Prolonged morphine administration alters protein

expression in the rat myocardium

Juliana MolinaCarolina MadridTercer semestre

INTRODUCTION

Morphine: is a potent opiate analgesic medication. agonist at μ opioid receptors coupled to G protein

Acts opening voltage-dependent potassium channel and closing calcium-dependent causing hyperpolarization and reduced excitability of the neuron.

Analgesia is due to changes in the perception of pain at the spinal level

Miocardyum: involuntary striated muscle

• Protein expression: DNA ProteinRNA

Morphine can induce changes in cell metabolism that coudl eventualy modify the expression of certain proteins, in this particular case, myocardium.

GENERAL OBJETIVE

The main aim of the study was to asses the presumed effect of prolonged treatment with high dosis of morphine in male rast on myocardial protein expression

METODOLIGÍA

MATERIALES

• acrilamida y bis-acrilamida• SYPRO: ruby stain from molecular probes• Membrana de nitrocelulosa• Inmobilune DryStrips • Buffer de pharmalyte• Anticuerpos secundarios anti-rabbit marcados con peroxidasa de rabano• Anticuerpos primarios rabbit

METODOLIGÍA

ANIMALES Y TRATAMIENTO CON MORFINA

Ratas albinas adultas

Cámaras de

plexiglas

Ciclo de 12 horas

luz/oscuridad

Agua y comida

3 a 4 por

camara

Inyección intramuscular

• Grupo CON: solución salina

• Grupo MOR: morfina- 10mg/Kg por 10 dias

• Naloxona: 10mg/Kg por 10 dias

• Naxolona + morfina: 10mg/Kg por 10 dias

METODOLIGÍA

ANIMALES Y TRATAMIENTO CON MORFINA

Sacrificio de animales Dislocación cervical- 24 horas después ultima dosis

Extirpación- disección corazón

Congelamiento en nitrógeno liquido y almacenado a -80°C

Experimento con retiro de la dosis Animales sacrificados 3 días después de ultima dosis

METODOLIGÍA

FRACCIONAMIENTO DE TEJIDO CARDIACO

Muestras congeladas de ventrículo izquierdo 10 volúmenes de TMES buffer+ coctel inhibidor de proteasa

Corte en pedazos y homogenización Suspensión

homogenización

Centrifugación

Supernadante postnuclear (PNS)

Para remover tejidos y fragmentos nucleares

METODOLIGÍA

FRACCIONAMIENTO DE TEJIDO CARDIACO

PNS Aplicado a solución percoll 18% en buffer TMES

Centrifugación Parte opaca

parte translucida centrifugación

Membrana del plasmaFracción citosolica

mitocondria

Dilución en buffer TMECentrifugaciónResuspensiónCongeladoAlmacén alícuotas

METODOLIGÍA

ELECTROFORESIS E INMUNOBLOT

Muestras de proteína Solubilizadas en laemmli buffer

Gel de poliacrilamida 10%

Transferencia a membranas de nitrocelulosa

Bloqueo de membranas con leche descremada seca al 3%

Sonda con anticuerpos Inmunoblot- análisis y cuantificación

METODOLIGÍA

ELECTROFORESIS E INMUNOBLOT

inmunoblot:

las proteínas de extractos celulares son separadas por electroforesis en gel según tamaño por medio de SDS-PAGE poliacrilamida gel electroforesis cargado negativamente. Después las proteínas van a un filtro incubado con anticuerpos que reaccionan con la proteína especifica. El anticuerpo unido al filtro se detecta.

METODOLIGÍA

ANALISIS PROTEOMICO

Precipitación de la fracción citosolica, mitocondrial, membrana

Proteínas se pusieorn en gradientes lineares de pH 4-7

Se separaron con multiphor apparatus

2 equilibrios con buffer EQ

Separación 2D en gel poliacrilamida 10% teñidos con SYPRO ruby

cuantificación de la densidad de los puntos con software PDQuest

Proteínas alteradas se identificaron con 4800 plus MALDI TOF/TOF análisis

METODOLIGÍA

MISCELANEA

La concentración de proteínas fue determinada por método BCA

Los geles proteomicos de referencia 2D se establecieron haciendo un por medio de 12 replicas de cada grupo

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

DISCUSSION

AUTHOR YES NO

G. Ferns X

J. Ikeda X

GS. Murphy X

JN. Peart x

CONCLUSIONS

• Prolonged Morphine administration can caused oxidative stress and cardioprotective effect by binding with opioid receptor. The mechanism of action would be important at the time to seek for drug interactions that may increase or reduce the benefit.

• the myocardium responds to oxidative stress by increasing the synthesis of several proteins with a protective role.

• Morphine is used for treatment in many diseases, molecular studies provide insights into the behavior and cellular response of different tissues of the body in a prolonged administration, this knowledge allows a better approach in the treatment of patients.

• Molecular studies should be made in order to find a way to induce the same protective response in the cell without the need of the constant stim from the drug. this would be really important in the treatment of some patients beacuse dosis decreases or may even disappear