BIFCBimolecular Fluorescence

Complementation

Alba Espargaró Colomé

Protein Fragment Complementation

o També anomenats: Interaction trapping.

o Permeten observar interacció entre proteïnes in vivo.

o Classes:o Ubiquitinao Dihidrofolat reductasao Β-galactosidasao GFP (green fluorescent protein)

o Detection of transient protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation:The Abl-SH3 case

M. Morell et al. Proteomics 2007,7,1023-1036

Estudiar en detall la habilitat del mètode BIFC per detectar interaccions transitòries.

The Abl-SH3 case

Domini SH3:Domini implicat en la regulació negativa de l’activitat quinasa mitjançant interaccions transitòries entre proteïnes.

o C-Abl tyrosine kinase: regula diferenciació cel·lular i apoptosi, sent responsable de molts senyals extracel·lulars (factors de creixement, adhesió cel·lular i citoquines) i intracel·lulars (dany DNA, estrès oxidatiu)

Interaccions estudiades

o Domini SH3 interacciona amb polipèptids rics en prolina, seguint el motiu PXXP:o BRCA1: càncer de mama tipus 1o PRDX1: peroxiredoxinao p41: pèptid ric en prolina + mutants

o WT (Tyr4)o Tyr4Argo Tyr4Pheo Tyr4Trpo Tyr4Gly

Bimolecular Fluorescent Complementation

o C-Abl-SH3: fusionada a l’extrem C-terminal (156-238) amb un linker de seqüència SGGGSGGS i clonada en pBAT-4 (ampR)

o Pèptid p41: fusionat a l’extrem N-terminal (1-155) amb un linker de seqüència SGGGS i clonat en pET28-a(+) (kanR)

Transformació de cèl·lules competents d’Escherichia coli BL21(D3)

Esquema basat en les estructures obtingudes per X-ray

Experiments amb p41o Cèl·lules transformades amb p-Abl-SH3-CYFP o p-

p41-NYFP individualment.

Fragments individuals de YFP no són funcionals

o Cèl·lules transformades amb p-Abl-SH3-CYFP i p-p41-NYFP

La majoria de les cèl·lules tenen fluorescència.o Cèl·lules transformades amb p-Abl-SH3-CYFP i p-NYFP

Necessitat de dues proteïnes per la reconstitució de YFP

o Anàlisi de l'espectre d’emissió de fluorescència on s’observa el pic a 523 nm, l’espectre característic de la YFP nativa

Estructura de Abl-SH3 interaccionant amb P41

o Pro54 i Trp36 són dos residus molt ben conservats en el domini SH3, situats en el centre hidrofòbic.

o Juga un paper molt important en la interacció amb els pèptids rics en prolina.

o Pro54Leu redueix significativament la unió del domini Abl-SH3 amb els lligands

Contrast de fases (esquerra) i fluorescència (dreta)

Western blot:(1) c-Abl-SH3-CYFP(2) C-Abl-SH3-P45L-NYFP

Mutants de p41

o Construcció de 5 mutants de p41 en la posició 4 (important per la interacció amb Abl-SH3)o Trp4, Phe4, Tyr4, Arg4 i Gly4

o Es va transformar amb una barreja dels 5 a igual concentració juntament amb c-Abl-SH3-CYFP

Western Blot

Tyr>Arg>Phe>Gly>Trp

Estabilitat de la reconstitució de la YFP

Una vegada YFP està reconstituïda és molt estable

Seguiment de les interaccions mitjançant citòmetre de flux

o 1: control negatiu Abl-SH3-CYFPo 2: control positiu YFPo 3: Abl-SH3-CYFP + NYFPo 4: Abl-SH3-CYFP + p41-NYFPo 5: Abl-SH3-CYFP + p41-Gly4-NYFP

o Relació en % de Abl-SH3-CYFP+p41-NYFP / Abl-SH3-CYFP+p41-Gly4-NYFP

o Negre: 20/80o Gris fosc: 10/90o Gris clar: 5/95

o Mitjançant el citòmetre de flux podem observar la presència de bons lligands encara que es trobin a una concentració molt baixa.

o Citòmetre de flux és molt ràpid, altament sensible per tant una bona tècnica per avaluar les interaccions transitòries mitjançant BIFC.

Conclusions

o BIFC: mètode de visualització directe d’interaccions febles entre proteïnes intracel·lulars. Bon mètode per detectar interaccions fortes però també febles.

o No necessita cap assaig enzimàtic per detectar la seva activitat.

o L’assaig és suficientment sensible per detectar interaccions entre proteïnes que estan poc expressades en bactèria.o Una vegada els dos fragments de YFP estan units són molt

estables, això pot ser la raó de l’elevada sensibilitat, ja que el complex pot emetre fluorescència durant molt temps (setmanes)

Conclusions

o Les diferències de fluorescència observades entre els diferents mutants de p41 determina que és un mètode capaç de diferenciar lligands d’alta i baixa afinitat.

o La combinació de BIFC amb el citòmetre de flux fa que sigui un mètode ràpid, altament sensible i selectiu per determinar interaccions febles entre proteïnes

o Manera fàcil d’obtenir els resultats.

BIFCBimolecular Fluorescence

Complementation

Alba Espargaró Colomé