despertam grande interesse pelas atividades
biológicas exercidas nas plantas em resposta aos estímulos do meio ambiente e também pela
sua grande atividade farmacológica. Muitos são de importância comercial nas áreas
farmacêutica, alimentícia, agronômica, perfumaria e outras (PEREIRA, 2006).
Os compostos terpênicos constituem o maior grupo de metabólitos secundários
conhecidos, com mais de 40.000 substâncias já identificadas. As diversas substâncias desta
classe são sintetizadas através da rota do ácido mevalônico a partir da condensação de uma
unidade de acetocetil-CoA e acetil-CoA, seguida de uma hidrólise, formando o 3-hidróxi-3-
metilglutaril-CoA (HMGCoA). Em seguida, o HMGCoA é reduzido por um processo
dependente de NADPH e catalisado pela HMGCoA-redutase a mevalonato. O mevalonato
então é convertido em isopentil-pirofosfato (IPP) e seu isômero dimetilalilpirofosfato
(DMAPP). A produção de IPP pode também ocorrer no cloroplasto pela via 1-deoxi-D-
xilulose (DXP), iniciando com a condensação de uma molécula de piruvato a outra D-
gliceraldeído-3-fosfato, formando 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato, após reações sucessivas, a
molécula de IPP e DMAPP são formadas. Estas moléculas, formadas em ambas as vias,
condensam-se e originam o trans-geranilpirofosfato (GPP), o qual é convertido em diferentes
monoterpenos. Os terpenos e terpenóides mais simples (mono e sesquiterpenos/terpenóides)
29
são amplamente utilizados na indústria de aromas e são os principais constituintes dos óleos
essenciais (DEWICK, 2002; DZUBAK et al., 2006; BICAS et al., 2010a; SIMÕES et al.,
2010).
Do ponto de vista químico, são substâncias hidrofóbicas, armazenadas em canais
de resina, células de óleos essenciais ou mesmo tricomas glandulares, contendo ou não
oxigênio que, devido à origem biossintética são constituídos de unidades básicas de isopreno
(2-metil-1,3-butadieno, C5H8). A união de duas moléculas de isopreno pode ocorrer de três
maneiras diferentes: cabeça-cabeça, cabeça-cauda e cauda-cabeça. Nos monoterpenos, classe
formada por uma grande variedade de substâncias encontradas na natureza, a conexão
normalmente encontrada entre as unidades de isopreno é a cabeça-cauda (Figura 1), embora
existam algumas exceções para este arranjo (KIRK-OTHMER, 1983; LOOMIS; CROTEAU,
2014).
Figura 1. Representação da formação estrutural do limoneno.
Fonte: Meireles (2013).
Assim, os compostos terpênicos podem ser classificados de acordo com o número
de unidades de isopreno que possuem (Tabela 1). Outra forma de classificação dos compostos
terpênicos refere-se à ciclização ou não da cadeia e ao número de anéis na molécula. Assim,
podem ser caracterizados como acíclicos (cadeia aberta), monocíclicos (um anel), bicíclicos
(dois anéis), tricíclicos (três anéis), etc., podendo ser oligômeros de isopreno e também
isômeros saturados ou parcialmente saturados, bem como derivados oxigenados, como
alcoóis, aldeídos, cetonas, fenóis, éteres e ésteres, podendo estes ser denominados
“terpenóides” (derivados dos terpenos). Uma única planta pode sintetizar muitos compostos
terpênicos diferentes, em diferentes órgãos, para uma grande variedade de propósitos e em
30
épocas diferentes, ao longo do seu desenvolvimento (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER, 1997;
DEWICK, 2002; HILL; CONNOLLY, 2012; KRIVORUCHKO; NIELSEN, 2014).
Tabela 1. Classificação dos terpenos, com base no número de subunidades de isopreno.
Unidades de isopreno Átomos de Carbono Classificação
1 5 Hemiterpeno
2 10 Monoterpeno
3 15 Sesquiterpeno
4 20 Diterpeno
5 25 Sesterpeno
6 30 Triterpeno
8 40 Tetraterpeno
10 ou > 10 50 ou > 50 Politerpeno
Fonte: Adaptado de Mikami (1988).
O Brasil é um dos maiores exportadores mundiais de terpenos. Os terpenos de
ocorrência natural são constituintes principais de óleos essenciais (Tabela 2) e representam
uma matéria-prima renovável comercialmente importante para as indústrias farmacêuticas, de
perfumes, de flavorizantes, agroquímicas, cosméticos e de aromas, além de intermediários
sintéticos versáteis, podendo ser usados na síntese de produtos quirais. Os monoterpenos e
sesquiterpenos, com estruturas terpênicas de menor massa molecular, apresentam volatilidade
acentuada. Essa última característica, por sua vez, apresenta grande importância para o aroma
dos produtos naturais, particularmente de frutas cítricas, ervas aromáticas, especiarias e
condimentos (SELL, 2006; FARKAS; MOHÁCSI-FARKAS, 2014; FELIPE; BICAS, 2017).
31
Tabela 2. Principais constituintes de alguns óleos vegetais
Óleo essencial Composição
Alecrim Monoterpeno (α-pineno, β-mirceno, canfeno), monoterpenoide (1,8 cineol,
borneol, geraniol), outros compostos (verbenona).
Bergamota
Ésteres de álcoois monoterpênicos (linalil acetato, neril acetato, geranil
acetato); monoterpenos (limoneno, β-pineno, γ-terpineno);
monoterpenoides (linalol, geraniol, geranial, neral).
Capim citronela Monoterpeno (limoneno), monoterpenoide (β-citronelol, nerol, α-
terpinoleno) outros compostos (citronelal).
Casca de laranja Monoterpenos (limoneno, mirceno); sesquiterpenoides (β-sinensal, α-
sinensal), sesquiterpeno (valenceno); monoterpenoides (decanal, linalol,
neral, geranial, citronelal), outros compostos (octanal).
Gengibre Sesquiterpenos (zingibereno, AR-curcumeno, β-sesquifelandreno,
bisaboleno); monoterpenos (canfeno, β-felandreno), monoterpenoide (1,8-
cineol)
Hortelã pimenta Monoterpenoide (isomentona, (−)-mentol, (−)-mentona, 1,8-cineol,
mentofurano); monoterpeno (limoneno), álcoois (octan-3-ol, oct-1-en-3-
ol).
Limão Monoterpenos (limoneno, β-pineno, γ-terpineno); monoterpenoides
(geranial, neral, citronelal, linalol); outros compostos (neril acetato,
geranil acetato, nonanal).
Melaleuca Monoterpeno (limoneno, α-terpineno, γ-terpineno, α-terpinoleno, p-
cimeno), monoterpenoide (1,8-cineol, terpinen-4-ol, α-terpineol)
Pimenta Monoterpeno (sabineno).
Pinus Monoterpenos (pinenos, car-3-eno, limoneno, mirceno).
Terebintina Monoterpenos (α-pineno, canfenos)
Adaptado de: Margetts (2005); Baser e Demirci (2007); Ribeiro et al. (2012); Felipe e Bicas (2017).
3.3.2. Importância da estereoisomeria no estudo de compostos terpênicos
A quiralidade está presente em muitas moléculas orgânicas, inclusive nos óleos
essenciais. Este fenômeno ocorre quando um átomo de carbono está ligado a quatro diferentes
grupos funcionais. Carbonos desse tipo são chamados de assimétricos ou quirais e as
moléculas são denominadas moléculas quirais (ASZTEMBORSKA; OCHOCKA, 2002;
McMURRY, 2011; SOLOMONS; FRYHLE, 2012).
A isomeria pode ser dividida em dois tipos principais (Figura 2): i) plana ou
constitucional (isômeros de cadeia, de posição, de função, de compensação e tautomeria) e ii)
espacial ou estereoisomeria (isomeria geométrica ou cis-trans e isomeria óptica). Os
estereoisômeros têm seus átomos conectados na mesma sequência (mesma constituição), mas
32
diferem no arranjo de seus átomos no espaço, e podem ser subdivididos em duas categorias:
aqueles que são enantiômeros entre si e aqueles que são diasteroisômeros entre si. Os
enantiômeros são estereoisômeros cujas moléculas são imagens especulares não sobreponíveis
entre si e os diastereoisômeros são estereoisômeros cujas moléculas não são imagens especu-
lares entre si (SOLOMONS; FRYHLE, 2012).
Figura 2. Subdivisão dos isômeros.
Fonte: Adaptado de Solomons e Fryhle (2012).
Os enantiômeros são tipos de isômeros que ocorrem em moléculas quirais, ou
seja, moléculas cuja imagem não é sobreponível, mas é simétrica em relação a um plano e
apresentam desvios polarimétricos opostos e de mesma magnitude. Podem ser encontradas na
forma de mistura racêmica, quando os enantiômeros estão em igual proporção, sendo
oticamente inativa, ou estar em excesso de uma de suas formas (ASZTEMBORSKA;
OCHOCKA, 2002; SOLOMONS; FRYHLE, 2012).
Esses isômeros possuem algumas propriedades físicas semelhantes, como
solubilidade, densidade e ponto de fusão. No entanto apresentam diferenças quanto ao aroma,
sabor, toxicidade, atividade biológica e atividade ótica. Com base na atividade ótica, se o
desvio da luz polarizada for para a direita, os isômeros são denominados dextrógiros,
ISÔMEROS
(Compostos diferentes com
a mesma fórmula
molecular).
Isômeros Constitucionais
(Isômeros cujos átomos
têm conectividades
diferentes).
Estereoisômeros
(Isômeros que tem a mesma
conectividade, mas que diferem no
arranjo espacial de seus átomos).
Enantiômeros
(Estereoisômeros que são
imagens especulares não
sobreponíveis um do
outro).
Diasteroisômeros
(Estereoisômeros que não
são imagens especulares
um do outro).
33
representados por (d) ou (+); se o giro for para esquerda, são chamados de levógiros (l) ou (-).
Também pode ser denotado pela ordem decrescente de prioridade do número atômico do(s)
átomo(s) ligado(s) ao carbono quiral. Se a configuração for ao sentido horário em torno do
carbono, é designado como R- (“rectus”); se a configuração for anti-horária, é indicado por S-
(“sinister”). Esta última notação (R, S) é comumente utilizada para estabelecer a configuração
absoluta dos enantiômeros e foi desenvolvida por Can-Ingold-Prelog (Robert S. Can,
Christopher Ingold e Vladimir Prelog) em 1966 e adotado pela International Union of Pure
and Applied Chemistry (IUPAC) (IUPAC, 1997; McMURRY, 2011; SOLOMONS;
FRYHLE, 2012).
A atividade biológica de substâncias opticamente ativas não é idêntica para ambos
os enantiômeros. Um modelo explicativo deste é a teoria dos três pontos: a formação do
complexo enzima-substrato só é possível para o enantiômero que possui três pontos
corretamente posicionados para ocorrer interação com o sítio ativo da enzima (Figura 3)
(BRUICE, 2003). A existência de enzimas e receptores estereoespecíficos no organismo
conduz às características biológicas diferentes para compostos com estruturas quirais. Tais
características são de extrema importância biológica, uma vez que a maioria dos receptores
endógenos dos fármacos e compostos bioativos também é composto quiral (THALL, 1996).
Figura 3. Diagrama esquemático da interação de moléculas quirais com enzimas receptoras.
Teoria dos três pontos. Fonte: Rinaldo (2010).
Como os nossos receptores são feitos de proteínas quirais, dois enantiômeros de
um composto quiral, similares em suas estruturas químicas, podem diferir substancialmente
em suas atividades biológicas. Como exemplo clássico da importância da quiralidade na
indústria farmacêutica encontra-se o caso da talidomida, comercializada como mistura
Enantiômero R Enantiômero S
Sítio de ligação do receptor (enzima) Sítio de ligação do receptor (enzima)
34
racêmica, na década de 1960, como sedativo e analgésico. Após a tragédia causada por esse
fármaco, em razão do enantiômeros S-(-) apresentar efeitos teratogênicos, levando à má
formação de milhares de fetos humanos, novos modelos de estudos para fármacos quirais
foram desenvolvidos (CALDWELL, 1995; BARREIRO; FERREIRA; COSTA, 1997; SILVA
JÚNIOR et al., 2006).
A detecção de aromas envolve a interação de moléculas voláteis quirais com os
receptores nasais. Por este motivo, dois enantiômeros de um monoterpeno podem dar
diferentes impressões olfatométricas. O S-(-)-limoneno e R-(+)-limoneno, por exemplo,
encontrados nas cascas de frutas cítricas, possuem odores de limão e laranja, respectivamente;
S-(+)-carvona apresenta aroma de hortelã, enquanto R-(-)-carvona possui odor de sementes de
pinheiro. O R-(+)-α-terpineol possui aroma floral, enquanto que o S-(-)-α-terpineol possui um
odor conífero. (ASZTEMBORSKA; OCHOCKA, 2002; HARRATHI et al., 2012; PORTE;
PORTE; OLIVEIRA, 2014; REZENDE; AMAURO; RODRIGUES FILHO, 2016).
Os aromas são resultantes de misturas complexas de substâncias voláteis e
geralmente consistem de centenas de substâncias de funções orgânicas diferentes, e entre elas
os terpenos enantioméricos. Eles são geralmente limitados a monoterpenos, sesquiterpenos e,
em raras ocasiões, diterpenos. Como os enantiômeros de um composto podem apresentar ca-
racterísticas de odor distintas, é fundamental a utilização de técnicas que permitam a
elucidação da configuração absoluta (R ou S) presente, bem como o conhecimento da
proporção e da pureza enantiomérica destes compostos no alimento. A proporção
enantiomérica é dada normalmente pelo excesso enantiomérico (ee) das substâncias quirais,
definido por (R - S)/(R + S) x 100, onde R e S são as quantidades relativas dos enantiômeros R
e S. Enquanto que a concentração do excesso enantiomérico é a diferença entre os percentuais
dos dois enantiômeros, a pureza enantiomérica é definida como a proporção (expressa em
percentagem) dos enantiômeros detectados (ELIEL; WILEN; MANDER, 1994;
ASZTEMBORSKA; OCHOCKA, 2002; TEMBA; OLIVEIRA; DONNICI; 2003; PORTE;
PORTE; OLIVEIRA, 2014).
3.3.3. Limoneno
O limoneno, de nomenclatura IUPAC 1-metil-4-isopropenilciclohex-1-eno, é um
hidrocarboneto monoterpênico cíclico insaturado (C10H16, MM = 136,24 g. mol-1
). Por
apresentar um carbono quiral no anel ciclo-hexeno, muitas espécies de plantas podem
biossintetizá-lo nas formas de seus enantiômeros (Figura 4) e na forma racêmica. Limoneno
(em ambas as formas enantioméricas) já foi encontrado nos óleos essenciais de mais de 300
35
espécies de plantas (DNP, 2015), incluindo laranja, limão, hortelã e árvores coníferas, sendo a
prevenção da desidratação e a inibição do crescimento microbiano suas funções naturais nos
vegetais. O R-(+)-limoneno é encontrado em espécies de Citrus ssp, Lippia e Artemia, sendo
o principal constituinte do óleo da casca de laranja (concentrações entre 90 e 97%) e do óleo
essencial de alcarávia. Já o S-(-)-limoneno é encontrado principalmente no óleo da casca de
limão e em óleo essencial da espécie de Mentha ssp. (ERASTO; VILJOEN, 2008; RUIZ;
FLOTATS, 2014).
Figura 4. Estruturas enantioméricas do limoneno.
Mais de 60 mil toneladas de R-(+)-limoneno são recuperadas ao ano como
subproduto da indústria cítrica mundial. O limoneno é geralmente extraído do óleo essencial
contido na casca de laranja pela sua baixa solubilidade em água, alta tendência à autoxidação
e polimerização, tornando-se um subproduto industrial adequado para bioconversões em
compostos de alto valor comercial. (CARVALHO; FONSECA, 2006; MARÓSTICA
JÚNIOR; PASTORE, 2007b; LANGE, 2015).
A disponibilidade de grandes quantidades de limoneno e o seu baixo custo (US$
5–7/kg) (ALICEWEB, 2016) têm despertado o interesse dos pesquisadores e da indústria. Isso
se explica, principalmente, pelo fato de alguns compostos medicinais e de aroma possuírem
fórmulas estruturais semelhantes ao limoneno, sugerindo grande potencial para a utilização
industrial desse rejeito. Por exemplo, o limoneno tem sido utilizado na produção
biotecnológica de monoterpenos oxigenados bioativos. Diversos estudos foram desenvolvidos
no intuito de utilizar o limoneno como substrato para a produção biotecnológica de aromas
naturais de maior valor comercial como a biotransformação em álcool perílico, carvona,
S-(-)-limoneno R-(+)-limoneno
36
carveol e α-terpineol (TAN; DAY, 1998; DUETZ et al., 2001; MENÉNDEZ et al., 2002;
TRYTEK; FIEDUREK, 2005; ROTTAVA et al., 2010; RUIZ; FLOTATS, 2014;
MARMULLA; HARDER, 2014; LANGE, 2015).
3.3.4. α-terpineol
O α-terpineol (Figura 5), de nomenclatura IUPAC 2-(4-Metil-1-ciclohex-3-
enil)propan-2-ol, é um monoterpenóide cíclico hidroxilado (C10H18O, MM = 154,25 g/mol),
incolor e de aroma agradável encontrado em uma grande variedade de óleos essenciais, com
ampla aplicação industrial. O consumo anual do α-terpineol é estimado em,
aproximadamente, 9,2 toneladas, o que representa uma ingestão individual diária de 17,2
µg/kg, nos Estados Unidos (BATHIA; LETIZIA; API, 2008; BURDOCK; FENAROLI,
2010).
Este monoterpenoide é utilizado em indústrias de produtos de perfumaria como
constituinte de sabonetes e cosméticos, em indústrias de produtos de limpeza como repelente
de insetos, desinfetante e aromatizante, em indústrias farmacêuticas como antifúngico e
antisséptico, sendo aprovado como substância GRAS (Generally Recognized as Safe – GRAS
3045). O uso do α-terpineol em alimentos, geralmente em uma faixa de 10-25 ppm, incluem
produtos cozidos, gomas de mascar, condimentos, produtos lácteos, doces e bebidas. Devido a
essa enorme demanda, o α-terpineol utilizado no mercado mundial é obtido, em grande parte,
por via sintética, e vários métodos para tal são disponíveis, com especial destaque àqueles que
utilizam pinenos ou a própria terebintina como materiais de partida (BAPTISTELLA et al.,
2009; BICAS et al., 2010a; BURDOCK; FENAROLI, 2010; DIONÍSIO et al., 2012).
Figura 5. Estruturas enantioméricas do α-terpineol.
R-(+)-α-terpineol S-(‒)-α-terpineol
37
O α-terpineol apresenta duas formas isoméricas (Figura 5), que vão determinar
suas propriedades de aroma: R-(+)-α-terpineol, de aroma floral intenso, e S-(-)-α-terpineol,
presente na espécie Pinus palustris Mill., em concentração menor de 60% em seu óleo
essencial, que possui um odor caracteristicamente conífero. Apesar do α-terpineol ocorrer em
muitos óleos essenciais, apenas pequenas quantidades são isoladas. Está presente em
concentrações de 3 a 4% em óleos essenciais de Melaleuca alternifolia, Salvia officinalis e
Carthamus tinctorius (HARRATHI et al., 2012), bem como nos óleos essenciais de laranja
(grapefruit), bergamota e lima em concentrações variáveis (BAUER; GARBE; SURBURG,
2001; ROTTAVA et al., 2010). O α-terpineol está comercialmente disponível como mistura
racêmica (mistura em quantidades iguais dos isômeros óticos), recuperado como subproduto
da indústria de celulose e papel (CADWALLADER; BRADDOCK; PARISH, 1992).
Uma das mais recentes tendências é a produção de α-terpineol natural pela
biotransformação do limoneno, α-pineno ou β-pineno. A biotransformação de limoneno para
α-terpineol como principal produto já foi descrita por fungos filamentosos Cladosporium,
Penicillium digitatum, Aspergillus niger e Fusarium oxysporum. Para as bactérias, este
caminho de conversão tem sido relatado em Pseudomonas gladioli, Escherichia coli,
Pseudomonas fluorescens e Sphingobium spp. (BICAS et al., 2008; 2010bc; TAI et al., 2016).
Em todos os casos, o processo é altamente enantioespecífico, mas a concentração do produto
depende das condições da reação (KRAIDMAN; MUKHERJEE; HILL, 1969; BICAS;
DIONÍSIO; PASTORE, 2009; BICAS et al., 2010b).
3.4. BIOTRANSFORMAÇÃO DE LIMONENO EM α-TERPINEOL
O limoneno tornou-se um dos precursores mais estudados em experimentos de
bioconversão para a produção de derivados de alto valor, o que pode revelar-se uma boa
estratégia para o enriquecimento do valor comercial dos subprodutos da agroindústria, como
óleo de casca de laranja. O limoneno pode ser biotransformado em monoterpenos oxigenados
como o α-terpineol, que é um monoterpenoide que tem um valor agregado significativamente
maior que o limoneno (MARÓSTICA JÚNIOR; PASTORE, 2007a; BURDOCK;
FENAROLI, 2010; MARMULLA; HARDER, 2014).
Há progressos no campo da biotransformação de limoneno, especialmente no que
se refere à regioespecificidade da biocatálise por micro-organismos. Maróstica Júnior e
Pastore (2007b) e Bicas et al. (2008) expuseram as seis principais reações químicas da
biotransformação do limoneno (Figura 6): (1) a oxidação de carbono 7 do limoneno a
38
compostos perílicos; (2) epoxidação da dupla ligação do anel, seguida pela formação do diol
correspondente e sua oxidação; (3) a oxidação de carbono 6 para formar cis, trans carveóis e
carvona; (4) hidroxilação do carbono 8 para formar α-terpineol; (5) oxidação do carbono 3
para formar isopiperitenol e isopiperitona e (8) epoxidação da ligação 8,9 a limoneno-8,9-
epóxido.
Figura 6. Principais rotas envolvidas na biotransformação do limoneno.
Fonte: Maróstica Júnior e Pastore (2007b).
O primeiro relato da biotransformação de limoneno em α-terpineol foi em 1969,
por uma linhagem de Cladosporium sp. (KRAIDMAN; MUKHERJEE; HILL, 1969).
Posteriormente, inúmeros estudos demonstraram essa capacidade de biotransformação para
várias espécies de fungos filamentosos, como as do gênero Aspergillus sp., Fusarium sp. e
Penicillium sp. (TAN; DAY; CADWALLADER, 1998; DEMYTTENAERE; DE KIMPE,
39
2001; ADAMS; DEMYTTENAERE; DE KIMPE, 2003; TRYTEK; FIEDUREK, 2005;
MARÓSTICA JÚNIOR; PASTORE, 2007a; BICAS et al., 2010c; MOLINA et al., 2013;
2015; TAI et al., 2016).
Algumas bactérias também são capazes de utilizar limoneno como fonte de
carbono ou energia. A utilização de bactérias para a produção biotecnológica de α-terpineol
também é conhecida. Estudos com linhagens de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas
gladioli, Pseudomonas fluorescens, Bacillus stearothermophillus, Escherichia coli
recombinante e Sphingobium sp., demonstraram capacidade de biotransformar limoneno à α-
terpineol e outros derivados oxigenados (CADWALLADER et al., 1989; CADWALLADER;
BRADDOCK; PARISH, 1992; SAVITHIRY; CHEONG; ORIEL, 1997; BICAS et al., 2008;
2010b; MOLINA, 2014).
A toxicidade dos micro-organismos ao precursor limoneno e a multiplicidade dos
metabólitos originados da biotransformação do monoterpeno resultam em baixas
concentrações dos produtos finais e intermediários, elevando os custos da recuperação dos
compostos gerados. No entanto, algumas bactérias, como as do gênero Pseudomonas sp.,
apresentam a capacidade de degradar e de sobreviver em meios contendo monoterpenos,
sintetizando enzimas para a bioconversão destes compostos (CADWALLADER et al., 1989;
SPEELMANS; BIJLSMA; EGGINK 1998; RAMOS et al., 2015).
Alguns processos viáveis na biotransformação de limoneno em, até agora
descritos na literatura, tiveram suas condições otimizadas e seus rendimentos foram
aumentados significativamente. Molina (2014) otimizou a produção de α-terpineol, partindo
de um estudo iniciado por Bicas et al. (2010b) ao utilizar como biocatalisador Pseudomonas
fluorescens NCIMB 11671 (reclassificado como Sphingobium sp.) e limoneno como substrato
em meio bifásico (fase aquosa/óleo de soja). Bicas et al. (2010b) obtiveram rendimento de
130 g. L-1
de α-terpineol, enquanto no estudo de Molina (2014), nas melhores condições de
processo, a produção de α-terpineol chegou a 500 g. L-1
.
As reações de biotransformação realizadas em sistemas bifásicos são
implementadas para proteger os micro-organismos dos efeitos tóxicos de alguns substratos,
intermediários e produtos finais e melhorar o rendimento da bioconversão. Desta forma,
estudos de Bicas et al. (2008) foram realizados utilizando Pseudomonas rhodesiae
CIP107491 e Pseudomonas fluorescens NCIMB 11671 nas reações com terpenos onde foram
utilizados meios bifásicos (fase aquosa/hexadecano). Os resultados mostraram que P.
rhodesiae foi eficiente na bioconversão de α- and β-pineno, enquanto P. fluorescens
metabolizou o limoneno a α-terpineol (11 g. L-1
). O α-terpineol obtido por Molina (2014) em
40
concentrações de 500 g. L-1
em meio bifásico utilizando óleos vegetais como fase orgânica,
foi de longe o mais alto já descrito para a bioprodução de α-terpineol.
No que se refere à enantioespecificidade da biotransformação, alguns estudos já
relataram a bioconversão de R-(+)-limoneno e S-(-)-limoneno a enantiômeros R-(+)- e S-(-)-α-
terpineol, respectivamente, por Penicillium digitatum. Adams, Demyttenaere e De Kimpe
(2003) observaram que R-(+)- limoneno foi convertido, com elevada enantioseletividade, em
R-(+)-α-terpineol com 99% de excesso enantiomérico, semelhante àquele obtido por Bicas et
al. (2010b) para o mesmo enantiômero. Neste mesmo estudo, os pesquisadores observaram
que a quantidade obtida para o isômero R-(+)-α-terpineol foi mais de 10 vezes superior,
similar à observada por Braddock e Cadwallader (1995) para a bactéria Pseudomonas
gladioli. Também foi observada a conversão de S-(-)-limoneno a S-(-)-α-terpineol, com 60%
de excesso enantiomérico (BICAS et al., 2010b).
Portanto, a produção de α-terpineol é importante abordagem na produção
biotecnológica de compostos de aroma utilizando substratos terpênicos de baixo custo, por
apresentar a vantagem de se obter um composto valorizado comercialmente, considerado
natural e com importantes atividades biológicas.
3.5. OBESIDADE
3.5.1. Obesidade: uma epidemia mundial
A obesidade é definida como um acúmulo anormal ou excessivo de gordura que
pode ser prejudicial para a saúde. A etiologia da obesidade é bastante complexa, apresentando
um caráter multifatorial. Envolve, portanto, uma gama de fatores, incluindo os genéticos,
psicológicos, fisiológicos (fatores endócrino-metabólicos) e ambientais - alimentação
excessivamente industrializada, o consumo excessivo de gorduras e açúcares, a diminuição do
consumo de frutas, verduras e legumes e o sedentarismo, associado a mudanças de estilo de
vida geradas pela industrialização, urbanização e desenvolvimento econômico
(WANDERLEY; FERREIRA, 2010; CHURCH et al., 2011, MATTES, 2013; SAMPLE et
al., 2015; NJIKE et al., 2016; MEDICI; McCLAVE; MILLER, 2016; POPKIN; HAWKES,
2016; HEYMSFIELD; WADDEN, 2017; UPADHYAY et al., 2018; WHO, 2018).
A prevalência de obesidade vem crescendo de forma alarmante nos últimos anos,
constituindo um importante problema de saúde pública, que ganha contornos de epidemia
mundial. De acordo com os últimos dados da Organização Mundial de Saúde (WHO), de
2014, 39% de homens e 40% de mulheres acima de 18 anos estavam acima do peso. O
número de indivíduos adultos com sobrepeso vem crescendo mundialmente e já representava
41
perto de dois bilhões de pessoas (26% da população mundial), e mais de 500 milhões de
obesos (7% da população mundial) (WHO, 2017). No Brasil, segundo o Ministério da saúde,
de acordo com um levantamento feito com 53,2 mil brasileiros adultos, em 2016, foi
mostrado que 53,8% estavam acima do peso, apresentando índices de massa corporal (IMC)
acima de 25 kg/m2, e 18,9% eram obesas, com IMC superior a 30 kg/m
2.
Em 2006, esta
proporção era de 42,6% para excesso de peso e 11,8% para obesidade, o que mostra tratar-se
de uma epidemia em bastante crescimento (BRASIL, 2017).
A partir dos dados sobre a obesidade no mundo, preocupações são levantadas
sobre a propensão desses indivíduos a desenvolverem comorbidades. O aumento de tecido
adiposo é acompanhado por importantes modificações de perfil lipídico que estão
intimamente associadas ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares, como aterosclerose,
bem como no desenvolvimento de resistência à insulina, diabetes mellitus tipo 2, doenças
hepáticas e certos tipos de câncer (ALEXANDER et al., 2016; BOUTENS; STIENSTRA,
2016; CHABOT; STEFFENSEN; FARRELL, 2016). Além disso, alguns estudos relacionam
a obesidade com efeitos cognitivos adversos (FRANCIS; STEVENSO, 2013; SHEFER,
MARCUS, STERN; 2013; BOITARD et al., 2014) e o risco de demências, tais como a
doença de Alzheimer (MILLER; SPENCER, 2014).
3.5.2. Obesidade e inflamação
A obesidade é definida como uma doença caracterizada pela expansão excessiva
do tecido adiposo e que está associada ao estabelecimento de um estado inflamatório que está
implicado em várias desordens metabólicas. Essa hipertrofia vem principalmente do excesso
de nutrientes que esse tecido tem que armazenar. Muitas vezes, a quantidade de
macronutrientes extrapola a capacidade metabólica da célula e ela acaba desenvolvendo
mecanismos de proteção, que podem gerar sua morte, por exemplo. Outras vezes, essa
hipertrofia promove níveis baixos de oxigênio às células, que passam a viver em situações de
hipóxia. Todas essas alterações geram sinais intra e extracelulares que vão culminar no
recrutamento de células imunológicas ao tecido para “solucionar” este estado de alerta que os
adipócitos se encontram (GREGOR; HOTAMISLIGIL, 2011; BALSAN et al., 2015).
O tecido adiposo é composto por adipócitos, células endoteliais e leucócitos,
principalmente macrófagos, além de uma variedade de células, sendo os adipócitos os mais
abundantes. Existem dois tipos de tecido adiposo, classificados de acordo a sua estrutura
celular, localização, coloração, vascularização e funções, que são o tipo marrom e o branco. O
tecido adiposo marrom é praticamente ausente em indivíduos adultos, porém está presente em
42
fetos e recém-nascidos, e seus adipócitos são de menor tamanho que os adipócitos do tecido
adiposo branco, cuja função principal é armazenar lipídeos na forma de triacilgliceróis. Sabe-
se que os adipócitos do tecido adiposo branco produzem uma variedade de citocinas
inflamatórias na proporção de seus volumes, e a obesidade está associada com o aumento de
vários destes peptídeos próinflamatórios (FONSECA-ALANIZ et al., 2006;
FRANCISQUETI; NASCIMENTO; CORRÊA, 2015; DIVELLA et al., 2016).
Produzidas por adipócitos ou células residentes no tecido adiposo, as
adipocitocinas são proteínas que regulam importantes funções no organismo e influenciam
uma variedade de processos fisiológicos, entre os quais o controle da ingestão alimentar, a
homeostase energética, a sensibilidade à insulina, a angiogênese, a proteção vascular, a
regulação da pressão, a coagulação sanguínea e a modulação de respostas imunes. Durante o
estabelecimento da obesidade, o armazenamento excessivo da energia pelos adipócitos é
acompanhado pelo aumento da secreção de adipocitocinas pró-inflamatórias - fator de necrose
tumoral-alfa (TNF-α), adiponectina, resistina, leptina, interleucina-6 (IL-6), interleucina-1β
(IL-1β) e inibidor do fator ativador de plasminogênio (PAI-1), dentre outras - e redução das
anti-inflamatórias, o que induz respostas pró-inflamatórias com recrutamento de células
imunológicas (monócitos/macrófagos, linfócitos) para o local. Tais substâncias geram um
nível moderado de inflamação local e sistêmica, que influencia no comportamento das vias
metabólicas. (GALIC; OAKHILL; STEINBERG, 2010; JOHNSON; MILNER; MAKOVSKI,
2012; BALSAN et al., 2015; DIVELLA et al., 2016; KANG et al., 2016; LAUTERBACH;
WUNDERLICH, 2017).
Essas citocinas pró-inflamatórias estão intimamente relacionadas com a
resistência à insulina (RI), que pode ser descrita como uma alteração metabólica e patológica
da ação fisiológica da insulina sobre os tecidos, diminuindo a captação da glicose para o meio
intracelular gerando um quadro de hiperglicemia. Pode ser entendida também como uma
resposta diminuída a ação da insulina, interferindo diretamente no metabolismo dos
carboidratos, principalmente da glicose. Está presente na fisiopatologia de diversas doenças
de origem metabólicas, como a síndrome metabólica. Na RI ocorre um desequilíbrio no
metabolismo dos carboidratos e dos lipídios levando as células β do pâncreas a aumentarem a
secreção de insulina na tentativa de compensar o estado de resistência à insulina, porém com a
progressão da resistência as células β não conseguem mais suprir a demanda orgânica levando
a um estado de intolerância à glicose (FREITAS; CESCHINI; RAMALLO, 2013;
WAJCHENBERG; LERARIO; BETTI, 2014). A RI desencadeia outras alterações
43
metabólicas, como elevação dos níveis de triglicerídeos e LDL colesterol, além de diminuição
nos níveis de HDL colesterol (MESHKANI; ADELI, 2009).
Ao comparar indivíduos eutrópicos e obesos, o estresse oxidativo é maior na
população obesa devido a fatores característicos destes pacientes como a hipercolesterolemia,
metabolismo anormal, no tecido adiposo ou a liberação excessiva liberação de citocinas
inflamatórias. Assim, o aumento da produção de pró-oxidantes, em detrimento dos
antioxidantes, pode sobrecarregar o organismo e promover o estresse oxidativo crônico. O
estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de
oxigênio (ERO) e a capacidade dos sistemas de defesa antioxidante em neutralizá-las e
prevenir seus efeitos deletérios. ERO são produtos instáveis, decorrentes do metabolismo
aeróbio e são reconhecidas tanto por desempenhar funções fisiológicas quanto por seus efeitos
deletérios. Tais espécies abrangem radicais livres derivados do oxigênio tais como superóxido
(•O2-), hidroxil (OH
•), peroxil (ROO
•) e alcoxil (RO
•) e também derivados não radicais do
oxigênio como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Devido à sua alta reatividade, quando não
neutralizadas, as ERO podem modificar e causar danos em diversos componentes celulares
como proteínas, lipídios e DNA (HALLIWELL, 2007; FRANÇA et al., 2013; RAJENDRAN
et al.; 2014).
Estudos recentes relatam que a microbiota intestinal também deve ser levada em
consideração no desenvolvimento da obesidade (BRAHE; ASTRUP; LARSEN, 2013;
CLAVEL et al., 2014; FERNANDES et al., 2014; GERARD, 2016; LOO et al., 2017; CANI;
JORDAN, 2018). A microbiota intestinal humana é composta de aproximadamente 100
trilhões de bactérias envolvendo mais de mil espécies, em relação de simbiose com o
organismo, aos quais mais de 90% dessa composição bacteriana são representados por
Bacterioides e Firmicutes. Uma vez estabelecida, a microbiota do intestino humano pode ser
vista como um órgão metabólico que afeta a regulação da energia, a sensibilidade à insulina, o
armazenamento de gordura e o peso corporal (CLARKE et al., 2014; ANDRADE et al.,
2015).
Pessoas obesas e magras apresentam microbiotas distintas. A microbiota intestinal
saudável e microbiologicamente equilibrada resulta em um desempenho normal das funções
fisiológicas do hospedeiro. De fato, as bactérias intestinais são capazes de formar os ácidos
graxos de cadeia curta – tais como o acetato, o butirato e o propionato – pela fermentação dos
carboidratos não digeríveis bem como outros nutrientes essenciais, no cólon, exercendo
efeitos benéficos sobre o peso corporal, a homeostase da glicose e a sensibilidade à insulina
44
(STEFE; ALVES; RIBEIRO, 2008; BAOTHMAN et al., 2016; SAAD; SANTOS; PRADA,
2016).
A obesidade altera a natureza da microbiota intestinal, o que eleva à modificação
da regulação e armazenamento de energia obtida a partir dos nutrientes, e afeta a adiposidade
através da influência da microbiota no metabolismo do hospedeiro, interferindo no sistema
imunológico, na alteração da barreira de mucosa intestinal, na expressão de fatores
inflamatórios e no desencadeamento de endotoxemia metabólica (elevados níveis de
lipopolissacarídeos sanguíneo), diabetes mellitus e resistência à insulina. Assim, hábitos de
vida como consumo de dietas hipercalóricas, por exemplo, faz com que a microbiota intestinal
de indivíduos obesos apresentem peculiaridades que possam induzir processos inflamatórios
(DIBAISE et al., 2008, LEY, 2010; SANTACRUZ et al., 2010).
3.5.3. Modelos experimentais de obesidade induzida por dieta hiperlipídica
A gordura é o nutriente dietético com a maior densidade energética, pois fornece
9,0 kcal por grama, enquanto que os carboidratos e as proteínas fornecem apenas 4,0 kcal.
Deste modo, o aumento da ingestão de gordura pode promover um alto consumo de energia e,
por essa razão, é considerada um dos fatores que mais contribuem para a atual epidemia de
obesidade. Embora o consumo de uma dieta rica em gordura seja apenas uma hipótese para a
causa da obesidade, os fatores genéticos também desempenham um papel importante
(KLAUS, 2005; BROWN et al., 2010; PICCHI et al., 2011).
No intuito de auxiliar na compreensão da fisiopatologia da obesidade e avaliar
possíveis tratamentos para a síndrome metabólica, foram desenvolvidos vários modelos
experimentais de obesidade. Dietas hipercalóricas têm sido comumente utilizadas em ensaios
experimentais de obesidade, objetivando mimetizar efeitos orgânicos associados à
adiposidade. Neste sentido, a promoção de obesidade em roedores a partir de dietas
hiperlipídicas almeja reproduzir o comportamento alimentar humano (BURNEIKO et al.,
2006). Este modelo em particular é extremamente útil nas pesquisas com obesidade em
animais de laboratório devido à sua grande semelhança com a gênese e com as respostas
metabólicas decorrentes da obesidade em humanos (ROSINI; SILVA; MORAES, 2012).
O impacto do consumo excessivo de uma dieta rica em lipídios, denominado dieta
high-fat (HF), foi estudado nos últimos anos (GANCHEVA et al., 2015; LIMA et al., 2016;
MARQUES et al., 2016; SUMAN et al., 2016; BATISTA et al., 2017; MONTALVANY-
ANTONUCCI et al. 2017). Estas dietas são geralmente compostas por ácidos graxos
saturados e seu consumo está associado à obesidade, alterações metabólicas e inflamação
45
sistêmica. Vários modelos experimentais foram empregados, havendo, entre eles, variações
em decorrência da composição da dieta, concentração de lipídios e períodos experimentais
(MONTALVANY-ANTONUCCI et al. 2017).
Muitos pesquisadores têm desenvolvido diferentes tipos de dietas com alto teor de
gordura, que variam entre 20 e 60% da energia total. A fonte de lipídeos pode ser óleos
vegetais (milho, soja ou azeite de oliva) ou gorduras derivadas de animais (sebo de bovino e
banha de porco). As dietas hiperlipídicas têm sido amplamente utilizadas para induzir
síndrome metabólica e obesidade em animais. Estudos também indicaram que a dieta rica em
gordura é eficaz na promoção da hiperglicemia, resistência à insulina, dislipidemia e aumento
nos níveis de ácidos graxos livres no sangue, de forma independente ou simultânea
(HALADE et al., 2010; XU et al., 2013; WONG et al. 2016).
A quantidade e tipo de ácidos graxos na dieta podem modular vias de sinalização
celular e desta forma alterar o metabolismo. O consumo de dietas hiperlipídicas em roedores é
relacionado à hipertrofia do tecido adiposo, alterações no metabolismo de lipídios e aumento
do estoque de triacilgliceróis em células não adiposas. A associação destes fatores causa
alteração na sensibilidade à insulina e consequentemente redução da captação de glicose pelos
tecidos periféricos (LOTTENBERG et al., 2012). Dietas ricas em ácidos graxos poli-
insaturados, especialmente ω-3 e ω-9, estão associadas a efeitos anti-inflamatórios,
imunorreguladores e hipolipemiante. Por outro lado, gorduras trans e saturadas são
conhecidas por promover a hipertrigliceridemia e hiperinsulinemia, e reduzir os níveis de
colesterol HDL e elevar os de colesterol LDL (GAÍVA et al., 2001; 2003; BENOIT et al.,
2009). Além disso, o excesso de lipídios provenientes da dieta pode alterar a composição da
membrana celular dos adipócitos, modular a transcrição de diferentes genes envolvidos na
lipólise e lipogênese e alterar o padrão de produção e secreção de adipocinas (WONG et al.
2016).
De acordo com Ando e Fujita (2009), a indução da obesidade por meio de dieta
hiperlipídica em ratos aumenta o estresse oxidativo, e o mecanismo ao qual se atribui tal
efeito é a produção de adipocinas, como o Fator de Necrose Tumoral Alfa (TNF-α) e
interleucina-6 (IL-6), pelos adipócitos. A elevada produção de ERO pode também induzir um
quadro de resistência à insulina e o consumo de drogas antioxidantes demonstram melhorar a
resistência insulínica.
Alguns estudos têm demonstrado a eficácia da ingestão de dietas hiperlipídicas na
gênese da obesidade e de suas comorbidades, principalmente em roedores da linhagem
Sprague-Dawley e Wistar. Estas linhagens podem ser consideradas como padrão para este
46
tipo de experiência, uma vez que são suscetíveis à obesidade induzida pela dieta e à
resistência à insulina com variações individuais (MARQUES et al., 2016). Animais da
linhagem Wistar (peso médio de 200 gramas) foram utilizados em estudos de obesidade
induzida por dietas por Gancheva et al. (2015). Após 8 semanas experimentais, os
pesquisadores observaram que a ingestão de dieta hiperlipídica aumentou os níveis de
triglicerídeos e colesterol LDL e reduziu os níveis de colesterol HDL, resultando em baixa
sensibilidade à insulina, em comparação ao grupo controle. Comportamento semelhante foi
observado por Yao et al. (2015) com ratos Sprague-Dawley (180-220 g), após 10 semanas
experimentais
Marques et al. (2016) estudaram, paralelamente, ratos das linhagens Wistar e
Sprague-Dawley (7 semanas de idade), durante 17 semanas para avaliar os efeitos
metabólicos provocados pelo consumo de dieta high-fat, em comparação com uma dieta
padrão. Os resultados obtidos mostraram que ambas as linhagens podem ser utilizadas como
modelos para ensaios de obesidade e que a ingestão da dieta hiperlipídica promoveu aumento
na ingestão calórica, no peso corporal e nos níveis de adipocinas no plasma e redução na
tolerância à glicose, sendo que estes efeitos foram mais rapidamente detectados nos ratos
Wistar.
.
3.6. POTENCIAL BIOLÓGICO DO α-TERPINEOL
Atualmente, tem-se verificado valiosos avanços envolvendo os metabólitos
derivados de plantas em vários processos farmacológicos e bioquímicos. Os monoterpenos
têm representado uma nova classe de agentes químicos com elevado potencial terapêutico
Uma substância dessa classe que vem despertando grande interesse é o α-terpineol (BICAS et
al., 2011).
O α-terpineol, assim como os diversos derivados oxigenados de monoterpenos, é
reconhecido por sua nota aromática agradável e também por suas atividades antimicrobiana,
antitumoral, antioxidante e anti-inflamatória já relatados (JUN; JEONG; HO, 2006). Estudos
evidenciaram atividades biológicas importantes do α-terpineol, como atividade
antiproliferativa in vitro frente a linhagens celulares de adenocarcinoma da mama (MCF-7) e
leucemia mielóide crônica (K-562), evidenciando-se nesse caso, uma maior especificidade
que o limoneno (BICAS et al., 2011). Hassan et al. (2010) mostraram que α-terpineol inibiu o
crescimento das células tumorais de pulmão humana (NCI-H69), carcinoma coloretal humano
(HCT-116) adenocarcinoma ileocecal humana (HCT-8), câncer de pulmão (H69AR) mieloma
47
(RPMI 8226), pelo mecanismo que envolve a inibição da rota do NF-κB (Nuclear Factor-
Kappa B), associada a processos inflamatórios. Noor, Astuti e Mustofa (2014) avaliaram a
citotoxicidade do α-terpineol e seus efeitos na apoptose. Os resultados mostraram que o α-
terpineol apresentou citotoxicidade contra a célula HeLa com um valor IC50 de 12,46 μg.mL-1
,
sendo um potencial antitumoral nestas células.
Quanto à ação antimicrobiana, Park et al. (2012) avaliaram a ação do α-terpineol
contra bactérias cariogênicas e periodontogênicas. Os valores de mínima concentração
inibitória (MIC) e bactericida (MBC) encontrados pelos pesquisadores variaram entre 0,1 a
0,8 mg. mL-1
. Li et al. (2014) encontraram valores de MIC e MBC, contra Escherichia coli,
de 0,78 µL. mL-1
. O α-terpineol apresentou também atividade antifúngica contra
Trichophyton mentagrophytes, na concentração de 0,2 mg.mL-1
, por difusão em Agar
Sabouraud Dextrose (PARK et al., 2009) e Geotrichum citri-aurantii, cuja MIC e mínima
concentração fungicida (MFC) encontradas no estudo foram 2,0 e 4,0 μL.mL-1
,
respectivamente (ZHOU, TAO; JIA, 2014). Estudos de Jing et al. (2015) mostraram que o
crescimento micelial de Penicillium digitatum foi fortemente inibido pelo α-terpineol, com a
MIC e a MFC de 2,00 e 8,00 μL.mL-1
, respectivamente.
Atividade antioxidante também é relatada para o α-terpineol. Este monoterpeno
inibiu a peroxidação lipídica em 80%, na concentração de 0,02% (v/v) e reduziu, em 10 vezes,
a liberação de ânions superóxido em cultura de células leucêmicas, em concentrações
inferiores a 0,02% (v/v) (MARÓSTICA JÚNIOR et al., 2009). Bicas et al., 2011 avaliaram a
atividade antioxidante do α-terpineol pelo método ORAC, e obtiveram valor de 2,72 µmol de
Trolox equivalente por µmol de α-terpineol, semelhante ao determinado para o antioxidante
sintético BHA (2,43 mol de Trolox equivalente. µmol-1
de BHA). O α-terpineol mostrou ser
um forte agente quelante de íons Fe2+
, em estudos de Di Sotto et al. (2013). Este efeito foi
dependente da concentração e atingiu o valor de cerca de 98,1% a 0,6 mM. A quelação do íon
ferroso é uma forma indireta de atividade antioxidante, por proteger as células do dano
oxidativo do DNA, induzido pela produção de espécies reativas ao oxigênio, o pode estar
envolvida também na antimutagenicidade da substância.
Efeito anti-inflamatório foi verificado pela inibição da formação de citocinas IL-6
em células epiteliais bucal, quando exposta a suco de laranja, em testes in vitro (HELD;
SCHIEBERLE; SOMOZA, 2007). Nogueira et al. (2014) encontraram a mesma conclusão
sobre a atividade anti-inflamatória do α-terpineol pela redução na produção de IL-10 e and IL-
1β.
48
Outros benefícios do α-terpineol também são relatados na literatura: efeito
gastroprotetor em modelos experimentais de úlcera gástrica induzida por etanol em ratos
Wistar, tratados oralmente (gavagem) com doses de 30 e 50 mg. kg-1
(SOUZA et al., 2011),
efeito protetor contra convulsão induzida por pentileno-tetrazol, na dosagem de 100 mg. kg-1
de α-terpineol, injetada em ratos Swiss machos (SOUSA; QUINTANS JÚNIOR; ALMEIDA,
2007), proteção contra agressão nociceptiva, apresentando efeito analgésico em ratos Swiss na
dose de 25 mg. kg-1
, injetados na região subplantar da pata traseira direita (QUINTANS-
JÚNIOR et al., 2011; OLIVEIRA et al. 2012). Resultados obtidos por Sabino et al. (2013),
após de sete dias experimentais, mostraram que a administração oral de α-terpineol nas doses
de 25, 50 e 100 mg. kg-1
, produziu uma hipotensão acentuada em ratos Wistar hipertensos
induzidos por L-NAME (N-(G)-nitro-L-arginina metil ester) quando comparados com animais
do grupo controle. Houve uma redução dos níveis das enzimas antioxidantes catalase e
glutationa peroxidase nos animais hipertensos em comparação com o controle, mas após a
administração do α-terpineol, os níveis destas enzimas apresentaram-se semelhantes aos do
grupo controle. Segundo os autores, resultados podem ser atribuídos a potencial atividade
antioxidante do α-terpineol contra lesões causadas por radicais livres.
Goto et al. (2010), descreveram que vários terpenoides bioativos, dentre eles o
farnesol, geraniol e geranilgeraniol, podem ser úteis para o tratamento de distúrbios
metabólicos induzidos pela obesidade, como diabetes tipo 2, hiperlipidemia, resistência à
insulina e doenças cardiovasculares, devido à capacidade de ativação dos receptores ativados
por proliferadores de peroxissoma (PPARs) do tecido adiposo, que são fatores de transcrição
pertencentes à família de receptores nucleares que regulam a homeostase da glicose,
metabolismo de lipídeos e inflamação.
Ensaios clínicos com álcool perílico, um composto terpênico obtido pela
biotransformação do limoneno, foram realizados por pesquisadores da Universidade Federal
Fluminense e Universidade Federal do Rio de Janeiro. Os testes foram conduzidos em
pacientes com diferentes gliomas malignos em estado terminal. A terapia adotada foi baseada
na administração por inalação direta de álcool perílico 0,3%, quatro vezes ao dia durante
quatro semanas. Resultados mostraram que alguns pacientes revelaram regressão do tumor
(FONSECA et al., 2006; FONSECA et al., 2008). Outro estudo investigou a administração de
álcool perílico (288±32 dias) em oito pacientes com câncer pancreático. Foi observada a
redução do tamanho do tumor em função do mecanismo de apoptose celular. Embora não
tenha sido demonstrada significância estatística, os pacientes apresentaram uma sobrevida
maior de 84 dias quando comparado ao grupo controle (MATOS et al., 2008).
49
Tomaz-Morais et al. (2017) estudaram os efeitos antinociceptivos do (S)-(-)-
álcool perilílico na nocicepção orofacial em ratos Swiss machos, utilizando testes de dor
induzidos por formalina, capsaicina e glutamato na área direita do lábio superior. Para cada
teste, oito animais por grupo foram pré-tratados intraperitonealmente com álcool perílico (50
e 75 mg.kg-1
), morfina (5 mg.kg-1
) ou veículo (solução salina + Tween 80 0,2%). O álcool
perílico foi capaz de bloquear o comportamento nociceptivo orofacial em ambas as doses
testadas, e similar à morfina.
Apesar de constar na literatura relatos de atividade antioxidante, antitumoral e
anti-inflamatória e potencial no tratamento da síndrome metabólica de compostos terpênicos,
ainda são escassos os estudos acerca da atividade biológica de outros derivados da
biotransformação desses compostos, a saber, alguns derivados do limoneno, como o α-
terpineol. Vale ressaltar que ainda há muitas lacunas no mecanismo de ação do α-terpineol
contra os efeitos adversos da obesidade, que devem ser preenchidas, e desta forma novas
abordagens para o estudo de seu efeito e ação são necessárias para uma melhor compreensão
de seu potencial terapêutico.
50
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. PRODUÇÃO DE R-(+)-α-TERPINEOL E (-)-α-TERPINEOL POR
BIOTRANSFORMAÇÃO
4.1.1. Micro-organismos e reagentes
A cepa microbiana utilizada neste estudo foi o Pseudomonas fluorescens NCIMB
11671, reclassificado como Sphingobium sp. (BICAS et al., 2010b), que foi reativada e
mantida em meio YM (em g.L-1
: Agar = 20; glicose = 10; peptona = 5; extrato de levedura =
3; extrato de malte = 3, pH ~ 6,7) em estufa a 30°C de temperatura. R-(+)-limoneno (Sigma-
Aldrich, 96% de pureza) e S-(-)-limoneno (Sigma-Aldrich, 96% de pureza), em óleo de soja
(grau comercial) como fase orgânica, foram utilizados como substrato na biotransformação.
Hexano (Dinâmica, 99% de pureza) e acetato de etila (Synth, 100% de pureza) foram
utilizados na etapa de purificação dos enantiômeros R-(+)- e (-)-α-terpineol produzidos na
biotransformação. Etanol (Synth, 95% de pureza), e n-decano foram utilizados na extração e
análise de identificação em cromatógrafo a gás.
4.1.2. Preparo da pré-cultura
Três alçadas da cultura de células previamente cultivadas por 48 horas em placa
de Petri foram transferidas para um Erlenmeyer de 500 mL contendo 1,0 g de glicose, 0,25 g
de (NH4)2SO4, 5,0 mL da solução de Hutner, 10 mL de solução A, e 235 mL de água
destilada. A solução de Hutner foi preparada, inicialmente, pela dissolução do 2,5 g de ácido
nitrilotriacético em água destilada (cerca de 200 mL) e o pH da solução foi ajustado para um
valor maior ou igual a 8,0 por adição de grânulos de hidróxido de potássio. Após a dissolução
completa, os outros sais foram adicionados (8,2 g de MgSO4. 7 H2O; 3,9 mg de (Na)2MoO4.
2H2O ; 19,6 mg de FeSO4. 1,5H2O), além de 13,9 mL de meio mineral (em g. L-1
:
MgSO4.7H2O = 0,5; NaNO3 = 3,0; K2HPO4 = 1,0; KCl = 0,5 e Fe2SO4 = 0,001). O pH foi
reajustado para 7,2 e o volume total foi completado para a 250 mL com água destilada. Já a
solução A consistiu de 6,5 g de K2HPO4 e 8,28 g de KH2PO4, em 200 mL de água destilada.
A pré-cultura foi incubada em shaker a 30°C e 200 rpm por 24 horas (BRUNIERE et al.,
1987; FONTANILLE, 2002; FONTANILLE; LE FLÈCHE; LARROCHE, 2002; BICAS et
al., 2010a).
51
4.1.3. Produção do biocatalisador
Uma alíquota de 20 mL de pré-cultura foi transferida assepticamente para outro
Erlenmeyer de 500 mL contendo o mesmo meio descrito em 4.1.2., exceto a glicose, que foi
substituída pela solução contendo 500 μg de R-(+)-Limoneno ou S-(-)-Limoneno em 12,5 mL
de óleo de soja (concentração de 40 g. L-1
). Os frascos foram mantidos em incubadora a 30 ºC
e 200 rpm por 48 horas. Em seguida, o meio de cultura foi centrifugado a 2600g por 10
minutos, resultando na biomassa produzida, a qual foi ressuspendida em tampão fosfato 20
mM e pH 7,0, até alcançar a densidade ótica igual a 10 a 600 ηm (DO600), a qual foi
congelada (-18°C) para os futuros ensaios.
4.1.4. Procedimentos de biotransformação em sistema bifásico
Para a produção dos enantiômeros R-(+)- e (-)-α-terpineol, a partir de R-(+)-
limoneno e S-(-)-limoneno, respectivamente, foram utilizadas as melhores condições de
processo estudadas por Molina (2014). A biomassa congelada (37,5 mL) e 12,5 mL de fase
oleosa (350 g. L-1
de R-(+)-limoneno ou S-(‒)-limoneno em óleo de soja) foram transferidos
para um Erlenmeyer de 250 mL. Os frascos foram incubados a 28°C e 200 rpm por 72 horas,
para produção de R-(+)-α-terpineol, ou 120 horas, no caso da produção de (-)-α-terpineol
(BICAS et al., 2010c). Após a biotransformação, as amostras foram centrifugadas a 2600g por
5 minutos a 5 °C, sendo descartada a fase aquosa, e os produtos da biotransformação foram
extraídos da fase oleosa por agitação manual como o mesmo volume de etanol, até separação
em duas fases. A fração etanólica foi analisada, por cromatografia gasosa com detecção por
ionização em chama, e utilizada para obtenção do α-terpineol (item 4.1.5).
Os enantiômeros produzidos foram analisados em cromatógrafo a gás HP-7890A
(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) equipado com detector de ionização de chama
(GC-FID). Uma coluna capilar HP-5 (30 m de comprimento x 0,25 mm de diâmetro interno x
0,25 μm de espessura) foi utilizada e hélio foi o gás de arraste percorrendo a coluna a uma
taxa constante de 1,0 mL min-1
. A temperatura do forno foi mantida a 80 °C durante 3
minutos, elevada à taxa de 20 °C. min-1
até 200 °C e mantido por 4 minutos. As temperaturas
do injetor e do detector foram mantidas em 250 °C.. R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol
(frações etanólicas) foram identificados após adição de 1,0% (v/v) de n-decano como padrão
interno e acrescentando sulfato de sódio para remoção de água, e injetando-se 1 μL no
cromatógrafo a gás (razão de Split de 1:10). Análises quirais foram feitas no mesmo
cromatógrafo gasoso, equipado com coluna quiral β-DEX 120 (60 m de comprimento x 0,25
mm de diâmetro interno x 0,25 μm de espessura), seguindo a mesma programação já descrita.
52
4.1.5. Purificação dos produtos da biotransformação
Os extratos etanólicos (item 4.1.4) foram rotaevaporados a 40°C sob vácuo.
Limoneno e α-terpineol, contidos no óleo resultante, foram separados por meio da técnica de
cromatografia em coluna aberta, conforme método descrito por Madyastha e Renganathan
(1984), com adaptações. Para a separação cromatográfica foi utilizada, como fase
estacionária, sílica gel 60 (Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha) previamente ativada em
estufa a 105°C por 3 horas. A fase móvel consistiu da mistura composta de hexano: acetato de
etila na proporção de 9:1. Para o preenchimento da coluna de vidro (coluna de 15 cm de
altura) foi utilizado o mesmo volume das fases móvel e estacionária, e agitando a coluna para
retirada das bolhas de ar, de forma a compactá-la o máximo possível.
Uma vez que as amostras não apresentam coloração, testes preliminares foram
feitos em colunas de 20 mm de diâmetro (47 mL de fase estacionária), adicionando 0,7 mL de
amostra (mistura de padrões de limoneno e α-terpineol na proporção de 1:1) na coluna,
recolhendo-se frações de 2,0 mL de eluente, e analisando-as em cromatógrafo gasoso (item
4.1.4), a fim de determinar o intervalo de separação dos enantiômeros de limoneno e α-
terpineol, por meio do volume de fase móvel utilizado.
Estabelecidos os intervalos de eluição dos enantiômeros de α-terpineol, o mesmo
procedimento foi realizando, transpondo o experimento para uma coluna de 37 mm de
diâmetro, mantendo os 15 cm de altura da coluna (160 mL de fase estacionária). Alíquotas de
5 mL de amostra (mistura de padrões de limoneno e α-terpineol na proporção de 1:1) foram
adicionadas à coluna a cada corrida e, imediatamente, as frações de 5,0 mL de eluente foram
recolhidas e monitoradas por cromatografia a gás (item 4.1.4). Definidas as frações que
continham apenas o α-terpineol, o procedimento foi repetido com todo o volume de amostra
(5 mL por coluna), recuperando apenas as frações de interesse. As frações que ainda
continham mistura de limoneno e α-terpineol foram novamente adicionadas à coluna em uma
nova corrida, até que o α-terpineol presente na mistura fosse totalmente extraído. Por fim, as
frações contendo um mesmo enantiômero do α-terpineol foram reunidas e o solvente foi
removido por evaporação à temperatura ambiente, em capela de fluxo laminar. Os produtos
obtidos foram analisados por cromatografia gasosa (item 4.1.4) e armazenados a -18°C até o
momento do uso. O excesso enantiomérico dos enantiômeros do α-terpineol foi definido
como a razão (R - S)/(R + S) x 100, onde R e S são as concentrações dos enantiômeros de α-
terpineol (ELIEL; WILEN; MANDER, 1994; TEMBA; OLIVEIRA; DONNICI; 2003).
53
4.2. ENSAIO BIOLÓGICO
4.2.1. Animais
Para realização do ensaio biológico foram utilizados 48 ratos Sprague-Dawley
machos, com 21 dias de idade e peso inicial aproximado de 150 g, provenientes do Centro
Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência de Animais de Laboratório
(CEMIB/UNICAMP). Os ratos foram distribuídos aleatoriamente em grupos, contendo 8
tratamentos com 6 repetições.
Figura 7: Ratos Sprague Dawley mantidos em gaiolas individuais em sala, sob condições
ambientais controladas.
Os animais foram mantidos em gaiolas de crescimento individuais (Figura 7) e
submetidos a um período de adaptação e aclimatação (7 dias), consumindo dieta comercial
(Labina, Purina, Paulínia, SP, Brasil), às condições do Laboratório de Ensaios Biológicos
(LEB/UNICAMP), com temperatura controlada (21 3C), e sob ciclo claro/escuro de 12
horas, e com água e alimentação sob o sistema de livre acesso.
54
4.2.2. Dietas
As dietas foram elaboradas no Laboratório de Ensaios Biológicos
(LEB/UNICAMP), de acordo com a definição da American Institute of Nutrition (AIN-93G),
para roedores em crescimento. O grupo controle magro (AIN) consumiu dieta normolipídica e
o grupo controle obeso (HF) recebeu a dieta AIN-93G modificada para hiperlipídica (Tabela
2), com 35% de gordura, das quais 31% provenientes de banha de porco e 4% de óleo vegetal
(REEVES, 1997). Para a elaboração das dietas hiperlipídicas contendo R-(+)- e (-)-α-
terpineol, foram acrescidos 25, 50 e 100 mg. kg-1
de dieta, de cada enantiômero, no óleo de
soja (Tabela 2). Estas concentrações estudadas são inferiores ao NOAEL (No Observed
Adverse Effect Level), que para o α-terpineol é 200 mg. Kg-1
(API et al., 2017). O NOAEL
corresponde a maior concentração ou quantidade de aditivo, em mg. Kgpc-1
, determinada
experimentalmente, que não causa reações adversas no organismo exposto (WHO, 1996).
A Tabela 3 apresenta a composição centesimal das dietas, determinada por meio
de análises de umidade (105°C), proteínas e cinzas, segundo métodos da Association of
Official Analytical Chemists (AOAC, 2006); e lipídeos (BLIGH; DYER, 1959). O teor de
carboidratos (inclusive a fibra alimentar total) foi calculado pela diferença entre 100 e a soma
das porcentagens de água, proteína, lipídeos e cinzas. O cálculo do valor energético foi
estimado (kcal), a partir dos teores em proteínas, lipídeos e carboidratos, de acordo com o
sistema Atwater, utilizando os coeficientes específicos (carboidratos e proteínas 4,0 kcal.g-1
e
lipídeos 9,0 kcal.g-1
) (MERRIL; WATT, 1973; FAO, 2003; NEPA, 2011).
35
Tabela 3. Composição das dietas (g. kg-1
de dieta)
Ingredientes (g) Grupos*
AIN HF S25 S50 S100 R25 R50 R100
Caseína 145,0 145,0 145,0 145,0 145,0 145,0 145,0 145,0
Amido de milho 452,5 269,0 269,0 269,0 269,0 269,0 269,0 269,0
Amido de milho dextrinizado 132,0 77,0 77,0 77,0 77,0 77,0 77,0 77,0
Sacarose 100,0 58,5 58,5 58,5 58,5 58,5 58,5 58,5
Fibras (celulose) 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0
Mistura mineral 35,0 35,0 35,0 35,0 35,0 35,0 35,0 35,0
Mistura vitamínica 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0
L-cistina 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
Bitartarato de colina 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Tert-butil hidroquinona (TBHQ) 0,014 0,014 0,014 0,014 0,014 0,014 0,014 0,014
Óleo de soja 70,000 40.000 39.975 39.950 39.900 39.975 39.950 39.900
Gordura animal - 310,0 310,0 310,0 310,0 310,0 310,0 310,0
α-terpineol - - 0,025 0,050 0,100 0,025 0,050 0,100
Total 1000,014 1000,014 1000,014 1000,014 1000,014 1000,014 1000,014 1000,014
*Grupos suplementados - S25: dieta hiperlipídica acrescida de 25 ppm de (-)-α-terpineol; S50: dieta hiperlipídica acrescida de 50 ppm de (-)-α-terpineol;
S100: dieta dieta hiperlipídica acrescida de 50 ppm de (-)-α-terpineol; R25: dieta hiperlipídica acrescida de 25 ppm de R-(+)-α-terpineol; R50: dieta
hiperlipídica acrescida de 50 ppm de R-(+)-α-terpineol; R100: dieta hiperlipídica acrescida de 100 ppm de R-(+)-α-terpineol (Tabela 4).
55
36
Tabela 4. Composição centesimal das dietas (g. 100g-1
)
Resultados apresentados como média ± desvio padrão (n=3). Médias nas linhas seguidas por letras iguais não diferem entre si ao nível de 5% de significância pelo Teste de
Tukey. Grupos controle normolipídico (AIN) e hiperlipídico (HF) e grupos hiperlipídicos suplementados com 25 ppm de R-(+)-α-terpineol (R25) e (-)-α-terpineol (S25), 50
ppm de R-(+)-α-terpineol (R50) e (-)-α-terpineol (S50) e 100 ppm de R-(+)-α-terpineol (R100) e (-)-α-terpineol (S100). ns
Não significativo pelo teste de Tukey no nível de 5% de probabilidade.
Análise Grupos
AIN HF S25 S50 S100 R25 R50 R100
Umidade 8,10±0,06a 5,20±0,39
b 5,10±0,08
b 4,70±0,06
c 4,50±0,02
d 4,50±0,12
d 4,40±0,47
de 4,30±0,14
e
Proteínans
13,10±0,76 12,60±0,25 12,70±0,25 12,60±0,22 12,90±0,55 12,80±0,77 12,50±0,33 12,40±0,23
Cinzasns
2,90±1,48 2,30±0,35 2,90±0,04 3,00±0,13 3,00±0,07 3,00±0,15 2,80±0,02 2,90±0,09
Lipídeos 15,10±0,91b 38,00±0,87
a 36,30±0,43
a 37,80±0,19
a 36,70±0,22
a 37,10±0,09
a 37,00±0,07
a 37,20±0,41
a
Carboidratos 60,80±3,21a 41,90±1,86
b 43,00±1,60
b 41,90±1,20
b 42,90±1,72
b 42,60±2,32
b 43,30±1,78
b 42,90±1,74
b
Valor calórico
(kcal. 100g-1
) 431,5±1,61
b 560,00±1,39
a 554,50±11,27
a 558,20±7,39
a 555,30±12,66
a 555,50±13,17
a 556,20±9,07
a 555,30±10,87
a
56
57
4.2.3. Procedimento experimental
O experimento foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de
Animais (CEUA/UNICAMP), sob protocolo n° 3843-1 (Anexo 1). Após 7 dias de adaptação,
os animais foram divididos em 2 grupos: magro (n=6) alimentado com dieta AIN-93G e
obeso (n=42) alimentado com a dieta AIN-93G modificada para hiperlipídica. Os animais
foram alimentados com a dieta hiperlipídica por 5 semanas para o desenvolvimento da
obesidade, objetivando ganho de peso e alterações no metabolismo glicídico e lipídico. Após
este período, os animais do grupo obeso foram divididos, aleatoriamente, em 7 grupos com 6
ratos (Tabela 4), e mantidos por mais 6 semanas experimentais consumindo as dietas
suplementadas com R-(+)-α-terpineol ou (-)-α-terpineol, totalizando 12 semanas de
experimento. É importante enfatizar que houve necessidade de refazer o ensaio biológico
apenas para os grupos controle normolipídico e hiperlipídico, no sentido de ajustar a
quantidade de dieta a ser fornecida a estes animais. Para o grupo controle magro (AIN), foram
fornecidas a mesma quantidade de dieta consumida pelos animais do grupo controle obeso
(HF – pair feeding), de maneira a igualar o consumo alimentar de ambos os grupos, durante
todo o ensaio biológico.
Tabela 5. Descrição dos grupos experimentais
Grupo Identificação Dieta
Controle normolipídico AIN AIN 93G
Controle hiperlipídico HF AIN 93G + gordura
Grupo hiperlipídico
[R-(+)-α-terpineol]
R25 AIN-93G + gordura + 25 ppm de R-(+)-α-terpineol
R50 AIN-93G + gordura + 50 ppm de R-(+)-α-terpineol
R100 AIN-93G + gordura + 100 ppm de R-(+)-α-terpineol
Grupo hiperlipídico
[(-)-α-terpineol]
S25 AIN-93G + gordura+ 25 ppm de (-)-α-terpineol
S50 AIN-93G + gordura + 50 ppm de (-)-α-terpineol
S100 AIN-93G + gordura + 100 ppm de (-)-α-terpineol
Ao final das 12 semanas experimentais, os animais foram colocados em jejum de
12 horas, e então sacrificados por exsanguinação por meio de punção cardíaca, após anestesia
com cloridrato de quetamina (doses de 40 a 87 mg. Kg-1
) e cloridrato de xilazina (doses de 5 a
13 mg. Kg-1
) administrados por via intraperitoneal.
58
As amostras de sangue (10 mL) foram obtidas por punção cardíaca, sob anestesia,
e armazenadas em tubos de polietileno, com e sem anticoagulante, previamente identificados.
Para a separação do soro e plasma, as amostras foram centrifugadas a 3000 rpm por 15
minutos. Posteriormente, soro e plasma foram separados e congelados até o momento das
análises.
Após a exsanguinação, sob anestesia, os órgãos: coração, fígado, rins, baço, ceco
e tecidos adiposos marrom e epididimal foram retirados, limpos com solução fisiológica
(0,9% de NaCl) e pesados. Após a pesagem, alíquotas de aproximadamente 100 mg de fígado
de cada animal foram coletadas e armazenadas em formalina para avaliação histológica, após
coloração das lâminas com hematoxilina e eosina, e os fígados remanescentes foram
congelados em nitrogênio líquido e armazenado em ultrafreezer (-80°C) para análises futuras.
4.2.4. Ganho de peso e consumo alimentar
A determinação do peso corporal foi realizada uma vez por semana, de forma a
minimizar a manipulação e estresse dos animais, em balança semi-analítica, com precisão de
0,1 g. As dietas foram fornecidas ad libitum em quantidade conhecida, exceto para o grupo
AIN (pair feeding HF), que recebeu a mesma quantidade de dieta (em massa) do grupo HF. A
cada 48 horas, as sobras de dieta, bem como o rejeito separado das fezes das bandejas foram
pesados. Desta forma, foi calculado o consumo semanal de dieta de cada animal, por meio da
diferença entre a quantidade de dieta ofertada e as sobras (de dieta e rejeito nas bandejas). Já a
ingestão semanal de α-terpineol, para cada animal, foi calculada pela razão entre quantidade
da substância ingerida na dieta e o peso corporal (kg).
4.2.5. Testes de tolerância à glicose e à insulina
Após um período de 12 horas de jejum, na penúltima semana do ensaio biológico,
os animais foram submetidos ao teste de tolerância à glicose (GTT) e, na última semana
experimental, ao teste de sensibilidade à insulina (ITT), segundo metodologia de Vinué e
González-Navarro (2015). A glicemia dos animais foi aferida em diferentes tempos, em
ambos os testes, após a administração de glicose ou insulina intraperitoneal, cujas quantidades
aplicadas variavam em função do peso dos animais.
Para o GTT, o volume de solução de glicose (20% m/v) requerida para injeção
intraperitoneal em cada animal foi calculado de maneira que a dose final de glicose fosse de
2,0 g. kg-1
de peso corporal. Após a administração da glicose, um pequeno corte na ponta da
59
cauda dos animais foi feito para coleta de sangue e aferição da glicemia em tiras inseridas em
medidor digital de glicose (FreeStyle Lite, Abbott, Alameda, CA, USA). Foram aferidos os
níveis glicêmicos antes da injeção da solução de glicose, ou seja, a glicemia de jejum e após
30, 60, 90 e 120 minutos da administração da solução de glicose. Os resultados do teste foram
expressos pelo cálculo da área sob a curva (AUC) (MATHEWS et al., 1990).
No ITT, o volume calculado de insulina a ser injetado, em cada animal, foi de 5,0
U. kg-1
de peso de cada animal. A primeira coleta sanguínea foi realizada antes da
administração de insulina, sendo então realizadas coletas de sangue após 15, 30, 45, 60, 90 e
120 minutos da administração da insulina, conforme descrito anteriormente. A razão da
constante de decaimento (coeficiente angular) da glicemia (KITT) foi calculada por meio da
fórmula 0,693/(T1/2), sendo T1/2 o tempo necessário para reduzir a glicemia basal à metade. O
T1/2 da glicose sérica foi calculado a partir da inclinação da curva de decaimento da glicose
durante sua fase linear (BONORA et al., 1989).
4.2.6. Parâmetros bioquímicos
Estudos bioquímicos do sangue e soro foram realizados por meio de metodologias
colorimétricas utilizando kit comercial, de acordo com as instruções do fabricante. O perfil
lipídico foi avaliado por meio da dosagem de triglicerídeos (Wiener lab 1780101, Rosario,
Argentina), colesterol total (Wiener lab 1220001, Rosario, Argentina) e colesterol LDL
(Wiener lab 1220220, Rosario, Argentina). Para averiguar possíveis danos hepáticos foram
avaliados os níveis das enzimas alanina aminotransferase – ALT (Wiener lab 1761302,
Rosario, Argentina) e aspartato aminotransferase – AST (Wiener lab 1751302, Rosario,
Argentina) por método enzimático-colorimétrico. As citocinas inflamatórias (TNFα e IL-1β)
foram avaliadas por ensaio imunoenzimático por meio de kit Elisa (Peprotech
, Rocky Hill,
CT, USA).
4.2.7. Peroxidação lipídica (TBARS)
Determinações das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (thiobarbituric
acid reactive substances - TBARS) no soro e tecido hepático foram feitas segundo Ohkawa,
Ohishi e Yagi (1979), com adaptações. Para o fígado, 10 mg de tecido liofilizado foi
trituradas em 1 mL de tampão acetato (pH 3,5) para obtenção dos homogenatos. A
concentração de proteínas nos homogenatos dos tecidos foi determinada pelo método
Bradford (BRADFORD, 1976), utilizando albumina de soro bovino como padrão. As
amostras de tecido ou de soro (100 µL) foram misturadas com dodecil sulfato de sódio (SDS)
60
8,1% e reagente de trabalho (2-ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,8%, ácido acético 20% e
hidróxido de sódio 5%). Após aquecimento a 95 °C por 60 minutos, as amostras
permaneceram em banho de gelo por 10 minutos e foram centrifugadas a 10000 g, por
10 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a sua absorbância foi medida a 532 nm, utilizando
microplaca de 96 poços. Curva padrão (0,625–50 nmol malondialdeído. mL−1
) foi obtida
utilizando padrão 1,1,3,3-tetraethoxipropano. Os resultados foram expressos em nmol MDA
(malondialdeído). mg-1
tecido ou nmol MDA. mL−1
soro.
4.2.8. Análise histológica em tecido hepático
A avaliação histológica das amostras de tecido hepático foi realizada no
Laboratório de Biologia da Reprodução, do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional
(Instituto de Biologia/UNICAMP). Após o preparo das amostras em monoblocos de parafina,
montagem das lâminas e coloração em hematoxilina e eosina, as imagens destas foram
obtidas utilizando o fotomicroscópio Nikon Eclipse E-400 (Nikon, Tóquio, Japão), com
aumento de 40X. As estruturas do tecido hepático e suas alterações microscópicas foram
observadas e foi realizada uma análise descritiva das características morfológicas observadas.
4.2.9. Análise estatística
Os resultados obtidos foram apresentados em média desvio padrão. Para os
dados com distribuição normal foi aplicado teste estatístico paramétrico (ANOVA e Teste
Tukey) com nível de significância de 5% (p<0,05). Para os dados que não apresentam
distribuição normal, teste não paramétrico foi aplicado, Kruskal-Wallis seguido de Dunn. As
análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad
Software, Inc., La Jolla, CA, USA).
4.3. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA IN VITRO DE R-(+)-α-
TERPINEOL E (-)-α-TERPINEOL
4.3.1. Preparo das suspensões celulares e aplicação das amostras
A atividade antiproliferativa das amostras foi realizada segundo o protocolo
descrito por Monks et al. (1991). Dez linhagens de células tumorais humanas (Tabela 5),
gentilmente cedidas pelo Instituto Nacional do Câncer/EUA, foram mantidas em cultura em
meio RPMI 1640 (GIBCO BRL) suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB) e
61
penicilina:estreptomicina (1000 U. mL-1
:1000 µg. mL-1
, 1%). As mesmas condições foram
utilizadas para manutenção das linhagens não tumorais de queratinócitos humanos (HaCat,
doada pelo prof. Dr. Ricardo Della Coletta, Faculdade de Odontologia de Piracicaba,
Unicamp). Os testes foram realizados na Divisão de Farmacologia e Toxicologia do
CPQBA/UNICAMP.
Tabela 6. Linhagens celulares utilizadas nos estudos in vitro.
Linhagem celular Órgão/Doença Densidade de Inoculação
(x 104
células. mL-1
)
U251 SNC; glioma 4,0
MCF-7 Mama; adecarcinoma 6,0
NCI-ADR/RES* Ovário; adenocarcinoma 5,0
786-0 Rim; adenocarcinoma 5,0
NCI-H460 Pulmão; carcinoma tipo não pequenas
células
4,0
PC-3 Próstata; adenocarcinoma 4,5
OVCAR-3 Ovário; adenocarcinoma 7,0
HT29 Cólon; adenocarcinoma 5,0
UACC-62
Melanoma; adenocarcinoma 5,0
K562 Medula óssea; Leucemia mielóidecrônica 6,0
HaCaT Pele (queratinócito); não tumoral 4,0
*Esta linhagem apresenta resistência a múltiplos fármacos.
As células dispostas em placas de 96 compartimentos (100 µL. mL-1
de suspensão
celular, densidade de inoculação, conforme Tabela 7) foram expostas a quatro concentrações
(0,25; 2,5; 25 e 250 µL. mL-1
) dos enantiômeros [R-(+)- e S-(–)] de Limoneno e [R-(+)- e (–)]
α-terpineol (Figura 8), previamente diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO, 100 mg. mL-1
) e
incubadas por 48 horas a 37 °C, em atmosfera úmida com 5% de CO2.
No momento de adição das amostras, as células inoculadas na placa controle T0
foram fixadas com a adição de 50 μL/compartimento de ácido tricloroacético (TCA) a 50%
(Sigma-Aldrich®) para determinação da quantidade de células presentes no momento em que
as amostras foram aplicadas, sendo este o valor basal no tempo 0. Com base em resultados
anteriores, sabe-se que a concentração final de DMSO (<0,25%) não interfere na viabilidade
62
celular. Ao final de 48 horas de incubação, as células tratadas foram fixadas com TCA a 50%
e incubadas por 1 hora, a 4ºC. Em seguida, as placas foram submetidas a quatro lavagens
consecutivas em água corrente para a remoção dos resíduos de TCA, meio SFB e metabólitos
secundários.
Figura 8. Representação gráfica da distribuição das amostras na placa de 96 compartimentos
utilizada no teste de atividade antiproliferativa in vitro.
(Fonte: Torre, 2013)
Após secagem completa, à temperatura ambiente, foram adicionados 50
μL/compartimento do corante proteico sulforrodamina B (SRB, Sigma-Aldrich®) a 0,4 %
(p/v) dissolvido em ácido acético a 1 % (v/v) e, a seguir, as placas foram incubadas à
temperatura ambiente, por 10 minutos. As placas foram então lavadas por 4 vezes
consecutivas com solução de ácido acético 1% (v/v) e, após secagem completa à temperatura
ambiente, o corante ligado às proteínas celulares foi solubilizado com 150 μL/compartimento
de Trizma Base (10 μM, pH 10,5) (Sigma-Aldrich®). A leitura espectrofotométrica da
absorbância foi realizada em leitor de microplacas a 540 nm (Molecular Devices®, modelo
VersaMax).
4.3.2. Análise dos resultados
A partir da média das leituras espectrofotométricas, foi calculado o crescimento
celular (%C) para cada concentração de amostra testada, por meio das seguintes fórmulas:
63
Se T > T1 → a amostra estimulou o crescimento celular
Se T0≤ T< T1 → atividade citostática da amostra: %C = 100 x [(T-T0)/( T1-T0)]
Se T< T0 → atividade citocida: %C = 100 x [(T-T0)/ T0]
Sendo T a média da absorbância da célula tratada, T0 a média das absorbâncias
das células no tempo 0 e T1 a absorbância das células não tratadas após 48 h de incubação.
Esses resultados foram expressos em curvas de crescimento celular de cada
linhagem em função da concentração da amostra, e a partir deles foram calculadas as
concentrações efetivas TGI (Total Growth Inhibition, concentração necessária para inibição
total de crescimento celular) e GI50 (concentração necessária para inibição de 50% da
viabilidade celular), através de regressão não linear, tipo sigmoidal, empregando-se software
ORIGIN 8.0 (OriginLab Corporation).
64
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. PRODUÇÃO DE R-(+)-α-TERPINEOL E (-)-α-TERPINEOL POR
BIOTRANSFORMAÇÃO
Os resultados obtidos da biotransformação, em sistema bifásico, mostraram que a
enzima responsável pela conversão dos substratos para o -terpineol foi capaz de converter
enantioespecificamente R-(+)- e S-(–)-limoneno para R-(+)- e (–)--terpineol,
respectivamente, embora tenha ocorrido um decréscimo no rendimento de conversão, em
relação aos estudos de Molina (2014) e Bicas et al. (2010b). O decréscimo na conversão é um
indício de que a capacidade de biotransformação do Sphingobium sp. pode ser afetada de
forma negativa pela manutenção do micro-organismo ou devido a repiques periódicos. Deste
modo, uma fração considerável de substrato da biotransformação (limoneno) permaneceu no
óleo de soja, sendo necessária a purificação para isolamento do -terpineol produzido.
A Tabela 7 apresente os resultados das concentrações dos produtos obtidos da
biotransformação do limoneno. Após 72 horas R-(+)-limoneno converteu-se, parcialmente,
gerando aproximadamente 151,0 g. L-1
de R-(+)--terpineol, enquanto o S-(–)-limoneno
gerou, aproximadamente, 91,0 g. L-1
de (–)--terpineol, após 120 horas.
Tabela 7. Tempo de retenção e concentrações de produtos após 72 horas (no caso do R-(+)-
limoneno) e 120 horas (no caso do S-(–)-limoneno) de biotransformação dos enantiômeros do
limoneno.
Biotransformação do R-(+)-limoneno Biotransformação do S-(–)-limoneno
R-(+)-
limoneno
residual
R-(+)--
terpineol
S-(–)--
terpineol
S-(–)-
limoneno
residual
R-(+)--
terpineol
S-(–)--
terpineol
Conc.* (g. L-1
) 147,5 151,0 4,2 133,6 50,0 91,0
TRCQ** (min) - 27,1 - - - 26,7
Prop.*** (%) 2,7 94,5 2,8 1,5 33,9 64,6
e**** (%) 94,2 31,5
* Concentração de produtos após a biotransformação.
**Tempo de retenção na coluna quiral.
***Proporção de produtos (% em área em CG) após biotransformação, extração, concentração (rotaevaporador)
e purificação em coluna aberta.
**** Excesso enantiomérico do α-terpineol purificado em coluna aberta.
65
Os produtos finais da biotransformação, contendo os enantiômeros de limoneno e
α-terpineol foram purificados por meio de cromatografia em coluna aberta, em sílica gel e
utilizando-se como eluente uma mistura de hexano: acetato de etila (9:1). Inicialmente, estes
produtos apresentaram-se como óleo levemente amarelado, provavelmente pelos carotenoides
oriundos do óleo de soja. A cromatografia em coluna é uma das técnicas mais utilizadas para
a separação ou purificação de produtos de reações químicas; além de ser muito versátil, pois
permite a utilização de colunas de diferentes tipos e dimensões, assim como combinações de
diversas fases móveis e estacionárias. Essa técnica pode ser realizada em colunas de vidro,
sob pressão atmosférica, ou com equipamentos especiais que permitem trabalhar com
pressões maiores, o que consequentemente aumenta a velocidade e a eficiência do processo de
separação (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006).
A Figura 9 apresenta a curva de separação de limoneno e α-terpineol, contidos no
óleo resultante da biotransformação do limoneno, demontrando que o método cromatográfico
escolhido foi eficiente na separação dos compostos. Os substratos eluíram antes que os
produtos, uma vez que o limoneno é mais apolar e, portanto, apresenta maior afinidade com a
fase móvel. Considerando a polaridade do -terpineol, pela presença de grupos hidroxila, e
sua maior afinidade pela fase estacionária de sílica gel, para a separação completa de ambos
os enantiômeros foi utilizado, aproximadamente, o dobro do volume de fase móvel utilizado
na separação do limoneno. Assim, houve apenas uma pequena fração com coeluição do
limoneno e -terpineol (200 mL). Como pode ser observado (Figura 9), o α-terpineol
purificado foi obtido juntando-se as frações referentes aos volumes 210 a 560 mL.
Depois de recuperadas as frações ricas em α-terpineol, o solvente (fase móvel) foi
eliminando e o produto resultante foi caracterizado por cromatografia gasosa com coluna
quiral. Observou-se que o produto da biotransformação de R-(+)-limoneno, aqui chamado R-
(+)-α-terpineol, apresentava 94,5% do isômero R-(+)-, 2,8% de S-(–)- α-terpineol e 2,7% de
limoneno residual, de forma que o produto tinha 97,3% de pureza de α-terpineol com um
excesso enantiomérico de 94,2% da forma R. Já o produto da biotransformação do S-(–)-
limoneno, aqui chamado (–)-α-terpineol, indicou a presença de 64,6% do isômero S-(–)- e
33,9% de R-(+)-α-terpineol, além de 1,5% de limoneno residual, de forma que o produto tinha
98,5% de pureza de α-terpineol com um excesso enantiomérico de 31,5% da forma S.
66
Figura 9: Curvas de separação de R-(+)-limoneno e R-(+)-α-terpineol (A), e S-(–)-limoneno
(–)-α-terpineol (B) do óleo resultante da biotransformação do limoneno, obtidas por
cromatografia em coluna de vidro contendo sílica gel e eluida com hexano e acetato de etila
(9:1).
Os resultados indicaram que a pureza enantiomérica dos produtos obtidos por
biotransformação está superior aos padrões comerciais disponíveis para o α-terpineol, o que
justifica a produção destes compostos pela biotransformação do limoneno. O padrão de α-
terpineol Sigma-Aldrich, por exemplo, apresenta um excesso enantiomérico de 16% para a
forma S, enquanto que o padrão (+)-α-terpineol da marca Fluka tem 30% de excesso
enantiomérico para a forma R. Sendo assim, é bastante vantajoso para a indústria de alimentos
e aromas a obtenção de compostos enantiomericamente puros por biotransformação. Tais
A
B
67
compostos apresentam características sensoriais mais atrativas e são mais valorizados no
mercado que os aditivos químicos artificiais, pois atende à demanda do consumidor por
produtos com apelo de saudabilidade (AKACHA; GARGOURI, 2015; BERGER, 2015).
5.2. AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DOS ANIMAIS
5.2.1. Consumo alimentar dos animais
Na Figura 10A e Tabela 10 estão apresentados os dados sobre ingestão semanal
de dieta dos animais durante o período experimental. Os animais do grupo HF apresentaram
maior ingestão energética, em comparação com os demais tratamentos, durante todo o
experimento.
A partir da segunda semana de experimento, verificou-se uma redução
significativa da ingestão alimentar nos animais alimentados com dieta hiperlipídica, refletindo
também em uma queda na ingestão energética (Figura 10B e Tabela 11). Dentre as hipóteses
para esta redução estariam o efeito sacietógeno desta dieta, bem como a diferença de
consistência entre as dietas normolipídica (sólida) e hiperlipídica (pastosa), a qual parece
exercer alguma influência na morfologia da mandíbula e dente dos ratos. Dietas pastosas
podem retardar ou inibir o desenvolvimento dos músculos mastigatórios, bem como reduzir o
desgaste dos dentes incisivos que crescem continuamente, pelo pouco estímulo funcional da
mastigação, se comparada com dietas sólidas (GUERREIRO et al. 2013). Sendo assim, na
quarta semana de experimento, foram fornecidos aos animais dos grupos hiperlipídicos
pequenos blocos de madeira, previamente higienizados e esterilizados. Isso foi feito para que
estes animais não tivessem crescimento dentário que prejudicasse a ingestão alimentar.
68
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
6
8
10
12
14
16
18
20
S25
S50
S100
AIN
HF
R25
R50
R100
Semana
Co
ns
um
o (
g d
ia-1
)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1130
40
50
60
70
80
90
100
AIN
HF
S25
S50
S100
R25
R50
R100
Semana
Ing
es
tão
ca
lóri
ca
(k
ca
l d
ia-1
)
Figura 10. Consumo alimentar (A) e ingestão calórica semanal dos animais (B). Resultados
expressos como média ± desvio padrão (n=6 por grupo). Grupos controle normolipídico
(AIN) e hiperlipídico (HF) e grupos hiperlipídicos suplementados com 25 ppm de R-(+)-α-
terpineol (R25) e (-)-α-terpineol (S25), 50 ppm de R-(+)-α-terpineol (R50) e (-)-α-terpineol
(S50) e 100 ppm de R-(+)-α-terpineol (R100) e (-)-α-terpineol (S100).
O enriquecimento ambiental (inclusão dos blocos de madeira) pode ter
contribuido na melhoria da alimentação de alguns animais antes da suplementação das dietas
com os enantiômeros do α-terpineol. Com a suplementação das dietas, a partir da sexta
semana, os enantiômeros do α-terpineol possivelmente poderiam ter modificado a
palatabilidade das dietas para estes animais, e consequentemente influenciado também no
consumo alimentar dos mesmos. A inclusão de (–)-α-terpineol na dieta de animais
alimentados com dieta hiperlipídica não promoveu alterações significativas no consumo e
nem na ingestão calórica dos animais. O mesmo também foi observado para os animais
alimentados com a dieta hiperlipídica contendo 25 mg.kg-1
de R-(+)-α-terpineol, os quais
apresentaram consumo médio (em gramas e em kcal) inferior ao dos animais do grupo
A
B
69
controle normolipídico (AIN) durante todo o período experimental. Já nos animais que
consumiram as dietas hiperlipídicas contendo 50 e 100 mg.kg-1
de R-(+)-α-terpineol, mesmo
com melhorias no consumo com o enriquecimento ambiental, também apresentaram um
aumento significativo no consumo alimentar após a mudança da dieta, reestabelecendo o
consumo de dieta e de ingestão calórica, semelhante ao do grupo HF.
6 7 8 9 10 11
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
S25
S50
S100
R25
R50
R100
Semana
Ing
es
tão
de
-te
rpin
eo
l (m
g. k
g-1
se
m -
1)
# #
Figura 11. Ingestão semanal de α-terpineol, em relação ao peso corporal dos animais.
Resultados expressos como média±desvio padrão (n=6 por grupo). Grupos controle
normolipídico (AIN) e hiperlipídico (HF) e grupos hiperlipídicos suplementados com 25 ppm
de R-(+)-α-terpineol (R25) e (-)-α-terpineol (S25), 50 ppm de R-(+)-α-terpineol (R50) e (-)-α-
terpineol (S50) e 100 ppm de R-(+)-α-terpineol (R100) e (-)-α-terpineol (S100). #
Diferença
estatística significativa (p<0,05) entre os grupos R100 e S100, nas semanas 6 e 7. One way,
ANOVA, com pós-teste de Tukey (n=6 por grupo).
No geral, a ingestão dos enantiômeros do α-terpineol (Figura 11 e Tabela 12) foi
proporcional à concentração presente nas dietas. O grupo R100, um dos que apresentou
maiores valores de consumo alimentar, ingeriu mais R-(+)-α-terpineol do que os animais que
consumiram as mesmas concentrações de (–)-α-terpineol contidas na dieta, entre a sexta e
sétima semanas de testes. A partir dos dados de consumo e ingestão dos enantiômeros de α-
terpineol apresentados, o reestabelecimento dos níveis de ingestão nos animais que
consumiram dietas contendo concentrações superiores a 50 mg.kg-1
de dieta de (-)-α-terpineol
pode sugerir algum efeito na alteração do apetite dos animais (Figura 10A). Tal efeito pode
estar relacionado à palatabilidade das dietas, bem como na modulação de vias de sinalização
70
do apetite na região do hipotálamo responsáveis pelo controle alimentar (SIMPSON;
MARTIN; BLOOM, 2009; SUZUKI; JAYASENA; BLOOM, 2012; SCHNEEBERGER;
GOMIS; CLARET, 2014). Tal efeito precisaria ser investigado para melhor esclarecimento
dos resultados observados.
5.2.2. Peso corporal dos animais
A Figura 12A apresenta a curva de crescimento ponderal média dos animais ao
longo das 12 semanas de experimentação, baseado no ganho de peso corporal dos ratos.
Iníc
io
Semana 1
Semana 2
Semana 3
Semana 4
Semana 5
Semana 6
Semana 7
Semana 8
Semana 9
Semana 1
0
Semana 1
1100
200
300
400
500
AINHFS25S50S100R25R50R100
Pe
so
co
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ral (
g)
AIN H
FS25 S50
S100
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R50
R10
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0
100
200
300
400 a
b
a
ab
cc
c
c
Ga
nh
o t
ota
l d
e p
es
o (
g)
Figura 12. Evolução semanal do peso corporal de ratos Sprague Dawley submetidos a
diferentes tratamentos durante 12 semanas experimentais (A) e ganho total de peso dos
animais (B). Resultados expressos como média ± desvio padrão. Letras diferentes indicam
diferença estatística significativa (p<0,05). One way, ANOVA, com pós-teste de Tukey (n=6
por grupo). Grupos controle normolipídico (AIN) e hiperlipídico (HF) e grupos hiperlipídicos
suplementados com 25 ppm de R-(+)-α-terpineol (R25) e (-)-α-terpineol (S25), 50 ppm de R-
(+)-α-terpineol (R50) e (-)-α-terpineol (S50) e 100 ppm de R-(+)-α-terpineol (R100) e (-)-α-
terpineol (S100).
A
B
71
Não foi observada diferença estatística no peso inicial dos animais. A evolução do
ganho de peso semanal dos animais evidenciou um maior ganho de peso nos ratos do grupo
controle hiperlipídico (HF), devido a maior ingestão alimentar e energética dos mesmos. Os
resultados apresentados (Figura 12B) mostram uma diferença entre os enantiômeros de α-
terpineol. Infere-se que a suplementação das dietas hiperlipídicas com (–)-α-terpineol e com
25 mg.kg-1
de dieta de R-(+)-α-terpineol exerceu menor influência no ganho de peso nos
animais (menor ingestão calórica), comparados aos animais dos grupos R50 e R100, cujo
ganho de peso foi semelhante ao do grupo HF, o que pode estar associado à ao
enriquecimento ambiental e palatabilidade das dietas (item 5.2.1).
5.2.3. Pesos dos tecidos
O peso dos tecidos é um parâmetro utilizado para avaliar possíveis alterações
metabólicas em resposta ao tratamento aplicado, uma vez que alterações morfológicas de uma
diminuição ou um aumento no peso bruto dos tecidos pode alterar funções vitais no
organismo. Os dados sobre peso relativo dos órgãos, em relação ao peso total dos animais
estão apresentados na Figura 13. Os resultados dos grupos controle normolipídico e
hiperlipídico mostraram que a dieta hiperlipídica promoveu alteração no peso relativo dos
órgãos, como o aumento significativo no tecido adiposo epididimal nos animais do grupo HF
em relação aos do grupo AIN (Figuras 13F e 13G), bem como na redução nos valores de peso
relativo do coração, rins e ceco (Figuras 13A, 13C e 13E).
A suplementação das dietas com os enantiômeros do -terpineol reverteu a
redução do peso relativo do coração, exceto para o grupo R25 (Figura 13A), reverteu o
aumento de peso relativo do tecido marrom (Figura 13F) e diminuiu o peso relativo do fígado
(Figura 13B), independente da concentração testada. Nos grupos tratados com (–)-α-terpineol
e com 25 mg.kg-1
de dieta de R-(+)-α-terpineol houve a reversão da redução do peso relativo
do ceco (Figura 13E), além do aumento no peso relativo dos rins (Figura 13C) e redução no
tecido adiposo epididimal (Figura 13G), ambos em comparação ao grupo AIN. A
suplementação das dietas com concentrações de R-(+)-α-terpineol acima de 50 mg.kg-1
reverteu a redução de peso relativo dos rins e o ganho de peso no tecido adiposo epididimal.
A reversão do ganho de peso do tecido adiposo epididimal promovida pelo consumo dos
enantiômeros α-terpineol pode estar associada à menor resistência à insulina (Figura 15)
apresentada por estes animais (LÊ et al., 2011; HOCKING et al., 2013)
72
Coração
AIN HFS25
S50S100
R25R50
R1000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
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b bP
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g. 1
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)
Fígado
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FS25 S50
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R50
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3
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-1)
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S50S100
R25R50
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. 100
g-1
)
Baço
AIN H
FS25 S50
S100
R25
R50
R10
0
0.0
0.1
0.2
0.3
Pe
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. 1
00
g-1
)
Ceco
AIN H
FS25 S50
S100
R25
R50
R10
0
0.000
0.005
0.010
0.015
aaa a
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Pe
so
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. 1
00
g-1
)
Tecido adiposo marrom
AIN H
FS25 S50
S100
R25
R50
R100
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
a
abab
bc bc bc bc
c
Pe
so
(g
. 10
0g
-1)
Tecido adiposo epididimal
AIN H
FS25 S50
S100
R25
R50
R100
0
1
2
3
4
b
a
c cc
c
bb
Pe
so
(g
. 10
0g
-1)
Figura 13. Peso relativo do coração (A), fígado (B), rins (C), baço (D), ceco intestinal (E),
tecido adiposo marrom (F), tecido adiposo epididimal (G), corrigido em relação ao peso
corporal total dos animais. Resultados expressos como média ± desvio padrão. Letras
diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05). One way, ANOVA, com pós-
teste de Tukey (n=6 por grupo). Grupos controle normolipídico (AIN) e hiperlipídico (HF) e
grupos hiperlipídicos suplementados com 25 ppm de R-(+)-α-terpineol (R25) e (-)-α-terpineol
(S25), 50 ppm de R-(+)-α-terpineol (R50) e (-)-α-terpineol (S50) e 100 ppm de R-(+)-α-
terpineol (R100) e (-)-α-terpineol (S100).
A B
C D
E F
G
73
A literatura relata que a intervenção hiperlipídica, em experimentos de obesidade
induzida por dieta, mostra-se relacionada com modificações metabólicas e morfológicas do
coração (OUWENS et al., 2005; LEOPOLDO et al., 2010; HALADE; JIN; LINDSEY, 2012;
SILVA et al. 2014; MARTINS et al., 2015) e rins, causando dilatação e disfunção tubular,
inflamação e insuficiência renal crônica (ALTUNKAYNAK et al., 2008; DEJI et al., 2009;
KIM et al., 2010). Mateus e Fiorino (2012) relataram existir alterações renais, como redução
do peso renal e diminuição do tubo glomerular, em ratos Wistar tratados com dieta
hiperlipídica. Outros estudos também relataram a ação dos terpenos no metabolismo em
humanos e animais (LEWIS et al., 1994; KOHLERT et al., 2000; PANEL et al., 2008;
ADAMS et al., 2011).
5.2.4. Testes de tolerância à glicose e sensibilidade à insulina
Para avaliar o efeito da suplementação com os enantiômeros de α-terpineol na
resposta glicêmica frente a uma sobrecarga de glicose foi realizado o teste de tolerância à
glicose (GTT). A Figura 14A apresenta a média dos valores da concentração de glicose em
cada ponto de coleta realizada durante o GTT. Não houve diferença significativa nos valores
de glicemia basal (T0) entre os tratamentos (p<0,05). Em todos os grupos experimentais, o
pico de glicemia ocorreu aos 30 minutos após a injeção intraperitoneal da solução de glicose,
e as concentrações de glicose começaram a decair após este tempo. A ingestão de dietas
hiperlipídicas influenciou na resposta ao teste, induzindo uma maior intolerância à glicose, se
comparada ao grupo AIN (Figura 14B). Embora a maioria dos grupos suplementados
apresentem valores de GTT que não diferiram estatisticamente do grupo controle
hiperlipídico, a tendência é de piora neste parâmetro, observada principalmente no grupo S50,
cujo valor obtido no teste foi superior ao do grupo HF. Uma hipótese para a piora no GTT
seria os altos níveis de triglicerídeos e colesterol total e LDL (Figura 16) destes animais, o que
comprometeria a tolerância à glicose dos mesmos (KLAUS, 2005).
74
0 30 60 90 1200
2000
4000
6000
AIN
HF
S25
S50
S100
R25
R50
R100
Tempo (min)
Glico
se (M
)
AIN H
FS25
S50
S10
0R25
R50
R10
0
0
100000
200000
300000
400000
500000
aab ab ab ab
b b
c
GT
T (
AU
C)
Figura 14. Teste de tolerância à glicose. Curva de controle da glicemia durante 120 minutos
(A), em µM de glicose, após injeção intraperitoneal de solução de glicose e área sob a curva
da glicemia durante o GTT (B). Resultados expressos como média ± desvio padrão. Letras
diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05). One way, ANOVA, com pós-
teste de Tukey (n=6 por grupo). Grupos controle normolipídico (AIN) e hiperlipídico (HF) e
grupos hiperlipídicos suplementados com 25 ppm de R-(+)-α-terpineol (R25) e (-)-α-terpineol
(S25), 50 ppm de R-(+)-α-terpineol (R50) e (-)-α-terpineol (S50) e 100 ppm de R-(+)-α-
terpineol (R100) e (-)-α-terpineol (S100).
A interpretação da constante de decaimento da glicose (KITT), no teste de
tolerância à insulina, baseia-se na velocidade e intensidade da queda da glicemia. Quanto mais
rápida e intensa a queda, maior a sensibilidade à ação da insulina. O índice corresponde à
queda da glicemia expressa em %. min-1
, e quanto maior o valor do KITT maior a sensibilidade
à insulina (GELONEZE; TAMBASCIA, 2006). No intuito de avaliar a resposta à insulina nos
animais submetidos às diferentes dietas, foi realizado o teste de sensibilidade à insulina. Foi
observado que alguns animais (17% do total de animais avaliados) que consumiram dieta
hiperlipídica suplementada com R-(+) e (–)-α-terpineol e dieta normolipídica apresentaram
hipoglicemia a partir de 90 minutos após injeção de insulina, e tiveram que receber glicose
por via oral. Nenhum dos animais do grupo controle hiperlipídico apresentou sintomas de
hipoglicemia sugerindo que tal dieta pode conferir resistência à ação da insulina (Figura 15).
O teste mostrou que a suplementação de dietas hiperlipídicas com doses acima de
50 mg.kg-1
de R-(+) e (–)-α-terpineol promoveu um aumento na sensibilidade à insulina dos
animais, representado pelos maiores valores de KITT, os quais não apresentaram diferença
significativa em relação ao grupo normolipídico. Tal teste sugere que este efeito não tem
relação com a configuração espacial da molécula de α-terpineol.
A B
75
AIN H
FS25
S50
S10
0R25
R50
R10
0
0
2
4
6
8
c
a
cbc
aab a
a
KIT
T (
% m
in -
1)
Figura 15. Índice de decaimento da glicose, KITT, calculada a partir das glicemias coletadas
no teste de tolerância à insulina. Resultados expressos como média ± desvio padrão. Letras
diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05). One way, ANOVA, com pós-
teste de Tukey (n=6 por grupo). Grupos controle normolipídico (AIN) e hiperlipídico (HF) e
grupos hiperlipídicos suplementados com 25 ppm de R-(+)-α-terpineol (R25) e (-)-α-terpineol
(S25), 50 ppm de R-(+)-α-terpineol (R50) e (-)-α-terpineol (S50) e 100 ppm de R-(+)-α-
terpineol (R100) e (-)-α-terpineol (S100).
A obesidade pode levar a diversas complicações no metabolismo da glicose, como
o desenvolvimento de hiperlipidemia, resistência insulínica, diabetes tipo 2, doenças
cardiovasculares, culminando na síndrome metabólica (BASTIEN et al., 2014; LÓPEZ-
JARAMILLO et al., 2014). Por esse motivo, foi pesquisado se a indução da obesidade por
dieta e a inserção dos enantiômeros do α-terpineol nas mesmas poderia afetar a homeostase da
glicose. Os dados dos grupos que consumiram dieta hiperlipídica corroboram os dados da
literatura, os quais relatam alterações na homeostase da glicemia em virtude do consumo de
uma dieta com elevado teor de lipídeos. A adição dos enantiômeros do α-terpineol nas dietas
mostrou-se efetiva na redução dos danos causados pela dieta hiperlipídica, no que diz respeito
à homeostase da glicemia (Figura 15), indicando que o consumo dos mesmos pode favorecer
uma menor resistência à ação da insulina, nas doses de 50 e 100 mg.kg-1
na dieta. Porém,
atenção deve ser dada quanto à tendência ao aumento na intolerância à glicose ao suplementar
as dietas com os enantiômeros de α-terpineol.
5.2.5. Análises bioquímicas
5.2.5.1. Avaliação do perfil lipídico
Os valores de colesterol total e colesterol LDL estão representados nas Figuras
16A e 16B. Os dados mostram que a suplementação com (–)-α-terpineol elevou os níveis de
colesterol total e colesterol LDL, comparado com os demais grupos. A mesma tendência
76
também foi observada nos grupos que receberam dieta hiperlipídica suplementada com 25
mg. kg-1
de R-(+)-α-terpineol. Uma vez que enantiômeros podem apresentar diferenças em
suas propriedades biológicas, estes resultados podem sugerir que a mistura com excesso
enantiomérico de 31,5% de S-(-)-α-terpineol adicionada à dieta poderia estar agindo na
modificação da concentração das lipoproteínas aterogênicas, como a lipoproteína de baixa
densidade (LDL), no soro destes animais. Tal mecanismo precisa ser elucidado com estudos
moleculares mais específicos. Os níveis mais baixos de colesterol total e colesterol LDL
foram encontrados nos animais do grupo controle magro, enquanto que os animais dos grupos
R50 e R100 apresentaram valores um pouco maiores, mas que não foram estatisticamente
significativos em relação aos grupos controle.
AIN H
FS25
S50
S10
0R25
R50
R10
0
0
30
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90
120
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a
a
bc
a
b
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Co
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L-1
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AIN H
FS25
S50
S10
0R25
R50
R10
0
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20
40
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100 a
a
a a
bcbcb
c
Co
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L-1
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AIN H
FS25 S50
S100
R25
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40
60
80
100 a
b
aa a aaa
Tri
gli
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deo
s (
mg
. d
L-1
)
Figura 16. Níveis séricos de Colesterol total (A), Colesterol LDL (B) e Triglicerídeos (C) de
ratos Sprague-Dawley. Resultados expressos como média ± desvio padrão. Letras diferentes
indicam diferença estatística significativa (p<0,05). One way, ANOVA, com pós-teste de
Tukey (n=6 por grupo). Grupos controle normolipídico (AIN) e hiperlipídico (HF) e grupos
hiperlipídicos suplementados com 25 ppm de R-(+)-α-terpineol (R25) e (-)-α-terpineol (S25),
50 ppm de R-(+)-α-terpineol (R50) e (-)-α-terpineol (S50) e 100 ppm de R-(+)-α-terpineol
(R100) e (-)-α-terpineol (S100).
A B
C
77
É importante enfatizar também que tanto os monoterpenos quanto o colesterol são
sintetizados a partir do isopentenil pirofosfato (IPP) e dimetilalil pirofosfato (DMAP) pela via
do mevalonato (GOLDSTEIN; BROWN, 1974; BLOCH, 1992; CHAPPELL, 2012;
CERQUEIRA et al., 2016), o que de alguma forma pode estar relacionado com a interferência
nos níveis de colesterol total e colesterol LDL dos grupos suplementados obtidos neste
estudo. Estudos também mostram que terpenos são potentes inibidores da HMG-CoA
redutase, enzima chave que regula a biossíntese do colesterol (CLEGG et al., 1982; REN;
GOULD, 1994; POLO et al., 2013).
Os níveis de triglicerídeos no plasma (Figura 16C) foram superiores em todos os
grupos hiperlipídicos, comparado ao grupo magro AIN. A suplementação das dietas com os
enantiômeros do -terpineol não foi capaz de alterar este parâmetro. Estudos de Miao et al.
(2015) mostraram que ratos Sprague-Dawley tiveram os níveis de triglicerídeos e colesterol
plasmático aumentados ao receberem dietas hiperlipídicas por 6 semanas, resultado este que
corrobora aos observados no presente estudo.
5.2.5.2. Determinação das concentrações séricas das aminotransferases alanina
aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST)
Entre os indicadores do processo inicial de lesão do fígado estão as enzimas ALT
e AST. A ALT é encontrada principalmente no fígado e, em menor proporção, nos rins,
coração, pâncreas e pulmão. Por outro lado, a AST está amplamente difundida no organismo
em uma diversidade de tecidos tais como o fígado, coração, músculos, rim, e cérebro. Quando
algum desses órgãos é lesado, há um aumento nos níveis séricos destas enzimas, de forma
proporcional ao dano produzido, possibilitando a detecção dessas enzimas em amostras de
sangue (COUTO; VIEIRA; BARBOSA, 2008; STOCKEN et al., 2008; KIBA et al., 2014;
LEE et al., 2017).
Os valores médios da atividade sérica de AST e ALT, expressos em Unidades.L-1
,
encontram-se na Figura 17. Os níveis de ALT no grupo controle hiperlipídico (HF)
mostraram-se significativamente superiores (p<0,05) em relação aos demais grupos
experimentais, indicando que o consumo das dietas suplementadas com os enantiômeros do
-terpineol proporcionou maior proteção aos tecidos dos danos causados pela dieta
hiperlipídica. Vale ressaltar, que não foi observada diferença significativa entre os grupos que
consumiram as dietas hiperlipídicas suplementadas com os enantiômeros de α-terpineol
(Figura 17A). Isto sugere que o efeito protetor não tem relação com a configuração espacial
da molécula de α-terpineol, nem com a dose consumida dos enantiômeros de α-terpineol.
78
AIN H
FS25
S50
S10
0R25
R50
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0
0
5
10
15
20
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bc
b
cAL
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U. L
-1)
AIN H
FS25
S50
S10
0R25
R50
R10
0
0
20
40
60
a
c
bbbbb
b
AS
T (
U. L
-1)
Figura 17. Níveis séricos da alanina aminotransferase (A) e aspartato aminotransferase (B),
em ratos Sprague Dawley que receberam dieta normolipídica, hiperlipídica e hiperlipídica
suplementadas com enantiômeros de α-terpineol. Resultados expressos como média ± desvio
padrão. Letras diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05). One way,
ANOVA, com pós-teste de Tukey (n=6 por grupo). Grupos controle normolipídico (AIN) e
hiperlipídico (HF) e grupos hiperlipídicos suplementados com 25 ppm de R-(+)-α-terpineol
(R25) e (-)-α-terpineol (S25), 50 ppm de R-(+)-α-terpineol (R50) e (-)-α-terpineol (S50) e 100
ppm de R-(+)-α-terpineol (R100) e (-)-α-terpineol (S100).
Os resultados do presente estudo, relativo à AST (Figura 17B), mostraram um
aumento estatisticamente significante (p<0,05) na atividade desta aminotransferase no soro
dos animais que consumiram as dietas hiperlipídicas. Com relação ao consumo dos
enantiômeros, notamos que a dieta hiperlipídica suplementada com 100 mg. kg-1
de dieta de
(–)-α-terpineol promoveu um aumento significativo nos níveis séricos desta aminotransferase
dos animais em comparação aos outros grupos hiperlipídicos. Tal fato sugere que possa haver
um efeito adverso associado seletivamente a elevadas concentrações do enantiômero S do α-
terpineol. Correlacionado estes dados com aqueles da Figura 13, um potencial alvo para uma
possível ação tóxica do α-terpineol seriam os rins. Considerando que o NOAEL é
determinado em indivíduos saudáveis, infere-se que, nas condições de obesidade, a adição de
(–)-α-terpineol em concentrações superiores a 100 mg.kg-1
de dieta pode apresentar toxicidade
(API et al., 2017).
É documentada na literatura a relação da exposição à dieta hiperlipídica e o
aumento de transaminases e doença hepática em ratos adultos (DHIBI et al., 2011;
MANTING et al., 2011; SUNDARESAN et al., 2011; CASTRO et al., 2013). No presente
trabalho, a concentração das transaminases foi maior nos grupos hiperlipídicos, corroborando
os dados da literatura em relação aos efeito deletérios à saúde do consumo excessivo de
lipídio nas dietas. Vale ressaltar que a suplementação das dietas hiperlipídicas com os
enantiômeros de α-terpineol levou a uma redução significativa nos níveis séricos de alanina
A B
79
aminotransferase, indicando que tais compostos poderiam ter alguma participação na proteção
ao tecido hepático contra o acúmulo de lipídica (esteatose hepática).
5.2.6. Peroxidação lipídica (TBARS)
Os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) são
amplamente utilizados como indicadores da peroxidação de lipídios. Para estimar o grau de
estresse oxidativo, a concentração de malondialdeido (MDA) foi avaliada no soro e no tecido
hepático dos animais. Conforme pode ser observado na Figura 18A, o grupo HF apresentou
níveis séricos de TBARS significativamente superiores quando comparado ao controle
normolipídico. A suplementação com R-(+) e (–)-α-terpineol promoveu uma redução
significativa de 40 a 70% nos níveis destas substâncias, comparado ao grupo HF. Chama a
atenção também que as concentrações de MDA no soro nos animais dos grupos hiperlipídicos
S50, R50 e R100 são significativamente menores que os animais do grupo controle magro
AIN.
AIN H
FS25
S50
S10
0R25
R50
R10
0
0
2
4
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b
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a
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L-1
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R50
R10
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2
4
6
8 a
bb b b b b b
TB
AR
S (
nm
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MD
A m
g-1 t
ec
ido
)
Figura 18. Níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em soro (A) e
homogenato hepático (B) de ratos Sprague-Dawley que receberam dietas normolipídica e
hiperlipídica e dieta hiperlipídica suplementados com R-(+) e (–)-α-terpineol. Resultados
expressos como média ± desvio padrão. Letras diferentes indicam diferença estatística
significativa (p<0,05). One way, ANOVA, com pós-teste de Tukey (n=6 por grupo). Grupos
controle normolipídico (AIN) e hiperlipídico (HF) e grupos hiperlipídicos suplementados com
25 ppm de R-(+)-α-terpineol (R25) e (-)-α-terpineol (S25), 50 ppm de R-(+)-α-terpineol (R50)
e (-)-α-terpineol (S50) e 100 ppm de R-(+)-α-terpineol (R100) e (-)-α-terpineol (S100).
Os resultados obtidos na avaliação de TBARS no tecido hepático (Figura 18B)
mostram que a suplementação das dietas hiperlipídicas com os enantiômeros de α-terpineol
promoveu redução significativa nos níveis de TBARS, comparado ao grupo HF, e com
valores estatisticamente semelhantes aos animais do grupo controle normolipídico. Não houve
A B
80
diferença significativa entre os enantiômeros de α-terpineol, em todas as concentrações
testadas. A reversão foi independente da dose e do enantiômero estudado.
Estudos in vitro em sistemas homogêneos (solução de gema de ovo) haviam
indicado a capacidade de reduzir a peroxidação de lipídeos do (-)-α-terpineol (SILVA et al.;
2012). Nossos resultados mostraram que essa capacidade in vitro traduziu-se em efeito
protetor in vivo. O α-terpineol é um álcool de cadeia cíclica e ramificada que apresenta e, sua
estrutura um grupo hidroxila (OH), que pode estar associado à capacidade antioxidante do
mesmo (SILVA et al., 2012). Os resultados deste estudo parecem sugerir que o tanto R-(+)-α-
terpineol quanto o (–)-α-terpineol apresentam significativo impacto sobre a peroxidação
lipídica (sem seletividade), que pode ser atribuída à presença da hidroxila, que ao doar um
átomo de hidrogênio, converte os radicais livres em espécies menos reativas, e que estes
monoterpenoides podem exercer um efeito antioxidante protetor de biomoléculas lipídicas in
vitro. Tais resultados estão de acordo com estudos anteriores que mostram a ação antioxidante
in vitro do α-terpineol em diferentes ensaios (RAMALHO; JORGE, 2006; MARÓSTICA
JÚNIOR et al., 2009; BICAS et al., 2011; DI SOTTO et al., 2013).
5.2.7. Determinação dos níveis de citocinas TNF-α e IL-1β
A obesidade é um estado clínico de inflamação crônica de baixo grau
caracterizado pela produção de uma ampla variedade de mediadores bioquímicos, dentre eles
as citocinas pró-inflamatórias. Procurou-se, neste estudo, avaliar se a suplementação das
dietas com os enantiômeros de α-terpineol seria capaz de promover alterações nos níveis de
duas importantes citocinas: fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a interleucina 1β (IL-1β).
O aumento na liberação destas citocinas está diretamente ligado à resposta fisiológica
observada nos processos inflamatórios (LEE; LEE; CHOUE, 2013; ESSER et al., 2014),
assim como ao aumento do tecido adiposo característico da obesidade (SUO; WANG, 2015;
WU et al., 2016).
A citocina TNF-α está relacionada com respostas inflamatórias agudas e crônicas
e contribui no desenvolvimento de uma variedade de doenças inflamatórias crônicas, tais
como diabetes tipo 2, sendo produzida por vários tipos de células, especialmente macrófagos.
Esta citocina promove também a ativação de outras citocinas (IL-1β, IL-6 e IL-8). A IL-1β
também é uma potente citocina pró-inflamatória, e está envolvida em uma variedade de
atividades celulares, incluindo a proliferação celular, diferenciação e apoptose, além de
promover a progressão de uma série de doenças autoimunes (KAWAGUCHI;
MATSUMOTO; KUMAZAWA, 2011; ZHAO; ZHOU; SU, 2013; DENNY et al., 2014).
81
AIN H
FS25
S50
S10
0R25
R50
R10
0
0.00
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aa
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L-1
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AIN H
FS25
S50
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0R25
R50
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0
0.00
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0.25
a
bb
a
b bb
b
IL-1
(n
g m
L-1
)
Figura 19. Efeitos dos enantiômeros de α-terpineol nos níveis das citocinas pro-inflamatórias
TNF-α (A) e IL-1β (B) dos diferentes grupos experimentais. Resultados expressos como
média ± desvio padrão. Letras diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05).
One way, ANOVA, com pós-teste de Tukey (n=6 por grupo). Grupos controle normolipídico
(AIN) e hiperlipídico (HF) e grupos hiperlipídicos suplementados com 25 ppm de R-(+)-α-
terpineol (R25) e (-)-α-terpineol (S25), 50 ppm de R-(+)-α-terpineol (R50) e (-)-α-terpineol
(S50) e 100 ppm de R-(+)-α-terpineol (R100) e (-)-α-terpineol (S100).
A análise da Figura 19 mostra que os níveis de citocinas inflamatórias TNF-α e
IL-1β foram significativamente inferiores (p<0,05) nos grupos tratados com R-(+) e (–)-α-
terpineol em comparação aos grupos controle normolipídico e hiperlipídico. A concentração
do mediador inflamatório IL-1β não diferenciou significativamente entre os enantiômeros de
α-terpineol (Figura 19B), cuja expressão nos grupos experimentais foi independente das
diferentes concentrações utilizadas (25; 50 e 100 ppm).
Para os resultados de TNF-α (Figura 19A), observou-se uma diferença notável
entre os enantiômeros de α-terpineol. A suplementação das dietas com (–)-α-terpineol nas
diferentes concentrações proporcionou uma redução significativa estimada entre 60 e 70% no
nível sérico desta citocina quando comparada aos grupos AIN e HF. Já os ratos alimentados
com dietas contendo R-(+)-α-terpineol, a redução foi entre 30 e 40%, comparado aos grupos
controle magro e obeso.
Diante dos resultados obtidos (Figura 19), a suplementação das dietas com os
enantiômeros do α-terpineol, nas doses testadas, foi capaz de exercer nos animais uma ação
protetora contra o processo inflamatório, que pode estar relacionado à inibição da via de
sinalização celular NF-kB, que controla a transcrição de genes da maioria das citocinas
inflamatórias (HASSAN et al., 2010; NOGUEIRA et al., 2014). Somado a isto, os resultados
de TNF-α e IL-1β nos grupos controle normolipídico e hiperlipídico mostraram que a
diferença no peso e consumo alimentar destes dois grupos não foi suficiente para promover
uma diferença nos níveis destas duas citocinas.
A B
82
Estes resultados são importantes e bastante promissores, haja visto que não há na
literatura estudos sobre a ação do α-terpineol e de outros compostos terpênicos na inibição da
produção das citocinas pró-inflamatórias, em modelos experimentais de obesidade, e que estes
compostos podem indicar boa ação anti-inflamatória (HUO et al., 2013; NOGUEIRA et al.,
2014; CHEN et al., 2014; KIM et al., 2015; RAMALHO et al., 2015). Além disso, este efeito
protetor dos enantiômeros do α-terpineol sob a inflamação pode ser um dos fatores
relacionados à melhor resposta dos animais à insulina, observada no teste de ITT .
5.2.8. Análise histológica
O fígado é composto por células epiteliais, os hepatócitos, organizados em placas
e dispostos na unidade estrutural chamada lóbulo hepático. O acúmulo de gordura no interior
dos hepatócitos é um mecanismo natural, utilizado para armazenar energia. Entretanto, em
situações de sobrecarga, ocorre o acúmulo de gordura nos hepatócitos e, por conseguinte, o
desenvolvimento de disfunção hepática (MENDEZ-SANCHEZ et al., 2007; BERTRAM et
al., 2012).
A análise histológica do tecido hepático foi utilizada para avaliar o acúmulo de
gotículas lipídicas nos hepatócitos dos animais. Ratos alimentados com dieta normolipídica
apresentaram morfologia normal do tecido, com hepatócitos de estrutura hexagonal com
núcleos bem evidentes centralmente dispostos e sinusoides visíveis (setas pretas), sem
deposição de gordura (Figura 20A). Por outro lado, nos animais do grupo HF (Figura 20B) foi
observado maior acúmulo de gotas lipídicas no citoplasma dos hepatócitos, em relação aos
demais grupos experimentais, além da perda da identificação dos sinusóides hepáticos.
A ingestão dos enantiômeros de α-terpineol levou a uma redução no acúmulo de
gotículas lipídicas nos hepatócitos, em relação ao grupo HF. Embora haja um pequeno
acúmulo de gordura em algumas regiões, os tecidos apresentaram hepatócitos com morfologia
regular e sinusoides visíveis (Figuras 20C a 20H), semelhantes ao grupo AIN. Assim, a
suplementação das dietas com os enantiomeros de α-terpineol poderia ter um efeito positivo
na redução do acúmulo de gordura hepática, principalmente, levando em consideração os
valores da aminotransferase ALT , bem como no aumento na sensibilidade à insulina
promovida pela suplementação das dietas, e na redução da peroxidação lipídica (TBARS),
fatores estes que influenciam na diminuição do acúmulo de gordura hepática (FRANÇA et al.,
2013).
83
Figura 20. Análise histológica do fígado: AIN (A); HF (B); S25 (C); S50 (D); S100 (E); R25
(F); R50 (G); R100 (H). As seções histológicas foram coradas com hematoxilina e eosina.
Setas pretas: sinusóides. Aumento de 40X.
A B
C D
E F
G H
84
5.3. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA EM CULTURA DE
CÉLULAS
A fim de agregar informações sobre outras possíveis atividades biológicas dos
enantiômeros R-(+)- e S-(–)-limoneno e R-(+)- e (–)-α-terpineol, realizou-se o teste de
atividade antiproliferativa em linhagens tumorais humanas. Os gráficos gerados relacionam o
crescimento celular em função da concentração das amostras testadas (Figura 22 E 23). Os
valores entre 100% e 0% representam proliferação celular, sendo a linha 0% o marco para a
inibição total de crescimento, ou seja, a quantidade de células ao final do experimento era a
mesma do momento de adição das amostras (placa T0). Já os valores negativos representam
morte celular, pois a quantidade de células era menor do que aquela do momento de adição
das amostras (placa T0) (MONKS et al., 1991).
Para análise da proliferação celular utilizou-se a sulforrodamina B (SRB), um
corante protéico que se liga aos resíduos de aminoácidos básicos das proteínas de células que
estavam viáveis no momento da fixação. Assim, quanto maior a quantidade de SRB ligada ao
compartimento, menor a atividade citotóxica da amostra em teste. O ácido tricloroacético
(TCA) atua na fixação de células viáveis, pela precipitação de proteínas. Desta forma, as
células viáveis se mantêm fixas na placa, enquanto células não viáveis são lavadas, o que
favorece a estabilidade da placa para leitura, pois as células são primeiramente fixadas,
coradas e a medida da absorbância pode ser realizada várias semanas após o término do
experimento (MONKS et al., 1991; VICHAI; KIRTIKARA, 2006; HOUGHTON et al.,
2007).
Os enantiômeros R-(+) e S-(–)-limoneno e R-(+)- e (–)-α-terpineol foram
avaliados quanto ao potencial antiproliferativo em culturas de células tumorais humanas, nas
concentrações de 0,25; 2,5; 25 e 250 μg. mL-1
. A doxorrubicina, utilizada como controle
positivo, inibiu a proliferação de praticamente todas as linhagens de células tumorais humanas
testadas (Figura 21) de forma concentração-dependente.
85
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
Cre
scim
ento
Cel
ula
r (%
)
Concentração (g/mL)
U251
UACC-62
MCF7
NCI/ADR-RES
786-0
NCI-H460
PC-3
OVCAR-3
HT29
K-562
HaCaT
0,025 0,25 2,5 25
Doxorrubicina
Figura 21. Efeito antiproliferativo da Doxorrubina frente um painel de células humanas, após
48 horas de exposição. Linhagens tumorais: Glioma (U251), Mama (MCF-7), Ovário com
fenótipo resistência multidroga (NCI-ADR/RES), Rim (786-0), Pulmão (NCI-H460), Próstata
(PC-3), Ovário (OVCAR-3), Cólon (HT-29), Melanoma (UACC-62) e Leucemia (K562).
Linhagem não tumoral: Queratinócitos imortalizados (HaCaT).
Para uma melhor visualização das atividades dos compostos, pode-se utilizar a
curva concentração versus crescimento celular que fornece informações importantes da
atividade antiproliferativa das substâncias estudadas. Com esse tipo de gráfico é possível
verificar se a substância possui efeito citostático, ou seja, qual a concentração necessária da
mesma para que ocorra 50% de crescimento celular (GI50), que corresponde aos pontos da
curva acima do ponto zero; ou efeito citocida (pontos da curva abaixo do ponto zero) ou
inibição total do crescimento quando T=T0, ou seja, a concentração que promove 100% de
inibição celular (TGI - Total Growth Inhibition) é o valor no eixo da abscissa onde a curva
corta o eixo das ordenadas.
A Figura 22 e Tabela 9 apresentam os resultados de atividade antiproliferativa do
R-(+)- e S-(–)-limoneno. Como pode ser observado, o perfil de ambos enantiômeros do
limoneno é muito semelhante, sugerindo não haver alterações na atividade em decorrência de
pequenas alterações na estrutura espacial desta molécula. Na maior concentração testada (250
μg. mL-1
), ambos os enantiômeros apresentaram atividade antiproliferativa em todas as
linhagens de células tumorais testadas. A linhagem de células não tumoral HaCat
(Queratinócitos humano) também se mostrou sensível a ação do R-(+)- e S-(–)-limoneno
(TGI: 81,0 e 71,5 μg. mL-1
, respectivamente). Estes resultados sugerem um efeito
proliferativo inespecífico do limoneno (efeito semelhante em todas as linhagens e na maior
TGI
GI50
Concentração (µg. mL-1
)
86
concentração). Neste estudo, o limoneno apresentou perfil antiproliferativo semelhante ao de
Bicas et al. (2011).
10-3
10-2
10-1
100
101
102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100C
resc
imen
to C
elu
lar
(%)
Concentração (g/mL)
U251
MCF7
NCI/ADR-RES
786-0
NCI-H460
PC-3
HT29
K-562
HaCaT
UACC-62
OVCAR-3
0,25 2,5 25 250
10-3
10-2
10-1
100
101
102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Cre
scim
ento
Cel
ula
r (%
)
Concentração (g/mL)
U251
MCF7
NCI/ADR-RES
786-0
NCI-H460
PC-3
HT29
K-562
HaCaT
UACC-62
OVCAR-3
0,25 2,5 25 250
Figura 22. Efeito antiproliferativo de S-(-)-limoneno (A) e R-(+)-limoneno (B) frente um
painel de células humanas, após 48 horas de exposição. Linhagens tumorais: Glioma (U251),
Mama (MCF-7), Ovário com fenótipo resistência multidroga (NCI-ADR/RES), Rim (786-0),
Pulmão (NCI-H460), Próstata (PC-3), Ovário (OVCAR-3), Cólon (HT-29), Melanoma
(UACC-62) e Leucemia (K562). Linhagem não tumoral: Queratinócitos imortalizados
(HaCaT).
R-(+)-limoneno
S-(-)-limoneno A
B
Concentração (µg. mL-1
)
Concentração (µg. mL-1
)
87
Por sua vez, ambos enantiômeros de α-terpineol (Figura 23) apresentaram efeito
citostático promissor (GI50 < 30,0 μg. mL-1
, FOUCHE et al., 2008) frente às linhagens glioma
(U251), mama (MCF7) e leucemia (K562) (Tabela 8). Das linhagens avaliadas, duas
linhagens tumorais apresentaram sensibilidade diferente aos dois enantiômeros, sugerindo
uma relação entre o efeito antiproliferativo e a estereoquímica das substâncias. Assim, o R-
(+)-α-terpineol foi cerca de 10 vezes mais ativo (GI50 = 2,5 μg. mL-1
) do que o (-)-α-terpineol
(GI50 = 26,2 μg. mL-1
) frente à linhagem tumoral de próstata (PC-3), enquanto o (-)-α-
terpineol foi cerca de duas vezes mais ativo (GI50 = 21,5 μg. mL-1
) do que o isômero R-(+)
(GI50 = 42,7 μg. mL-1
) na inibição de células tumorais de ovário (OVCAR-03) (Tabela 8).
Adicionalmente, a linhagem HT-29 foi a mais resistente (Figura 23). Assim, de forma geral,
não se observou diferenças importantes entre os produtos testados, indicando que os efeitos
evidenciados não são seletivos para alguma forma enantiomérica do α-terpineol.
Contrariamente, outros estudos relataram diferenças nas atividades biológicas entre os
enantiômeros do monoterpenoide carvona (BUCHBAUER et al., 2005; SOUSA; NÓBREGA;
ALMEIDA, 2007).
88
10-3
10-2
10-1
100
101
102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Cre
scim
ento
Cel
ula
r (%
)
Concentração (g/mL)
U251
MCF7
NCI/ADR-RES
786-0
NCI-H460
PC-3
HT29
K-562
HaCaT
UACC-62
OVCAR-3
0,25 2,5 25 250
10-3
10-2
10-1
100
101
102
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
Cre
scim
en
to C
elu
lar
(%)
Concentração (g/mL)
U251
MCF7
NCI/ADR-RES
786-0
NCI-H460
PC-3
HT29
K-562
HaCaT
UACC-62
OVCAR-3
0,25 2,5 25 250
Figura 23. Efeito antiproliferativo de (-)-α-terpineol (A) e R-(+)-α-terpineol (B) frente um
painel de células humanas, após 48 horas de exposição. Linhagens tumorais: Glioma (U251),
Mama (MCF-7), Ovário com fenótipo resistência multidroga (NCI-ADR/RES), Rim (786-0),
Pulmão (NCI-H460), Próstata (PC-3), Ovário (OVCAR-3), Cólon (HT-29), Melanoma
(UACC-62) e Leucemia (K562). Linhagem não tumoral: Queratinócitos imortalizados
(HaCaT).
(-)-α-terpineol
R-(+)-α-terpineol
A
B
Concentração (µg. mL-1
)
Concentração (µg. mL-1
)
61
Tabela 8. Valores de GI50 (μg. mL-1
) após o tratamento com R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol frente às linhagens tumorais e não
tumorais no ensaio antiproliferativo.
2 u m a 7 4 p o h k q
R-(+)-α-terpineol 28,0 75,0 27,7 46,3 41,8 76,3 2,5 42,7 >250 26,1 41,8
(-)-α-terpineol 28,0 143,2 26,7 62,4 50,6 68,6 26,2 21,5 >250 28,3 56,6
Doxorrubicina <0,025 <0,025 0,025 0,10 21,8 <0,025 <0,025 0,053 0,19 0,16 0,034 Linhagens tumorais humanas= 2 (U251, glioma); u (UACC62, melanoma); m (MCF7, mama); a (NCI-ADR/RES, ovário com fenótipo de resistência a
múltiplos fármacos); 7 (786-0, rim); 4 (NCI-H460, pulmão tipo não pequenas células); p (PC-3, próstata); o (OVCAR-03, ovário); h (HT29, cólon); k (K562,
leucemia).
Linhagem não tumoral humana = q (HaCaT, queratinócitos imortalizados).
GI50 (g. mL-1
) = concentração, expressa em microgramas por mililitros, de substância necessária para reduzir em 50% a proliferação celular.
Tabela 9. Valores de TGI (μg. mL-1
) após o tratamento com R-(+)-limoneno, S-(-)-limoneno, R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol
frente às linhagens tumorais e não tumorais no ensaio antiproliferativo.
2 u m a 7 4 p o h k q
R-(+)-limoneno 49,7 67,0 79,8 86,7 88,4 76,6 68,2 64,5 99,6 69,1 81,0
S-(-)-limoneno 56,2 83,5 62,6 62,7 71,5 84,5 59,7 63,7 97,9 84,3 71,5
R-(+)-α-terpineol 75,4 >250 121,3 >250 >250 >250 90,6 >250 >250 91,3 >250
(-)-α-terpineol 78,0 >250 90,6 >250 >250 >250 101,0 >250 >250 105,8 >250
Doxorrubicina 0,94 0,15 >25 6,6 >25 >25 0,042 1,9 9,7 7,1 0,81 Linhagens tumorais humanas= 2 (U251, glioma); u (UACC62, melanoma); m (MCF7, mama); a (NCI-ADR/RES, ovário com fenótipo de resistência a
múltiplos fármacos); 7 (786-0, rim); 4 (NCI-H460, pulmão tipo não pequenas células); p (PC-3, próstata); o (OVCAR-03, ovário); h (HT29, cólon); k (K562,
leucemia).
Linhagem não tumoral humana = q (HaCaT, queratinócitos imortalizados).
TGI (g. mL-1
) = concentração, expressa em microgramas por mililitros, de substância necessária para inibir totalmente a proliferação celular.
89
90
Bicas et al. (2011) verificaram a atividade antiproliferativa α-terpineol in vitro
frente a linhagens tumorais humanas. O composto estudado apresentou bom efeito inibitório
para maioria das linhagens, especialmente para MCF-7 (mama) e K-562 (leucemia), e baixa
atividade citostática para HT-29 (cólon), resultados semelhantes ao deste estudo. Estudos de
Hayes et al. (1997) e Lampronti, Saab e Gambari (2006) também apontam atividade
citostática do α-terpineol contra células K-562.
Outros terpenos tem sua atividade antiproliferativa relatados em diversos estudos.
Yuri et al. (2004) mostram que o álcool perílico inibiu a proliferação celular, de forma dose-
dependente, em diferentes linhagens celulares de adenocarcinoma de mama humano (KPL-1,
MCF-7, MKL-F e MDA-MB-231). O α-pineno, isolado de óleo de pinho, apresentou efeito
inibitório no crescimento de células BEL-7402 (carcinoma hepatocelular) de 79,3%, quando
aplicado na concentração de 8,0 mg. L-1
por 72 horas (CHEN et al., 2015).
A relação entre a estrutura dos compostos terpênicos e atividade antiproliferativa
não está bem elucidada. Uma das hipóteses é que a hidroxilação do limoneno a um álcool
terciário (α-terpineol) poderia manter a atividade inibitória contra as linhagens tumorais
(Bicas et al., 2011). Hassan et al. (2010) sugerem que o α-terpineol inibe o crescimento de
células tumorais por meio de um mecanismo que envolve a inibição da via fator nuclear κB
(NF-κB). O NF-κB é um fator de transcrição envolvido no controle da expressão de diversos
genes ligados à resposta inflamatória, também apresentando papel fundamental em muitas
etapas de iniciação e progressão do câncer (HOESEL; SCHMID, 2013)
Estes resultados estimulam a continuidade dos estudos com os enantiômeros de α-
terpineol, com o objetivo de identificar os mecanismos de ação anticâncer e comprovar sua
atividade em modelos experimentais de câncer in vivo para validação.
91
CONCLUSÃO GERAL
Em conclusão, o presente estudo apresentou os resultados obtidos da produção
biotecnológica de R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol, a partir da biotransformação de R-(+)-
limoneno e S-(-)-limoneno, utilizando o biocatalisador Sphingobium sp. Embora a conversão
de substratos em produtos não tenha sido total, a biotransformação teve uma razoável
enantioseletividade. Nas condições de produção (concentração de limoneno de 350 g. L-1
,
agitação de 200 rpm e 28 oC), a produção de R-(+)-α-terpineol chegou a 151,0 g.L
-1, com
excesso enantiomérico de 94,2% da forma R, e a de S-(-)-α-terpineol chegou a 91,0 g.L-1
com
um excesso enantiomérico de 31,5% da forma S. O óleo resultante da biotransformação foi
purificado utilizado cromatografia em coluna aberta, resultando no completo isolamento do α-
terpineol.
A pureza enantiomérica dos enantiômeros de α-terpineol obtidos neste estudo foi
superior ao encontrado nos padrões comerciais, o que torna bastante interessante
tecnologicamente a produção destes compostos por biotransformação, pois está relacionada à
obtenção de bioaromas com características sensoriais mais atrativas e com maior valor
agregado, se comparado aos produzidos por via química, e atendendo à crescente demanda do
consumidor por produtos com apelo de saudabilidade.
O trabalho ainda visou à avaliação do potencial biológico dos enantiômeros R-
(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol, produzidos por biotransformação. Tanto o R-(+)- como o (-)-
α-terpineol apresentaram ação antiproliferativa equivalente contra três linhagens tumorais
humanas (leucemia, mama, glioma), sendo o R-(+)-α-terpineol ativo para PC-3 (próstata) e o
(-)-α-terpineol para OVCAR-3 (ovário).
De forma geral, não foram evidenciadas diferenças significativas nas atividades
biológicas entre os enantiômeros de α-terpineol, o que pode ser inferida pela presença de R-
(+)-α-terpineol (33,9%) no (-)-α-terpineol. Porém, alguns resultados merecem destaque:
diminuição dos níveis de TNF-α nos animais dos grupos suplementados com (-)-α-terpineol e
de IL-1β em ambos os enantiômeros, impacto positivo sobre a peroxidação lipídica e nos
níveis séricos de ALT, além de efeito protetor sobre a resistência à insulina e contra o
acúmulo de gordura no tecido hepático, induzida por dieta hiperlipídica em ratos em ambos os
enantiomêros.
Entretanto, é importante enfatizar que possíveis efeitos adversos também foram
evidenciados. Em particular, o aumento do peso relativo dos rins e nos níveis séricos de
colesterol (total e LDL) nos grupos tratados com (-)-α-terpineol, tendência à piora na
92
tolerância à glicose nos grupos tratados com α-terpineol e o aumento na enzima AST para o
grupo S100 despertaram atenção. Sendo assim, é preciso que a indicação de administração de
α-terpineol para a melhora dos fatores associados à obesidade seja vista com cautela.
Este estudo apresentou algumas limitações quanto ao protocolo experimental dos
ensaios in vivo em modelos de obesidade induzidos por dieta hiperlipídica, destacando o
elevado teor de gordura das dietas hiperlipídicas (60% do valor calórico total), a falta de
avaliação da glicemia dos animais fora do jejum e na escolha do tempo de indução da
obesidade, pois uma indução eficiente da obesidade pode necessitar de períodos de tempo
maiores. Reajustes nestes procedimentos seriam recomendados em trabalhos futuros
envolvendo em modelos de obesidade com utilização dos enantiômeros de α-terpineol.
Esta tese abre caminhos para que outros estudos sejam desenvolvidos sobre o
potencial funcional dos enantiômeros de α-terpineol, ratificando a sua utilização como
estratégia nutricional na prevenção e combate ao desenvolvimento de células tumorais, dano
oxidativo, obesidade, resistência à insulina e esteatose hepática. Sendo assim, novas pesquisas
com o α-terpineol devem ser encorajadas; por exemplo, a avaliação in vivo em outros modelos
experimentais, o estudo do impacto perceptivo/sensorial destes enantiômeros em humanos e
animais e na sua aplicação em produtos alimentícios.
93
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121
Tabela 10. Resultados de consumo alimentar (g. dia-1
) dos ratos Sprague-Dawley alimentados com diferentes dietas.
Resultados expressos como média ± desvio padrão. Médias nas colunas seguidas por letras diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05). One way, ANOVA,
com pós-teste de Tukey (n=6 por grupo).
* Início do consumo de dietas contendo os enantiômeros de -terpineol, nos grupos S25, S50, S100, R25, R50 e R100.
** Realização dos testes GTT e ITT
Grupo Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 5 Semana 6* Semana 7 Semana 8 Semana 9 Semana 10** Semana 11**
AIN 18,00±1,77a 13,38±0,92
a 14,45±0,75
a 16,89±0,49
a 18,38±0,53
a 17,04±0,41
b 16,27±0,80
a 16,55±0,43
a 16,35±0,17
a 15,44±0,55
a 16,33±0,33
a
HF 14,93±1,95a 13,72±0,32
a 15,14±0,75
a 16,95±1,31
a 16,47±0,44
a 16,58±1,07
a 15,98±0,18
a 16,87±0,18
a 16,45±0,47
a 15,82±3,58
a 15,93±4,32
ab
S25 11,86±1,20b 9,10±1,82
b 8,75±0,93
b 10,17±2,47
b 9,46±0,81
bc 8,78±1,10
c 8,80±1,30
b 11,98±2,69
bc 9,67±0,52
b 10,65±2,36
b 10,92±1,90
b
S50 12,08±2,32b 7,28±1,27
b 9,58±2,62
b 8,38±1,07
b 7,87±1,67
c 7,98±1,53
c 8,87±1,08
b 9,05±1,52
c 9,20±2,08
b 10,51±2,87
b 8,88±1,31
b
S100 13,67±2,86ab
9,30±0,87b 8,53±0,97
b 7,71±0,72
b 8,96±2,11
bc 7,93±1,00
c 8,00±0,86
b 9,04±1,57
c 8,93±1,54
b 9,83±1,33
b 8,28±0,95
b
R25 10,08±2,92b 9,52±2,03
b 7,88±1,72
b 8,69±1,46
c 11,85±2,16
b 8,05±1,03
c 9,52±1,57
b 9,63±1,88
c 10,67±2,06
b 9,58±1,37
b 8,78±1,09
b
R50 14,94±2,55a 10,00±2,54
b 10,07±1,95
b 7,74±0,82
b 10,16±3,91
bc 13,80±0,92
b 15,17±2,22
a 15,64±2,21
a 13,30±3,17
a 14,83±1,68
a 14,23±3,05
a
R100 11,13±1,95b 8,42±0,93
b 9,63±1,63
b 10,12±2,56
b 9,52±2,62
bc 14,84±2,64
b 15,08±1,98
a 13,99±2,03
b 14,00±2,37
a 15,66±2,50
a 14,95±1,98
a
APÊNDICE: Resultados do ensaio biológico
121
122
Tabela 11. Ingestão calórica (kcal. dia-1
) dos ratos Sprague-Dawley alimentados com diferentes dietas.
Grupo Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 5 Semana 6* Semana 7 Semana 8 Semana 9 Semana 10** Semana 11**
AIN 77,66±7,62ab
57,72±3,98b 62,37±6,87
b 72,89±2,12
b 79,30±2,28
b 73,54±1,78
a 70,21±3,46
b 71,41±1,86
b 70,55±0,74
b 66,61±2,35
c 70,46±1,42
b
HF 83,67±9,89a 76,85±1,79
a 84,77±4,20
a 94,90±7,34
a 92,21±2,49
a 92,87±5,97
a 89,51±1,03
a 94,49±1,00
a 92,14±2,65
a 88,61±20,06
a 81,33±9,27
a
S25 65,77±6,63bc
54,74±3,89bc
48,52±5,13c 51,17±8,22
bc 52,47±4,52
c 48,69±6,10
a 48,78±7,21
c 66,42±14,92
bc 53,61±2,91
c 59,05±8,11
cd 60,56±10,51
bc
S50 72,00±7,38bc
40,61±7,10b 53,45±3,44
c 46,74±5,97
bc 43,92±9,35
c 44,56±8,52
c 43,53±6,94
c 50,50±8,49
c 47,23±6,49
c 53,30±10,25
cd 49,55±7,31
c
S100 75,93±15,89ab
51,63±4,84b 47,34±5,38
c 42,78±4,01
c 45,65±6,66
c 44,01±5,54
c 44,42±4,78
c 50,18±8,75
c 49,60±8,56
c 54,57±7,37
d 46,00±5,27
c
R25 55,99±16,23c 52,88±11,26
bc 43,78±9,56
c 48,26±8,08
c 65,84±11,98
bc 44,71±5,74
c 52,89±8,71
c 53,51±10,47
c 59,27±11,44
c 53,23±7,60
d 48,76±6,05
c
R50 83,09±14,16ab
55,64±14,10b 55,99±10,82
bc 43,06±4,58
c 56,51±21,75
bc 76,77±5,13
b 80,42±14,73
ab 81,20±17,94
ab 67,67±9,64
bc 82,48±9,33
b 79,17±16,96
ab
R100 61,82±10,82bc
46,73±5,16bc
53,46±9,08bc
56,22±14,21bc
52,84±14,53c 82,40±14,99
ab 83,74±10,99
ab 77,69±11,29
b 77,79±13,18
b 86,96±13,90
ab 83,00±11,00
ab
Resultados expressos como média ± desvio padrão. Médias nas colunas seguidas por letras diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05). One way, ANOVA, com pós-teste de
Tukey (n=6 por grupo).
* Início do consumo de dietas contendo os enantiômeros de -terpineol, nos grupos S25, S50, S100, R25, R50 e R100.
** Realização dos testes GTT e ITT.
122
123
Tabela 12. Ingestão semanal (mg. kgpc-1
) dos enantiômeros de -terpineol, em relação ao peso
corporal dos animais.
Resultados apresentados como média ± desvio padrão.
* Realização dos testes GTT e ITT. #
Diferença estatística significativa (p<0,05) entre os grupos S100 e R100, nas semanas 6 e 7 do experimento.
One way, ANOVA, com pós-teste de Tukey (n=6 por grupo). Nos demais pares, não houve diferença estatística ns
Não significativo pelo teste de Tukey no nível de 5% de probabilidade os pares S25 e R25, S50 e R50, S100 e
R100.
Grupo Semana 6 Semana 7 Semana 8ns
Semana 9 ns
Semana 10 ns
* Semana 11 ns
*
S25 6,54±1,01 6,31±1,21 8,26±1,35 6,51±0,57 6,84±1,54 6,98±1,11
S50 12,03±2,65 12,94±1,81 12,85±1,87 11,49±1,48 12,42±2,49 11,25±0,90
S100 24,02±3,04 23,62±3,18 24,44±2,93 25,60±3,42 26,96±4,75 22,44±3,20
R25 6,12±0,68 6,89±1,01 6,74±1,44 7,06±1,34 6,19±0,97 5,57±0,73
R50 17,74±3,01 15,69±1,81 14,54±2,27 12,82±1,78 13,70±1,11 12,75±1,88
R100 35,20±4,74# 31,32±1,21
# 27,41±1,94 25,50±3,66 27,10±3,12 25,38±1,80
91
Tabela 13. Peso corporal médio (g) de ratos Sprague Dawley para os diferentes tratamentos, durante 12 semanas experimentais.
Resultados expressos como média ± desvio padrão. Médias nas colunas seguidas por letras diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05). One way, ANOVA,
com pós-teste de Tukey (n=6 por grupo). ns
Não significativo pelo teste de Tukey no nível de 5% de probabilidade.
* Início do consumo de dietas contendo os enantiômeros de -terpineol, nos grupos S25, S50, S100, R25, R50 e R100.
** Realização dos testes GTT e ITT.
Grupo Inícions
Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 5 Semana 6* Semana 7 Semana 8 Semana 9 Semana 10** Semana 11**
AIN 159,9±14,7 184,4±9,6a 207,3±8,4
a 232,1±8,4
b 259,1±8,4
b 289,7±7,8
b 312,5±6,8
b 327,9±10,1
b 344,7±11,3
b 355,8±12,6
c 356,4±11,7
c 361,8±10,2
c
HF 146,5±21,1 182,5±24,0a 227,5±16,1
a 281,7±29,0
a 329,9±27,0
a 363,5±27,8
a 400,6±32,4
a 424,6±35,8
a 454,4±44,1
a 476,0±40,3
a 487,7±41,4
a 479,9±45,3
a
S25 177,1±23,7 192,7±21,8a 192,7±21,8
a 213,9±19,2
b 223,3±17,0
c 231,3±19,0
c 238,1±18,3
c 247,3±20,3
c 250,0±21,7
c 262,6±22,0
d 273,1±24,1
d 273,8±18,2
d
S50 176,5±11,2 191,3±8,4a 191,3±8,4
a 208,7±21,4
b 219,3±17,8
c 225,0±22,5
c 233,8±22,2
c 241,4±24,2
c 246,6±23,3
c 256,8±21,8
d 270,0±17,9
d 281,7±34,0
d
S100 164,6±20,9 192,3±22,1a 192,3±22,1
a 209,7±14,8
b 213,9±13,8
a 228,0±15,8
c 231,5±15,3
c 238,1±14,3
c 242,6±18,6
c 250,5±20,8
d 257,5±25,1
d 263,6±26,1
d
R25 168,4±32,9 184,6±28,1a 190,0±25,6
a 201,5±24,2
b 209,9±22,8
c 228,0±25,8
c 230,2±16,8
c 242,5±14,6
c 251,3±12,2
c 264,7±11,5
d 271,5±13,3
d 276,5±15,6
d
R50 170,8±15,5 184,7±14,4a 191,4±15,8
a 199,6±27,8
b 213,8±31,5
c 215,2±37,8
c 269,1±25,0
b 305,9±26,5
b 332,2±30,4
b 342,0±31,6
bc 362,4±31,8
bc 371,0±30,6
bc
R100 180,4±29,4 197,4±25,8a 202,0±25,6
a 210,5±25,0
b 221,4±28,2
c 236,2±35,4
c 295,5±35,2
b 333,2±40,4
b 356,9±43,9
b 379,2±28,8
b 404,2±38,9
b 412,1±45,0
b
124
125
Tabela 14. Peso bruto (g) dos orgãos extraídos dos ratos Sprague-Dawley.
Resultados expressos como média ± desvio padrão. Médias nas colunas seguidas por letras diferentes indicam
diferença estatística significativa (p<0,05). One way, ANOVA, com pós-teste de Tukey (n=6 por grupo).
Grupo Coração Fígado Rins Baço Ceco
Tecido
adiposo
marrom
Tecido
adiposo
epididimal
AIN 1,15±0,22ab 11,90±0,82b 2,43±0,13b 0,69±0,08b 2,78±0,43a 0,39±0,07b 5,94±1,02b
HF 1,26±0,25a 15,13±1,97a 2,89±0,20a 0,86±0,08a 2,15±0,22b 0,69±0,12a 12,59±3,02a
S25 0,89±0,07c 7,27±1,12c 2,52±0,09b 0,59±0,08bc 1,97±0,38b 0,35±0,06bc 3,17±0,69c
S50 0,95±0,09c 7,37±0,53c 2,30±0,16b 0,55±0,06c 2,20±0,45ab 0,24±0,05c 3,39±0,72c
S100 0,91±0,09c 7,54±0,53c 2,16±0,20b 0,59±0,11bc 2,47±0,32a 0,27±0,08c 2,54±1,08c
R25 1,00±0,17bc 8,17±1,11c 2,20±0,35b 0,52±0,10c 2,07±0,41b 0,24±0,07c 3,18±0,85c
R50 1,28±0,18a 11,32±2,52ab 2,64±0,24a 0,65±0,10bc 2,68±0,53a 0,37±0,13bc 6,55±1,08b
R100 1,29±0,17a 12,10±1,46a 2,72±0,28a 0,78±0,05a 2,69±0,72a 0,31±0,07bc 8,01±2,48b
93
Tabela 15. Peso relativo dos órgãos (g. 100 g-1
), corrigido em relação ao peso corporal total.
Grupo Coração Fígado Rins Baçons
Ceco Marrom Epididimal
AIN 0,319±0,027b 3,29±0,15
a 0,671±0,031
b 0,192±0,022 0,766±0,125
a 0,108±0,017
ab 1,63±0,25
b
HF 0,273±0,017c 3,04±0,33
a 0,596±0,026
c 0,181±0,028 0,482±0,065
c 0,142±0,025
a 2,59±0,42
a
S25 0,328±0,039ab
2,66±0,38b 0,926±0,084
a 0,215±0,016 0,725±0,157
ab 0,116±0,020
ab 1,16±0,22
c
S50 0,348±0,026ab
2,71±0,08b 0,847±0,082
a 0,202±0,014 0,858±0,078
a 0,091±0,017
bc 1,24±0,19
c
S100 0,345±0,022ab
2,87±0,13b 0,811±0,076
a 0,225±0,032 0,942±0,138
a 0,091±0,019
bc 0,94±0,32
c
R25 0,384±0,022a 2,95±0,35
ab 0,840±0,088
a 0,192±0,041 0,802±0,145
a 0,088±0,026
bc 1,17±0,31
c
R50 0,330±0,011b 2,88±0,25
b 0,685±0,088
b 0,178±0,022 0,629±0,035
b 0,084±0,025
bc 1,83±0,28
b
R100 0,312±0,021b 2,93±0,12
b 0,664±0,067
b 0,191±0,014 0,647±0,177
b 0,076±0,010
c 1,91±0,46
b
Resultados expressos como média ± desvio padrão. Médias nas colunas seguidas por letras diferentes indicam diferença
estatística significativa (p<0,05). One way, ANOVA, com pós-teste de Tukey (n=6 por grupo). ns
Não significativo pelo teste de Tukey no nível de 5% de probabilidade.
126
94
Tabela 16. Resultados dos testes de tolerância à glicose e insulina (GTT e KITT) dos animais dos diferentes grupos estudados.
Resultados expressos como média ± desvio padrão. Médias nas colunas seguidas por letras diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05). One way, ANOVA,
com pós-teste de Tukey (n=6 por grupo). ns
Não significativo pelo teste de Tukey no nível de 5% de probabilidade.
Grupo
GTT
KITT
(%. min-1
) GTT x 10-5
(AUC)
Glicose (µM)
Inícions
Glicose (µM)
30 minutos
Glicose (µM)
60 minutos
Glicose (µM)
90 minutos
Glicose (µM)
120 minutos
AIN 2,209±0,189c 1483,6±128,9 2603,6±410,9
c 1672,7±107,6
c 1525,4±159,4
c 1396,4±118,1
b 5,41±0,54
a
HF 2,894±0,294b 1287,3±167,4 3134,5±193,5
bc 2676,4±265,8
b 2003,6±492,0
b 1814,6±184,3
a 3,03±0,85
c
S25 3,618±0,541ab
1609,5±146,6 4833,1±1107,9a 3107,2±498,1
a 2229,1±0,20
ab 1761,1±203,6
a 3,22±0,15
c
S50 3,839±0,516a 1394,3±264,2 4250,9±974,2
a 3413,9±684,9
a 2523,0±366,4
a 1920,7±321,6
a 4,82±1,27
a
S100 3,503±0,583ab
1409,0±293,8 4593,3±1008,0a 2786,2±352,5
b 2417,6±482,9
a 1822,9±256,9
a 4,27±0,76
ab
R25 3,359±0,704ab
1506,5±243,8 4799,3±1227,8a 2642,5±420,2
b 2192,6±294,9
ab 1873,4±298,8
a 3,53±0,81
bc
R50 2,892±0,390b 1466,0±67,9 3282,6±341,2
ab 2494,1±394,1
b 1855,7±192,2
b 1818,9±115,4
a 4,41±0,87
a
R100 3,493±0,543ab
1473,8±251,1 5193,7±984,7a 3089,0±484,1
ab 2148,2±153,0
ab 1880,3±255,3
a 4,82±1,27
a
127
95
Tabela 17. Efeito das diferentes concentrações dos enantiômeros de -terpineol (25, 50 e 100 mg. kg-1
) das dietas sobre os parâmetros
bioquímicos e níveis de citocinas TNF-α e IL-1β nos diferentes grupos de ratos Sprague Dawley estudados.
Resultados expressos como média ± desvio padrão. Médias nas linhas seguidas por letras diferentes indicam diferença estatística significativa (p<0,05). One way, ANOVA, com pós-
teste de Tukey (n=6 por grupo).
Grupo AIN HF S25 S50 S100 R25 R50 R100
Triglicerídeos
(mg. dL-1
) 34,86±9,72
b 81,90±18,90
a 73,36±7,19
a 68,20±21,82
a 67,48±12,68
a 70,75±28,93
a 62,25±9,76
a 69,40±21,39
a
Colesterol Total
(mg. dL-1
) 55,06±9,40
c 66,40±3,20
b 88,25±14,89
a 78,27±8,19
a 82,90±19,60
a 82,98±17,08
a 59,26±9,95
bc 63,12±6,14
bc
Colesterol LDL
(mg. dL-1
) 48,06±8,49
c 57,74±3,19
b 89,92±19,17
a 71,53±14,14
a 77,98±24,97
a 78,02±21,00
a 54,37±13,78
bc 59,31±8,76
bc
AST (U. L-1
) 14,21±2,31c 30,45±7,99
b 26,49±5,95
b 30,91±7,45
b 45,65±6,81
a 30,04±5,18
b 26,80±7,47
b 25,52±6,43
b
ALT (U. L-1
) 5,80±1,69c 17,69±5,89
a 6,38±3,06
bc 9,96±2,92
b 9,86±2,37
b 9,28±3,52
b 6,84±2,15
bc 9,86±3,15
bc
TBARS soro
(nmol MDA mg-1
) 3,11±0,56
b 4,34±0,52
a 2,29±0,31
bc 1,73±0,38
cd 2,58±0,60
bc 2,54±0,58
bc 1,03±0,20
d 1,93±0,18
cd
TBARS tecido
(nmol MDA mg-1
tecido)
4,70±0,59b 6,63±0,57
a 3,69±0,76
b 4,40±0,49
b 4,27±0,57
b 4,24±0,81
b 4,36±0,58
b 4,15±0,95
b
TNF-α (ng. mL-1
) 0,157±0,007a 0,158±0,021
a 0,069±0,015
cd 0,065±0,015
cd 0,046±0,012
d 0,108±0,018
b 0,088±0,015
c 0,119±0,013
b
IL-1β (ng. mL-1
) 0,159±0,034a 0,133±0,026
a 0,095±0,025
b 0,086±0,035
b 0,077±0,009
b 0,069±0,015
b 0,074±0,033
b 0,095±0,032
b
128
129
ANEXO - Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Instituto de Biologia da Unicamp
(CEUA/Unicamp)
