Introdução a Virologia Marinha

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microbiologia

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  • UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

    DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

    M.SC PRISCILA SANTANA PEREIRA

    Introduo a Virologia

    Marinha: Caractersticas

    e Importncia Ambiental

  • VRUS NO ERAM

    CONHECIDOS!

    1898

    Vrus foram descobertos

    (filtro de 0,22m,

    porcelana.

    1937

    Criao do Microscpio

    eletrnico

    1915

    Bacterifago (Vaccinia)

    1946

    Primeiro Vrus

    Marinho

    Os vrus no eram considerados seres

    vivos, mas sim biomolculas ou

    partculas proteinadas ( 0,2 m) que no fazem diviso binria, no so

    autnomas e possuem cido nucleico

    (elemento infeccioso).

    Lwoff, 1957 Fonte: Raoult & Forterre, 2008

    A Vida surge de outra vida....

    Koch Organismo vivo pode causar doenas.

  • O que so vrus?

    Vrus = Veneno, latim;

    So nicos na natureza;

    Estrutura celular convertidas em maquinrio (Beijerink);

    Vrus so capazes de se adaptar a mudanas ambientais;

    Viso mais difundida Vrus NO so entidades vivas;

  • Como so constitudos os vrus???

  • ICTV: CIDO NUCLEICO, ESTRUTURA VIRAL, ESTRATGIA

    DE REPLICAO E SEQUENCIA NUCLEOTDICA.

    73 famlias 9 subfamlias

    287 gneros 1950 espcies virais

  • Classificao dos vrus

  • Classificao dos vrus

  • 1940

    Descoberta dos vrus marinhos

    (1946)

    1970

    Divulgada a hiptese da ala

    microbiana (1974)

    Desenvolvimento de mtodo de

    contagem direta de micro-organismos marinhos (1976)

    1980

    Primeiro fago marinho cultivado

    (1980)

    Partculas virais encontradas em alta abundncia na gua

    do mar (1986)

    1990

    Hipotetizada a contribuio viral

    para os ciclos biogeoqumicos

    (1990)

    Desenvolvimento do mtodo de

    contagem viral com SYBR Green

    (1998)

    2000

    Primeiro genoma viral marinho

    sequenciado (2002)

    Genes da fotossntese

    encontrados em cianfagos (2003)

    Descoberta de vrus gigantes

    possuidores do maior genoma,

    Megavirus chilensis (2003)

    Vrus so descritos como as entidades

    biolgicas mais abundantes dos oceanos - 1030

    (2005)

    Virosfera marinha global explorada

    (2006)

    Estudos dos vrus satlites - Sputnicks

    e Mavirus (2009)

    2010

    Inicia-se os estudos do virioplanckton no Brasil - UFF

    (2010)

    Descoberta do Samba Virus no rio

    da floresta Amaznica (2011)

    Determinao da presena de vrus

    marinhos em Arraial do Cabo, Bzios e Baa de

    Guanabara/RJ (2014)

    1974- Descrita a importncia dos virus na ecologia marinha;

    1986 - (107-108 particulas/mL na superfcie dgua);

    Fonte: Arslan, D. et al., 2011, Forest Rohwer & Rebecca Vega Thurber - Nature 459, 207-212 (14 May 2009) - adapted

  • Seus tamanhos podem variar de 20 m at 750 m.

  • Oceanos:

    Cobrem 70% da Terra

    Abrigam 90% da biomassa de microrganismos

    Viriosfera: lise de 20% - 40% dessa biomassa/dia maior

    reserva de diversidade gentica da Terra.

    Maior abundncia (108 109 partculas virais/ml) na superfcie e 1030 partculas virais/ml nos oceanos.

  • Vasta distribuio

  • Controle da abundncia de Procariontes e Eucariontes

    Distribuio e biodiversidade

    de espcies

    Mediar transferncia de genes

    Ciclagem de nutrientes

    Fonte: Furhman, 1999; Wilhem & Suttle, 1999; Thingstand, 2000; Brussard, et. al, 2008; Breitbart, 2012.

    Grande parte do fluxo total de

    matria e energia da cadeia

    alimentar marinha atravs dos

    vrus se torna MOD

    Agentes patognicos????

    NOVA PERSPECTIVA

    VIRAL!!!!

    Qual a importncia da comunidade viral?

  • MOP(viva)

    MOD MOP(morta)

    Bomba Biolgica Dissulfeto (DMS) Ferro Mineralizao do N em NH4 CO2

    Shunt viral

    (Shelfford et al, 2012)

    A quantidade e a composio de material que liberado atravs da lise viral afeta a

    comunidade microbiana e os ciclos biogeoqumicos.

  • Altera:

    a estrutura e diversidade das comunidades fitoplanctnicas e produo da matria orgnica

    da estrutura de populaes e comunidades hetertrofas marinhas Bloom Algas

  • Exportao de C e nutrientes maior em

    relao ao afluxo de novos nutrientes

  • A lise celular mediada por vrus intensifica um desvio do carbono de MOP

    para MOD

    Ciclo do Carbono - C: decisivo para a quantificao de nutrientes e de fluxo de energia

    - MOD: reciclado atravs da comunidade microbiana (ala microbiana)

    - MOP: transferido para nvel trfico dos herbvoros

    This model is a revision of the steady-state model of Jumars et al. (1989) Fo

    nte

    : W

    ilh

    elm

    & S

    utt

    le, 1

    99

    9

  • Nitrognio e Fsforo

    - Disponibilidade de N e P: regula produo primria.

    - Lise viral: liberao de cidos nucleicos e aminocidos

    Elementos-trao : Ferro

    - Limitao do crescimento do fitoplncton.

    - Gobler et al. (1997): Estudo examinou a liberao de elementos-trao por lise viral em

    A.anophagefferens.

    Liberao de ferro dissolvido durante a lise viral, seguido de uma rpida transferncia de

    ferro para a fase de partculas, como resultado de uma rpida assimilao por bactrias

    heterotrficas

    Fonte de nutriente para bactrias partir de produtos de lise de fitoplncton

    A lise de plncton marinho por vrus provavelmente fornece uma rota direta pela qual o

    ferro organicamente complexado liberado de volta para a comunidade microbiana.

    Fonte: Wilhelm & Suttle, 1999

  • Source: Clokie et. al., 2011, adapted; ICTV - EC 45, Edinburgh, July 2013/Email ratification 2014

  • Sub famlia:

    Alphaherpesvirinae Gnero Scutavirus (Tartarugas)

    Famlia:

    Alloherpesviridae (Peixes) Diversos : Batrachovirus

    Cyprinivirus

    Ictalurivirus

    Salmonivirus

  • Ambiente Ecossistema Vrus Bactria Referncia

    Marinho Raunefjorde,

    Noruega 9.9x106 0.2x106 Bergh (1989)

    Dulccola Raunefjorde,

    Noruega 1.1x107 a 3.5x107 0.7x105 a 1.5x105

    Helda & Gunnar

    (1991)

    Marinho Golfo do Mxico,

    EUA 28.3x107 3.5106

    Heldal &

    Gunnar(1991)

    Marinho Golfo de Bothnia,

    Sucia 1.7-5.2x107 - Cochlan (1993)

    Marinho Baa deTampa ,

    Florida, EUA 0.2x108 0.56x107 Jiang & Paul (1995)

    Marinho Lago Donghu,

    China 5.8x108 a 1.9x109 8.3x106 a 5.1x107 Hennes (1995)

    Dulccola Lago Constance,

    Alemanha 10-40x106 -

    Hennes & Simon

    (1995)

    Dulccola Lagos de Quebec,

    Canada 41-250x106 0.02-14x106

    Maranger & Bird

    (1995)

    Dulccola Lagos da Antartica 4.2-33.5x106 4.3x14x106 Kepner (1998)

    Marinho Mar Mediterrneo 5-30x106 - Guixa-Boixereu

    (1999)

    Dulccola Lago Erie, EUA 0.3-3.7x108 1.8-4.6x106 Wilhelm & Smith

    (2000)

    Dulccola Lago Skarlen,

    Sua 1.2x107 a 2.4x107 0.2x106 a 1.1x106 Ansio (2004)

    Dulccola Diama Dam, frica 1.5x107 1.1x106 Bettarel (2006)

    Marinho Baa de

    Chesapeake, EUA 1.1x106 3.2x105 Liu (2006)

    Dulccola Lago Druzhby,

    Leste da Antartica 1.6-15.6x108 1-2.4x108 Swastrow (2007)

    Dulccola Lago Batata,

    Oriximin, Brasil 0.2-1.7x107 1-3.4x106 Barros (2010)

    Marinho Mar de Sargasso,

    Atlntico Norte 6-12x109 3.5-6.5x108 Parsons (2012)

    Abundncia de vrus

    (partculas.mL-1) e

    bactrias (clula.mL-1)

    em diversos ambientes

    aquticos.

  • NUCLEO-CYTOPLASMA

    1. Vrus liga a receptores na

    clula.

    2.Migrao do core do DNA

    para o ncleo

    3.Replicao do genoma .

    4.Sntese de protenas

    precoces.

    5. Sntese das protenas tardias

    e montagem de novos virions

    no citoplasma

  • Caractersticas do genoma

    DNA dupla fita

    250.000-350.000 nucleotideos

    G+C 40-52%

    Phycodnaviridae

    Simetria: Icosadrica

    Gneros: Chlorovirus

    Coccolithovirus Prasinovirus

    Prymnesiovirus Phaevirus

    Raphidovirus

  • Emiliania huxleyi cocolitforo + abundante

    Capaz de formar floraes com extenso at 10.000 km2.

    O vrus pertence ao gnero Coccolithovirus.

    Genoma completo sequenciado 407.339 pb codificar 472 seqncias

    codificantes de protenas (cds).

    o maior Phycodnavirus sequenciado at o momento (wilson et al., 2005b).

  • Famlia Herpesviridae

    1. Herpesvrus Salmonis (Herpesvrus disease of Salmonidis)

    HPV-1 Comum em trutas

    Sintomas: Exoftalmia

    Abdmen aumentado

    Edema

    HPV-2 : Trutas arco Iris

    Salmo prateado

    Salmo kokanee

    Salmo masou

    Salmo chum

    Sintomas: letargia

    perda de apetite

    escurecimento da pele

    pigmentao sanguinolenta

    * Animais desenvolvem cncer de pele, barbatanas e maxilar

    Mec. Transmisso: Contato direto

  • Channel Catfish Virus (Herpesvrus de bagre)

    Caractersticas: Persistncia na gua a 25C /2dias e 28dias a 4C

    Comum em recm nato e Larvas de peixe Vero /Temp. H2O=22-30C

    Sintomas: Diminuio no apetite

    Distrbios na locomoo

    Hiperatividade

    Letargia

    Exoftalmia

    Esplenomegalia

    Pontos hemorrgicos na pele e nos rins

    Mec. Transmisso: Contato direto: peixe peixe (Horizontal)

    Via gua contaminada

    Vertical: Ovos ou smen

    Preveno e Controle: Reduo do stress ambiental (poluio)

    Reduo da temperatura da gua

    Quarentena para animais novos

    Diagnstico laboratorial: Isolamento em Cultivo de clulas de ovrio de peixe

  • Famlia Nome Hospedeiro Transmisso Sintomas Preveno

    Herpesviridae Epiteliom

    a

    papillossu

    m (fish

    pox)

    Carpa chinesa

    gua gelada

    Peixe-peixe

    gua contaminada

    Verrugas

    brancas/cinzas/rosas

    ?

    Orthomyxoviri

    dae

    Isavrus

    Anemia

    do salmo

    Linguado, Salmo,

    truta

    Horizontal ?

    Rhabdoviridae Septicemi

    a

    hemorrgi

    ca

    Carpa

    Ciprindeos

    Bacalhau

    Salmo

    ardinha

    Horizontal (peixe-

    peixe)

    Vertical (Ovos)

    Parenteral

    (Parasitos

    sanguneos)

    Distrbios na locomoo Exoftalmia Hemorragia

    Esplenomegalia

    ?

    Iridoviridae Vrus da

    Necrose

    Hematop

    oitica

    Epizootic

    a

    Salmo

    Linguado

    Truta

    Garoupa

    Horizontal (peixe-

    peixe)

    Vertical???

    Distrbios na locomoo Letargia

    Exoftalmia e hemorragia Esplenomegalia

    Cianose

    ?

    Birnaviridae Vrus da

    necrose

    infecciosa

    do

    pncreas

    Trutas, Linguado,

    salmo

    Peixe-peixe

    Vertical?

    Exoftalmia e hemorragia Esplenomegalia

    Pancreatite

    ?

  • Famlia Parvoviridae

    Gnero Brevidensovirus.

    Doena: Hepatopancreatic parvovirus disease.

    Hospedeiro - Penaeid shrimp. (Camaro)

    Mec. Transmisso- Contato direto: Horizontal

    gua contaminada

    Vertical

    Diagnstico Laboratorial PCR , ME ,Imunohistoquimica.

  • http://homepage.ntu.edu.tw/~daaseven/doc

    /Tim/VIRAL1-Taipei%2008-color.pdf

  • - Famlia : Nimaviridae

    - Gnero : Whispovirus

    - Espcie: White spot Sndrome baculovrus complex

    Genoma: DNA dupla fita

    Ampla faixa de hospedeiros

    Extremamente virulento: 100%mortalidade

    Transmisso

    Horizontal: gua contaminada

    Vertical

    No infecta humanos

    No tem tratamento

  • Famlia siphoviridae

    Hospedeiros

    Enterobactrias

    Micobacterium

    Famlia Podoviridae

    Hospedeiros

    Enterobactrias

    Pseudomonas

    Salmonelas

    Vibries

    Estafilococo

    Estreptococo

    Famlia Myoviridae

  • SIDERASTREA STELLATA

    Fonte: Disponvel em IUCN http://www.iucnredlist.org. Acesso em 07/01/2014. Cites II; Santos et al., 2004; Hetzel & Castro, 1994; Leo

    et al., 1985. Foto: Santana-Pereira, P. 2014.

  • Hospedeiros

    Clamydias

    Enterobactrias

    Genoma ssDNA

    Famlia Microviridae

    Hospedeiros

    Enterobactrias

    Pseudomonas

    Vibrio

    Xanthomonas

    Genoma ssDNA

    Famlia Inovoridae

    Famlia Leviviridae Genoma ssRNA +

    Hospedeiros

    Enterobactrias;

    Pseudomonas;

    Acinetobacter

  • Revoluo darwiniana

    Revoluo gentica

    Proposta de diagnosticar o parentesco dos seres

    vivos (organismos celulares) pela anlise de

    sequncias do rnar (16S) para a construo da

    rvore filogentica universal.

    Criao dos domnios archaea, eubactria e

    eukarya (woese, et al, 1990)

    Fonte: Raoult & Forterre, 2008)

    Qual o domnio dos vrus?

  • DESAFIO PARA A DEFINIO

    DE VRUS ENTIDADES VIVAS!

  • So parasitas intracelulares obrigatrios

    Infectam organismos de todos os 3 domnios.

    Podem at mesmo parasitar outros vrus (Coinfeco)

    Representao da nova proposta rvore

    filogentica Universal:

    Organismos que conseguem codificar capsdeos inclusos nos trs domnios da vida

    que se desenvolveram a partir de um ancestral

    universal comum.

    Organismos que conseguem codificar ribossomos nos trs domnios com ribossomos

    e sem capsdeos.

    Outros elementos infecciosos no so mostrados.

  • Descoberto na Costa do Chile infectando Acanthamoeba polyphaga.

    Possui 680nm de tamanho e 1,25 milhes de pares de base codificando 1120 protenas.

    O genoma do M. chilensis se assemelha ao do Mimivrus, incluindo a presena de genes celulares, mas 258 protenas do Megavirus no so encontradas nos Mimivrus. Estas observaes sugerem que Megavirus e Mimivrus surgiram a partir de um ancestral comum celular - um que poderia realizar a sntese de protenas - e perdeu os genes que no eram mais necessrios.

    Por isso h uma grande necessidade do isolamento de outros vrus gigantes DNA

    Megavirus chilensis (2003)

  • - Biodiversidade Amaznia brasileira.

    - Poucos estudos.

    - Coleta: outubro de 2011 Rio Negro.

    Samba Vrus: maior e primeiro Mimivirus do Brasil

    SAMBA VRUS (SMBV) - 2011

  • SMBV particle visualized by transmission electronic microscopy

    Detail of the star-gate structure (visualized by electronic microscopy),

    which is also present in APMV.

    Possuem mais genes que muitas

    bactrias e desempenham funes

    que, normalmente, ocorrem

    somente em organismos celulares.

    SAMBA VRUS (SMBV)

  • Vrus Cafeteria roenbergensis

    Genoma DNA 730.000 pb

    Hospedeiro

    Bactria Cafeteria roenbergensis

    Micro organismo unicelular predador:

    1. Bactrias

    2. Outros microorganismos no oceano

  • Realiza uma co-infeco em Acanthamoebas. Sputnik aproveita as protenas do Mamavirus ou Mimivirus

    para produzir rapidamente novas cpias de si mesmo.

    Ele contm genes capazes de infectar todos os trs domnios da vida:. Eukarya, Archaea e Bacteria.

    uma das mais convincentes evidncias de mistura de genes.

    Estudos sobre evoluo viral sugerem que a transferncia de genes entre os Mimivrus e Sputnik

    ocorre durante a infeco de Acanthamoeba.

    Portanto, provvel que o virifago controla a

    transferncia lateral de genes entre vrus gigantes.

    Sputnik (Vrus Satlite)

  • Vrus "gigante" pode mudar a rvore da vida

    - Descoberta de dois novos vrus desafiam viso do no-vivo.

    - Grus

    - H 10 anos atrs:

    Mimivirus: 1.18 milhes de bases continham 900 genes putativos

    Mimivirus descende de uma clula de vida livre, que foi gradualmente

    perdendo a maior parte de seus e outros genes at se tornar um parasita.

    Seu precursor: ramo desconhecido, anterior aos 3 domnios.

    Pennisi, E. Science, Vol 341,19. JUL 2013

    SUPOSIO

  • A procura de vrus com genoma

    maiores uma maneira de voltar

    no tempo e encontrar um

    postulado ancestral.

    Pandoravirus

    - Aparentou ser bactria

    - Vrus: Incapacidade de produzir

    protena por conta prpria .

    Science, Vol 341,19. JUL 2013

    Faltam genes para produo da protena da capsdeo e alguns

    genes-chave.

    Uma nova famlia para si mesmos.

  • TRUC

    Virus gigantes

    Archea

    Bactrias

    Micrbios eucariontes

    Fonte: Raoult, 2013 Science, Vol 341, 19

    TRUC:

    Things Resisting Uncomplete Classification

  • METODOLOGIAS DE ANLISE

    Anlise molecular:

    PCR, PCR-Q, Sequenciamen

    to

    Anlise qualitativa

    determinando morfologia, estrutura e tamanho

    Anlise quantitativa

    Caracterizao especfica das partculas virais

  • METODOLOGIAS PRELIMINARES

    Ultrafiltrao

    Concentrao

    Floculao

    VFF

    TFF

  • DETERMINAO DA ABUNDNCIA

    M. EPIFLUORESCNCIA CITOMETRIA

    Medio robusta

    Quantitativa

    Complexidade estrutural

    Tamanho da partcula

    Fluorocromos:

    Syber Green 1, 2

    YO Pro

    Laranja de Acridina

    DAPI

  • MICROSCOPIA ELETRNICA DE TRANSMISSO

    AVALIAR:

    Estrutura

    Tamanho

    Uniforidade

    Quantificao (-)

  • PCR

    PCR-Q

    RT-PCR

    Mutiplex

    Nested

    ...

    SEQUENCIAMENTO

    Determinao de

    sequncias alvo

    Anlise de similaridade

    Anlise de caractersticas

    especficas

    Comparaes

    Determinao sp.

    ANLISE MOLECULAR

  • METAGENMICA

    PURIFICAO POR

    ULTRACENTRIFUGAO

    MICROSCOPIA DE FORA

    ATMICA

    CULTIVO EX SITU

    ELISA

    SHOTGUN

    ANLISES

  • PERSPECTIVAS NA VIROLOGIA MARINHA

    PRODUTOS NATURAIS COM ATIVIDADES BIOLGICA

    CARREADORES DE NANOPARTCULAS

    ESTMULADORES DA EXPRESSO GNICA

    INDUTORES

    BIORREMEDIAO

    INTERVENO EM PROCESSOS BIOLGICOS

  • A descoberta do Pandoravirus e Mimivirus torna

    cada vez mais claro que os domnios da vida so

    um conceito arcaico. Essa descoberta faz com que

    os vrus sejam mantidos no seu lugar de direito na

    histria da evoluo da vida.

    Curtis Suttle, University of British Columbia, Vacounver.

  • Falkowski, P. G. The Oceanss Invisible Forest. Marine phytoplankton play a critical role in regulating the earths climate.

    Could they also be usedto combat global warming?. SCIENTIFIC AMERICAN. AUGUST 2002.

    Danovaro, R. et al. Marineviruses and global climate change. FEMS Microbiol Rev. 142. 2010.

    Campos, R.K. et al. Samba virus - A novel mimivirus from a giant rain forest, the Brazilian Amazon. Virology Journal. 2014.

    Pennisi, E.Ever-bigger viruses shake tree of life. Science, Vol 341.19. JUL 2013.

    Serronha, A.M., Loureno, J. & Vera Sobral, V. Vrus Marinhos e seus efeitos Ecolgicos e Biogeoqumicos Universidade de

    vora - Virologia Biologia. 2004/2005

    Wilhelm,S.W., Suttle, C.A.Viruses and Nutrient Cycles in the Sea - Viruses play critical roles in the structure and function of

    aquatic food webs. BioScience Vol. 49 No. 10. 1999.

    Lwoff, A. 1957. J. The Concept of Virus . Gen. Microbiol. 17:239253.

    Raoult,D and Forterre, P. Redefining viruses: lessons from Mimivirus. Nature Reviews Microbiology 6, 315-319 (April 2008).

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    Arslan et al. 2011. Distant Mimivirus relative with a larger genome highlights the fundamental features of Megaviridae.

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    Suttle, 2005. Nature 437:356-361. Suttle, 2007. Marine viruses Major players in the global ecosystem, Nature Publishing Group, October 2007

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