PATRONES DE RECURRENCIA: VARIABILIDAD … · TRM: Transmembrana μg: Microgramos ... 5.2. ANÁLISIS...

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

UNIDAD DE POSGRADO

Patrones de recurrencia y resistencia asociadas a la

variabilidad genética de Plasmodium vivax durante la

malaria asintomática en la localidad de Mazán-Iquitos

TESIS

Para optar el Grado Académico de Magister en Biología Molecular

AUTOR

Edward Valencia Ayala

Lima – Perú

2012

LISTA DE ABREVIACIONES

aa: Aminoácidos

Alu I: Enzima de restricción Arthrobacter luteus

ATP: Adenosina de Tri-Fosfato

COI: Complejidad de la infección

CQR: Cloroquino-resistencia

Ct: Ciclo de threshold

DIRESA: Dirección Regional de Salud

DNA: Ácido desoxiribonucleotido

dNTPs: Desoxinucleótidos

EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético

E/K: Cambio de Glutamina por Lisina

F/L: Cambio de Fenilalanina por Leucina

GG: Gota gruesa

Hd: Haplotipo diferente

Hha I: Enzima de restricción Haemophilus haemolyticus

Hhe: Hipnozoito heterólogo

Hho: Hipnozoito homólogo

Hi: Haplotipo idéntico

HRM: High resolution melting

IAP: Índice parasitario anual

IC50: Coeficiente de inhibición media

IPTG: Isopropiltio–β–D–galactósido

KD: Kilodaltons

LB: Medio Luria-Bertani

L/L: Sin cambio de aminoácido Leucina

OD: Densidad óptica

MDR1: Proteína multidrogo resistente

MgCl2: Cloruro de magnesio

MINSA: Ministerio de Salud

MSP3-α: Proteína se superficie del merozoito

M/T: Cambio de Metionina por Treonina

ng: Nanogramos

nM: Nanomolar

NBD: Nucleotide Binding Dominion

OMS: Organización Mundial de la Salud

ORF: Open Read Frame

pb: Pares de bases

pfmdr1: Gen mutidrogoresistente de Plasmodium falciparum

PLD: Nivel de la diversidad poblacional

pvald1: Gen aldolasa de Plasmodium vivax

pvmdr1: Gen mutidrogoresistente de Plasmodium vivax

pvmsp3-α: Gen de la proteína de superficie del merozoito

qPCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa Cuantitativo

RENACE: Red Nacional de Control Epidemiológico

RFLP: Patrones de longitud de fragmentos de restricción

RNA: Ácido ribonucleico

RQ: Cuantificación Relativa

SE: Semana Epidemiológica

SNPs: Polimorfismos de nucleótidos únicos.

SVE: Servicio de Vigilancia Epidemiológica

Taq: Thermus acuaticus

TMDs: Dominios transmembrana

TRM: Transmembrana

μg: Microgramos

μl: Microlitros

μM: Micromolar

UV: Ultravioleta

X-Gal: 5–bromo–4–cloro–3–indolil–β–D–galactósido.

Y/F: Cambio de Tirosina por Fenilalanina

ÍNDICE

TÍTULO

AGRADECIMIENTO

DEDICATORIA

RESUMEN

ABSTRACT

I. INTRODUCCIÓN 1

II. ANTECEDENTES 3

2.1. GENERALIDADES 3

2.1.1. ETIOLOGÍA 3

2.1.2. CICLO BIOLÓGICO 4

2.1.3. EPIDEMIOLOGÍA 5

2.1.4. SINTOMATOLOGÍA 6

2.1.4.1. Malaria Asintomática 7

2.1.5. DIAGNÓSTICO 8

2.1.6. TRATAMIENTO 9

2.2. RECURRENCIA DE LA MALARIA POR P. vivax 10

2.2.1. RELAPSO O REINFECCIÓN 10

2.2.1.1. Análisis Polimórfico del gen pvmsp3-α 12

2.2.2. RESISTENCIA 13

2.2.2.1. Análisis Polimórfico del gen pvmdr1 14

III. OBJETIVOS 16

IV. HIPÓTESIS 16

V. MATERIALES Y MÉTODOS 17

5.1. POBLACIÓN DE ESTUDIO 17

5.2. ANÁLISIS DE DATOS 18

5.3. MÉTODOS DE INVESTIGACIÓN 19

5.3.1. EXTRACCIÓN DE DNA 19

5.3.2. DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE Plasmodium 19

5.3.2.1. Nested PCR 19

5.3.2.1.1. Primera PCR 19

5.3.2.1.2. Segunda PCR 20

5.3.3. GENOTIPIFICACIÓN MOLECULAR DE P. vivax 20

5.3.3.1. Nested PCR 20

5.3.3.1.1. Primera PCR 21

5.3.3.1.2. Segunda PCR 21

5.3.3.2. Digestión enzimática 21

5.3.4. ANÁLISIS DE RESISTENCIA DE P. vivax 22

5.3.4.1. PCR Convencional 22

5.3.4.2. Secuenciamiento 23

5.3.4.3. Número de copias 24

5.3.4.4. Clonamiento 25

VI. RESULTADOS 28

6.1. DETECCIÓN DE LA MALARIA DURANTE LA VIGILANCIA ACTIVA 28

6.2. VARIABILIDAD POLIMÓRFICA DEL GEN pvmsp3-α 30

6.3. PATRONES DE RECURRENCIA 36

6.4. MECANISMOS DE RESISTENCIA 39

VII. DISCUSIÓN 47

7.1. DETECCIÓN DE LA MALARIA DURANTE LA VIGILANCIA ACTIVA 47

7.2. VARIABILIDAD POLIMÓRFICA DEL GEN pvmsp3-α 48

7.3. PATRONES DE RECURRENCIA 50

7.4. MECANISMOS DE RESISTENCIA 52

VIII. CONCLUSIONES 55

IX. RECOMENDACIONES 56

X. BIBLIOGRAFÍA 57

XI. ANEXOS 67

DEDICATORIA

A mis padres Saturnino Valencia y Juana Ayala, por ser el pilar fundamental en todo lo que

soy, porque creyeron en mí y porque me sacaron adelante, dándome ejemplos dignos de

superación y entrega, porque en gran parte gracias a ustedes, hoy puedo ver alcanzada mí

meta.

A mi esposa Miriam y a mi hijo Leonardo, quienes han sido mi inspiración y motivación

para los esfuerzos que he hecho en mi vida para superarme en mi formación personal y

quienes al final han soportado cada situación difícil que pasamos debido a esos esfuerzos.

Dios los bendiga por eso.

A mis hermanos, Carlos, Nikita, John y Engels, a mis sobrinos Alexandra, Ródrigo e Italo

por estar conmigo y apoyarme siempre, los quiero mucho. Y a todos aquellos que

participaron directa o indirectamente en la elaboración de esta tesis.

¡Gracias a ustedes!

AGRADECIMIENTO

Al Laboratorio de Enfermedades Infecciosas de la Universidad Peruana Cayetano Heredia

por haberme dado cobijo y por todo lo que aprendí en el, así mismo, por haberme dado su

voto de confianza y por todo el apoyo otorgado a mi persona.

Un agradecimiento especial al Dr. Robert Gilman, al Dr. Joe Vinetz, a la Dra. Manuela

Verastegui y al Dr. Holger Mayta, por su invaluable apoyo y confianza para la realización

de esta tesis. A mi asesora, la Dra. Maritza Calderón Sánchez por su paciencia, apoyo y

confianza en mí como persona y en mi trabajo. Gracias por sus consejos personales y

académicos. Gracias por escucharme.

A mis maestros de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, que ayudaron en mi

formación profesional. A mis jurados Mag. Ruth Garcia de la Guarda, Mag. Débora

Alvarado, Mag. Teresa Barreto, Dr. Abelardo Maturrano, gracias por todo su tiempo

invertido en la revisión de esta tesis.

A mis amigos y colegas: Edith Málaga, Roxana Zamudio, Nancy Chile, Susan Espetia,

Sonia Apaza, Leny Sánchez, Janeth Acosta, Juan Pacori, Jesus Pinto, Manuel Fasabi y Gary

Malpartida, por todo lo que vivimos y por su influencia en mi vida. Gracias por infundirme

sus ánimos y compartir conmigo sus conocimientos. También quiero agradecerles el

haberme hecho participe de su trabajo. Gracias de corazón. A mis amigos, porque sin ellos

no hubiera sido lo mismo. Gracias, eternamente gracias, a todos.

RESUMEN

Plasmodium vivax agente etiológico de la malaria, exhibe una gran variabilidad genética

durante episodios recurrentes de la enfermedad. Esta recurrencia es informada como de

baja prevalencia asociada con la malaria asintomática. Así mismo los episodios recurrentes

(reinfecciones o relapsos) a menudo pueden ser confundidos por resistencia a fármacos

como la cloroquina. Por lo tanto el objetivo principal de este estudio fue relacionar los

patrones de recurrencia y la resistencia con la variabilidad genética de P. vivax. En este

estudio se evaluaron las muestras secuenciales de individuos provenientes de una región

endémica del Perú (Mazán-Iquitos), diagnosticados previamente con malaria, por

microscopía, durante seguimientos activos y sometidos a un régimen de tratamiento

estándar con cloroquina. La genotipificación realizada en base al gen pvmsp3-α, utilizando

el Nested PCR y la digestión enzimática, permitió identificar una alta variabilidad genética

de P. vivax, a partir de la cual, se identificaron los patrones de recurrencia, establecidos

como relapsos, a partir de estadios latentes o hipnozoitos homólogos (con haplotipos

idénticos) y reinfecciones (con haplotipos diferentes). Los rangos de tiempo permitieron

una identificación más precisa, observándose mayores frecuencias de relapsos por

hipnozoitos homólogos antes de los 90 días post-primera evaluación y mayores frecuencias

de reinfecciones después de este periodo. Así mismo las recurrencias en el primer periodo

de tiempo, por haplotipos diferentes, pueden deberse también a hipnozoitos heterólogos.

Complementando el estudio, el análisis de secuenciamiento del gen pvmdr1, permitió

identificar SNPs, codificantes de mutaciones no sinónimas, relacionadas con resistencia a

cloroquina. Estos SNPs, a través del software U-Melt (análisis in sílico), presentaron

variaciones en las temperaturas de fusión. Finalmente los resultados de cuantificación

relativa con qPCR Real Time no mostraron diferencias significativas en el número de

copias del gen pvmdr1.

Palabras clave: Cloroquina, Genotipificación, Haplotipos, Hipnozoito, Malaria

Asintomática, Recurrencia, Variabilidad.

ABSTRACT

Plasmodium vivax etiologic agent of malaria has a large genetic variability during recurrent

episodes of the disease. This recurrence is reported as low prevalence associated with

asymptomatic malaria. Also recurrent episodes (reinfection or relapse) can often be

mistaken for drug resistance as chloroquine. Therefore the main objective of this study was

to correlate the patterns of recurrence and resistance to the genetic variability of P. vivax. In

this study, we evaluated the sequential samples of individuals from an endemic region of

Peru (Mazán-Iquitos), previously diagnosed with malaria microscopy during active follows

and subjected to a standard treatment regimen with chloroquine. Genotyping based on the

pvmsp3-α gene, using Nested PCR and enzymatic digestion, identified high genetic

variability of P. vivax, from which were identified recurrence patterns established as

relapse, from latent stages or homologous hypnozoites (with identical haplotypes) and

reinfections (with different haplotypes). The time ranges allow more accurate identification,

with higher frequency of relapses by homologous hypnozoites before 90 days post-first

evaluation and higher frequencies of reinfection after this period. Also recurrences in the

first period of time, for different haplotypes may also be due to heterologous hypnozoites.

Complementing the study, the sequencing analysis of the gene pvmdr1, identified SNPs,

encoding nonsynonymous mutations related to resistance to chloroquine. These SNPs,

through U-Melt software (in sílico analysis), showed variations in the melting temperatures.

Finally the results of relative cuantification with Real Time qPCR no showed significant

differences in copy number of the pvmdr1 gene.

Keywords: Chloroquine, Genotyping, Haplotypes, Hipnozoite, Recurrence, Asymptomatic

Malaria, Variability.

I. INTRODUCCIÓN

La malaria es una hemoparasitosis aguda, de evolución crónica y

recurrente, producida por protozoarios intracelulares obligados del género

Plasmodium y transmitida por mosquitos hembras del género Anopheles. Dentro

de las principales especies de parásitos tenemos a Plasmodium vivax, el cual

causa la malaria terciaria benigna y ocasiona entre 147 a 436 millones de

infecciones clínicas/año. A diferencia de Plasmodium falciparum, que causa la

malaria terciaria maligna, P. vivax está menos asociado con mortalidad aunque se

relaciona con una considerable morbilidad (Hay et al., 2004; Vargas et al., 2003).

Esta enfermedad parasitaria es un problema de salud global, ampliamente

distribuida en el mundo. Según la OMS, malaria es endémica en 108 países,

siendo el continente africano el más afectado con el 60% de los casos. En

Latinoamérica, Brasil es el país con la más alta prevalencia de malaria, seguido

por Colombia y Perú (WHO, 2005). En nuestro país, P. vivax es la especie

predominante, sin embargo, recientemente varios estudios muestran regiones

endémicas con una baja tasa de prevalencia en la transmisión, lo cual está

relacionado con el alto índice de formas asintomáticas de la enfermedad (Branch et

al., 2005).

Las infecciones asintomáticas son poco conocidas en estas regiones pero a

través de los sistemas de vigilancia activa, se ha demostrado persistencia de la

infección y constantes recurrencias de la parasitemia. Es de considerar además

que esta forma de la enfermedad, donde se ubican los portadores asintomáticos,

tiene un gran significado epidemiológico, pues aunque es invisible al ojo clínico,

contribuyen a mantener, difundir y perpetuar la infección. (Koram, 1993).

P. vivax se caracteriza por ocasionar recurrencias, principalmente por: a)

relapsos, debidos a estadios latentes del mismo parásito en el hígado, conocidos

como hipnozoitos; la parasitemia reaparece semanas después de la cura del

episodio inicial, b) reinfecciones, por la picadura infectante de otro mosquito.

Estas recurrencias originan adaptación inmunológica e incremento de la

inmunidad en los huéspedes humanos, evitando las complicaciones de la

enfermedad, por lo tanto se relacionan con las manifestaciones subclínicas y

asintomáticas (Loyola, 1991; Branch et al., 2005). Estas características propias del

huésped junto con la variabilidad genética de P. vivax son una limitante para el

tratamiento oportuno y efectivo de la enfermedad.

Sumado a esto, la variabilidad genética es un factor que influye

significativamente en el flujo de genes, como aquellos que confieren resistencia a

fármacos. En P. vivax la resistencia es otra forma de recurrencia de la parasitemia

(Baird et al., 2004). Al respecto, actualmente en el Perú la recurrencia por resistencia

está pobremente definida, entendiendo estos mecanismos solo desde el punto de

vista de las variaciones en el estado inmune de los pacientes.

Las medidas establecidas para el control de la malaria tienen como

necesidad primordial conocer las frecuencias reales de las reinfecciones, las

mismas que son confundidas a menudo por los relapsos y el incremento de la

resistencia a fármacos como la cloroquina. En regiones endémicas como el distrito

de Mazán, al sur de Iquitos, en el departamento de Loreto, no existen datos reales

sobre la malaria asintomática, se carece de información sobre la dinámica de las

reinfecciones, relapsos, resistencia a drogas y variabilidad genética de P. vivax;

teniendo como población más expuesta y en mayor riesgo a los individuos no

inmunes, las mujeres embarazadas y los niños.

Por lo tanto, este estudio tiene como principal objetivo: Relacionar los

patrones de recurrencia y la resistencia con la variabilidad genética de P. vivax,

estableciendo técnicas que nos permitan determinar la reinfección, el relapso o la

resistencia. De esta manera se planteó la interrogante sobre: ¿Cuál es la

frecuencia de estos patrones de infección, en individuos asintomáticos

provenientes de una región endémica? y apoyados en herramientas de

epidemiología molecular, como la genotipificación y secuenciamiento, es posible

identificar estas características en P. vivax.

Para lograr estos objetivos se tomaron en cuenta la utilización de varias

técnicas moleculares. Nested-PCR, utilizado para el diagnóstico, en base a la

amplificación del gen que codifica el RNA ribosomal 18S (SSUrRNA). PCR-RFLP,

para la genotipificación, en base al polimorfismo del gen pvmsp3-α que codifica la

proteína de superficie del merozoito (MSP3). Secuenciamiento, para identificar

SNPs en el gen pvmdr1, el cual es ortólogo al gen de resistencia pfmdr1 de P.

falciparum. Así mismo, el uso del software U-melt (análisis in sílico), para

establecer diferencias en las temperaturas de fusión de estos SNPs. Finalmente,

clonamiento y la utilización de técnicas como el qPCR Real Time, para establecer

el número de copias del gen de resistencia.

II. ANTECEDENTES

2.1. GENERALIDADES

2.1.1. ETIOLOGÍA

La malaria es una enfermedad parasitaria causada por protozoarios del

género Plasmodium. Más de 120 especies han sido descritas en mamíferos,

reptiles y aves; sin embargo clásicamente, solo 4 especies son las que causan

infección en humanos, dentro de estos tenemos a P. falciparum, P. vivax, P. ovale

y P. malariae; aunque recientemente P. knowlesi, el cual tiene a los monos

macacos como hospederos naturales, ha sido propuesto como el quinto parásito

causante de malaria en humanos. Estas 5 especies de Plasmodium difieren en

morfología, ciclo de vida y presentación clínica (Singh et al., 2004; White, 2008).

2.1.2. CICLO BIOLÓGICO

En el ciclo biológico de Plasmodium existen 2 huéspedes, uno definitivo (la

hembra del mosquito Anopheles, donde el Plasmodium se reproduce

sexualmente) y otro intermediario (el ser humano, donde se realiza la reproducción

asexual del parásito) (Manguin et al., 1995). El ciclo empieza con la picadura de un

huésped infectado por el mosquito Anopheles, en el cual se inicia la fase sexual o

esporogónica, con una duración de 8 a 16 días, donde los gametocitos ingeridos

maduran a gametos, se fusionan y dan lugar al cigoto, este es el único estadio

diploide en el ciclo de vida de Plasmodium (la meiosis ocurre a pocas horas de la

formación del cigoto, permaneciendo el parásito en las formas haploides durante

semanas o meses) (McKenzie et al., 2001). El cigoto se introduce en el epitelio

intestinal del insecto, donde se desarrollan miles de esporozoitos que migran a las

glándulas salivales, a partir de donde serán inoculadas en el torrente sanguíneo

de un nuevo hospedero, iniciándose la fase asexual o esquizogónica del parásito.

En la fase asexual se observan 2 estadios: 1) exoeritrocítico, los

esporozoitos pasan de la circulación sanguínea a las células hepáticas, donde se

forman esquizontes (esquizogenésis), dando lugar a la formación de merozoitos

que al quedar libres inician esta fase nuevamente, con una duración de 6 a 8 días,

este estadio termina cuando los merozoitos invaden los hematíes, 2) eritrocítico;

los merozoitos en el interior de los hematíes forman el trofozoito joven, luego

adulto, seguido del esquizonte, originándose nuevamente merozoitos que al

romper el hematíe repiten el ciclo y dependiendo de la especie, luego de 2 ó 3

generaciones, algunos merozoitos desarrollan los gametocitos que son la forma

infectante para el mosquito (Aramburu et al., 1999; Hay et al., 2004). Una característica

propia de P. vivax y P. ovale es que estos tienen una forma asexual latente,

conocido como hipnozoito, el cual persiste en el hígado y causa relapsos semanas

después de la eliminación de los estadios sanguíneos que causan la infección

aguda (Hanf et al., 2009).

2.1.3. EPIDEMIOLOGÍA

Según la Organización mundial de la salud (OMS), la malaria es

considerada una de las enfermedades tropicales más importantes, siendo

endémica en África sub-Sahariana, oeste de Asia, América, el Caribe, Nueva

Guinea, Vanuatu, Islas Salomón, India y Pakistán, donde vive la mitad de la

población mundial. A mediados del 2008 unos 3200 millones de personas vivían

en zonas con riesgo de transmisión, en 109 países y territorios (WHO, 2008a). Se

estima que anualmente ocurren entre 350 y 500 millones de casos clínicos y entre

1,5 a 2,7 millones de muertes, la mayoría causados por P. falciparum y P. vivax

(WHO, UNICEF, 2005). Siendo el continente africano el más afectado con alrededor

del 60% de estos casos y más de 80% de muertes (WHO, 2007).

Entre las 4 especies causantes de malaria, P. falciparum y P. vivax tienen la

mayor incidencia, considerando a P. falciparum como la más peligrosa, por su

letalidad, por la dispersión mundial de sus estirpes resistentes a las drogas anti-

maláricas y por su predominio en África. P. vivax es el segundo parásito causante

de malaria mas prevalente en el mundo, predominantemente en Asia, América

Central y Sudamérica (Ousmane et al., 2005). Actualmente P. vivax ocasiona 70-80

millones de infecciones/año, que es un poco más de la mitad de la casuística

global registrada fuera de África, con más del 50% de los casos registrados en

Latinoamérica (WHO, 2009). La habilidad de P. vivax de completar su ciclo

esporogónico a una temperatura mínima de 16°C, comparada con 21°C utilizado

por P. falciparum, ha contribuido a la capacidad de establecerse en distintas

regiones tropicales, subtropicales y templadas (Mendis et al., 2001).

En América, el 38,4% de la población vive en regiones ecológicas propicias

para la transmisión de malaria. En el año 2000, de los 1,14 millones de casos

notificados, 53,6% se presentaron en Brasil, seguido por 9,45% en Colombia,

8,65% en Ecuador, 6,12% en Perú, 4,68% en Guatemala, 3,08% en Honduras,

2,76% en Bolivia, 2,61% en Venezuela, 2,11% en Guyana y 1,15% en Surinam. A

partir del 2005, con el incremento de casos de malaria por P. vivax en la región

amazónica, el Perú ocupa el tercer lugar después de Brasil y Colombia (WHO,

2005).

En el Perú la malaria es endémica y caracterizada por ser cíclica o

estacional. El área de transmisión involucra el 75% del territorio nacional,

distribuido en escenarios epidemiológicos como la cuenca amazónica, valles

occidentales de la costa norte y valles interandinos hasta los 2300 m.s.n.m.

(Aramburu et al., 1999; DRE-SVE, 2007). En nuestro país, P. vivax es el más

importante parásito causante de malaria en términos de su morbilidad y a pesar de

la amplia prevalencia, estudios concernientes a su biología y a las manifestaciones

de la enfermedad son limitados, en parte, debido a que la mayor atención ha sido

dirigida a P. falciparum por ser el causante de la malaria maligna (Ayala et al., 2005;

Volman et al., 2005).

La mayor incidencia de malaria, en el Perú, se encuentra en el norte de la

región amazónica, donde se ubica el departamento de Loreto, siendo el epicentro

de esta enfermedad desde los años 1990. En el 2008, esta región registró el 55%

de los casos notificados, seguido por los departamentos de Madre de Dios, Piura,

Tumbes y Junín, que constituyen un segundo estrato en relación a la carga de

enfermedad (MINSA, 2009). En el 2009, esta región también registró el brote de

mayor magnitud con 25928 casos. En el 2011 a nivel nacional se notificó 23062

casos, 11779 procedieron de Loreto (51 % del total).

Actualmente DIRESA Loreto ha notificado hasta la semana epidemiológica

(SE) 29 del 2012, un total de 14463 casos, de los cuales 85,8% son por P. vivax y

14,2 % por P. falciparum. La provincia de Maynas, una de las siete que conforman

el departamento de Loreto, en el 2008 registró 30% de los casos del país. Esta

provincia, de gran extensión territorial, limita al norte con Colombia y al Oeste con

Ecuador, presenta distritos como Fernando Lores, San Juan Bautista y Mazán que

conforman un importante foco de malaria principalmente por P. vivax. Estas

localidades se ubican próximas a la ciudad de Iquitos, donde la dinámica de

transmisión guarda relación con los desplazamientos de la población (MINSA, 2008).

2.1.4. SINTOMATOLOGÍA

La sintomatología de la malaria consiste en un cuadro clínico clásico de

escalofríos, episodios febriles intensos y sudoración. Al terminar la sudoración el

paciente entra en un período asintomático, hasta el próximo acceso febril. Los

primeros síntomas son poco específicos y similares a los de una infección viral:

dolor de cabeza, debilidad, fatiga, mialgias y artralgias. En casos severos se

presentan coma, acidosis metabólica, anemia severa, hipoglucemia, falla renal,

falla pulmonar y esplenomegalia. En este estado, aun con tratamiento, la letalidad

puede llegar a ser de 15-20% y si no se trata, la malaria complicada es casi

siempre fatal. Sin embargo todos los signos y síntomas varían en función a la

especie de Plasmodium, la carga parasitaria y estado inmune del paciente (Mwangi

et al., 2005; WHO, 2006).

Todas las especies de Plasmodium tienen un componente hemolítico, por lo

que cada vez que una generación de merozoitos destruye el glóbulo rojo se

originan los síntomas. En el caso de P. falciparum, los parásitos se multiplican

rápidamente y pueden infectar más del 30% de los eritrocitos, causando altos

niveles de hemólisis e incremento las complicaciones de la enfermedad; este

parásito invade células de todas las edades mientras que P. vivax y P. ovale

prefieren células jóvenes y P. malariae busca células maduras (Carlton et al., 2003).

Las características únicas de P. vivax y P. ovale en la reactivación de los

hipnozoitos, llevan a la reaparición de nuevos episodios o relapsos, en estos

casos, los síntomas subclínicos como dolor de cabeza, dolor de espalda, nauseas

y malestar general pueden ser muy leves o estar ausentes (OPS, 2006).

2.1.4.1. Malaria Asintomática

La malaria asintomática está relacionada con las constantes infecciones y

los relapsos, que ocasionan incremento de la inmunidad adquirida, con la

consecuente disminución en las complicaciones de la enfermedad.

Frecuentemente en regiones endémicas, tras prolongados periodos de infección,

las personas expuestas tienen un alto grado de inmunidad y la malaria clínica es

poco frecuente, con lo cual se incrementa el número de portadores asintomáticos.

Además varios estudios en P. vivax han señalado que durante los relapsos,

la respuesta inmune es más rápida y amplificada, seguida de elevaciones

adicionales en los niveles de anticuerpos (Loyola, 1991; Branch et al., 2005).

La malaria puede comportarse como una infección asintomática sólo puede

detectarse mediante procedimientos de laboratorio), como una infección subclínica

(que supera el umbral clínico, pero no lo hace de forma típica), como una infección

sintomática o, incluso, como una infección hiperaguda fulminante, de rápida

evolución que produce la muerte. Las formas subclínicas y asintomáticas, donde

se ubican los portadores, tienen gran significado epidemiológico pues aunque son

invisibles al ojo clínico, contribuyen a mantener, difundir y perpetuar la infección

(Koram, 1993).

La frecuencia de malaria asintomática no es conocida en regiones de baja

transmisión. En Perú, los estudios se han limitado a diseños transversales, como

los efectuados en las comunidades al sur de Iquitos, donde, a partir de 998

individuos, se encontraron 13 con P. falciparum y 30 con P. vivax, todos

detectados por microscopía, de éstos, sólo 8 y 19 respectivamente, reportaron

solo fiebre. (Alves et al., 2002; Roshanravan et al., 2003; Branch et al., 2005).

2.1.5. DIAGNÓSTICO

El diagnóstico oportuno y preciso es crítico para el manejo efectivo de la

malaria. Las implicaciones del diagnóstico guardan relación con la diferente

morfología de las especies maláricas, la esquizogonia eritrocítica, la endemicidad,

los niveles de transmisión, la densidad parasitaria, la inmunidad, los signos y

síntomas clínicos, la resistencia a drogas, la malaria recurrente y la parasitemia

persistente, todo un conjunto complejo de elementos que influyen en la

interpretación del diagnóstico (Tangpukdee et al., 2009). La presentación clínica de la

malaria es variable y poco específica, por lo tanto es necesario incorporar técnicas

de laboratorio para su diagnóstico (Perkins y Bell, 2008).

La microscopía convencional, utilizando el examen de gota gruesa o frotis

sanguíneo, se considera el método idóneo para el diagnóstico y control de la

malaria, aún cuando puede presentar menor sensibilidad que las técnicas

moleculares, particularmente ante parasitemias bajas e infecciones mixtas (Gillet et

al., 2009; Tangpukdee et al., 2009). Su umbral de detección se ubica entre 4 y 20

parásitos/μl (Wongsrichanalai et al., 2007), aunque en condiciones de campo, un

umbral entre 50 y 100 parásitos/μl se considera más realista, con un número

recomendado de campos a ser leídos entre 100 y 400 (WHO, 1991).

Por otra parte diferentes estudios han demostrado que los métodos

moleculares detectan 8 veces más infecciones, por Plasmodium spp., que la

microscopía, representando las infecciones mixtas, hasta un tercio de ellas. Las

herramientas de diagnóstico molecular han modificado la interpretación de la

epidemiología malárica, al revelar grandes reservorios de infecciones

asintomáticas (Steenkeste et al., 2009). Además son consideradas muy importantes

por su utilidad para identificar especies cuando las densidades parasitarias son

muy bajas, en las infecciones mixtas o cuando las muestras se han deteriorado.

Esta es una técnica altamente específica y sensible, con un umbral de detección

entre 1 y 10 parásitos/ μl. Las técnicas moleculares también permiten detectar

parásitos resistentes a drogas y analizar el polimorfismo genético en estudios de

relapsos (Johnston et al., 2006; Kain et al., 1993).

2.1.6. TRATAMIENTO

La pauta antimalárica, para P. vivax, contempla el tratamiento de cura

radical recomendado por la OMS: Combinación de Cloroquina (CQ) a razón de 25

mg/kilo de peso corporal, distribuidos en 3 días y Primaquina (PQ) a razón de 0,25

mg/kilo de peso corporal, por día, durante 14 días. La primera actúa como

esquizonticida sanguíneo, elimina trofozoitos y esquizontes que son las formas

asexuales responsables de las manifestaciones clínicas y la segunda actúa como

esquizonticida tisular, elimina los parásitos en desarrollo o latentes (hipnozoitos)

en el hígado, para prevenir los relapsos (WHO, 2006). En el caso de relapsos, al

igual que en el episodio inicial, las pautas para el tratamiento son las mismas. En

caso de un segundo o tercer relapso deberá prescribirse la cloroquina en la misma

dosis y la primaquina al doble, dosificando a 0,5 mg/kg por día por 14 días ó 0,25

mg/kg por día durante 28 días (Álvarez et al., 2006).

2.2. RECURRENCIA DE LA MALARIA POR P. vivax

La reinfección, los relapsos y la resistencia a fármacos son el origen de las

recurrencias. Cuando una parasitemia reaparece después del tratamiento, puede

tratarse de: a) un relapso, por reactivación de estadios latentes en el hígado,

conocidos como hipnozoitos, b) una reinfección, por la picadura infectante de otro

mosquito, que en zonas endémicas es constante o c) una resistencia, originada

por estadios asexuales sanguíneos que sobrevivieron a la terapia y permanecieron

a niveles subpatentes (Baird et al., 2004; Orjuela et al., 2009a).

Diversos ensayos clínicos con drogas antimaláricas estiman alarmantes

rangos de recurrencia de P. vivax, los cuales pueden llegar de 26% a 40 % en 180

días de seguimiento post-tratamiento. Algunos estudios en regiones de la

amazonía rural reportan recurrencias de la parasitemia por haplotipos idénticos de

P. vivax (consistentes con reactivación de hipnozoitos homólogos) y por haplotipos

relacionados pero diferentes, sugiriendo la necesidad de caracterizar un número

mayor de muestras con infección primaria y recurrente para determinar

exactamente la asociación genotípica (Mallika et al., 2007; Baird et al., 2008; Orjuela et

al., 2009b).

2.2.1. RELAPSO O REINFECCIÓN

El manejo y control de P. vivax es complicado por su habilidad de causar

relapsos y por las continuas reinfecciones. Los relapsos presentan variaciones

notables de acuerdo a las diferentes regiones geográficas y climáticas, así las

cepas originarias de regiones tropicales están caracterizadas por una infección

primaria temprana, seguido por un corto periodo latente, de 5 a 10 semanas, antes

de la aparición de frecuentes relapsos durante el siguiente año. En contraste

cepas de regiones templadas están caracterizadas por un periodo variable antes

de la infección primaria, seguido por un largo periodo latente, de 5 a 10 meses,

antes del comienzo de los relapsos. Claros ejemplos son los estudios realizados

en Guyana Francesa, donde se mostraron picos de relapsos en los primeros 3

meses después del episodio inicial, posterior a este periodo la mayoría de

episodios fueron principalmente debidos a reinfecciones. Estas observaciones

mostraron un patrón de cepa tropical, con un corto periodo latente para el inicio de

los relapsos. (Alyson et al., 1996; Hanf et al., 2009).

En varios estudios registran frecuencias para los relapsos que varían desde

11% en la India hasta 51% en Afganistán, con valores intermedios de 30% en

Indonesia (WHO, 2006). En Colombia, un estudio realizado en el año 2004 mostró

que el tiempo en que se presentan la recurrencias (relapsos), en pacientes

sometidos a diferentes esquemas de tratamiento, fluctúan entre 53 a 129 días

después del episodio inicial (Álvarez et al., 2006).

Diferenciar relapso y reinfección en regiones endémicas resulta complicado,

la mayoría de estudios usan técnicas moleculares como la genotipificación para

hacer una distinción entre los tipos de recurrencias, diferenciando los relapsos

(con el mismo genotipo como en la infección inicial) de las reinfecciones (con un

genotipo diferente) (Orjuela et al., 2009b), cabe señalar además que los relapsos

pueden originarse tanto desde la reactivación del mismo clon del parásito,

encontrado en la infección inicial (hipnozoito homólogo), como de otro clon

genéticamente diferente (hipnozoito heterólogo). Otros estudios estiman el relapso

usando rangos de tiempo según el tipo de cepa o basado en la frecuencia de

casos de P. vivax durante la estación de no transmisión. De forma más precisa,

algunos proponen una simple clasificación para la fácil diferenciación entre

relapsos y reinfecciones, se plantean rangos de tiempo a escala individual,

identificando infecciones antes de 90 días post-primer episodio, con una alta

probabilidad que el ataque secundario sea un relapso y después de los 90 días es

más probable que el ataque secundario sea por una reinfección (Chen et al., 2007;

Veron et al., 2009).

2.2.1.1. Análisis Polimórfico del gen pvmsp3-α

La epidemiología molecular contribuye a diferenciar entre relapsos y

reinfecciones, mediante la utilización de técnicas moleculares. El marcador

pvmsp3-α, que codifica para la proteína de superficie del merozoito (MSP3-α), ha

sido extensamente estudiado (Cui et al., 2003). Este gen de copia única

comúnmente utilizado para la genotipificación de P. vivax, codifica una región

altamente polimórfica con un dominio central rico en Alanina que contiene una

región interna compuesta por motivos repetitivos de longitud variable (PlasmoDB

gene ID: PVX_097720). La proteína codificada por este gen, tiene un peso

molecular entre 148 a 150 KD, se encuentra en el estadio eritrocítico del ciclo de

vida del parásito y es considerada como un potencial blanco de vacunas. (Cui et al.,

2003; Mascorro et al., 2005; Imwong et al., 2005).

En países como Irán, Papúa Nueva Guinea y Colombia el polimorfismo del

gen pvmsp3-α ha sido ampliamente estudiado, mediante la utilización de técnicas

como el Nested-PCR y digestión enzimática o RFLP, con enzimas como Alu I y

Hha I (Zakeri et al., 2006; Cole-Tobian et al., 2005; Cristiano et al., 2008). A su vez en

Venezuela y Tailandia se han llevado a cabo técnicas de secuenciamiento génico,

para determinar más extensamente el polimorfismo de este gen (Ord et al., 2005; Cui

et al., 2003).

Tres alelos principales han sido reportados después de realizar el Nested-

PCR, los cuales son caracterizados como alelo A = 1800 a 1900 pb, B = 1500 pb y

C = 1100 a 1200 pb. La diversidad puede ser mayor dentro de estos alelos, si se

utiliza la digestión enzimática combinando las enzimas Hha I y Alu I. La digestión

nos permite obtener patrones de corte enzimático, a partir del producto de

amplificación, que pueden ser compilados y usados para la genotipificación de P.

vivax. Las técnicas tanto de Nested-PCR como de RFLP permiten identificar no

solo haplotipos monoclonales sino también policlonales y las frecuencias de estos

haplotipos permiten definir el nivel de la diversidad poblacional (PLD) y la

complejidad de la infección (COI) (Bruce et al. 1999, Ord et al.,. 2005, Sutton et al., 2009).

Gen polimórfico pvmsp3-α de P. vivax

Cui et al., 2003

2.2.2. RESISTENCIA

La recurrencia, debida a la incompleta eliminación de estadios eritrocíticos

del parásito, ocasionada por el inadecuado tratamiento terapéutico, también puede

ser producida por mecanismos de resistencia. Aunque la resistencia podría ser

común después de un tratamiento inadecuado, también es necesaria la presencia

de parásitos resistentes, con variaciones genéticas en su genoma (Cogswell et al.,

1992). En el control de la malaria por P. vivax, las medidas aplicadas son

confundidas a menudo por factores como el surgimiento de resistencia a drogas,

principalmente a cloroquina. El primer caso de resistencia de P. vivax a cloroquina

fue reportado en 1989 desde Papúa Nueva Guinea, donde la monoterapia con

este fármaco es ahora virtualmente inefectiva. Más recientemente casos

esporádicos han sido reportados desde Myanmar, Sudamérica, Vietnam, y

Turquía (Hay et al., 2004; Price et al., 2007).

Reportes desde Sudamérica también sugieren la presencia de casos

aislados de P. vivax resistente a cloroquina, principalmente en regiones

endémicas como la ciudad de Manaus, en Brasil, donde en el 2000 se identificaron

casos de infección con P. vivax resistente al tratamiento con cloroquina (Alecrim,

2000). En Perú a partir de 1998, debido al peligro de propagación de la resistencia

a cloroquina, el Ministerio de Salud empezó una serie de ensayos de eficacia

terapéutica de este fármaco (Garg et al., 1995; Dua et al., 1996). Sin embargo a pesar

de los reportes clínicos, la prevalencia global de resistencia por P. vivax

permanece pobremente definida, principalmente debido a las variaciones de las

condiciones inmunológicas de cada paciente, por las continuas reinfecciones y por

los relapsos (Nomura et al., 2001; Tjitra et al., 2002; Ratcliff et al., 2007).

2.2.2.1. Análisis Polimórfico del gen pvmdr1

Estudios sobre el perfil de susceptibilidad a drogas han permitido identificar

proteínas transportadoras de membrana, como el MDR1, asociadas con

resistencia a cloroquina (CQR) principalmente en P. falciparum. Así mismo el

secuenciamiento permitió identificar proteínas ortólogas en P. vivax, codificadas

por el gen pvmdr1 (Baird et al., 2004; Babiker et al., 2001).

El gen pvmdr1 esta caracterizado por un único ORF de 4392 bp que

codifica una proteína de 1464 aa. Para determinar la resistencia a drogas fueron

tomadas en consideración 2 regiones de este gen: La primera abarca la posición

homóloga a los sitios polimórficos 86 y 184, la segunda abarca la posición

homóloga a los sitios polimórficos 1034 y 1042 de P. falciparum, que están

relacionadas con el fenotipo CQR.

El análisis de secuenciamiento permitió identificar polimorfismo de

nucleótidos únicos o SNPs en los codones 976 y 1076, localizados en los

segmentos hidrofóbicos X y XI de la proteína MDR. SNPs en estos codones

originan mutaciones no sinónimas como el cambio de aminoácidos Y/F y F/L,

respectivamente. Estos SNPs fueron asociados con CQR tanto in vitro como in

vivo y fueron reportados esporádicamente en pacientes provenientes de las

regiones amazónicas tanto del Perú como de Brasil (Sattabongkot et al., 2004; Fidock

et al., 2000; Brega et al., 2005; Suwanarusk et al., 2007).

Proteína TRM codificada por el gen pvmdr1 de P. vivax

Orjuela et al., 2009a

El análisis completo de la secuencia nucleotídica del gen pvmdr1 demostró

que contiene 24 SNPs y una única secuencia microsatélite conservada.

Notablemente 17 (73%) de los SNPs fueron no-sinónimos; sin embargo a pesar de

esta alta frecuencia de SNPs, ninguno fue encontrado en los motivos conservados

ABC. El motivo ABC es una secuencia aminoacídica corta, presente en el sitio de

fijación a nucleótidos (NBD), el cual junto con los motivos Walker, es responsable

de la hidrólisis de ATP (Brega et al., 2005). El SNP en el codón Y976F fue propuesto

como un marcador temprano de CQR y en estudios de susceptibilidad in vitro fue

encontrado en un 96.1% (123/128) de aislados provenientes de Indonesia

comparados a un 25% (17/69) de aislados provenientes de Tailandia. En

Indonesia, la media geométrica IC50 de susceptibilidad a cloroquina en aislados

con mutación Y976F fue de 283 nM, significativamente mayor que en los aislados

con el genotipo wild type con 44,5 nM (Suwanarusk et al., 2007; Orjuela et al., 2009a).

Por otro lado la CQR también está relacionada con la variación en el

número de copias de genes que codifican proteínas de resistencia como el MDR1.

Estudios efectuados en cepas provenientes de África principalmente en P.

falciparum se basan en técnicas de qPCR Real Time para determinar estas

variaciones (Ferreira et al., 2006). Así mismo los plásmidos clonados (fragmentos de

pvmdr1 y pvald1) utilizados como calibradores permitieron determinar el número

de copias en distintos aislados provenientes de Indonesia y Tailandia (Suwanarusk

et al., 2007).

III. OBJETIVOS

Objetivo general

Relacionar los patrones de recurrencia y la resistencia con la variabilidad

genética de Plasmodium vivax, en individuos con infección asintomática

provenientes de Mazán, región endémica del Perú.

Objetivos específicos

Detectar infecciones recurrentes por P. vivax, en individuos asintomáticos.

Identificar la variabilidad genética de P. vivax, en base al gen pvmsp3-α, en

individuos con infección recurrente.

Identificar los patrones de recurrencia asociados a la variabilidad genética

de P. vivax.

Identificar mutaciones no sinónimas e incremento en el número de copias

del gen pvmdr1, relacionados con resistencia de P. vivax a la cloroquina.

IV. HIPÓTESIS

Los patrones de recurrencia y la resistencia de P. vivax, en individuos con

infección asintomática, están relacionados con la variabilidad genética del

parásito, identificada por el polimorfismo del gen pvmsp3-α y por la

presencia de mutaciones no sinónimas e incremento en el número de

copias del gen pvmdr1.

V. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. POBLACIÓN DE ESTUDIO

El presente estudio se realizó con muestras colectadas, entre Junio del

2006 y Noviembre del 2008, en el distrito de Mazán ubicado en la parte Nororiental

del Perú a 50 km de la ciudad de Iquitos, capital del departamento de Loreto.

Presenta un clima tropical, cálido, húmedo y lluvioso, con una temperatura

promedio de 28ºC y es considerada una zona de alto riesgo para la transmisión de

P. vivax. (Sawyer, 1993).

La población total de individuos, supuestamente sanos, captados para este

estudio fue de 496. La normalización estadística de datos permitió obtener una

muestra significativa de 222 individuos. Para ello se tomaron en cuenta niveles de

confianza al 95% (Zα2 = 1.962), con proporción esperada del 50% (p=0.5; q=1-p) y

precisión estadística en 5% (d=0.05). A partir de este grupo se obtuvieron 444

muestras, colectadas mediante el sistema de vigilancia activa y evaluadas dentro

del contexto de un estudio de eficacia de cloroquina in vivo para el tratamiento de

la malaria por P. vivax.

Los criterios de inclusión fueron: Individuos comprendidos entre 0 a 75 años

de edad, firma de consentimiento informado, residentes en la zona endémica, con

2 muestras secuenciales, previamente diagnosticados por microscopía y

evaluados durante un año de seguimiento activo. Criterios de exclusión fueron:

Individuos con tratamiento antimalárico previo al diagnóstico y con

manifestaciones clínicas o subclínicas de la enfermedad.

Todas las muestras colectadas en tubos de EDTA y en un volumen de 5 ml

de sangre total (punción venosa) fueron trasladadas en cajas provistas con hielo

seco y enviadas al área de Biología Molecular en el Laboratorio de Investigación y

Desarrollo de la Universidad Peruana Cayetano Heredia en Lima–Perú. Este

estudio forma parte del proyecto: “Human reservoirs of Plasmodium vivax

transmission in the Peruvian Amazon”, aprobado por el comité de ética de la

universidad en mención (código SIDISI: 50457). En colaboración con la

Universidad Johns Hopkins en USA, el Instituto de Medicina Tropical “Alexander

Von Humbolt”, la Asociación Benéfica “PRISMA” y el Ministerio de Salud a través

de la Dirección Regional de Salud de Loreto.

5.2. ANÁLISIS DE DATOS

La variabilidad genética de P. vivax fue evaluada mediante la determinación

del nivel de la diversidad poblacional (PLD), definido como la variación genética de

un gen, en un loci antigénico, variable o neutral. Una medida del PLD es la

heterocigosidad esperada (He = 1/(1 − N) (1 – Σp2i) (Sutton et al., 2009), con p igual

a la frecuencia del alelo y N igual al número de alelos detectados, los valores del

He oscilan entre 0 a 1, considerando una alta variabilidad genética cuando los

valores son cercanos a la unidad. La complejidad de la infección (COI) es usada

también para evaluar la variabilidad genética, identificando el mínimo número de

alelos presentes en un loci polimórfico de copia única. Un COI > 1 puede ser

determinado por la observación de múltiples alelos dentro de una única muestra.

Para medir la significancia de las frecuencias de haplotipos encontrados se

utilizó la prueba de Fisher (F). En esta prueba el valor de la razón estadística (F

prueba) fue comparada con el valor de la razón tabular (F tabla). Considerando un

nivel de significancia del 95% (1-α = 0,95) y valorando las frecuencias observadas

como similares (F prueba<F tabla) o variables (F prueba > F tabla). Para el

análisis de relación se utilizó el Chi-cuadrado (X2). Considerando una relación

significativa con una probabilidad del 95%, cuando p < 0,05 (Tabla X2) y altamente

significativa con una probabilidad del 99%, cuando p < 0,01 (Tabla X2) con grados

de libertad mayores a cero (GL ≥ 1).

5.3. MÉTODOS DE INVESTIGACIÓN

El diseño de la investigación planteada es de tipo Experimental.

5.3.1. EXTRACCIÓN DE DNA

Se realizó la extracción de DNA a partir de las muestras de sangre en

EDTA, mediante el protocolo del Kit comercial QIAamp DNA Blod (Qiagen

Sciences, Maryland-USA). El volumen utilizado fue de 200 μl, a partir de lo cual se

obtuvo una concentración entre 20 a 50 ng de DNA, el cual fue conservado

inmediatamente a una temperatura de -20ºC, posteriormente utilizado tanto para el

diagnóstico como para la genotipificación molecular.

5.3.2. DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE Plasmodium

5.3.2.1. Nested PCR

La detección de las especies de Plasmodium se realizó mediante el Nested-

PCR, el cual consta de 2 PCR consecutivos, realizados con la finalidad de

aumentar tanto la especificidad como la sensibilidad del análisis. Los

oligonucleótidos y condiciones de reacción y amplificación fueron adaptadas de

Roshanravan et al., 2003.

5.3.2.1.1. Primera PCR: Se amplificó un segmento del gen

que codifica el RNA ribosomal 18S (SSUrRNA) de 1200 pb, específico del género

Plasmodium. Los oligonucleótidos fueron: Plagen1= 5´-

CTTGTTGTTGCCTTAAACTTC-3´ y Plagen2= 5´-

TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG-3´.

La reacción de amplificación se realizó en un volumen final de 15 μl

conteniendo: buffer 1X (10 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KCl), 2 mM de MgCl2, 0,2

mM de dNTPs, 0,25 μM de cada oligonucleótido, 0,032 U/μl Taq DNA polimerasa

(Promega) y 50 ng de DNA. Las condiciones fueron: 95ºC por 3 min.; 19 ciclos

cada uno de 94°C por 30 seg., 58°C por 30 seg., 72°C por 1 min.30seg. y 1 ciclo

de extensión final de 72°C por 7 min.

5.3.2.1.2. Segunda PCR: Se amplificó una región interna

específica para P. vivax y para P. falciparum. Los oligonucleótidos fueron: Para P.

vivax: Viv1= 5´-CGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTGATAC-3´ y Viv2= 5´-

ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCCTTA-3´, que amplificaron 120 pb. Para

P. falciparum: Fal1= 5´-TTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATT-3´ y Fal2=

5´-ACACAATGAACTCAATCATGACTACCCGTC-3´, que amplificaron 205 pb.

La reacción de amplificación se realizó en un volumen final de 15 μl

conteniendo: buffer 1X (10 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KCl), 2 mM de MgCl2, 0,2

mM de dNTPs, 0,5 μM de cada oligonucleótido, 0,032 U/μl Taq DNA polimerasa

(Promega) y 1 μl de DNA obtenido de la primera amplificación. Las condiciones

fueron: 95ºC por 2 min, 34 ciclos cada uno de 94ºC por 30 seg., 60ºC por 1

min.30seg., 72ºC por 1 min. 30 seg., y finalmente 1 ciclo de extensión de 72ºC por

7 min.

Las reacciones de PCR fueron realizadas en un termociclador PT-100 MJ

Research. Los productos de PCR fueron separados por electroforesis en geles de

agarosa al 2% (Invitrogen, Life technologies) conteniendo 0,05 mg de bromuro de

etidio (Sigma Chemical CO.) y visualizados bajo iluminación UV. Los

oligonucleótidos seleccionados fueron evaluados con: BLASTn

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), CLUSTAL X (Gibson et al., 1994), PRIMER

PREMIER (htpp://www.premierbiosoft.com/primer design/index.html).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

5.3.3. GENOTIPIFICACIÓN MOLECULAR DE P. vivax

5.3.3.1. Nested PCR

Para la amplificación de la región polimórfica del gen pvmsp3-α se realizó

un Nested PCR. Los oligonucleótidos y condiciones de reacción y amplificación

fueron adaptadas de Bruce et al., 1999 y Cui et al., 2003.

5.3.3.1.1. Primera PCR: Los oligonucleótidos utilizados

fueron: P1V1= 5´-CAGCAGACACCATTTAAGG-3´ y P2V1= 5´-

CCGTTTGTTGATTAGTTGC-3´. La reacción de amplificación se realizó en un

volumen final de 15 μl, conteniendo: buffer 1X (10 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM

KCl), 2 mM de MgCl2, 0,15 mM de dNTPs, 0,15 μM de cada oligonucleótido, 0,013

U/μl. Taq DNA polimerasa (Promega) y 50 ng de DNA. Las condiciones fueron:

94ºC por 3 min., 34 ciclos cada uno de 94ºC por 30 seg., 56ºC por 30 seg., 68ºC

por 2 min. 30seg. y 1 ciclo de extensión final de 72ºC por 4 min.

5.3.3.1.2. Segunda PCR: Los oligonucleótidos utilizados

fueron: N1V1= 5´-GACCAGTGTGATACCATTAACC-3´ y N2V1= 5´-

ATACTGGTTCTTCGTCTTCAGG-3´. Estas secuencias amplificaron fragmentos

de 1900 pb y 1500 pb, correspondientes a los alelos A y B respectivamente. Las

reacciones de amplificación fueron similares a las usadas para la primera PCR,

agregando 1 μl de DNA a cada reacción, obtenido de la primera amplificación. Las

condiciones fueron de: 94ºC por 3 min., 29 ciclos cada uno de 94ºC por 30 seg.,

57ºC por 30 seg., 68ºC por 2 min. 30seg. y 1 ciclo de extensión final de 68ºC por 4

min.

Las reacciones de PCR y el análisis de los productos de PCR en geles de

agarosa al 1% se realizaron tal como se describe en la sección 5.3.2.1.2. Los

tamaños de los fragmentos fueron determinados usando un marcador de peso

molecular de 1 Kb (Invitrogen, Life technologies). Todas las muestras fueron

analizadas por duplicado para confirmar la reproducibilidad de los resultados.

.

5.3.3.2. Digestión enzimática

Para determinar el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de

restricción (RFLP), que permite establecer los diferentes haplotipos, se utilizaron 2

enzimas de digestión Alu I y Hha I (20000 U/ml. BioLabs Inc. UK) usadas para la

genotipificación de P. vivax (Kosek et al., 2012). Cien nanogramos de DNA

amplificado, proveniente de la segunda PCR, fueron digeridos con: 1X NEBuffer 4

(50 mM de acetato de potasio, 20 mM Tris-acetato, 10 mM Acetato de magnesio, 1

mM ditiotreitol pH 7,9), 0,5U de Alu I y 0,5U de Hha I en un volumen final de 16 μl.

La incubación de la reacción se realizó a 37ºC por 3 horas, posteriormente las

enzimas fueron inactivadas a 65°C por 10 min.

Los fragmentos de DNA obtenidos de la digestión enzimática fueron

separados por electroforesis en geles de agarosa al 2%, tal como se describe en

la sección 5.3.2.1.2. Los tamaños de los fragmentos fueron determinados usando

un marcador de peso molecular de 100 bp (Invitrogen, Life technologies). Los

patrones enzimáticos fueron establecidos en base al número y al tamaño de los

fragmentos producidos con cada enzima, designados como haplotipos PA para

Alu I y PH para Hha I. Las infecciones policlonales o mixtas fueron identificadas

usando 2 criterios: Por el Nested PCR, con la presencia de 2 o más secuencias

alélicas del producto no digerido (Alelos A ó B) y por el RFLP comparando la suma

de los tamaños de los fragmentos del producto digerido con el tamaño del

producto no digerido.

5.3.4. ANÁLISIS DE RESISTENCIA DE P. vivax

5.3.4.1. PCR Convencional

Para identificar la resistencia de P. vivax se realizó inicialmente una PCR

convencional, para amplificar el gen pvmdr1. Posteriormente los productos de

amplificación previamente purificados fueron secuenciados. Los oligonucleótidos y

condiciones de reacción y amplificación fueron adaptadas de Brega et al., 2005.

Los oligonucleótidos utilizados fueron los siguientes: MdrF800= 5´-

ATAGTCATGCCCCAGGATTG-3’ y MdrR800= 5’-

ACGTTTGGTCTGGACAAGTATC-3’, cuyo producto de amplificación fue de 800

pb. La reacción de amplificación se realizó en un volumen final de 20 μl,

conteniendo: buffer 1X (10 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl), 2,5 mM de MgCl2,

0,25 mM de dNTPs, 0,5 μM de cada oligonucleótido, 0,03 U/μl. Taq DNA

polimerasa (Promega) y 50 ng de DNA. Las condiciones fueron: 94ºC por 2 min.,

34 ciclos cada uno de 94ºC por 1 min., 62ºC por 1 min., 72°C por 1 min. y 1 ciclo

de extensión final de 72ºC por 5 min.

5.3.4.2. Secuenciamiento

Los productos de amplificación del gen pvmdr1 (sección 5.3.4.1.) fueron

enviados a los laboratorios de la corporación Macrogen en Maryland-USA para su

secuenciamiento, mediante el secuenciador BigDye Terminator 3.1 (Applied

Biosystems). Se envió a secuenciar la región que comprende los SNPs en los

codones Y976F y F1076L del gen pvmdr1, usando los mismos oligonucleótidos

mencionados en la sección anterior.

Estas secuencias fueron comparadas con las secuencias del gen pvmdr1

de la cepa Sal1 de P. vivax (GenBank Acc. No. AY618622) sensible a cloroquina y

proveniente del Salvador, usada como cepa de referencia en este estudio. Las

secuencias obtenidas fueron alineadas y analizadas usando el programa

ClustalW2 disponible libremente en la página web:

http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/, además para investigar la relación

filogenética entre estas secuencias provenientes de diferentes muestras, se utilizó

el programa Clustal C. La presencia de SNPs en estos codones relacionados con

resistencia a cloroquina fue confirmado, identificando los cambios de aminoácidos

en la secuencia proteica a través de un proceso de transducción in sílico,

mediante el software Translate a DNA Sequence disponible libremente en la

página web: http://arbl.cvmbs.colostate.edu/molkit/translate/.

Adicionalmente las secuencias del gen pvmdr1, conteniendo los SNPs en

los codones Y976F y F1076L, fueron analizados in sílico para determinar las

temperaturas de fusión en alta resolución o HRM mediante el software U-Melt

disponible libremente en la página web: http://www.dna.utah.edu/umelt/um.php, el

cual proporciona datos para una fácil discriminación entre los genotipos wild-type y

los genotipos mutantes.

5.3.4.3. Número de copias

Para determinar el número de copias del gen pvmdr1, se utilizó el método

de cuantificación relativa mediante qPCR en tiempo real con fluoróforo SYBR

Green I, mediante el sistema de ∆∆Ct comparativo en el equipo Step One Plus

Real Time 7700. En este sistema de cuantificación el gen de copia única, Aldolasa

(pvald1) codificado por P. vivax (GenBank Acc. No. AF247063), es usado como

gen endógeno (normalizador) para estimar el número de copias del gen pvmdr1

(problema) Las secuencias, así como los oligonucleótidos y las condiciones de

reacción y amplificación fueron adaptadas de Suwanarusk et al., 2007.

Los oligonucleótidos utilizados para amplificar el gen pvmdr1 fueron los

siguientes: mdr1F= 5´-CTGATACAAGTGAGGAAGAACTACG-3´ y mdr1R= 5´-

GTCCACCTGACAACTTAGATGC-3´, cuyo producto de amplificación fue de 151

http://www.dna.utah.edu/umelt/um.php

pb y para amplificar el gen pvald1 se utilizaron: AldF= 5´-

GACAGTGCCACCATCCTTACC-3´ y AldR= 5´-

CCTTCTCAACATTCTCCTTCTTTCC-3´, cuyo producto de amplificación fue de

191 pb.

La reacción de amplificación se realizó en un volumen final de 20 μl,

conteniendo: Master Mix SYBR Green 1X (Invitrogen, Life technologies) y 0,1 μM

de cada oligonucleótido. Las condiciones fueron: 95ºC por 10 min., seguido de 40

ciclos cada uno de 95ºC por 30 seg., 60ºC por 1 min., y 72ºC por 30 seg., los

cambios de fluorescencia se midieron en el canal F1 del instrumento StepOne

Plus Real Time 7700, en el final de la fase de extensión de cada ciclo. Los

ensayos fueron optimizados con una concentración de DNA a partir de 50 ng/μl.

El sistema de cuantificación relativa en tiempo real, requiere la utilización de

fragmentos clonados del gen pvald1 y del gen pvmdr1 de P. vivax. Estos

fragmentos fueron utilizados como calibradores y controles de amplificación en

cada experimento. El software para la cuantificación relativa se basa en la

utilización del sistema de ciclo del threshold (Ct) comparativo dada por la fórmula:

N= 2∆∆Ct, donde ∆∆Ct = (Ct pvald1-Ct pvmdr1)-(Ct pvald1cal-Ctpvmdr1cal). El Ct

pvald1 y Ct pvmdr1 son valores de Ct para el gen pvald1 y pvmdr1

respectivamente, mientras que el Ctcal es una diferencia promedio entre Ct pvald1

y Ct pvmdr1 obtenida de los calibradores conteniendo una única copia de los

fragmentos clonados.

5.3.4.4. Clonamiento

Los calibradores (fragmentos de los genes pvald1 de 191 pb y pvmdr1 de

151 pb) fueron clonados, siguiendo los siguientes procedimientos:

PCR Convencional y ligación: Para el PCR la reacción de amplificación

se realizó en un volumen final de 20 μl, conteniendo: buffer 1X (10 mM Tris-HCl

pH 8,4, 50 mM KCl), 2,5 mM de MgCl2, 0,25 mM de dNTPs, 0,075 μM de cada

oligonucleótido, 0,03 U/μl. Taq DNA polimerasa (Promega) y 50 ng de DNA. Las

condiciones de reacción fueron: 94ºC por 1 min., 34 ciclos cada uno de 94ºC por 1

min., 54ºC por 1 min., 72°C por 1 min. y 1 ciclo de extensión final de 72ºC por 5

min. Los productos de PCR fueron purificados utilizando el kit QIAquick PCR

Purification a través de la columna de Spin DNAquick (Qiagen).

El proceso de ligación de los fragmentos de los genes pvald1 y pvmdr1

(insertos), amplificados previamente, se realizó con el vector pGEM-T easy

(Promega). Este vector es lineal y presenta bases de Timina (T) en los extremos

3´ terminal, que se unen por complementariedad con los extremos poliA 5´

terminal de los productos de amplificación; esta característica facilita la ligación y

evita la recirculización del vector. La ligación se realizó en un volumen final de 10

μl, conteniendo: buffer 1X (60 mM Tris-HCl pH 7,8, 20 mM MgCl2, 2mM ATP),

pGEM-T easy 5 ng/μl, T4 DNA ligasa 10U y una relación de inserto con vector de

3:1.

Preparación de células competentes y transformación: La preparación

de células competentes se inicio con el cultivo de Escherichia coli (E. coli - cepa

NovaBlue) en agar/LB (Difco) e incubación a 37°C durante toda la noche.

Posteriormente colonias de E.coli fueron inoculadas en medio LB (Triptona 1%,

extracto de levadura 0,5% (Difco) y NaCl 0,5% (Merck)) e incubadas a 37°C con

agitación a 250 rpm, durante 2 horas, hasta que el OD (600 nm) sea de 0,35 a

0,45.

Las células con valores óptimos de OD fueron centrifugadas a 4000 rpm por

10 min. a 4°C, el sobrenadante fue descartado y el pellet resuspendido con 20 ml

de 0,1 M CaCl2 y 15% glicerol frio. Después de 15 minutos de incubación en hielo,

se realizó una segunda centrifugación a 3000 rpm por 10 min. a 4°C, el

sobrenadante fue descartado y el pellet resuspendido con 1 ml de 0,1 M CaCl2 y

15% glicerol frio, finalmente las células competentes fueron conservadas a -70°C

en alícuotas de 50 μl.

El proceso de transformación se realizó mediante shock térmico, con 2 μl

del inserto ligado al vector pGEM-T easy y 50 μl de células competentes

previamente descongeladas a 4°C. Las células fueron incubadas en hielo a 4°C

por 30 min. e inmediatamente llevadas a baño maría a 42°C por 50 seg.

Posteriormente volúmenes de 50 μl, 100 μl y 150 μl de células transformadas

fueron sembradas en agar/LB suplementado con 100 μg/ml de carbenicilina, 80

μl/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-gal) y 0,5 mM de

isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG); esparcidas con una densidad menor a

104 células por placa de cultivo e incubadas a 37°C durante toda la noche.

Análisis de recombinantes: La clonación y transformación fue confirmada

por el crecimiento de E. coli en agar/LB suplementado con antibiótico de selección

(carbenicilina 100 mg/ml) y para diferenciar entre células transformadas que

adquirieron o no el inserto, el medio de crecimiento fue enriquecido con X-gal

(sustrato cromogénico) e IPTG. De esta manera las células que captaron los

plásmidos con el operón lac intacto, una vez inducidas por IPTG, expresaron

activamente β-galactosidasa, que al hidrolizar a X-gal coloreo las colonias de azul.

Por otro lado las células que captaron los plásmidos con el operón lac

recombinante, con el inserto del fragmento de interés, sufrieron con la inserción la

inactivación del gen lacZ (uno de los genes que codifica la β-galactosidasa) y por

tanto, no expresaron β-galactosidasa ni degradaron X-gal, dejando las colonias de

color blanco. Dichas colonias blancas también fueron utilizadas para PCR, con los

oligonucleótidos específicos para los insertos, descrito anteriormente en la sección

5.3.4.4.

http://es.wikipedia.org/wiki/5-bromo-4-cloro-3-indolil-%CE%B2-D-galactopiran%C3%B3sido

Purificación del plásmido calibrador: Colonias de células transformadas

que adquirieron el inserto fueron inoculadas en 10 ml de medio LB + Carbenicilina

e incubadas a 37°C con agitación a 250 rpm, durante toda la noche.

Posteriormente las células en medio LB fueron centrifugadas a 3000 rpm por 15

min. a 4°C, el sobrenadante fue descartado y el pellet resuspendido y purificado

mediante kit de purificación de plásmidos EasyPrep (Invitrogen, Life technologies),

siguiendo las instrucciones del fabricante. El DNA plasmídico fue diluido hasta

obtener una concentración equivalente a una copia/μl del fragmento clonado

(pvald1 ó pvmdr1), siendo esta de 3,5 atogramos/μl (3,513 x 10-18 gramos).

VI. RESULTADOS

6.1. DETECCIÓN DE LA MALARIA DURANTE LA VIGILANCIA

ACTIVA

La detección de la malaria por el sistema de vigilancia activa, se realizó a

través del Nested PCR (Fig. 1). Durante la primera evaluación se detectaron: 86%

(191/222) de casos con infección por P. vivax; 0,9% (2/222) de casos con

infección por P. falciparum, 9,5% (21/222) de casos con infección mixta y 3,6%

(8/222) fueron negativos. Durante la segunda evaluación, considerando los casos

con infección primaria por P. vivax, se detectaron recurrencias de la infección por

este parásito en 81% (180/222) de los casos, por P. falciparum 1,8% (4/222), por

infecciones mixtas 2,7% (6/222) y no hubo recurrencias 0,45% (1/222). También

durante la segunda evaluación se detectaron infecciones por P. vivax, en 0,9%

(2/222), 7,2% (16/222) y 2,7% (6/222) de casos, que durante la primera evaluación

fueron detectados como infecciones por P. falciparum, mixtas y negativas

respectivamente. Además se observó que 2,3% (5/222) de casos permanecieron

como infecciones mixtas y que 0,45% (1/222) de infecciones por P. falciparum así

como 0,45% (1/222) de infecciones mixtas detectados en la segunda evaluación,

anteriormente fueron negativos (Tabla 1 y Fig. 2).

Fig. 1. Diagnóstico de la malaria por Nested PCR. Detección de P. vivax, P. falciparum e

infecciones mixtas durante la vigilancia activa. M: marcador 100 pb., P1-P18: pacientes

diagnosticados (P11 con infección mixta, P17 con P. falciparum y P18 negativo), C+: control

positivo.

El diagnóstico por Nested PCR mostró una mayor sensibilidad en

comparación con la microscopía, realizada previamente, a través del método de

gota gruesa (GG). En la primera evaluación, la sensibilidad del Nested PCR fue de

un 99% frente a un 91,6% de la microscopía, en este grupo, solo 24 muestras

fueron diagnosticas como negativas por microscopía, de las cuales 18 fueron

positivas y 6 negativas por Nested PCR, así mismo solo 2 muestras que fueron

positivas por microscopía fueron negativos por Nested PCR, las cuales tuvieron un

conteo menor a 40 parásitos/μl en 50 campos observados y una densidad < 100

parásitos/μl. En la segunda evaluación, la sensibilidad del Nested PCR fue del

100% frente a 87,8% de la microscopía, en este grupo, de 28 muestras negativas

por microscopía, 27 fueron positivos y solo 1 negativa por Nested PCR (Tabla 2).

Tabla 1. Detección de la malaria mediante Nested PCR. Rango de frecuencias de P. vivax, P.

falciparum, infecciones mixtas y casos negativos, durante la vigilancia activa.

PRIMERA EVALUACIÓN

SEGUNDA EVALUACIÓN

INFECCIÓN P. vivax P. falciparum Mixtas Negativos

P. vivax 86,0%

(191/222)

81%

(180/222)

1,8%

(4/222)

2,7%

(6/222)

0,45%

(1/222)

P.

falciparum

0,9%

(2/222)

0,9%

(2/222)

0%

-----

0%

-----

0%

-----

Mixtas 9,5%

(21/222)

7,2%

(16/222)

0%

-----

2,3%

(5/222)

0%

-----

Negativas 3,6%

(8/222)

2,7%

(6/222)

0,45%

(1/222)

0,45%

(1/222)

0%

-----

Fig. 2. Detección de la malaria mediante Nested PCR. Frecuencias de infección primaria y

recurrente, en individuos asintomáticos provenientes de Mazán-Iquitos.

Tabla 2. Comparación de la detección de la malaria por microscopía y Nested PCR. Número

de casos positivos y negativos diagnosticados en individuos supuestamente sanos.

CONDICIÓN DIAGNÓSTICA

PRIMERA EVALUACIÓN

(n=222)

SEGUNDA EVALUACIÓN

(n=222)

G (+) y PCR (+) 196 194

GG (+) y PCR (-) 2 0

GG (-) y PCR (+) 18 27

GG (-) y PCR (-) 6 1

*Sensibilidad Nested PCR: 99% y 100%; Microscopía (GG): 91.6% y 87.8%

6.2. VARIABILIDAD POLIMÓRFICA DEL GEN pvmsp3-α

La genotipificación de P. vivax se realizó en todos los individuos con

infección recurrente por este parásito, correspondientes al 81% (180/222) de la

población muestreada. Mediante el Nested PCR se identificaron 2 secuencias

alélicas diferentes, el A (1,900 pb) y el B (1500 pb) (Fig. 3). En la primera

evaluación 95,5% (172/180) de las infecciones, presentaron el alelo A, mientras

que 4,5% (8/180) presentaron el alelo B. En la segunda evaluación 92,2%

(166/180) de las infecciones, presentaron nuevamente el alelo A y 1,7% (3/180)

nuevamente el alelo B. Además 2,8% (5/180) con el alelo A y 3,3% (6/180) con el

alelo B fueron identificados en la primera evaluación como alelos B y A

respectivamente (Tabla 3).

Fig. 3. Genotipificación de P. vivax mediante Nested PCR (pvmsp3-α). M: Marcador de 1 kb.,

A1-A3: muestras con el alelo A, B1-B3: muestras con el alelo B.

Mediante la digestión enzimática utilizando Hha I, en el alelo A, se

identificaron 9 haplotipos monoclonales (PH1 a PH9) y 3 haplotipos policlonales

(PH11 a PH13), con esta misma enzima, en el alelo B, se identificó 1 haplotipo

monoclonal (PH10) (Fig. 4A). Todos los haplotipos presentaron fragmentos

polimórficos entre 200-1000 bp. (Tabla 4). Utilizando Alu I, en el alelo A, se

identificaron 6 haplotipos monoclonales (PA1-PA6) y 1 haplotipo policlonal (PA8),

con esta misma enzima, en el alelo B, se identificó 1 haplotipo monoclonal (PA7)

(Fig. 4B). En este caso todos los haplotipos presentaron fragmentos polimórficos

entre 150-550 bp. (Tabla 4).

Tabla 3. Genotipificación de P. vivax en individuos con infección recurrente. Rango de

frecuencias del alelo A (1900 pb) y alelo B (1500 pb).

PRIMERA

EVALUACIÓN

SEGUNDA

EVALUACIÓN

ALELOS A B

A 95,5% (172/180)

92,2%

(166/180)

3,3% (6/180)

B 4,5% (8/180)

2,8%

(5/180)

1,7% (3/180)

Con la combinación de ambas enzimas se logró identificar una mayor

variabilidad genética, con 14 haplotipos monoclonales (PAH1-PAH14) y 7

haplotipos policlonales (PHA15-PHA21) (Tabla 4). Analizando la recurrencia de

estos haplotipos, se identificó a PHA13, PHA2 y PHA6 como los más recurrentes

con 5,5%, 7,2% y 12,2%, respectivamente. Por otra parte los haplotipos PHA8,

PHA10, PHA17 y PHA 19 no fueron identificados en la primera evaluación, por lo

tanto no se pudo evaluar las recurrencias en estos haplotipos. Del mismo modo,

fue posible identificar la frecuencia de haplotipos no recurrentes y policlonales

(presentes como haplotipos diferentes en la segunda evaluación) (Fig. 5).

En el análisis estadístico, el 5,6% (10/180) de los individuos en la primera

evaluación y 3,9% (7/180) en la segunda evaluación, presentaron un COI>1,

correspondientes a infecciones por haplotipos policlonales o infecciones mixtas.

Los valores PLD fueron He=0,88 y 0,87 en ambos periodos de evaluación,

demostrando una alta variabilidad genética. Además la prueba F (α=0,05; Fp<Ft),

indicó que no existe diferencias reales entre las frecuencias de haplotipos

identificados, en ambos periodos de evaluación (Tabla 5).

A. PATRONES ENZIMÁTICOS CON Hha I

B. PATRONES ENZIMÁTICOS CON Alu I

Fig. 4. Genotipificación de P. vivax mediante digestión enzimática. M: Marcador de 100 pb. A.

Haplotipos identificados con la enzima Hha I, B. Haplotipos identificados con la enzima Alu I.

Tabla 4. Tamaño de los fragmentos de digestión enzimática con Hha I y Alu I.

(.) Patrón en el alelo A, (:) Patrón en el alelo B, (*) Patrones policlonales

Fig. 5. Análisis de la recurrencia de haplotipos durante la segunda evaluación. Haplotipos

identificados con la combinación de Hha I + Alu I. Prueba F (α=0,05): no existe diferencias reales

entre las frecuencias de haplotipos identificados en la primera y segunda evaluación; F prueba < F

tabla.

Tabla 5. Evaluación de la variabilidad genética de pvmsp3-α, COI: Complejidad de la infección,

PLD: Nivel de la Diversidad poblacional, He: Heterocigosidad esperada, F: Prueba de Fisher.

6.3. PATRONES DE RECURRENCIA

La variabilidad genética permitió identificar recurrencias por haplotipos

monoclonales idénticos (relapsos) a la infección primaria en 41,7% (75/180) y por

haplotipos monoclonales diferentes (reinfecciones) en 48,9% (88/180) de los

casos. Las infecciones con el haplotipo PHA6 tuvieron la mayor frecuencia de

recurrencias por el mismo haplotipo con 12,2% y las infecciones con PHA5 y

PHA7 tuvieron las menores recurrencias por el mismo haplotipo, ambos con 0,6%

(1/180), además la infección con PHA5 presentó recurrencia solo por el mismo

haplotipo. Por otra parte las infecciones con el haplotipo PHA4 tuvieron la mayor

frecuencia de recurrencias, pero por haplotipos diferentes, con 8,4% (15/180) y las

infecciones con PHA 11 tuvieron recurrencias de 1,1% (2/180) tanto por el mismo

haplotipo como por haplotipos diferentes. También las infecciones con el haplotipo

PHA12 presentaron únicamente recurrencias por haplotipos diferentes (Tabla 6 y

Fig. 6).

EVALUACIÓN DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA DE pvmsp3-α

PRIMERA EVALUACIÓN

SEGUNDA EVALUACIÓN

ENZIMAS Hha I + Alu I Hha I + Alu I

N° HAPLOTIPOS

21 21

COI>1 5,6% 3,9%

PLD (He) 0,88 0,87

Fisher (F)

Fp < Ft ; α=0,05 (0,0023 < 4,22)

Tabla 6. Patrones de recurrencia en individuos infectados con P. vivax. Frecuencia de

recurrencias por haplotipos monoclonales idénticos (relapsos) y diferentes (reinfecciones).

PATRONES DE RECURRENCIA

HAPLOTIPOS

MONOCLONALES

RELAPSOS REINFECCIONES

PHA1 2,2% (4/180) 4,4% (8/180)

PHA2 7,2% (13/180) 5,6% (10/180)

PHA3 3,9% (7/180) 3,3% (6/180)

PHA4 4,4% (8/180) 8,4% (15/180)

PHA5 0,6% (1/180) -----

PHA6 12,2% (22/180) 6,1% (11/180)

PHA7 0,6% (1/180) 2,2% (4/180)

PHA9 2,2% (4/180) 2,8% (5/180)

PHA11 1,1% (2/180) 1,1% (2/180)

PHA12 ----- 4,4% (8/180)

PHA13 5,6% (10/180) 7,8% (14/180)

PHA14 1,7% (3/180) 2,8% (5/180)

TOTAL 41,7% 48,9%

Fig. 6. Frecuencia de haplotipos monoclonales causantes de reinfección y relapso

En la distribución de las recurrencias según el rango de tiempo, entre 0 a 90

días, se observa 20% (36/180) de recurrencias por haplotipos idénticos o relapsos

por hipnozoitos homólogos y 11,7% (21/180) de recurrencias por haplotipos

diferentes que pueden ser consideradas como reinfecciones o relapsos por

hipnozoitos heterólogos. Las recurrencias por haplotipos idénticos muestran una

disminución de 13,9% (25/180) a 5,6% (10/180) y 2,2% entre 180, 270 y 365 días

post-primera evaluación, respectivamente, siendo consideradas como relapsos por

hipnozoitos homólogos o reinfecciones con parásitos genéticamente idénticos.

Por otra parte las recurrencias por haplotipos diferentes o reinfecciones

incrementan mientras mayor sea el rango de tiempo de 10,5% (19/180) a 11,7%

(21/180) y 15% (27/180) en los mismos periodos de tiempo. (Tabla 7 y Fig. 7). El

análisis de X2 mostró una relación altamente significativa (X2=24,9; p<0,01; 99%

de confiabilidad) entre las recurrencias por haplotipos idénticos o diferentes y el

rango de tiempo post-primera evaluación.

Tabla 7. Análisis de los patrones de recurrencia según el rango de tiempo, de 0 a 365 días

post- primera evaluación.

PATRONES DE RECURRENCIA SEGÚN RANGO DE

TIEMPO

DÍAS POST-

1°EVALUACIÓN

0-90

90-180

180-270

270-365

RELAPSO

20,0%

(36/180)

13,9%

(25/180)

5,6%

(10/180)

2,2%

(4/180)

REINFECCIÓN

11,7%

(21/180)

10,5%

(19/180)

11,7%

(21/180)

15,0%

(27/180)

Fig. 7. Patrones de recurrencia según el rango de tiempo. Chi-cuadrado (X2)=24.9 p<0.01;

99% de confiabilidad, con una relación altamente significativa entre la variabilidad genética y el

rango de tiempo en que se presentaron las recurrencias.

6.4. MECANISMOS DE RESISTENCIA

Se realizó la PCR convencional para la amplificación del fragmento de 800

pb del gen pvmdr1. El número de muestras obtenidas al azar, amplificadas y

sometidas al análisis de secuenciamiento, fue de 50. Estas muestras fueron

divididas en 2 grupos de 25, provenientes de individuos con relapso y con

reinfección, identificadas en diferentes días post-primera evaluación. El análisis de

las secuencias nucleotídicas se realizó mediante el programa Clustal W, tomando

como referencia a la cepa Sal1 (Salvador).

En este análisis se identificaron alelos wild-type en el 64% (32/50) de

muestras, 15 con relapso y 17 con reinfección, también se identificaron alelos

mutantes con 1 SNPs sinónimo y 1 o 2 SNPs no sinónimos en el 36% (18/50) de

muestras, 10 con relapso y 8 con reinfección. En total fueron identificados 5 SNPs;

en las posiciones de los codones 958 (ATG/ACG), 976 (TAC/TTC), 1022

(CTA/TTA), 1076 (TTT/CTT) y 1125(GAA/AAA). (Fig. 8).

Las secuencias nucleotídicas fueron sometidas al proceso de transducción

in sílico mediante el software Translate a DNA Sequence, el cual permitió

identificar el cambio de aminoácidos en la proteína MDR1. Mediante este proceso

fueron identificados 4 mutaciones no sinónimas o cambio de aminoácidos en los

codones M958T, Y976F, F1076L y E1125K (Fig. 9) y 1 mutación sinónima, el cual

no originó cambio de aminoácidos, en el codón L1022L.

En el grupo de muestras de individuos con relapso, 12% (3/25) presentaron

SNPs únicos sinónimos en el codón L1022L. Así mismo 12% (3/25) presentaron

SNPs únicos no sinónimos en el codón M958T y 16% (4/25) presentaron SNPs

dobles no sinónimos en el codón Y976F y F1076L, estos últimos están reportados

como posibles marcadores de resistencia a cloroquina por P. vivax (Fig. 10A). En

el grupo de individuos con reinfección, 8% (2/25) presentaron SNPs únicos

sinónimos en el codón L1022L, 24% (6/25) presentaron SNPs únicos no

sinónimos, 4 en el codón M958T y 2 en el codón E1125K, los cuales no están

relacionados con mecanismos de resistencia. (Fig. 10B). Mediante el análisis

estadístico se encontró una relación significativa entre la presencia de SNPs que

originan mutaciones no sinónimas y la ocurrencia de relapsos con X2=3.84;

p<0.05, correspondiente al 95% de confiabilidad.

T/C (ATG/ACG) CODON 958

CEPASALI GTCATTTTTACTCACTTTATAGTGCTCTTCCTTGTGAGTATGGTCATGTCATTTTATTTC

SAMPLE-9MH GTCATTTTTACTCACTTTATAGTGCTCTTCCTTGTGAGTACGGTCATGTCATTTTATTTC



SAMPLE-3DH GTCATTTTTACTCACTTTATAGTGCTCTTCCTTGTGAGTACGGTCATGTCATTTTATTTC




**************************************** *******************

A/T (TAC/TTC) CODON 976

CEPASALI TGCCCTATCGTGGCGGCTGTACTGACCGGAACGTACTTCATTTTTATGAGAGTGTTTGCC

SAMPLE-1MH TGCCCTATCGTGGCGGCTGTACTGACCGGAACGTTCTTCATTTTTATGAGAGTGTTTGCC




********************************** ************************

C/T (CTA/TTA) CODON 1022

CEPASALI ACAGCATTTGTCTACAACAGTGATGATGAAATATTTAAAGACCCAAGTTTCCTAATTCAG

SAMPLE-6MH ACAGCATTTGTCTACAACAGTGATGATGAAATATTTAAAGACCCAAGTTTCTTAATTCAG







SAMPLE-4DH ACAGCATTTGTCTACAACAGTGATGATGAAATATTTAAAGACCCAAGTTTCTTAATTCAG

SAMPLE-5DH ACAGCATTTGTCTACAACAGTGATGATGAAATATTTAAAGACCCAAGTTTCTTAATTCAG

*************************************************** ********

T/C (TTT/CTT) CODON 1076

CEPASALI TCGATGCTCTGGGGGTTCAGTCAGAGTGCCCAATTTTTCATTAACAGTTTTGCCTACTGG

SAMPLE-1MH TCGATGCTCTGGGGGTTCAGTCAGAGTGCCCAACTTTTCATTAACAGTTTTGCCTACTGG




********************************* **************************

G/A (GAA/AAA) CODON 1125

CEPASAL-I GAAAATGCAAAGCTGTCCTTCGAAAGGTACTACCCACTGATCACGAGGAAGTCCCTCATC

SAMPLE-2DH AAAAATGCAAAGCTGTCCTTCGAAAGGTACTACCCACTGATCACGAGGAAGTCCCTCATC

SAMPLE-21DH AAAAATGCAAAGCTGTCCTTCGAAAGGTACTACCCACTGATCACGAGGAAGTCCCTCATC

***********************************************************

Fig. 8. SNPs en los codones del gen pvmdr1. Hi: Haplotipo idéntico, Hd: Haplotipo diferente.

Análisis de las secuencias nucleotídicas presentando 5 SNPs, en posiciones 958, 976, 1076 1022

y 1125.

MUTACIÓN M958T

CEPASAL-I VIFTHFIVLFLVSMVMSFYFCPIVAAVLTGTYFIFMRVFAIRARIAANKDVEKKRVNQPG

SAMPLE-9MH VIFTHFIVLFLVSTVMSFYFCPIVAAVLTGTYFIFMRVFAIRARIAANKDVEKKRVNQPG



SAMPLE-3DH VIFTHFIVLFLVSTVMSFYFCPIVAAVLTGTYFIFMRVFAIRARIAANKDVEKKRVNQPG




************* **********************************************

MUTACIÓN Y976F

CEPASAL-I VIFTHFIVLFLVSMVMSFYFCPIVAAVLTGTYFIFMRVFAIRARIAANKDVEKKRVNQPG

SAMPLE-1MH VIFTHFIVLFLVSMVMSFYFCPIVAAVLTGTFFIFMRVFAIRARIAANKDVEKKRVNQPG




*******************************:****************************

MUTACIÓN F1076L

CEPASAL-I SMLWGFSQSAQFFINSFAYWFGSFLIRRGTIQVDDFMKSLFTFLFTGSYAGKLMSLKGDS

SAMPLE-1MH SMLWGFSQSAQLFINSFAYWFGSFLIRRGTIQVDDFMKSLFTFLFTGSYAGKLMSLKGDS




***********:************************************************

MUTACIÓN E1125K

CEPASAL-I ENAKLSFERYYPLITRKSLIDVRDNGGIKIKNSNDIKG

SAMPLE-2DH KNAKLSFERYYPLITRKSLIDVRDNGGIKIKNSNDIKG

SAMPLE-21DH KNAKLSFERYYPLITRKSLIDVRDNGGIKIKNSNDIKG

:*************************************

Fig. 9. Mutaciones no sinónimas en las secuencias aminoacídicas de la proteína MDR1. Hi:

Haplotipo idéntico, Hd: Haplotipo diferente. Análisis de las mutaciones no sinónimas (marcadas en

azul) originando el cambio de aminoácidos M/T en el codón 958, Y/F en el codón 976, F/L en el

codón 1076 y E/K en el codón 1125.

A. SNPs Y976F, SNPs F1076L B. SNPs E1125K

SNPs M958T SNPs M958T

Wild-type Wild-type

Fig. 10. Distribución de SNPs codificando mutaciones sinónimas y no sinónimas

(Cladograma). A. Distancias filogenéticas en casos con relapso, B. Distancias filogenéticas en

casos con reinfección.

Mediante el análisis in sílico, con el software U-Melt, se identificaron las

temperaturas de fusión en alta resolución (HRM), distinguiendo claramente los

SNPs en alelos mutantes así como los alelos wild-type en los codones 976 y 1076

del gen pvmdr1. Se analizaron fragmentos pequeños de hasta 100 pb

correspondientes a regiones con las mutaciones no sinónimas relacionadas con

resistencia. Se encontraron diferencias en los picos de las temperaturas de fusión

de ambos alelos Y976F y L1076F de hasta 0,5°C. El análisis mostró una

temperatura de 85,6°C para el alelo wild-type Y976 y 85,1°C para el alelo mutante

F976 (Fig. 11A). También se observó una temperatura de 83,5°C para el alelo wil-

type L1076 y 84°C para el alelo mutante F1076. (Fig.11B).

ANÁLISIS U-MELT

A.

B.

Fig. 11. U-Melt de secuencias nucleotídicas del gen pvmdr1. Análisis HRM de las temperaturas

de fusión A. Curvas de melting en la mutación Y976F y B. Curvas de melting en la mutación

F1076L.

El número de copias del gen pvmdr1 fue exitosamente medido en el 100%

(50/50) de las muestras, sometidas previamente al análisis de secuenciamiento.

La amplificación de la muestra de referencia, en este caso el plásmido (calibrador)

diluido, conteniendo hasta 1 copia de los fragmentos pvald1 y pvmdr1, mostraron

un Ct de 29,2 y 29,4 respectivamente, en 40 ciclos de amplificación (Fig. 12A). La

diferencia entre ambos genes se pudo establecer mediante los picos de las

temperaturas de fusión. Se observó una temperatura de 79,3 +/- 0,2°C para el

gen pvald1 y una temperatura de 77,9 +/- 0,2°C para el gen pvmdr1 (Fig. 12B).

A.

B.

Fig. 12. Amplificación mediante qPCR Real time- SYBR Green I (Cuantificación Relativa). A.

Análisis de ∆Ct (ciclo de amplificación comparativa) entre pvald1 (gen endógeno) y pvmdr1 (gen

problema). M1-M5: Muestras de individuos con recurrencia. Plásmido 1 copia: Muestra de

referencia, B. Curvas de melting en los genes pvald1 (78,1°C) y pvmdr1 (79,4°C).

El número de copias del gen pvmdr1 se determinó mediante el sistema de

∆∆Ct comparativo, utilizando el gen de copia única pvald1 como gen endógeno

(normalizador). De esta manera en el grupo de muestras de individuos con

relapso, 8% (2/25) presentaron un ligero incremento en el número de copias con

1,1 y 1,2 copias, la media fue de 0,84 +/- 0,16 copias/gen (Fig. 13A). En el grupo

de individuos con reinfección, ninguno mostró un incremento en el número de

copias, con una media de 0,81 +/- 0,11 copias/gen (Fig. 13B).

A.

B.

Fig. 13. Número de copias del gen pvmdr1 de P. vivax. A. RQ en los casos con haplotipos

idénticos, B. RQ en los casos con Haplotipos diferentes. Plásmido (calibrador): 1 copia de pvmdr1

y pvald1. RQ: Cuantificación relativa

VII. DISCUSIÓN

7.1. DETECCIÓN DE LA MALARIA DURANTE LA VIGILANCIA

ACTIVA

Estudios realizados por Mayxay et al., 2001, mencionan que en muchas

regiones endémicas existen problemas y limitaciones, asociadas con la

dependencia al diagnóstico microscópico, para la detección de casos activos y

pasivos de la malaria. Por su parte Siripoon et al., 2002, indican que en el caso de

individuos sintomáticos con relativa alta parasitemia (>500 parásitos asexuales/μl)

el diagnóstico por microscopía puede ser agudo y usado para iniciar un apropiado

tratamiento, sin embargo la agudeza de este método puede disminuir

significativamente en los casos de individuos con bajos niveles de parasitemia,

como en aquellos individuos asintomáticos donde los rangos de parasitemia son a

menudo muy bajos. Una solución a este problema es el uso de técnicas

novedosas como la PCR, planteado por Singh et al., 1999, la cual ofrece alta

sensibilidad y especificidad para la detección del DNA genómico de Plasmodium,

además es efectiva para la determinación de infecciones mixtas. Barker et al.,

1992 y Snounou et al., 1993 indicaron que la PCR fue más sensible y específico

que la examinación microscópica por gota gruesa y frotis sanguíneo,

particularmente en casos con baja parasitemia o infecciones mixtas.Por su parte

Andrade et al., 2010 usaron una variante, el Nested PCR, para el diagnóstico de

Plasmodium, el cual fue utilizado como prueba estándar en diversos estudios.

En Mazán-Iquitos, el uso del Nested PCR para el diagnóstico de

Plasmodium presentó una alta capacidad de discriminación entre las especies,

identificación de infecciones mixtas, además de una alta sensibilidad comparada

con la microscopía. Se detectó tan solo 0,9% (2/222) de muestras negativas para

el Nested PCR y positivas por microscopía, lo cual está relacionado con las bajas

densidades observadas, < 50 parásitos/μl. Estos resultados también son

observados por Scopel et al., 2004 quienes determinaron que el uso de DNA

extraído a partir del frotis sanguíneo presentó una pobre detección de malaria,

particularmente con densidades menores a 20 parásitos/μl.

Los hallazgos en este estudio mostraron individuos asintomáticos con altas

frecuencias de infecciones por P. vivax y bajas por P. falciparum, condiciones

similares a las reportadas en Venezuela por Rodulfo et al., 2007, quienes

indicaron infecciones asintomáticas de 34,8% para P. vivax y 15,2% para P.

falciparum. Otros estudios como de Orjuela et al., 2009 en la amazonía brasileña,

indicaron bajos índices de transmisión tanto en P. vivax como en P. falciparum,

con un alto número de individuos asintomáticos no detectados. Esto es

corroborado por Sojo et al., 2008 y Sutton et al., 2009, por estudios realizados en

la amazonia peruana.

Generalmente los estudios epidemiológicos no consideran las altas

frecuencias de infecciones asintomáticas, por lo que es necesario el empleo de

métodos de vigilancia activa para la detección de las especies de Plasmodium.

Este el principal problema en muchas regiones endémicas del mundo, debido

principalmente a que los individuos desarrollan un incremento de la inmunidad y

resistencia a la enfermedad, después de repetidas infecciones, lo cual minimiza la

intensidad de los síntomas, manteniendo bajos niveles parasitemia por largos

períodos de tiempo. Este hecho es epidemiológicamente importante ya que los

portadores asintomáticos son un reservorio frecuente de la infección. Al respecto,

en Cali-Colombia, Echeverri et al., 2011 reportaron un caso de malaria transmitida

por transfusión a un recién nacido prematuro, por la sangre infectada de un

donante asintomático. La prueba de la gota gruesa confirmó la enfermedad por

Plasmodium vivax en el recién nacido y la muestra del donante se sometió a PCR

y fue positiva para la misma especie.

7.2. VARIABILIDAD POLIMÓRFICA DEL GEN pvmsp3-α

La genotipificación realizada en las muestras de Mazán, se basó en el

polimorfismo del gen pvmsp3-α, varios estudios como los efectuados en Guyana

Francesa por Verón et al., 2009, en Perú por Ayala et al., 2005, en Colombia por

Cristiano et al., 2008 y en Brasil por Ribeiro et al., 2011, también utilizaron este

gen como marcador genético para evaluar la diversidad poblacional de P. vivax.

La genotipificación mediante el Nested-PCR permitió detectar 2 secuencias

alélicas diferentes, de 1900 pb (Alelo A) y de 1500 pb (Alelo B). Adicionalmente,

investigaciones realizadas por Bruce et al., 1999 en Papúa Nueva Guinea y Cui et

al., 2003 en Tailandia, reportaron un tercer alelo de 1100 pb (Alelo C), incluso

investigaciones realizadas por Prajapati et al., 2010 en la India (Chennai),

mencionaron a un cuarto alelo de 500 pb (Alelo D). En este estudio, los resultados

de las frecuencias para estos alelos (A y B) son concordantes con los reportados

por Bruce et al., 1999, quienes indicaron un 70,5% y 6,7% y por Cui et al., 2003,

quienes indicaron un 74,8% y 6,5%, respectivamente. Sin embargo en regiones

como Venezuela Ord et al., 2005, indicaron 9,3% para el alelo A y 21,9% para el

alelo B. Incluso contrastando con la mayoría de investigaciones de esta parte del

mundo, un estudio realizado en el Sur de Irán por Zakeri et al., 2006 mencionaron

al alelo C como el más prevalente. Estos resultados nos muestran un predominio

de determinado tipo alélico, por una determinada región, aunque con una escaza

variabilidad genética de P. vivax, considerando al alelo A como el más prevalente

en muchas regiones endémicas.

Mediante la utilización de técnicas de genotipificación combinadas como la

PCR–RFLP, se observó una mayor variabilidad genética en P. vivax. Se

identificaron 10 haplotipos monoclonales con la enzima Hha I y 7 con Alu I, de los

cuales 6 con Hha I y 3 con Alu I, también fueron encontrados por Prajapati et al.,

2011 en la India, por Cui et al., 2003 en Tailandia y por Zakeri et al., 2006 en Irán y

al menos 3 fueron encontradas por Bruce et al., 1999 en Papúa Nueva Guinea;

sugiriendo que algunas de estas variantes alélicas tienen una distribución global.

Por otra parte también se pudo observar modificaciones en los patrones

enzimáticos del alelo B, identificado por Ribeiro et al., 2011 en Brasil, el cual

presentó diferentes tamaños de fragmentos digeridos comparados con los

encontrados en este estudio. Al igual que en otros estudios también se

identificaron haplotipos policlonales, los cuales representan el 9,5% (5,6% en la

primera evaluación y 3,9% en la segunda evaluación) de los casos,

contrariamente, Ribeiro et al., 2011 indicaron 14% de infecciones policlonales

analizadas solo con la enzima Hha I, por su parte Bruce et al., 1999 y Cui et al.,

2003 también encontraron un mayor número de infecciones policlonales o mixtas.

La variabilidad genética mostrada por P. vivax indica que la diversidad de

este parásito es mantenida por una selección positiva, sin embargo puede haber

otras razones incluyendo algunas de las propiedades biológicas del parásito tales

como su habilidad para ocasionar relapsos, interacción con poblaciones de P.

falciparum co-circulantes o por la migración de personas infectadas desde una

región a otra. Esta posibilidad es de especial atención porque durante los últimos

años, parte de la población rural de la selva peruana ha sido sujeta a constante y

continuo desplazamiento. En este estudio la variabilidad genética fue evaluada

determinando los niveles de significancia de la diversidad poblacional (PLD) en

base a la heterocigosidad esperada (He) y la complejidad de la infección (COI).

Los datos encontrados coinciden con el estudio efectuado por Sutton et al., 2009,

en la amazonía peruana, en donde mencionaron un PLD cercano a la unidad

(He=0,845), pero un 23,6% de infecciones policlonales (COI>1), siendo mayores a

los porcentajes encontrados en este estudio.

7.3. PATRONES DE RECURRENCIA

En este estudio se encontró 81% de recurrencias por P. vivax en un periodo

de 365 días post-primera evaluación, por su parte Orjuela et al., 2009b, reportaron

rangos de recurrencia entre 26% a 40% dentro de 180 días post-tratamiento.

Mediante métodos de genotipificación, Chen et al., 2007 asociaron un solo tipo

alélico al 99 % de las recurrencias y 71% a tipos alélicos similares, en 2 episodios,

con un intervalo de tiempo entre 29 y 343 días, lo cual es concordante con el

periodo de tiempo que se utilizó para evaluar las recurrencias en este estudio,

identificándose 41,7% de recurrencias por haplotipos idénticos o relapsos y 48,9%

de recurrencias por haplotipos diferentes o reinfecciones. Otros estudios como el

de Hanf et al., 2009 en Guyana Francesa, utilizaron rangos de tiempo e indicaron

que el incremento de los relapsos se produjo en los primeros 3 meses después del

episodio inicial, posterior a esto, la mayoría de ataques secundarios fueron

producto de reinfecciones. En regiones endémicas más próximas, como Colombia,

estudios realizados por Álvarez et al., 2006 también indicaron que el tiempo en

que se presentan las recurrencias (relapsos), en pacientes sometidos a diferentes

esquemas de tratamiento, fluctúan entre 53 a 129 días después del episodio

inicial. Estos reportes fueron concordantes con los relapsos que muestra una cepa

tropical y al igual que en este estudio, la mayor frecuencia de recurrencias por

haplotipos idénticos o relapsos se produjeron durante los primeros 3 meses

después de la infección primaria, posterior a este periodo se incrementaron las

frecuencias de recurrencias por haplotipos diferentes o reinfecciones.

Las recurrencias por reinfecciones son comunes en regiones endémicas ya

que los individuos permanecen en la misma zona todo el tiempo y es más

probable que pueden adquirir rápidamente una nueva infección, sin embargo estas

deducciones deben interpretarse con cuidado ya que estos individuos también

pueden tener un relapso causado por activación de hipnozoitos heterólogos. Al

respecto Imwong et al., 2007 reportaron infecciones recurrentes, por parásitos no

relacionados con la infección primaria, en 78% de individuos provenientes de

Tailandia y 63% en India, en estos casos la reactivación de hipnozoitos

heterólogos podría ser la principal causa de las recurrencias. Concordante con

estos datos, la OMS en el 2006 informó frecuencias bajas de relapsos que varían

desde 11% en la India hasta 51% en Afganistán, con valores intermedios de 30%

en Indonesia.

En este estudio, las altas frecuencias de reinfecciones y relapsos pueden

ser relacionados con un posible incremento de la inmunidad adquirida y por

consiguiente la resistencia a las complicaciones de la enfermedad e incremento en

el número de portadores asintomáticos. Esta forma de la malaria fue identificada

por Loyola, 1991 quien mencionó, que en regiones endémicas, tras prolongados

periodos de infección, las personas adquieren un alto grado de inmunidad y la

malaria asintomática es frecuente. Además Branch et al., 2005 señalan que

durante las recurrencias la respuesta inmune es más rápida y amplificada.

Finalmente, al igual que Alyson et al., 1996 concordamos que el manejo y

control de P. vivax es complicado por su habilidad de causar relapsos y por las

continuas reinfecciones en zonas endémicas, por lo cual es necesario una

detección e identificación oportuna del tipo de infección malárica.

7.4. MECANISMOS DE RESISTENCIA

Reportes como el de Baird et al., 1991; Phillips et al., 1996 y Brega et. al.,

2005 relacionaron la CQR con el polimorfismo de nucleótidos únicos o SNPs, en el

gen de resistencia pvmdr1 de P. vivax. En este estudio, por el análisis de

secuenciamiento, se identificó 16% (4/25) de muestras infectadas con un alelo

doble mutante, con mutaciones no sinónimas en los 2 codones Y976F-F1076L

relacionados con resistencia. Estas mutaciones son observadas también por

Suwanarusk et al., 2007 en Indonesia y Tailandia, lugares donde se realizaron

estudios de susceptibilidad a la cloroquina, in vitro. Frecuencias más altas son

reportadas por Brega et. al., 2005, encontrando 26% (6/23) de aislados, 4 desde

Tailandia y 2 desde Indonesia con el alelo Y976F y 61% (14/23) de aislados con el

alelo F1076L, 5 desde Tailandia, 4 de los cuales también tuvieron la mutación en

el codón Y976F, 4 desde Azerbaiyán, 3 desde Turquía y 2 desde Indonesia, los

cuales también tuvieron la mutación en el codón Y976F. Otros estudios como el de

Dua et al., 1996, efectuados en poblaciones que presentan CQR definido como la

India, Papúa Nueva Guinea y Myanmar muestran un incremento de estas

mutaciones, por lo que se podría especular que estos 2 SNPs serían marcadores

moleculares tempranos que indiquen CQR en P. vivax.

Las muestras para el secuenciamiento fueron obtenidas al azar, debido

principalmente a que las mismas no fueron colectadas a través de un seguimiento

estricto para determinar la eficacia o falla del tratamiento, sin embargo todos los

individuos positivos inicialmente a microscopía (primera evaluación), que

representan el 89.1% de la población analizada, fueron sometidos a tratamiento

por 3 días con cloroquina. Al respecto, varios estudios de sensibilidad a este

fármaco, como los efectuados por Trenton et al., 2003 en la región amazónica y en

la costa del pacífico de Perú, recomiendan un seguimiento de 28 días para

determinar la eficacia de cloroquina in vivo.

Otros estudios en Sudamérica como los efectuados en Colombia y Brasil,

por Soto et al., 2001 y Alecrim, 1999 también indican periodos similares de

seguimiento. Incluso estudios efectuados en Madagascar por Barnadas et al.,

2008, indican que los pacientes deben someterse a un régimen de seguimientos

acorde a los lineamientos recomendados por la OMS en el 2001. A pesar de las

limitaciones, en este estudio, cabe resaltar lo mencionado por Brega et al., 2004,

quienes señalan que la identificación de genes potencialmente involucrados en la

resistencia a drogas y sus variaciones moleculares, podrían proveer un esquema

para estudiar la incidencia y propagación de cepas de P. vivax resistentes a

drogas.

Por otra parte un aporte importante de este estudio fue el uso del software

U-Melt, para el análisis in sílico del HRM, el cual permitió establecer diferencias

entre los SNPs de los alelos mutantes con los alelos wild type. Estos datos son

una información útil para poder discriminar fácilmente la presencia de

determinados SNPs que originen mutaciones no sinónimas en la secuencia de

aminoácidos. Ensayos similares utilizando la PCR en Tiempo Real para analizar

HRM fueron implementados por Alonso et al., 2010, la cual permitió diferenciar

fácilmente distintos alelos de un gen, con presencia o ausencia de SNPs en

determinados codones.

En relación a la cuantificación relativa, Brega et al., 2005 indicaron que la

sobreexpresión del gen pvmdr1 de P. vivax ha sido asociada con resistencia a

drogas como cloroquina, estudios similares en P. falciparum como el efectuado

por Ferreira et al., 2006, evaluaron el número de copias del gen pfmdr1 utilizando

como gen endógeno a la Actina, y mostraron un incremento de 3 veces respecto a

la cepa de referencia (cepa 3D7). En este estudio el análisis del número de copias

del gen pvmdr1, utilizando como gen endógeno a la Aldolasa, no mostró ningún

incremento significativo tanto en las muestras de individuos con relapso así como

en los que presentaron reinfección.

La importancia de realizar un diagnóstico preciso reside primeramente en

determinar la especie de Plasmodium que causa la enfermedad, así mismo es

necesario establecer la recurrencia de la infección, a fin de que el paciente reciba

el tratamiento adecuado. Además Bray et al., 2005 mencionaron la importancia de

la variabilidad genética de P. vivax en el flujo de genes como los que confieren

resistencia, Brega et al., 2005 también mencionaron que la resistencia a

cloroquina podría deberse a que la diversidad genética de P. vivax tiende a variar

según el área geográfica, por lo tanto se considera necesario efectuar estudios

similares en diferentes regiones geográficas endémicas para P. vivax.

VIII. CONCLUSIONES

En individuos asintomáticos provenientes de una región endémica como

Mazán, el diagnóstico mediante Nested PCR, a partir de muestras

secuenciales evaluadas durante un año de seguimiento activo, permitió

detectar altas recurrencias de la infección por P. vivax.

La genotipificación, en base al gen pvmsp3-α, utilizando sólo el Nested

PCR no fue suficiente para establecer una clara variabilidad, sin embargo la

posterior digestión de los productos de amplificación, combinando enzimas

como Alu I y Hha I, permitió identificar diversos haplotipos. Los valores de

COI>1 y PLD (He) fueron concordantes con una alta variabilidad genética,

logrando identificarse infecciones mixtas por haplotipos policlonales e

infecciones simples por haplotipos monoclonales.

En individuos con infección recurrente por P. vivax, se identificó que la

recurrencia se debía a una reinfección cuando se observaron haplotipos

diferentes a la infección primaria y a un relapso cuando se observaron

haplotipos idénticos. Además concordante con el comportamiento de cepas

tropicales, los relapsos fueron más frecuentes que las reinfecciones durante

los primeros 90 días después de la infección primaria, posterior a este

periodo las reinfecciones fueron más frecuentes.

Los SNPs dobles mutantes, causantes de mutaciones no sinónimas, en los

codones Y976F y F1076L del gen pvmdr1 de P. vivax, previamente

relacionados con resistencia, fueron identificados solo en 4 individuos con

relapso. Además no se mostró ninguna variación cuantitativa en el gen

pvmdr1, que sea significativa e indique resistencia, tanto en las muestras de

individuos con relapso y con reinfección.

IX. RECOMENDACIONES

En regiones endémicas de baja transmisión de la malaria, se debe tomar en

cuenta la persistencia de infecciones asintomáticas y el incremento de las

recurrencias principalmente debidas a reinfecciones o relapsos.

Para una mejor caracterización de la variabilidad genética de P. vivax, se

requiere analizar un gran número de muestras, así mismo también es

necesario utilizar, en conjunto, otros marcadores genéticos para proveer un

mayor análisis de variabilidad.

Para estudios de evaluación de la variabilidad genética de P. vivax mediante

PCR-RFLP, es necesario utilizar por lo menos 2 enzimas de restricción.

Debido a que infecciones inicialmente clasificadas como simples, basadas en

los resultados de digestión con una sola enzima, posteriormente pueden ser

identificadas como infecciones mixtas con una segunda enzima e incluso la

utilización de una tercera enzima proporcionaría mayor información de la

diversidad genotípica.

Para determinar los patrones de recurrencia, en futuras investigaciones, es

necesario evaluar como mínimo 2 muestras secuenciales por paciente, con

seguimiento terapéutico durante los primeros 28 días hasta 3 meses post-

infección primaria. Se recomienda evaluar los relapsos y las reinfecciones

después de un mes de la infección primaria. La resistencia por el contrario

debe ser evaluada antes de este periodo, por lo general se recomienda

seguimientos a los 0, 7, 14 y 28 días.

En estudios de enfermedades transmisibles como la malaria por P. vivax, no

solo es necesario la utilización de marcadores genéticos de resistencia para

discriminar la falla a tratamiento o relapso desde hipnozoitos homólogos, sino

también aplicar otros procedimientos de inmunoserología, que podrían ayudar

a distinguir entre nuevas infecciones o relapsos.

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XI. ANEXOS

Fig. A1. Mapa de riesgo de malaria por P. vivax, incidencia acumulada por

1000 habitantes, Loreto 2009

Fig. A2 .Mapa de riesgo de malaria del departamento de Loreto 2012

Fig. A3 Ciclo Biológico de Plasmodium vivax

Fig. A4 Fase exo-eritrocítica de Plasmodium vivax

Tabla A1. Rango de frecuencias de los patrones enzimáticos durante la primera y segunda

evaluación

PATRÓN ENZIMÁTICO

PRIMERA EVALUACIÓN

SEGUNDA EVALUACIÓN

Hha I Alu I COMBINACIÓN A B F% A B F%

PH1 PA2 PHA1 12 6.7 9 5

PH2 PA1 PHA2 24 13.3 27 15

PH3 PA6 PHA3 12 6.7 21 11.7

PH4 PA2 PHA4 25 14 21 11.7

PH4 PA3 PHA5 1 0.5 1 0.5

PH5 PA2 PHA6 35 19.4 36 20

PH6 PA3 PHA7 6 3.3 5 2.9

PH6 PA7 PHA8 - - 1 0.5

PH7 PA3 PHA9 9 5 6 3.3

PH8 PA2 PHA10 - - 2 1

PH8 PA7 PHA11 5 2.9 5 2.9

PH9 PA4 PHA12 8 4.4 2 1

PH9 PA5 PHA13 25 14 28 16

PH10 PA7 PHA14 - 8 4.4 - 9 5

PH11 PA2 PHA15 3 1.7 1 0.5

PH11 PA4 PHA16 4 2.2 - -

PH11 PA8 PHA17 - - 2 1

PH11 PA6 PHA18 1 0.5 1 0.5

PH11 PA7 PHA19 - - 1 0.5

PH12 PA1 PHA20 1 0.5 - -

PH13 PA7 PHA21 1 0.5 2 1

Tabla A2. Distribución de los casos recurrentes con haplotipos monoclonales y policlonales

Tabla A3. Mutaciones en el gen de resistencia pvmdr1 de P. vivax presentes en aislados de

la localidad de Mazán-Iquitos.

Aislado-Mazán MUTACIONES NO SINÓNIMAS MUTACIÓN SINÓNIMA

Haplotipo idéntico SNPs M958T SNPs Y976F SNPs F1076L SPNs E1125K SNPs L1022L

DTS 603 M F L E L

DTS 869 M F L E L

DTS 646 M F L E L

DTS 353 M F L E L

DTS 561 T Y F E L

DTS 782 T Y F E L

DTS 149 T Y F E L

DTS 362 M Y F E L

DTS 849 M Y F E L

DTS 310 M Y F E L

DTS 370 M Y F E L

DTS 749 M Y F E L

DTS 191 M Y F E L

DTS 288 M Y F E L

DTS 392 M Y F E L

DTS 888 M Y F E L

DTS 034 M Y F E L

DTS 234 M Y F E L

DTS 786 M Y F E L

DTS 396 M Y F E L

DTS 636 M Y F E L

DTS 771 M Y F E L

DTS 433 M Y F E L

DTS 479 M Y F E L

DTS 832 M Y F E L

Haplotipo diferente SNPs M958T SNPs Y976F SNPs F1076L SPNs E1125K SNPs L1022L

DTS 544 T Y F E L

DTS 699 T Y F E L

DTS 555 T Y F E L

DTS 502 T Y F E L

DTS 826 M Y F K L

DTS 395 M Y F K L

DTS 072 M Y F E L

DTS 140 M Y F E L

DTS 427 M Y F E L

DTS 186 M Y F E L

DTS 803 M Y F E L

DTS 343 M Y F E L

DTS 221 M Y F E L

DTS 099 M Y F E L

DTS 796 M Y F E L

DTS 325 M Y F E L

DTS 125 M Y F E L

DTS 023 M Y F E L

DTS 421 M Y F E L

DTS 485 M Y F E L

DTS 747 M Y F E L

DTS 532 M Y F E L

DTS 689 M Y F E L

DTS 221 M Y F E L

DTS 941 M Y F E L

Tabla A4. Valores de amplificación (Ct) de los fragmentos génicos pvald1 y pvmdr1 para

determinar el número de copias del gen blanco, en las muestras de individuos con relapso.

Sample Name

Target Name

Cт

Tm1

Target Name

Cт

Tm1

RQ

LED

pva

ld1

29.2396 79.30217

pm

dr1

29.4139 77.809624 1

Sample 1 23.9142 79.45104 24.4192 77.962288 0.7951443

Sample 2 15.8389 79.30217 16.1807 77.962288 0.8903434

Sample 3 24.6422 79.30217 25.3199 77.962288 0.7054419

Sample 4 18.6828 79.59991 19.3295 77.962288 0.7207633

Sample 5 31.6353 79.30217 32.9746 77.813416 0.445951

Sample 6 21.4916 79.59991 22.003 77.962288 0.7916367

Sample 7 25.1425 79.45104 25.8859 77.962288 0.6740463

Sample 8 30.3658 79.45104 30.6902 77.962288 0.9011423

Sample 9 23.7606 79.30032 23.61 77.960327 1.2525674

Sample 10 17.2431 79.30032 17.523 77.960327 0.9294083

Sample 11 19.4234 79.5981 19.6166 77.960327 0.9870059

Sample 12 26.286 79.30032 26.3154 77.960327 1.1056682

Sample 13 18.7262 79.30032 19.4946 77.960327 0.6624361

Sample 14 20.9454 79.4492 21.5247 78.109207 0.7552239

Sample 15 23.6405 79.4492 23.9314 77.960327 0.9223161

Sample 16 21.8247 79.44488 22.3638 78.104759 0.7765665

Sample 17 25.2147 79.44488 25.5966 77.955856 0.8659642

Sample 18 26.7417 79.74268 26.9113 78.104759 1.0032589

Sample 19 18.7338 79.44488 19.0024 78.104759 0.9367098

Sample 20 18.141 79.44488 18.4383 78.104759 0.9182803

Sample 21 24.3782 79.44488 24.6677 78.104759 0.9232311

Sample 22 25.3648 79.44488 25.6167 78.104759 0.9476525

Sample 23 28.8975 79.30696 29.7893 77.967361 0.6081348

Sample 24 18.4218 79.44488 18.9024 78.104759 0.8083209

Sample 25 20.7154 79.4492 20.8947 78.109207 0.9965403

Σ 21.323754

Media 0.85

DS 0.16

Tabla A5. Valores de amplificación (Ct) de los fragmentos génicos pvald1 y pvmdr1 para

determinar el número de copias del gen blanco, en las muestras de individuos con

reinfección.

Sample Name

Target Name

Cт

Tm1

Target Name

Cт

Tm1

RQ

LED p

va

ld1

29.2396 79.30217

pm

dr1

29.4139 77.809624 1

Sample 26 19.0215 79.4558 19.4617 78.116211 0.8317019

Sample 27 20.6259 79.4558 21.0054 77.967361 0.8674011

Sample 28 19.9124 79.30696 20.4473 77.967361 0.7788738

Sample 29 22.4272 79.15812 22.5808 77.669678 1.0144331

Sample 30 21.7057 79.4558 22.2015 78.116211 0.8002444

Sample 31 20.3429 79.4558 20.8285 78.116211 0.8059662

Sample 32 23.1732 79.3028 23.731 77.963173 0.7665527

Sample 33 21.4429 79.3028 21.7931 77.963173 0.8852084

Sample 34 22.7865 79.3028 23.3244 77.963173 0.7771879

Sample 35 26.1737 79.3028 27.1666 77.814323 0.5670115

Sample 36 18.9259 79.3028 19.4409 77.963173 0.789659

Sample 37 15.8695 79.45164 16.3852 78.112022 0.7893073

Sample 38 19.3259 79.14927 19.7252 77.809624 0.855553

Sample 39 21.5252 79.14927 22.1813 77.809624 0.7160789

Sample 40 15.8187 79.14927 16.5892 77.958473 0.6614857

Sample 41 25.1425 79.45104 25.8859 77.962288 0.6740463

Sample 42 30.3658 79.45104 30.6902 77.962288 0.9011423

Sample 43 20.9454 79.4492 21.5247 78.109207 0.7552239

Sample 44 23.6405 79.4492 23.9314 77.960327 0.9223161

Sample 45 18.141 79.44488 18.4383 78.104759 0.9182803

Sample 46 19.9124 79.30696 20.4473 77.967361 0.7788738

Sample 47 22.8592 79.15812 22.9808 77.769678 1.0374199

Sample 48 26.1737 79.3028 27.1666 77.814323 0.5670115

Sample 49 19.9769 79.3028 20.4521 77.963173 0.8111272

Sample 50 16.7495 79.45164 16.9752 78.112022 0.9645982

Σ 20.236705

Media 0.81

DS 0.11

Tabla A6. Código Genético, tripletes de nucleótidos codificantes de aminoácidos

Formato A1: Consentimiento Informado de Participación de Adultos

CONSENTIMIENTO INFORMADO DE PARTICIPACIÓN-ADULTOS

Título del Proyecto de Investigación: Genotipificación de Plamodium vivax en la Amazonía Peruana (Reservorios

Humanos para la Transmisión de Malaria por Plasmodium vivax en la amazonía Peruana)

Investigador principal: Dr. Joseph Vinetz. Co-Investigadores: Dr. Raul Chuquiyauri, Dr. Robert H. Gilman, Dra. Margaret Koset, Dra. Maritza Calderón

Propósito del Estudio: Este es un estudio conducido por la Universidad Peruana Cayetano Heredia, la Universidad de California en San Diego y el Instituto de Medicina Tropical “Alexander von Humboldt”; y en colaboración con el Ministerio de Salud a través de la Dirección Regional de Salud de Loreto. El objetivo es conocer los perfiles genéticos del Plasmodium vivax causante de malaria y determinar la forma en que se transmite en las zonas de estudio.

Como usted sabe la malaria es una enfermedad muy frecuente en nuestra Amazonia, con importantes trastornos entre las personas que la padecen. Hay dos especies de parásito que causan malaria en Perú: Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum. Se esta haciendo un gran esfuerzo para luchar contra ella. Estos esfuerzos en el diagnóstico y prevención requieren de la participación directa de las personas como usted.

Usted esta siendo invitado a tomar parte en este estudio porque su gota gruesa es positiva para Plasmodium vivax. Su participación en este estudio depende completamente de usted.

Procedimientos: Si usted acepta participar en el estudio, un trabajador de salud realizará lo siguiente:

Le hará preguntas básicas sobre usted, su trabajo, su casa y su historial médico y síntomas.

Se tomara una muestra de sangre de 10 ml. Exclusiones: Si usted tiene alguna de las siguientes condiciones no podrá participar en este estudio:

Uso de antibióticos al momento o una semana antes de ingresar al estudio.

Estar recibiendo tratamiento antimalárico ahora o en la última semana.

No haber firmado el consentimiento informado.

Tener malaria por Plasmodium falciparum o malaria mixta.

Tener menos de 5 años de edad. Riesgos e Incomodidades: Su participación en el estudio con lleva un riesgo mínimo. La toma de sangre puede ocasionarle cierta incomodidad. Existe un mínimo riesgo de que aparezca un moretón después de la toma de sangre. Nosotros trataremos de mantener este riesgo tan bajo como sea posible. Este procedimiento se realizará con material estéril. Si decide participar, necesitaremos unos minutos para completar todo el proceso.

Beneficios: Tomando parte en este estudio, ayudará a los médicos a conocer más sobre la malaria en nuestra Amazonia. El beneficio también será para su comunidad, ya que los médicos conocerán mejor sobre como se transmite la malaria en su comunidad y se podrán diseñar mejores técnicas de control. Los análisis de la sangre son completamente gratuitos para usted. Un personal de salud le visitara después de iniciado el tratamiento, de esta manera su condición de salud será estrechamente evaluada. Confidencialidad: Protegemos su confidencialidad. Sus respuestas, resultados y otra información que nos provea, tendrán un código en lugar de su nombre. Guardaremos toda la información bajo llave en nuestro laboratorio de la calle Morona 448, Iquitos, y sólo personal del estudio tendrá acceso. La información que lo identifique no será publicada con los resultados. Nosotros nos reservamos el privilegio, de en el futuro, hacer otras pruebas para otros estudios sobre infecciones en las muestras obtenidas pero su nombre no será relacionado con la muestra. Voluntad a participar: La participación es voluntaria. En el caso de que usted decida participar, tiene opción de retirarse en cualquier momento si así lo desea, sin que esto afecte la atención médica que usted recibe. Preguntas acerca de este estudio: Este formato de consentimiento explica el objetivo del estudio. Por favor léalo con mucho cuidado antes de firmarlo. Puede hacer las preguntas que desee sobre lo que no entienda. Si no tiene preguntas ahora, siempre puede hacerlas en el futuro. Durante este estudio, va a ser informado sobre toda nueva información que pueda afectar a su salud. Si tiene alguna pregunta, o si quiere hablar con alguien porque siente que usted ha sido maltratado, o siente que participar en el estudio ha afectado su salud, por favor comuníquese por teléfono con el Dr. Joseph Vinetz (investigador principal, 065-242226) o al Dr. Raúl Chuquiyauri (coordinador, 065-9610846). Si firma abajo significa que desea participar.

Nombre y firma del participante

Loreto, ____ de __________ del 200

Nombre y firma del testigo

Loreto, ____ de __________ del 200

Firma del testigo

Loreto, ____ de __________ del 200

Formato A2: Consentimiento Informado de Participación – Menores

CONSENTIMIENTO INFORMADO DE PARTICIPACIÓN-MENORES

Título del Proyecto de Investigación: Genotipificación de Plamodium vivax en la Amazonía Peruana (Reservorios

Humanos para la Transmisión de Malaria por Plasmodium vivax en la amazonía Peruana)

Investigador principal: Dr. Joseph Vinetz. Co-Investigadores: Dr. Raul Chuquiyauri, Dr. Robert H. Gilman, Dra. Margaret Koset, Dra. Maritza Calderón

Propósito del Estudio: Este es un estudio conducido por la Universidad Peruana Cayetano Heredia, la Universidad de California San Diego y EL Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt; y en colaboración con el Ministerio de Salud a través de la Dirección Regional de Salud de Loreto.

La malaria es una enfermedad muy frecuente en nuestras comunidades, afectando a niños y adultos, con importantes trastornos entre las personas que la padecen. Hay dos especies de parásito que causan malaria en Perú: Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum. Desde hace muchos años numerosas instituciones estamos haciendo un gran esfuerzo para luchar contra ella. Estos esfuerzos en el diagnóstico, cuidado de enfermos y prevención requieren la participación directa de las personas afectadas como usted.

Usted esta siendo invitado a tomar parte en este estudio porque su gota gruesa es positiva para Plasmodium vivax. Su participación en este estudio depende completamente de ustedes.

Procedimientos: Si usted esta de acuerdo que su hijo participe, un trabajador de salud realizará lo siguiente:

Le hará preguntas básicas sobre su casa, historial médico y síntomas de su hijo.

Se le tomara a su hijo una muestra de sangre de 05 ml. Exclusiones: Si su hijo tiene alguna de las siguientes condiciones no podrá participar en este estudio:

Uso de antibióticos al momento o una semana antes de ingresar al estudio.

Estar recibiendo tratamiento antimalárico ahora o en la última semana.

No haber firmado el consentimiento informado.

Tener malaria por Plasmodium falciparum o malaria mixta.

Tener menos de 5 años de edad. Riesgos e Incomodidades: La participación en el estudio conlleva un riesgo mínimo. La toma de sangre puede ocasionarle cierta incomodidad. Existe un mínimo riesgo de que aparezca un moretón después de la toma de sangre. Nosotros trataremos de mantener este riesgo tan bajo como sea posible. El procedimiento se realizará con material estéril. Necesitaremos unos minutos de su tiempo. Beneficios:

Con su participación ayudará a los médicos a conocer más sobre la malaria en nuestra Amazonia. Los análisis de la sangre de su hijo son completamente gratuitos. Un personal de salud le visitará después de iniciado el tratamiento, de esta manera la condición de salud de su hijo será estrechamente evaluada. Confidencialidad: Nosotros protegemos su confidencialidad y la de su hijo dentro de los estándares establecidos. Sus respuestas, resultados de pruebas, y otra información que nos provea, serán identificados con un código en lugar de su nombre. Guardaremos toda la información del estudio bajo llave en nuestras oficinas en la calle Morona 448, y sólo el personal del estudio tendrá acceso a la información, a menos que nos dé su permiso. Su nombre, el de su hijo y otra información que lo identifique no serán publicados. Nosotros nos reservamos el privilegio, de en el futuro, hacer otras pruebas para otros estudios sobre infecciones en las muestras obtenidas pero su nombre o el de su hijo no serán relacionados con la muestra. Voluntad a participar: La participación es voluntaria. En el caso de que usted decida hacer participar a su hijo, tiene la opción de retirarlo del estudio en cualquier momento si así lo desea, sin que esto afecte a la calidad o atención médica que usted o su hijo recibe. Preguntas acerca de este estudio: Este formato de consentimiento explica el objetivo del estudio. Por favor léalo con cuidado antes de firmarlo. Puede hacer preguntas sobre lo que no entienda. Si no tiene preguntas ahora, siempre puede hacerlas en el futuro. Durante el estudio, va a ser informado sobre toda nueva información que pueda afectar la salud de su hijo. Si tiene alguna pregunta, o siente que su hijo ha sido maltratado, o siente que participar en el estudio ha afectado su salud, por favor comuníquese por teléfono con el Dr. Joseph Vinetz (investigador principal – 065-242226) o al Dr. Raúl Chuquiyauri (coordinador – 065-9610846). Si Usted firma abajo significa que desea hacer participar a su hijo.

Nombre y firma del padre o tutor responsable

Iquitos, ____ de __________ del 200

Nombre del niño y fecha de nacimiento

Iquitos, ____ de __________ del 200

Nombre y Firma del testigo

Iquitos, ____ de __________ del 200

Firma y nombre del investigador responsable

Iquitos, ____ de __________ del 200

PATRONES DE RECURRENCIA: VARIABILIDAD … · TRM: Transmembrana μg: Microgramos ... 5.2. ANÁLISIS...

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