1

BELANČEVINE

UvodUvod

� Belančevine ili proteini su visokomolekulski

prirodni proizvodi (prirodni makromolekuli)

izgrañeni od α-aminokiselina, koje su

meñusobno povezane peptidnim vezama u

makromolekulske nizove.

� Naziv PROTEINI potiče od Grčke reči proteios,

što znači PRVI

� čine osnovu života, ulaze u sastav svih živih bića

2

Peptidi

� Amidna veza, -NHCO-, se ovde zove peptidna veza

� Peptidi su amidi dobijeni reakcijom amino-grupa i karboksilnih grupa aminokiselina

� Peptidi se dele na dipeptide, tripeptide ... polipeptide

� Polipeptidi su molekuli sa MM do 10000

� Proteini su molekuli sa MM preko 10000

H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-

R1 R2R3 R4 R5

-NH-CH-COOH

Rn

. . .

u izgradnji učestvuje svega oko 20 prirodnih αααα-aminokiselina

3

� U izgradnji belančevina, sem amino kiselina, mogu da učestvuju i druga jedinjenja, manje ili više složena, gradeći na taj način složene sisteme u kojima su makromolekulski polipeptidni nizovi spregnuti sa neproteinskimdelovima, koji se opštim imenom nazivaju prostetske grupe.

� Prostetske grupe mogu da budu veoma raznolike i složene, kao što su nukleinske kiseline, bojene materije, lipidi, ugljeni hidrati, fosfatna kiselina ili, pak, metali, tako da se sreće niz tipova složenih belančevina ili, kako je to uobičajeno da se kaže – konjugovanih proteina.

Aminokiselinski sastav belančevina

� l. Sve aminokiseline koje se pojavljuju u belančevinama, bez izuzetka, su α -aminokiseline.

� 2. Sa izuzetkom najjednostavnije aminokiseline koja se pojavljuje u belančevinama (glikokol, glicin, α-aminosirćetna kiselina), sve ostale prirodne aminokiseline sadrže najmanje tri C atoma, koji sačinjavaju jedan zasićeni niz.

� 3. Isto tako, sa izuzetkom glikokola, drugi C atom prirodnih aminokiselina je asimetričan, tako da su sve optički aktivne i sve imaju L-konfiguraciju.� u prirodi - manji broj aminokiselina koje imaju D-konfiguraciju

4

C

CH X

HNH2

R

COOH

C HNH2

COOH

R

I II

X = H, CH3 ili hetero grupaR = H ili organski ostatak

Pregled aminokiselina

Alifatske zasićene nesupstituisane monoamino-monokarbonske kiseline

5

Alifatske oksiamino-monokarbonske kiseline

6

Tioaminokiseline

Aromatske aminokiseline

7

Heterociklične aminokiseline

Diamino-monokarbonske kiseline

8

Iminokiseline

Monoamino-dikarbonske kiseline

9

C HH3N

COOH

R

C HH3N

COO

R

C HNH2

COO

R

+

katjon (I) dipol-jon (II) anjon (III)

+- -

..

Fizičko-hemijske karakteristike amino kiselina

1. Slobodne aminokiseline sadrže jednu kiselu i jednu baznu grupu, koje se meñusobno neutralizuju, tako da se aminokiseline praktično pojavljuju isključivo u obliku dipol-

jona.2. Rastvaranjem slobodnih aminokiselina u vodi, dolazi do

uspostavljanja ravnoteže izmeñu slabo kisele NH3+ grupe,

slabo bazne COO- grupe i H+ jona iz vode, a pH vrednost na kojoj dolazi do uspostavljanja ove ravnoteže naziva se izoelektrična tačka.

3. Aminokiseline su amfoterna jedinjenja i mogu da grade soli kako sa kiselinama tako i sa bazama, te im stoga i odgovaraju dve konstante disocijacije, kisela i bazna, koje odgovaraju kiselosti NH3

+ grupe i baznosti COO- grupe (a ne konstantama disocijacije COOH odnosno NH2 grupe).

I= ½ (pKa-pKb + 14)

10

NH2

O

R

O NH2

O

R

O

Cu+

Kompleks αααα-aminokiseline sa jonom bakra

4. Stvaranje dipol-jona kod aminokiselina može se sprečiti samo u slučaju da se blokira bilo karboksilna bila amino grupa.

5. α-aminokiseline su sposobne da grade komplekse sa teškim metalimatipa helata →način za izdvajanje i prečišćavanje aminokiselina

O

O

OH

OHR C COOH

H

NH2

O

O

OH

HR C O

H

+ + + +NH3 CO2

ninhidrin redukovani ninhidrin

6. Aminokiseline su poznate po brojnim bojenim reakcijama: ninhidrinska reakcija ima opšti značaj ovu reakciju ne pokazuju aminokiseline: prolin i oksiprolin (imino, a ne amino grupa)

11

O

O

OH

OH

O

O

H

OH

O

O

N

O

OH

+

+

NH3

3H2O

ninhidrinoksidovani oblik

ninhidrinredukovani oblik

plavo-ljubičasti kompleks

+

Stereohemijske karakteristike

N C

R

C N

H

C

R

CO

H H H

O1 2. . . . . .

Peptidna veza

Peptidna veza i njene karakteristike

12

a) trans b) cis

Valentni uglovi i rastojanja peptidne veze

(retko)

CC'

ON

H

C

CC'

ON

H

Cα

α ..

α

α +

I II

_

•C-N veza za 0,015 nm kraća od uobičajene jednostruke C-N veze

•C—O veza za 0,002 nm duža od C=O veze (aldehidi ili ketoni)

� kod kristalnih sistema sa jednom ili više peptidnih veza - hibridna struktura,

� učešće granične strukture I sa približno 60%

� i granične strukture II sa oko 40%,

� Iako ne postoji mogućnost slobodne rotacije oko same peptidne

veze, rotacija oko veza Cα-C’ prvog, kao i N-C

αdrugog ostatka

aminokiseline nije ograničena, što znači da planarni fragmenti mogu meñusobno zauzimati različite prostorne rasporede.

13

Prostorni odnos planarnih fragmenata peptidnih veza, koji se sučeljavaju na istom αααα-C atomu.

� Ravni dveju susednih planarnih peptidnih veza koje se sučeljavaju na

istom α-C atomu mogu da zauzmu različite prostorne rasporede, a u zavisnosti od vrednosti azimutalnih uglova ϕ i ψ, koji inače definišu rotaciju oko veza C

α-C' odnosno N-C

α.

Cαααα

N

C’

14

Prostorni raspored peptidnih veza i aminokiselinskih ostataka R

� Mogućnost da planarni fragmenti peptidnih veza zauzimaju različite rasporede u odnosu na α-C atome, i meñusobno, s jedne strane, kao i sposobnost karakterističnog ostatka aminokiseline R sa α—C atomom, s druge strane, pruža velike mogućnosti meñusobnog prostornog podešavanja i planarnih fragmenata i karakterističnih ostataka.

Definisanje peptida

Definisanje belančevina – složeno

� 20 aminokiselina

� aminokiselinski sastav-kvalitativan i kvantitativan -nedovoljno

� struktura i prostorni oblici makromolekulskih nizova

1. Odreñivanje krajnjih aminokiselina

2. Postupna odgradnja pojedinih aminokiselina

15

Odreñivanje krajnjih aminokiselina

NedostatakRazlaganje peptida pase ne može više koristiti

DNP derivat aminokiseline je karakteristično žuto obojen,dok dansil derivat intenzivno fluorescira

Samo podaci o jednoj grupi!

16

Postupna odgradnja pojedinih aminokiselina

� Reakcija po Edmanu

� Reakcija sa bromcijanom

� Ostale specifične reakcije raskidanja peptidne veze

Reakcija po Edmanu (Edman)

Fenilsenfno ulje

17

Do 100 a.k. ostatakaOgraničenje-gubitak supstance

Reakcija sa bromcijanom

R

CH2

CH2 S CH3

N C Br

R

CH2

CH2S CH3

C N

O

R'-NHN CH-CO-...

HR

N

O

R'-NHO

R

R'-NH-CH-CO-NH-CH-CO-... R'-NH-CH-CO-NH-CH-CO-...

+

+

+ CH3-S-C

+ H2N-CH-CO-...

Lakton homoserina

metionin

•Dobijanje manjih fragmenata•Lakša analiza

slično reaguje i I-CH2-CONH2

18

Pregled peptidnih veza koje se razlažu pod dejstvom pojedinih enzima

G1y-G1n;Cys-SO3H-Ser; Gln-Leu; Gly-Asn7,0Papain

X-Tyr; X-Phe; X-Leu-X;

X-Gly-X1-2Pepsin

Phe-X; Tyr-X8,0Himotripsin

X-Lys-X; X-Arg-X7,8Tripsin

Peptidne veze koje

enzim specifično

razlaže

Optimalna pH vrednost

dejstva enzimaEnzim

Ostale specifične reakcije raskidanja peptidne veze

RR

R CH

NH2

C

O

RN

CH

COOH

H

N

N

R

O

O

R

H

H

H2N-CH-COOH

1

1

1 2

2

H2N-CH-COOH2+

dipeptid

diketopiperazin

Uspostavljanje peptidne veze

•Biosintetski - enzimski•Hemijski - acilovanje ili zagrevanje

19

20

Sinteza peptida

-C6H5CH2OCOCl + H3NCH2COO

C6H5CH2OCO-NHCH2COOH

C6H5CH2OCO-NHCH2COCl

SOCl2

karbobenzoksi-hlorid

karbobenzoksiglicin

hlorid karbobenzoksiglicina

+

Sinteza peptida

CH3

CH3

-+ H3NCHCOO

C6H5CH2OCO-NHCH2CO

C6H5CH2OCO -NHCH2COCl

-NHCHCOOH

karbobenzoksiglicilalanin

+

21

Sinteza peptida

CH3

CH3

C6H5CH2OCO-NHCH2CO -NHCHCOOHH2,Pd

+ -H3NCH2CO -NHCHCOO + C6H5CH3 + CO2

Gly-Ala

Zaštitne grupe pri sintezi peptida

• neophodno je da se zaštitna grupa lako uspostavlja, pri čemu je poželjno dai odgovarajući reaktivi budu pristupačni.

• zaštitna grupa mora da bude stabilna za vreme reakcije uspostavljanja peptidne veze.

• posle obavljenih reakcija poželjno je da se zaštitna grupa otcepi pod blagimuslovima, i to tako da ne doñe do narušavanja tek uspostavljene peptidne veze.

22

R R

R R

NH-CO-NH

N C N

Z-NH-CH-COOH + H2N-CH-CO-Y

Z-NH-CH-CO-NH-CH-CO-Y +

1

1 2

2 (DCC)

zaštićeni peptid dicikloheksilkarbamid

dicikloheksilkarbodiimid (DCC)

Aktivacija COOH grupe pri sintezi peptida

� Najčešće-prevoñenje u hlorid kiseline – nije uvek pogodna, nepoželjne sporedne reakcije

� Upotreba dicikloheksilkarbodiimida

CH2Cl

R

CH3

CH3

CH3

O

O

CH2-O-CO-CH-NH-t-Boc

R

P + H3C-O-CH2Cl

kopolimer stiren-divinilbenzen

hlormetil-metiletar

SnCl4/hlormetilovanje

P + O-CO-CH-NH-t-Boc

1

t-Bochlormetilovana smola t-Boc-aminokiselina

_

P

1

t-Boc-aminoacil polimer

HCl/CH3COOHili CF3COOH/CH2Cl2

odstranjivanjet-Boc grupe

Uspostavljanje peptidne veze na čvrstom nosaču (Merifildov postupak)

•prednost-velika brzina (6 ak u danu)•nema problema po pitanju rastvorljivosti•operacije su jednostavnije i lako se izvode•proces može da se automatizuje

(t-butiloksikarbonil)

23

CH2-O-CO-CH-NH3

R

P

1+

Cl_

Et3N/CH2Cl2neutralizacija

CH2-O-CO-CH-NH2

R

R

P

1

+ t-Boc-NH-CH-COOHDCC/CH2Cl2

2uspostavljanje peptidne veze

CH2-O-CO-CH-NH-CO-CH-NH-t-Boc

R R

CH2Br

R R

t-Boc-dipeptidil polimer

HBr/CF3COOH/HF

P

1 2

otcepljivanjesintetizovanog peptida sa polimera

P + H2N-CH-CO-NH-CH-COOH

12

brommetilovani polimer dipeptidNedostaci•otežano razdvajanje•reakcije ne idu do kraja, ostaju pratioci

Efekat faznog prinosa na ukupan prinos u sintezi peptida

82111,7100

90321351

94512931

96644421

98806611

99,8%98%96,8%

Ukupan prinos finalnog peptida (%),

kada je prinos svake faze:Broj ostataka a.k.

u finalnom

polipeptidu

Sinteza u ćeliji – belančevina od 100 a.k. za 5 s, uz potpunu tačnost

Za par dana

24

sinteza glukagona (proteinski hormon pankreasa), Vinš

fragment l: AK 1-6 His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phefragment 2: AK 7-15 Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Aspfragment 3: AK 16-21 Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Aspfragment 4: AK 22-26 Phe-Val-Gln-Trp-Leufragment 5: AK 27-29 Met-Asn-Thr

Sinteza polipeptida iz fragmenata

Za uspostavljanje peptidnih veza izmeñu pojedinih fragmenata korišćena je kombinacija dicikloheksilkarbodiimida i N-oksisukcinimida

Z1-NH-AK 22-26 COOH + H2N-AK 27-29 COO-t-Bu

fragment 4 fragment 5

Z1-NH-AK 22-29 COO-Y

Z1-NH-AK 16-21 COOH + H2N-AK 22-29 COO-t-Bu

fragment 3

Z1-NH-AK 16-29 COO-Y

Z1-NH-AK 7-15 COOH + H2N-AK 16-29 COO-t-Bu

Z1-NH-AK 7-29 COO-Y

fragment 2

25

Z2-NH-AK 1-6 COOH + H2N-AK 7-29 COO-t-Bu

fragment 1

Z2-NH-AK 1-29 COO-t-Bu

H2N-AK 1-29 COOH

glukagon

zaš. polipeptid

otcepljivanjezaš. grupa

Z1 – 2-nitrobenzensulfonil ostatak, Z2 – N-diadamantiloksikarbonil ostatak,

t-Bu – terc- butil ostatak.

(CF3COOH)

fragment 2fragment 1

1 5 10 15H2N-His-Ser-G1n-G1y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-

fragment 3 fragment 4 fragment 5

20 25 29-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH

� Dejstvom trifluorsirćetne kiseline otcepljene su zaštitne grupe i kao krajnji proizvod je dobijen sirovi glukagon, koji odgovara sledećoj strukturi:

•izbegnuta otežana rastvorljivost i usporavanje brzine reakcije•opasnost od racemizacije povećana

26

Definisanje belančevina

Saznanja o aminokiselinskom sastavu su neophodna, ali ne i dovoljna da bi se na osnovu samo ovih podataka mogla definisati bilo koja belančevina.

� Da bi se došlo do odgovora, neophodno je poznavanje � veličine molekula, � njihovih struktura i

� meñusobnih odnosa svih prisutnih aminokiselinskih ostataka, kao i

� prostornog oblika u celini, ali i u pojedinostima.

Odreñivanje molekulske veličine

Krioskopska i ebulioskopska metoda, su praktično

neprimenljive za utvrñivanje mase zbog slabe

rastvorljivosti belančevina

� Od hemijskih metoda za odreñivanje veličine

makromolekulskog sistema često se koristi

metoda kvantitativnog odreñivanja krajnjih grupa

� MALDI/MS (matrix assisted laser

desorption/ionisation mass spectrometry)

� ESI MS (electron spray ionisation mass

spectrometry)

27

S S

S

S

S

S

G-I-V-E-Q-C-C-A-S-V-C-S-L-Y-Q-L-E-N-Y-C-N

F-V-N-Q-H-L-C-G-S-H-L-V-E-A-L-Y-L-V-C-G-E-R-G-F-F-Y-T-P-K-A

niz A

niz B

5 10 15

5 10 15

20

25 3020

Primarna struktura insulina

Odreñivanje primarne strukture belančevina

� Senger - metodom obeležavanja slobodnih NH2 grupa krajnjih aminokiselina dinitrofenil- (DNP-) ostatkom, utvrdio krajnje amino grupe kod insulina – Gly i Phe

� Parcijalnom hidrolizom i identifikacijom a.k. utvrñen sastav insulina

Odreñena kombinacijom hemijskih i enzimskih metoda

MM=5733 g/mol

Razlike u aminokiselinskom sastavu niza A insulina različitog porekla

– Cys – Thr – Ser – Ile –Kit

– Cys – Thr – Gly – Ile –Konj

– Cys – Ala – Gly – Val –Ovca

– Cys – Thr – Ser – Ile –Svinja

– Cys – Ala – Ser – Val –Goveče

7 8 9 10

Aminokiseline u položajima 7-10 niza A insulinaPoreklo insulina

28

Potpuno prostorno definisanje belančevina

� primarna struktura- regulisana kovalentnim vezama- nedovoljna za definisanje belančevina;

� prostorno definisanje pravilno izgrañenih fragmenata – sekundarna struktura;

� prostorno definisanje jedinstvenih makromolekulskih nizova, uključujući i pravilno i nepravilno izgrañene fragmente – tercijarna struktura;

� prostorno definisanje makromolekulskih sistema, izgrañenih od više nizova meñusobno povezanih u agregate nekovalentnim vezama – kvaternerna struktura.

29

Prostorno definisanje pravilno izgrañenih fragmenata –sekundarna struktura

� primarna struktura - regulisana kovalentnim vezama

(dužina i uglovi)

� sekundarna struktura – regulisana diedralnim uglovima ϕi ψ

� vrednosti ovih uglova su pozitivne za rotaciju u smeru kretanja kazaljke na satu i negativne ukoliko je rotacija suprotna.

� Spirala - okarakterisana

� korakom zavojnice, p, i

� brojem aminokiselinskih ostataka po jednom koraku zavojnice, n(→visina pojedinog a.k. ostatka, d)

Prostorno definisanje pravilno izgrañenih fragmenata –sekundarna struktura

�kod α-keratina,

�miozina u zbijenom stanju,

�hemoglobina.

dve intramolekulske

vod. veze

30

31

Strukturni parametri najvažnijih prostornih oblika spirala belančevina

vrednosti u zagradi su iz drugih izvora

0,6950,9360,5600,6000,541p,nm

0,3470,3120,2800,2000,150d, nm

2,003,002,003,003,61n

315°326°250°154° (176°)123° (136°)ψ

40°103°105°131° (106°)132° (113°)ϕ

antiparalelni β-naborani

niz

spirala poliproli-

na2 γ-traka310-spira1a

α-spirala

32

� α-spirala, za koju je tipičan predstavnik vlakno vune, (i epidermin, miozin i fibrinogen pojavljuju se u ovom obliku, kao i većina keratina),

� β-naborani list, ranije poznat i kao β-keratinska struktura, predstavlja sledeći prostorni oblik belančevina, čiji je najtipičniji predstavnik fibroin svile (u ovom obliku susreće i keratin ptičjeg perja kao i neki skeletni delovi životinja koje ne pripadaju sisarima) i

� kolagen kože i vezivnih tkiva koji pripada trećoj grupi fibrilarnih belančevina za koje je karakteristična trojna spirala (poliprolin).

Kod fibrilarnih belančevina se najčešće susreću tri tipa struktura:

Način uspostavljanja vodoničnih veza kod β-naboranog niza.

Karakteristični aminokiselinski ostaci R su orijentisani upravno na pravac

rasprostiranja niza.

Struktura ββββ-naboranog lista i fibroin

� Fibroin svile je izgrañen od antiparalelno orijentisanih polipeptidnih nizova, koji uspostavljanjem intermolekulskih vodoničnih veza obrazuju strukturu naboranog lista kako su to definisali Poling i Kori, 1951. g.

Gly:Ala:Ser=3:2:1

33

Šematski prikaz naizmeničnog prostornog uklapanja ostataka glikokola i alanina, antiparalelno orijentisanih slojeva fibroina svile

Obezbeñena maksimalna zbijenost reda→minimalna elastičnost i izduženje, velika jačina na kidanje

Beta strukturaAntiparalelna

Paralelna

34

αααα-Keratin

desna

10 protofibrila

u vlaknu vune, u kosi

stotine mikrofibrila

vlakno

• vuneno vlakno može da istegne na gotovo dvostruku dužinu zahvaljujući postojanju

spirala, i tom prilikom, umesto strukture α-spirale uspostavlja se izdužena struktura β-naboranog lista• elastičnost –disulfidni mostovi

makrofibrile (200 nm)

8 nm 2 nm

Trojna spirala kolagena

� kolagen je čvrst i slabo istegljiv

� fibrile kolagena - mogu da budu na veoma raznovrsne načine povezane u celine� u koži govečeta

� u rožnjači oka

� osnovna strukturna jedinica kolagena je tropokolagen � MM 285000 g/mol

� u obliku štapića dužine 300 nm i prečnika 1,5 nm.

35

Primarna struktura fragmenata kolagena (ostaci aminokiselina su označeni usvojenim sistemom sa jednim simbolom)

G-Y-D-E-K-S-A-G-V-S-V-P-G-P-M-G-P-S-G-P-R-G-L-P-G-P-

-P-G-A-P-G-P-Q-G-F-Q-G-P-P-G-E-P-G-E-P-G-A-S-G-P-M-G-

-P-R-G-P-P-G-P-P-G-K-N-G-D-D-G-E-A-G-K-P-G-R-P-G-Q-R-

-G-P-P-G--P-Q-A-R-G-L-P-G-T-A-G-L-P-G-M-K-G-H-R-G-F-

-S-G-L-D-G-A-K-G-N-T-G-P-A-G-P-K

10 20

30 40 50

60 70

80 90 100

110 120

Trojna spirala kolagena

� makromolekul se sastoji iz trojne spirale -tri pojedinačne spirale koje se meñusobno obavijaju i koje su povezane vodoničnim vezama�dve meñusobno identične - α1-nizovi

� treća slična - α2-niz

�MM nizova 95000 g/mol

� uspostavljanja spirale poliprolinskog tipa

36

Šematski prikaz isečka trojne spirale kolagenaPojedinačne poliprolinske spirale se uvijaju ulevo,

dok se trojna spirala uvija udesno

Trojna spirala kolagena

� svi ostaci glikokola orijentisani ka unutrašnjosti trojne spirale � omogućeno gušće pakovanje pojedinačnih makromolekulskih

nizova

� ostaci prolina okrenuti ka spoljašnjosti trojne spirale

� dva tipa levih spirala� spirala - poliprolin I (10 a.k. na tri zavoja, cis peptidna veza)

� spirala – poliprolin II (3 a.k. po zavoju – trans peptidna veza) →poliprolinska spirala izduženija od α-spirale

37

Etapno obrazovanje kolagenskih vlakana

Prostorno definisanje makromolekulskih nizova –tercijarna struktura belančevina

Prostorna struktura fibrilarnih belančevina

� kod vlakana vune, svile i kolagena kože → uspostavljanje αααα-spirale, ββββ-naboranog lista ili poliprolinske spirale

� ni kod jedne od ovih belančevina nije zapažena potpuna pravilnost prostorne grañe makromolekulskih nizova.

� na osnovu hemijskih istraživanja - makromolekulski nizovi nisu

izgrañeni jedinstvenim načinom smenjivanja pojedinih aminokiselina ili pojedinih fragmenata, već se susreću kraći, pravilno izgrañeni fragmenti čiji ukupni udeo obično ne prelazi 60% od ukupne mase belančevine, dok ostatak makromolekulskih nizova predstavljajunesreñena područja.

38

Prostorna struktura globulastih belančevina

Dva tipa ββββ-pregiba (I i II)

II

� Pravilno izgrañeni fragmenti se pojavljuju, sem kod fibrilarnih, i kod globulastih belančevina.

� Za razliku od fibrilarnih, kod globulastih belančevina u istom polipeptidnom nizu mogu da se sresti i različiti tipovi sekundarnih struktura (α-spirala, 310- i π-spirala, β-naborani list), pored nesreñenih područja.

Prostorni raspored lizozima koji sadrži 6 spiralnih fragmenata (40% mase belančevine) i 2 ββββ-naborana sloja sa

6 antiparalelnih ββββ-nizova i 6 ββββ-pregiba

39

Primarna struktura lizozima belančevine kokošijeg jajeta sa uspostavljenim disulfidnim vezama u položajima 6-127, 30-115, 64-80 i 76-94

Uprošćeni prikaz tercijarne strukture molekula lizozima koji obuhvata samo αααα-C atome

40

� Dejstvom rastvarača se narušavaju kontakti izmeñu pojedinačnih makromolekulskih nizova pri čemu se uspostavljaju novi kontakti makromolekula belančevina sa molekulima rastvarača.

� Zadržavaju svoj karakteristični prostorni aranžman, u neutralnim rastvaračima (dimetilformamid, hloroform, etilendihlorid itd.), ili pak u vodenim rastvorima odreñene pH vrednosti.

� Delovanjem na belančevine rastvarača sposobnih za interakcije, kao što su npr. dihlor- ili trifluorsirćetna kiselina, zatim promenom pH vrednosti vodenih rastvora ili promenom temperature, pokazalo se da su moguće i takve promene koje se pripisuju promenama prostornog rasporeda.

Ponašanje globulastih belančevina u rastvorima

Denaturisanje belančevina

narušavanjem sekundarnih veza → slučajni raspored -denaturisane belančevine

Denaturisanje može da se ostvari različitim uticajima, kao što su

� organski rastvarači,

� soli,

� karbamid,

� guanidin-hlorhidrat,

� LiCl,

� KSCN,

� CaCl2,

� NaClO4,

� promena vrednosti pH,

� detergenti,

� joni teških metala, kao i pod

� uticajem toplote;

� usled oksidacione ili redukcione razgradnje disulfidnih veza,

� oksidacijom -SH u -SO3H grupe ili pak supstitucijom funkcionalnih grupa.

41

Denaturacija∆∆∆∆

Nativni protein

Parcijalno denaturisan

Nativni protein

Hlañenje pod kontrolisanim uslovima

Neaktivan

Denaturisan

Nekontrolisanohlañenje

∆∆∆∆

Denaturisanje i regenerisanje ribonukleaze

Primarna struktura ribonukleaze (levo) i tercijarna (desno)sa disulfidnim vezama u položajima

26-84, 40-95, 58-110 i 65-72

42

Šematski prikaz denaturisanja i regenerisanja ribonukleaze

t=10 h

sati

Prostorna organizacija belančevina i biološka aktivnost

� Naziv ,,domen" za karakteristične, manje ili više složene funkcionalne fragmente.

� Funkcionalni domeni se odlikuju svojom biološkom aktivnošću, iako ne moraju da budu strukturno potpuno definisani, dok su strukturnidomeni strukturno potpuno definisani (αααα-spirala, ββββ-struktura), bez obzira na njihovu biološku aktivnost.

� Kako funkcionalni domeni mogu da premašuju veličinu strukturnih domena, nije isključena mogućnost da jedan funkcionalni domenobuhvata više od jednog strukturnog domena.

� Čest je slučaj da se ,,aktivni centar" funkcionalnog domena nalazi na granici dva strukturna domena.

Glutation reduktaza

43

Agregati. Kvaternerna struktura

� meñusobno povezivanje različitih polipeptidnih nizova� disulfidni mostovi (keratin i druge belančevine), � estarske ili veze slične estarskim (kolagen), � Vodonične veze, � Vandervalsove sile � jonske veze

� osnov meñusobnog povezivanja pojedinačnih polipeptidnih nizova u molekulske agregate: � dimere, � trimere, � tetramere, � heksamere – oligomere, i � multimere.

� makromolekuli belančevina se samo izuzetno pojavljuju kao izolovani nizovi

Agregati. Kvaternerna struktura

� Fibrilarne belančevine – makroskopski vidljivi oblici – vlakno vune, fibrion svile, kolagen kože

�definisane – dužinom, prečnikom, debljinom

vlakna, jačinom na kidanje, izduženjem...

� Globulaste belančevine – sferne ili manje ili više izdužene čestice

44

Kvaternerna struktura

Uporedni šematski prikaz oblika i veličina nekih globulastih belančevina

Molarne mase nekih belančevina odreñene merenjem brzine sedimentacije u ultracentrifugi

Belančevina Molarna masa, g/mol M/17500

Mioglobin Mlečni albumin Citohrom c Pepsin Kazein Hemoglobin Edestin Serum-albumin

16900 17400 15600 35500 33600 34300 49500 70000

~1 ~1 ~1 ~2 ~2 ~2 ~3 ~4

A. Molarne mase belančevina koje se pokoravaju Svedbergovom pravilu

B. Molarne mase belančevina koje se ne pokoravaju Svedbergovom pravilu

Belančevina Molarna masa, g/mol M/17500

Gliadin Hordein Zein Lakto-globulin Albumin jajeta Žuti ferment Serum-globulin

27500 27500 40000 41500 44000 82000

167000

~1,5 ~1,5 ~2,5 ~2,5 ~2,5 ~4,5 ~9,5

Svedbergovo pravilo - prosečne veličine osnovnih jedinki koje izgrañuju složene sisteme belančevina

su približno iste i odgovaraju umnošcima molarne mase od oko 17500 g/mol.

45

Hemoglobin

Disocijacija molekulskih kompleksa belančevina

� Belančevina koja se sastoji samo od dva polipeptidna niza može da se razloži (disocira) na pojedinačne polipeptidne nizove.

� Ukoliko je broj polipeptidnih nizova koji su ugrañeni u kompleksni sistem belančevine veći od dva, disocijacija ovakvih sistema može da se odigra i na različite načine: � da se kompleks odmah razloži do pojedinačnih polipeptidnih

nizova,

� da razlaganjem složenog sistema nastaju manji, ali još uvek složeni sistemi-subjedinice, koji se u narednom stupnju razlažu do pojedinačnih polipeptidnih nizova,

� da razlaganjem složenog sistema nastaju kako subjedinice tako i pojedinačni polipeptidni nizovi, pri čemu subjedinice i dalje mogu da se razlažu.

46

Disocijacija molekulskih kompleksa belančevina

kompleks belančevine = x polipeptidnih nizova

kompleks belančevine = y subjedinica = y · x polipeptidnih nizova

kompleks belančevine = y subjedinica + z polipeptidnih nizova

y subjedinica = y · x polipeptidnih nizova

� Samo razlaganje je povratna reakcija, što znači da otklanjanjem uzroka razlaganja dolazi do ponovne asocijacije polipeptidnih nizova u subjedinice odnosno kompleksnu belančevinu.

� Ovaj proces poznat je i pod imenom agregacija, a samo razlaganje bi prema tome bilo dezagregacija.

Veze koje održavaju kvaternernu strukturu

47

Kvaternerne strukture značajnih belančevina

Za proučavanje i definisanje kvaternerne strukture koriste se sledeće metode:

� Rentgenostrukturna analiza koja pruža mogućnost čak i pri manjoj moći razlaganja da se u prostornom razmeštaju uoče pojedine subjedinice, čak i polipeptidni nizovi.

� Elektronska mikroskopija omogućava da se prostorni rasporedi pojedinih subjedinica učine vidljivim.

� Analiza krajnjih grupa pruža mogućnost da se odrede krajnje grupesvakog polipeptidnog niza.

� Metoda parcijalne enzimske hidrolize ili selektivne razgradnjemetodom sa bromcijanom omogućuje da se utvrdi broj polipeptidnih nizova.

� Denaturisanje i utvrñivanje broja subjedinica ili peptidnih nizova nastalih posle denaturisanja Svedbergovom metodom odreñivanja brzine sedimentacije u ultracentrifugi, omogućava da se utvrdi broj subjedinica ili polipeptidnih nizova.

� Ukoliko su polipeptidni nizovi meñusobno različiti, postoji mogućnost da se posle denaturisanja izvrši razdvajanje metodom elektroforeze, protivstrujne raspodele ili hromatografski.

� Broj subjedinica može se utvrditi i primenom metode izotopa.� Razjašnjenju kvaternerne strukture enzima može se doprineti odreñivanjem

broja mesta vezivanja supstrata.

48

.

α niz – 141 a.k.

β niz – 146 a.k.osim α2β2 postoje i α2δ2 i α2γ2

visoka konc.soli

pH>9.0/pH<<4.7

Transportne belančevine

� Najbolje proučene: hemoglobin i mioglobin

49

Kontakti izmeñu subjedinica oksihemoglobina i dezoksihemoglobina

Indeksi 1 i 2 predstavljaju redne oznake nizova.

1--α2β2

2--α2β2

-1

51

9869

α2β2α2β2

Dezoksihemoglobin

--

--

--

α2β2α2β2

--

51

11080

α2β2α2β2

Oksihemoglobin

Broj

jonskih

veza

Broj

vodoničnih

veza

Broj hidro-

fobnih veza

Kontaktne

subjediniceVrsta hemoglobina

vezivanjem kiseonika dolazi do promene kvaternerne strukture oksihemglobina u

odnosu na dezoksihemoglobin → alosterija

50

Složene belančevine (konjugovane belančevineili proteidi)

Podela prema hemijskoj strukturi neproteinskogdela:

� Glikoproteidi

� Lipoproteidi

� Nukleoproteidi

� Fosfoproteidi

� Metaloproteidi

� Hemoproteidi

� Flavoproteidi

Glikoproteidi

� sadrže polisaharide

� ulaze u sastav vezivnog i koštanog tkiva kao i u

sastave ćelijskih membrana

� na primer, fibronektin i proteoglikani su značajne

komponente ekstracelularnih prostora koji okružuju ćelije mnogih tkiva životinja.

� sastavni deo i drugih složenih prirodnih

proizvoda kao što su biljne sluzi, lektini, ricin,

arabin i sl.

51

Lipoproteidi

� sadrže lipidne molekule

� imaju važnu biohemijsku ulogu u organizmu

� ulaze u sastav krvne plazme mitohondrija,

plastida, ribozoma i drugih ćelijskih struktura

Nukleoproteidi

� sadrže nukleinske kiseline

� imaju veliku ulogu u skladištenju i prenosu

genetskih informacija

� nalaze se uglavnom u jezgru ćelija

� virusi, pa čak i hromozomi su kompleksne

nukleo-proteinske strukture

� pojedini enzimi su nukleoproteidi

52

Fosfoproteidi

� proteinska organska jedinjenja pri čemu je

fosfatna grupa najčešće esterifikovana

hidroksilnim grupama serina, treonina ili tirozina.

� na primer, kazein, osnovna belančevina mleka, sadrži mnoge fosfatne strukture i služi kao izvor fosfora pri

rastu dece.

Metaloproteidi

� kompleksna jedinjenja belančevina i jona metala

(gvožñe, cink, bakar)

� često se nazivaju enzim-proteini

� ulaze u sastav nekih enzima kao što su

katalaza, peroksidaza i sl.

katalaza

53

Hemoproteidi

� sadrže porfirinski prsten i predstavljaju u suštini podklasu metaloproteida

� prostetska grupa hem se najčešće sreće kod hemoglobina, mioglobina i citohroma.

� hem se sastoji od protoporfirina i gvožñe(II)-jona.

N

N

N

N

COOCOO

Fe2+

__

mioglobin153 a.k.

Flavoproteidi

� sadrže flavin

� imaju značajnu ulogu u oksido-redukcionim

procesima u organizmu

� spadaju u grupu koenzima

� najvažniji flavinski koenzimi su

� flavin-mononukleotid i

� flavin-adenin-dinukleotid

� najznačajniji flavoproteidi su oni koji sadrže

riboflavin.