EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD BIOTRANSFORMADORA DE LA CEPA NATIVA DE Fusarium oxysporum SOBRE EL β-D-GLUCOPIRANOSIL-

ESTER DEL ÁCIDO (-)16-(β-GLUCOPIRANOSILOXIL)-17-HIDROXI-KAURAN 19-OICO E IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS

SECUNDARIOS.

ANA MERCEDES MEDINA BUELVAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA CON ÉNFASIS EN INDUSTRIAL

BOGOTÁ.D.C, NOVIEMBRE 16 2001

EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD BIOTRANSFORMADORA DE LA CEPA

NATIVA DE Fusarium oxysporum SOBRE EL β-D-GLUCOPIRANOSIL-ESTER DEL ÁCIDO (-)16-(β-GLUCOPIRANOSILOXIL)-17-HIDROXI-

KAURAN 19-OICO E IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS.

ANA MERCEDES MEDINA BUELVAS

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el título de

magíster en microbiología.

Director RUBÉN DARÍO TORRENEGRA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA CON ÉNFASIS EN INDUSTRIAL BOGOTA.D.C, NOVIEMBRE 16

2001

NOTA DE ACEPTACIÓN

Dra. MARY SANTELLA

Dr. JORGE ROBLES

Dr. OMAR FUENTES

NOTA DE ADVERTENCIA Los criterios expuestos, las opiniones expresadas y las conclusiones

anotadas son responsabilidad del autor y no comprometen en nada a la

universidad.

Artículo 23 de la resolución número 13 de julio de 1964.

EL AUTOR.

Has de permanecer vigilante, para que

tus éxitos profesionales, no te hagan olvidar, cual es el verdadero fin de tu

Trabajo ¡la gloria de Dios! J. E. B

AGRADECIMIENTOS

Les agradézco de todo corazón:

Al doctor Rubén D. Torrenegra.

A Martha. M. Gonzáles, Paola Daza, Ana Oliveros, Adriana Chitiva, Samira Rueda, Constanza Cabrera, Nelly Diaz.

A los profesores Martha Ramirez, Marcela Franco, Martín Bayona, Álvaro

Granados.

Que con su apoyo me hicieron sentir que no importa comenzar el camino

con las mínimas condiciones, si encontramos personas que ante las

dificultades expresan su fraternidad.

A mis padres y a la Santísima Virgen que con su amor me apoyan en todo momento y Dora Yamile (Q.E.P.D) por animarme a seguir mis sueños.

CONTENIDO

Pág INTRODUCCIÓN 1 2. MARCO REFERENCIAL 2

2.1 BIOTRANSFORMACIÓN 2

2.1.1 Tipos de biotransformación 2

2.1.2 Tipos de reacciones 3

2.1.3 Transformaciones con esporas 3

2.2 TERPENOS 4

2.2.1 Kaurenoides 4

2.3 BIOTRANSFORMACIONES DE DITERPENOS KAURENOIDES 4

2.4 BIOTRANSFORMACIÓN POR Fusarium 7

2.5 Fusarium 10

2.6 Fusarium oxysporum 10

2.7 Importancia biotecnológica del género Fusarium 11

3. MÉTODOS 19

3.1 Activación de cepas fúngicas conservadas en suelo 19

3.2 Esporulación 19

3.3 Cultivos monospóricos 19

3.4 Recolección y preservación de conidios 20

3.5 Recuento de conidios 20

3.6 Determinación de posibles cepas transformadoras 21

3.7 Extracción de productos biotransformados y metabolitos

secundarios 21

3.8 Purificación e identificación de sustancias 21

3.9 Actividad antimicrobiana 22

3.9.1 Actividad antibacteriana 22

3.9.2 Actividad antifúngica 22

4. EXPERIMENTACIÓN 23

4.1 Activación de cepas 23

4.2 Obtención de conidios 25

4.3 Selección de la posible cepa transformadora 25

4.4 Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa nativa

de Fusarium oxysporum F-14 26

4.5 Aislamiento y purificación de productos 27

4.6 Identificación del metabolito mayoritario secundario 28

4.7 Rendimiento 28

4.8 Actividad antibacteriana de la sustancia F1 29

4.8.1 Prueba de sensibilidad por difusión en pozos 29

4.8.2 Concentración mínima inhibitoria 29

4.8.3 Concentración mínima bactericida 31

4.8.4 Prueba de sensibilidad por difusión con discos 31

4.8.5 Método de siembra en estrías 31

4.9 Actividad antifúngica 33

5. RESULTADOS 34

5.1 Activación de cepas 34

5.2 Selección de la cepa transformadora 34

5.3 Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa nativa

de Fusarium oxysporum por CCD.

5.4 Aislamiento y purificación de productos 35

5.5 Identificación del metabolito secundario mayoritario 35

5.6 Rendimiento 38

5.7 Actividad antibacteriana del cloranfenicol 42

5.8 Actividad antifúngica del cloranfenicol 47

6. DISCUSIÓN 51

6.1 Selección de la cepa 51

6.2 Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa nativa

de Fusarium oxysporum F-14 51

6.3 Identificación del metabolito secundario mayoritario 52

6.4 Actividad antimicrobiana del cloranfenicol 53

6.4.1 Actividad antibacteriana 53

6.4.2 Actividad antifúngica 54

6.5 Rendimiento del cloranfenicol 54

7. CONCLUSIONES 56

8. RECOMENDACIONES 57

BIBLIOGRAFÍA 58

ANEXOS

LISTA DE TABLAS

Pág

Tabla 1. Actividad biológica de los kauranos 5

Tabla 2. Biotransformaciones xenobióticas 8 Tabla 3. Biotransformaciones biosintéticas 9 Tabla 4. Metabolitos secundarios producidos por Fusarium 16 Tabla 5. Bacterias evaluadas por el método siembra en estrías 32 Tabla 6. Asignación por analogía del espectro infrarrojo del cloranfenicol 39 Tabla 7. Datos del espectro de RMN+H del cloranfenicol 40 Tabla 8. Datos del espectro de RMN13C JMOD del cloranfenicol 41 Tabla 9. Prueba de sensibilidad por difusión en agar con pozos 43 Tabla 10. Concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol frente a Staphylococcus aureus 44

Tabla 11. Concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol frente a

Escherichia coli 45 Tabla 12. Prueba de sensibilidad por difusión con discos del cloranfenicol frente a Staphylococcus aureus 46 Tabla 13. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frenta a bacterias Gram positivas por el método de siembra en estrías 48 Tabla 14. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frente a bacterias Gram negativas por el método de siembra en estrías 49

Tabla 15. Actividad antifúngica

LISTA DE FIGURA Pág

Figura 1. β-D-glucopiranosil-ester del ácido (-) 16-

(β-glucopiranosiloxil)-17-hidroxi-kaurano-19-oico 6

Figura 2. Características macroscópicas y microscópicas de

Fusarium oxysporum F-14 12

Figura 3. Relación metabolismo secundario-nutrición y crecimiento 14

Figura 4. Diagrama de flujo 24

Figura 5. Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa

nativa de Fusarium oxysporum por CCD 36

Figura 6. Estructura del cloranfenicol 37

Figura 7. Espectro infrarrojo del cloranfenicol 39

Figura 8. Espectro de RMN+H del cloranfenicol 40

Figura 9. Espectro de RMN13C JMOD del cloranfenicol 41

Figura 10. Prueba de sensibilidad por difusión en agar con pozos

del cloranfenicol 43

Figura 11. Concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol frente a

Staphylococcus aureus 44

Figura 12. Concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol frente a

Escherichia coli 45

Figura 13. Prueba de sensibilidad por difusión con discos del

cloranfenicol frente a Staphylococcus aureus 46

Figura 14. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frente a bacterias

Gram positivas por el método de siembra en estrías 48

Figura 15. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frente a bacterias

Gram negativas por el método de siembra en estrías 49

RESUMEN

El presente trabajo evaluó la capacidad transformadora de la cepa nativa de

Fusarium oxysporum sobre el β-D- glucopiranosil-ester del ácido (-) 16- (β-

glucopiranosiloxil)- 17-hidroxi-kaurano-19-oico en el medio de transformación

para diterpenos; la evaluación de la posible transformación se evaluó por

cromatografía en capa delgada, en sílica gel 60G y en fase reversa (RP18),

donde no se observó transformación del sustrato. Paralelamente se aisló,

purificó e identificó el metabolito secundario mayoritario, producido por

Fusarium oxysporum (F-14), durante el proceso de biotransformación, el

cual se denominó sustancia F1 y corresponde por sus propiedades físicas y

datos espectroscópicos a cloranfenicol y tiene una fórmula molecular de

C11H12Cl2N2O.

Durante el ensayo de biotransformación se obtuvo un exceso de 21.3mg de

cloranfenicol, en el medio de transformación para diterpenos.

Posteriormente se evaluó la actividad antibacteriana y antifúngica del

cloranfenicol (sustancia F1), presentando éste una concentración mínima

inhibitoria (CMI) para Staphylococcus aureus de 25μg/mL y para

Escherichia coli de 37μg/mL.

El cloranfenicol hasta 400μg no presentó actividad antifúngica frente a los

dermatofitos Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes.

INTRODUCCIÓN

El β-D-glucopiranosil-ester-del ácido (-) 16 (β-glucopiranosiloxil)-17-hidroxi-

kaurano-19-oico, es un diterpeno glicosilado, aislado de hojas y flores de

Ageratina vacciniaefolia por el grupo de investigación en fitoquímica, de la

Universidad Javeriana (GIFUJ), fundado hace 25 años, el cual ha venido

estudiando plantas de la familia Asteracea y se ha encontrado que

diterpenos tipo kauranos son los compuestos mayoritarios.

Los hongos son capaces de transformar una variedad de compuestos

orgánicos como terpenos tipo kaurenoides, muchos de éstos con baja

actividad biológica, tales como antimicrobiana, antiparasitaria, citotóxica,

anti-HIV, anti-inflamatoria, hipotensiva; para lograr una mayor actividad del

compuesto, en algunos casos solo es posible por procesos de

biotransformación microbiana, dicho proceso se ha venido estudiando por el

grupo de investigación en biotransformación de la Universidad Javeriana

(GIBUJ), hace tres años.

Los procesos de biotransformación se prefieren a los químicos por su alta

especificidad, las condiciones de reacción son leves y por los beneficios

ecológicos.

Hongos filamentosos como Gibberella fujikuroi, Fusarium, Aspergillus y

Mucor han sido reportados como transformadores de diferentes diterpenos;

el género Fusarium tiene una amplia importancia biotecnológica en la

producción de metabolitos secundarios con propiedades antibacterianas,

antifúngicas, antivirales, antiparasitarias y anti-inflamatorias.

En los últimos años la búsqueda de nuevas sustancias antimicrobianas a

partir de fuentes naturales ha aumentado por la gran biodiversidad que

ofrecen, además debido al desarrollo de patógenos resistentes; por tal motivo

el grupo de biotransformación ha ampliado sus objetivos hacia la

búsqueda de estas sustancias durante los ensayos de biotransformación.

1

2. MARCO REFERENCIAL 2.1 BIOTRANSFORMACIÓN La Biotransformación es el proceso por el cual microorganismos, células

vegetales o células de mamíferos mediante sus sistemas enzimáticos son

hábiles de transformar una variedad de componentes orgánicos tales como:

hidrocarburos, terpenos, esteroides, alcaloides, antibióticos y aminoácidos

para su utilización terapeútica e industrial (Vezina, 1991; Turner, 1994).

Se prefieren biotransformaciones con microorganismos por su rápido

crecimiento y metabolismo; además poseen una variedad de enzimas con

facilidad de adaptación a ambientes artificiales económicos (Vezina, 1991).

Las ventajas de las biotransformaciones frente a procesos químicos, radica

en su especificidad por el sustrato, regioespecificidad, estereoespecificidad,

condiciones de reacciones leves, beneficios ecológicos (disminución de la

contaminación ambiental), economización de energía; es importante la

biotransformación si reemplaza varias etapas químicas. (Anke, 1997; Vezina,

1991).

Los sistemas para las biotransformaciones pueden utilizar: células completas

o enzimas purificadas; en el sistema de enzimas purificadas el control y

monitoreo es màs fácil aunque con células completas es más económico y

se cuenta con la presencia de cofactores (Davies, 1992).

2.1.1 Tipos de biotransformación

Las biotransformaciones son de dos tipos, xenobióticas y biosintéticas, en

las xenobióticas el sustrato es completamente ajeno al microorganismo,

estas transformaciones utilizan sistemas enzimáticos de baja especificidad

por el sustrato pero con una definida regio especificidad e implican uno o

2

dos pasos enzimáticos; en las biotransformaciones biosintéticas el sustrato

es semejante a un intermediario biosintético y la transformación permite

flexibilidad de la vía biosintética existente, además implica una serie de

pasos que hacen que la eficiencia sea menor que la xenobiótica ( Hanson,

1992).

2.1.2 Tipos de reacciones

• Oxidaciones: hidroxilación de posiciones saturadas, hidroxilaciones

de arenos, epoxidación, degradación parcial oxidativa, oxidación

de alcoholes y cetonas.

• Reducciones: Reducción de monocetonas, aldehídos, ácidos

carboxílicos, hidrogenación de dobles enlaces.

• Reacciones hidrolíticas: hidrólisis de ésteres de enlaces C-N,

adición de agua a enlaces C=C, hidrólisis de epóxidos, hidrólisis de

glucósidos.

• 4. Condensación y adiciones: formación de enlaces èsteres y

amidas. (Anke, 1997).

2.1.3 Transformaciones con esporas Las esporas pueden almacenarse o transportarse como catalizador

bioquìmico estable; dan conversiones altas y reproducibles del sustrato y

cantidades mínimas de productos no deseables.

Es el proceso de elección cuando el sustrato es caro y no existen equipos

para fermentación a gran escala, las esporas pueden ser inmovilizadas para

procesos de biotransformación. (Vezina, 1991).

3

2.2 TERPENOS Los terpenos son hidrocarburos, alcoholes, éteres, aldehídos y cetonas,

típicos constituyentes de los aceites esenciales de las plantas, pero también

se encuentran en especies de animales donde desempeñan un papel

fisiológico importante( vitamina A, hormona juvenil de los insectos).

Estructuralmente están constituidos por unidades de isopreno y se clasifican

según las unidades de isopreno que se unen (Gros, 1985).

Los terpenos pueden sintetizarse a través de dos vías: Vía del mevalonato y

la vía del no mevalonato (Dewick, 1999).

2.2.1 Kaurenoides Son una clase de diterpenos que contienen un esqueleto tetracíclico rígido.

La mayoría de kauranos encontrados en la naturaleza provienen de

reacciones de oxidación y/o epoxidación e hidrólisis.

Su importancia radica en que dan origen a las giberelinas, hormonas de

crecimiento en plantas (Dewick, 1999) y en su actividad biológica (tabla 1).

El β-D –glucopiranosil-ester del ácido (-) 16 (β-glucopiranosiloxil)-17-hidroxi-

kauran-19-oico es un diterpeno glicosilado, aislado de las hojas y flores de

Ageratina vacciiniaefolia por el grupo de Fitoquímica de la Universidad

Javeriana, (Pescador, 1996), con fórmula molecular de C32H52O14, cuya

estructura se presenta en la figura 1.

2.3 BIOTRANSFORMACIONES DE DITERPENOS KAURENOIDES. Las transformaciones que con mayor frecuencia se presentan son

hidroxilaciones.

4

Tabla 1. Actividad biológica de kauranos (Ghisalberti, 1997).

ACTIVIDAD

KAURANO

ESPECIFICIDAD

Reguladora en el crecimiento de plantas

Ácido grandiflorénico

Estimula la formación de α

amilasa de cebada

Antimicrobiana

Ácido grandiflorénico

Inhibidor del crecimiento B. subtilis, S. aureus, E. coli

Antiparasitaria

Ácido-19-kaurenoico

T. cruzi, B. gabata

Anti-inflamatorio

Ácido-19-kaurenoico

Inhibición de malondialdehído

Anti-HIV

Ácido kauren-13-hidroxi-19-

oico

Replicación en células

linfocíticas H9

Hipotensiva

Ácido kauren-13-hidroxi-19-

oico

Renal

Citotóxico

Ácido kaurenoico

Leucemia linfocítica murina

Insecticida

Ácido kaurenoico

H. eletellum, H. Zea

T. canadiensis

5

o

o

C o

1

2

3

12

6 15

14

OH

OH

OH

OH

OH

OH

H

O

OHOH

OHOH

17

Figura 1. β-D-GLUCOPIRANOSIL-ESTER DEL ÁCIDO (-) 16- (β-GLUCOPIRANOSILOXIL)-17 – HIDROXI-KAURANO- 19-OICO

(Torrenegra, 1999).

6

7

Las biotransformaciones xenobióticas son llevadas a cabo principalmente

por C. decora, R.nigricans, A. niger y A. Ochraceus ( tabla 2).

Las biotransformaciones biosintéticas son llevadas a cabo principalmente

por Gibberella fujikuroi, hongo que de forma normal y por una variedad

de vías divergentes terpénicas, produce giberelinas, ent-kauranos y

lactonas kaurenolidas ( tabla 3).

Otros ejemplos de biotransformaciones.

Por Rhizopus: Metil ent-15-oxokaur-16-en-19-oato (Boaventura, 1995); àcido

ent- kaur-16-en-19-oico (Silva,1999); Ent-kaur-16-eno (García, 1990).

Por Gibberella fujikuroi: Ent-kaur-6,16-dieno (Fraga, 1983); Ent-16β,17-

epoxikaurano (Fraga, 1994); 14β,19-dihidroxi-ent-kaur-15-eno (Fraga, 1993);

Ent-15β,16β-epoxi-kaurano ( Fraga,1993); 18-hidroxy-9-epi-ent-pimara-7,15-

dieno (Fraga, 2000).

Por Mucor :Metil-ent-15-oxokaur-16-en-19-oato (Boaventura,1995).

2.4 BIOTRANSFORMACIÓN POR Fusarium.

• Fusarium moniliforme: 2-benzoxazolina y metoxi-benzoxalinona

(Yue,1998).

• Fusarium oxysporum: Hidroxilación del ácido dehidroabiético (Tapia,

1997).

• Fusarium solani y caucasium: Deshidrogenación C1(introduciendo

un doble enlace) pero degradan extensamente la cadena lateral

cuando existe. No requiere oxígeno. (Vezina, 1991).

8

Tabla 2. Biotransformaciones xenobióticas (Hanson, 1992)

SUSTRATO

HONGO

REACCIÓN

POSICIÓN

PRODUCTO

Ent-17-norkauran-16-ona

C. decora

R. nigricans

A. niger

A. ochraceus

Hidroxilación

Hidroxilación

Hidroxilación

1α, 6β 1α, 7β

3α

1α, 3α 3α, 7α 3α, 7β

3α

Ent-1α,6β-dihidroxi-17-norkauran-16-ona Ent-1α,7β-dihidroxi-17-norkauran-16-ona

Ent-3α-hidroxi-17-norkauran-16-ona

Ent-1α,3α-dihidroxi-17-norkauran-16-ona Ent-3α,7α-dihidroxi-17-norkauran-16-ona Ent-3α,7β-dihidroxi-17-norkauran-16-ona

Ent-3α-hidroxi-17-nokauran-16-ona

17-norkauran-16-ona

R. nigricans

A. niger A. Ochraceus

C. decora

Hidroxilación

Hidroxilación

Hidroxilación

3β

3β,7β

3β.7α

3β,9α

3β

7α 7β

3β-hidroxi-17-norkauran-16-ona

3β,7β-dihidroxi-17-norkauran-16-ona

3β,7α-dihidroxi-17-norkauran-16-ona

3β,9α-dihidroxi-17-norkauran-16-ona

3β-hidroxi-17-norkauran-16-ona

ent-7α,17-dihidroxi-17-norkauran-16-ona ent-7β,17-dihidroxi-17-norkauran-16-ona

Tabla 3. Biotransformaciones biosintéticas de diterpenos kaurenoides

(Hanson, 1992).

SUSTRATO PRODUCTO

Ent-3-hidroxi-16-en-19-lil-succinato Ent-3,7β-dihidroxikaur-16-en-19-il-succinato

Ent-3,7β,6β-trihidroxikaur-16-en-19-il-succinato

Ent-kaur-2,16,dien-19-ol

2,3-dehidro-giberelina A12 2,3-dehidro-giberelina A9

Ácido-ent-3α-hidroxikaur-16-en-19-oico

GA1, GA3, GA

Ent-3β,18-dihidroxikaur-16-eno

Ent-3β,7α,18-trihidroxikaur-16-eno

Ent-7α-hidroxi-16-eno

Ácido giberélico GA4, GA7

Ent-kaur-6,16-dieno

7-hidroxikaurenólido

Ent-18-hidroxikaur-6-16-dieno

7,18-dihidroxikaurenólido

Epicandiol

Ent-7α,18,19-trihidroxikaurenólido

Ent-12β-hidroxikaur-16-eno

12α-hidroxi-GA21 12α-hidroxi-GA25 12α-hidroxi-GA13

Ent-15β,18-dihidroxikaur-16-eno

Ent-11α,15β,18,dihidroxikaur-16-eno

Ent-15β,19-dihidroxikaur-16-eno

Ent-11α,15β,19-trihidroxikaur-16-eno Ent-7β,11α,15β,19-tetrahidroxikaur-16-eno

Ent-kaur.6,16-dieno

7-hidroxikaurenólido

18-hidroxikaur-6,16-dieno

7,18-dihidroxikaurenólido

14β,19-dihidroxi-ent-kaur-15-eno

Ácido-ent-7α,14α-dihidroxikaur-15-en-19-oico Ácido-ent-6α,7α,14α-trihidroxikaur-15-en-19-

oico Ácido-ent-15β,16β-epoxi-6α,7α,14α-

trihidroxikauran-19-oico

14β-acetoxi-15α,16α-epoxi-GA15

Ent-7α,15β-dihidroxikaur-16-eno

Ent-7α,11,15β-trihidroxikaur-16-eno

33

2.5 Fusarium. Reino: Fungi

División: Eumycota

Subdivisión: Deuteromycotina

Subclase: Hyphomycetidae

Clase: Deuteromycetes

Orden: Moniliales

Familia: Tuberculariacea

Género: Fusarium

Género descrito por Link en 1809; Presenta macro y microconidias; las

clamidosporas terminales o intercalares pueden estar o no presentes.

Se encuentran distribuidos en sustratos orgánicos; en suelo tanto en

regiones desérticas como en regiones polares. Fusarium es uno de los

géneros más heterogéneos y taxonómicamente de los más difíciles de

clasificar por métodos tradicionales, debido a la carencia de estabilidad

morfológica del grupo (Andrade, 1993); la morfología de la espora es la

principal característica de identificación(Booth, 1971).

2.6 Fusarium oxysporum

• Generalidades. Hace parte del grupo elegans (Booth, 1971); macroscópicamente presenta

un micelio aéreo esparcido, abundante, flocoso, con tinte púrpura a violeta;

diámetro 4.5-6.5cm al cuarto día a 25°C.

Microscópicamente presenta macro y micro conidias, las macroconidias son

fusiformes, moderadamente curvas, puntiagudas en los extremos, presenta

de 3-5 septos; las microconidias son abundantes, nacen de las fiálides cortas

que se ramifican a conidióforos, nunca forman cadenas, no tienen septos,

son elipsoidales a cilíndricas; Presenta clamidospora terminales o

intercalares.

34

Se encuentran distribuidos en suelo con pH neutro, a 30cm de profundidad,

en algunas ocasiones se presentan en suelos ligeramente ácidos(Traute,

1980). Los ensayos de patogenicidad han sido hasta ahora el único criterio

para diferenciar las poblaciones de Fusarium oxysporum, sin embargo

estos resultados pueden estar influenciados por factores ambientales,

método de experimentación y naturaleza del inóculo (Andrade, 1993), la

patogenicidad tiende a perderse después de repeticiones transferidas sobre

medios de agar (Traute, 1980).

• Condiciones de cultivo. Temperatura: óptima: 25-30°C. Máxima: 37°C Mínima: 5°C.

pH óptimo: 7.7 Rango: 2.2-9.0

Esporulación óptima: 20-25°C.

Fuentes de carbono: ácido succínico, ácido láctico, glicerol, manitol,

celobiosa, almidón, maltosa, sacarosa, lactosa, xilosa. Mejor fuente glucosa y

galactosa ya que incrementan la respiración y el crecimiento. (Trauter, 1980).

Fusarium oxysporum F-14 : Cepa nativa utilizada para el ensayo de

biotransformaciòn , macroscópicamente presenta un micelio aéreo esparcido,

abundante, flocoso, con tinte pùrpura a violeta; microscópicamente presenta

macroconidias fusiformes y microconidias elipsoidales, ( figura 2); fue aislada

de hojas y flores de Espeletia killipi (Pineda, 2000) e identificada por

Claves taxonómicas (Rueda, 2001).

2.7 Importancia biotecnológica del género Fusarium

Fusarium oxysporum: utilizado para la erradicación de cultivos de

Erythroxylum coca (Hebbar, 1997).

Celulolítico, puede fermentar directamente la paja a etanol, siempre que la

paja esté particulada (Wainwright, 1992).

Fusarium solani: transformador de esteroides en la posición 1-2

deshidrogenación (Wainwright, 1992).

35

Micelio aéreo, esparcido, abundante, flocoso, con tinte púrpura a violeta

Macroconidias fusiformes y microconidias elipsoidales

Figura 2. Características macro y microscópicas de Fusarium oxysporum

F-14

36

Fusarium oxysporum: Gibberella fujikuroi: degradación de cianuro por la

cianuro hidrolasa (Wainwright, 1992).

Fusarium flocciferum: degradación del fenol.

Fusarium sp: productor de metabolitos secundarios, los cuales son

compuestos que aunque no hacen parte de la composición celular del

microorganismo son generados bajo condiciones de estrés, en el umbral de

la fase estacionaria o cerca de ella; muchos de estos compuestos son

volátiles, coloreados con propiedades antagonistas, medicinales o tóxicas

(Franco, 1999) y se caracterizan por:

Cada metabolito secundario se forma únicamente a partir de

relativamente pocos microorganismos.

No son indispensables para el crecimiento y reproducción.

Son dependientes de las condiciones de crecimiento, en particular de la

composición del medio.

Suelen producir un grupo de sustancias estrechamente relacionadas.

Se puede obtener una sobreproducción notable, mientras que los

primarios no se sobreproducen.

Los enzimas que intervienen en la producción se regulan por separado

del metabolismo primario.

El producto puede no derivarse del sustrato de crecimiento primario, sino

de un producto que a su vez se formó a partir del sustrato del

metabolismo primario. ( Brock, 1991).

Se encuentran relacionados con la nutrición y el crecimiento (figura 3);

distinguiéndose las siguientes fases:

- Tropofase: período de crecimiento exponencial.

- Idiofase: limitación del crecimiento y producción de metabolitos

secundarios.

- Fase de balance: utilización de nutrientes, crecimiento exponencial, los

metabolitos secundarios son raramente producidos.

37

1 2 3

4 5

1. Fase de balance. Peso seco 2. Fase de almacenamiento. Nitrógeno 3. Fase de mantenimiento. Producto 4. Tropofase. Células 5. Idiofase. Glucosa

Figura 3. Relación metabolismo secundario-nutrición y crecimiento (Garraway, 1984).

38

- Fase de almacenamiento: deplección de nutrientes, el crecimiento

disminuye, la división celular cesa, pero el peso seco se incrementa por

la acumulación de productos de almacenamiento como lípidos y

polisacáridos, comienza la síntesis de metabolitos secundarios.

- Fase de mantenimiento: el peso seco es constante, la producción de

metabolitos secundarios baja, autolisis celular (Garraway, 1984).

Una variedad de metabolitos secundarios son producidos por el género

Fusarium; en la tabla 4 encontramos diversas estructuras de metabolitos

secundarios producidos por diferentes especies.

39

Tabla 4. Metabolitos secundarios producidos por el género Fusarium.

Fusarium METABOLITO ACTIVIDAD REFERENCIA

oxysporum

Reguladores de crecimiento en

plantas

Miersh, 1999.

moniliforme

Mutagénico para

Salmonella

Barrero, 1991

O

(CH2)n

O

OH

Ácido jasmónico

OH

O

(CH2)n

O

Ácido 7-iso-jasmónico

O

OO

OH

OH

HN

9

8

23 6

MeOFusarina-8z

N

H

OH

OH

OO

O10 8 6 4

2

1

24 23 22 CO2Me

Fusarina C

40

HONGO METABOLITO ACTIVIDAD REFERENCIA

Gibberella fujikuroi

Primer triterpeno

precursor de esteroles

Primer triterpeno

tetracíclico precursor de

esteroles

Hormonas de crecimiento en

plantas

Fernández, 2000

Tudzynski, 1999

subglutinans

Tóxico para plantas y linfocitos B

Logrieco, 1996

Escualeno

H

ent-kaurano

AH

C

DB

18 19

H7

15

1617

20

111

2

314

1312

68

Giberellinas

CH2

CH2

C

H

CC

C

HCH

CH3 OH

CH2

CH2

C

CH3CH3

CH2

C

HCH2

CHCH3C

CO CC

OH

CH CH3

CH2

OCOH3

Fusaproliferina

41

Fusarium

METABOLITOS

REFERENCIA

solani

Mendentsev, 1998

bostrycoides

Mendentsev, 1998

martii

Mendentsev, 1998

O

MeOO

O

OH

Me

OH

OH

Fusarubin

Me

MeOO

O

Me

OH

OH

OH

Solaniol

OH

O

O

MeOOH

N

bostrycoidin

MeOOH

OH

O

O

O

CH2OH

Novarubin

42

3. MÉTODOS

3.1 Activación cepas fúngicas conservadas en suelo. Para la activación de cepas conservadas en suelo, se esparcen granos de

suelo sobre cajas de petri con agar selectivo para hongos (Demain, 1986).

3.2 Esporulación. Se pueden utilizar medios sólidos para hongos altamente esporulantes y

medios líquidos para los de baja esporulación.

Medios sólidos: agar papa, sacarosa, cloranfenicol; agar harina de maíz

( Franco, 1999); en tubos de agar inclinado se siembra el microorganismo y

se deja crecer hasta que esporule a 25°C, 10h/luz.

Medios líquidos: caldo papa, glucosa, cloranfenicol, caldo malta; se adicionan

en erlenmeyer guardando una relación mínima 1/5 y se agitan a 250

revoluciones por minuto (rpm) a 25°C, 10h/luz de 5-10 días.

3.3 Cultivos monospóricos.

Esporas obtenidas en tubos con agar inclinado : se adicionan 5mL de tween

80 al 0.5%, a partir de esta suspensión se realiza una dilución 1/500, de

ambas soluciones se toma 0.1ml y se siembra por agotamiento en cajas de

petri con agar papa, sacarosa, cloranfenicol, se incuban a 25°C y se

monitorean cada dos horas hasta lograr observar una espora germinada, se

marca y la porción de medio con la espora se lleva asépticamente a un tubo

con agar inclinado, selectivo para hongos; el cultivo que se desarrolle será un

cultivo monospórico (Silverio, 1983).

43

Esporas obtenidas de caldo: se filtran con gasa para la obtención de

conidios, se les adiciona tween 80 al 0.5% y luego se realiza siembra por

agotamiento en caja de petri con agar APSC, se incuban a 25°C y se

monitorean cada dos horas hasta la germinación de una espora, se marca y

la porción del medio con la espora se lleva a un tubo con agar inclinado.

3.4 Recolección y preservación de conidios.

La solución con esporas se centrifugan a 10.000 rpm durante una hora , el

sobrenadante se descarta y las esporas se recolectan con pipeta pasteur

estéril, en tubos eppendorf con glicerol y se almacena a –5°C, también se

pueden preservar en suelo estéril colocando 1ml de suspensión de conidios

por 5g de suelo (Demain, 1986).

3.5 Recuento de conidios.

Se realizan diluciones por duplicado 10-1, 10-2, 10-3 de la suspensión de

esporas con tween 80 al 0.5% y se realiza el conteo en cámara de Newbauer

(Bauer, 1986)

células contadas Área contada x profundidad de la cámara x dilución del recuento

0.1 mm: profundidad de la cámara. Área contada : # de cuadrantes contados / # de cuadrantes totales.

44

3.6 Determinación de posibles cepas transformadoras.

Se buscan microorganismos transfomadores al azar ( Vezina, 1991). Se

toman varios hongos de géneros y especies diferentes, se cultivan en las

mismas condiciones, adicionándole igual cantidad de sustrato ( Tapia, 1997;

Demythenaere, 2001), la relación erlenmeyer / medio de cultivo utilizadas

son:

250/50 (Fraga, 2000) ; 500/100 (Silva, 1999); 250/100 (Boaventura, 1995)

y la selección de la cepa se puede realizar por:

• Cromatografía en capa delgada(CCD), por comparación de controles

(Tapia, 1997).

• Cromatografía de alta resolución en fase líquida (HPLC) (Yue, 1998).

3.7 Extracción de productos biotransformados y metabolito secundario

mayoritario. Se realiza tanto del caldo como del micelio; cultivos menores de 200mL con

embudo de separación y los de volúmenes mayores en sistema continuo

líquido-liíquido, las sustancia del micelio seco se extraen por maceración con

solventes (Silva, 1999; Fraga, 2000).

3.8 Purificación e identificación de sustancias. La purificación de las sustancias se pueden realizar por:

• Columna Sílica gel (Boaventura, 1995) (Hanson, 1994).

• Cromatografía preparativa en capa delgada en sílica gel (Hirabayashi,

1996).

45

La identificación se realiza por Resonancia magnética nuclear de

hidrógeno(RMN1H) y de carbono (RMN13C); espectrometría de rayos

infrarrojos (IR).

3.9 Actividad antimicrobiana. 3.9.1 Actividad antibacteriana.

• Prueba de sensibilidad por macrodilución y microdilución en caldo

(Koneman, 1999).

• Prueba de sensibilidad por macrodilución en agar (Koneman, 1999).

• Prueba de difusión en agar en disco (Sánchez, 1986; García, 1997).

• Método de siembra por estría (Brock, 1991).

3.9.2 Actividad antifúngica.

• Prueba de sensibilidad por macrodilución en agar, (Koneman, 1999).

46

4. EXPERIMENTACIÓN

El desarrollo de la investigación fue realizado en varias etapas; se inició con

la activación de diferentes cepas fúngicas, pertenecientes al grupo de

investigación en biotransformación de la universidad Javeriana, las cuales

fueron aisladas de plantas de Espeletia killipi cuatr y barclayana cuatr;

posteriormente se realizaron ensayos preliminares con diferentes especies

para evaluarlas como posibles transformadoras del β-D- glucopiranosil-ester

del ácido (-) 17-(β-glucopiranosiloxil)-16-ol kauran 19 oico, sustrato

suministrado por el GIFUJ, escogiendose la cepa de Fusarium oxysporum

(F-14) para los ensayos de biotransformación, por literatura; paralelamente

se identificó el metabolito mayoritario producido por este hongo, empleando

espectroscopía de rayos infrarrojos, RMN13C y RMN1H, al cual se le

determinó su actividad antibacteriana y antifúngica. Todo el procedimiento

se presenta como diagrama de flujo en la figura 4.

4.1 Activación de las cepas.

Se activaron las cepas de Fusarium: EK-14, EK-8.1, F-14; Aspergillus:

19-4, 407; Penicillium: 404, 405; Curvularia: 9-bonito; Mucor: 321, 509;

géneros reportados en literatura como transformadores de diterpenos, las

cuales se encontraban conservadas en suelo, para lo cual se esparcieron

granos de suelo sobre cajas de petri con agar papa, sacarosa y

cloranfenicol(APSC) (Booth, 1971); posterior a su crecimiento se realizaron

subcultivos en tubos con APSC y se dejaron crecer hasta que esporularon,

las cepas que no esporularon se pasaron a un erlenmeyer de 125ml con

10mL de caldo papa, glucosa y cloranfenicol(CPGC) (anexo B), se agitaron a

250 rpm en shaker; bajo 10 h/luz a 25°C; una vez esporuladas las cepas se

realizaron diluciones 10-1, 10-2, 10-3 en tween 80 al 0.5% y de éstas diluciones se realizaron cultivos monospóricos (Wiley, 1981), seguidamente

47

Figura 4. Diagrama de flujo de la metodología utilizada

Activación de las cepas Esporulación Cultivos monospóricos

Recolección masiva de conidios

Tubo Caldo

Selección de la cepa Almacenamiento Rto # de conidios -5°C, glicerol

Evaluación de la capacidad Monitoreo del sustrato

biotransformadora de la cepa por CCD

de Fusarium oxysporum F-14

Purificación CCD. Fermentación 1L

con sustrato

Sustrato Metabolito mayoritario

Fermentación 1L

sin sustrato RMN13C

Identificación RMN+H

IR

Actividad antimicrobiana

Antibacteriana Antifúngica

Rendimiento

48

se tomó una espora de cada uno de los microorganismos y se transfirió a un

erlenmeyer de 125mL con 10mL de CPGC, se incubó a 25°C a 10h/luz con

agitación constante de 250rpm.

4.2 Obtención de conidios.

Una vez esporulados los cultivos monospóricos, los cultivos en medio líquido

se filtraron con gasa para la separación de los conidios, los cultivos en medio

sólido se lavaron con tween 80 al 0.5%, tanto la suspensión obtenida en

medio líquido, como la de medio sólido, se centrifugaron a 10.000 rpm en

centrífuga modelo Clay Adams N.J 07054 durante una hora, el sobrenadante

se descartó y los conidios se recolectaron en un tubo eppendorf, se les

adicionó glicerol y se almacenaron a –5°C (Demain, 1986). El número de

conidios /mL se determinó en cámara de Newbauer (Bauer, 1986).

4.3 Selección de la posible cepa transformadora.

Las siguientes cepas fueron evaluadas: Fusarium: EK-14, EK-8.1, F-14;

Aspergillus: 19-4, 407; Penicillium: 404, 405; en 10mL de medio de

transformación para diterpenos (Hanson, 1992)(anexo A ) con 60 ppm de

Chlorocholine chloride (CCC), inhibidor de la sintetasa ent-kaurano (Hanson,

1992); a las 48 horas se adicionó 3mg del sustrato disuelto en metanol,

paralelamente se escogió la cepa F-14 para los siguientes controles.

Medio de transformación y biomasa(1x107 conidios/mL) (Tapia, 1997).

Medio de transformación y sustrato (3mg) ( Tapia, 1997)

Buffer fosfato 10mM, sustrato (3mg) y biomasa (1x107 conidios/mL) (Pineda,

2000).

Después de haber sido adicionado el sustrato, la fermentación se siguió por

nueve días (Tapia, 1997), tiempo en el cual se midió el pH para verificar la

acidez de los cultivos y seguidamente se filtraron; los micelios obtenidos se

lavaron tres veces, cada lavado se hizo con 5mL de agua destilada, se

49

secaron a 45°C y se maceraron con acetato de etilo (Tapia, 1997), el caldo

se extrajo igualmente con acetato de etilo con embudo de separación, luego

las muestras se secaron con sulfato de sodio (Oliverio, 1996) y se

concentraron en rotavapor BUCHI-RE111.

Para escoger la posible cepa transformadora se realizó cromatografía en

capa delgada, utilizando como fase estacionaria placas de sílica gel 60 G y

como fase móvil diclorometano-metanol 7:3 y se reveló con vainillina.

4.4 Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa nativa Fusarium oxysporum.

Se seleccionó la cepa de Fusarium oxysporum para los ensayos de

biotransformación en base a literatura, ya que es hongo estrechamente

relacionado con Gibberella fujikuroi, hongo más reportado como

biotransformador de kauranos (Alam, 1991; Hanson, 1992; Fraga, 2000);

además Fusarium se ha reportado como transformador de glucósidos.

Para la evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa de

Fusarium oxysporum (F-14) se realizó inicialmente un monitoreo del

sustrato por CCD, la fermentación para el seguimiento de posibles

transformaciones del sustrato, se llevó a cabo en un erlenmeyer de 500mL

con 50mL de medio de transformación para diterpenos. Al tercer, cuarto y

quinto día después de haber adicionado 20mg de sustrato, se extrajeron

15mL del cultivo cada uno de los días, se les midió el pH y se filtró, el micelio

se lavó con 15mL de agua destilada y se siguió el mismo procedimiento que

en el ensayo anterior, tanto para el micelio como para el caldo. Se realizó

cromatografía en capa delgada, de los exractos del micelio y del caldo en

placas RP18 utilizando como fase móvil metanol agua 7:3.

Posteriormente se realizó un ensayo para evaluar la capacidad

biotransformadora de la cepa de Fusarium F-14, en un erlenmeyer de

5000mL conteniendo 1000mL de medio de transformación para diterpenos; a

50

las 48 horas de fermentación se adicionaron 160mg del sustrato disueltos en

metanol; al séptimo día después de haber sido adicionado el sustrato se

midió el pH, luego el cultivo se filtró y el micelio se lavó con 50mL de agua

destilada, la extración tanto del micelio como del caldo se hizo con acetato de

etilo, el micelio por maceración y al caldo en sistema continuo líquido-líquido,

las muestras se secaron con sulfato de sodio y se concentraron en rotavapor.

Se corrió cromatografía en placas RP18 utilizando como fase móvil metanol-

agua 7:3 para la separación del sustrato ; y para la separación de metabolitos

secundarios en sílica gel 60G con diclorometano-metanol 9:1 y 7:3

observadas bajo luz ultravioleta (U.V)

4.5 Aislamiento y Purificación de productos.

Los extractos del micelio y del caldo obtenidos de la fermentación en 1L

fueron lavados con éter de petróleo y eluídos por separado en una columna

fase reversa, utilizando como fase móvil metanol-agua 7:3, se unieron las

fracciones donde se encontraba el sustrato y se eluyeron en una columna en

sílica gel con diclorometano, diclorometano-metanol 9:1, 8:2, 7:3;

nuevamente se unieron las fracciones donde se encontraba el sustrato y se

corrió cromatografía en sílica gel 60G con fase móvil diclorometano-metanol

7:3 revelada con vainillina.

Una vez separado el sustrato se unieron las fracciones restantes y se

separaron tres fracciones: diclorometano, cloroformo y acetona, ésta última

se eluyó en una columna sílica gel 60G con diclorometano-metanol 9.5:0.5

para la purificación del metabolito mayoritario, luego se corrió cromatografía

en capa delgada en sílica gel 60G con diclorometano-metanol 9:1,

observados bajo luz U.V, para confirmar la pureza.

posteriormente se realizó una fermentación en un erlenmeyer de 5000mL con

1L de medio de transformación con un inóculo de 1x107conidios/mL de

Fusarium oxysporum F-14, para determinar si el metabolito mayoritario

51

producido por el hongo era inducido o no por el sustrato y para obtener

mayor cantidad del metabolito.

4.6 identificación Se realizó la prueba de solubilidad con los siguientes solventes:

diclorometano, acetato de etilo, metanol, cloroformo y acetona.

Microfusión sódica: se tomaron 5mg de la sustancia F1 con un pedacito

de sodio y se llevó a la fusión sódica para la determinación de nitrógeno

con base a la reacción de ferrocianuro férrico.

Rf: se determinó en placas de sílica gel 60G corridas con diclorometano-

metanol: 9:1.

Punto de fusión : se realizó en un fusiómetro MEL-TEMP, laboratory.

Devices. Mass 02139.

Pruebas

Absorción Ultravioleta : en un spectronic 2000 Bausch&Lomb.

Rotación óptica: en un polarímetro Polartronic E. SCHMID-HAENSCH.

Espectrometría de rayos infrarrojos en un equipo FTIR-8300 SHIMADZU.

Resonancia magnética nuclear de Carbono 13 y de Hidrógeno: en un

espectrómetro de resonancia magnética nuclear Jeol FX 90Q de 90MH.

4.7 Rendimiento de la sustancia F-1

Se determinó:

- La cantidad de sutancia F1 producida en 1L de medio de transformación

producida por un inóculo de 1x107conidios/mL de Fusarium oxysporum.

- Rendimiento en biomasa : Y= biomasa/sustrato x 100 (Scragg, 1997).

- Rendimiento en producto: Y= producto/sustrato x 100 (Scragg, 1997).

- mg de producto / g de peso seco de biomasa (Scragg, 1997).

52

4.8 Actividad antibacteriana de la sustancia F1. 4.8.1 Prueba de sensibilidad por difusión en agar en pozos.

Fueron evaluadas las siguientes bacterias:

Bacillus subtilis: Bacilo Gram positivo, formador de endosporas

Escherichia coli: Cocobacilo Gram negativo.

Staphylococcus aureus: Coco Gram positivo.

Se tomaron placas con agar Mueller Hinton a las cuales se le realizó cuatro

perforaciones a cada una de las cajas, cada perforación con un diámetro de

6mm; seguidamente se sembró el microorganismo masivamente con un

inóculo equivalente al estándar de Mc Farland de 0.5, en fase exponencial;

por otra parte 5mg de la sustancia F-1 fueron disueltos en 2mL de

dimetilsulfóxido(DMSO).

En el 1er pozo, de cada una de las cajas, se adicionó 62.5μg de la sustancia

F-1, en el 2do pozo 100μg, en el 3er pozo 125μg y en el 4to pozo sólo DMSO.

Cada microorganismo se evaluó por duplicado en agar Mueller Hinton y la

actividad antimicrobiana se determinó por la presencia de halos de inhibición.

4.8.2 Concentración mínima inhibitoria (CMI) Se determinó la CMI de la sustancia F1 frente a Escherichia coli y

Staphylococcus aureus, por la prueba de sensibilidad en caldo.

A. Preparación del inóculo

Los microorganismos (S. aureus y E. coli) se dejaron toda la noche a 35°C

en agar nutritivo.

- En 2mL de caldo tripticasa de soya, y se inocularon aproximadamente 5

colonias provenientes de la placa de agar y se corrigió la turbidez para

que fuera equivalente al estándar de Mc Farland 1.

- De la suspensión anterior se transfrió 0.1mL a 10mL de caldo tripticasa

de soya y se incubó por seis horas, esto representa el punto medio de la

fase exponencial.

53

- Se estandarizó el inóculo haciéndolo coincidir con el estándar de Mc

Farland 0.5 en 3mL de caldo tripticasa de soya.

- El inóculo estandarizado se diluyó1:10 en caldo tripticasa de soya

(aproximadamente 5x106UFC/mL).

- Se tomaron 5 tubos con 4mL de caldo tripticasa de soya y se evalúo la

sustancia a diferentes concentraciones: 6μg/mL, 12μg/mL, 25μg/mL,

37.5μg/mL, 50μg/mL; a cada tubo se le adicionó 0.1mL del inóculo diluido,

además se incluyeron los siguientes controles:

Control de esterilidad: 4mL de caldo tripticasa de soya.

Control positivo : 4mL de caldo + amoxacilina 3μg/mL

Control negativo: 0.1mL de suspensión bacteriana+4mL de caldo.

Control DMSO: 0.1mL de DMSO + 0.1mL de suspensión bacteriana+4mL de

caldo.

Posteriormente se incubaron los tubos por 20 horas a 37°C.

B. Cuantificación del inóculo.

- A partir de la dilución final del inóculo se les realizó 4 diluciones seriadas

al décimo en caldo tripticasa de soya.

- Se colocó 0.1mL sobre la superficie en una placa con agar Mueller-Hinton

y se distribuyó el inóculo uniformente .

- se incubaron las placas a 35°Cx 24horas, pasado este tiempo se realizó

el conteo de las UFC/mL.

Determinación de la CMI. Después de la incubación de los tubos se determinó la menor concentración

de la sustancia F1, que impide el crecimiento in vitro de las bacterias (CMI)

de forma visual y por determinación en absorbancia a 500nm.

54

4.8.3 Concentración mínima bactericida.

Después de la determinación de la CMI se incubaron los tubos por 4 horas

más y de los tubos aparentemente límpidos se distribuyó 0,1mL de cada tubo

en la superficie de las placas de agar Mueller-Hinton y se incubaron por

24horas a 37°C, terminado este tiempo se contaron las colonias y se

determinó la concentración mínima de la sustancia que mata el 99.9% de

UFC/mL.

La CMI y la CMB se evaluaron por duplicado.

4.8.4 Prueba de sensibilidad por difusión con discos. Se tomaron placas con agar Mueller-Hinton y se sembró masivamente con

un inóculo de Staphylococcus aureus en fase exponencial equivalente al

estándar de Mc Farland de 0.5, posteriormente se colocó sobre la superficie

del medio, discos con una carga de 25μg y 50μg de la sustancia F1,

utilizándose como control, sensidiscos de eritromicina 15μg y vancomicina

30μg; a las 24 horas se determinó el diámetro del halo de inhibición del

crecimiento.

4.8.5 Método de siembra en estrías. La actividad antibacteriana fue ampliada con otras bacterias por el método de

siembra en estrías (Brock, 1991), el cual permite evaluar diferentes bacterias

en una misma caja.

Se tomaron cajas de Mueller-Hinton y se realizaron perforaciones centrales

donde se colocó 200μg de la sustancia F1; se tomaron dos cajas para

evaluar bacterias Gram positivas y dos para Gram negativas, las bacterias

evaluadas se presentan en la tabla 6.

55

Tabla 5. Bacterias evaluadas por el método de siembra en estrías.

Bacterias Gram positivas

ESTRÍA # BACTERIAS 1 Bacillus cereus 2 Bacillus subtilis 3 Streptococcus mutans 4 Staphylococcus epidermidis 5 Streptococcus pyogenes 6 Staphylococcus aureus

Bacterias Gram negativas

ESTRÍA # BACTERIAS 1 Citrobacter freundii 2 Escherichia coli 3 Salmonella tiphy 4 Klebsiella pneumoniae 5 Pseudomonas aeruginosa 6 Proteus sp

56

4.9 Actividad antifúngica.

Se realizó por el método de macrodilución en tubos con agar inclinado

(Rodríguez, 1999); los hongos evaluados fueron los dermatofitos

Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes.

Se tomaron tubos de 10x150 y se les adicionó 4mL de agar saboureand sin

solidificar y se agregó a cada tubo cantidades diferentes de la sustancia F1

400μg, 200μg, 100μg, 50μg, se dejó solidificar y se sembró el hongo con un

asa de disección, en el centro del bisel, además se realizó un control positivo

con 50μg de Ketoconazol; un control negativo, un control de esterilidad y un

control con DMSO. La prueba se dejó por 12 días y se evaluó por la

presencia o ausencia de crecimiento comparada con los controles.

57

5. RESULTADOS 5.1 Activación de las cepas. Las cepas de Fusarium, Curvularia y Mucor 321 no esporularon en APSC

por lo que fue necesario pasarlas a CPGC, de estas cepas no se pudieron

recolectar esporas suficientes de la Curvularia ni del Mucor 321 por esto

fueron descartados. Se seleccionarion las siguientes cepas para ser evaluadas: Fusarium: EK-14, EK-8.1, EK-16, F14; Aspergillus: 19-4, 407;

Penicillium: 404, 407, ya que fueron de los géneros reportados, las cepas de las que se pudo recuperar gran cantidad de

conidios.

5.2 Selección de la cepa transformadora. Terminada la fermentación el pH estaba en 2.0 en todos los cultivos.

En las cromatografías realizadas a los extractos del micelio y del caldo, de

cada uno de los cultivos no se pudo observar ninguna mancha similar al

patrón, posiblemente por degradación del sustrato, se procedió a escoger la

cepa de Fusarium oxysporum F-14 para evaluar su capacidad

biotransformadora, porque es un hongo estrechamente relacionado con

Gibberella fujikuroi, hongo más reportado como transformador de kauranos

(Alam, 1991; Hanson, 1992; Fraga, 2000), además Fusarium ha

transformado glucósidos (Yue, 1998).

5.3 Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa nativa de Fusarium oxysporum .

En los ensayos del monitoreo del sustrato y fermentación a 1L, para evaluar la capacidad biotransformadora de la cepa de F. oxysporum; el sustrato no presentó cambios en CCD en sílica gel 60G con fase móvil diclorometano-metanol 7:3; y en cromatografía en RP18 con fase móvil metanol-agua 7:3 (figura 5); la cromatografía para metabolitos secundarios reveló una mancha en gran cantidad que se decidió purificar.

58

5.4 Aislamiento y Purificación de productos. Una vez pasado los extractos de la fermentación a 1L por las columnas en RP18 se unieron las fracciones del sustrato y se

realizó cromatografía en placas RP18 corridas con metanol-agua 7:3 y en sílica gel 60G diclorometano-metanol 7:3 y ambas

revelaron el sustrato al mismo nivel del patrón (figura 5), por lo cual la cepa de Fusarium oxysporum no presenta capacidad

biotransformadora en el medio de transformación para diterpenos.

Se purificó el metabolito mayoritario producido por el hongo durante el proceso de biotransformación, con diclorometano-

metanol 9.5:0.5 al que se denominó F1, confirmándose la pureza en cromatografía en sílica gel 60G, utilizando como fase móvil

diclorometano-metanol 9.0:1.0.

5.5 Identificación del metabolito secundario mayoritario producido por Fusarium oxysporum.

La sustancia F1 se identificó como cloranfenicol, según sus propiedades

físicas y datos espectroscópicos y presenta una fórmula molecular de

C11H12Cl2N2O, cuya estructura se presenta en la figura 6.

Cristalización: diclorometano; solubilidad: metanol y acetona.

Punto de fusión : 150°C

Rf: diclorometano-metanol (9.0: 1.0) = 0.5 , en CCD bajo luz U.V de onda

corta.

Microfusión sódica: Se determinó la presencia de nitrógeno .

Rotación óptica: αD25 = 0.0

Absorción ultravioleta: longitud de onda de máxima absorción :273λ .

MONITOREO DEL SUSTRATO

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Extracto 3er día de fermentación: 1 y

2 Extracto 4to día de fermentación: 3 y 4 Extracto 5to día de fermentación: 5 y 6

Control: medio+sustrato: 7

59

Fermentación 1L Sustrato purificado

C: Extracto del caldo M: Extracto del micelio P: Patrón

P: Patrón S: Sustrato

Figura 5. Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa nativa de

Fusarium oxysporum F-14 por CCD

NO2

C

C

CH2

H OH

H NH C

O

CHCl2

OH

Figura 6. Estructura química del cloranfenicol

60

Espectro infrarrojo: En la figura 7, se observa una señal en la posición 3263

cm-1 que nos indica la presencia de OH; en 3080cm-1 un OH; en 1689 cm-1

un grupo carbonilo; en 1562 cm-1 un éster; en 1521 cm-1 un C-N; en la

posición 1350cm-1 un grupo O-C y en 1064 cm-1 un C-O; la asignación por

analogía la observamos en la tabla 6.

En el espectro de RMN1H, se observan señales en 2.1, multiplete que hace

referencia al solvente; en 3.8 y 5.3 multipletes que representan H unidos a C-

O ó C-N; en 6.4 dobletes que son H muy desplazados a campos bajos; en

7.2 y 8.2 dobletes que representan aromáticos con sustitución para. (figura 8,

tabla 7).

El espectro de RMN13C de la figura 9, presenta señales para 1 grupo CH2 en la posición 62; 7grupos CH en las posiciones 58, 68, 72, 122 126, siendo uno de éstos un C-N y 3 grupos C en las posiciones 140, 149, 162; para un total de 11 átomos de carbono, las asignaciones por analogía se presentan en la tabla 8. 5.6 Rendimiento.

Biomasa: 3.214g/L

Cloranfenicol extraído del micelio y del caldo: 421.3mg, es decir, se presenta

un exceso de 21.3mg.

Extracto total: 862mg

Rendimiento en biomasa= Y = 3214mg/mL 8000mg/mL = 0.40 x 100= 40%

Rendimiento en producto Y= 21.3mg/mL 8000mg/mL= 0.0026x100 = 0.26%. Del cloranfenicol se obtuvo: 0.15 mg de cloranfenicol por g de peso seco.

61

0.0

25.0

50.0

75.0

%T

500.01000.01500.02000.03000.01/cmA.M.

1064.61350.11521.7

1562.2

1689.53263.3

Figura 7. Espectro infrarrojo del cloranfenicol.

Tabla 6. Asignación por analogía del espectro infrarrojo del cloranfenicol

POS(1/cm) Asignación 1064.6 C-O 1350.1 O-C 1521.7 C-N 1562.2 C-O 1689.5 C=O 3080.1 O-H 3263.4 O-H

62

Figura 8. Espectro de RMN+H del cloranfenicol.

Tabla 7. Datos del espectro de RMN+H del cloranfenicol

RMN1H δppm Multiplicidad

3.8 m 5.3 m 6.4 d 7.7 d 8.2 d

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 δ(ppm)

63

Figura 9. Espectro de RMN13C JMOD del cloranfenicol .

Tabla 8. Datos del espectro de RMN13C JMOD del cloranfenicol.

RMN13C δppm C

58 (+) CH 62 (−) CH2

68 (+) CH 72 (+) CH

122 (+) =CH- 126 (+) =CH- 140 (−) =C= 149 (−) =C= 162 (−) -C=0

200 170 150 120 90 70 50 30 10 0

64

5.7 Actividad antibacteriana del cloranfenicol.

• Prueba de sensibilidad por difusión en agar con pozos: En la tabla 9 se

presentan los datos de los halos de inhibición en mm, correspondientes a los

μg de cloranfenicol evaluados, con las siguientes bacterias: Staphylococcus

aureus, Bacillus subtilis y Escherichia coli; de igual forma se presentan en

la figura 10.

• Concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida del

cloranfenicol para Staphylococcus aureus.

El inóculo utilizado para la CMI fue de 1.6x106 UFC/mL ( 164

colonias/0.1mLx 3 diluciones seriadas = 164x10x103= 164x104= 1.6x107

UFC/mL).

La CMI del cloranfenicol para Staphylococcus aureus fue de 25μg/mL; los

datos en absorbancia para la determinación de la CMI, se presentan en la

tabla 10, de igual forma en el gráfico 11.

la CMB para Staphylococcus aureus se evaluó en 37μg/mL y en 50μg/mL,

obteniéndose un recuento de UFC: incontables; por lo que se determinó que

a éstas concentraciones el cloranfenicol es bacteriostático.

• Concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida del

cloranfenicol para Escherichia coli.

La CMI para E. coli fue de 37μg/mL, los datos en absorbancia se presentan

en la tabla 11, de igual forma en el gráfico 12; la CMB para E. coli se evaluó

en 37μg/mL y en 50μg/mL , obteniéndose un recuento de UFC: incontables;

por lo que se determinó que a éstas concentraciones el cloranfenicol es

bacteriostático.

El inóculo utilizado fue de 3.6x106UFC/mL .

• Prueba de sensibilidad por difusión con discos.

Con el cloranfenicol frente a Staphylococcus aureus se obtuvo halos de

inhibición de 18mm para 25μg y de 23mm para 50μg respectivamente, estos

datos se observan en la tabla 12 y figura 13

65

Tabla 9. Prueba de sensibilidad por difusión en agar en pozos .

BACTERIAS

Cloranfenicol

Halos en mm Halos en mm DMSO 50μL

62.5 24 S.aureus 100 26 0

125 30 62.5 18

E.coli 100 19 0 125 20 62.5 18

B.subtilis 100 19 0 125 20

62.5 μg 125 μg

DMSO 100 μg DMSO

125 μg 100 μg

62.5 μg

DMSO

62.5 μg 100 μg

125 μg

Stafilococcus aureus Bacillus subtilis

Escherichia coli

Figura 10. Prueba de sensibilidad por difusión en agar en pozos.

66

Tabla 10. concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol para Staphylococcus aureus .

Cloranfenicol μg/mL Absorbancia 6 1

12 0.3 25 0.07 37 0.07 50 0.07

control esterilidad 0.06 control positivo 0.07 control negativo 1.08 control DMSO 1.11

CMI: 25μg/mL.

CMI

0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,1

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0

Concentración

Abs

orba

ncia

Figura 11. concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol para Staphylococcus aureus .

67

Tabla 11. Concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol para E. Coli .

Cloranfenicolμg/mL Absorbancia 6 0.85

12 0.06 25 0.50 37 0.14 50 0.12

Control esterilidad 0.08 Control positivo 0.09 Control negativo 1.15 Control DMSO 1.15

CMI: 37μg/mL.

CMI

0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0

0 10 20 30 40 50 60

Concentración F1

Abs

orba

ncia

Figura 12. Concentración mínima inhibitoria del cloranfenicol para E. Coli.

Tabla 12. Prueba de sensibilidad por difusión en agar con discos del cloranfenicol frente a Staphylococcus aureus .

68

Cloranfenicol Halos en mm 25μg 18 50μg 24

Eritromicina 15μg ( sensible >18) 29 Vancomicina 30μg (sensible >12) 15

50 μg

V

50 μg 25 μg 25 μg

E

V: Vancomicina E: Eritromicina

Figura 13. Prueba de sensibilidad por difusión en agar con discos del cloranfenicol frente a Staphylococcus aureus .

• Actividad antibacteriana por el método de siembra en estrías.

Todas las bacterias Gram positivas evaluadas fueron sensibles a 200μg del

cloranfenicol, los datos se presentan en la tabla 13 y en la figura 14.

69

De las bacterias Gram negativas evaluadas, Pseudomonas aeruginosa fue resistente a 200μg de la sustancia F1, los datos se presentan en la tabla 14 y figura 15. 5.8 Actividad antifúngica. Hasta 400μg/mL del cloranfenicol no ejercen actividad antifúngica frente a los dermatofitos T.

rubrum y T. mentagrophytes. (tabla 15)

Tabla 13. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frente a bacterias Gram positivas por el método de siembra en estrías .

ESTRÍA # BACTERIA mm

1 Bacillus cereus 13 2 Bacillus subtilis 10 3 Streptococcus mutans 14 4 Staphylococcus epidermidis 13 5 Streptococcus pyogenes 20 6 Staphylococcus aureus 13

70

Figura 14. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frente a bacterias

Gram positivas por el método de siembra en estrías

Tabla 14. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frente a bacterias Gram negativas por el método de siembra en estrías.

ESTRÍA # BACTERIAS mm

1 Citrobacter freundii 14 2 Escherichia coli 10 3 Salmonella tiphy 14 4 Klebsiella pneumoniae 11 5 Pseudomona aeruginosa 2 6 Proteus sp 10

Figura 15. Figura 14. Actividad antibacteriana del cloranfenicol frente a bacterias Gram negativas por el método de siembra en estrías

71

Tabla 15. Actividad antifúngica del cloranfenicol.

cloranfenicol μg Crecimiento T. rubrum/mm

Crecimiento T. mentagrophytes/mm

25 + + 100 + + 150 + + 200 + + 400 + +

Control positivo: ketoconazol

(50μg).

−

−

Control negativo + + Control DMSO + +

Control esterilidad

−

−

72

6. DISCUSIÓN

El β-D-glucopiranosil-ester del ácido (-)16-(β-glucopiranosiloxil)-17-hidroxi-

kaurano 19 oico, fue seleccionado para los ensayos de biotransformación,

por las considerable concentraciones producidas por la Ageratina

vacciniaefolia, planta promisoria colombiana.

6.1 Selección de la cepa.

Aunque se realizó un ensayo preliminar con cepas de los géneros:

Penicillium, Aspergillus y Fusarium, no fue posible realizar la selección

por CCD probablemente por degradación del sustrato.

La selección de la cepa nativa de Fusarium oxysporum para los ensayos de

biotransformación, se basó en los reportes de literatura, ya que es un género

estrechamente relacionado con Gibberella fujikuroi (estado sexual de

Fusarium moniliforme), hongo transformador de una variedad de diterpenos

kaurenoides(Fraga, 2000; Alam, 1991), además Fusarium transforma

kauranos y beyeranos, hidroxilando el C7 y C12β de igual forma que

Gibberella fujikuroi (Oliveira, 1996).

6.2 Evaluación de la capacidad biotransformadora de la cepa de Fusarium oxysporum por CCD.

Desde los primeros reportes en biotransformación se ha utilizado la CCD

para detectar posibles transformaciones, por comparación de controles

(Anderson, 1975; Ipsen, 1982), en la última década todavía sigue vigente

el método (Tapia, 1997);éste método se escogió para determinar la

posible cepa transformadora por disponibilidad del laboratorio, ya que

73

métodos como HPLC son muy costosos. La posibilidad de que el hongo

genere sustancias con polaridades iguales o similares al sustrato e

interfiera en la interpretación de resultados, es superada con la

fermentación del hongo sin adición de la sustancia a transformar.

Como se pudo observar en el ensayo a los 11 días de fermentación en el

medio de transformación para diterpenos, el sustrato es degradado

completamente, ésto se confirmó con un posterior ensayo en 200mL de

medio con 50mg del sustrato, por lo cual se decidió realizar un monitoreo al

5to, 6to y 7tmo día de fermentación , aquí no se observó cambios del sustrato ni

en la cromatografía en sílica gel 60G , ni en RP18, sin embargo se realizó

una posterior fermentación en 1L de medio donde tampoco se observó

ningún cambio.

El sustrato se decidió purificar ya que en los extractos , se pueden presentar

numerosa sustancia producidas por el hongo que podrían no tener relación

con el diterpeno en cuestión , sin embargo el sustrato purificado tampoco

reflejó cambios; además se utilizaron dos sistemas de cromatografía en sílica

gel 60G y RP18, no ameritando el resultado RMN, por lo cual la cepa nativa

de Fusarium oxysporum no presenta capacidad de transformar el β-D-

glucopiranosil-ester del ácido (-)16-(β-glucopiranosiloxil)-17-hidroxi-kauran 19

oico en el medio de transformación para diterpenos.

6.3 Identificación del metabolito secundario mayoritario producido por Fusarium oxysporum.

Durante el proceso de biotransformación se aisló, purificó e identificó, el

metabolito secundario mayoritario producido por la cepa nativa de Fusarium

oxysporum, sustancia denominada F1, que según datos espectrales, se

74

identifica como un metabolito nitrogenado que tiene en su estructura

molecular un anillo aromático con sustitución en para, grupos ésteres y un

grupo alcohol, con una fórmula molecular C11H12Cl2N2O5, la cual

corresponde a cloranfenicol.

para su identificación se tuvo en cuenta los siguientes aspectos:

-Propiedades físicas: Solubilidad, punto de fusión.

-Datos espectroscópicos: RMN1H, RMN13C, IR.

-Actividad antibacteriana: Amplio espectro.

-Actividad antifúngica: No presenta actividad.

Todos éstos datos son iguales a la literatura.

6.4 Actividad antimicrobiana del cloranfenicol. 6.4.1Actividad antibacteriana.

• Prueba de difusión en agar con pozos.

Se realizó esta prueba como ensayo preliminar para determinar si la

sustancia F1 (Cloranfenicol) presentaba actividad antibacteriana, se

evaluaron las siguientes bacterias: E. coli, como representante del grupo de

bacterias Gram negativas ; S. aureus, del grupo Gram positivo; y B. subtilis

representando el grupo de bacterias formadoras de endosporas, las tres

bacterias frente a 62.5, 100 y 125 μg de F1 presentaron halos de inhibición ,

entre 18 y 30 mm; pero el tamaño del halo no es significativo por sí solo ya

que no se conocen las características de difusión de la sustancia (Koneman,

1999), por tal motivo se determinó la CMI y la CMB para S. aureus y E. coli.

• Determinación de La CMI y CMB . (Koneman, 1999).

Para S. aureus la CMI es de 25μg/mL y para E. coli es de 37μg/mL ; E. coli

y S. aureus fueron seleccionados por su importancia clínica; S. aureus es el

agente causal de infecciones de heridas y abscesos, además produce

75

infecciones respiratorias y alimentarias; E. coli se encuentra frecuentemente

comprometida en infecciones urinarias y gastrointestinales. (Broock, 1991).

• Prueba de sensibilidad por difusión con discos (García, 1997).

Para ésta prueba se utilizó Staphylococcus aureus, presentando halos de

inhibición de 18mm para discos con 25μg y 23mm para discos con 50μg de

cloranfenicol La eritromicina y la vancomicina de utilizaron como controles

de la técnica, estos datos son muy similares a los obtenidos con el reportado

en la literatura para Staphylococcus aureus: discos con 30μg de

cloranfenicol, sensible: halos>18mm.

• Método de siembra en estrías.

De 12 bacterias evaluadas sólo Pseudomonas aeruginosa fue resistente a

200μg de cloranfenicol, las bacteria evaluadas se seleccionaron por su

importancia clínica.

S. pyogenes, produce infecciones de garganta y fiebre reumática, K.

pneumoniae, infecciones respiratorias; Proteus sp infecciones urinarias, S.

tiphy infecciones alimentarias y fiebre tifoidea.

6.4.2 Actividad antifúngica: Hasta 400μg de cloranfenicol no ejercen

acitividad frente a los dermatofitos Trichophyton rubrum y Trichopyton

mentagrophytes.

6.5 Rendimiento.

Se obtuvo un exceso de 21.3mg de cloranfenicol en un litro de medio de

transformación para diterpenos con un inóculo de 107 conidios/ mL de

Fusarium oxysporum; dato importante para continuar la investigación, ya

76

que los datos espectroscópicos no reflejan impurezas, además durante el

proceso de purificación se perdió gran cantidad de sustancia mientras se

determinó el sistema de elución adecuado. También supone pérdida la

acción del antibiótico ya debe unirse a la unidad ribosomal 50s.

Se obtuvo un rendimiento en biomasa de 40% y en producto 5.2% estos

datos fueron determinados para tener en cuenta en estudios posteriores,

pues no se dieron las condiciones óptimas para la producción de metabolitos

secundarios, ni se monitorearon parámetros importantes (Curva de

crecimiento).

77

7. CONCLUSIONES • El β-D-glucopiranosil-ester del ácido (-)16-(β-glucopiranosiloxil)-17-

hidroxi-kaurano 19 oico no es transformado por la cepa nativa de Fusarium oxysporum, en el medio de transformación para diterpenos.

• La sustancia F1 aislada del medio de transformación para diterpenos

inoculado con Fusarium oxysporum corresponde a cloranfenicol. • El cloranfenicol presenta una CMI para S. aureus de 25μg/mL. • El cloranfenicol presenta una CMI para E. coli de 37μg/mL. • El cloranfenicol a 200μg no ejerce actividad antibacteriana contra

Pseudomonas aeruginosa. • El cloranfenicol hasta 400μg no tiene actividad antigúngica contra los

dermatofitos T. rubrum y T. mentagrophytes. • Se obtuvo un exceso de 21.3mg de cloranfenicol a partir de 1L de

medio de transformación para diterpenos con un inóculo de 1x107conidios/mL, con un rendimiento en biomasa del 40% y en producto de 0.26% ; obteniéndose 0.15 mg de cloranfenicol/ g de peso seco.

78

8. RECOMENDACIONES • Evaluar la capacidad biotransformadora de otros géneros del hongos

sobre el β-D-glucopiranosil-ester del ácido (-)17-(β-glucopiranosiloxil)-16-ol-kauran 19 oico.

• Realizar el ensayo de biotransformación en diferentes medios de

cultivo y variando las condiciones de fermentación. • No adicionar sustancias en los procesos de fermentación para la

obtención de metabolitos secundarios a partir de hongos que puedan interferir en la interpretación de resultados

79

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85

MEDIO DE BIOTRANSFORMACIÓN PARA DITERPENOS (Anexo A)

• Glucosa : 80g/L

• Sulfato de amonio: 7.92g/L

• Fosfato dipotásico: 5g/L

• Sulfato de Mg: 1g/L

• 2mL de elementos trazas :

Sulfato ferroso: 0.1g Sulfato de cobre: 0.015g Sulfato de zinc: 0.016g

Sulfato de manganeso: 0.01g Molibdato de amonio: 0.01g

Co(No3)26H2O: 0.01g

• Cloranfenicol: 400ppm/L

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MEDIO LÍQUIDO PARA ESPORULACIÓN (Anexo B)

• Papa: 200g/L • Glucosa: 20g/L

• Sulfato de amonio: 1g/L

• Cloranfenicol: 400ppm/L

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