Lección 1: Introducción histórica a la microbiología. Diversidad del mundo microbiano.

1. Concepto de microbiología y microorganismo.La palabra microbiología proviene de tres palabras. Se trata de la ciencia que estudia los microorganismos.Hablamos de microorganismos como el organismo que debido a su pequeño tamaño escapa a la vista del ser humano, teniendo que utilizar el microscopio para observarlos..Poseen tres características que determinan el término:

- Pequeño tamaño.- Falta de organización tisular, no forma tejidos.- Para su estudio vamos a utilizar siempre la técnica del cultivo puro.

Son objeto de material de estudio de la Microbiología todas aquellas entidades biológicas acelulares y organismos unicelulares, pluricelulares o cenocíticos, carentes de organización tisular, para cuyo estudio se requiere la metodología del estudio del cultivo puro y que por su tamaño escapan a la perfección del ojo humano.Estudia la estructura, función, desarrollo, metabolismo, genética, comportamiento, ordenación taxonómica y evolución de los microorganismos, así como el estudio de las actividades de los microorganismos para su explotación y control.

2. Descubrimiento del mundo microbiano.El descubrimiento del mundo microbiano estuvo condicionado por el descubrimiento del microscopio. Con los microscopios de la época no se podían ver los microorganismos, pero Leeuwenhoke con un microscopio simple tallado por él pudo ver los microorganismos, que los denominó animáculos, eran estructuras en forma de bastón que en realidad de trataban de bacterias.Fue el primero en ver los microorganismos.A partir de ese momento tuvieron que pasar casi dos siglos para que sucedieran los siguientes avances en la fabricación de microscopios compuestos y consigo los siguientes avances microbianos, la tinción de gram, la tinción de flagelos.

3. Controversia sobre la generación espontánea.Otro problema que existía era el de la generación espontánea, en la que se decía que la vida surgía de manera espontánea, también es llamada abiogénesis.· Francesco Redi abolió la teoría de la generación espontánea en animales.· Lázaro Spallanzani, era un naturista que vio que la vida surgía de otra vida, refiriéndose ya a los microorganismos. Se le ocurrió hervor unos caldos y cerrarlos, y como no se contaminaban pensó que en el aire había algo, y cuando no los tapaba si que se contaminaban.· Needham, pensaba que al cerrar los caldos no había oxígeno, por lo que no podía surgir vida.· Louis Pasteur, fue el encargado en abolir la teoría de la generación espontánea en el mundo microbiano. Pensó que en el aire había gérmenes, por lo que filtro grandes cantidades de aire y lo miró en un microscopio (compuestos), donde pudo ver que había bacterias. ¿Pero como podía demostrar que a partir de ahí surgía la vida?, ideo un experimento en el que tenia una infusión de carne que calentaba (para matar lo que hubiese) y pudo ver que si lo dejaba sin tapar se contaminaba. Lo que hizo después fue calentar esa infusión en unos matraces con cuello de cisne y pudo ver que pasado el

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tiempo seguía transparente, pudiendo pasar el oxígeno pero no los microorganismos. Cuando inclinaba el matraz se volvía a contaminar la infusión.· John Tyndall, se dio cuenta que en algunas infusiones estando en el matraz seguían contaminándose y pensó que esos microorganismos se encontraban en dos formas: vegetativas y en forma de resistencia(esporas).· Esto lo corroboró Ferdinand Cohn que descubrió las endoesporas.· A Nicolas Appert que intentó conservar alimentos herméticamente cerrados y calentarlos se le conoce con el nombre de appertización.

4. Descubrimiento del papel de los microorganismos en las transformaciones de la materia orgánica, inorgánica y en la producción de enfermedades.Pasteur estudió las transformaciones químicas que llevaban a cabo los microorganismos, observó que cuando los caldos se contaminaban cambiaban sus características. Aparecía olores pútridos (que venían dados por la utilización de las proteínas), olores ácidos (por la utilización de los azúcares).Descubrió que los microorganismos estaban fermentando, donde los azúcares se transformaban en ácidos (o alcohol). La Sacchaiomycer cerevisial produce la fermentación alcohólica. Vio que había otros organismos, bacterias lácticas, que transformaban los azúcares en ácidos. También descubrió la fermentación butírica, realizada por microorganismos anaerobios.A partir de aquí se empezaron a realizar los cultivos puros: que son aquellos cultivos que solo tienen un tipo de microorganismos.· Emil Hansen y Jeseph Listen, por disoluciones.· Robert Koch, ideó un método para obtener cultivos puros pero en medios sólidos. Se dio cuenta que si dejada una rodaja de patata se formaban unas agrupaciones (colonias) que procedían de un solo microorganismo. Esa colonia está formada por individuos iguales, formando un cultivo sólido.Al líquido se añadía gelatina, para solidificar pero no lo hacia por las proteasas que tenía y por que a altas temperaturas se volvía líquida. Pero gracias a Walter Hesse y Fannie Hesse lo logró, utilizando el agar en los medios sólidos.

Microorganismos como agentes biogeoquímicos.Se pudo ver que había una implicación de los microorganismos en el medio ambiente. A Martinus Beijerinck y a Sergei Winograndsky se les conoce como los padres de la ecología microbiana.· Beijerinck: realizó cultivos de enriquecimiento (métodos de cultivo que tiene unas sustancias para que crezcan los microorganismos).También realizó el aislamiento de bacterias fijadoras de nitrógeno en asociación con leguminosas, como es el caso de Rhizobium. Y también de bacterias libres como las Azotobacter.· Winograndsky: descubrió las bacterias quimioautótrofas, capaces de fijar el CO2

atmosférico para sintetizar la materia orgánica. También eran quimiolitótrofos, que obtienen la energía de compuestos inorgánicos (Fe2+, amonio, ...).

Microorganismos como agentes productores de enfermedades.Primero vieron los microorganismos como agentes de enfermedades en plantas e incluso en animales, pero la enfermedad en seres humanos no se había demostrado.· Semmelweis, trabajaba en un hospital y se dio cuenta que había muchas más muertes de mujeres cuando daban a luz en el hospital que cuando lo hacía en sus propias casas.

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Se producía la fiebre puerperal y recomendó a los médicos que se lavasen las manos antes de cada intervención.· Listen, se dio cuenta que las heridas se infectaban y recomendó una disolución de fenol diluido.· El primero que relacionó un microorganismo con una enfermedad fue Koch. Estudió mucho Bacillus anthracis, que causaba el carbunco. Los granjeros le consultaron porqué se morían muchos de sus animales a causa de una enfermedad. Lo que hizo fue determinar que los animales morían a causa de este microorganismo.1º Extrajo la sangre de los animales muertos y la miró al microscopio, donde vio unos microorganismos..2º Cultivó esos microorganismos y vio que crecían.3º Se los implantó a un animal sano y vio que enfermaba.4º Observó la sangre y vio los mismos microorganismos del principio.Después de este experimento redacto unos postulados. Los POSTULADOS DE KOCH.1º. El patógeno a de estar siempre presente en el enfermo pero no en el sano.2º. El patógeno se tiene que poder separar en cultivo puro.3º. El patógeno obtenido de ese cultivo puro ha de producir la enfermedad en un animal sano cuando lo inoculamos.4º. Hemos de poder reaislar el patógeno del animal que hemos inoculado y ha de ser igual que el inicial.

Descubrimiento de los virus.Después de demostrar la anterior siguió investigando. Esos postulados los volvió a utilizar para demostrar a Mycobacterium tuberculosis o tisis.No sólo investigó Koch sino que también lo hicieron Pasteur y su grupo. Se crearon dos escuelas:La alemana donde se encontraba Koch, y la francesa donde estaba Pasteur.Había enfermedades que no se daban a causa de bacterias sino que eran causadas por virus.· Chamberland era de la escuela de Pasteur. Construyó unos filtros de porcelana que eran capaces de retener las bacterias para esterilizar materiales líquidos.· Otros investigadores (Ivanovsky y Beijerinck, por separado) se dieron que usando los filtros de Chamberland que cuando hacían una maceración en plantas y le añadían el líquido filtrado se infectaban, por lo que los agentes infecciosos tenían que ser más pequeños que las bacterias.· Loeffter y Frosch descubrieron la fiebre aptosa, se trataba de un agente filtrante que causaban enfermedades en animales.También había virus que infectaban a bacterias, como el bacteriófago T4.· Wendell Stanley fue el primero en cristalizar un virus, se dieron cuenta que están formados por proteínas y ácidos nucleicos y necesitaban una célula para reproducirse.· Howard Temin estudió el virus del Sarcoma de Rous, se dieron cuenta que el material del virus era ARN que mediante la transcriptasa inversa daba ADN.· Montagnier y Galla descubrieron el Virus de la inmunodeficiencia humana.

Desarrollo de la Quimioterapia.Utilización de compuestos químicos para curar enfermedades.· Paul Erlich descubrió el Salvarsán 606 que se utilizó para el utilizamiento de la sífilis.· Gerhard Domagk, encontró el Prontosil rubrum que era efectivo frente a estafilococos y estretococos.· Alexander Fleming descubrió la penicilina.

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· La producción del compuesto la hicieron Florey y Chain.· Waksman descubrió otros medicamentos,

Desarrollo de la inmunología.Prevención mediante vacunas.· Edward Jenner. La viruela está erradicada, pero es un arma biológica. Fue se fijó que las mujeres que cuidaban a las vacas (las vaqueras) no tenían viruela, sufrían una viruela leve, era un tipo que sufrían las vacas llamado virus vacunal. Lo que hizo fue extraer linfa y se lo inoculaba a un niño y ya no presentaba la enfermedad.Descubrió las vacunas atenuadas.· Pasteur descubrió una vacuna del cólera aviar.· Jaime Ferrar Cluá. Descubrió unas vacunas para la tuberculosis, cólera, rabia y tifus.

Desarrollo de la genética.· Beadle y Tatum establecieron que en los genes estaba la información genética que daban luegar a proteínas.· Delbrück y Luria, mutaciones.· Watson y Crick, descubrieron la estructura de ADN.· Kary Mullis, descubrió una enzima Taq polimerasa. Contribuía en la replicación de la información genética- esta enzima es importante porque amplifica una región de ADN durante largo tiempo. Esto se podía hacer con la replicación, pero para que se abran las cadenas hay que ponerlo a 90º C. Por lo que esta enzima se ponía desde el principio porque es extremófila.

5. La microbiología como ciencia básica y aplicada.Podemos ver la microbiología como una ciencia básica que se puede estudiar desde distintos puntos de vista como la taxonomía, citología, fisiología, ecología y genética.También se distinguen distintas ramas cuando es una ciencia aplicada, como la microbiología médica, de alimentos, sanitaria, de la salud, ambiental o industrial.Los microorganismos son los seres vivos mejor conocidos. Debido a su simplicidad estructural tienen una elevada velocidad de crecimiento. Tienen una gran facilidad de manipulación genética y una gran capacidad de llevar a cabo transformaciones químicas.

6. La microbiología en la actualidad: perspectivas futuras.Se sigue investigando en la lucha contra las enfermedades infecciosas, se han encontrado nuevos métodos de diagnóstico, nuevas tecnologías de vacunas y se experimenta en la búsqueda de nuevos fármacos.En la agricultura y la ganadería son importantes como insecticidas biológicos, hay una búsqueda de nuevas cepas fijadoras de nitrógeno, y los microorganismos se utilizan como suplemento en la alimentación animal.También son importantes en la industria alimenticia y biotecnológica, ya que se utilizan en los controles de calidad, se produce la obtención de enzimas, vitaminas, ácidos orgánicos y se produce una mejora de la producción de un determinado producto.En el medioambiente también toman un papel importante ya que participan en los ciclos de los elementos, se utilizan en el reciclado de basuras y depuración de aguas, en la eliminación de contaminantes del suelo y, en la decoloración y detoxificación de efluentas textiles, papeleros, ...“ Es extraordinario como, en todo el mundo, los microbiólogos participan en actividades tan diferentes como el estudio de la estructura de los genes, control de las enfermedades

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y los procesos industriales basados en la extraordinaria capacidad de los microorganismos para degradar y sintetizar moléculas complejas. La Microbiología es una de las profesiones más satisfactorias porque ofrece a sus facultativos la oportunidad de estar en contacto con el resto de las ciencias naturales y, por ello, contribuir de muchas maneras a mejorar la vida humana” RENE DUBOS

7. Diversidad microbiana: microorganismos con estructura celular procariota y microorganismos con estructura celular eucariota y entidades acelulares.- Entidades acelulares: virus, viroides, virusoides, ARNs satélites y priones.Dentro de las entidades acelulares se estudian los virus que son partículas infectivas con organización simple, son considerados parásitos intracelulares obligados, existen en dos formas: una forma extracelular llamada virión y otra intracelular llamada virus.El virión es metabólicamente inerte, están constituidos por una parte proteica formado por una cápside dentro de la cual se encuentra el ácido nucleico, pudiendo ser ADN o ARN. Al conjunto se le denomina núcleo cápside. Los que solo poseen núcleo cápside se les denomina virus desnudos y los que poseen una envuelta lipídica se llaman virus envueltos. Cuando el virus penetra dentro de la célula el virus se apodera de la maquinaria de la célula para reproducirse. Algunas veces dentro del núcleo cápside hay algunas enzimas como la lisozima que ataca a bacterias, que le permite al virus hacer un poro en la pared de la célula y penetrar.Virus satélite: está formado por una cápside y ácidos nucleicos. Necesitan infectar al mismo tiempo que otro virus para que se pueda reproducir. Es el caso del virus de la hepatitis D.Viroide: son partículas infectivas que causan malformaciones en plantas, tienen un gran poder infeccioso. Están formados exclusivamente por ARN circular y simplexo. Posee una serie de plegamientos porque posee regiones homólogas entre sí y se unen, pareciendo una cadena duplexa.Ácidos nucleicos satélite: son también partículas infecciosas que se encuentran dentro de virus, dentro encontramos los virusoides, son también cadenas simplezas de ARN que se encuentra dentro de la cápside de ARN de otro virus. Se consideran como parásitos de virus, hay casos que se produce una relación muy fuerte entre el virusoide y el virus para que se reproduzcan.Priones: los descubrió Prusiner, y están formados exclusivamente por proteínas. Son variantes conformacionales de proteínas normales. Lo que hacen es modificar la conformación de PrP haciéndolas patógenas.- Organismos procariotas: bacterias y arqueas.Estas células no poseen ningún tipo de membrana unitaria a excepción de la membrana plasmática. No tienen RE, mitocondrias, ... Lo que si tienen son ribosomas de tamaño 70s. Poseen un sistema de membrana que va a ser diferente en bacterias (poseen unos lípidos de membrana diferentes a los que están en arqueas, al glicerol se le unen ácidos grasos mediante enlaces ester) y en arqueas (el glicerol está unido a cadenas isoprenoides mediante enlaces eter).Disponen también de pared celular que se sitúa por fuera de la membrana plasmática que es la que les confiere la forma, también son diferentes en bacterias y en arqueas.No hay ningún tipo de reproducción, pero existe intercambio genético que hace que la diversidad aumente, se lleva a cabo mediante: la transformación, la transducción y la conjugación.Existe otra diferencia entre arqueas o bacterias, el aminoácido por el que empiezan las proteínas también es diferente en ambas, el ARNt es diferente. En bacterias es formil-metionina y en arqueas metionina.

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Pueden ser móviles(presentando flagelos y nunca cilios), inmóviles.- Organismos eucariotas: protozoos y algunos hongos y algas.Dentro de los hongos lo que nosotros estudiamos son los microscópicos, siendo unicelulares llamados levaduras (viven en lugares con gran cantidad de azúcar) y pluricelulares (que sus células forman filamentos, denominándolos así hongos filamentosos, los filamentos se unen entre sí formando el micelio). Son importantes por:· Que son agentes productores de enzimas y antibióticos.· También los hay patógenos.· son oportunistas.En general no son fotosintéticos, no tienen cloroplastos. Tiene pared celular diferente a la de los procariotas.En hongos si se puede dar reproducción asexual, hay unos hongos denominados mucosos que son unos híbridos entre los hongos y los protozoos. Se alimentan de bacterias.Las algas no son móviles, las hay unicelulares y pluricelulares, disponen de pared celular.Los protozoos son organismos eucariotas móviles, son muy importantes como patógenos, como es el caso de Plasmodium (malaria).

8. Propuestas de clasificación de los seres vivos.Los virus y derivados no están encuadrados en cuadrados dentro de los seres vivos.Vamos a tener que encuadrar los procariotas (bacterias y arqueas) y los eucariotas.Antes estaban divididos en dos reinos: plantae y animalia. Cuando se descubrieron los microorganismos incluyeron las algas y los hongos en el reino plantae y, bacterias y protozoos en el reino animalia, pero se vieron algunos errores.Después se descubrió que había unas algas verdeazuladas (cianobacterias) que tenían una estructura muy similar a las bacterias, y metieron este tipo de algas en el reino plantae.Ernst Haeckel propuso la formación de otro reino que lo llamó protista y donde incluyó algas, bacterias, hongos y protozoos. Se dio cuenta que las algas y las cianobacterias eran diferentes y formaron el grupo monera.Chatton se dio cuenta que había dos tipos de estructura celular, procariotas y eucariotas. Atendiendo a todo esto Whittaker los separó en cinco reinos, basado en la estructura celular y la alimentación. Los reinos eran los siguientes:

- Monera: donde estaban las bacterias. - Protista: donde se encontraban protozoos y algas.- Funji: donde se encuentran los hongos.- Animalia: están todos los animales.- Plantae: plantas.

Whittaker junto con Margulir al reino protista le llaman protoctista.Hay otros autores que defienden la clasificación en seis reinos, dividiendo el reino monera en Eubacterias y arqueobacterias.Cavalier-Smith los clasifica en ocho reinos, con dos imperios teniendo en cuenta la estructura celular:

- Bacteria dividiéndolos en dos reinos (Eubacterias y arqueobacterias).- Euraria dividiéndolo en cinco reinos (plantae, chromista, fungi, animalia,

protozoo, arqueozoo).Nosotros vamos a utilizarel modelo de Carl Woese, está basado en la filogenia (relaciones evolutivas), es el más natural, basado en las similitudes que tienen unas macromoléculas denominadas cronómetros moleculares que son algunas proteínas y

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algunos ácidos nucleicos. Es que más se utiliza es el ARNribosómico, forma parte de los ribosomas, está universalmente distribuida, tiene siempre la misma función, permite establecer comparaciones entre organismos. El que se utiliza para realizar estas relaciones es en el caso de los eucariotas el ARNr 18s, y en el caso de los procariotas el ARNr 16s.En base a las similitudes del ARN, propone un sistema de clasificación, los seres vivos se dividen en tres taxones llamados dominios: bacterias, arquea y eukarya.En bacterias estarían incluidos todas las bacterias. En arqueas estarían incluidos todas las arqueas. En eukarya estaría incluidos todas los demás seres vivos.Establece que todos los seres vivos salieron de un ancestro universal, del que se bifurcan en dos líneas que llegan al dominio bacteria y otra en eukarya y arquea.Dentro de estos tres dominios en bacterias están incluidos unos 15 reinos.En arqueas hay tres reinos (“ korarchaeota”, crenarchaeota, euryarchaeota).Y en eukarya encontramos varios reinos.Dentro del dominio bacteria es el que más reino hay y los que vamos a estudiar.A partir del ancestro universal (procariota) , una línea arquea, bacteria y otra la de los eucariotas, esta empezó a crecer, el material genético se organizó dando lugar a una célula eucariota con núcleo, en simbiosis con una bacteria es cuando se forma el origen de las mitocondrias. Cuando una célula con mitocondrias se une con una bacteria da lugar a los cloroplastos (fotofrofas).

Lección 2. Observación de los microorganismos.

1. Microscopio óptico. El ojo humano es capaz de ver organismos de hasta medio milímetro, los microorganismos son del tamaño entre m = 10-6m, nm = 10-9m.El microscopio que más utiliza es el microscopio óptico de campo claro.El campo visual aparece totalmente iluminado y la muestra con un tono más oscuro, esto es debido al contraste entre el campo y la muestra. Hay veces que el contraste es tan pequeño que se van a tener que utilizar técnicas de tinción para poderlas ver.La fuente de luz llega al primer sistema de lente que es el condensador, que dirige los rayos de luz hacia el lugar donde se encuentra la muestra, en la platina. La luz penetra en el segundo sistema de lente llamado objetivos que se sitúan en un rotor o revolver donde se sufre una ampliación, luego la luz a va a los oculares donde sufren otra ampliación.Los oculares tiene un aumento de 10 y los objetivos de 5, 10, 40 y 100.El poder de resolución hace referencia a la capacidad que tiene el microorganismo para que dos puntos que están muy juntos, se puedan diferenciar separados. Está en función de una ecuación:d = 0,5 n senEl denominador se conoce con el nombre de apertura numérica. Cuanto más pequeña sea d, más resolución tendrá el microscopio.d = la distancia mínima de separación de dos puntos para que esos dos puntos se perciban como separados. es la longitud de onda de la fuente de iluminación, como en este caso es visible estará entre 400-700 nm, lo normal es 530nm.n es el índice de refracción del medio existente entre la muestra y el objetivo, hay aire que es 1.

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hace referencia a la mitad del ángulo del cono de luz que sale de la muestra y llega al objetivo. Como mucho es 90º, y el sen90 = 1.La apertura numérica es característica del microscopio.Cuanto mayor sea”d”, mayor poder de resolución tendrá del microscopio.¿Cómo podemos hacer que un microscopio tenga menor “d”?· Haciendo que sea pequeño.· Otra manera es aumentar la apertura numérica, aumentando el ángulo.· Otra manera es cambiando el índice de refracción, aumentándolo, poniendo aceite de inversión, oscilando entre 1,2 y 1,4, lo normal sería de 1,25.· El máximo de resolución de un microscopio de campo claro es 0,2m.· El índice de refracción del aceite es similar al del vidrio, el aceite lo que hace es que los rayos no se refracten.Se utiliza a nivel de prácticas, no sirve para ver estructuras internas. La imagen que nos muestra es bidimensional. Se tiene que teñir la muestra y lo primero que hay que hacer es fijarla al vidrio.Hay otros microscopios en los que no hace falta teñir la muestra para poderla observar.

2. Microscopio de campo oscuro.El campo visual va a ser completamente oscuro y los organismos van a aparecer más claros y brillantes.Poseen un condensador opaco, de tal manera que a la muestra solo le llega la radiación procedente de los laterales, por lo que el campo visual es negro.Presenta unas ventajas:· Su poder de resolución es mayor.· No es necesario teñir las muestras.· Son capaces de observar algunas estructuras internas.· Se pueden visualizar los flagelos.· se utiliza para aquellos microorganismos que son lábiles, cuando se tiñen se estropean.

3. Microscopio de contraste de fases.Se ideó para aumentar el contraste con el campo visual y la muestra y nos evitásemos teñir las muestras.El campo visual también aparece claro, pero un poco más oscuro que en el microscopio de campo claro, y los microorganismos van a aparecer más brillantes.Se pueden visualizar estructuras internas.Posee un sistema de lentes modificados. Tiene un condensador con un diafragma anular y el objetivo con una placa de difracción, con esto se quiere aumentar las diferencias entre los diferentes índices de refracción que tienen las distintas partes de la muestra. Todo esto se traduce en las diferencias de contraste entre las diferentes partes de la muestra y, entre la muestra y el exterior.Las imágenes que se ven son bidimensionales.

4. Microscopios de fluorescencia.También se trata de un microscopio óptico y nos va a dar imágenes bidimensionales.Se basa en la propiedad de que tiene alguna sustancia que absorbe una luz de onda corta y emite luz de onda larga en el espectro visible. Estas sustancias se denominan fluorocromos. Por lo tanto este miscroscopio poseerá una fuente de iluminación ultravioletra, mientras que la miestra emite luz visible para que nosotros la podamos ver.Se utiliza mucho en ecología mibrobiana.

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El fluorocromo que más se utiliza es el DAPI, se une a los ácidos nucleicos y después emite una luz en el espectro de color azul.Este tipo de microscopio tiene que tener unas características.· El condensador tiene que ser de cuarzo, porque el vidrio es opaco a la luz ultravioleta.· Cuando la muestra se ve verde está presente el fluorocromo isotiocionato de fluoresceína.

5. Microscopio de interferencia.En este microscopio ya podemos ver imágenes tridimensionales.Utiliza una fuente de luz polarizada que se hace incidir en un prisma que se separa en dos rayos perpendiculares entre sí. Cuando los dos rayos inciden en la muestra al no estar en la misma fase se producen unas interferencias y lo vamos a ver como diferencias en el contraste y también en las dimensiones de la muestra.No es necesario teñir las muestras y se van a visualizar muy bien las estructuras internas.

6. Microscopio de fuerza atómica.Es mucho más sofisticado.Posee una especie de sonda que recorre toda la muestra, lo que hace es reproducir la muestra (detecta cualquier tipo de anomalía en la muestra).Son imágenes tridimensionales y no hace falta teñirlas. Dentro del poder de resolución son mucho más reales que cuando hay que teñir la muestra.

7. Microscopio confocal de rayo láser.Este rayo se dirige hacia una zona en vertical de la muestra. Vamos a poder ver los distintos planos de la muestra en profundidad.Este tipo de microorganismos suele ser con muestras teñidas, con fluorescencia, para ver los microorganismos vivos y muertos.

8. Tratamiento de la muestra en el microscopio óptico de campo abierto.Antes de empezar a teñir una muestra es necesario fijarla al porta, que se realiza mediante la aplicación de calor. Cuando la muestra es sólida lo que hay que hacer es resuspenderla en una gota de agua, después mediante un asa de siembra se extiende por todo el porta. Una vez resuspendida, o bien se deja secar al aire o utilizamos la llama del mechero, de esta manera conseguimos que las proteínas de los microorganismos se adhieran al vidrio. Hay que hacer esto, para que cuando se le eche un líquido no se pierdan los microorganismos, a este proceso se le denomina FROTIS.Cuando ya está fijada la muestra es cuando empezamos a teñir. Se realiza mediante la utilización de colorantes que pueden ser ácidos, con carga negativa, o básicos, con carga positiva.Nuestra muestra va a ser negativa, así que cuando la teñimos con un colorante básico, éste penetrará en los tejidos de la muestra, pero si es ácida no penetrará y lo que se teñirá será es campo visual.Podemos utilizar distintas tinciones:· Simples: únicamente se utiliza un contaminante. Si es básico el contaminante tiene que ser Azul de metileno, Safranina (rojo- rosado) o Cristal violeta.En el caso de que el contaminante sea ácido tiene que ser o Migiosina, Tinta china o Eosina.

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Para hacer la tinción primero hay que hacer un Frotis, luego le añadimos el colorante que se deja actuar dos minutos, se lava y se deja secar al aire, cuando esté seco ya lo podemos observar al microscopio pero siempre con el de inmersión.En el caso de que el colorante sea ácido, el Frotis se realiza en el mismo colorante, no se resuspende en agua, se deja secar al aire y no hay que lavarlo. Este tipo de tinción da información a cerca de la forma de los microorganismos, vamos a ver organismos pequeños y también vamos a poder determinar si se agrupan o no.· Diferenciales: ya se utilizan dos colorantes, de tal manera que los microorganismos responden de diferente manera dependiendo del colorante.

- Gram: utiliza dos colorantes y los dos don básicos, unos se denomina primario que es el Cristal violeta y el otro secundario o de contraste y es la safranina. A los que se tiñen con el cristal violeta se les denomina Gram positivos y se tiñen de violeta, los que se tiñen de Safranina son los Gram negativo que se tiñen de un color rojo- rosado. Se tiñen de diferente color debido a los peptidoglucanos.Primero se hace un Frotis, luego se añade el Cristal violeta, se deja actuar, lo retiramos y se añade un mordiente (lugol, que se une al Cristal violeta, formando un complejo de mayor tamaño) durante un minuto. A continuación se añade el alcohol, en algunos microorganismos va a arrastrar el colorante y en otros no. Se añade la Safranina y los microorganismos que se han quedado sin tinte se tiñen de color rojo- rosado.

- Ácido alcohol resistente o también denominada tinción de Zielh- Nielsen: se utiliza en microbiología cínica para diferenciar dos especies: la Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae. Todos los del género Mycobacteriun y Nocardia poseen pared de Gram positiva y poseen ácidos, micólicos y ceras por lo que la tinción de gram no es muy efectiva y se utiliza esta.Primero se hace el Frotis, luego se añade la Fucsina fenicada y se espera cinco minutos, dándole calor para que el colorante penetre en el microorganismo. Luego se le añade un colorante ácido que es el etanol clorhídrico y se deja un minuto, se añade azul de metileno. Los organismos que sean ácido- alcoholes resistentes se verán de color fucsia y serán positivos, y los que no sean resistentes serán negativos y se verán de color azul.

- Especiales:· Esporas o endosporas: son muy resistentes al tinte, se utiliza el Verde malaquita.Primero se hace un Frotis, luego añadimos el colorante, se tiene ocho minutos aproximadamente dándole calor, luego se lava. Se añade la Safranina, si las células tienen esporas ésta se quedará teñida de verde y los demás de rojo- rosado.· Capsula: es una estructura que poseen algunos microorganismos, de naturaleza polisacárida y son solubles en agua. Se usa un colorante ácido, Tienta china. Colocamos una gota en el porta, resuspendemos la muestra y extendemos. Dejamos secar al aire y cuando está seca se añade un colorante básico, normalmente la Safranina. La tinte china no penetra, la Safranina sí y se va a ver rojo- rosado, se tiñe la pared y el citoplasma pero no la cápsula.· Flagelos: es muy laboriosa. Se utiliza un mordiente para aumentar el tamaño del flagelo, puede ser el alumbre de potasio o el ácido tánico. Luego se tiñe con fucsina.

9. Microscopios electrónicos.· Su fuente de luz son los electrones, a diferencia de la luz visible del óptico.

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· Las lentes son electromagnéticas y tienen que estar siempre situadas en un tubo al vacío, porque si hay aire, los electrones se dispersan..· El poder de resolución es mayor, porque la longitud de onda de los electrones es de 0,005nm.· Hay dos tipos de microscopios:

- De transición (MET = TEM) las imágenes que nos dan son bidimensionales y se utiliza para estudiar la ultra estructura celular.Se consiguen valores de d = 0,5 nm, los aumentos que se consiguen también son mayores, oscilan entere 100000 y otros llegan hasta un millón de aumentos.Se utilizan para estudiar los orgánulos celulares. En este microscopio los electrones proceden de un filamento de tungteno que se calienta y emite una serie de electrones que se dirigen a la muestra mediante un condensador, los electrones chocan con la muestra. Algunos quedan absorbidos y otros la atraviesan (producidos por lente del objetivo) sufren amplificación, son captados esos electrones en una pantalla sensible a los electrones.La imagen es bidimensional y como no se utiliza luz , son en blanco y negro. Lo que vamos a ver son zonas más oscuras en la que han llegado menos electrones, y una zona más clara en la que han llegado más electrones.Con este microscopio no se pueden ver las muestras en vivo porque los electrones tienen poco poder de penetración, hay que cortar la muestra en láminas con un grosor de 20-100 nm, pero lo normal es de 60 nm.Para preparar una muestra lo primero que hay que hacer es fijar la muestra, utilizando para ello un Glutaraldehido, en el que precipitan proteínas. Una vez fijada hay que deshidratarlas, sometiéndolas a concentraciones ascendentes de etanol o acetona. Una vez deshidratada la muestra se mete en una resina que ha temperatura ambiente es sólida. Vamos a tener un bloque de resina y dentro la muestra. Cuando está solidificada se corta la muestra, mediante un ultramicrotomo. Cada uno de esos cortes lo colocamos sobre una rejilla de cobre que luego se pone en el microscopio.Para que haya más contraste la muestra se puede teñir.Todo este proceso hace que algunas veces se produzcan estructuras que no se encuentran en vivo.

- De barrido: las imágenes que nos dan son tridimensionales y se utilizan para estudiar el exterior de las células.Tiene menor resolución, una d = 7 nm y también tiene menos aumentos. La diferencia está que lo que observamos en la superficie celular, nunca el interior.Partimos de un filamento ............. que se denomina haz primario, cuando choca con la muestra la superficie de la membrana emite otro haz secundario, éste a través del objetivo incide en la pantalla y se ve la imagen.Es necesario hacer un tratamiento de la muestra. La introducimos y la deshidratamos en concentraciones ascendentes de etanol o acetona. Una vez deshidratada se coloca sobre un disco o plataforma y se cubre con una capa de oro/ paladio y ya podemos verla al microscopio.

Lección 3. Estructura y función de la célula procariota.

El tamaño de los microorganismos es muy variable, se ha descubierto la Thiomargarita namibiensis que se puede ver a simple vista, estos microorganismos suelen medir entre 0,2 y 5 m de diámetro y de 2 a 40 m de longitud.

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Aunque son muy pequeños tiene muchas ventajas, cuanto más pequeños mayor será la relación superficie/ volumen.

1. Formas.Existen diferentes formas, los que más se ajustan son los redondos (cocos), hay otros cilíndricos (bacilo: Bacillus), unos bacilos en forma de coma (vidrios), otros tienen forma de espiral (espiralinos), si se trata de una espiral flexible (espiroquetas). Otros tienen forma de pedúnculos, otros forman filamentos que se unen dando el micelio (actinomicetos)Pueden formar agrupaciones debido a que cuando se dividen, las células no se separan.Los cocos si se dividen por un plano vertical forma diplococos y si son cadenas de denominan estretococos. Si el microorganismo se divide en planos perpendiculares entre sí, se formará una agrupación de tétradas. Su se divide en planos al azar se forman agrupaciones en Sarcinas, en los estafilococos se ven muy bien.Los bacilos al dividirse lo hacen por el eje menor y los vamos a ver de dos en dos (diplobacilos) o en cadenas (estretobacilos).

2. Estructura general de la célula procariota.Costa de una membrana plasmática, la mayoría tiene también una pared celular. Algunas poseen una cápsula, vamos a ver ribosomas, nucleoide, intrusiones, algunas van a poseer flagelos.La membrana plasmática es una estructura que rodea al citoplasma celular. Va a tener importantes funciones.La estructura procariota es diferente si se trata de bacterias o si se trata de arqueas. La de bacterias en una estructura unitaria, que responde al esquema de una bicapa fosfolipídica y con proteínas en el interior, la bicapa está formada por glicerol fosfato y dos ácidos grasos. Un carbono está fosforilado y los otros dos están unidos a ácidos grasos que pueden estar saturados o no.El ácido graso se une al glicerol por un enlace ester. En las bacterias es ácido graso está unido mediante un enlace ester.Las proteínas pueden ser superficiales o de transmembrana, con canales para el paso de moléculas, también las hay transportadoras.En la membrana de las bacterias existen unas moléculas que se denominan hopanoles, que poseen una estructura similar a los esteroles que existen en las membranas de las células eucariotas. En Micoplasmas si que hay esteroles, pero no tienen membrana.En las arqueas la estructura de la membrana plasmática es diferente. La diferencia está en los lípidos que forman la membrana que son diferentes. Tenemos glicerol, pero en vez de estar unidos a ácidos grasos, están unidos a cadenas carbonadas (isoprenoides), por tanto no tiene grupos carboxilos, pueden tener ramificaciones. Las cadenas más frecuentes presentan 20 átomos de Carbonos y se llaman fitano o fitanil. Por lo tanto están formados por enlaces de tipo eter. Cuando los lípidos de las arqueas están formados de esta manera, presentan una estructura en bicapa. A este tipo de estructuras se le llama dieres o difitanil de tal manera que forma la bicapa. Hay algunas arqueas que son diferentes, presentan una estructura en monocapa porque las cadenas isoprenoides que están unidas al glicerol que se unen entre sí, esta membrana será tetraeter. Cuando este isoprenoide tiene 40 Carbonos se le llama bifitanil. En las monocapas hay 4 enlaces eter y dos bifitanil (dibifitanil). La estructura es monocapa es más estable ante situaciones ambientales extremas, por ejemplo con pH muy ácidos en ambientes. En la membrana también hay proteínas.

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3. Funciones de membrana (tanto en bacterias como arqueas).1. Actúa de barrera ya que es semipermeables. Impide las salidas de sustancias

imprescindibles para la célula e impide también entrar otras sustancias. Por su naturaleza (lipídica) hidrofóbica va a dejar pasar aquellas sustancias solubles en líquidos como los gases (O2,CO2, ...)a través de difusión. El agua puede pasar por difusión aunque hay proteínas que transportan agua en la membrana llamadas aquaporinas (aceleran el transporte de agua). Otras moléculas hidrofílicas como los azúcares, necesitan una serie de sustancias transportadoras (que es único en procariotas), es lo que se denomina la traslocación de grupo (sistema fosfotransferasa). Existe una proteína que está en el interior de la célula y que recibe el nombre de HPr, este está en el citoplasma. Se fosforila gracias al grupo fosfato que le da una molécula altamente energética que es el PEP, la proteína se convierte es H-Pr-P (se fosforila) va hacia la membrana y es capaz de unir azúcares, se transforma en azúcar con un grupo fosfato y recuperamos la proteína.HPr- P + azúcar azúcar- P + HprCon otras moléculas más grandes (Ca+, iones, ...), el sistema de transporte es mediante proteínas específicas (transportadoras) que están situadas en la membrana plasmática.

2. Albergan proteínas para el transporte de moléculas.3. También son importantes en procariotas porque se encuentran los sistemas

productores de energía.4. En la membrana también se encuentra la ATPasa (paso de energía), también se

encuentran los pigmentos fotosintéticos para realizar la fotosíntesis.5. Las membranas son también diana de muchos antibióticos para destrucción

microorganismos.

4. Pared celular.Es una capa que se encuentra por fuera de la membrana plasmática. Esta pared celular está presente en la mayor parte de bacterias y de las arqueas, y son diferentes entre ellas.

5. Funciones de la pared celular.1. La pared celular le confiere rapidez y le da forma a las características, aquellas

que no tienen son redondas.2. Impide que las células estallen, porque generalmente los microorganismo viven

en ambientes donde la concentración de sotutos es mayor de l que ellas tienen dentro. Las bacterias están turgentes (inchadas) por tanto si no hubiese pared celular pasaría agua mediante ósmosis.

3. Impide la lisis osmótica.4. La pared también es punto de anclaje de muchas estructuras celulares de

estructura procariota como los flagelos.5. También es diana de muchos antibióticos.

Pared celular de bacterias.La pared celular de las Gram + se ve más gruesa y en Gram – la pared celular es de menor grosor.El péptidoglucano está presente en todos los microorganismos (bacterias) que tienen pared celular. El péptidoglucano es un eteropolisacárido, formado por aminoácidos y cadenas de azucares.

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Los azúcares que constituyen el péptidoglucano son el N-acetilglucosamina y el N- acetilmurámico (es un lactileter, es decir se le une un ácido láctico), son derivados de la glucosa.Las cadenas de glucano van a ser fuertes y resistentes, los azúcares se unan entre sí de manera alternativa mediante enlaces 1-4.Los animoácidos sólo se pueden unir al ácido láctico, es decir al azucar del N- acetilmurámico. La parte peptídica está formada de aminoácidos que se unen siempre al N- acetilmurámico (al grupo carboxilo).Los aminoácido que forman el peptidoglucano son 4 y aunque varían, las combinaciones más frecuentes son:· Gram – y algunas Gram +: L-ala, D-glu, Diaminopimélico, D-ala.· Gram +: L-ala, D-glu, L-lys, D-ala.Hay aminoácidos que se encuentran en formas D, y esto hace que algunas proteasas de las células no van a poder romper esta estructura, por tanto confiere resistencia.Los aminoácidos con cadenas de glucano están unidas a otras cadenas de glucano con animoácidos adyacentes. Los aminoácidos establecen uniones interpeptídicas entre sí con otros de otra cadena, formándose una “malla”.Las uniones pueden ser directas: cuando una cadena de aminoácidos se une a otra cercana, la unión se establece entre el último aminoácido de una cadena y el tercero de otra (lisina o Diaminopimélico), se trata de un enlace peptídico, la alanina tiene el grupo carboxilo y la lisina o el diaminopimélico tiene dos grupos aminos, uno para unirse al anterior y otro para unirse a la alanina. Este tipo de uniones es más frecuente en Gram -. Pero también se da en algunas Gram +. Hay en algunas bacterias que los aminoácidos se unen por medio de puentes peptídicos, normalmente en Gram +, este puente puede ser de diferente naturaleza, en Staphylococus aureas presentan 5 Glicinas, pero nunca estos puentes pueden estar formados por aminoácidos aromáticos.Esta malla puede ser más o menos tupida, en Gram + hay mayor número de entrecruzamientos, por lo que va a ser más tupida y con menor número de poros, en Gram – es al revés.· Gram +: la pared celular está formada por un peptidoglucano de gran tamaño, que ocupa entre el 80-90 %, y tiene muchos entrecruzamientos.Presentan también ácidos teitoicos que son exclusivos de las Gram +. Estos ácidos es encuentran unidos covalentemente al peptidoglucano. Están formados por polímeros de glicerol o de otro alcohol que es el ribitol con 5 átomos de carbono. Estas unidades están unidas por grupos fosfatos (por enlaces ester), suelen tener como sustituyentes otras moléculas y la que más abunda es la D-Ala, pero también encontramos azúcares y hay variabilidad, glucosa, glucosamina, ... Todo esto le supone una gran variabilidad.Hay algunas bacterias que los ácidos teitoicos se unen a los lípidos de la membrana plasmática, llamándolos ácidos lipoteitoicos que son siempre de glicerol- fosfato (porque este sustituye al glicerol de la membrana plasmática).Funciones de los ácidos teitoicos:

- Por tener el glicerol- fosfato dan carga negativa a la pared celular.- Como tienen carga negativa se les pueden unir cationes, que ayudan en la

estabilidad de la pared celular.- Actúan como antígenos de superficie, frente a los cuales nuestros sistema

inmune va a producir anticuerpos.- Algunas proteínas se une al peptidoglucano.

· Pared celular de Mycobacterium, Nocardia y algunas corineformes: son Gram +, pero no se tiñen bien con la tinción de Gram. a parte de todo lo que poseen, también tienen ácidos micólicos y glucolípidos (ceras).

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Los ácidos micólicos son ácidos grasos unidos a un polisacárido, en este caso es un Arabinogalactono (polisacárido formado por arabinosa y galactosa), unido mediante un enlace ester a un fosfato.Los glucolípidos son ácidos grasos unidos a un azúcar que puede variar. Estas bacterias tienen un alto contenido en lípidos y eso hace que no se tiñan bien con la tinción de Gram.· Las Gram -: su pared celular es mucho más compleja. También tienen peptidoglucanos pero en este caso es una capa más pequeña, tiene menor número de entrecruzamientos. A continuación de la capa de peptidoglucanos hay una capa denominada membrana externa, se le llama así porque está fuera. También posee una estructura de bicapa lipídica. Los fosfolípidos más internos tienen una coloración distinta a los externos. En la parte externa los fosfolípidos están sustituidos por glucolípidos (azúcares unidos a ácidos grasos), de forma que en la membrana externan hay un componente fundamental y característico que es el lipopolisacírido, la parte lipídica la constituye el lípido A y la polisacárida la forman dos partes la CORES o Región Central, o el Polisacario O. La estructura del lipopolisacírido varía de unos microorganismos a otros.En el lipopolisacírido de Salmonella:Primero estaría el Lípido A, que esta formado por 2N-glucosamina fosforilada. A la N-acetilclucosamina se le unen los ácidos grasos que en este caso son saturados (caproico).A continuación vendría el CORE que es de naturaleza polisacárida, formada por el ácido cetodesoxioctonato (KDO), también se le unen azúcares que son heptosas fosforilados y luego también azúcares de seis carbonos como la glucosa, la galactosa y el N-acetilclucosanima.Después viene el polisacárido O que está formado por azúcares de 6 carbonos , como la galactosa, la Rhamnosa y azúcares raros (desoxiazúcares como la abecuosa y la tagatosa) que se encuentran formando unidades de 4 o 5 azúcares que se van repitiendo.También tiene proteínas que unen el peptidoglucano con la membrana externa, esta proteína es la que se llama proteína de Braun.

En la membrana externa hay otro componente que son las porinas, se trata de proteínas que permiten el paso de moléculas hidrofílicas no muy grandes (de pequeño peso). Estas proteínas están formadas por tres subunidades de tal manera que en el centro dejan un canal por donde pasaría la molécula a transportar. Hay porinas que son inespecíficas, transportan a moléculas que cumpliese esas características. Hay otras que son específicas como las aquaporinas.

Funciones de la membrana externa: - Le proporciona la carga negativa a los microorganismos.- Actúa como una barrera frente a antibióticos, desinfectantes,…- Es tóxica para las células animales, concretamente es el lipopolisacárido, por eso

se dice que es una endotoxina (es el propio microorganismo es que tiene una parte tóxica para la célula, tiene un efecto pirógeno [fiebre]). La parte más tóxica es el lípido A y la otra parte es lo que permite la solubilidad del lípido A.

Relacionar como se tiñen según la pared celular.En Gram + se pone el cristal violeta, se tiñe, luego se pone el mordiente. Se creo el complejo cristal violeta- lugol, formando unas moléculas más grandes. Luego hechamos alcohol deshidratándose, los poros se hacen más pequeños y cuando se añade el siguiente tinte no llega a penetrar.

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En Gram – el complejo que se forma con el lugol si que llega a salir por los poros y luego se vuelve a teñir con la safranina.

Espacio periplásmico.Es un espacio con naturaleza viscosa. En Gram – es el espacio que existe entre la membrana plasmática y la membrana externa, en él se encuentra el peptidoglucano.Y en Gram +, es el espacio que se encuentra entre la membrana plasmática y el peptidoglucano. En él se encuentra tanto en las Gram + como en las Gram – proteínas. Se localizan enzimas hidrofílicas que intervienen en la degradación de nutrientes a moléculas más sencillas. También se pueden encontrar proteínas de enlace y que intervienen en el transporte. Existen proteínas denominadas quimioreceptoras que son proteínas que participan en la quimiotaxis (movimiento de los microorganismos hacia un estímulo determinado, los microorganismos ante un estímulo químico pueden acercarse o alejarse).

Pared celular en Arqueas.La pared celular es diferente que en bacterias, presentan varios tipos de pared. Algunas arqueas la tienen formada por un pseudopeptidoglucano o también pseudomureina, que está formado por azúcares y también aminoácidos, la cadena de azúcares esta formado por N-acetilglucosamina y el N-acetilmurámico esta sustituido por un N-acetil-talosa-minurómico unidos por enlaces 1-3.Otras arqueas no tienen en su pared ningún péptido/pseudopeptidoglucano sino que estan formados por proteínas unidos a glúcidos o lípidos (glicoproteínas o lipoproteínas) y/o polisacáridos.Cuando una célula pierde su pared celular se transforma en un protoplasto, asunque realmente este término solo se aplica cuando son las Gram +, que son las que pierden la pared. La lisozima está implicada en la degradación del peptidoglucano, rompiendo el enlace 1-4 entre el N-acetilglucosamina y el N-acetilmurámico, por lo que no atacará a la de Arqueas.En las Gram – quedan restos de membrana externa y se la denominan esferoplastos. A ambos (protoplastos y esferoplastos) para mantenerlos hay que tenerlos en un medio isotónico.

6. Glucocalix.Es una capa generalmente formada por polisacáridos que se encuentran por fuera de la pared celular. Si esta capa es una capa bien organizada y esta fuertemente unida a la pared celular se le denomina cápsula. Si por el contrario no es una capa que se organiza y no esta fuertemente unido se le denomina capa mucosa o slime.

Funciones de la capa:- Confiere resistencias a la desecación.- Impide la Fagositosis, es importante para las bacterias patógenas.- Está implicada en la patogeneidad del microorganismo.- Los microorganismos se adhieren a distintas superficies.- En el ambiente son capaces de formar los Biofilms (bacterias y arqueas que se

encuentran protegidos inmersos en un material polisacarídico) se supone una protección frente a cualquier tipo de agentes.

- Son características de microorganismos que nos producen la caries dental Streptococcus mutants.

- En Bacillus anthracis la cápsula esta formada por D-glutámico (proteínas).

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7. Capas S.Las tienen muchos procariotas, y se puede decir que es universal en las arqueas. Es de naturaleza proteica, además tienen una apariencia cristalina y las proteinas son capaces de cristalizar en los distintos niveles de cristalización.

Funciones de las capas S.- Son capas que protegen a la célula frente a rganismos patógenos.- También suponen una barrera que impide la entrada o salida de sustancias.- En muchas arqueas la capa S forma directamente la pared celular.

8. Fimbrias (Pili – Pelo).Son filamentos largos y rígidos a modo de vellosidades presenten en muchas de las Gram -, estas estructuras son de naturaleza proteica, a estas estructuras se las conoce con el nombre de pilina.

Fimbrias.Son más cortas y delgadas que los pelos, y generalmente se encuentran presentes en un número muy elevado hasta 1000 en una misma bacteria.En una fimbria podemos distinguir tres partes:

- Placa basal: que une la fimbria a la membrana externa.- Filamento: es la parte intermedia- Un proteína: llamada adsina.

La función de las fimbrias es la de adherir los microorganismos a cualquier superficie y no está implicadas en el movimiento.

Pelos.También están formados por la pilina.Son más largos y gruesos que las fimbrias, y suelen encontrarse en menor número, lo normal es 1 o 2, pero pueden llegar a tener 10.La función de los pelos es la del intercambio genético, también son zonas de reconocimiento de fagos y sirven para adherirse.Están condificadas en plásmidos, los llamados plásmidos conjugados, siendo F+ o F-.

9. Flagelo.La movilidad se debe a la presencia de unos apéndices largos denominados flagelos. Son helicoidales y pueden estar en diferentes posiciones en una célula. Si se encuentra en un polo se denomina flagelo polar:

- Si sólo tienen uno y se encuentra en un polo se dice que es flagelado monotrica.- Si tiene dos uno en cada lado se dice que es flagelado anfitrica.- Si tiene un penacho en uno o en los dos lados se dice que es flagelado lofotrica.

Si se encuentra alrededor de toda la célula se denomina peritrica.Se encuentran tres partes (de fuera hacia adentro):

- Filamento: se encuentra formando unidades de una proteína denominada flagenina que se unen unas con otras dejando un hueco central. Las propias proteínas llevan la información para el crecimiento del flagelo. Pasan por el hueco central y se van colocando en la parte externa.

- Gancho: es una zona formada por proteínas pero que no son flagelina, es más ancho y tiene una forma acodada.

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- Cuerpo basal: ya está anclado en la pared y membrana citoplasmática. También es de naturaleza proteica, está formado por un cilindro central que se dispone en anillos que varían si son Gram + (4 anillos) o – (2 anillos).En Gram – presentan un par de anillos que se encuentran en la pared celular, llamándose L al que se encuentra en el lipopolisacárido y P al que se encuentra en el peptidoglucano. los otros dos anillos se encuentran en la membrana plasmática llamándose S y M.En Gram + sólo se ven los dos anillos más internos, y se denominan de igual forma.Además de los anillos, rodeando a los anillos S y M se encuentran unas proteínas que actúan como el motor del flagelo, y son de dos tipos:· Mot: se encuentran envolviendo los anillos S y M y forman un tipo de empalizada, son de gran importancia para el movimiento del flagelo, porque para que se mueva se necesita energía, es decir ATP. Estas proteínas están implicadas en la generación del gradiente de protones, que producen ATP para que se mueva el flagelo. Genera una fuerza motriz.· Fli: actúan como conmutador para que el organismo se mueva es una dirección o en otra. Se mueven porque el flagelo rota. En las bacterias peritrica todos los flagelos se orientan hacia el mismo polo.Que una bacteria se móvil significa que va a poder moverse acercarse o alejarse de una sustancia tóxica o no.También las hay móviles pero sin flagelos, y se puede producir por:· Deslizamiento: secretan una sustancia que actúa de lubrificante y las va a permitir moverse, pero es un movimiento muy lento. Se trata de las mixobacterias.· Vesículas de gas: se dan en organismos acuáticos como en las cianobacterias, y producen movimientos en vertical únicamente.

10. Citoplasma.El citoplasma está formado por un 70% de agua, también de sustancias solubles y no solubles. Y no hay orgánulos rodeados de membrana unitaria.

- Ribosomas: realizan la síntesis de proteínas, son de 70 S, y están formados por dos subunidades: · 30 S es donde está el ARNribosómico 16 S y 21 proteínas.· 59 S está formada por ARNribosómico 23 S, 5 S y 34 proteínas.

- Nucleoide: se trata de la región dentro de la célula procariota donde se encuentra el cromosoma y los plasmidios, donde se encuentra el material genético que está formado mayoritariamente por cromosoma. El de bacterias es mayoritariamente ARN duplexo circular, pero también se conocen lineales y también se ha visto microorganismos con más de un cromosoma.Un plásmido es un ADN duplexo circular de un tamaño menor, están codificadas algunas proteínas, dan información que aunque no sea esencial para la bacteria si que le confiere ventajas selectivas. Suele estar codificando la utilización de compuestos recalcifrantes, resistencia a materiales pesados.

- Una serie de enzimas que están implicadas en el metabolismo celular.- Proteínas que se llaman chaperonas, que intervienen en el plegamiento de otras

proteínas. Si se pliega mal actúa para que se plieguen correctamente. Hay algunas que intervienen en el transporte de nutrientes de la célula.

- Sustancias de reserva, también acúmulos o inclusiones de reserva. Se trata de acúmulos de sustancias orgánicas o inorgánicas que están rodeadas o no de una

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membrana de naturaleza proteica (nunca unitaria) se originan en unas determinadas condiciones. Puede ser de dos tipos:· De naturaleza orgánica: 1) Inclusiones polisacarídicas: son el glucógeno y el almidón, son polímeros de

glucosa unidos por enlaces -1,4 con ramificaciones -1,6. constituyen una reserva de carbono para la célula y se forman cuando en el ambiente hay falta de nitrógeno.

2) Gránulos de poli--OH-butirato (PHB): estos son polímeros de un ácido graso 3-OH-butirato. Constituye una reserva de carbono para la célula, que se unen por enlaces ester. También se sintetizan si falta nitrógeno. Están envueltos por una membrana proteica. Son un tipo dentro de una clase más grande como los PHA.

3) Gránulos de poli-hidroxi-alcanato (PHA): son polímeros de alcanos. Estos tienen una gran importancia porque tienen características de termoplásticos biodegradables. La Alcaligenes eutrophus cuando crece en presencia de glucosa y de ácido propiónico que forma un copolímero ( un polímero formado por 3-OH-butirato y 3-OH-valérico), este es comercializado por una empresa inglesa ICI y recibe el nombre de Bioplo. También se trata de reservas de carbono.

4) Gránulos de cianoficina: constituyen una reserva de Nitrogeno, los formanlas cianobacterias. Con polímeros de ácido aspártico y a cada una de las unidades se le une una aspargina formando un copolímero de aspártico y arginina. Se formarán cuando falte algún componente necesario para la célula.

· De naturaleza inorgánica: constituyen una reserva de fósforo y azufre.1) Gránulos de polifosfato, denominados también corpúsculos metacromáticos

o también gránulos de volutina.Estos son polifosfatos, polímeros formados por fosfatos. Se ha visto que cuando se tiñen con azul, en el microscopio óptico se ven de color rojo.Son unas reservas de fósforo, se acumulan cuando empiez a faltar el azufre, a la espera de que haya azufre para que se puedan sintetizar aminoácidos.Los gránulos se utilizan en la eliminación de fosfato de las aguas residuales concretamente un organismo denominado acinetobacter. Se sabe que tienen un 21% de su peso en gránulos de pilifosfato.

2) gránulos de azufre. Constituyen una reserva de azufree, que son sintetizadas por unas bacterias quimiolitotrofas que utilizan SH2 como fuente de energía. También son acumulados por bacterias fotosintéticas, que oxidan el SH2 a azufre elemental y luego lo vuelve a oxidar a SO4 (sulfato).

11.Orgánulos de procariotas.No tienen membrana unitaria solo la tienen los tilacoides de las cianobacterias.· Carboxisomas: están presentes en bacterias fototrofas y en quimiolitotrofas, los dos tipos son autótrofos. Es dentro de estos orgánulos donde se encuentra la enzima del ciclo de calvin, la rubisco, que fija el CO2 atmosférico y lo convierte en sustancias orgánicas.Estos tienen aspecto poliédricos que derivan a esféricos y también están rodeados por una membrana proteica.· Clorosomas: están presentes en algunas bacterias fototrofas como es el caso de las bacterias verdes. Estos simplemente son vesículas de aspecto aplanado que se sitúan por debajo de la membrana plasmática y no tienen continuidad con ella, pero hay veces que

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están unidos a la membrana a través de un pedúnculo. La función de estos en las bacterias verdes es la de albergar algunos pigmentos que intervienen en la fotosíntesis en ausencia de oxígeno.· Vacuolas de gas: son unos organismos que tienen un aspecto muy refringente al microscopio óptico.Están constituidos por agrupaciones de vesículas de gas estas tienen una forma fusiforme o de cilindro bicónico. Las vesículas están rodeadas cada una por su membrana que es impermeable al agua pero permeable a los gases. Su función es la de permitir a las bacterias una movilidad en la vertical. Están presentes en bacterias acuáticas como es el caso de las cianobacterias. · Magnetosomas: son organismos sensores del campo magnético terrestre, están presentes en algunos acuáticos microaerófilos o en anaerobios. Los que primero se descubrieron fueron la Asquaspirillum magnetotacticum. Estos magnetosomas están envueltos por una membrana proteica y son gránulos de magnatita, donde las partículas de Fe actúan como un imán permitiendo al microorganismo que los posea orientarse de Norte a Sur.Algunas bacterias que viven donde hay mucho azufre, pueden formar también magnetosomas pero formados por greigena FE3S4, donde el Fe actúa como imán.Los delfines tienen magnetosomas que les sirve para orientarse.

12. Endospora bacteriana. Muchas bacterias Gram + tienen la capacidad de formar una célula latente llamada endosporas.Se diferencian muy bien al microscopio óptico, porque:· Son más refringentes que la célula vegetativa.· Se forman siempre en el interior celular.· Son muy resistentes a teñirse con colorantes básicos.No se forman durante el crecimiento activo de la célula sino que se originan cuando empieza a escasear el carbono.Algunas empiezan a formar esta estructura hasta que en el medio de cultivo aparezcan nutrientes nuevos.Cuando se ha formado se dice que la célula ha entrado n un estado de criptobiosis.Una vez formada la endospora sale de la célula y no tiene metabolismo, está en estado le latencia.Son muy resistentes al calor, radiaciones y también productos químicos que destruyen a la célula vegetativa.Este tipo de estructuras se da en los géneros Bacillus, Clostridium y Desusfotomaculum.Las endesporas se empiezan a formar en condiciones de escasez de nutrientes esenciales. En el momento en que empiezan a escasear los nutrientes, se producen unas respuestas:· Pueden ser capaces de sintetizar flagelos para su movilidad.· Empieza a sintetizar una especie de enzimas intra o extracelulares, que les permite utilizar otros nutrientes que en condiciones normales no se utilizarían.· Cuando se gastan estos nutrientes, se comienza el proceso de esporulación, formando endosporas. Cada célula madre da lugar sólo a una endospora.· La localización depende de la célula: central, subterminal, terminal. Puede ser que en algún género la endospora sea más grande que la célula madre y de esta forma la deforma.· No se trata de células relacionadas con la reproducción. Estas endosporas son fácilmente transportadas por el aire.

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Esporulación.Se trata del paso de la célula vegetativa a la endospora.Se ha estudiado mucho este proceso en el género Bacillus y se ha visto que aproximadamente desde que empiezan a faltar los nutrientes hasta que empieza el proceso pasan 8 horas.Este proceso de divide en 7 etapas:Etapa 0: partimos de una célula con duplicación cromosómica, no se divide y empieza a esporular.Etapa 1: el material genético se condensa formando una filamento axial.Etapa 2: se trata de la formación de un septo acéndrico (se forma más cerca de uno de los polos) en el que interviene solamente la membrana plasmática. Si está situado en un polo de la célula, se podría decir que una de las partes tendrá más material genético que la otra. Pero existen unas proteínas SpoIII que empujan el material genético para que haya el mismo material en los dos lados.Etapa 3: la membrana plasmática de la célula más grande empieza a englobar a la célula más pequeña. Transcurrida esta etapa la célula madre estará dividida en dos partes. La más pequeña tendría dos membranas formando un protoplasto y se le denomina preespora y en este momento la esporulación es irreversible.Etapa 4: en esta etapa se forman una estructura exclusiva denominado córtex, que se encuentra en medio de las dos membranas.Se empieza a depositarlo que se llama germen de la futura pared celular que también se deposita por encima de la membrana esporal externa.También empieza a entrar dentro de la preespora el ácido dipicolínico junto con iones calcio, de tal manera que dentro del protoplasmo el ácido se une con el ión formándose el dipicolinatocálcico. Esta sustancia contribuye a la pérdida de agua en el protpplasto. También para algunas esporas son capaces de sintetizar otra capa denominada exosporio. Esta sería la capa más externa.Etapa 5: se sintetizan otras capas fundamentales para la espora denominadas cubiertas. Se sitúan por fuera de la membrana esporal externa y son de naturaleza proteica.También en esta etapa van madurando las otras capas.Etapa 6: es una etapa de maduración. Pero sigue entrando calcio para unirse con el ácido.Etapa 7: una vez formada la endospora se produce la lisis de la célula madre y la endospora sale al medio.

Los organismos que son capaces de formar endosporas son los que se encuentran en el suelo, les ayuda a perdurar más tiempo en el medio.Composición de las capas.De dentro hacia fuera.

- Protoplasto: · Presenta material genético.· Una pequeña dotación de ribosomas· Un compuesto exclusivo (dipicolinatocálcico, que contribuye con la deshidratación del protoplasto para ser más resistente a las condiciones ambientales)· ARNpolimerasa(para sintetizar el ARNmensajero)· AMP y ADP, el ATP se forma gracias al 3-fosfoglicerico que cuando puede ocurrir la germinación se va a transformar en 2-fosfoglicéico y luego en PEP, liberando un fosfato que se unirá al ADP y lo formará.

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· También hay unas proteínas llamadas SASP. Están unidas al cromosoma celular, para hacerlo muy resistente ala luz ultravioleta. Y cuando empiece le germinación (de endospora a célula vegetativa) las proteínas se hidrolizarán para dar lugar a péptidos y amino ácidos para sintetizar otras proteínas.

- Membrana esporal interna.- Cortex: es un peptidoglucano más laxo, con menos entrecruzamientos que el

presente en la pared celular. Presentan modificaciones, aproximadamente el 15% de los aminoácidos son los mismos que en el peptidoglucano de la pared celular. Pero hay otros que solo tienen L-ala y otros que no tienen nada.Esto hace que como sólo una parte tienen los aminoácidos y otra no pues son más laxos. Este peptidoglucano no va a formar parte de la pared celular.

- Germen de la pared celular.- Membrana esporal externa.- Las cubiertas: constituyen una gran parte de la espora. Está formado por

proteínas ricas en cisteina y otros aminoácidos hidrófobos. Esto hace que la célula sea muy resistente a productos químicos.

- Exosporio: algunas bacterias al mismo tiempo que se forma este proceso forman otras proteínas amorfas pero generalmente cristalinas denominadas cuerpos parasporales como es el caso de Bacillus thuringiensis y Bacillus popillae. Estos cuerpos se forman cercanos a la espora o unidos a ella, inmersos en el exosporio.Cuando están en un pH alcalino se convierten en proteínas muy tóxicas para las larvas de muchos insectos, diciendo que son insecticidas biológicos.Su función es la de formar una célula para sobrevivir, si matan las larvas eso les sirve para la existencia de nutrientes.

Germinación.Proceso por el cual a partir de una espora se convierte en una célula vegetativa nuevamente.En este proceso que es más corto, se ha estimado una duración de 90 minutos y se divide en cuatro fases:Etapa 1: Preactivación. Se trata de la alteración de las cubiertas sometiendo a las esporas a temperaturas altas (hasta los 100ºC), produciendo cambios de pH (normalmente bajándolos), y por radiaciones ionizantes.Etapa 2: Activación. Se debe a un compuesto químico (generalmente). Este depende del microorganismo (iones, aminoácidos, bases nitrogenadas, ...). Esta molécula se une a un receptor que estaría situado en la membrana esporal interna y la unión desencadenaría una serie de hechos que llega a la síntesis de unas enzimas que empiezan a romper el cortex. Una vez roto ya empieza a entrar agua y sale el dipicolinatocálcico.Etapa 3: Germinación propiamente dicha. Se termina de romper el cortex, de degradar todas las cubiertas y se empieza a sintetizar la pared celular, se empieza a sintetizar el ATP, y la ARNpolimerasa empieza a actuar.Etapa 4: Terminación y crecimiento. Se termina de formar la célula vegetativa, en un principio esta célula si la hacemos la tinción se hace como Gram -, hasta que adquiere las características de Gram +.

Lección 4. Estructura y función de la célula de los microorganismos eucariotas.

Las células eucariotas son mucho más complejas y con mucho más orgánulos.

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Citoplasma.Está formado por una matriz citoplasmática formada mayoritariamente por agua. En ella se encuentran los orgánulos y el citoesqueleto (en procariotas no existe). Citoesqueleto: se trata de una red de túbulos conectados entre sí. Está formado por tres tipos de túbulos:

- Microfilamentos: se trata de filamentos de naturaleza proteica, de tamaño entre 4-7 nm de diámetro, participan en la forma y cambios de estas células, también en el movimiento celular.

- Microtúbulos: son también de naturaleza proteica, de unos 25 nm de diámetro, formados por una proteína llamada tubulina, que está formada a su vez por dos subunidades de esta uniéndose entre sí formando una estructura helicoidal. Participan en la forma, movimiento celular y movimiento intracitoplasmático. La tubulina forma parte de los flagelos, huso mitótico.

- Filamentos intermedios: con tamaños entre 8-10 nm de diámetro, y participa en el moviemiento.

En los procariotas existen unas proteínas que participan en la división celular, las Fts-Z; y las MreB que tienen un papel en la forma. Estas proteínas podrían ser las análugas de las eucariotas (actina y tubulina).

Orgánulos: - Núcleo: en proteínas se trata del nucleosoma (cromosoma y plásmidos).

En eucariotas está rodeado por una membrana nuclear doble y con poros, por donde el núcleo se comunica con el citoplasma. Dentro de este se encuentra la cromatina (formada por ADN, proteínas histónicas o no histónicas), también se encuentra el nucleoide (es una zona muy rica en ARN).

- Retículo Endoplasmático: no existe en procariotas.Se trata de una red de túbulos conectados con el núcleo por los poros. Puede ser de dos tipos: RER (con ribosomas, y en él se sintetizan proteínas) y el REL (sin ribosomas, y en el se sintetizan lípidos).

- Aparato de Golgi: no existe en procariotas.Está formado por sacos apilados, en la parte externa se encuentran unas vesículas secretoras.Secretan sustancias y sintetizan la parte polisacarídica.

- Mitocondrias: no existe en procariotas. La función la realiza la membrana.Se trata de un orgánulo con doble membrana , con crestas en el interior y con una matriz. Son los órganos energéticos de las células porque en ellos se sintetiza el ATP. En las crestas se produce la síntesis de ATP mediante la fosforilación oxidativa), en la matriz se produce el ciclo de Krebs.En procariotas la fosforilación oxidativa se da en la membrana citoplasmática.El equivalente de la matriz sería el citoplasma.Las mitocondrias provienen del ADN de la madre. El número suele ser de unas mil.

- Cloroplastos: no existen tampoco en procariotas.Se encuentran en algas. Se encuentran rodeados de una doble membrana. En el interior se encuentra el estroma y los tilacoides, que se agrupan formando el grana y al conjunto se la llama granum. En este orgánulo se realiza la fotosíntesis, en los tolacoides la fase luminosa y en el estroma el ciclo de kalvin.El análogo en procariotas es el carboxisoma porque tienen rubisco. En el estroma también hay ribosomas y ADN.

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- Ribosomas: existen en ambos. En eucariotas son de 80s (60s y 40s), y en procariotas son de 70s (50s y 30s).Están formados por ácidos nucleicos y proteínas.

Estructura de los flagelos y cilios.No hay cilios en procariotas, pero si hay flagelos.Los cilios y flagelos en eucariotas sirven para el movimiento celular, tienen citoplasma con membrana y tienen microtúbulos, 9pares y un par central.

Pared celular.Existen en algunos (algas y hongos) y en otros no (protozoos).La pared celular de los hongos está formada por un polímero (quitina formado por N-acetilglucosamina, pero también suelen tener glucano).En algas suele estar formado por clulosa, peptina y en algunos hay sílice y carbonato.

Membrana.Existen el procariotas y en eucariotas, pero son diferentes.En la de bacterias no hay esteroles a excepción de los micoplasmas, es igual a la de las eucariotas (si tienen esteroles, y se unen mediante enlaces ester).En archeas se encuentran unidos mediante enlaces eter.Los opanoides son exclusivos de procariotas.La endocitosis es exclusiva en eucariotas, mientras que en procariotas se da la translocación de grupos.

División.En procariotas por fusión binaria y en eucariotas la división celular.

Lección 5. Cultivo y crecimiento en microorganismos.

1. Requerimientos nutricionales.Para estudiar los microorganismos es imprescindible que estén en cultivos puros y por lo que hay que saber los nutrientes necesarios.Un nutriente es aquella sustancia del ambiente que es utilizada por los microorganismos para su metabolismo, pudiendo ser anabolismo:Síntesis de monómeros (azúcares, proteínas) polímeros (polisacáridos, lipoproteínas) estructura (pared celular, ribosomas, ácidos nucleicos).Y también el catabolismo para la obtención de energía, ATP.Esos nutrientes podemos dividirlos en distintos tipos:· Macronutrientes: son los que se necesitan en mayor cantidad (g/L o mg/L)

- Carbono: junto con el agua es uno de los nutrientes más abundantes. Está presente en todos los organismos vivos, formando parte de azúcares, ácidos grasos,... Los obtienen o bien por fijación del CO2 atmosférico (autótrofos) o de compuestos orgánicos (heterótrofos).

- Nitrógeno: normalmente 2g/L, forma parte de azúcares, proteínas, bases nitrogenadas, lípidos. Lo toman de moléculas orgánicas, de moléculas inorgánicas del suelo (en nitratos, amonio, en forma de sales), y también del Nitrógeno atmosférico (en simbiosis o de manera libre).

- Fósforo: va a formar parte de un montón de monómeros que van a formar parte de ácidos nucleicos, fosfolípidos, cofactores, algunas proteínas. Lo toman de compuestos inorgánicos (fosfatos).

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- Azufre: forma pate de aminoácidos, coenzimas. Se puede tomar a partir de compuestos orgánicos (aminoácidos) o de compuestos inorgánicos (sulfatos).

- Otros macronutrientes: · K+: se trata de un cofactor y activador de enzimas.· Ca2+: son termorresistentes a las esporas, y también son cofactores de enzimas.· Mg2+: Cofactor de enzimas y ribosomas.· Na+: actúa como estabilizador de halófitos.· Fe2+ y Fe3+: actúan como citocromos, proteínas y cofactores. En condiciones anaerobias el Fe es soluble en forma de Fe2+ y puede ser captado por microorganismos. En condiciones aerobias el Fe 2+ se oxida a Fe3+ (sólido), que va a poder ser captado gracias a que los microorganismos poseen sideróforos que son moléculas quelantes de hierro (unen el Fe y lo hacen soluble para que la célula lo pueda asimilar).

· Micronutrientes: son los que se encuentran en menores cantidades (g/L).- Cobalto: actúa en la síntesis de la vitamina B12.- Cinc: tiene un papel estructural en muchas enzimas.- Molibdeno: es necesario para la actividad de algunas enzimas.- Manganeso: es activador de muchas enzimas.- Cobre: forma parte del grupo prostético de muchas enzimas.

· Factores de crecimiento: no son esenciales para todos. Son cualquier compuesto orgánico de un microorganismo que requiere como constituyente o precursor de su material celular, y que no pueden sintetizar y tiene que ser suministrado.

- Aminoácidos.- Bases púricas o pirimidínicas.- Vitaminas: p- aminobenzoico, biotina, niacina, riboflavina, piridoxina, tiamina.

Energía.Hay una clasificación según la fuente de energía utilizada. Si es la luz se denominan fototrofos, y si es por la oxidación de un compuesto químico reducido se denominan quimiotrofos. Dentro de estos si son compuestos orgánicos se denominan quimioorganotrofos y si son compuestos inorgánicos se denominan quimiolitotrofos.Si juntamos la fuente de carbono y de energía:

Energía Carbono MicroorganismosFototrofos Autótrofos CianobacteriasFototrofos Heterótrofos Bacterias verdes, púrpurasQuimiolitotrofos AutótrofosQuimiolitotrofos Heterótrofos MixotrofosQuimioorganotrofos Heterótrofos

2. Medios de cultivo: composición y preparación.Los medios de cultivo son las soluciones nutritivas preparadas en el laboratorio para el crecimiento de los microorganismos. Los microorganismo que crecen en este medio se denominan cultivos microbianos.Primero hay que pesar todos los materiales (nutrientes)., una vez pesados se esteriliza y se reparte en placas, tubos.Tipos:

- Según su estado físico: · Sólidos: llevan agar (16g/L o 20g/L)

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· Semisólidos: más o menos entre un 4 y un 6% de agar.· Líquido: no contienen agar.

- Según su composición: · Medios sintéticos o definidos. Se conoce su composición química de forma exacta.· Medios complejos. No se conoce la composición química exacta, porque poseen extractos muy nutritivos, pero nutricionalmente indefinidos.Ejemplo: extracto de levadura, peptosas y caseínas.· Medios complejos + extractos (suero, sangre, tejidos). Son fastidiosos de crecer, se les denomina enriquecidos.

- Según su función: para aislar a microorganismos e identificarlos.· Medio selectivo. Posee sustancias que inhiben el crecimiento de unos microorganismo , permitiendo el crecimiento de otros. Ejemplo: Agar Saboureaud que se usa para el crecimiento de hongos. Poseen una serie de nutrientes y luego se le añade un antibiótico inhibiendo el crecimiento de bacterias.Un medio que contenga Cristal violeta de dice que es selectivo porque inhibe el crecimiento de las Gram +.Mientras que el ClLi, inhibe las Gram -.· Medios diferenciales. Contienen distintos compuestos químicos indicadores que nos permiten diferenciar unos organismos de otros. El color, porque aparezca algún alo.Ejemplo; Agar de sangre, el Levine “EMB”, para la Escherichia coli de color verde metálico.

Estos indicadores son generalmente los siguientes:· Rojo de fenol: se trata de un indicador de pH, a pH ácidos los medios son de color amarillo, y si es neutro son rojos.· Rojo neutro: es un indicador de pH, si son ácidos son rosados.· Púrpura de bromocresol: también se trata de un indicador de Ph, si son ácidos también son amarillos.Hay medios que pueden ser selectivos y diferenciales a la vez. Son los que contienen las dos propiedades a la vez.Un ejemplo es el medio McConkey y otro es el VRBA. El McConkey contiene cristal violeta, que inhive el crecimiento de las Gram +, también tiene el púrpura de bromocresal y contiene lactosa.Nos permite saber si hay organismos fermentadores de lactosa o no, produciéndose ácidos, virando el pH y pasando de púrpura a amarillo.

Otro medio que se utiliza mucho es el de enriquecimiento.Poseen sustancias que favorecen el crecimiento de un determinado grupo de microorganismos. En este tipo de medios no hay ningún tipo de inhividor.

Medios de mantenimiento.Se utilizan para conservar microorganismo en el laboratorio, son nutritivos,

Las condiciones físicas son también importantes. Factores a tener en cuenta para que crezcan:

- Temperatura.- Condiciones de crecimiento en cuanto a los gases, como es el caso del oxígeno.

Se clasifican en 5 grupos:

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· Aerobios estrictos: es aquel que necesita crecer en unas condiciones de oxígenos que corresponde a la presión parcial de oxígenos que hay en la atmósfera, un 20%.· Microaerófilos: son aerobios estrictos. En este caso solo puede crecer cuando la presión parcial se encuentra en torno al 10%.· Anaeróbicos o aerobios facultativos: son capaces de crecer tanto en presencia o no de oxígeno, tienen un mayor crecimiento en presencia de oxígeno.· Anaeróbios estrictos: no pueden vivir en presencia de oxígeno.· Anaeróbios aerotolerantes: pueden crecer tanto en presencia de oxígeno, como en ausencia, pero el oxígeno no lo utilizan para su metabolismo.Esta clasificación tiene una relación directa con el tipo de metabolismo. Todos los aerobios estrictos tienen respiración aerobia, y el oxígeno es el aceptor final de electrones, los microaerófilos también tienen respiración aeróbica.Los anaeróbicos o aerobios facultativos tienen una mayor versatibilidad metabólica. Pueden realizar la respiración aeróbica y también la anaeróbica, cuyo aceptor final de electrones es otra molécula oxidada. También hacen la fermentación, pero siempre en condiciones anaerobicas.Los anaerobios estrictos realizan la respiración anaeróbica y la fermentación.Los anaeróbios aerotolerantes nunca van a realizar la respiración anaeróbica. La mayoría de estos solo son fermentadores.

Cultivo de microorganismos anaeróbicos o microaerófilos.Crecen mejor en cultivos líquidos con agitación, para que aireen.Los anaerobios estrictos y microaerófilos se han de cultivar en jarras de anaerobios. Se introducen unos sobres denominados GAS PACK, con un generador de anaerobiosis, también presentan una catalizador de paladio.El sobre se corta y se añade agua, suelen llevar bicarbonato de sodio y un borohidruro. El bicarbonato produce CO2 y el borohidruro H2.Este H2 se combina con el O2 que hay dentro de la jarra, produciendo agua y quitando todo el O2 que hay en la jarra.El catalizador sólo se utiliza para catalizar la reacción.Para los microaerófilso siempre hay que utilizar un generador de CO2.

3. Obtención de cultivos puros.Los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas. Necesitamos tener unas técnicas para poder obtener los cultivos puros. Los cultivos puros son aquellos que solo poseen un único tipo de microorganismo que provienen todos ellos de una única célula, son todos clones de uno. Para obtenerlos vamos a usar medios sólidos, porque es microorganismo se queda fijo y empieza a producirse formando una colonia.Hay dos técnicas para conseguir cultivos puros:

3.1 Siembra por agotamiento.Usamos una varilla (asa de siembra) y un sólido. Se esteriliza la varilla y se toma una alícuota que se pone en el porta y se extiende. Se esteriliza otra vez la varilla y volvemos a extender de forma perpendicular a la anterior, así sucesivamente hasta que cada vez queden menos microorganismos. Esto de realiza para obtener colonias aisladas.

3.2. Disoluciones seriadas.

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Hay que hacer unas disoluciones decimales y luego una siembra en placas para obtener las colonias.Se toma una alícuota y se extiende con un asa de vidrio para obtener el medio.¿Para qué hacemos las disoluciones? Para que los microorganismos estén lo suficientemente alejados entre sí como para que se puedan formar las colonias.¿Qué nos permite esta técnica? Aislar cultivos puros y contar el número de microorganismos que había en la muestra original.Nunidades formadoras de colonias g o ml = Cnumero de colonias · 1/Disoluciones · 1/ inóculo

Una placa que contenga de 30 a 300 colonias son las mejores para estudiar un cultivo puro.

Colecciones cultivo.- Resiembras periódicas.- Congelación. Se preparan suspensiones del microorganismo y se mezcla con

glicerol del 20-40% a -20ºC.- Liofilización. Se elimina el agua de los cultivos. Los microorganismos se

mezclan con leche en polvo (ya con agua). Se congelan y la suspensión se mete en un liofilizador parra quitar el agua mediante sublimación. Se queda deshidratado, luego se mete en unas ampollas y se cierran al mechero.

4. Crecimiento microbiano.Crecimiento de una población microbiana: se le llama así al aumento en el número de células de esa población que se divide por fisión binaria.También se le denomina al aumento en el tamaño o masa celular de esa población, en el caso que se trate de organismos cenocíticos (la división del material no implica división celular).Velocidad de crecimiento de una población microbiana: se trata del cambio de la masa celular por unidad de tiempo.Tiempo de generación de una población microbiana: tiempo requerido por un microorganismo para duplicarse. Se le representa con la letra “g”.

4.1. Tasa.Una población microbiana que se duplica cada cierto tiempo tiene un tipo de crecimiento exponencial, que se representa como 2n, siendo n el número de generaciones que trascurren. Si lo representamos en una gráfica el número de células frente al tiempo sale una función exponencial.Si queremos calcular el número total de una población microbiana durante un tiempo de crecimiento exponencial tendremos que aplicar la siguiente fórmula:NT = N0 · 2n

NT: número total.N0: número inicial.2n: representación exponencial.Si tomamos logaritmos nos queda una línea recta y la fórmula sería la siguiente:Log NT = log N0 · n log 2Donde n = Log NT - log N0

Log 2También podemos relacionar n con el tiempo de generación, porque el tiempo de generación de una población microbiana que está creciendo exponencialmente será:g = t/nEste tipo de crecimiento no es para siempre.

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Ejemplo:Partiendo de una población inicial de una célula, que crece durante dos días y pesa 10-12

¿Cuánto pesará ese cultivo si crece de manera exponencial? Si el tiempo de germinación es de 20 minutos.G = t/n n = 144NT = N0 · 2n = 2,23 · 1043 microorganismos.El peso sería de 2,23 · 1031 g, que pasados a kg, serían 2,23 · 1028. Se trata de un peso mayor al de la Tierra que es 5,95 · 1024 kg y eso no podría ser.

5. Curva de crecimiento típica de una población bacteriana.La población microbiana pasa por 4 fases:

- Fase de latencia o fase lag: cuando inoculamos, no crece inmediatamente, tiene que pasar un tiempo hasta que empieza a dividirse o a aumentar su masa.Tarda un tiempo, porque el cultivo necesita sintetizar las enzimas, los ácidos nucleicos, las proteínas para que puedan crecer posteriormente.

- Fase exponencial: el número de células reajusta al crecimiento esponencial.Cada cierto tiempo (tiempo de generación) el número de células se duplica. El tiempo de generación está determinado geneticamente y también por las condiciones ambientales.Este tiempo de generación se va reflejar en la pendiente.No se trata de un crecimiento indefinido, porque los nutrientes empiezan a escasear y ya no pueden crecer más, y los propios microorganismos empiezan a secretar unas sustancias tóxicas en las que no pueden vivir.

- Fase estacionaria: el número de células se mantiene constante. Habrá unas células que viven y siguen creciendo yy otras que mueren, por lo que el balance meto es cero. Esta fase es muy importante porque se trata de una fase en la que se sintetizan los antibióticos, también se produce la esporulación.

- Fase de muerte: llega un momento en que las células empiezan a morir y vemos una disminución.

6. ¿Qué métodos se utilizan para estimar el crecimiento de una población microbiana?.Existen distintos métodos:

6.1. Recuento directo de microorganismos utilizando la cámara de Petroff- Hausser.Se trata de un porta especial que va a tener una ranura. Que tiene una altura de 1 mm y una superficie de 0,02 mm2, y entra un volumen de 0,02mm3.luego se lleva al microscopio y se ve.En el porta viene labrado una cuadrícula dividida en 25 cuadrados más pequeños. Hay que contar el número de células que observamos en cada uno de los recuadros, pero con que lo hagamos 5 o seis veces vale y luego se hace la media.Si ponemos 0,02 mm3 de inóculo y la media nos sales de 12 en cada cuadrado. Calcular cuantas células hay.

Inconvenientes de este método:No se distingue entre las células vivas y las muertas. Muchas veces el inóculo no está siempre limpio. Y hay algunas bacterias que no se pueden distinguir.

6.2 Contadores electrónicos de células o de Counter.

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Estos contadores miden resistencia eléctrica de lo que pasa a través de él. Cuando pasan células hace que aumente la resistencia.Desventajas.No distinguen entre células vivas o muertas. Tampoco distinguen las células de cualquier sustancia sólida que haya en el medio.

6.3. Recuentos de viables.Número de células de esa población que esta viva. Cada célula viva que pongamos en un medio sólido dará lugar a una colonia, pudiendo contarlas y saber así el número de células que habría.Primero se hacen disoluciones sucesivas, normalmente decimales.Luego se siembra en placas.Siembra en masa:Partimos de placas vacías, ponemos un mililitro de inóculo, se vierte en el medio de cultivo, se mueve bien la placa, se deja secar, se incuba y por último se cuenta.Siembra en superficie:Placas con el medio, ponemos el inóculo, con el asa de siembra ponemos el microorganismo en la superficie y dejamos que crezcan.

6.4. Método del número más probable.Para una muestra problema cuantificar los microorganismos. Es un método estadístico. Se parte de tres series de tubos, de tres o cinco cada una de ellas. La primera tiene 10ml del medio de cultivo que estemos utilizando, depende del microorganismo que queremos determinar, se inocula con 10ml. La segunda serie tiene 9ml de cultivo y se inocula con 1ml. Y la tercera serie de 9,9mln de medio de inocula con 0,1ml.Se incuba, y se mira a ver si son positivos o negativos. Mirando si ha fermentado y formado una burbuja.En cada serie se mira cuales son las positivas, en unas tablas se ve reflejado el número más probable, pero suele haber unas por encima y por debajo, se mide en 100ml.

6.5. Determinación del paseo seco.Este tipo de estimación es obligatorio por los organismos cenociticos, para los hongos filamentosos y también para la bacterias filamentosas.Consiste en poner el el microorganismo en un matraz con un medio y luego lo dejamos crecer. Usando la filtración o centrifugación.Se preparan una serie de filtros y se taran (pesan), en un embudo Bunchen colocamos el filtro. El embudo se pone en un kitasato y lo conectamos a una bomba de vacío. El microorganismo se queda en el filtro y el medio en el matraz.Se pone a secar en una estufa 24 horas, se saca y se pesa y por diferencia tenemos lo que pesa.

6.6. Turbidez.Sólo se aplica para organismos unicelulares o para esporas. Se basa en que cuanto mayor sea el número de organismos habrá mayor turbidez. Se mide en un espectrofotómetro, tomamos medidas de absorbancia. Se medie con valores entre 560-600nm.Se puede hacer también una curva, absorbancia crecimiento.No solamente se puede hacer esto, esta técnica se uas mucho en los laboratorios, hay una técnica que mezcla dos de las técnicas, que nos permite saber cuantos microorganismos ponemos en un determinado momento.

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Se puede hacer una gráfica turbidez número de viables.En la misma muestra en la que medimos la turbidez, hacemos un recuento del número de viables, con las diluciones, y luego siembra en masa o en superficie.

6.7. Otras técnicas.Filtración de membrana: se trata de filtros de un tamaño de poro que retienen las bacterias y se suele usar de 0,45m o 0,25m.Se utiliza cuando la muestra tiene poca cantidad de microorganismos. Los filtros los vendes esterilizados o sin esterilizar.Los filtros se colocan en el embudo, lo conectamos a un kitasato y éste a una bomba de vacío. Echamos la muestra, quedándose los microorganismos en el filtro, para posteriormente sembrarlos en un medio de cultivo y dejarlo crecer para poder contar las colonias.Esta técnica sirve no sólo para contar microorganismo, sino también para que el medio de cultivo se esterilice.

7. Factores fisico-químicos que influyen en el crecimiento.Hay una serie defactores que van a influir en el crecimiento.

7.1. Clasificación de los microorganismos en función de su temperatura de crecimiento.La temperatura es uno de los factores que más influyen en el crecimiento de los microorganismos, porque todos los microorganismos tienen una temperatura mínima, por debajo de la cual no crecen, una temperatura máxima por encima de la cual no crecen, y una temperatura óptima.Esta temperatura óptima siempre se acerca más a la máxima.Es importante porque influyen en la velocidad de crecimiento. Va a influir en las condiciones de desarrollo de los microorganismos. También influye en todos los procesos metabólicos.Atendiendo al rango de temperatura se clasifican en cuatro grupos:

- Microorganismos Psicrofilos: son aquellos que tienen un rango de crecimiento con un mínimo inferios a 0ºC, un óptimos menos de 15ºC y un máximo de 20ºC. Se encuentran en ambientes fríos. ¿Por qué crecen a esas temperaturas? Porque han tenido unas determinadas adaptaciones a ellas:· Proteínas: son mucho más ricas en aminoácidos hicrofílicos que en aminoácidos hidrofóbicos.La estrusctura secundaria presenta una mayor cantidad de - hélices que de -lámina.· Membranas plasmáticas: en bacterias presentan ácidos grasos insaturados para que no se solidifique. En Archeas las cadenas de isoprenoides tendrán más instauraciones.· Acúmulos de agentes crioprotectores como el glicerol.· Enzimas que actúan perfectamente.

- Mesófilos: tienen un rango de crecimiento con un mínimos de 15ºC, un óptimos entre los 30-37ºC, y una temperatura máxima de 45ºC.Son la mayoría. Las patógenas van a ser siempre mesófilos.Hay algunos microorganismos que siendo mesófilos son capaces de crecer a temperaturas de refrigeración y se les denomina psicrotrofos o psicotolerantes.

- Termófilos e hipertermófilos: crecen a temperaturas muy altas.

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Los termófilos tienen un rango de crecimiento con un mínimo de 45ºC, un óptimo de 55-56ºC y una temperatura máxima de 80ºC. Son los que viven en el compost (abono).

Los hipertermófilos tienen el rango mayor que se conoce, tienen unas temperaturas mínimas de 65ºC, un óptimo de 80ºC y unas temperaturas máximas de 114ºC. Viven en zonas volcánicas, aguas termales.

Adaptaciones a las altas temperaturas.- Las proteínas, las enzimas de los microorganismos tienen su óptimo de

actuación a temperaturas elevadas. Para ello estas proteínas poseen densos empaquetamientos de aminoácido hidrofóbicos en la parte interna de su estructura terciaria y cuaternaria. Esto hace que la proteína sea más resistente a la desnaturalización en el ambiente acuático del citoplasma en el que están.También las proteínas están protegidas porque estos microorganismos producen diinoislo P y el diglicerol P que estabilizan las proteínas.

- Las membranas. La membrana plasmática en el caso de bacterias poseen ácidos grasos saturados y en el caso de archeas existe un tipo de membrana en monocapa.

- ADN. Presenta protecciones. En los organismos producen un compuesto que es el 2-3-difosfoglicerato potásico cíclico que ayuda o impide la desnaturalización de las bases púricas.Poseen una enzima que es una topoisomerasa denominada girasa inversa que introduce vueltas al ADN en sentido inverso al ADN normal. Esto le hace que sea un ADN más resistente.También poseen unas proteínas similares a las histonas que estabilizan también la molécula de ADN.

- Hay una mayor cantidad de chaperoninas.

8.2. Clasificación de los microorganismos en función del pH del medio.Hay organismos que viven en ambientes muy ácidos y otros en ambientes muy básicos pero lo normal es entre 6 y 8 de pH. Se clasifican en:

- Acidófilos: viven en ambientes ácidos entre 0 y 6.- Neutrófilos: viven en ambientes neutros, de ahí su nosmbre, en hambientes con

un pH entre 6 y 8.- Basófilos: viven en ambientes con un pH entre 8 y 14.

Independientemente del pH del medio, el pH interior de la célula se encuentra entre 6 y 8.

8.3. Efectos de la concentración del ClNa en el crecimiento de los microorganismos.El agua tiene que estar disponible, esto no depende de la cantidad de agua que haya en el medio, sino también de solutos.Para un organismo es muy importante la actividad del agua (Aw): el agua disponible para un organismo que hay en un determinado ambiente. En física es la presión de vapor que hay en un ambiente, partido por la presión de vapor del agua pura.Aw = P1 /P0

Es un valor que tiene como máximo 1.La Aw del suelo se encuentra entre 0,9.La presencia del ClNa es determinante en las bacterias marinas. Dependiendo del ClNa que haye en el medio se clasifican en:

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- Halófilos: necesitan ClNa para vivir. Lo necesitan para estabilizar sus membranas dentro de estos hay otra degradación:

o Discretamente halófilos: 1-6%o Moderadamente halófilos: 6-15%o Halófilos extremos: 15-30%

En el mar se consideran que son discretamente halófilos.Cuando un organismo vive en un ambiente donde la cantidad de ClNa es muy alta tienen que tener adaptaciones, porque si no las tuviese se producirían plasmólisis. En una salina lo que va a ocurrir es que va a salir agua de la célula, para evitar esto las bacterias sintetizan solutos compatibles, que son compuestos que se encuentran en el citoplasma para igualar la cantidad de soluto entre el medio y el interior celular, para que no haya salida de agua.En las bacterias más extremas el soluto compatible es el Potasio y equilibra la concentración de solutos. También actúan los aminoácidos pero no los esenciales, carbohidratos, alcoholes y otros como el dimetilfosfoprotonato.

- No holófilos: no necesitan ClNa para vivir.o Halotolerantes: pueden vivir en presencia de unas cantidades de ClNa.

Hay algunos organismos que viven en presencia de azúcar, que también hace que disminuyan la cantidad de agua en el ambiente.Los microorganismos que son capaces de crecer cuando la cantidad de agua e muy baja se les denomina osmófilos, estos son los hongos (osmofilamentosos y levaduras).

8.4. Clasificación de los microorganismos de acuerdo a su tolerancia al O2.En función de la presencia de O2 en el medio se clasifican en:

- Aerobios estrictos. Tienen que vivir en presencia de oxígeno.- Anaerobios estrictos. Viven sin presencia de oxígeno, su presencia les mata.- Anaerobios o aerobios facultativos. Viven en ausencia y presencia de oxígeno,

pero viven más en presencia de oxigeno.- Microaerófilos. - Anaerobios aerotolerantes. No usan el oxígeno

El metabolismo que se realiza en presencia de oxígeno, produce respiración aeróbica, el aceptor final de electrones en la cadena en el oxígeno. Durante el proceso se generan unos radicales tóxicos, a partir de este oxígeno.02 + 4e

- + 4H+ 2H2OLos radicales son los siguientes:

- Superóxido: se forma cuando el oxígeno acepta un electrón, se forma este radical inestable que es más tóxico que el oxígeno, formando O2

-.Es capaz de oxidar cualquier componente celular, pero se suele oxidar en lípidos produciendo una destrucción de las membranas.

- Si este O2- toma un electrón y dos protones se forma el peróxido de hidrógeno.

H2O2.- Cuando el H2O2 se une a un electrón y a un protón se forma agua pero se forma

el radical más tóxico para cualquier célula, el OH.- Cuado el OH se une a un electrón y un protón se forma el agua.

Los más tóxicos son el O2- y el OH. Los microorganismos tienen enzimas que

son capaces de destoxificar los radicales.· Superróxido dismutasa: destoxifica el O2

-. O2- + O2

- + 2H+ H2O2 + O2

Los microorganismos tienen también enzimas para destoxificar el H2O2

· Catalasa: destoxifica el H2O2. H2O2 + H2O2 2H2O + O2

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· Peroxidasa: también destoxifica el H2O2.Si los microorganismos tiene enzimas para destoxificar H2O2 no se forma OH, pero si se llega a formar no hay ninguna enzima que lo puedan eliminar.Los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos disponen de catalasa y superóxidasa dismutasa. Los que no tienen catalasa tienen peroxidasa.Los anaerobios estrictos no presentan ninguna de estas encimas.Los anaerobios aerotolerantes generalmente no tienen catalasa, pueden tener algunos de ellos peroxidasa y superóxido dismutasa.Aquellos organismos fototrofos que viven en condiciones aerobias, como consecuencia de realizar la fotosíntesis axigénica se puede formar un radical tóxico denominado radical singlete.El 3O2 tiene los dos electrones desapareados de la última capa paralelos.El 1O2 tiene los dos electrones desapareados de la última capa antiparalelos.Los organismos fototrofos generalmente son pigmentados que protegen la formación del radical singlete.

Lección 6. Control del crecimiento microbiano.

Esterilización proceso de destrucción de toda forma de vida de un objeto o material, incluida las endosporas, virus, tiroides, etc.No tienen grado, no hay objetos o materiales más estériles que otros.Desinfección proceso de destrucción de microorganismos patógenos produciendo enfermedades trasmisibles de cualquier objeto o material, no implica destrucción de endosporas. De aquí sale el nombre de desinfectante.Antisepsia cuando el proceso se aplica sobre tejidos vivos. Antisépticos: desinfectan la piel.Germicida agente físico o químico que mata los microorganismos, no tienen porqué eliminar las endosporas.

- Esporicida: todo aquel que destruye los microorganismos y endosporas.- Fungicida: el que mata a los hongos.- Bactericida: mata a las bacterias.- Fungiestático: detiene el crecimiento del hongo.- Bacteriestático: detiene el crecimiento de las bacterias.

Saneamiento/ higienización proceso por el cual reducimos el número de microorganismos tanto patógenos como no hasta unos niveles aceptables en salud publica.Asepsia ausencia de microorganismos.Septis presencia de microorganismos.

1. Métodos físicos que se utilizan para regular el crecimiento de los microorganismos.a) Temperatura:· A altas temperaturas es el método más barato y más usual.

1) Calor seco:- Horno Pasteur: en él se esterilizan utensilios de vidrio vacíos, utensilios pulverulentos. Dos horas a 180ºC, produciendo así una esterilización.- Incineración: se utiliza para el asa de siembra, se hace a la llama del mechero hasta la incandescencia, también se usa para ropas y el material biológico.- Flameado: se utiliza para las bocas de los tubos y matacres.Esta esterilización se produce por la oxidación de los componentes celulares, este proceso tarda más que el del calor húmedo.

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2) Calor húmedo: en este proceso se rompen los puentes de hidrógenos entre los componentes. Hay distintos tratamientos:- Ebullición: a 100ºC, nos aseguramos de que mueren las células vegetativas de los microorganismos y los agentes patógenos, pero no las endosporas, no sería una esterilización.- Autoclave: se trata de un aparato que nos permite la esterilización de los materiales, siempre y cuando nosotros trabajemos sobre presión. Tienen una rejilla con una resistencia donde añadimos el agua. Tiene un termómetro y un manómetro. Tiene una espita por donde sale el vapor. Cerramos la tapa, pero sin cerrar la espita (trabaja a vapor fluyente, no hacemos esterilización), al rato cerramos la espita, y comienza a aumentar la presión. Podemos poner la presión que queramos (1atm = 121ºC) durante 15 o 20 minutos, consiguiendo así una esterilización.Podemos aumentar hasta 126ºC siendo 1,4 atm aproximadamente.Se utiliza para los medios de cultivo a excepción de aquellos que contengan glucosa o grandes cantidades (se carameliza).Para los cultivos que tienen productos lábiles no se pueden esterilizar a estas temperaturas, se hace mediante filtración.- Tindalización Tyndall: se utiliza para medios de cultivo con glucosa. Consiste en someter al medio a calor fluyente durante tres días consecutivos incubando ese medio a 37ºC entre tindalización y tindalización. Al incubarlos a 37ºC germinan dando lugar a células vegetativas, al día siguiente se vuelve a hacer lo mismo, para matar a las células que hayan crecidos, y así durante tres días. De esta forma aseguramos que el material esté estéril.- Pasteurización: se trata de un tratamiento de calor húmedo. Es un proceso por el cual se somete a calos para eliminar los organismos patógenos a 62,8ºC durante 30 minutos. Esta temperatura se calculó para Mycobacterium y Coxiella. No está estéril. Actualmente se utilizan temperaturas de 72ºC durante 15 segundos.- UHT: uperización, se consigue la eliminación de cualquier forma celular de vida. Se pone a 140ºC durante 1 segundo.

· A bajas temperaturas: utilizando temperaturas de refrigeración (4-8ºC) y de congelación, que se trata de temperaturas por debajo de los 0ºC.Se trata de un efecto estático, que inhibe el crecimiento de los microorganismos pero no los mata.

b) Filtración: Se utiliza para materiales termolábiles, como es el caso de los antibióticos, enzimas, urea,…Se trata de unos filtros de celulosa que impiden el paso de microorganismos. Se colocan en un soporte que lo unimos a un receptor donde colocamos la solución líquida. Se coloca sobre un kitasato unido a una bomba de vacío. Los microorganismos se quedan en el filtro y el líquido se va a esterilizar. Existen unos filtros que se colocan en distintos dispositivos que sirven para que en la sala donde se encuentran la mantengan libres de gérmenes, por ejemplo en una sala de hospital.El tipo de filtros que se utilizan en las salas blanco se denomina HEPA, son filtros con un tamaño de partícula hasta 0,3 µm.

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Las campanas de flujo laminar, puede que sean horizontales (desde el panel) o verticales (el aire pasa de arriba abajo). Presentan una lámpara de luz ultravioleta que se tiene que conectar 15 minutos antes para la desinfección.

c) Desecación:Se trata de la eliminación de agua para que los microorganismos no puedan crecer. Se utilizan para alimentos desecados y deshidratados.También produce un efecto estático.

d) Uso de radiaciones:Tienen distintos efectos sobre el crecimiento, dependiendo de la longitud de onda y el tiempo que esté actuando sobre los microorganismos.

- Radiación no ionizante: nos referimos a la radiación ultra-violeta con una longitud de onda entre 200 y 280 nm, pero la más efectiva está alrededor de los 254nm.Efectos: forma dímeros de timina, impidiendo la replicación de los ácidos nucleicos. La radiación ultra-violeta se utiliza para la desinfección del aire, superficies, agua (residuales o bebible).Las radiaciones ultra-violetas tiene poca capacidad de penetración (hay que utilizar directamente estas radiaciones con los microorganismos).Hay que tener precauciones, usar gafas, desconectar la máquina para no quemarnos.

- Radiaciones ionizantes: se diferencian en que la longitud de onda es muchísimo más pequeña y los efectos van a ser más nocivos para los microorganismos. Se creó la necesidad de utilizan una esterilización fría y es en la que se utilizan las radiaciones ionizantes.Las radiaciones que más se utilizan son la de rayos X y la de rayos γ.Dependiendo del tiempo y de la radiación se producirán distintos tipos de esterilización. Efecto: esta radiación produce una energía capaz de arranca electrones de los átomos produciendo radicales muy tóxicos, como lo son el OH y el H.Son capaces de degradar las proteínas las proteínas, ácidos nucleicos, membranas,…El efecto que producen estas radiaciones es –cida (que matan).Se utilizan para material quirúrgico, farmacéutico, hormonas, alimentos (conservas), para las patatas (impedir la maduración).Cualquier producto que este irradiado tiene que aparecer señalado en la etiqueta.

2) Control de crecimiento microbiano por agentes químicos.a) Fenol y derivados.Actualmente son muy poco utilizados. Presentan una acción desinfectante, para el control de las bacterias, sobre las membranas haciendo poros, en enzimas, proteínas estructurales,…Fenol: compuesto que fue el primer antiséptico que se utilizó. El problema es que desprende un olor desagradable y que es tóxico.Derivados fenólicos: hay de dos tipos.

- Cresoles: formados por Lysol (orto-fenilfenol) forma parte del jabón, cosméticos, no debe usarse como antisépticos en heridas abiertas o piel inflamada,

- Hexaclorofeno: se le añade Cl, para incrementar la actividad antimicrobiana.

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b) Clorohexidina: es una alternativa al hexaclorofeno. El modo de acción es la unión del lipopolisacárido y también a las proteínas.Las lesiones las produce mediante las membranas. Sería un desinfectante antiséptico, antibacteriano, antifúngico, pero no es un esporicida.Uso: colutorios bucales, pasta de dientes,…

c) Halógenos: es otro grupo que se utiliza en los microorganismos.Hemos de distinguir entro desinfectantes y otros halógenos que tienen una función antiséptica.El yodo se va a unir con el aminoácido tirosina de las proteínas y se forma diyodotirosina, lo que da lugar a una inhibición de las proteínas.Usos: se utiliza como yodóforo (en combinación con un detergente) un ejemplo es el betadine. Para la desinfección de la piel y tratamiento de heridas.El cloro tiene una acción más como desinfectante en superficies o de objetos. Esta función le viene dada por al ácido hipercloroso que se forma al añadir Cl2 al agua. Este ácido es un fuerte agente oxidante que impide el funcionamiento de muchos sistemas enzimáticos.Usos: se puede utilizar en forma de gas, o en combinación con otras sustancias químicas. El gas cloro se utiliza para desinfectar el agua de bebida, piscinas, aguas residuales,…Otros compuestos de Cl que se utilizan como desinfectantes eficaces son la cal (hipoclorito cálcico), la lejía ( hiperclorito sódico) y las cloraminas.

d) Alcoholes (etanol e isopropanol):Destruyen eficazmente bacterias y hongos, pero no las endosporas y los virus desnudos.Modo de acción: desnaturalización de las proteínas; alteración de las membranas al disolver los lípidos.Usos: se emplean como desinfectantes de superficies (etanol al 70%) y también como antisépticos (lavado rápido de la piel antes de las inyecciones). No se recomienda en heridas abiertas. Es más efectivo en isopropanol al 70% que en etanol.

e) Metales pesados:modo de acción: se combinan con los grupos –SH de las proteínas y producen la desnaturalización de las mismas. Presenta una acción oligodinámicas, en concentraciones muy pequeñas.

- Plata: actúa como antiséptico. Una solución de nitrato de plata al 1% se utilizaba para evitar la “oftalmia neonatorum”, infección ocular que podía aparecer en los recién nacidos si la madre padecía una infección gonocórica.

- Mercurio: actúa como antiséptico. Se utilizan compuestos orgánicos de mercurio: Mercurocromo y el Mertiolato. Son antisépticos de la piel y mucosas.

- Cobre: en forma de sulfato de cobre se utiliza como alguicida: también para evitar el enmohecimiento de las pinturas.

- Cinc: en forma de cloruro de cinc, se utiliza para colutorios bucales. En forma de óxido de cinc, como antifúngico de pinturas.

f) Agente tensoactivos:- Jabones: consiguen la eliminación mecánica de los microorganismos mediante

frotamiento. Antisépticos.- Detergentes:

· Aniónicos: actúan como higienizantes. Limpieza de utensilios y equipos.

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· Catiónicos: los más utilizados son los compuestos de amonio cuaternarios. Son bactericidas, especialmente frente a Gram + y menos eficaces frente a Gram -. Son también funguicidas, amebicidas y viricidas (virus con envoltura). No destruyen endosporas. Parece ser que su modo de acción es alterar la permeabilidad celular, provocando la pérdida de constituyentes citoplasmáticos esenciales, como el K. Se utilizan como antisépticos de la piel y mucosas, y como desinfectantes de instrumentos, utensilios, artículos de goma.

g) Ácidos orgánicos: En general se utilizan como conservantes para controlar el crecimiento de hongos.

- Ácido sórbico (sorbato potásico). Inhibe el crecimiento de hongos en quesos y otros alimentos ácidos.

- Ácido benzoico (benzonato sódico). Es un eficaz antifúngico a pH bajos. Se utilizan para bebidas refrescantes y alimentos ácidos.

- Derivados del ácido benzoico (metilparabén y propilparabén). Inhibición del crecimiento de hongos en cosméticos líquidos y champús. Actúan a pH neutro.

- Propionato sódico. Inhibición del crecimiento de hongos en panadería.

h) Aldehidos:Son eficaces antimicrobianos. Actúan inactivando las proteínas, formando enlaces covalentes entre varios de sus grupos funcionales (NH2, OH, COOH, SH).

- Formaldehídos: es un excelente desinfectante. Se utiliza frecuentemente en solución acuosa al 37% (formol), para conservar muestras biológicas e inactivar bacteris y virus. Utilizado en forma de gas puede ser esterilizante. Muy irritante, olor desagradable.

- Glutaraldehido: es menos irritante. Se utiliza para esterilizar instrumentos químicos, equipos de respiración asistidas, etc. Es considerado como esterilizante.

i) Esterilizantes químicos gaseosos:- Óxido de etileno: es el gas que más se utiliza.

Modo de acción: desnaturaliza proteínas, reemplezando los grupos SH, COOH, OH, por grupos alquino (CH2-CH2-OH). Es un agente esterilizante, muy penetrante. Se utiliza para esterilizar instrumentos y equipos médicos, material desechable de plástico.

- Otros gases: óxido de propileno y -propiolactona. Presentan el inconveniente de que son considerados posibles carcinógenos.

j) Agentes oxidantes:Modo de acción: oxidan compuestos celulares de los microorganismos.

- Ozono (O3): se trata de una forms del oxígeno muy reactiva. Es un agente antimicrobiano eficaz. Se utiliza para la desinfección del agua. Actualmente hay un gran interés por sustituir el Cl2 por el O3.

- Peróxido de hidrógeno (H2O2): es un antiséptico que se encuentra en la mayoría de los botiquines caseros. Es también un buen desinfectante de algunos objetos, por ejemplo las lentillas.

- Peróxido de Cinc: se utiliza para irrigar heridas profundas, donde el O2 liberado inhibe el crecimiento de microorganismos anaerobios.

- Peróxido de benzoilo. Se utiliza para el tratamiento de heridas infectadas por patógenos anaerobios; también en el tratamiento del acné.

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k) Agentes quimioterapéuticos: agentes sintéticos y antibióticos.Un agente quimioterapéutico es un compuesto que se utiliza por vía interna, con el fin de controlar las infecciones. Su principal propiedad es su toxicidad selectiva: tiene que dañar al organismos patógeno sin hacerlo a las células del hospedador. Los agentes sintéticos son compuestos de sintetizados en un laboratorio.Los antibióticos son compuestos químicos producidos por microorganismos, que inhiben el crecimiento de otros microorganismos. La mayor parte son producidos por hongos, Streptomyces, algunos Bacillus.Las dianas de estos microorganismos son varias:Dianas: donde actúan para tener esta inhibición.

- Pared celular: Penicilinas, Cefalosporinas. Estos dos grupos son β- lactámicos, porque tienen un anillo. Su acción es inhibir la síntesis de la pared celular. Concretamente su acción es sobre unas enzimas transpectidasas, participan que en se formen puentes peptídicos entre las cadenas de glucano.En el caso de la penicilina la que más se utilizaba antiguamente era la penicilina G, pero actualmente hay una gran variedad de esta porque la penicilina G sólo era efectiva en Gram +.Hay muchos microorganismos que se han hecho resistentes frente a las penicilinas. Estos dicen que son resistentes a los β- lactámicos, porque presentan la β- lactamasa, rompiendo el anillo de β- lactámico.

- Síntesis de proteínas: ribosomas. Hay antibióticos que inhiben a las subunidades 50s y 30s. Los que actúan sobre la subunidad 50s es la Eritromicina. El antibiótico que actúa sobre la subunidad 30s son muchas más, como es el caso de la Estreptomicina.

- Ácidos nucleicos: dentro de estos hay diferentes mecanismos:· Alterar la formación del ácido fólico. Este tipo de antibióticos no nos perjudican. Los antibióticos que actúan sobre este son las sulfamidas y el trimetroprim.· Acción importante sobre la ADN girasa, superenrollamiento del ADN en los microorganismos. Los agentes sintéticos más importantes son las Quinolonas (ácido nalidíxico o el ciprofloxacino).

- Membrana plasmática: en estas actúan las polimixinas.

Lección 7. Fundamentos del metabolismo microbiano.

1. Concepto de metabolismo.Conjuntos de reacciones químicas que tienen lugar en una célula. Estas reacciones pueden ser de dos tipos:

- Catabólicas: catabolismo, tiene como objetivo la obtención de energía.- Anabólicas: anabolismo, se dan porque son necesarias la síntesis de monómeros

que dan polímeros, y por último constituyentes.El crecimiento celular es un proceso en el que anabolismo y catabolismo están íntimamente relacionados.En el catabolismo trata con sustancias de desecho, y la energía la obtienen de la biosíntesis, el transporte celular y el movimiento celular.Los organismos son capaces de itilizar distintas fuentes de energía. En función de donde la obtengan se clasifican en:

- Fototrofos, de la luz.- Quimiotrofos, de compuestos químicos, que pueden ser de dos tipos.

· Inorgánicos Quimiolitotrofos.

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· Orgánicos Quimioorganotrofos.Los organismos también necesitan sustancias para su anabolismo, las sustancias que emplean son fuentes de carbono como:

- Fijadores de CO2 Autótrofos.- Compuestos orgánicos Heterótrofos.

La fuente de electrones o fuente de poder reductor, generalmente coincide con la fuente de energía:

- Compuestos orgánicos Organotrofos.- Compuestos inorgánicos Litotrofos.

De la fuente de energía se obtien ATP que se utiliza para la biosíntesis y para actividades celulares (movimientos,...)Algunas moléculas producidas en el catabolismo se usan también en el anabolismo.

2. Quimiotrofos.En los organismos vivos, en los sitemas biológicos, la conservación de la energía en forma de moléculas de alta energía implica reacciones de oxido-reducción, denominadas reacciones redox.La oxidación es la pérdida de electrones y la reducción, la ganancia de electrones, pero en la química de la vida no se implica la pérdida o ganancia de electrones, sino que la oxidación implica una pérdida de átomos de hidrógeno, es decir una pérdida de protones y de electrones.

H2 2H+ + 2e-. Cuando el H pierde los dos protones y los dos electrones son aceptados por otras moléculas, como es el caso del oxígeno. ½ O2 + 2H+ + 2e- H2O.El donador de protones y electrones, diríamos que es el donador y el que los acepta, es el aceptor. Por lo tanto el donador tiene que ser una molécula reductora, es decir, un reductor siempre tiene que estar reducido. El aceptor es un compuesto oxidado que se reduce formando un compuesto reducido. El donador siempre está reducido y el receptor es una molécula más oxidada que el donador.Al oxígeno, al ser el más oxidado, se le va a denominar aceptor final de electrones.Los compuestos químicos varían en cuanto a su tendencia a ceder o ganar electrones. Esta tendencia se expresa como potencial de reducción, se expresa con la letra “E” y se mide en Voltios (V). Además los potenciales de reducción se expresan como mitades de reacción, de tal manera que siempre se expresan como pares, poniendo: oxidante/ reductor y hay siempre un potencial de reducción de cada mitad.2H+/ H2 ½ O2/ H2OLa reacción del H está mal escrita: 2H+ + 2e- H2

Cuanto más negativo sea el potencial de reducción del par O/R, la molécula más reducida es mejor donador de electrones y con ello los protones, cuanto más positivos sean los potencial de reducción, el oxidante tiene más tendencia a aceptarlos.Dependiendo de con quien reaccionen los compuestos, van a actuar como donadores o como receptores.La molécula que tiene más tendencia a donar electrones es la glucosa, y la que más tendencia tiene a aceptar es el oxígeno.En el catabolismo identificaremos al donador de electrones como la fuente de energía. Por tanto denominamos al compuesto donador de electrones como fuente de energía.No es sinónimo, la energía que se obtiene en una reacción catabólica, no depende del donado, sino que lo importante es la diferencia de potencial que hay entre el donador y el aceptor de electrones.

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La reacción que más energía se va a obtener es la respiración de glucosa, es decir, la reducción de glucosa en presencia de oxígeno.Los donadores de electrones cuando ceden los electrones son transportados por una serie de moléculas antes de llegar a un aceptor final, esas moléculas son los denominados transportadores, los cuales pueden ser de dos tipos:

- Transportadores libre, se dan en el citoplasma.- Transportadores unidos s proteínas, situados en la membrana.

Los transportadores libres más importantes son el NAD+ y NADP+ que son transportadores de átomos de H completos.

NAD+ + 2H+ + 2e- NADH + H+ _______ (oxidante reductor)NADP+ + 2H+ + 2e- NADPH + H+

El NAD+ sería un transportador que actúa fundamentalmente en el catabolismo, el NADP+, actúa fundamentalmente en reacciones anabólicas. Ambas tienen un potencial de reducción muy alto, lo cual no dice que el NADH + H+, por lo que serán buenos donadores de electrones.El ATP posee tres grupos fosfato de alta energía, que cuando se rompen desprenden energía. El enlace de alta energía es el establecido entre el oxígeno y el fósforo, es un enlace anhídrido.El ADP también es una sustancia de alta energía. El fosfoenol piruvato y el 1,3-difosfo glicerato también lo son.Los derivados el acetil-CoA presentan un enlace de alta energía y se representa como “”, por tanto son moléculas de alta capacidad energética.

3. Quimiorgánotrofos heterótrofos.La fuente de energía son compuestos orgánicos. Los procesos de biosíntesis (anabolismo) se llevan a cabo por mitosis orgánica, por ello son heterótrofos.Obtienen la energía mediante dos procesos bioquímicos:

- Respiración. Proceso por el cual un compuesto químico orgánico se oxida, actuando el oxígeno molecular como aceptor final de electrones, y en ese caso se denomina respiración aeróbica, o actuando otra molécula distinta al oxígeno como aceptor final de electrones y en ese caso será respiración anaeróbica, pueden actuar moléculas como nitratos, sulfatos u otra moléculas orgánicas.La respiración anaeróbica se da sólo en el mundo microbiano.Una molécula orgánica se oxida totalmente a CO2, en el ciclo de Krebs o ciclo de las ácidos tricarboxílicos. Los electrones acaban siempre llegando al aceptor final.El ATP se forma por fosforilación oxidativa, es decir, en la cadena de transporte de electrones.

- Fermentación. Proceso de obtención de energía, en el que donadores y aceptores de electrones forman parte del proceso de fermentación, es decir, son los propios compuestos del complejo los que ceden y ganan electrones, por tanto no hay aceptor final de electrones.El ATP se forma por fosforilación a nivel de sustrato, es decir, hay una molécula de alta energía, PEP, que cuando se rompe da lugar a ácido pirúvico y ATP. Por tanto no hay cadena de transporte de electrones. Los productos finales tienen el mismo grado de oxidación que el inicial, es decir, el producto orgánico no se oxida totalmente, de manera que el producto inicial y final tienen el mismo grado de oxidación.

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Respiración Aeróbica.Los microorganismos pueden utilizar una gran cantidad de compuestos orgánicos, los más utilizados son los azúcares y entre ellos la glucosa. En el proceso de respiración a partir de la glucosa hay una serie de pasos: se pasa de glucosa a ácido pirúvico, los pasos de esta transformación son comunes en los dos procesos bioquímicos.

- La glucólisis: también se la denomina ruta de Embden – Meyerhott. También se da en los microorganismos. La glucosa se tiene que activar fosforilándose mediante una molécula de ATP, formando glucosa 6-P. conuna isomerasa se transforma a fructora 6-P, se vuelve a fosforilar formándose fructosa 1,6-P. Hasta aquí hemos gastado dos ATP. Mediante una aldolasa se transforma en dos moléculas de gliceraldehido 3-P. A partir de aquí el gliceraldehido se va a oxidar (va a ceder electrones que los coge el NAD para formar NADH + H+) y se produce otra fosforilación (inorgánica) transformándose en 1,3-difosfoglicerato (se ha oxidado). Es te último pierde uno de sus grupos fosfatos mediante una quinasa formándose 2 – fosfoglicerato. Se produce una pérdida de agua dando lugar a fosfoenol pirúvico y por una quinasa se da el ácido pirúvico /dos moléculas).Se forman 2 ATP, 2 NADH + H+

- Ruta de Entner- Doudoroff: partimos también de una glucosa que la activamos dando glucosa 6-P, mediante un aoxidación se forma 6-

fosfoglicerato, se pierde una molécula de agua formando 2ceto-3desoxi-6fofoglucónico. A partir de esta molécula se rompe en dos moléculas de pirúvico y gliceraldehido 3 fosfoglicérico, de aquí sigue la misma ruta que la glucólisis. Se forman 2 pirúvicos, 1 ATP, 1 NADH + H+, y 1NADPH + H+

Se da en procariotas y en Pseudomonas y Cimomonas.

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- Ruta de las pentosas: es una ruta también anabólica,parte de esta ruta se puede utilizar como ruta catabólia, para formar pirúvico (bacterias lácticas). La glucosa la activamos dando glucosa 6-P. se oxida dando 6-fosfogluconato (formando NADH), se produce una oxidación y una descarboxilación dando ribulosa 5P más CO2 (formando NADH). Mediante unos pasos se transforma en xilulosa 5-P, se fosforila dando gliceraldehido 3 fosfoglicérico y ácido fosfato. El gliceraldehido sigue la ruta de la glucólisis para dar pirúvico.

Se producen 1 ácido pirúvico, 1 Acetil P, CO2, 3 NADH + H+ y 1ATP

El ATP formado hasta aquí se ha formado por fosforilación a nivel de sustrato.Ahora vamos a ver que pasa con el piruvato, ciclo de krebs, para oxidar el piruvato a CO2.

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Ciclo de Krebs.El piruvato se activa con el CoA, se descarboxila y se oxida dando lugar a Acetil CoA, se condensa con el oxalacetato dando citrato. Después de una serie de oxidaciones y descarboxilaciones se vuelve al oxalacetato.

A partir de cada pirúvico se forma 3 CO2,4 NADH + H+, FADH, GTP (ATP)Los NADH + H+ son buenos donadores de electrones porque tiene un poder reductor muy negativo.Ahora el poder reductor son moléculas que tienen un potencial redox muy negativo (son muy buenos donadores de protones y de electrones), son los que van a la cadena transportadora de electrones para formar el ATP.¿Qué sucede con los protones y con los electrones?El NADH se une a una serie de enzimas (primeras transportadoras) que son las deshidrogenadas. Las NADH deshidrogenadas son las primeras enzimas de la cadena, estas transportan átomos completos de hidrógeno (protones y electrones) y se los (los dos átomos de hidrógeno) ceden a las siguientes proteínas. Estas son las flovoproteínas que tiene como grupo prostético (parte no proteica de una proteína pero que colabora en su acción enzimática) el FAD o FMD, son transportadoras únicamente de electrones, expulsan a los protones fuera de la cadena y pasan los electrones al siguiente transportador. El siguiente transportador son las proteínas ferrosulfurasas, únicamente transportan los dos electrones del hidrógeno, que se los ceden a las quinonas.Las quinonas toman los electrones y dos protones del citoplasma celular, formándose una quinona reducida, que transportan los electrones de uno en uno y expulsan los dos protones al exterior celular. Los dos electrones se los ceden a los citocromos, que pueden ser de distintos tipos. Los citocromos son proteínas que tiene como grupo prostético un grupo Hemo, y en su interior presenta un átomo de Fe, que se reduce y se oxida. Hay varios citocromos con diferentes potenciales de reducción que se unen con dos protones y forman agua, en el caso del oxígeno. Estas proteínas se encuentran en la membrana. En la membrana se crea un gradiente de protones. Fuera está cargada positivamente y dentro está cargada negativamente. Es un gradiente electroquímico que hace que la membrana tenga

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energía, esta energía se aprovecha para mover el flagelo, la acumula en forma de ATP, para el movimiento,…

La energía acumulada se denomina fuerza motor-motriz.Se acumula mediante la ATPasa que se encuentra en la membrana.La ATPasa participa en síntesis de ATP y en la ruptura del ATP en ADP + Pi.Esta enzima tiene una parte en la membrana plasmática denominada F0 y otra parte situada en el citoplasma denominada F1.

La parte F1 presenta distintas subunidades: 1α, 3β, 1γ, 1δ, 1ε. mientras que la F0 tiene 1ª, 2b, y 12c..Las proteínas son canalizadas hacia el interior por la subunidad “a”, cuando entran provocan una rotación de las subunidades “c”, esta rotación se comunica a través de la subunidad δ y ε, a las subunidades α y β, originando un cambio conformacional en β. Este cambio es el que activa la enzima para que el ADP se una el un Pi y se forme el ATP. Este ATP se forma por fosforilación oxidativa.Por cada NADH + H+ que se forma en el ciclo de krebs se forman 3ATP y por cada FADH se forman 2ATP.

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Así que por cada piruvato que entra en el ciclo de krebs se forman 15 ATP, y por cada glucosa se forman 38 ATP.

Respiración Anaeróbica.El aceptor final de electrones no es el oxígeno sino otra molécula. Estas moléculas pueden ser nitratos, sulfatos,…El proceso es el mismo que en la respiración aeróbica. La glucosa se sigue catabolizando en el ciclo de krebs.Si es nitrato se forman nitritos, si el nitrato tiene un potencial menos negativo se formarán menos ATP, los electrones no hacen tanto recorrido y no van a salir tantos protones.En E. coli pueden realizar la respiración aeróbica y anaeróbica, pero la formación de ATP siempre será menos en anaeróbios.

Fermentación.No hay aceptor final de electrones. Los elementos que se fermentan son los aceptores y donadores de electrones.El ATP se forma a partir de la fosforilación a nivel de sustrato. El compuesto orgánico reducido se oxidada completamente a CO2. el compuesto inicial y el final tienen el mismo grado de oxidación.

Partimos de un compuesto orgánico reducido que dona los electrones y se convierte en un compuesto más oxidado. Este compuesto se fosforila formando un compuesto fosforilado. Este intermediario cede los electrones que los coge el NAD formando NADH + H+, que no va a ninguna cadena de electrones, sino que va a unirse con el compuesto intermediario para que se reduzca.

- Fermentación alcohólica: es llevada a cabo por muchos microorganismos, pero los más habituales son las levaduras (Sacharomyces cerevisiae). La glucosa sería

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el compuesto inicial. Tras una serie de etapas pasa a dos moléculas de pirúvico por la vía de la glucólisis- los electrones y protones están en forma de NADH + H+. El ácido pirúvico mediante una descarboxilasa se descarboxila dando lugar a 2 CO2 y a 2 acetaldehidos, que se reducen utilizando los NADH + H+ a etanol.1 Glucosa 2 CO2 + 2 etanol + 2ATP.Hay algunas bacterias como Zymomonas que utilizan la vía de Entner- Doudoroff para obtener las dos moléculas de pirúvico.

- Fermentación láctica: es característica de las bacterias del ácido láctico como es el caso de Streptococcus, Lactobacillus. Hay dos tipos:· Fermentación Homoláctica es aquella que tiene como único producto de fermentación el ácido láctico. De glucosa pasa directamente a ácido láctico.

Los microorganismos fermentan la glucosa a piruvato por medio de la glucólisis, formando 2 pirúvicos, 2 TAP y 2 NADH + H+. Las dos moléculas de piruvato se reducen por una deshidrogenasa a ácido láctico, gracias a NADH + H+.1 Glucosa 2 ácidos lácticos + 2ATP.Es característica de Stremtococcus.· Fermentación Heteroláctica a partir de una glucosa se nos forma CO2, ácido láctico y etanol.

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La glucosa pasa a pirúvico por la ruta de las pentosas fosfato. El gliceraldehido va a la glucólisis, se transforma en pirúvico que se reduce a ácido láctico.El acetil fosfato se reduce a cetaldehido y a etanol. Los 3 NADH + H+ que se forman en esta ruta son los que se utilizan en las reducciones.La formación neta de ATP es de1. es típico de algunos Lactobacillus.

- Fermentación ácido – mixta: es característica de la familia Enterobacteriaceae. Se trata de microorganismos anaerobios facultativos y fermentadores.Presentan respiración aeróbica, anaeróbica y fermentación.Todas ellas fermentan la glucosa.Esta ruta parte de la glucosa que se transforma en pirúvico mediante la glucólisis. A partir de este pirúvico se van a formar una mezcla de ácidos por diferentes procesos.

El pirúvico se puede reducir para dar lugar a ácido láctico. También le puede pasar que se carboxile (CO2) formando ácido succinico.Puede que una de las moléculas de piruvato se condense con CoA para dar ácido fórmico más acetil CoA.El acetil CoA puede perder el CoA uniéndose una molécula de fosfato formando acetil fosfato (que es una molécula de alta energía) que se transforma en ácido acético.También el acetl CoA se puede reducir dando lugar a acetaldehído reduciéndose otra vez para dar etanol.Y el ácido fórmico se puede convertir en CO2 + Hidrógeno, este proceso lo harán los que tengan la hidrogenoliasa fórmica.E. coli lleva a cabo este proceso y lo poneos de manifiesto mediante el RM.

- Fermentación butanodiólica: la realizan Enterobacter, Serratia,...Es una fermentación que a partir de la glucosa se obtiene una mezcla de ácidos pero en unas cantidades más bajas que la anterior fermentación, formándose más 2,3-butanodiol.

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La glucosa se metaboliza hasta piruvato por la vía de la glucólisis. Estos 2 piruvatos se condensan formando el acetolactato más CO2. el acetolactato se descarboxila perdiendo un CO2 y se forma acetoína, que se reduce a 2,3-butanodiol.1 Glucosa 2,3-butanodiol + 2 CO2.La ponemos de manifiesto en el Boges Proskauer.

- Fermentación propiónica: la glucosa se fermanta dando lugar a ácido propiónico y a ácido acético. Es llevada a cabo por anaerobios.

- Fermentación butírica: la realizan microorganismos anaerobios como el género Clostridium.

La glucosa se descompone dando lugar a ácido acético, etanol, butanol, ácido butírico y butanol.Antes era muy importante esta fermentación porque era la única vía para formar acetona y butanol.

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4. Quimiolitotrofos autótrofos.Fijan el CO2 atmosférico para su biosíntesis.Los quimiolitotrofos son organismos que pueden vivir en la oscuridad y que obtienen energía de la oxidación de compuestos inorgánicos, son microorganismos respiradores (van a sintetizar el ATP por medio de la fosforilación oxidativa), esto quiere decir que tienen en su membrana una cadena transportadora de electrones.El compuesto inorgánico actuará como donador de electrones.

5. Fototrofos autótrofos.

Lección 8. Fundamentos de genética microbiana.

1. El genoma bacteriano: cromosoma y plásmidos.En bacterias el material genético se encuentra en una región sin membrana formado por cromosoma y plásmido.El cromosoma es duplexo, superenrollado, circular, lineal (Streptomyces), desnudo, haploide, no existe meiosis, el intercambio genético se produce por:

- Transformación.- Transducción.- Conjugación.

Los plásmidos son moléculas de ADN circular, duplexo, superenrollado, aparecen en la mayoría de las bacterias pero no en todas. Se reproducen automáticamente. El tamaño varía desde 0,2 a 4% del cromosoma bacteriano.Si son grandes suelen estar en la célula como mucho en una o dos copias. Si son pequeños hay multicopias.No son imprescindibles, pero si confieren una serie de ventajas, genes que codifican:

- Toxinas.- Resistencias: antibióticos y a metales pesados.- Enzimas que les permiten utilizar algunos sustratos “raros”: hidrocarburos como

fuentes de carbono (Pseudomonas: plásmido tol, puede vivir en tolueno); pesticidas.

- Procesos de conjugación.

2. Estructura y tipo de plásmidos.Uno de los más conocidos en el plásmido F, presente en E. coli.Es un plásmido conjugado: tiene genes que permiten el proceso de conjugación bacteriano. Es grande, unas 100kpb.Todos tienen su origen de replicación, se trata de una zona denominada oriS.Tiene una región muy importante, la región tra, unas 30kpb, donde se encuentran los genes codificados. Todos los que tengan región tra pueden ser transmitidos de una bacteria a otra mediante conjugación.Existen unas regiones IS (Secuencias de inserción). Los genes a veces son capaces de cambiar de posición y de saltar de un lugar a otro del cromosoma o de un plásmido, a este fenómeno se le denomina procesos de transposición. No se da con una alta frecuencia 10-5- 10-7. No todos los genes van a poder moverse, a los que pueden moverse se les denomina elementos transponibles, siendo secuencias de inserción. Son pequeños sólo poseen un gen que va a codificar para que ese gen salte, transposasa. Estas IS le permiten recombinarse dentro del cromosoma microbiano. Cuando un plásmido se integra dentro del cromosoma se denomina Epistoma. Son homólogos a zonas del cromosoma.

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También hay una región Tn (transposones). Son más grandes porque contienen más genes. Como son movibles van a poder saltar de un cromosoma a otro o a otro plásmido.Las células que portan este plásmido F se denominan células F+ y las que no los portan se denominan F-.Las F+ presentan la región tra y está codificada la síntesis de Pili:

- Pilis F: son distintos, van a poder pasar a otra célula los plásmidos F y algunos R (resistentes).

- Pilis I: otros plásmidos que codifican para las bactiriocinas.Plásmidos R: son de gran tamaño, una monocopia de 90kpb.Presenta la región tra, que permite que se transmita por conjugación.Presentan también secuencias de inserción, y puede formar epistomas. También contienen transposones.Le van a conferir a la bacteria que los porte resistencia a metales pesados y antibióticos.Plásmidos recombinantes: son plásmidos construidos por ingeniería genética con el fin de utilizarlos en la clonación de genes.Tienen que tener su origen de replicación con un marcador de selección (de resistencia a un antibiótico, se pone para saber si el gen está en ese plásmido).Tiene una región denominada Poli-linker, son luegares don de actúan muchas enzimas de restricción (cortan el plásmido).Una vez introducido el gen en el plásmido, hay que meter este en una bacteria por ejemplo E. Coli, si tiene el gen de la insulina crecerá.

2. Aislamiento de mutaciones auxotrofos: métodos de la réplica placa.Mutación: un cambio heredable en el ADN de un organismo.A la cepa que no porta esta mutación es la salvaje y la que si lo porta es la mutante.No siempre las mutaciones llevan un cambio fenotípico.Los nombre de los genes se escriben con tres letras en minúsculas y una cuarta en mayúsculas, y en cursiva o subrayado.Cuando los genes codifican proteínas se escribe la primera y la última con mayúsculas. El fenotipo de un organismo se escribe con mayúsculas la primera y con un signo +, -, R (resistente), S (sensible), depende de si son capaces de sintetizar la proteína o no.

- Mutaciones espontáneas: se producen de manera natural, sin que haya ningún factor. La frecuencia varía dependiendo del gen que está implicado. Ejemplo:mutaciones auxotrofía (nutricional), una célula de cada 10 millones mutaría espontáneamente 10-7.

- Inducidas: aumentamos la frecuencia de mutación. Factores:· Físicos Radiaciones ultravioletas, radiaciones ionizantes, rayos x.· Químicos Gas mostaza, Naranja acuidina, Bromuro de etidio, Nitrosoguanidina.

2.1. Aislamiento de mutantes.El aislamiento se realiza en los laboratorios. Se lleva a cabo de distintas maneras dependiendo del tipo de mutación.

- Mutantes resistentes a un antibiótico/fago.Imaginamos que tenemos un cultivo creciendo. Fenotipicamente la cepa salvaje es Amps (muere en presencia de Amp).Esperamos a que haya células que hayan mutado pasando a AmpR, ¿cómo nos damos cuenta? Ponemos un medio de cultivo sin Amp y otro con Amp. Cultivamos. En el cultivo sin Amp crecerá células todo tipo de células, en las los

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medios con Ampicilina crecerán las que soporten la Amp, las que sean fenotipicamente AmpR.

- Mutantes de utilización de azúcares.Tenemos nuestra población porque estamos estudiando el gen de fermentación , de la lactosa. La cepa salvaje será Lac+ (capaz de sintetizar la proteína), queremos estudiar los mutantes que pasen a Lac- (no sintetizan la proteína).las ponemos en un medio McConkey (lactosa), lo sembramos. Las células salvajes aldrán amarillas y las mutantes saldrán incoloras. También podríamos usar el VRBA saliendo de color rosa.

- Mutantes auxótrofos (nutricional).Presentan una frecuencia de 10-7. Hay algunos microorganismos que se denominan prototrofos y otros auxótrofos. Nos imaginamos un microorganismo que sea fenotipicamente Leucina+, sería un organismo prototrofo porque tiene todas las enzimas necesarias para sintetizar la leucina, esté o no esté el organismo va a crecer.Si es auxotrofo, Leu-, le falta alguna enzima, no es capaz de sintetizar la leucina, para que creciese se la tendríamos que añadir.Nuestra población de partida es Leu+ y queremos aislar las Leu-. Tenemos un problema, porque si ponemos en el medio Leucina crecerán todos, o Leu+ si no añadimos.Método de la replica placa.Sembramos la bacteria en una placa con un medio completo (con leucina), cuando sembremos crecerán los prototrofos y los auxotrofos. De estos la mayoría serán pototrofos ¿cómo nos damos cuenta de cual es cual? Cogemos u taco de madera y le ponemos un fieltro, del mismo tamaño que la placa petry. Hacemos una impronta en la placa. Esta impronta la ponemos en dos placas, una con leucina y otra con el medio mínimo (sin leucina). En la placa con leucina crecerán los dos tipos, en la que no tiene crecerán los prototrofos. Por comparación las colonias que no aparecen en el medio sin leucina y si aparecen en el medio con leucina son las mutantes.

Métodos de aislamiento mediante enriquecimiento por penicilina.Es más rápida.La penicilina es un antibiótico que actúa solo sobre las células que están creciendo, cuando se está sintetizando la pared celular.Tenemos un matraz con células que están creciendo en un medio con leucina+ y queremos saber si han crecido leucina-.

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Tomamos este cultivo, centrifugamos, tomamos las células. Las pasamos a un tubo que contiene medio son leucina pero con penicilina. La penicilina mataría a las bacterias que pueden crecer en este medio (Leucina + prototrofos).Dejamos crecer, y volvemos a centrifugar, lo pasamos a una placa de medio incompleto (con leucina).

Hacemos una réplica capa en otra placa con el medio mínimo (sin leucina), las que no aparecen serán las mutantes.

3. Test de Ames.Nos permite evaluar la capacidad mutagénica de un compuesto. Los compuestos mutagénicos son también concerígenos, nos evalúa la capacidad mutagénica si son cancerígenos o no al 99%.Forma de evaluarlo:Los agentes mutagénicos aumentaban la frecuencia de mutación, evalúa si en presencia de ese compuesto mutagénico se aumenta la frecuencia de reversión de una mutación.Para este test se usa una cepa de Salmonella typhimurium His-. Aumenta la frecuencia de reversión a His+.¿Cómo se hace? Tienen una frecuencia de 10-7, en presencia del compuesto aumentaría o no, eso es lo que hay que ver.Se parte de una población de Salmonella typhimurium 108 ufc/ml (población inicial).Hay una placa control con medio mínimo, lo que hace que crezca His+, en otra placa se pone el compuesto. Podrían crecer unas 10 colonias.Si crecen más colonias de las que deberían crecer quiere decir que el compuesto es muta génico. La mutación es puntal porque sólo está implicada una base,La cepa no tienen efectivo el sistema de reparación de las muestras.Muchas veces los productos químicos no son mutagénicos, pero cuando los tomamos y nuestro hígado lo empieza a degradar puede que si que llegue así a ser tóxico. Por eso junto con el compuesto químico en este test se ponen enzimas de hígado de rata.

4. Procesos de transferencia de genes en bacterias: transformación y transducción.4.1. Transformación.Proceso por el cual el ADN libre se incorpora a una célula denominada competente.En la naturaleza no se da de manera natural en todas las bacterias. Entre las que si lo hacen se encuentran Bacillus, Streptomyces (ambas Gram +) y Haemophylus (gram-).En los Gram +, tenemos una cadena de ADN libre fuera de la célula. Hay una nucleasa que rompe una de las cadenas del ADN, de manera que sólo una cadena de ADN (monocatenario) es capaz de entrar en la célula competente, incorporándose al ADN de la bacteria.En Gram -, la cadena libre de ADN penetra al completo, aunque luego sólo una de ellas se incorpora al ADN de la célula competente.En el laboratorio se usa mucho para la clonación de genes.

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4.2. Transducción.Transferencia de ADN de una bacteria a otra mediado por un fago. Hay dos tipos:

- Generalizada: se lleva a cabo cuando ese fago es lítico (fago que mata a la bacteria que parasita). Sólo entra el ácido nucleico del fago, una vez dentro se apodera de la maquinaria de la bacteria para replicar su ácido nucleico. Cuando se han sintetizado todos los componentes del virus se meten en la cápside, estallando la célula, siendo los virus liberados al exterior. A veces en lugar de encapsidarse el ácido nucleico del virus se introduce un trozo de ácido nucleico de la bacteria, cuando la bacteria estalle y salga, cuando vaya a infectar a otra célula el ácido nucleico se puede recombinar con el ácido nucleico de otra célula.

- Especializada: se da entre los virus lisogénicos. Cliclo lisogénico: sus virus on capaces de integrarse dentro del cromosoma de una bacteria, cuando esto ocurre se denomina profago, con lo cual estos virus se van a ir multiplicando a medida que se multiplique la célula, no mata a la célula. Algunas veces virus o fagos que están lisogeneizados empiezan a hacer ciclo lítico. Para que haga esto lo primero que tiene que hacer es que el ADN del virus salga del cromosoma. Cuando ya estña fuera se apoderará de la maquinaria de la célula y termina el ciclo lítico. Hay algunas veces que en el proceso de desintegración del virus no lo hace correctamente sino que arrastra algún gen de la bacteria. El virus se multiplica con ese gen. Cuando el virus salga y ataque a otra bacteria le introducirá el gen de otra bacteria.

4.3. Conjugación.Para que este proceso ocurra es necesario que las células presenten plásmidos F. Es el proceso de recombinación genético en el que la transferencia de ADN de una célula donadora a otra receptora implica el contacto entre ellas, entre los pilis. Van a estar implicadas dos células.La célula donadora es portadora de plásmido conjugado o F denominándola F+. La célula que no tiene el plásmido conjugado es la receptora y se le denomina F-. Hay una transferencia del plásmido F de una célula donadora a otra receptora. Hay una nucleasa de forma que una de las cadenas del plásmido entra en la célula receptora. Esta cadena se replica, teniendo en las dos células el plásmido.Una célula F+ convierte a una F- en una F+.El plásmido F tenía zonas IS. Las células que tienen el plásmido F integrado en el cromosoma de la bacteria se llaman células Hfr.¿Qué pasa cuando una Hfr se encuentra con una F-? Presentan un origen de transferencia y hace que el plásmido sea capaz de transferir a la F-, a través del pili empieza a pasar el plásmido, pero es imposible que en el tiempo en el que se encuentran unidas las células pase todo el plásmido. Y es imposible que la F- adquiera una copia completa del plásmido, no pudiendo así transformarse en F+.

Lección 9. Principios de taxonomía.

Taxonomía: ciencia que estudia la clasificación de los organismo, en este caso de los microorganismos.Dentro de esta clasificación hay varios apartados:

- Identificación: es parte de la taxonomía que consiste en asignar a un organismo vivo dentro del taxón adecuado.

- Nomenclatura: es la asignación de un nombre a un determinado organismo.

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Podemos clasificar a los microorganismos de distintas formas.Filogenia: clasificación de los organismos vivos atendiendo a sus relaciones evolutivas.Taxones fundamentales:Dominio Reino Clase Orden Familia Género EspecieEl más importante de todos es la especie.El género se escribe siempre con mayúsculas y la especie en minúsculas y todo subrayado. Ejemplo: Escherichia coli.Se puede abreviar el género, pero no la especie, sólo se puede abreviar si a se ha hecho anteriormente. Ejemplo: E. coli.Una especie en microbiología es el conjunto de cetas (cultivo puro)que comparten la mayoría de las propiedades principales y que se diferencian en otras propiedades no tan importantes que se denominan significativas.El genoma entre especies se diferencia aproximadamente en un 3%. Dentro de una especie hay también variabilidad, esta puede hacer que dentro de una especie existan diferentes biovares (que son microorganismos que se diferencian en una serie de caracteres morfológicos o también fisiológicos), también existen los que se denominan serovares (cepas que se diferencian en características serolígicas, es decir, diferentes propiedades antigénicas).En taxonomía podemos utilizar para clasificar distintos criterios:

- Características fenotípicas:· Morfológicas (forma, agrupación, con cápsula o sin ella,…)· Respuesta a la tinción de Gram.· Tipo de nutrición (fototrofos, quimiorganotrofos, quimiolitotrofos)· Bioquímicas y fisiológicas (tipos de fuentes de carbono, si son sensibles a anticuerpos).

- Atendiendo al genoma, parámetros moleculares:· Contenido guanina-citosina (porcentaje que tienen en todo el ADN)G + C = G + C . 100 A + T + G + CSe encontró que los organismos que tenían igual porcentaje tenían más relación entre ellos.· Hibridación ADN: para establecer la relación entre ellos. Cuanta mayor hibridación haya, mayor será la relación entre ellos.Esto era muy laborioso por lo que ahora se toman otras relaciones como las filogenéticos.

- Relaciones filogenéticos: nosotros vamos a tener en cuenta la filogenia de describió Carl Woese que la realizó en relación con el ARN ribosómico (16s procariotas) que es un cronómetro molecular. Es una molécula que su secuenciación nos permite establecer si dos organismos están muy próximos evolutivamente. Esta molécula tenía que estar distribuida en todos los organismos con la misma función, tenía que tener una gran parte de su molécula bien conservada y otra parte variable.

- Dentro de esta molécula existen secuencias que son específicas de clase, familia, género, …, se les denomina secuencias variables.

- En base a esta clasificación Woese estableció un árbol filogenético basado en la secuencia de ARN ribosómico.

En microbiología existe un manual “Manual de Bergey” donde están plasmados todos los microorganismos.Están en vigor la segunda edición (atiende a la relación filogenético), porque la primera atendía a características fenotípicas.

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Lección 10. Bacterias fototrofas.

Vamos a hacer una clasificación en base a los criterios bioquímicos.

1. Microorganismos fototrofos.Son aquellos que utilizan la luz como fuente de energía. La mayoría fija CO2 atmosférico, y la mayoría son autótrofos, hay algunos que son capaces de utilizas fuentes de carbono (heterótrofos).Dentro de los fototrofos vemos dos grupos:Tanto uno como otro son organismos fotosintéticos en los que el ATP se obtiene a partir de la luz por un proceso que se denomina fotofosforilación.

- Fototrofos anoxigénicos: son microorganimos anaerobios. Dentro de estos vamos a hacer referencia a los siguientes grupos microbianos:· Bacterias púrpuras o rojas. Son microorganismos Gram -.· Bacterias verdes. Son microorganismos Gram -.· Heliobacterias. Son microorganismos Gram +.Estas bacterias anoxigénicas tienen unas características: Todas ellas realizan la fotosíntesis anoxigénica, para llevarla a cabo

necesitan tener pigmentos fotosintéticos que se denominan bacterioclorofilas. Existe un único fotosistema.

Los fototrofos anoxigénica solamente pueden crecer fototróficamente (con luz) en condiciones de anoxia, porque sus pigmentos solamente actúan en ausencia de O2.

El poder reductor que necesitan lo obtienen de compuestos reducidos del ambiente por ejemplo el SH2 y H2 (actuarán como donadores de electrones).

La fotosíntesis anóxigénica sólo tiene un fotosistema, que presenta unas características diferentes si se trata de bacterias púrpuras, verdes o heliobacterias, dependen de las bacterioclorofilas.Las bacterioclorofilas son porfinas que se diferencian en los radicales que presentan, tienen espectros de absorción diferentes, por lo que pueden vivir en un mismo hábitat dependiendo de las bacterioclorofilas que tengan absorberán una luz u otra.La clorofila y las bacterioclorofilas tienen una estructura parecida a los citocromos, pero con un átomo de magnesio en el centro.Fotosíntesis anoxigénica en bacterias púrpuras:El fotosistema se denomina P870 (máximo de absorción en ese punto). Las bacterioclorofilas se disponen en el fotosistema P870 que tiene un potencial positivo (no son buenos donadores de electrones) cuando la luz incide en las bacterioclorofilas se activan y esto hace que disminuya el potencial hasta potenciales muy negativos (buenos donadores). Los electrones van a moverse a través de una cadena de electrones.Estos electrones pasan de las bacterioclorofilas a la bacteriofeofitina (sin átomo de magnesio). Más tarde pasan a las Quinonas, al Citocromo BC1 y al BC2, y este último se lo vuelve a ceder a la bacteria del fotosistema P870, los electrones viajan de manera cíclica.Acoplado al transporte de electrones también hay una salida de protones al exterior, de los que se obtienen el ATP.¿Cómo se sintetiza el poder reductor? para que se forme poder reductor se necesitan moléculas donadoras de electrones y protones para dárselas al NAD o

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NADP. Las moléculas donadoras son elementos químicos externos (SH2, S, Tiosulfato, H2), donan los electrones y los protones a una molécula que tenga un potencial mayor que él, estos electrones pasan al Citocromo BC2 que se los pasa a la bacterioclorofila reduciéndola de nuevo. De aquí pasan a la bacteriofeofitina y luego a las quinonas, que por flujo inverso de electrones van a viajar al NAD para formar NADH, a costa de gastar ATP.

En el caso de las bacterias verdes o heliobacterias el poder reductor no se forma por flujo inverso de electrones, los electrones se los cede directamente.· Bacterias verdes: se dividen en los tipos

o Bacterias púrpuras del azufre: son fototrofos anoxigénicos (organismos anaerobios. Son Gram - , normalmente microorganismos móviles con flagelos polares y presentan dos bacterioclorofilas una A y otra B.Los pigmentos se encuentran en la membranacuando ceden los protones y los electrones se oxidan primero a azufre elemental y luego a sulfato.La mayoría de los microorganismos acumulan azufre elemental en sus células.Utilizan el ciclo de calvin para sintetizar compuestos orgánicos.Estos microorganismos son fotolitotrofos autótrofos.Debemos conocer dos familias importantes: F. Ectothiorhodospiraceae, F. Chromatiaceae. Una de ellas almacena los compuestos azufrados en su interior y otra en el exterior.Todas las proteobacterias son Gram - .

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El hábitat en el que se encuentran son los lagos ricos en compuestos azufrados, en las zonas anóxicas (profundas), pero con algo de luz que llegue a las bacteroclorofilas.

o Bacterias púrpuras no del azufre: son también Gram – porque son proteobacterias, tienen bacterioclorofilas A y B, las hay móviles e inmóviles.Se llaman así porque en un principio no podían vivir en presencia de azufre, pero viven en lugares donde el azufre se encuentra en bajas concentraciones.Son fotolitotrofos autótrofos.Estas bacterias a partir de hacer la fotosíntesis pueden hacer muchas cosas y vivir en muchos sitios, pueden ser:

Fotoorganotrofos heterótrofos: el ATP lo obtienen mediante la fosforilación, el poder reductor lo obtienen de moléculas orgánicas y su material celular lo sintetizan a partir de materia orgánica.

Quimioorganotrofos heterótrofos: en ausencia de luz.Existen géneros como G. Rhodobacter.Viven en zonas de lagos ricas en materia orgánica con una cantidad baja de compuestos azufrados.

· Bacterias verdes: Existen también dos tipos o Bacterias verdes del azufre: se caracterizan porque poseen

Bacterioblorofila A + Bacterioclorofila C, D o e, pueden tener distintas formas, son inmóviles, pero si son móviles lo son por deslizamiento.Se llaman así porque como donadores de electrones tienen compuestos azufrados, van a compartir hábitat con las bacterias púrpuras del azufre, son fotolitotrofos autótrofos, no fijan el CO2 por el ciclo de calvin sino que utilizan el ciclo de krebs reverso.El género más importante es el G. Chlorobium.

o Bacterias verdes no del azufre: presentan bacterioclorofila A y B. Son bacterias que pueden vivir donde las concentraciones de azufre son más bajas. Son también muy versátiles metabólicamente, pudiendo ser fotoorganotrofos heterótrofos o quimioorganotrofos heterótrofos. En este caso el CO2 lo fijan por otra ruta denominada hidroxipropionato.El género más importante es el G. Choroflexus (se trata de una de las bacterias más antiguas).

Algunos pigmentos fotosintéticos se encuentran localizados en unas vesículas localizadas por debajo de la membrana denominados clorosomas. En los clorosomas se encuentran todas las bacterioclorofilas menos la A que se encuentra en la membrana. Puede que los clorosomas estén en contacto con la membrana mediante un pedúnculo, no tienen unidad de membrana. Tanto las verdes como las púrpuras poseen pigmentos característicos, no están implicados directamente en la fotosíntesis. Son los que dan el color, y protegen a los organismos de la formación del radical singlete. · Heliobacterias: son organismos Gram +. Estos microorganismos antes estaban incluidos en Gram -, porque al teñirse lo hacen como ellos. Están incluidos en el volumen III junto con los clostrodios, porque son bacterias esporulares (forman endosporas).Poseen bacterioclorofila G, este tipo es el más parecido a la clorofila.Normalmente son microorganismos bacilos móviles por deslizamientos.

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Estos son heterótrofos (no fijan CO2, los compuestos orgánicos para la síntesis de su material lo utilizan de moléculas orgánicas).Viven en hábitat donde haya compuestos azufrados, se suelen encontrar en los arrozales, porque son zonas donde se alternan las etapas de encharcamiento y sequía, que favorecen a la formación de endosporas.Los géneros más importantes son: G. Heliobacterium, G. Heliobacillus.

- Fototrofos Oxigénicos: nos referimos a las cianobacterias que realizan una fotosíntesis oxigénica o fotosíntesis en Z, hay dos fotosistemas:La energía viene de la luz, los electrones y los protones para el poder reductor vienen del agua (de la ruptura del agua por la luz formando oxígeno). El ATP se forma por fotofosforilación.El fotosistema dos P680 y el fotosistema uno P700, y los pigmentos fotosintéticos son de clorofila.El potencial de reducción del fotosistema dos en un poco más positivo que el del agua, por lo que el agua actúa como donador de los electrones y de los protones.Se produce la fotolisis del agua, pasando el potencial de 1 a –0,75 (se convierte en una molécula muy reducida, para poder ceder electrones y protones). Una vez activada la clorofila los electrones pasan a una cadena de transporte. Primero pasan a una feofitina (molécula sin magnesio) que cede los electrones a las quinonas, después pasan a los citocromos y posteriormente a otra molécula denominada plastocianina. Esta dona los electrones al fotosistema uno P700 que mediante la luz se excita, pasando a una molécula muy reducida.Los electrones pasan de la clorofila a las quinonas, luego a las proteínas de hierro y azufre, a las flovoproteínas y después se los pasan directamente al NAD para formar NADH. El ATP se forma en el intervalo del fotosisntema dos al uno. A veces cuando hay mucho poder de reducción y la célula necesita ATP la ferredoxina cede los electrones al citocromo formándose un poquito de ATP. Esta fotosíntesis no es cíclica a no ser que ocurra esto último.

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Características de las cianobacterias:Están incluidas en el reino Cianobacteria.Son Gram -, y pueden tener forma unicelular o filamentosa. Presentan clorofila A que se localiza en unas membranas especiales denominadas tilacoides (en procariotas se trata de la única membrana unitaria que hay), están recubiertos por unas estructuras denominadas ficobilisomas que presentan pigmentos como la ficocianina (azul) ola ficoenitina (rojo).Son fototrofas autótrofas, que asimilan el CO2 por el ciclo de calvin.En su interior acumulan un polímero de reserva de Nitrógeno que recibe el nombre de Cianoficia.Algunas cianobacterias poseen unas células especializadas denominadas heterocistos (a partir de una célula que se diferencia, produce la fijación del Nitrógeno atmosférico, presentan una pared gruesa para no dejar pasar al oxígeno, la enzima implicada en la fijación del nitrógeno es la nitrogenasa).Están divididas en cinco órdenes. Esta división se ha hecho en base a si son unicelulares o ficomentosas, y al modo en que se dividen:

- Orden Chroococcales: son unicelulares, se dividen por fisión primaria. Los géneros Prochloron y Prochlorococcus antes no estaban incluidos en cianobacterias sino que se encontraban en un grupo a parte deoninado Proclorofitos, porque contienen clorofila A y B.

- Orden Pleurocapsales: también son unicelulares pero se dividen por fisión múltiple (a partir de una célula, esta aumenta de tamaño y a continuación se divide en numerosas células hijas que reciben el nombre de baeocitos. Son conocidos los G. Pleurocapsa y G. Dermocapsa.

- Orden Oscillatoriales: está formado por bacterias filamentosas (cada uno de los filamentos se denomina un tricoma y la unión entre ellos es total). Ejemplos: G. Oscillatoria y G. Spirulina. El género Oscillatoria es capaz de fijar nitrógeno pero no tiene heterocistos.

- Orden Nostocales: son bacterias filamentosas que si que fijan el nitrógeno mediante los heterocistos.

- Orden Stigonematales: son bacterias filamentosas que poseen heterocistos, además forman unas estructuras de resistencia de condiciones ambientales denominados acinetos.

Lección 11, 12 y 13. Quimiolitotrofos.

Son microorganismos que pueden vivir en oscuridad y obtienen la energía y el poder reductor de la oxidación de compuestos químicos inorgánicos. Hacen respiración por lo que el ATP lo obtienen mediante la fosforilación. Son autótrofos, fijan el CO2 mediante el ciclo de calvin. Dependiendo del componente químico inorgánico que oxiden tenemos cinco categorías que son:

- Bacterias oxidatorias del amonio: obtienen la energía de oxidar el amonio a nitrato. Esto se lleva a acabo por las bacterias nitrosificantes (NH4

- NO2-) y

nitrificantes (NO2- NO3

-). Tanto una como otra son anaerobias, porque el aceptor final de electrones es el oxígeno.

o Bacterias nitrosificantes: son las encargadas de oxidar el amonio a nitrito.El NH3 en presencia de O2 + 2e- + 2H+ se transforma en un compuesto denominado hidroxilamina más agua, que se encuentra en el citoplasma. Esta reacción es catalizada por una enzima que se encuentra en la

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membrana denominada amonio monooxigenasa. La hidroxilamina atraviesa la membrana y pasa al periplasma (espacio periplásmico) y allí se va a oxidar a nitrito por la enzima hidroxilamina oxidoreductasa, liberando en el proceso 4 protones y 4 electrones.¿Por qué obtienen esa energía? Es debido a que los electrones que se liberan van a ir a un citocromo (periplásmico), dos de los electrones son cedidos a las quinonas y luego a la amonio moooxigenasa , y los otros dos electrones se los da a los otros citocromos que se los cede al oxígeno.El ATP se obtiene de los protones, por fosforilación oxidativa. Sólo pasan dos electrones a la cadena transportadora.Se forma poco ATP porque la diferencia de potencial es muy baja.¿Cómo forman el NADH2? Tenemos protones y electrones obtenidos, que irán a las quinonas y luego por flujo inverso de protones hasta llegar al NAD+ . Este proceso le cuesta ATP, por lo que su crecimiento es muy pobre.

Características:Se trata de bacterias gram -, son proteobacterias.Tienen distintas formas. Muchas en su interior poseen una gran cantidad de membrana. Los géneros más importantes son: el G. Nitrosomonas, y el G. Nitrosococcus.

o Bacterias nitrificantes propiamente dichas: obtienen la energía de la oxidación de nitrito a nitrato. El aceptor final de los electrones es el oxígeno, realizando una respiración aeróbica.El nitrito se oxida a nitrato liberándose protones y elctrones. La enzima que cataliza esta reacción es la nitrito oxidasa. Los electrones se los da al citocromo donando los electrones por último al oxígeno.Se produce una salida de protones, obteniéndose así ATP por fosforilación oxidativa. Por lo que se está dando respiración aeróbica.

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El poder reductor se produce por flujo inverso de protones, tienen que viajar hacia atrás para sintetizar el NAD+.

También son gram – ya que son proteobacterias. Presentan distintas formas, y algunas son móviles.

Los géneros más importantes son el G. Nitrobacter y el G. Nitrococcus.Estas bacterias viven en lugares ricos en componentes nitrificados. Lo que hacen es enriquecer el suelo en nitratos. Y son organismos aeróbicos.Se ha descrito un proceso denominado Anamox y que es llevado a cabo po un organismos de la especie Bracardia que oxida el amonio a nitrógeno.

NH4+ + NO2

- N2 + 2H2O.

- Bacterias oxidadoras del azufre: obtienen la energía de oxidar compuestos azufrados SH2, So, S2O3

-, oxidándolos a SO4-. El aceptor final de electrones son

el oxígeno y otros compuestos, por lo que realizan respiración oxigénica o anoxigénica. Por lo que son a/anaeróbicos facultativos.El SH2 pierde electrones y protones, oxidándose a azufre elemental , luego a S2O3

- y por último a sulfito. En estas oxidaciones se pierden electrones y protones, los electrones van a la cadena de transporte de electrones para formar ATP.La mayor parte de las bacterias pasa del sulfito al sulfato mediante la sulfito oxidasa.Pero hay algunas bacterias pertenecientes al género Thiobacillus que pueden utilizar otra ruta, que le permite sintetizar ATP mediante la fosforilación oxidativa y por la fosforilación a nivel de sustrato.En sulfito se une a una molécula de AMP (se activa), esa molécula formada se llama APS (adenosinfosfosulfato) y esa reacción es catalizada por la APS reductasa. El APS pierde el ADP dando SO42-. Los electrones van a la cadena de transporte de electrones.El poder reductor se forma por flujo inverso de protones.

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La diferencia de usar el SH2 o el tiosulfato es que el gasto de ATP para realizar el flujo inverso de los protones es menor en el SH2.

a) Bacterias oxidadoras de SH2, con formación de depósitos de azufre intracelulares. Géneros más importantes:G. Beggiatoa se trata de una proteobacteria, por lo que es una Gram -. Es una bacteria filamentosa móvil por deslizamiento. Utiliza el SH2, Sº y S2H3

- para obtener energía.Estas bacterias se encuentran en los arrozales con grandes cantidades de SH2 produciéndose una simbiosis entre Beggiatoa y las plantas del arroz. Disminuyendo la cantidad de SH2 beneficiando a las plantas del arroz, Beggiatoa se beneficia de que la planta transporta a la zona de la raíz oxígeno creándose un ambiente microaerófilo que lo necesita para llevar a cabo la respiración.Hay algunas especies de Beggiatoa que son mixtrofos (quimiolitotrofos heterótrofos).G. Thiovulum también es una Gram -, son ovoides y móviles. Estas bacterias establecen simbiosis con un gusano de las profundidades oceánicas denominado Raftis, este gusano posee un tubo digestivo denominado trofosoma que posee gránulos de SH2. el gusano se beneficia de los restos de los gránulos de SH2 que es de lo que se alimenta.b) Bacterias oxidadoras de SH2, con formacion de depósitos de azufre extracelular.G. Thiomicrospira son unicelulares en forma de espirilo, puede llevar a cabo una respiración anaeróbica (aceptor final de electrones el nitrato).Se encuentra en las profundidades oceánicas donde hay gran actividad geotérmica emanando SH2.G. Thermotrrix se encuentra en fuentes termales donde existen grandes cantidades de SH2 y S2H3

-. El aceptor final de electrones también es el nitrato y por lo tanto hacen respiración anaeróbica.G. Thiobacillus esta formado por bascillus, son Gram -, móviles con flagelación polar. Viven en zonas ácidas, son acidófilos, en aguas de drenaje ácido de las minas de sulfuros metálicos.Hay dos especies importantes:· T. thiooxidans.· T. ferrooxidans: sn capaces de obtener energía del SH2 y del hierro.Son importantes porque participan en un proceso denominado lixiviación (gracias a los microorganismos se obtienen metales de menas en la que las concentraciones del metal son muy pequeñas).Transforman el sulfuro de cobre en sulfato de cobre.

- Bacterias oxidadoras de hierro: que obtienen la energía de la oxidación del Fe2+ Fe3+. En presencia de oxígeno como aceptor final de electrones.Fe2+ + 1/2O2 + 2H+ + 2e- Fe3+ + H2O.Realizan respiración aeróbica, son autótrofos que fijan el CO2 por el ciclo de calvin.Consiguen muy poca energía de oxidación porque el par Fe3+ / Fe2+ tienen un potencial muy positivo. A pH neutro la oxidación no es microbiana, para que lo sea tienen que estar a pH ácido.Cuando el Fe2+ se oxida a Fe3+ se suele formar hidróxido férrico que aparece en forma de incrustaciones de color anaranjado.

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Hay un microorganismo al que se le considera por excelencia bacteria oxidadora de hierro:Thiobacillus ferroxidans: vive en aguas muy ácidas, aguas de drenaje ácido de las minas de sulfuro metálicos, pH entre 1 y 2. En el medio hay muchos protones, por lo que el exterior de la célula está muy protonado mientras que el interior presenta un pH neutro.De manera natural se forma ATP, se forma de manera natural, simplemente de la fuerza protón-motriz que se genera.¿Para qué sirve el hierro? Si la ATPasa está metiendo H+ se adificaría el interior por lo que el hierro le cede los electrones para formar agua y por lo tanto el pH se mantiene.Esto se produce gracias a una proteína denominada Rusticianina que es la que toma los electrones, luego se los da el Citrocromo C y al a, y por último al oxígeno que junto con los protones se forma el agua.¿Cómo se forma el poder reductor? Por flujo inverso de protones.

Algún género más:G. Sphaerotilus: la oxidación del hierro no es microbiana.G. Gallionela: vive en la interfase de la zona oxica o anóxica, en condiciones de pH neutro.

- Bacterias oxidadoras de hidrógeno: obtienen la energía de oxidar el H2 + 1/2O2 H20, con excepción de dos grupos microbianos que son Aquifer e Hydrogenobacter (solamente utilizan el hidrógenos para obtener energía) el resto son bacterias facultativas.Estas bacterias obtienes bastante energía porque la diferencia de potencial es muy grande.Se ha estudiado mucho en la especie Rastonia eutropha:Existen dos hidrogenasas, una está situada en la membrana y la otra en el citoplasma, cada una sirve para una cosa diferente, para la síntesis de ATP y para la del poder reductor.Las protones son cogidos por la hidrogenasa de la membrana, que se los pasa a las quinasas, luego a los citocromos que se los cede al oxígeno y jungo con los protones forma agua, formándose posteriormente ATP.

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La otra hidrogenasa le cede los electrones al NAD+ formando directamente el NADH.Pueden actuar como aceptor final de electrones el oxígeno y el nitrato.Hay algunas bacterias del hidrógeno que sólo tienen una hidrogenasa (la de la membrana), cuando sólo tienen una, el potencial no va a ser tan grande y el NADH se forma por flujo inverso de electrones.

Viven en lugares con hidrógeno, comparten hábitat con bacterias fermentadoras ya que forman oxígeno.

- Bacterias oxidadoras del monóxido de carbono: obtienen la energía de la oxidación del CO CO2.Son facultativos, todas las bacterias son heterótrofas (obtienen la energía y el carbono de compuestos orgánicos).Se encargan de eliminar el CO que se sintetiza debido a la actividad industrial.

CO + H2O CO2 + 2H+ + 2e-

Se encuentran dentro de los géneros Pseudomonas y Bacillus.

Lección 14. Bacterias Quimioorganotrofas heterótrofas.

A partir de ahora todas las bacterias que estudiemos van a sintetizar la energía y sus componentes celulares con materia orgánica.

Bacterias metanotrofas y metilotrofas.Metanotrofas son las que obtienen la energía de Metano (CH4), otros compuestos de un átomo de carbono (metanol, metilamina,...), o de compuestos de más de un átomo de carbono pero sin que estén unidos entre sí (dimetilamina). Pero siempre se tiene que encontrar la molécula de metano.Son proteobacterias por lo que son Gram -. Pueden tener distintas formas (bacilos, cocos,...), son aerobios estrictos, y normalmente son microaerófilos (la presión parcial de oxígeno es menor a la de la atmósfera).Poseen en el citoplasma un gran cantidad de membrana intracitoplasmática con esteroles, donde se lleva a cabo el proceso de obtención de energía. Se han hecho do grupos:

- Bacterias metanotrofas de tipo I.- Bacterias metanotrofas de tipo II.

La forma de diferenciarlas son las siguientes:· La vía de asimilación de los compuestos carbonados.

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· Distribución de la distancia de las membranas intracitoplasméticas.· Capacidad de formar formas de resistencia: cistos o exosporas.A partir del metano, por la metano-monooxigenasa, se oxida a metanol. Se oxida a forma aldehido y este a CO2.los electrones y los protones irán a la cadena transportadora. La forma aldehido puedeseguir oxidándose o ir a biosíntesis a través de dos rutas que es en lo que se diferencian las de tipo I y II.En las de tipo I la forma aldehido se van a la ruta de la ribulosa monofosfato. Todas las membranas están distribuídas por toda la célula y forman cistes.En las de tipo II el forma aldehido se une a la serina que se forma Acetil CoA qe es el que va a ir a los procesos de biosíntesis. Todas las membranas se encuentran en la periferia y forman exosporas.Se encuentran donde ha metano, donde hay productores de metano, que son las archeobacterias metanogénicas, que se encuentran en lodos, y en zonas carboníferas.

Metilotrofas son las que obtienen la energía de compuestos de un átomo de carbono (metanol, metilamina,...), o de compuestos de más de un átomo de carbono pero sin que estén unidos entre sí (dimetilamina).Salvo el G. Methylophyfus que es obligado, los demás son facultativos.

Lecciones 16 y 17. Bacterias Quimioorganotrofas heterótrofas aeróbicas.

Utilizan compuestos orgánicos en general.Las Pseudomonas y géneros relacionados.Dentro de las Pseudomonas se encuentran organismos con las siguientes características:· Bacilos.· Son proteobacterias, por lo que son Gram -.· Todos son quimioorganotrofos heterótrofos, por respiración aeróbica, estos organismos nunca son fermentadores.G. Pseudomonas: se encuentra dentro de las – proteobacterias.Son bacilos cortos, y pueden ser un poco curvados. Todos son móviles por flagelación polar.No forman ningún tipo de estructuras de resistencia.Pueden acumular gránulos de polifosfato en su interior.Poseen membrana externa, es más impermeable a compuestos antimicrobianos que las de otros gram -, son resistentes al tratamiento con antibióticos o detergentes.Siempre utilizan la vía de Entner- Doudoroff para transformar la glucosa en pirúvico. Son organismos muy versátiles ya que pueden utilizar una gran cantidad de compuestos de carbono (azúcares, ácidos, alcoholes), o incluso compuestos serobióticos (muy difíciles de degradar).Se encuentran en suelos, sobre material en tescomposición. Participan en el ciclo de la descomposición de la materia orgánica.Hay especies patógenas en hombres y plantas.

- G.P. aeuruginosa: producen pigmentos como la pioverdina (de color verde y es quelante del hierro, capta hierro), y la piocianina (que tiene propiedades antimicrobianas).Es un microorganismos patógeno oportunisma, están implicadas en enfermedades nosocomiales, porque pseudomona contamina muy fácilmente el

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material quirúrgico. Hay que tener mucho cuidado con él en la unidad de quemados, porque produce pus azul.Puede producir otitis, infecciones respiratorias y en ojos. Presentan patógenos R (resistentes).

- G.P. fluorescens. solo producen pioverdina. No es patógeno pero puede contaminar productos sanguíneos, no crece a temperatura de 37ºC.

- G. P. putida. Esta posee un plásmido tol que permite al microorganismos metabolizar hidrocarburos.

- G. P. syringae. Es patégena de plantas con una proteína que permite que las moléculas de agua formen cristales de hielo, se utiliza para hacer nieve artificial.

Hay otros géneros relacionados con las Pseudomonas como el G. Zooglear: es un bacilo, Gram – ya que es una proteobacteria, poseen un flagelo polar. Hay una especie importante que es la Z. ramigera se utiliza en la depuración de aguas residuales. Poseen un metabolismo muy activo, pueden degradar gran cantidad de materia orgánica.Durante su crecimiento forman polisacárdos que se sitúan por fuera del microorganismo que permite que las bacterias se unan unas a otras formando flóculos que pueden ser utilizados por protozoos, o simplemente van a sedimentar por sí mismos, es fácil su eliminación.Por lo que se dice que es un componente importante de los fangos activados.

Organismos fijadores de nitrógeno.- En simbiosis con leguminosas : vamos a hacer referencia a tres géneros.

G. Rhizobium. Es el más importante.G. Bradyrhizobium.G. Azorhizobium.Características generales:· Todos ellos pertenecen a los alfa proteobacterias, por lo que son Gram -.· Son móviles por flagelos, pero nunca polar.· Proceso de fijación de nitrógeno. Reduce en nitrógenos a amoniaco que es asimilado por la planta en forma de compuesto orgánico.En este proceso tiene una gran importancia un complejo denominado nitrogenasa que está formado por dos enzimas, la dinitrogenasa y la reductasa de la dinitrogenasa.Este complejo tienen una particularidad, sólo funciona en condiciones anaeróbicas totales o en lugares con poca cantidad de nitrógeno.Este proceso se conocía desde la antigüedad. Estas bacterias las descubrió Beijerink, en leguminosas había nódulos esenciales para que se produjese la fijación del nitrógeno, solamente lo hacen las bacterias.Existe una asociación directa entre la especie de Rhizobium y la planta que se une.Formación de nódulos fijadores de nitrógeno.El primer paso es la adherencia, la bacteriase une a un pelo radical gracias a unas proteínas que la bacteria posee en su pared y que se denominan ricadesinas. También están implicadas lectinas (sintetizadas por la planta). Una vez que la bacteria se ha adherido la siguiente etapa es que la bacteria empieza a expresar unos genes Nod que producen unos factores Nod. Estos factores están implicados en que el pelo radical se curve. Cuando se han curvado el microorganismos entra dentro del pelo radical que induce a formar un tubo de

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celulosa denominado tubo de infección por donde el microorganismo penetra y llega al cortex de la raíz.También participan en el crecimiento celular, inducen la formación de un nódulo.Cuando está formado, las células de Rhizobium (bacilos cortos) inician un proceso de transformación, se inchan, se deforman y pierden su capacidad reproductora denominándose bacteroides y es ahora cuando tienen la capacidad de fijar el nitrógeno. Estos bacteroides se unen en grupos de 2-3 envolviéndose de una membrana peribacteriodal formando simbiosomas.En este simbiosoma son los que van a llevar a cabo la fijación del nitrógeno. No todas las células van a sufrir esta transformación y cuando los nódulos caen al suelo se pueden unir a otra planta.Proceso de fijación de nitrógeno.Lo único que necesitamos es poder reductor. Es un proceso que necesita mucha energía ya que el hidrógeno es muy estable.El nitrógeno se va a reducir con 4 electrones y 4 protones dando 2NH, añadimos otros dos protones y electrones y se forman 2NH2 y si volvemos a añadirotros dos protones y electrones se forman 3NH3. entre 16 y 24 ATP son necesarios para la fijación del nitrógeno.La bacteria obtiene el ATP y el poder reductor de la fotosíntesis de la planta.Se necesita la nitrogenasa (complejo), ¿y cómo paricpa? El poder reductor lo va a tomar primero una proteína de hierro y azufre (flavoproteína), le cede los electrones a la reductasa de dinitrogenasa, que se los pasa a la dinitrogenasa y después llegan al nitrógeno.Para que esta reacción funcione la presión parcial tiene que ser muy baja o en condiciones anaeróbicas. Se utiliza una proteína leg Hemoglobina que sintetiza al 50% la bacteria y la planta, su función es unir el oxígeno, reduciendo la presión parcial. El grupo hemo es sintetizado por la bacteria y la proteína por la planta.

- Fijadores de nitrógeno libres :G. Azotobacter: se trata de un fijador de nitrógeno de vida libre más conocido.Es una proteobacteria gram -. Es un bacilo móvil por flagelación. Son respiradores aeróbicos. Forman unas células de resistencia formando cistos (células más engrosadas que le permite al organismo sobrevivir en condiciones extremas). Son mucho menos resistentes al calor que las exosporas.Tiene que solucionar el problema para que la nitrogenasa funciones. Está consumiendo oxígeno y así puede actuar, tiene una alta tasa respiratoria.G. Azomonas: actúa de la misma manera pero no forma cistos.

Organismos que no fijan el nitrógeno.G. Agrobacterium: pertenece también a las proteobacterias, es un aerobio estricto. Es un bacilo móvil por flagelos laterales.La importancia radica en que es un patógeno de plantas, produciendo tumores. Este microorganismos también ha adquirido gran importania en la biotecnología.Hay dos especies importantes.

- A. Tumefaciens: provoca tumoraciones en el tallo denominado agallas.- A. Rhizogenes: produce un crecimiento grande de las raíces denominándose

raíces pilosas.

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Estos tumores se los provocan a plantas dicotiledóneas. Esto se produce por la presencia de un plásmido, en el caso de A. Tumefaciens es el Ti, y en el caso de A. Rhizogenes es Ri.Proceso de formación de las agallas.El microorganismo va a entrar dento por una herida adheriendose.Están implicadas un polisacárido que tiene al microorganismo en su parede y también participan peptinas de la planta.Una vez unida a la planta, parte del plásmido T-DNA (donde están sintetizados los oncogenes y otros genes que codifican opinas que sirven como fuente de carbono para la bacteria) es la que va a pasar a la planta. En el plásmido hay otros genes denominados vir (virulencia) que van a codificar para endonucleasas que son las encargadas de liberar el DAN, también están codificadas proteínas encargadas de transportar DNA a la planta.Una vez dentro se integra con el DNA de la planta, de forma que cuando se multiplique el DNA se la planta se multiplicará el DNA bacteriano, expresándose oncógenes y opinas, dando lugas a la tumoración.En importante en ingeniería genética, ya que pueden ser introducidos genes en la región del DNA, resistentes a la sequía, se suelen meter genes marcadores,...G. Legionella: se trata de bacilos, son proteobacterias por lo que son Gram -. Son móviles por flagelación lateral o polar, dependiendo de l especie.L. pneumóphila: produce la legionelosis (neumonía) o la fiebre de pontiac. Se descubrión en 1976 cuando los legionarios se reunieron en Pensilvania donde hubo un brote de neumonía, como era nuevo se le puso el nombre en honor a los legionarios.Se trata de un organismo que crece muy bien en los sistemas de refrigeración por evaporación. La legionelosis no se contagia por contacto humano, sino por aerosoles, hay que hacer limpieza de las torres para eliminarlos. Suelen tener preferencia en hombres a partir de los 50 años con problemas de tabaquismo. La fiebre de pontiac no es grave.

Lección 18. Anaerobios facultativos.

Vamos a centrarnos en el estudio de dos familias.F. Enterobacteriaceae.Se trata de proteobacterias, por lo que son Gram -. Son bacilos cortos, aunque hay algunos que al ser tan cortos se les denomina coco-bacilos.Los hay mólives por flagelos pericritos e inmóviles.Crecen en los medios de cultivo, la mayoría de ellos contienen bilis.Metabólicamente son anaerobios facultativos, por los que peden realizar la respiración tanto aeróbica como la anaeróbica y estos microorganismos si que son fermentadores. Son capaces de fermentar la glucosa por la vía ácido mixta (produciendo muchos ácidos y algunos gases, da positivo en la prueba del Rojo de Metilo) o por la vía butanodioica (formando poca cantidad de ácidos y 2,3-butanodiol, dando positivo en la prueba VP).El hábitat es variado, son microorganismos que se van a encontrar en el suelo, en aguas, plantas, algunos viven en el intestino (animales o humanos) indican contaminación fecal.En el género Escherichia la especie más importante es E.coli: tiene todas las características de la familia. Fermenta la glucosa por la vía ácido mixta, también fermenta la lactosa por lo que es un coliforme. Es considerado como un coliforme fecal ya que habitan en el intestino. E.coli fermenta la lactosa a 37º y a 44º, pudiéndola diferenciar de otras especies.

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Es uno de los parámetros legislados en el agua potable según el real decreto 140/2003 no se permite la ausencia de E.coli cada 100ml.La mayoría de las cepas no son patógenas, es más estas cepas son beneficiosas para nosotros porque ayudan en la formación de la vitamina k y de algunas del grupo b.Hay algunas patógenas que producen infecciones urinarias, meningitis (k12), se has descubierto otras que producen procesos diarreicos, se consideran hasta 4 cepas de E.coli: ECEI, ECET, ECEP y ECEH, estas últimas son las más importantes.El género Salmonella tiene las mismas características de toda la familia, también fermenta la glucosa por la vía ácido mixta, no es coliforme por lo que no fermenta la lactosa. Se trata de un patógeno, la especie más importante es S.enterica subespecie enterica, dentro de estas hay serotipos como el –Typhi, -Paratyphi, -Enteritidis, - Typhimurium. Ocasiona dos tipos de enfermedades, cuando hablan de salmonelosis nos referimos a –Enteritidis y –Typhimurium, y las dos primeras ocasionan las fiebres tifoideas o paratifoideas. En Europa no hay casos de fiebre tifoidea, son transmitidas a través del agua.Otro género importante es el Shigella, que es inmóvil y con las característica de la familia. Fermenta la glucosa por la vía ácido mixta. Todas las especies son patógenas, la más importante es S.dysenteriae que provoca la disentería bacilar es una gastroenteritis pero más grave, heces con sangre, pus y mocos. La que circula es la S. sonnei que ocasiona una gastroenteritis pero más leve.Se contagia persona a persona.Otro género es Yersinia también comparte las características, es inmóvil, realiza la fermentación ácido mixta y no fermenta la lactosa. Es el que produce la peste, Y.pestis, hay otra implicada en gastroenteritis, Y. Enterocolitica.Otro género es G. Enterobacter , es muy similar a E. Coli, fermenta la glucosa por la via butanodioica, es coliforme por lo que fermenta la lactosa, pero no se considera fecal. Generalmente son inmóviles. No se trata de un patógeno y puede fijar nitrógeno.Serratia es otro genero móvil que fermenta la glucosa por la vía butanodioica, no es coliforme. Es una cepa que produce un pigmento rojo denominado prodigiosina.s. marcens en hospitales puede ocasionar casos de neumonía, crece bien en aparatos de respiración asistida.El último género es el Klebsiella, comparte características con la familia, son móviles realizan la fermentación por la vía butanodioica , también fermentan la lactosa por lo que se trata de un coliforme. K. Pneumoniae presenta una cápsula por lo que son más virulentas.

F. Vidrionaceae.Son también proteobacterias por lo que son Gram -.Son bacilos cortos, muchos de ellos son curvados. Son móviles por flagelación polar.Son anaerobios facultativos y fermentadores de la glucosa y otros azúcares. Son distribuidos principalmente en aguas.Vamos a hablar de dos géneros G. Vidrio y G. Photobacterium (bacterias luminiscentes).

Dentro del género Vidrio existen una especies importantes para le medio ambiente, como es el caso de V. cholerae , V. parahaemolyticus, y V. fischerii (emite luz).V. cholerae no es halófilo, es el agente productor del cólera, por consumo de agua.V. parahaemolyticus si es halófilo, necesita sales. Produce gastroenteritis por el consumo de pescado y marisco mal cocinado.

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G. Photobacterium, son proteobacteris con forma de bacilos gruesos. Se encuentran en zonas saladas, en asociación con peces, dentro de ellos o sobre la superficie de peces muertos.Son anaerobios facultativos, y bacterias luminiscentes. La emisión de luz siempre a de ser en presencia de oxígeno, se necesita flamin mononucleótido reducido, oxígeno y un aldehido alifático de cadena larga, para dar FMN, agua, un aldehido alifático de cadena larga y luz. Se trata de una luz verde azulada.La técnica del MICROTOX se utiliza para ver si un compuesto es tóxico o no, en el caso de que sea tóxico el compuesto matará a la bacteria y no emitirá luz, pero si no lo es si que emite luz.

Anaerobias estrictas.Dentro de este grupo hay tanto gram + como gram -. Las bacterias reductoras del sulfato son importantes porque cierran el ciclo dl azufre, utilizan el sultato reduciéndolo a para producir SH2.Estas bacterias son quimioorganotrofos heterótrofos, que utilizan el sulfuro como aceptor final de electrones en la respiración.Obtienen su energía de compuestos orgánicos, tienen su cadena de trasporte.¿Cómo es el proceso por el cual el sulfato se reduce a SH2? El sulfato primero se activa con un ATP dando APS, este se reduce primero a bisulfito y después se reduce sucesivamente a triosultato, tiosulfato y por último a sulfato, a esto se le denomina reducción disiminatoria del sulfato. El otro camino es la reducción asimilatoria del sulfato, para formar aminoácidos, se incorporan los compuestos azufrados al material celular. El sulfato se activa con ATP dando APS que se vueleve a activar por medio de otro ATP y da PAPs, que mediante reducciones de reducción se forma HSO3

- y SH3.Estas bacterias se encuentran en el agua, en sedimentos, lodos, pero siempre en zonas anaeróbicas, también en el rumen pero en menor cantidad y en el tracto intestinal de algunos animales. Participan en el ciclo del azufre junto con las bacterias verdes y las púrpuras.Las más importantes son las Desulfavibrio, desulfomonas (estas dos son gram -), y desulfuotomaculum (gram +, esporulados, en las latas de conserva produciendo SH2).

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Lección 19. Quimioorganotrofos heterótrofos.

Ahora empezamos con las gram +.Se trata de cocos y bacilos no formadores de esporas.Straphylococcus.Son cocos que se agrupan formando racimos inmóviles. Son anaerobios facultativos (teniendo un metabolismo tanto respiratorio pudiendo ser aeróbico y anaeróbico, y fermentativo, formando ácido láctico).Algunos producen pigmentos carotenoides.S. aureus presenta pigmentos dorados, viven en el suelo, piel, sobre los alimentos, en la mucosa nasal. Se trata de una bacteria patógena y puede ocasionar neumonías, forúnculos, granos, el síndrome del shock tóxico , y también está implicado en gastroenteritis.Se encuentra ausente en aguas de bebida, de piscinas y en cualquier análisis de amimentos.S. epidermidis, no es un patógeno primario, vive en la piel y está asociado a alguna infección.Estos dos producen “Sline” o capa mucosa que les permite adherirse a la superficie de lentillas, prótesis, ...Diferencias entre intoxicación alimenticia e infección alimenticia:La intoxicación es cuando ingerimos la toxina de la bacteria, mientras que la infección es cuando ingerimos al microorganismo y ente en el interior de nuestro cuerpo produce las toxinas.

Bacterias de ácido láctico.Presentan bajo contenido en guanina citosina.Presentan un importante papel en la producción de alimentos fermentados. Este grupo no es sólo importante por la utilización en la industria sino que también son patógenos.Características:Se trata de Gram -, son bacilos y también cocos.Son anaerobios erotolerante. Aunque técnicamente pueden realizar la respiración, su principal metabolismo es la fermentación, siendo homoláctica (la glucosa pasa a dos ácidos lácticos) o heteroláctica (la glucosa pasa a ácido láctico dióxido de carbono y etanol).El género más importante en cocos es G. Stremtococcus, es un fermentador homoláctico. Aquí se encuentran patógenos, pero el más importante es S. pyogenes, que produce anginas (se encuentra presenta la enzima estretolisina que produce la hemolisis total de los glóbulos rojos, y también produce la escarlatina). También existen S. pneurominicie que produce neumonías, S. salivarius, ...Otro género que también es importante Enterococcus, E. Fecalis, se trata de cocos que se agrupan de dos en dos o en cadenas, se trata de un microorganismo indicador de contaminación fecal.Dentro de los bacilos el género más importante es Lactobacillus, que es interesante desde el punto de vista industrial, forma parte dela flora vaginal, denominados bacilos de Doderlein y también intestinal. Cuando desaparecen pueden producir infecciones.

Lección 20. Formadores de endosporas.

Presentan un bajo contenido en guanina citosina, y se encuentran en el volumen III del Bergey.

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Formadores de endosporas.G. bacillus, son bacilos rectos más o menos grande. Generalmente se asocian formando cadenas más o menos largas.Son aerobios y anaerobios facultativos dependiendo de la especie pueden realizar la respiración o la fermentación.Son mesófilos se encuentran entre temperaturas de 25 y 40 ª, aunque también pueden ser Termófilos.Forman endosporas, dentro de la célula

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