Biologie moléculaire - jour 2

Commentaires J1

biomol = réactifs toujours sur glace(sinon = "Deadzyme")

produits en dehors du -20C le moins possible

« quick spin » avant d'ouvrir un tube

bien lire les notes de cours % d'agarose chauffer le λH3 (ne pas chauffer la soln mère) utiliser le P20 pour charger les gels (P10)

Commentaires J1

organisation/efficacité/planification s'assurer que le gel soit prêt quand les digestions

terminent compte rendu/ménage/cahier durant la migration

Biologie moléculaire- organigramme

Purification d’ADN de 2 plasmides à partir de cultures bactériennes

Coupure des ADNpar les enzymes

de restriction

Polymérisation en cascade (PCR)

Analyse sur gels d’agarose (1%)

Préparation des cartes de restriction et compte rendu

Analyse sur gel d’agarose (0,8%) et

compte rendu

Analyse sur gel d’agarose (2%) et

compte rendu

Extraction et purification d’ARN de foie de lapin

Analyse sur gel d’agarose (1%) et compte rendu

digestion des plasmides + gels d'agarose (compte rendu) PCR

Plasmides

molécules d'ADN extrachromosomiques ADN double brin + circulaire répliquent de façon autonome encodent résistance à un antibiotique vecteurs de choix dans biologie moléculaire

Enzymes de restriction

clivent les 2 brins d’ADN à des séquences spécifiques (4-8 nt)

nommer pour l’organisme duquel c’était isolé(e.g. EcoRI est isolée d’Escherichia coli)

digestion produit 3 sortes de bouts

Enzymes de restriction

site de coupure = palindrome

5'-GGATCC-3'

3'-CCTAGG-5'

5’ 3’

3’ 5’ Extension 5’

site de coupure

(4-8 nt)

Enzymes de restriction

site de coupure = palindrome

5'-GGATCC-3'

3'-CCTAGG-5'

5’ 3’

3’ 5’

site de coupure

(4-8 nt)

Extension 3’

Enzymes de restriction

5’ 3’

3’ 5’

site de coupure

(4-8 nt)

Bouts francs

Enzymes de restriction

clivent les 2 brins d’ADN à des séquences spécifiques (4-8 nt)

nommer pour l’organisme duquel c’était isolé(e.g. EcoRI est isolée d’Escherichia coli)

digestion produit 3 sortes de bouts

1. extension 5’

2. extension 3’

3. bouts francs

Bouts cohésifs

Enzymes de restriction - exemples

BamHI

5'-G/GATCC-3'3'-CCTAG/G-5'

KpnI

5'-GGTAC/C-3'3'-C/CATGG-5'

convention biomol toujours 5' 3'

Enzymes de restriction - exemples

BamHI

5'-G/GATCC-3' 5'-G3'-CCTAG/G-5' 3'-CCTAG-5'

KpnI

5'-GGTAC/C-3' 5'-GGTAC-3'3'-C/CATGG-5' 3'-C

extension 5’

extension 3’

bouts cohésifs

Enzymes de restriction - bouts cohesifs

BamHI

5'-G/GATCC-3' 5'-G

3'-CCTAG/G-5' 3'-CCTAG

GATCC--------------

G--------------

Enzymes de restriction

gel d'agarose (attention: % d'agarose)

Analyse des digestions

Gel #1: plasmide A

1. EcoRI

2. HindIII

3. ScaI

4. 1 kpb ladder

5. EcoRI/ScaI

6. EcoRI/HindIII

7. HindIII/ScaI

8. Non-digeré

Gel #2: plasmide B non - digéré EcoRI + HindIII BamHI + HindIII BamHI + EcoRI 1 kpb ladder

HindIII EcoRI BamHI

gel d'agarose (attention: % d'agarose) graphique log taille vs distance (un par gel)

Analyse des digestions

gel d'agarose (attention: % d'agarose) graphique log taille vs distance (un par gel)

Analyse des digestions

M 2 3 4 5 6 7 Taille

(pb)

10000

8000

6500

4000

1500

1000

ligne des puits

Graphique - log taille vs distance

pas linéaire

pas de courbe de tendance (droite)

Graphique - papier semi-log

graphique de taille vs distance sur papier semi-log bandes de 250 à 10000pb

(1 kpb ladder)

100

1000

10000

taill

e (p

b)

distance (cm)

Graphique - log taille vs distance

pas linéaire

pas de courbe de tendance (droite)

Distance demigration=18cm

log10taille = 3,05taille = 1100 pb

gel d'agarose (attention: % d'agarose)

graphique log taille vs distance (un par gel)

résultats utilisés pour établir la carte de restriction du plasmide

Analyse des digestions

enzyme qui coupe 1 fois est utilisée pour estimer la taille du plasmide

Carte de restriction

4,5 kpb

23.1 9.4 6.6 4.4

2.3 2.0

0.6

Digestion H3

Gel d'agarose Carte de restriction

enzyme qui coupe un plasmide de 4,5 kpb deux fois séparées de 1,5 kpb (1000 pb = 1 kpb)

Carte de restriction

Gel d'agarose

23.1 9.4 6.6 4.4

2.3 2.0

0.6 0.6

Digestion H3

Carte de restriction

2 sites

2

bandes

Exercice: carte de restriction

Information: enzyme fragments # de sites

BamHI 9+6 kpb

EcoRI 10+5

SalI 15

BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp

BamHI / SalI 9, 5, 1

EcoRI / SalI 10, 3, 2

Information: enzyme fragments # de sites

BamHI 9+6 kpb

EcoRI 10+5

SalI 15

BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp

BamHI / SalI 9, 5, 1

EcoRI / SalI 10, 3, 2

Ier étape: nombre de site(s) par enzyme

Exercice: carte de restriction

N’oublier pas que le plasmide est circulaire!

2

2

1

Information: enzyme fragments # de sites

BamHI 9+6 kpb 2

EcoRI 10+5 2

SalI 15 1

BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp

BamHI / SalI 9, 5, 1

EcoRI / SalI 10, 3, 2

2ième étape: taille

Exercice: carte de restriction

15 kpb (±)

Exercice: carte de restrictionInformation: enzyme fragments # de sites

BamHI 9+6 kpb 2

EcoRI 10+5 2

SalI 15 1

BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp

BamHI / SalI 9, 5, 1

EcoRI / SalI 10, 3, 2

3ième étape: placer EcoRI

EcoRIEcoRI 5

10

Exercice: carte de restriction

EcoRIEcoRI

10

5

SalI

23

SalI

Information: enzyme fragments # de sites

BamHI 9+6 kpb 2

EcoRI 10+5 2

SalI 15 1

BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp

BamHI / SalI 9, 5, 1

EcoRI / SalI 10, 3, 2

4ième étape: placer SalI

Exercice: carte de restriction

EcoRIEcoRI

2

10

3

SalI

21

BamHI

BamHI

Information: enzyme fragments # de sites

BamHI 9+6 kpb 2

EcoRI 10+5 2

SalI 15 1

BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp

BamHI / SalI 9, 5, 1

EcoRI / SalI 10, 3, 2

5ième étape: placer les BamHI

Exercice: carte de restrictionInformation: enzyme fragments # de sites

BamHI 9+6 kpb 2

EcoRI 10+5 2

SalI 15 1

BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp

BamHI / SalI 9, 5, 1

EcoRI / SalI 10, 3, 2

5ième étape: placer les BamHI

EcoRIEcoRI

21

SalIBamHI2

7BamHI

3

10

6kpb

Exercice: carte de restrictionInformation: enzyme fragments # de sites

BamHI 9+6 kpb 2

EcoRI 10+5 2

SalI 15 1

BamHI / EcoRI 7, 3 X2, 2 kbp

BamHI / SalI 9, 5, 1

EcoRI / SalI 10, 3, 2

6ième étape: vérification

EcoRIEcoRI

2

7

1

SalIBamHI2

BamHI

3(15 kpb)

conçu en 1983 par Kary Mullis(prix Nobel en 1993)

changé le cours de la biologie moléculaire

PCR

produit, in vitro, des nombres gigantesques de copies d'une séquence d'ADN spécifique d'un mélange d'ADN

basé sur le fonctionnement cyclique d'un ADN polymérase

PCR

synthèse de l’ADN en ajoutant des nucléotides au bout 3'-OH d’un l'amorce hybridé à un brin d’ADN matrice

direction de synthèse est 5'→3'.

précurseur est un dNTP qui perd les deux phosphates en position terminale

ADN polymérases

ADN polymérases

matrice

amorce

ADN polymérases

matrice

amorce

PCR - étapes du cycle

PCR - étapes du cycle

N.B. La polymérase doit être thermostable.

PCR - étapes du cycle

Amorce 5'Amorce 3'

PCR - étapes du cycle

Amorce 5'Amorce 3'

nombre de copies = 2n (n = # de cycles)

PCR - une amplification

nombre de copies = 2n (n = # de cycles)

PCR - une amplification

Énorme!

Copies produites

PCR song

http://www.youtube.com/watch?v=x5yPkxCLads

http://www.youtube.com/watch?v=CQEaX3MiDow&feature=related

Enzymes-tampons-nucléotides-marqueurs

1 boîte/table à -20oC

gardez sur glace en tout temps

retournez les tubes à -20oC après l'utilisation (ne jeter pas les restants!)

courte centrifugation avant d'ouvrir un tube

Enzymes-tampons-nucléotides-marqueurs

1 boîte/table pour vos échantillons d'ADN(bien les identifier, ne pas jeter vos PCRs)

pas de réaction de PCR = perte de points

HindIII vs λH3

Point technique - volumes en biomol

biologie moléculaire = petits volumes (~10 μL) soyez prudent dans vos pipettages (P10) toujours sur glace vérifier le volume aspiré rentrer l'embout dans le liquide avant la livraison surveiller la livraison il faut mettre les tubes de 200 et de 500 μl

dans des tubes de 1,5 ml pour les centrifuger

Points techniques - digestions

Digestions

utilisez 6/12 μl d'ADN / digestion

- 6 μl pour les digestions simples

- 12 μl pour les digestions doubles

Points techniques - digestions

Digestions simples:10 μl volume final1 μl enzyme*

Digestions doubles:20 μl volume final1 μl de chaque enzyme* (i.e. 2 μl total d'enzyme)

*Seulement 10% du volume final peut être enzyme. Pourquoi?

Garder les enzymes en dehors du congélateur le minimum possible (quick spin avant d'ouvrir).

Points techniques - gel d'agarose

utilisez le peigne avec 8 (Pharmacia) ou 10 dents (Labnet)

préparer deux gels (1%) de 60 ml (Pharmacia) ou 100 ml (Labnet) / équipe

Gel #1: digestions de plasmide A

Gel #2: digestions de plasmide B

Points techniques - gel d'agarose

chargez

12 μl digestions simples

15 μl digestions doubles (pas les 24 μl)

N'OUBLIEZ PAS DE METTRE LE STANDARD (1KB LADDER) SUR LES DEUX GELS!!!!

Mise en garde...

aucun site

activité étoile et digestions partielles

Mise en garde...

aucun site

activité étoile et digestions partielles

superposition de fragments de même taille

Mise en garde - superposition de bandes

Ex. plasmide d'une taille 6,4 kpb qui donne seulement des bandes de 2,9 et de 0,75 kpb

3000

2000

1000

6,4 3,7 6,4Total (kpb):

Clairement, il y a 2 bandes ici (2,9 + 2,7 kpb).

Mise en garde...

aucun site

activité étoile et digestions partielles

superposition de fragments de même taille

fragments de restriction trop petits pour être visibles sur le gel (surexposer lors de la photographie)

Points techniques - PCR

amplification, alors il faut être en garde pour de la contamination

embouts avec barrières (attention: choisir les bons, uniquement pour les réactions de PCR, $$$)

soyez prudent de ne pas contaminer vos solutions (tampons, eau, nucléotides, etc.)

diluer votre ADN plasmidique 1/20

Points techniques - PCR contamination

amplification, alors il faut être en garde pour de la contamination

non-contaminé contaminép

lasm

ide

+ve

pla

smid

e –

ive

con

trô

le +

veco

ntr

ôle

-iv

e

Point technique - nucleases

embouts + tubes stériles

toujours portez des gants et changez-les souvent

remplir les boîtes uniquement quand vide(sinon, dans tiroir)

portez des gants quand vous remplissez les boîtes d’embouts

boîtes remplies à l'autoclave

solutions préparées semaine I

1.TAE 50X

Points techniques

Compte rendu - présentation des photos

à compléter au labo

sur les images des gels faire attention de:identifier les puitsindiquer les tailles des bandes du marqueurindiquer, si le marqueur est "synthétique", le

fournisseur

Marqueurs de taille

utiliser pour déterminer la taille de l’ADN

préparation de l'échantillonADN (=1 kpb ladder) 5 µl10X OPA 2 µlH2O 3 µl6X LB 2 µl

12 µl

Compte rendu - tailles des fragments

log taille vs distances de migration des bandes du marqueur

papier semi-log (alors taille vs distance)

à main

pas de courbe de tendance

un graphique pour chaque gel!

Biologie moléculaire - questions

ADN plasmidique superenroulé