UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
EFEITO ANTIDEPRESSIVO-SÍMILE DA FRUTALINA, LECTINA α-D-
GALACTOSE LIGANTE, ISOLADA DE SEMENTES DE Artocarpus incisa L., EM
CAMUNDONGOS
FORTALEZA
2016
JOÃO RONIELLY CAMPÊLO ARAÚJO
JOÃO RONIELLY CAMPÊLO ARAÚJO
EFEITO ANTIDEPRESSIVO-SÍMILE DA FRUTALINA, LECTINA α-D-
GALACTOSE LIGANTE, ISOLADA DE SEMENTES DE Artocarpus incisa L., EM
CAMUNDONGOS
FORTALEZA
2016
Dissertação de Mestrado submetida à
coordenação do Curso de Pós-Graduação em
Bioquímica da Universidade Federal do Ceará
como requisito parcial para obtenção do grau
de Mestre em Bioquímica. Área de
concentração: Bioquímica Vegetal.
Orientador: Dr. Renato de Azevedo Moreira
JOÃO RONIELLY CAMPÊLO ARAÚJO
EFEITO ANTIDEPRESSIVO-SÍMILE DA FRUTALINA, LECTINA α-D-
GALACTOSE LIGANTE, ISOLADA DE SEMENTES DE Artocarpus incisa L., EM
CAMUNDONGOS
Data: 16/08/2016
BANCA EXAMINADORA
Dissertação de Mestrado submetida à
coordenação do Curso de Pós-Graduação em
Bioquímica da Universidade Federal do Ceará
como requisito parcial para obtenção do grau
de Mestre em Bioquímica. Área de
concentração: Bioquímica Vegetal.
Aos meus pais,
Sebastião Alves de Araújo e Jeanne Maria
Campêlo de Matos Araújo, pelo apoio e
dedicação para que todos os meus sonhos
sejam realizados.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por guiar os meus caminhos e ajudar em todos os momentos da minha vida.
Aos meus pais científicos e Orientadores, Dr. Renato de Azevedo Moreira e Dra. Ana
Cristina de Oliveira Monteiro Moreira, pelo apoio, paciência e dedicação para que este
trabalho pudesse ser realizado com sucesso. Por serem meus grandes exemplos na pesquisa
científica e por terem me acolhido da melhor forma possível em seu grupo de pesquisa.
À minha Co-orientadora, Dra. Adriana Rolim Campos Barros, pelo acolhimento em
seu grupo de pesquisa durante o desenvolvimento do trabalho, além de demonstrar grande
interesse e dedicação. Seu auxílio foi essencial para a realização deste trabalho.
Aos membros da banca examinadora, Professora Dra. Ana Lúcia Ponte Freitas, que
me orientou na disciplina de Ensino em Docência e me ajudou muito na realização das aulas,
e Dr. Gilvan Pessoa Furtado por aceitar o convite e contribuir com seu conhecimento.
Aos grandes amigos e pesquisadores José de Maria, Marina, Sacha, Talita e Andressa
por estarem comigo sempre quando necessário, até nos finais de semana, para que o trabalho
pudesse dar certo. Assim como também Ernani, Olavo, Robson, Isabel, Karine e Tânia.
Aos amigos pesquisadores e colegas do Laboratório F66: Kueirislene, Rossueti e
Hyldécia pela disponibilidade e ajuda nos momentos que precisei. Assim como Rogênio,
Fernanda, Melissa, Juliana, Felipe, Neto, Nydy, Marina, Márcio, Breno, Cícero, Eduardo,
Hermenson, Lorena e Nycolas por terem participado da minha trajetória no mestrado e me
apoiarem no projeto.
Ao CNPq, CAPES e FUNCAP pelo apoio financeiro.
À Universidade Federal do Ceará e Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular pela oportunidade para a realização deste trabalho. Assim como a Universidade de
Fortaleza por proporcionar todo o excelente ambiente de estudo, pesquisa e aprendizado.
Aos meus pais, Sebastião e Jeanne, por serem meu porto seguro e o apoio da minha
vida.
À minha irmã Camilla e primos Soraya e Joabe por estarem comigo no dia-a-dia e
pelo apoio. Aos meus avós, tias e primos.
Aos meus amigos Ana Estela, Alanna Cortez, Gillianne Vidal, Alana Azevedo, Ingrid
Azevedo, Cinthia Melo, Lyanne Texeira e Igor Sá por sempre torcerem pelo meu sucesso.
“O coração do homem pode fazer planos, mas
a resposta certa vem dos lábios do Senhor.”
Provérbios 16: 1.
“Que os vossos esforços desafiem as
impossibilidades, lembrai-vos de que as
grandes coisas do homem foram conquistadas
do que parecia impossível. ” Charles Chaplin
RESUMO
Frutalina (FTL), uma lectina α-D-galactose ligante, obtida de sementes de Artocarpus incisa
L., tem apresentado várias atividades biológicas, como ação na modulação de alvos
moleculares e reversão de neurotoxicidade in vitro, porém, há pouca evidência de seu efeito
sobre doenças no Sistema Nervoso Central (SNC). Diante disto, este estudo avaliou os efeitos
neurocomportamentais da FTL em camundongos. Os camundongos (n = 6 / grupo) foram
tratados com FTL (0,25; 0,5 ou 1 mg/kg; i.p.) ou Veículo (NaCl 0,9 % 10 mL/kg; i.p.;
Controle) e submetidos aos testes da placa perfurada, labirinto em cruz elevado, campo
aberto, suspensão pela cauda ou natação forçada. Num segundo conjunto de experimentos, a
ioimbina (1 mg/kg), cetamina (0,1 mg/kg), L-NAME (10 mg/kg) ou azul de metileno (10
mg/kg) foram administrados (i.p.) 15 min antes da FTL (0,5 mg/kg) e os animais foram
submetidos ao teste de natação forçada. Verificou-se também se o efeito de FTL no teste de
natação forçada era dependente da integridade estrutural e capacidade de interação a
carboidratos. A fim de avaliar o efeito subcrônico da FTL, os camundongos receberam FTL
(0,5 mg/kg) ou veículo durante 7 dias e submetidos ao teste de natação forçada no primeiro e
último dia de tratamento. Foi realizado docking molecular da FTL com NOS e receptor
NMDA. Os resultados mostraram que não houve alterações neurocomportamentais dos
camundongos nos testes de placa perfurada e campo aberto. FTL na dose mais baixa (0,25
mg/kg) aumentou o número de entradas nos braços fechados no teste do labirinto em cruz
elevado, permitindo sugerir um possível efeito do tipo ansiogênico. FTL reduziu o tempo de
imobilidade nos testes de suspensão pela cauda (0,25 e 0,5 mg/kg; p <0,05) e natação forçada
(0,25 mg/kg, p <0,05 e 0,5 mg/kg; p <0,01) apresentando um efeito antidepressivo-símile. A
redução da imobilidade provocada pela FTL foi prevenida pela Cetamina (antagonista de
receptores NMDA), L-NAME (inibidor não-seletivo da NOS) e azul de metileno (inibidor da
cGMP), mas não pela Ioimbina (antagonista α2-adrenérgico). A desnaturação da FTL, bem
como a sua associação à galactose, também preveniu o efeito antidepressivo-símile da lectina.
O efeito antidepressivo-símile da FTL permaneceu o mesmo após tratamento subcrônico (7
dias) e não houve alteração no peso dos animais. Corroborando com os resultados in vivo, os
estudos de docking molecular demonstraram que a FTL interage com a enzima NOS e
receptor NMDA. Nossos resultados demonstraram que a FTL possui efeito antidepressivo-
símile mediado por receptores NMDA e via L-Arginina/NO/cGMP, além de ser dependente
de sua integridade estrutural e capacidade de ligação a α-D-galactose.
Palavras-chave: Artocarpus incisa L. Frutalina. Depressão. NMDA. Via NO/cGMP.
ABSTRACT
Frutalin (FTL), an α-D-galactose-binding lectin isolated from breadfruit seeds (Artocarpus
incisa L.), has a range biological activities, but has not been conclusively shown to act on
CNS disorders. In this study we evaluated the effect of FTL on mouse behavior. Mice
(n=6/group) were treated with FTL (0.25; 0.5 or 1 mg/kg; i.p.) or vehicle (NaCl 0.9 %;10
mL/kg; i.p.) and submitted to hole-board (HBT), elevated plus maze (PMT), open field
(OFT), tail suspension (TST) and forced swimming (FST) tests. In a second set of
experiments, yohimbine (1 mg/kg), ketamine (0.1 mg/kg), L-NAME (10 mg/kg) or methylene
blue (10 mg/kg) were administered (i.p.) 30 min before FTL (0.5 mg/kg). In order to evaluate
the subchronic effect of FTL, animals were injected with FTL (0.5 mg/kg) or vehicle for 7
days and submitted to FST on the first and last day of treatment. A molecular docking was
conducted on the NOS enzyme and NMDA receptor. No changes were observed in HBT and
OFT results. The smallest dose of FTL (0.25 mg/kg) was associated with an increase in the
number of entries into closed arms in PMT (p<0.05). FTL reduced immobility in TST (0.25
and 0.5 mg/kg; p<0.05) and FST (0.25 mg/kg; p<0.05 and 0.5 mg/kg; p<0.01). In FST, the
effect of FTL was dependent on carbohydrate interaction and protein structure integrity and it
was reduced by ketamine (NMDA antagonist), L-NAME (non-selective NOS inhibitor) and
methylene blue (soluble guanylyl cyclase inhibitor). The antidepressant-like effect remained
after subchronic treatment. Matching the results of the experiment in vivo, the docking study
indicated an interaction between FTL and NOS enzyme and NMDA receptor. In conclusion,
FTL was found to have an antidepressant-like effect mediated by the NMDA
receptor/NO/cGMP pathway.
Keywords: Artocarpus incisa L. Frutalin. Depression. NMDA. NO/cGMP pathway.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura tridimensional da FTL ................................................................. 21
Figura 2 Síntese do óxido nítrico (NO) ...................................................................... 32
Figura 3 Teste de placa perfurada – “hole board” ...................................................... 36
Figura 4 Teste do labirinto em cruz elevado (LCE) ................................................... 37
Figura 5 Teste do campo aberto (TCA) ...................................................................... 38
Figura 6 Representação esquemática do teste de suspensão pela cauda (TSC) ......... 39
Figura 7 Teste de natação forçada (TNF) ................................................................... 40
Figura 8 Cromatografia de afinidade .......................................................................... 43
Figura 9 SDS-PAGE 12,5% e Espectros intactos desconvoluídos ............................. 44
Figura 10 Efeito da FTL no teste de labirinto em cruz elevado (LCE) ........................ 46
Figura 11 Efeito da FTL no teste de suspensão pela cauda (TSC) ............................... 48
Figura 12 Efeito da FTL no teste de natação forçada (TNF) ....................................... 49
Figura 13 Participação do sistema monoaminérgico .................................................... 50
Figura 14 Participação do sistema glutamatérgico ....................................................... 51
Figura 15 Participação da via L-Arginina/NO/cGMP .................................................. 52
Figura 16 Participação da integridade estrutural e domínio lectiníco .......................... 53
Figura 17 Efeito da administração repetida .................................................................. 54
Figura 18 Efeito da administração repetida da FTL no peso dos camundongos .......... 54
Figura 19 Docking Molecular A – FTL x Domínio Oxygenase da enzima NOS ......... 55
Figura 20 Docking Molecular A – FTL x Domínio Oxygenase da enzima NOS ......... 56
Figura 21 Docking Molecular B – FTL x receptores NMDA ...................................... 58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Efeito da FTL no teste da placa perfurada ................................................... 45
Tabela 2 Efeito da FTL no teste de campo aberto ...................................................... 47
Tabela 3 Energia da região de interação entre o domínio Oxygenase da enzima
NOS e a FTL (kcal/mol) ..............................................................................
57
Tabela 4 Energia da região de interação entre a FTL e o receptor NMDA (kcal/
mol) ..............................................................................................................
58
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMET Azul de metileno
AMPA A-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolproprionato
BBL Lectina de Bauhinia bauhinioides
BDNF Fator neurotrófico derivado do cérebro
CET Cetamina
CGL Lectina de Canavalia gladiata
GMPc Monofosfato guanosina cíclico
ConA Concanavalina A
ConBr Lectina de Canavalia brasilienses
DES Desnaturada
DSM-5 Manual diagnóstico e estatístico de transtornos mentais
EPM Erro padrão da média
ERN Espécies reativas de nitrogênio
ESI – MS Espectrometria de massas com ionização por eletrospray
FTL Frutalina
G Gravidade
GABA Ácido gama aminobutírico
GCs Guanilato ciclase solúvel
GLT Galactose
GLU Glutamato
GTP Trifosfato de guanosina
HeLa Helacyton gartleri
HIV Vírus da imunodeficiência humana
i.p. Intraperitoneal
IBN Ioimbina
IgA Imunoglobulina A
IL-2 Interleucina 2
kDa Quilodalton(s)
M Molar
mA Miliampere(s)
MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina)
NEBA Número de entrada nos braços abertos
NEBF Número de entrada nos braços fechados
NFKappaB Fator nuclear kappa B
Nl Nanolitro(s)
Nm Nanometro(s)
NMDA N-metil D-Aspartato
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
P1 Pico 1 (material não retido)
P2 Pico 2 (fração retida)
PDE-5 Fosfodiesterase-5
pH Potencial hidrogeniônico
PHA Fitohemaglutinina
rhEPO Eritropoietina humana recombinante
RIPs Proteínas inativadoras de ribossomo
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio
SNC Sistema nervoso central
TCA Teste de campo aberto
TNA Teste de natação forçada
TPBA Tempo de permanência nos braços abertos
TPBF Tempo de permanência nos braços fechados
TRP Receptor de potencial transitório
Tris – HCL Tris(hidroximetil)aminometano – ácido clorídrico
TSC Teste de suspensão pela cauda
V Volume
VGL Lectina de Vatairea guianensis
VML Lectina de Vatairea macrocarpa
Vs Versus
WHO World Health Organization
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 16
1.1 Lectinas ........................................................................................................... 16
1.2 Aplicações de lectinas vegetais ...................................................................... 18
1.3 Frutalina (FTL) .............................................................................................. 20
1.4 Lectinas e o sistema nervoso central (SNC) ................................................ 22
1.5 Considerações gerais sobre distúrbios mentais ........................................... 24
1.6 Ansiedade ....................................................................................................... 25
1.6.1 Modelos experimentais de ansiedade ............................................................. 26
1.7 Depressão ........................................................................................................ 28
1.7.1 Modelos experimentais de depressão ............................................................. 29
1.8 Neurobiologia da depressão .......................................................................... 30
2 OBJETIVOS .................................................................................................. 33
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................ 33
2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................... 33
3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 34
3.1 Frutalina: Isolamento e Purificação ............................................................ 34
3.2 Atividade Hemaglutinante 34
3.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS e
Espectometria de Massas (LC/MS) ..............................................................
35
3.4 Animais de experimentação .......................................................................... 35
3.5 Testes de atividade ansiolítica/ansiogênica .................................................. 36
3.5.1 Teste da Placa Perfurada – “Hole-board” ..................................................... 36
3.5.2 Teste do labirinto em cruz elevado (LCE) ...................................................... 36
3.5.3 Teste do campo aberto (TCA) ......................................................................... 37
3.6 Testes de atividade antidepressiva ............................................................... 38
3.6.1 Teste da Suspensão pela Cauda (TSC) ........................................................... 38
3.6.2 Teste de natação forçada (TNF) ..................................................................... 39
3.7 Análise do mecanismo de ação da FTL através de modulação
farmacológica .................................................................................................
40
3.7.1 Participação do sistema monoaminérgico ..................................................... 40
3.7.2 Participação da via glutamatérgica ................................................................ 40
3.7.3 Participação da via L-Arginina/NO/cGMP ................................................... 41
3.8 Avaliação da participação do domínio lectínico e ação da FTL
desnaturada ....................................................................................................
41
3.9 Efeito da administração repetida ................................................................. 41
3.10 Docking Molecular ........................................................................................ 42
3.11 Análise Estatística .......................................................................................... 42
4 RESULTADOS ............................................................................................... 43
4.1 Frutalina: isolamento e purificação ............................................................. 43
4.2 Avaliação da atividade ansiolítica/ansiogênica ........................................... 44
4.3.1 Teste da Placa Perfurada – “Hole-board” ................................................... 44
4.3.2 Teste do labirinto em cruz elevado (LCE) ................................................... 45
4.3.3 Teste do campo aberto (TCA) ....................................................................... 47
4.4 Avaliação da atividade antidepressiva ......................................................... 47
4.4.1 Teste da Suspensão pela Cauda (TSC) ........................................................... 47
4.4.2 Teste de natação forçada (TNF) ..................................................................... 48
4.5 Análise dos possíveis mecanismos de ação da FTL através da
modulação farmacológica .............................................................................
49
4.5.1 Participação do sistema monoaminérgico ..................................................... 49
4.5.2 Participação da via glutamatérgica ................................................................ 50
4.5.3 Participação da via L-Arginina/NO/cGMP ................................................... 51
4.6 Envolvimento do domínio lectínico e ação da FTL desnaturada .............. 52
4.7 Efeito da administração repetida de FTL .................................................... 53
4.8 Docking Molecular ........................................................................................ 55
5 DISCUSSÃO .................................................................................................. 59
6 CONCLUSÕES .............................................................................................. 65
REFERÊNCIAS ............................................................................................ 66
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 Lectinas
Dentre as macromoléculas biológicas, as lectinas constituem um importante grupo de
proteínas amplamente estudadas desde o século XIX (SHARON; LIS, 2004). Goldstein et al.
(1980) definiram lectinas como proteínas de origem não imunológica que se ligam de um
modo reversível a carboidratos, sendo capazes de aglutinar células ou precipitar
glicoconjugados sem qualquer tipo de atividade enzimática para os que são alvo da sua
ligação. Elas existem na forma livre ou associadas às células, podendo ser encontradas na
superfície ou no interior dessas (LIS; SHARON, 1998). As lectinas são amplamente
distribuídas na natureza, encontradas numa variedade de organismos como plantas, vírus,
bactérias, fungos, invertebrados (VIJAYAN; CHANDRA, 1999) e vertebrados (BARONDES
et al., 1988; HARRISON, 1991; LOH et al., 2015).
As investigações envolvendo lectinas iniciaram em 1854, quando Bower descobriu
uma emulsão alcoólica de sementes de Ricinus communis, apresentava toxicidade. Após esta
descoberta, iniciaram-se muitas pesquisas envolvendo estes extratos e em 1888 Hermann
Stillmark em sua Tese de Doutorado encontrou que extratos de Ricinus communis causava
aglutinação de eritrócitos. A palavra aglutinina foi então largamente usada para descrever
moléculas e extratos que causam agrupamento ou aglutinação de eritrócitos e outras células.
Dorset e Henley (1917) foram os primeiros a começar os testes com aplicações
biotecnológicas de lectinas, com ensaios envolvendo células humana e elaboração de
fármacos. Foi somente em 1954 que o termo lectina foi introduzido por Boyd e Shapleigh,
para enfatizar a habilidade exibida por algumas aglutininas de plantas em discriminar
eritrócitos do grupo sanguíneo ABO, devido às reações com os resíduos de açúcar expostos
(BIES et al., 2004; BOYD; SHARPLEIGH, 1954).
A era moderna da lectinologia teve início no começo da década de 60, com duas
grandes descobertas realizadas por Nowell (1960); ele estabeleceu que a lectina de Phaseolus
vulgaris, conhecida como fitohemaglutinina (PHA), e a lectina da Canavalia ensiformes
(ConA) são mitogênicas, pois possuem a capacidade de estimular linfócitos a entrar em
mitose, e que a atividade mitogênica da ConA podia ser inibida por pequenas concentrações
de monossacarídeos manose (SHARON; LIS, 2004).
17
O termo lectina foi redefinido com base em critérios funcionais e estruturais, como por
exemplo, ser uma glicoproteína capaz de se ligar reversivelmente a carboidratos, serem
distintas de imunoglobulinas e não causarem modificações estruturais nos carboidratos os
quais possuem especificidade. Atualmente definidas como proteínas que contêm pelo menos
um domínio não catalítico que lhes permite reconhecer seletivamente e se ligar de uma forma
reversível a glicanos específicos que podem estar presentes de forma livre ou fazem parte de
glicoproteínas e glicolípidos (VAN DAMME et al., 2011).
As lectinas são subdivididas em quatro classes (PEUMANS; VAN DAMME, 1998):
• As merolectinas: proteínas que possuem pelo menos um domínio de ligação a
carboidratos e por isso são incapazes de aglutinar células por serem monovalentes.
• As hololectinas: proteínas formadas por dois ou mais domínios de ligação a
carboidratos, que são idênticos ou homólogos; elas compreendem a maioria das
lectinas de plantas.
• As quimerolectinas: proteínas de fusão que possuem pelo menos um domínio de
ligação a carboidrato e um domínio não relacionado, com uma atividade catalítica bem
definida ou outras atividades biológicas (que age independentemente do domínio de
ligação a carboidratos).
• As superlectinas: proteínas que possuem ao menos dois domínios ligantes de
carboidratos que apresentam diferentes especificidades.
Monteiro-Moreira, em 2002, propôs um novo grupo, chamado de multilectinas que
seriam proteínas constituídas de domínios ligantes a carboidratos que são idênticos ou
homólogos, entretanto reconhecem açúcares estruturalmente não relacionados, ou seja, são
lectinas de especificidade múltipla.
De acordo com Vam Damme et al. (1998) também é possível estabelecer uma
classificação em sete famílias: lectinas de leguminosas, lectinas de monocotiledôneas ligantes
a manose, lectinas com domínio heveinico, proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) tipo
2, lectinas relacionadas à jacalina; amarantina e lectinas de floema de Curcubitaceae.
A maioria das lectinas de plantas está presente em cotilédones de sementes, onde
podem ser encontradas no citoplasma ou em corpos proteicos, embora elas também tenham
sido encontradas em raízes, caules, folhas (MOREIRA et al., 1991) e outros tecidos. Já foi
demonstrado que lectinas encontradas nas folhas têm propriedades similares àquelas obtidas
de sementes da mesma planta (SPILATRO et al., 1996); portanto, lectinas encontradas em
tecidos vegetais distintos podem apresentar propriedades similares.
18
A habilidade das lectinas em formar interações com carboidratos ou glicoproteínas
pode ser facilmente detectada por ensaios de aglutinação, em que essas proteínas podem
interagir através de ligações reversíveis com resíduos de carboidratos na superfície das
células, formando uma malha. O ensaio de hemaglutinação é utilizado frequentemente por
possibilitar a fácil visualização desta propriedade aglutinante de eritrócitos por lectinas;
eritrócitos utilizados no ensaio podem ser de origem humana ou de outros animais
(FLEMMING et al., 1992), frescos, ou tratados enzimaticamente ou quimicamente.
Apesar de lectinas apresentarem comumente uma alta eficiência e estabilidade,
existem alguns fatores que influenciam a atividade dessas proteínas, tais como íons, pH e
temperatura. Por exemplo, muitas lectinas necessitam de íons para manter a sua atividade
(SHARON; LIS, 1990). A estabilidade térmica das lectinas também pode ser bastante
variável; lectinas de diversas fontes mostram-se estáveis após serem mantidas congeladas por
meses ou anos, após sucessivos congelamentos e descongelamentos (CORREIA; COELHO,
1995) ou depois de mantidas por poucos dias em temperatura ambiente (RAY et al., 1992).
Apesar da grande quantidade de informação sobre sequência de aminoácidos e
especificidade de lectinas, a função fisiológica das lectinas de plantas tem sido amplamente
estudada e nem sempre definida (SHARON; LIS, 2004). Lectinas encontradas em raízes de
leguminosas podem estar envolvidas no reconhecimento e/ou ligação de bactérias fixadoras
de nitrogênio, como Rizhobium spp., desempenhando papel no estabelecimento da simbiose
(DÍAZ et al., 1989; KIJNE et al., 1992; VAN EIJSDEN et al.,1995). Várias evidências
indicam que as lectinas desempenham um papel de defesa nas plantas, protegendo estas de
microrganismos fitopatogênicos (como bactérias e fungos), de animais predadores e de
insetos (PEUMANS; VAN DAMME, 1995; SHARON; GOLDSTEIN, 1998).
1.2 Aplicações de lectinas vegetais
As lectinas vegetais, por suas características e principalmente pela possibilidade de
ligação reversível a glicoconjugados, fácil isolamento e manuseio, destacam-se como
importantes ferramentas em pesquisas de diversas áreas como Bioquímica, Farmacologia,
Biologia Celular, Biologia Molecular e Biotecnologia. Diversos autores contribuíram com
inúmeros trabalhos de aplicações de lectinas vegetais. Dentre as aplicações temos o uso de
lectinas em cromatografias de afinidade para isolamento e purificação de glicoconjugados,
receptores de hormônios, imunoglobulinas, fatores de crescimento, neurotransmissores e
outros compostos (HOWELLS et al., 1982).
19
Estas moléculas desempenham vários efeitos sobre as células, dentre eles a
aglutinação, o que possibilitou seu emprego na tipagem sanguínea; estimulação mitogênica
sobre células mononucleadas sanguíneas; e a caracterização da estrutura de glicoconjugados
presentes em células animais (LIS; SHARON, 1986a; MOREIRA et al., 1991; VIKRAM et
al., 2010).
Lectinas obtidas de diferentes plantas tem apresentado potencial atividade
antimicrobiana, como atividade antibacteriana contra bactérias Gram positivas e Gram
negativas (COSTA et al., 2010; GOMES et al., 2013; CARVALHO et al., 2015) e atividade
antifúngica contra várias espécies de fungos (VAZ et al., 2010; CHARUNGCHITRAK et al.,
2011; SOUZA et al., 2011). As lectinas, principalmente com especificidade de ligação a
manose, apresentaram atividade antiviral com alta eficácia contra o vírus HIV e a via de ação
pode estar envolvida com a inibição da atividade da transcriptase reversa (AN et al, 2006; LI
et al., 2008; PENG et al., 2009).
Além de seus efeitos contra microrganismos, as lectinas vegetais também têm
habilidade de atuar como moléculas inseticidas contra várias espécies de insetos
(VANDENBORRE et al., 2011; ARAÚJO et al., 2012; ATALAH et al., 2014), além disso,
seus genes são objetos de estudo na Engenharia Genética para serem utilizados na produção
de plantas transgênicas resistentes a pragas (MCCAFFERTY et al., 2008; AFOLABI-
BALOGUN et al., 2012).
Estudos que visam a busca por novos métodos de diagnóstico e terapia do câncer têm
crescido muito nos últimos anos, e as lectinas vegetais mostram-se promissoras nesta área.
Elas estão sendo utilizadas como marcadores tumorais podendo identificar e distinguir células
normais e neoplásicas através da interação com glicocoproteínas intracelulares ou presentes
na membrana celular. Como por exemplo, lectinas que foram capazes de reconhecer
leucemias, câncer de próstata, câncer de mama e câncer nas glândulas parótidas (BELTRÃO
et al., 1998; FERREIRA, 2010; SOBRAL et al., 2010; BEZERRA, 2014). Não apenas como
marcadores tumorais, as lectinas também têm apresentado atividades antitumorais e
anticarcinogênicas em diversas linhagens tumorais, como em células de leucemias,
osteosarcoma, adenocarcinoma, carcinoma de mama, dentre outras (FAHEINA-MARTINS et
al., 2012; OUYANG et al., 2014; QUIROGA et al., 2015; WU et al., 2016).
A ação pró-inflamatoria e antiinflamatoria de lectinas vegetais também têm sido
observada. Dependendo da via de administração utilizada, as lectinas podem ter efeitos
diferentes (RODRIGUES, 2012). Lectinas administradas localmente promovem respostas
proinflamatorias, como indução da migração de neutrófilos e ação endomatogênica, e ao
20
serem administradas por via endovenosa promovem ação antiinflamatoria, como inibição da
migração de neutrófilos e edemas (ALENCAR et al., 2010; RANGEL., 2011a; 2011b).
Diversas lectinas com diferentes tipos de afinidade de ligação, como ligantes de glicose,
manose e sacarose, tem demonstrado atividade antinociceptiva (PIRES et al., 2013; SILVA et
al., 2013; NASCIMENTO et al., 2015), atividade cicatrizante em diferentes lesões, como em
feridas de mucosa oral e feridas cutâneas (MELO et al., 2011; KIM et al., 2013; SILVA,
2014) e atividade gastroprotetora em modelos de lesões gástricas induzidas por etanol
(ABDON et al., 2012).
Lectinas vegetais tem demonstrado efeitos no sistema nervoso central, no qual elas
podem mediar funções neurais e produzir neuroproteção. Algumas lectinas apresentaram
efeitos estimulantes do tipo antidepressivo e inibição de convulsões induzidas (BARAUNA et
al., 2006; RUSSI et al., 2012). Outras lectinas apresentaram efeitos contrários, como indução
de atividade depressora e neuroinflamação (GONGALVES et al., 2013).
1.3 Frutalina (FTL)
A Frutalina (FTL) é obtida das sementes de Artocarpus incisa L. (sinonímia
Artocarpus altilis), popularmente conhecida como fruta-pão, pertencente à família Moraceae,
classe Magnoliadae que possui aproximadamente 75 géneros e 1550 espécies (BRAGA,
1976). A espécie A. incisa é uma árvore de porte médio e pode atingir até 20 metros de altura,
suas folhas são grandes (30 a 90 cm de comprimento por 30 a 45 cm de largura), o caule de
casca lisa e raízes profundas. Em relação aos frutos, há duas variedades: a variedade apyrena
que não possui sementes (variedade não seminífera) e é conhecida como “fruta-pão de massa”
e a variedade com sementes, conhecidas como “fruta-pão de caroço”, que possui fruto que
pode pesar até 6 kg (RAGONE, 1997; SIKASWAR et al., 2014).
A FTL foi isolada em 1998 por Moreira e colaboradores por meio de cromatografia de
afinidade em coluna de galactomanana reticulada de Adenanthera pavonina. É uma
glicoproteína α-D-galactose ligante (podendo reconhecer epímeros de α-D-Manose), contendo
2,1% de carboidratos em sua estrutura. Apresenta elevados teores de aminoácidos ácidos,
hidroxilados e hidrofóbicos e baixo teor de aminoácidos sulfurados e tem a capacidade de
aglutinar hemácias de vários animais, aglutinando fortemente as hemácias humanas, porém
não apresenta qualquer especificidade por antígenos do sistema ABO (MOREIRA et al.,
1998). A FTL apresenta duas bandas proteicas com massas moleculares aparentes de 12 e 15
kDa observadas em eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes
21
(PAGE-SDS), na presença e ausência de β-mercaptoetanol, evidenciando que não apresenta
pontes dissulfeto (MONTEIRO-MOREIRA, 2002).
A Frutalina é caracterizada como um tetrâmero contendo 153 aminoácidos por
monômero (MOREIRA, 1998). Sua estrutura foi obtida por Nepomuceno (2008) através de
modelagem por homologia, utilizando a jacalina, como proteína molde. Vieira-Neto (2015)
demonstrou a estrutura tridimensional através de cristalização e análises dos dados obtidos
por difração de raios-x (Figura 1), mostrando que a FTL apresenta, em cada unidade
monomérica, um β prisma simétrico, com três grupos de 4 folhas beta, cada. O sítio de
reconhecimento a carboidratos, é semelhante ao da Jacalina, e envolve o N-terminal da cadeia
α, demonstrando, na região, um enovelamento característico da família Moraceae. O sítio de
ligação da FTL consiste em uma cavidade próxima ao N-terminal da cadeia α, formada por
quatro resíduos-chave: Gly25, Tyr146, Trp147 e Asp149.
Figura 1. Fonte: Estrutura tridimensional da FTL
Fonte: Vieira-Neto (2015).
Muitos trabalhos têm sido realizados com a FTL e ela tem demonstrado muitas
atividades biológicas em diversas áreas. A FTL foi incluída na triagem para purificação do
hormônio eritropoietina humana recombinante (rhEPO) (AMADEO et al., 2003) e já foi
usada como modelo em estudos de processos de desenovelamento e renovelamento de
proteínas oligoméricas (CAMPANA, 2002).
Tem sido utilizada em estudos envolvendo a resposta imune inata, na qual a FTL
através de ligação a resíduos de galactose na superfície celular, estimula a proliferação de
22
linfócitos e produção de IL-2 pela ativação da via AKt-PI3 e modulação pelo fator NFKappaB
(PEREIRA et al., 2014). Brando - Lima e colaboradores (2005) demonstraram que a FTL é
capaz de induzir migração de neutrófilos humanos in vivo e in vitro através da interação
açúcar-proteína entre a lectina solúvel e a galactose presente na superfície do neutrófilo.
A FTL apresentou efeitos citotóxicos, como indução de apoptose e inibição da
proliferação celular, sobre as células HeLa, linhagem de câncer cervical (OLIVEIRA et al.,
2011). Também demonstrou ser altamente eficaz como marcador tumoral para
reconhecimento de neoplasias de mama (FERREIRA, 2001), tireóide (MILHOME, 2003) e
leucemia linfoblástica aguda (CAVALCANTE et al., 2016) se ligando seletivamente a
resíduos de α-D-galactose. Também é um potente ativador mitogênico de linfócitos humanos
e é capaz de se ligar a IgA (BRANDO-LIMA et al., 2005).
A FTL também apresentou atividade gastroprotetora em modelo experimental de lesão
gástrica aguda induzida por etanol, mostrando ser promissora para o desenvolvimento de
agente fitoterápico no combate a patologias gástricas (ABDON et al., 2012). Apresentou
efeito antinociceptivo observado na dor orofacial aguda e neuropática, podendo ser mediada
por receptores TRPA1, TRPV1 e TRPM8 (DAMASCENO et al., 2016). Ela também foi
capaz de reverter de forma significativa a excitotoxicidade glutamatérgica in vitro, sugerindo
um potencial neuroprotetor para essa lectina (JACQUES, 2012).
1.4 Lectinas e o sistema nervoso central (SNC)
Como já foi observado, as lectinas vegetais são utilizadas em várias pesquisas de
diversas áreas. A utilização destas proteínas na área de neurobiologia tem crescido muito nos
últimos anos e merece mais atenção, tendo em vista que existem poucas pesquisas nesta
temática quando comparamos a outras áreas como utilização de lectinas como agentes
antitumorais e antimicrobianos. A importância de novas pesquisas nesta área se dá ao fato de
que lectinas vegetais tem demonstrado capacidade potencial de modular alvos moleculares
que dentro do sistema nervoso central (SNC) poderiam estar envolvidos na resposta a
determinadas drogas de ação central, na regulação comportamental e na neuroplasticidade
(CAVADA et al., 2001; RUSSI et al., 2012).
A lectina Concanavalina A (ConA), extraída das sementes de Canavalia ensiformes
(Família Fabaceae) possui especificidade de ligação a glucose/manose, foi utilizada em
pesquisas que envolvem o isolamento de glicoproteínas sinápticas e estudo de indução de
mudanças conformacionais em receptores glutamatérgicos (FAY; BOWIE, 2006); também
como ferramenta em estudos da função neural e neuroplasticidade, apresentando melhoria no
23
crescimento de neurites, alterações na especificidade, força e bloqueio de conexões sinápticas
e modulação das respostas e mecanismos de liberação de neurotransmissores (LIN;
LEVITAN, 1991; SCHERER; UDIN, 1994; BOEHM; HUCK, 1998).
A ConBr, lectina extraída das sementes da Canavalia brasilienses (MOREIRA;
CAVADA, 1984), a qual apresenta 99% de similaridade na sequência de aminoácidos da
ConA e a mesma especificidade de ligação por glucose/manose (APARICIO et al., 1997),
apresentou efeito antidepressivo-símile em camundongos no modelo do teste de nado forçado
e foi dependente da ativação dos sistemas serotoninérgicos (via 5HT1 e 5HT2), adrenérgico
(via α1adrenérgico) e dopaminérgico (via receptor tipo D2) (BARAUNA et al., 2006).
Estudos mais recentes mostraram que esta ação tipo antidepressiva provocado pela
administração central de ConBr, pode ocorrer por meio do sistema glutamatérgico (através de
receptores NMDA) (RIEGER et al., 2014). ConBr também apresentou efeito neuroprotetor no
modelo de convulsões induzidas por ácido quinolínico, a qual foi capaz de inibir a severidade
das convulsões (RUSSI et al., 2012).
Jacques (2012) realizou um “screening” da atividade neuroprotetora de lectinas em
modelos de fatias hipocampais de camundongos tratadas in vitro com glutamato, através do
teste de viabilidade MTT. Foram utilizadas as lectinas ConBr e CGL (obtidas de sementes de
Canavalia gladiata) que possuem afinidade de ligação por glucose/manose, e as lectinas FTL
(obtidas de sementes de Artocarpus incisa), BBL (obtidas de Bauhinia bauhinioides) e VGL
(obtidas de sementes de Vatairea guianensis) que possuem afinidade de ligação por galactose.
ConBr, FTL e BBL foram capazes de reverter de forma significativa a excitotoxicidade
glutamatérgica in vitro, sugerindo um potencial neuroprotetor para essas lectinas frente à
neurotoxicidade do glutamato.
As galectinas, são uma família de lectinas endógenas presentes no organismo de
animais, possuem especificidade de ligação por β-galactosídeos, estão distribuídas dentro e
fora das células e estão envolvidas na regulação de vários processos celulares (BARONDES
et al., 1994; ELOLA; FINK, 2000). A galectina-1, uma das galectinas mais estudadas, é
amplamente expressa no SNC e tem se destacado como molécula moduladora de funções
neurais, ações neuroprotetoras e neuroplasticidade (CAMBY et al., 2006; QU et al., 2011;
STAROSSOM et al., 2012; GAUDET et al., 2015). VML, uma lectina isolada das sementes
de Vatairea macrocarpa, assim como a galectina-1 possui afinidade por galactose, foi capaz
de induzir um comportamento do tipo depressivo e aumentar a expressão de proteínas
relacionadas à inflamação e reatividade glial, apresentando efeitos potencialmente tóxicos
sobre o hipocampo de camundongos, aparentemente envolvendo respostas neuroinflamatórias
24
(GONÇALVES et al., 2013). Comparando às ações neuroprotetoras descritas para a lectina
endógena galectina-1 e a ação neuroinflamatória da lectina vegetal VML, é possível sugerir
um papel duplo de lectinas com afinidade por galactose na função neural (GONÇALVES et
al., 2013).
As lectinas com afinidade por galactose tem se destacado como importantes moléculas
moduladoras da função neural (IMAIZUNI et al., 2011; STAROSSOM et al, 2012). A lectina
endógena galectina-1, possui afinidade por galactose e tem sido muito estudada pelos seus
efeitos no SNC (KAJITANI et al., 2009; QU et al., 2010; QU et al., 2011). A administração
de galectina-1 após isquemia focal cerebral conduziu a uma serie de respostas neuroprotetoras
como: recuperação motora dos animais, produção de BDNF, diminuição da perda neuronal,
estimulo da neurogênese e inibição da astrogliose (ISHIBASHI et al., 2007; QU et al., 2010;
QU et al., 2011).
Diante de todos os achados, a FTL, por apresentar inúmeras atividades biológicas
como reconhecimento de neoplasias, ativação mitogênica, modulação de alvos moleculares e
ação gastroprotetora, pode auxiliar na compreensão do papel da interação de lectinas com
afinidade por galactose no SNC e apresentar efeitos neuroprotetores.
1.5 Considerações gerais sobre distúrbios mentais
Segundo o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais - DSM-5
publicado em 2014, um transtorno mental é uma síndrome caracterizada por perturbação
clinicamente significativa na cognição, na regulação emocional ou no comportamento de um
indivíduo que reflete uma disfunção nos processos psicológicos, biológicos ou de
desenvolvimento subjacentes ao funcionamento mental. (DSM-5, 2014).
Os transtornos mentais são doenças crônicas muito prevalentes no mundo e
contribuem para morbidade, incapacitação e mortalidade precoces. De acordo com a
Organização Mundial da Saúde (WHO, 2013), os transtornos mentais atingem
aproximadamente 700 milhões de pessoas no mundo, representando 13% do total de todas as
doenças. Em 2012, um trabalho mostrou que, na região metropolitana de São Paulo, 29,6% da
população apresenta transtorno mental, com grau moderado ou grave em dois terços dos casos
(ANDRADE et al., 2012).
No Brasil, em 2011, os gastos com saúde mental representaram 2,38% dos gastos com
saúde, sendo apenas 0,32% dos gastos totais destinados a hospitais psiquiátricos. O
investimento em hospitais psiquiátricos é baixo quando comparado a outros países, indicando
25
um investimento maior em terapia medicamentosa e criação de rede substitutiva aos hospitais.
Sendo assim, o Brasil segue a tendência mundial de aumentar seus gastos com medicamentos
para desordens psiquiátricas e vale ressaltar que sua política de saúde mental é relativamente
recente, portanto, o investimento nos próximos anos deve ser ainda maior (WHO, 2014).
Diante disto, tem crescido a busca por moléculas fitoterápicas que agem sobre o
Sistema Nervoso Central (SNC) que podem alterar as funções cerebrais e assim produzir
transitórias mudanças de humor, comportamento e percepção (PIMENTA, 2014). Há mais de
50 anos vêm sendo utilizados modelos de estudos em grupos de animais com resultados
convincentes, estes modelos são largamente utilizados no mundo inteiro e são particularmente
úteis na descoberta de fármacos para o tratamento de diversos tipos de distúrbios mentais
como ansiedade e depressão (BUCCAFUSCO, 2009; PIMENTA, 2014).
1.6 Ansiedade
A palavra ansiedade é usada para descrever um estado emocional transitório que varia
de intensidade e no tempo e que se caracteriza por um sentimento de tensão ou apreensão e
por um aumento na atividade do sistema nervoso, ao qual se associa à ocorrência de tremores,
falta de ar, aumento dos batimentos cardíacos, sudorese, alterações gastrointestinais, tonturas,
desmaios e outros sintomas (SPIELBERGER, 1972). Tem sido uma das causas mais comuns
que levam os pacientes a procurarem auxílio médico ou psiquiátrico (ANDRADE;
GORENSTEIN, 1998).
Os transtornos de ansiedade são caracterizados por ansiedade excessiva, medo
persistente e excessivo ou irracional. As pessoas que sofrem com transtornos de ansiedade
sentem-se, frequentemente, irritadas e depressivas, pois não tem capacidade de lidar com as
alterações fisiológicas que ocorrem com o organismo (GAZZANIGA; HEATHERTON,
2005). Os transtornos de ansiedade mais comuns são: de pânico, fobia o transtorno específica,
fobia social, transtorno obsessivo-compulsivo e a desordem de estresse pós-traumático. Essas
desordens diferem uma da outra pela natureza do estímulo, provocando a ansiedade (CRYAN;
HOLMES, 2005).
A ansiedade pode alterar o metabolismo geral do corpo e causar diversas outras
doenças, como taquicardia, na qual respiração se torna mais curta e ofegante em consequência
do bater acelerado do coração, que exige maior oxigenação na circulação, o que pode causar
falta de ar, engasgamento e dores no peito. Com pouco sangue na cabeça, a ansiedade pode
causar tonturas, visão borrada, dores de cabeça, confusão, fuga da realidade e sensações de
26
frio e calor (BARLOW, 1999; ROMAN; SAVOIA, 2003). A ansiedade também pode causar
alterações na atividade do sistema digestivo (causando náuseas, sensação de peso no
estômago, constipação ou diarréia) e sintomas de tensão, que podem acarretar dores. A
ansiedade também envolve a mudança na atenção do indivíduo que podem acarretar ao
indivíduo dificuldade de concentração e problemas de memória (BARLOW, 1999; ROMAN;
SAVOIA, 2003).
O uso de substâncias com o objetivo de obter sedação e alívio para as tensões
cotidianas acompanha o homem desde a Antiguidade. Há relatos sobre o uso de substâncias
capazes de produzir estupor e certo grau de inconsciência, estado em que rituais religiosos,
"mágicos" e procedimentos médicos transcorriam, em escritos de todas as antigas culturas
(HARVEY, 1985). No final do século XIX, o etanol, o paraldeído, o hidrato de cloral e os sais
de brometo já eram utilizados como depressores do sistema nervoso central (SNC) e
introduzidos especificamente como "ansiolíticos" (HOLLISTER, 1983; LOUDON, 1988). Em
1963 foi lançado no mercado um dos fármacos ansiolíticos mais utilizados, o diazepam, que
surgiu como uma alternativa ao clordiazepóxido (SILVA, 1999).
Hoje são inúmeros os fármacos usados com este fim. Do ponto de vista farmacológico
estes fármacos apresentam ação tranquilizante, mio-relaxante, anticonvulsivante,
potencialização do álcool e outros medicamentos, e do ponto de vista químico podem dividir-
se em carbamatos, piperazinas e benzodiazepinas (NEMEROFF, 2003). Entretanto, estes
fármacos apresentam alguns inconvenientes, o que justifica a busca por novas substâncias
ansiolíticas. Como exemplo temos os benzodiazepínicos que provocam sedação, amnésia,
podem causar dependência, síndrome de abstinência e interações com outros depressores do
SNC, por isso, muitos estudos estão sendo conduzidos para encontrar alternativas medicinais
que apresentem efeitos ansiolíticos mais específicos, como por exemplo, o uso de
fitofármacos (FAUSTINO et al. 2010; SOUSA et al. 2008).
1.6.1 Modelos experimentais de ansiedade
Os modelos animais de ansiedade procuram reproduzir uma situação ambiental de
provável ocorrência de diferentes formas de aversão ou desconforto. Geralmente isso é feito
expondo-se animais a ambientes novos ou potencialmente perigosos, estímulos ou contextos
associados a estímulos nociceptivos moderados, dentre outros (CRUZ et al., 1997). Os
padrões comportamentais e as reações fisiológicas ativadas pelo contato com essas fontes
indicadoras de perigo em potencial são utilizados como medidas de ansiedade e geralmente
27
apresentam grande correspondência com as medidas de ansiedade em humanos. (TREIT,
1985).
O desenvolvimento de modelos animais recebeu impulso importante pelo advento de
novas drogas ansiolíticas e pela compreensão da neurobiologia da ansiedade (LACERDA,
2006). Dentre os modelos mais utilizados nessa abordagem temos o teste de campo aberto,
oteste de labirinto em cruz elevado e o teste de placa perfurada.
O teste do labirinto em cruz elevado é um dos modelos mais utilizados na pesquisa da
ansiedade. Foi desenvolvido por Handley e Mithani em 1984, para ratos e validado por Lister
(1987) para camundongos. O aparelho possui 70 cm de comprimento e apresenta dois braços
fechados, de face um para o outro, e dois braços abertos, também perpendiculares, cada qual
medindo 45 x 10 cm. Os braços fechados também apresentavam paredes laterais com 10 cm
de altura. Os autores constataram que drogas ansiolíticas aumentavam a proporção entre
entradas e tempo de permanência nos braços abertos, ao passo que drogas ansiogênicas
diminuíam esta proporção (HANDLEY; MITHANI, 1984).
Outro teste muito utilizado é o teste da Placa Perfurada ou holeboard que foi
desenvolvido por Boissier e Simon em 1962 e atualizado por Takeda, Tsuji e Matsumiya em
2006. O aparelho consistiu de uma arena quadrada medindo 25 x 25 cm, construído em
acrílico, e no piso da arena tinham 4 orifícios de 3 cm de diâmetro, equidistantes. Este teste
tem como base a exposição do camundongo a luta entre a tendência exploratória de um novo
ambiente e a tendência à esquiva gerada pelo medo dos perigos potenciais que um novo
ambiente carrega. Os parâmetros que podem ser observados neste aparelho são a frequência
de mergulhos de cabeça nos orifícios ou head dipping, freqüência de levantamentos
(rearings), tempo de autolimpeza (grooming) e defecação. A premissa do teste é analisar a
diminuição ou aumento da frequência de mergulhos de cabeça dos camundongos nos orifícios
da placa, o que caracteriza drogas ansiogênicas e ansiolíticas, respectivamente (TAKEDA;
TSUJI; MATSUMYIA, 2006).
O teste de campo aberto (TCA) também é utilizado como uma ferramenta nas
pesquisas envolvendo testes comportamentais para ansiedade (Hall, 1934). O comportamento
do animal é determinado pelo conflito entre a motivação para explorar e a aversão a lugares
abertos, desprotegidos e iluminados, logo drogas de perfil ansiolítico ou ansiogênico tendem a
aumentar ou diminuir a ambulação no campo aberto, respectivamente. (WHIMBEY;
DENENBERG, 1967; CRUSIO et al., 1989; SCHMITT; HIEMKE, 1998).
O aparelho consiste de uma arena com aproximadamente 1,2 m de diâmetro,
circundada por uma parede circular de 0,45 m de altura. No teste é observado
28
comportamentos como locomoção (número de cruzamentos no chão da arena pelo animal),
freqüência de levantamentos (rearings), tempo de autolimpeza (grooming), defecação, tempo
gasto para deixar a área central (PRUT; BELZUNG, 2003, CAROLA et al., 2002). O
comportamento de diminuição de cruzamentos associado a diminuição no número de
levantamentos é considerado um efeito sedativo, enquanto que um aumento no número de
levantamentos e cruzamentos é considerado um efeito estimulante (PRUT; BELZUNG,
2003). O comportamento de auto-limpeza se reflete em um movimento de lambidas em
direção céfalo-caudal visando a limpeza da cabeça, patas, cauda e genitálias (VANERP et al.,
1994; KRUK et al., 1998; KALUEFF; TUOHIMAA, 2004).
1.7 Depressão
Segundo a Organização Mundial da Saúde, a depressão é um transtorno mental
caracterizada pela presença de humor deprimido ou perda do interesse e prazer pela maior
parte das atividades. Estima-se que hoje, no mundo, 350 milhões de pessoas vivam com
depressão e que se persistirem as tendências atuais, a carga da depressão subirá a 5,7 % da
carga total de doenças, passando a ser a segunda maior questão de saúde pública (WHO,
2001, 2010). Os principais sintomas são caracterizados por alterações no apetite ou peso, no
sono, e na atividade psicomotora; assim como também por sentimentos de culpa, falta de
concentração, pensamentos recorrentes sobre morte, ideação suicida, planos e/ou tentativas de
suicídio (DSM-IV-TR, AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 2002).
A depressão está associada a mudanças hormonais e fisiológicas no organismo que
podem estar envolvidas em determinadas doenças crônicas (BOING et al., 2012). Já foi
descrito relação de episódios depressivos com aumento nos níveis de cortisol, impacto no
sistema nervoso autônomo e em fatores metabólicos e diminuição na variabilidade da
frequência cardíaca (BROWN et al, 2004; CARNEY et al., 2005; KATON, 2011). Pacientes
com depressão também podem ter muitas complicações em doenças como diabetes,
hipertensão, retinopatia, neuropatia, nefropatia, dentre outras (DE GROOT et al., 2001;
GANGWISCH et al., 2010).
Existem muitos medicamentos antidepressivos no mercado, mas muitas vezes não
possuem uma boa eficácia e mesmo quando são eficazes, possuem algumas limitações para a
escolha de um tratamento, pois é muito comum efeitos adversos a estes medicamentos, que
muitas vezes são bastante severos (ERNEST, 2009; PAPAKOSTAS, 2010).
29
Muitas vias neurais estão envolvidas na fisiopatologia da depressão, logo existem
várias classes de medicamentos antidepressivos. Dentre os mais utilizados para esta desordem
são os Antidepressivos Tricíclicos que atuam no bloqueio de recaptura de monoaminas,
principalmente norepinefrina e serotonina, tendo como exemplo a imipramina, doxepina,
protriptilina e amitriptilina; os antidepressivos os Inibidores da Monoaminoxidase, que é a
enzima envolvida no metabolismo de serotonina, noradrenalina e dopamina, e são
representados pela fenelzina, isocarboxazida e a tranilcipromina; e os Inibidores Seletivos da
Recaptação de Serotonina que incluem a fluoxetina, paroxetina, sertralina, fluvoxamina e o
citalopram (MORENO et al., 1999; NUTT, 2008; KATZUNG, 2010).
No geral, os medicamentos antidepressivos atuam produzindo aumento na
concentração de neurotransmissores na fenda sináptica através da inibição do metabolismo,
bloqueio de recaptura neuronal ou atuação em autoreceptores pré-sinápticos, porém estes
medicamentos requerem de 2 - 4 semanas (ou mais) para a produção de uma melhoria
clinicamente significativa na sintomatologia depressiva. Este início tardio pode ter
consequências terríveis para os pacientes com ideação suicida (15% dos indivíduos
deprimidos cometem suicídio) (ROSENZWEIG-LIPSON et al., 2007; SKOLNICK et al.,
2009).
1.7.1 Modelos experimentais de depressão
Em modelos animais não há condição conhecida que corresponda à exata condição
inata da depressão em seres humanos, no entanto, tais modelos são um excelente método na
identificação de novos antidepressivos, de seu mecanismo de ação e no estudo da
neurobiologia da depressão (VIEIRA, 2001). Vários procedimentos foram descritos, que
produzem em animais estados comportamentais (retirada da interação social, perda de apetite,
atividade motora reduzida, estresse, situações inexplicáveis, entre outros), análogos à
depressão humana (PORSOLT et al., 1977).
Não existem muitos modelos experimentais para testes de depressão, tendo em vista
que as causas e sintomas desta doença são de difícil reprodução em animais. Os modelos teste
do nado forçado (TNF) e o teste de suspensão da cauda (TSC) são modelos com validade
preditiva e os mais utilizados para o desenvolvimento de fármacos antidepressivos
(NESTLER et al., 2002). Estes modelos se baseiam na observação de que, quando os animais
são submetidos a um estresse inescapável, após um período de agitação inicial eles adotam
30
uma postura imóvel, e os fármacos antidepressivos podem reduzir esse tempo de imobilidade
(PORSOLT et al., 1977; PETIT-DEMOULIERE et al, 2005).
O teste de nado forçado (TNF) foi descrito primeiramente por Porsolt et al. (1977), é o
modelo mais utilizado na avaliação de agentes com potencial efeito antidepressivo. Neste
modelo, os camundongos são postos em um recipiente cilíndrico com uma quantidade de água
que impede o apoio das patas no fundo do cilindro e de fuga pela borda superior, promovendo
uma situação supostamente aversiva. No início do teste, o animal desempenhará movimentos
de fuga desta situação e em poucos minutos o adotará a postura imóvel (ausência total de
movimentos ou com movimentos muito leves suficientes para deixar a cabeça do animal
emersa). Uma explicação para este comportamento é que no período inicial de tentativas para
sair da situação, o animal está “lutando” pela sobrevivência, com o passar do tempo o animal
“percebe” que não há possibilidade de conseguir fugir do cilindro e acaba parando os
movimentos e “desistindo” de tentar escapar e assim, de sobreviver à situação.
O teste de suspensão da cauda (TSC) é um modelo clássico para avaliação de fármacos
antidepressivos e foi desenvolvido por Stéru (1985). Este modelo tem o mesmo objetivo do
(TNF), que é expor o animal a uma situação inescapável, no qual há nos primeiros minutos a
agitação que seria a tentativa de fuga, e depois imobilidade. Neste modelo, os animais são
suspensos pela cauda e impedidos de tocar o chão e fugir, o que promove um conflito entre o
estresse físico por causa das tentativas de fuga sem sucesso e a motivação para continuar
tentando. No início do teste os animais desempenharão movimentos para tentativa de fuga, o
estresse físico ultrapassa a motivação para a fuga, e eles adquirem uma postura imóvel, o que
seria a desistência de “lutar” para fugir. De maneira semelhante ao (TNF), os agentes que
possuem efeito antidepressivo são capazes de reduzir o tempo de imobilidade dos animais
submetidos ao TSC.
1.8 Neurobiologia da depressão
A depressão está relacionada com a alteração de vários sistemas de neurotransmissão
(WONG; LICINIO, 2001). Uma das principais teorias bioquímicas da depressão é a hipótese
das monoaminas, proposta por Schildkraut em 1965, na qual afirmava que a depressão pode
ser causada por déficit funcional de neurotransmissores de monoaminas, norepinefrina e 5-
hidroxitriptamina (5-HT). A maioria dos fármacos disponíveis para o tratamento age na
modulação destes sistemas monoaminérgicos, cuja terapia é baseada no aumento das
monoaminas e é utilizada há mais de 50 anos (HASHIMOTO, 2011).
31
Considerando a necessidade de novos fármacos antidepressivos que tenham um início
de ação mais rápido e maior eficácia, tem existido um grande interesse por estudos com
outros sistemas de neurotransmissores na patogênese da depressão, tais como o sistema
glutamatérgico e a via L-arginina-NO (DA SILVA et al., 2000; HARKIN et al., 2003;
SKOLNICK, 2009; DUMAN; LI., 2012; RIEGER et al., 2014).
O glutamato (GLU) é o principal e mais abundante neurotransmissor excitatório do
sistema nervoso central (SNC) dos mamíferos, sendo essencial em mecanismos subjacentes à
plasticidade sináptica que estão envolvidos em processos comportamentais
(COLLINGRIDGE; LESTER, 1989; PRYBYLOWSKI; WENTHOLD, 2004). Nos últimos
anos, tem sido realizado estudos que demostram o envolvimento do glutamato no
desenvolvimento neural, na plasticidade sináptica, no aprendizado, na memória, na dor
neuopática, na ansiedade, na depressão, dentre outros (MELDRUM, 2000; OTTERSEN;
STORM-MATHISEN, 2000).
O GLU pode ser encontrado em vesículas sinápticas para ser liberado de maneira
dependente de Ca++ ou como precursor do ácido gama aminobutírico (GABA) em sinapses
inibitórias (KATZUNG, 2010). Seus receptores são classificados como ionotrópicos (iGLU;
ligados a um canal iônico) e metabotrópicos (mGLU; ligados a mecanismos intracelulares de
transdução de sinal, via proteína G). Os iGLU foram subsequentemente classificados de
acordo com o agonista mais seletivo e subdivididos em: NMDA (n-metil-d-aspartato), AMPA
(a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolproprionato) e cainato (CAROBREZ, 2003). Estudos
recentes demonstraram ação antidepressiva de lectinas via sistema glutamatérgico, através de
receptores NMDA (RIEGER et al., 2014).
Os receptores NMDA quando ativados ocasionam um influxo de cálcio no neurônio,
ativando a enzima óxido nítrico sintase (NOS), que converte a L-arginina em óxido nítrico
(NO) e L-citrulina (MONCADA et al., 1989; ESPLUGUES, 2002; BISHOP; ANDERSON,
2005). O mecanismo de ação do NO, de modo geral, envolve a sua ligação na porção heme da
guanilato ciclase solúvel (GCs), induzindo uma mudança conformacional que leva a enzima a
sintetizar 3’,5’ monofosfato guanosina cíclico (cGMP) a partir do trifosfato de guanosina
(GTP). O cGMP, por sua vez, é degradado pela fosfodiesterase-5 (PDE-5) e seus níveis
modulam a atividade de vários alvos intracelulares, como canais iônicos (GARTHWAITE;
BOULTON, 1995). Diante disto, a via L-Arginina/NO/cGMP pode causar alterações na
excitabilidade neural e propagacão de sinal pelo sistema nervoso através da abertura de canais
de potássio (K+) e consequente hiperpolarização da membrana plasmática do neurônio
(MACKINNON, 2003) (Figura 2).
32
Figura 2. Síntese do óxido nítrico
Os receptores NMDA são estimulados e há o influxo de Ca2+, o qual ativa as enzimas óxido nítrico sintases
(NOS). As NOS convertem a L-arginina em óxido nítrico (NO) e L-citrulina. O NO ativa as enzimas guanilato
ciclase solúvel (GCs) que transformam trifosfato de guanosina (GTP) em 3’,5’ monofosfato guanosina cíclico
(cGMP). A fosfodiesterase-5 (PDE-5) degrada o cGMP e seus níveis modulam os canais de potássio (K) e
consequente hiperpolarização. Fonte: Bettio (2012).
A investigação do papel do óxido nítrico (NO) na depressão também tem sido muito
estudada. Um grande número de trabalhos demonstrou evidências de que o NO está envolvido
na patofisiologia da depressão e que pacientes depressivos possuem um aumento na produção
de NO (SUZUKI et al., 2001; YILDIZ et al., 2000; DA SILVA et al., 2000; VOLKE et al.,
2003) e que substâncias que inibem a NOS ou a GCs tem efeito antidepressivo em modelos
pré-clínicos (YILDIZ et al., 2000; HARKIN et al., 2003; KASTER et al., 2005; JOCA;
GUIMARÃES, 2006).
33
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito da FTL em modelos neurocomportamentais em camundongos.
2.2 Objetivos Específicos
• Verificar o efeito da FTL em modelos experimentais de ansiedade;
• Investigar o efeito antidepressivo-símile da FTL;
• Analisar a participação dos sistemas monoaminérgico, glutamatérgico e via da L-
Arginina/NO/cGMP no efeito da FTL;
• Determinar se o efeito da FTL é dependente de sua integridade estrutural e capacidade
de reconhecimento e ligação a glicoconjugados.
• Verificar in silico as interações da FTL com sistema glutamatérgico e via da L-
Arginina/NO/cGMP.
34
3 MATERIAl E MÉTODOS
3.1 Frutalina: Isolamento e Purificação
As sementes foram coletadas de frutos maduros de Autocarpus incisa L. (fruta pão de
caroço) provenientes de Maranguape, Estado do Ceará, destegumentadas, desidratadas
(CH3OCH3 1:2 m/v 6/6 h por 24 h) com acetona e secas ao ar livre.
As sementes depois de selecionadas, livres de tegumento e desidratadas, foram
reduzidas a uma farinha fina (60 mesh), peneirada e estocada em frascos fechados,
previamente tarados, à temperatura ambiente.
A extração das proteínas foi realizada suspendendo-se a farinha em solução de NaCl
0,15 M, na proporção 1:10 (m/v) e deixada em agitação contínua por 30 min à temperatura
ambiente. A suspensão obtida foi centrifugada a 10.000 x g por 30 min a 4° C em centrifuga
refrigerada e o sobrenadante obtido foi filtrado e constituiu o extrato bruto.
Um volume de 25 ml do extrato bruto foi submetido a cromatografia de afinidade em
coluna de agarose-D-galactose, previamente equilibrada com NaCl 0,15 M, a um fluxo
constante de 30,0 ml/h mantido por bomba peristáltica, frações de 3,0 ml foram coletadas. O
material não retido (fração P1) foi eluído com NaCl 0,15 M. A fração retida na coluna (fração
P2) foi eluída com solução de galactose 0,2 M em NaCl 0,15 M que resultou na fração
lectinica. A eluição das proteínas foi acompanhada por absorbância a 280 nm em
espectrofotômetro. A fração P2 foi dialisada contra H2O destilada (1:50 v/v, trocas de 8/8 h
por 48 h) e liofilizada.
3.2 Atividade Hemaglutinante
Para detectação de atividade lectínica foram realizados ensaios da atividade
hemaglutinante com eritrócitos humanos, do tipo A+. Os ensaios de atividade hemaglutinante
foram realizados através de diluições seriadas em placas de 96 poços segundo o método de
Moreira e Perrone (1977). Em cada poço foram adicionados 50 µL de solução de NaCl 0,15
M e 50 µL de amostra com lectinas apenas no primeiro poço e após a diluição seriada de 1:2,
foi adicionado o mesmo volume de suspensão de hemácias 2%. O controle negativo continha
volumes iguais de NaCl 0,15 M e solução de hemácias 2%. Após 30 min de incubação a 37º
C e repouso por mais 30 min a temperatura ambiente, a atividade hemaglutinante foi
observada visualmente, sendo o título expresso em unidade de hemaglutinação (UH.mL-1),
que corresponde ao inverso da maior diluição da amostra que apresente nítida aglutinação.
35
3.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS e Espectometria de
Massas (LC/MS)
A pureza das preparações da fração P2 (FTL) foi avaliada por eletroforese em gel de
poliacrilamida em presença de SDS e por espectrometria de massas. A eletroforese foi feita
segundo a metodologia descrita por Laemmli (1970). A placa foi montada com gel de
aplicação a 3,5% de acrilamida em tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 e SDS 1,0% e o gel de
separação a 12,5% em tampão Tris-HCl 3 M pH 8,8 e SDS com pH 8,3. Amostras da FTL
(1,00 mg) foram dissolvidas em 1,0 ml de tampão Tris-HCl 0,0625 M, pH 6,8, glicerol 5% e
SDS 1% e submetida à fervura por 10 min. Azul de bromofenol (0,05%) foi adicionado às
amostras para controle das corridas eletroforéticas que foram realizadas a 200 V, 150 a 200
mA durante aproximadamente 4 h. Os géis foram corados com solução de Coomassie
Brilliant Blue 250 R (0,05%) em metanol: ácido acético glacial: água destilada (1:3:8) e
descorado com ácido acético glacial: metanol: água destilada (1:3:8). Os marcadores de massa
molecular foram: albumina sérica bovina (66 kDa), ovalbumina (45 kDa), anidrase carbônica
(30 kDa), inibidor de tripsina de soja (20,1 kDa), citocromo C (12,4 kDa) e inibidor de
calicreína (6,6 kDa).
FTL foi analisada em espectrômetro de massa SYNAPT HDMS (Waters, Manchester,
Reino Unido), acoplado a um sistema de nanoUPLC-ESI. A amostra foi diluída para 1mg/mL
em 0,1% (v / v) de ácido fórmico. Um microlitro de Frutalina foi usado para realizar uma
cromatografia de fase reversa utilizando um gradiente de 3% a 70% (v / v) de acetonitrila
durante 30 minutos com ácido fórmico a 0,1% (v: v) a uma taxa de fluxo de 300 nl / min em
uma coluna BEH C4, que mede 1,7 mm x 100 mm x 100 mm. Os dados de MS adquiridos
foram processados utilizando técnica que prioriza a obtenção de máxima entropia (MaxEnt)
para obter um espectro desconvoluído (FERRIGE; SEDDON, 1991).
3.4 Animais de experimentação
Foram utilizados camundongos albinos (Mus musculus), variedade Swiss Webster,
adultos, machos ou fêmeas, pesando entre 25 - 40 g, provenientes do Núcleo de Biologia
Experimental (NUBEX) da Universidade de Fortaleza (UNIFOR). Os animais foram
divididos em grupos (n = 6/cada), acondicionados em gaiolas de polipropileno, em
temperatura ambiente de 22 - 24° C, com ciclos de claro/escuro de 12 em 12 h, receberam
ração padrão e água ad libitum. Todos os protocolos seguiram estritamente as normas
36
internacionais de cuidados com os animais de laboratório (Parecer CEUA/UNIFOR
004/2015).
3.5 Testes de atividade ansiolítica/ansiogênica
3.5.1 Teste da Placa Perfurada – “Hole-board”
Os animais foram divididos em 4 grupos (n = 6/cada) e receberam, por via
intraperitoneal (i.p.) FTL (0,25, 0,50 ou 1,0 mg/kg) ou veículo (NaCl 0,9%; 10 ml/kg;
Controle) e 30 minutos depois foram colocados individualmente no “hole-board”. O
equipamento consiste em uma caixa quadrada de madeira (50 x 50 cm) a 10 cm de altura, com
16 orifícios de 2 cm de diâmetro, equidistantes uns dos outros e das bordas (Figura 2). Foram
registrados o número de vezes em que o animal introduziu o focinho nos orifícios da placa
(“hole dips”), o número de comportamentos de autolimpeza (“grooming”), de levantar
(“rearing”) e o número de bolos fecais por um período de 5 minutos (TAKEDA; TSUJI;
MATSUMYIA, 2006).
Figura 3. Teste de placa perfurada - “hole board”
3.5.2 Teste do labirinto em cruz elevado (LCE)
O labirinto em cruz elevado (LEC; Figura 3) consiste de dois braços abertos opostos
(30 x 5 x 25 cm) e dois braços fechados (30 x 5 x 25 cm), também opostos, em forma de cruz
grega. Os braços abertos e fechados são conectados por uma plataforma central (5 x 5 cm). A
plataforma, as paredes laterais dos braços fechados são confeccionadas em acrílico
transparente e o chão em acrílico preto. O aparelho está elevado a altura de 45 cm do nível do
37
chão. Os animais foram colocados no centro do aparelho com a cabeça voltada para os braços
fechados e o seu comportamento foi observado por 5 min.
Os camundongos foram divididos em 4 grupos (n = 6/cada) e tratados, i.p., com FTL
(0,25, 0,50 ou 1,0 mg/Kg) ou veículo (NaCL 0,9%; 10 ml/kg; Controle). Passados 30 min
foram colocados no equipamento e as medidas comportamentais registradas foram: frequência
de entradas e o tempo de permanência nos braços abertos e fechados.
Figura 4. Teste do labirinto em cruz elevado (LCE)
3.5.3 Teste do campo aberto (TCA)
O objetivo do teste foi avaliar a atividade estimulante ou depressora da FTL, podendo
ainda indicar atividades mais específicas como ansiolítica/ansiogênica. Um campo aberto,
confeccionado em acrílico (paredes transparentes e chão preto, 30 x 30 x 15 cm; Figura 4) foi
empregado para avaliar a atividade exploratória dos animais: sua movimentação espontânea
(número de cruzamentos, com as quatro patas, entre as divisões do campo), o número de
comportamentos de autolimpeza (“grooming”) e de levantar (“rearing”), registrados durante
um período de 5 min, após os tratamentos (Figura 4).
Os camundongos foram divididos em 4 grupos (n = 6/cada) e tratados, i.p., com FTL
(0,25, 0,50 ou 1,0 mg/Kg) ou veículo (NaCL 0,9%; 10 ml/kg; Controle). Após 30 min foram
colocados no centro do campo e avaliados.
38
Figura 5. Teste do campo aberto
3.6 Testes de atividade antidepressiva
3.6.1 Teste da Suspensão pela Cauda (TSC)
O teste consiste em observar o animal em uma posição estressante, onde a fuga é
impossível, naturalmente, após um tempo de tentativas frustradas, ele desiste e permanece
imóvel. Esse teste foi realizado conforme a metodologia descrita por Steru et al. (1985)
modificada. Os animais foram divididos em 4 grupos (n = 6/cada) e tratados, i.p., com FTL
(0,25, 0,50 ou 1,0 mg/Kg, i.p.) ou veículo (NaCL 0,9%; 10 ml/kg; Controle). Passados 30
min, os animais foram suspensos, presos com uma fita adesiva a cerca de 1 cm da ponta da
cauda, numa plataforma 58 cm acima da bancada (Figura 5).
Foram registrados o tempo de imobilidade (animal parado), “swinging” (o animal se
balança de um lado para o outro), “curling” (o animal encurva seu corpo para cima) e
“pedaling” (o animal move as apenas as patas continuamente), durante 6 minutos, sendo
cronometrados os 4 últimos minutos.
39
Figura 6. Representação esquemática do teste de suspensão pela cauda (TSC)
Fonte: Abelaira et al (2013).
3.6.2 Teste de natação forçada (TNF)
Os animais foram divididos em grupos (n = 6/cada) e tratados, i.p., com FTL (0,25,
0,50 ou 1,0 mg/Kg, i.p.) ou veículo (NaCL 0,9%; 10 ml/kg; Controle). 30 min depois foram
colocados, individualmente, num cilindro de vidro (altura = 40 cm; diâmetro = 25 cm),
contendo 19 cm de água por um período de 6 min, sendo cronometrado os 4 últimos minutos,
no qual foi registrado o tempo total de imobilidade para cada animal (Figura 6). Foi
considerado como imobilidade quando o animal fez apenas os movimentos mínimos para
manter a cabeça fora da água.
Imobilidade Mobilidade
40
Figura 7. Teste de natação forçada (TNF)
3.7 Análise do mecanismo de ação da FTL através de modulação farmacologica
Para a análise dos mecanismos de ação do efeito antidepressivo da FTL, foram
selecionados o teste de natação forçada e a dose 0,5 mg/Kg por apresentarem os melhores
resultados no estudo.
3.7.1 Participação do sistema monoaminérgico
Para investigar o envolvimento do sistema monoaminérgico na ação antidepressiva da
FTL, os camundongos foram pré-tratados com ioimbina (antagonista α2-adrenérgico; 1
mg/Kg, i.p.), 15 minutos antes da aplicação da FTL (0,5 mg/Kg, i.p.). 30 minutos após os
tratamentos, os camundongos foram submetidos ao teste de natação forçada.
3.7.2 Participação da via glutamatérgica
Para investigar o envolvimento do sistema glutamatérgico na ação antidepressiva da
FTL, os camundongos foram pré-tratados com cetamina (antagonista de receptores N-metil-
D-aspartato (NMDA) 0.1 mg/kg), 15 minutos antes da aplicação da FTL (0,5 mg/Kg, i.p.). 30
minutos após os tratamentos, os camundongos foram submetidos ao teste de natação forçada.
41
3.7.3 Participação da via L-Arginina/NO/cGMP
Para investigar o envolvimento da via nitrérgica na ação antidepressiva da FTL, os
camundongos foram pré-tratados com L-name (inibidor não específico das enzimas óxido
nítrico sintetases NOS; 10 mg/Kg, i.p), 15 minutos antes da aplicação da FTL (0,5 mg/Kg,
i.p.). 30 minutos após os tratamentos, os camundongos foram submetidos ao teste de natação
forçada.
Para investigar o envolvimento da guanilato ciclase na ação antidepressiva da FTL, os
camundongos foram pré-tratados com Azul de metileno (inibidor competitivo da enzima
guanilato ciclase; 10 mg/Kg, i.p), 15 minutos antes da aplicação da FTL (0,5 mg/Kg, i.p.). 30
minutos após os tratamentos, os camundongos foram submetidos ao teste de natação forçada.
3.8 Avaliação da participação do domínio lectínico e ação da FTL desnaturada
Para determinar o envolvimento do domínio lectínico no efeito antidepressivo-símile
da FTL, a ligação entre a lectina e o seu açúcar foi testada através da combinação de FTL (0,5
mg/kg) com D-galactose 0,2 M (incubadas a temperatura de 37°C por 30 min) e através da
aplicação separada de D-galactose 0,2 M seguido da aplicação de FTL (0,5 mg/kg) após 15
min.
Com o intuito de verificar a dependência da integridade estrutural da lectina, a FTL
(0,5 mg/kg) foi submetida a banho fervente durante 10 min a 100°C, afim de promover a sua
desnaturação. FTL desnaturada foi aplicada e 30 min depois os camundongos foram
submetidos ao teste de natação forçada.
Camundongos (n = 6/grupo) foram pré-tratados com veículo (NaCL 0,9%; 10 ml/kg;
Controle), FTL + D-galactose (pré-incubação), FTL e D-galactose (aplicadas separadamente)
ou FTL desnaturada. 30 minutos após os tratamentos, os camundongos foram submetidos ao
teste de natação forçada.
3.9 Efeito da administração repetida
Camundongos foram tratados com FTL (0,5 mg/kg) ou veículo (NaCL 0,9%; 10
ml/kg; Controle). 30 min após os tratamentos, os animais foram submetidos ao teste de
natação forçada. A fim de verificar o efeito da administração repetida da FTL, os
camundongos foram tratados com FTL ou veículo durante 7 dias e submetidos novamente ao
teste de natação forçada. Os pesos dos animais foram verificados todos os dias.
42
3.10 Docking Molecular
Para o docking molecular foi utilizado o software Hex 8.0.0, que realiza a procura por
ordenações e encaixes de forma automática, monitorando a energia de cada situação simulada.
Os encaixes foram realizados sem considerar as moléculas de água e explorando toda a
superfície do receptor. A obtenção de clusters com alta energia de interação foi o fator
determinante do sítio de interação. Para isso foram determinados os seguintes parâmetros:
Correlation type – Shape only, Calculation Device- CPU, Número de Soluções - 10000, Modo
FFT - 3D fast lite, Grid Dimension – 0.6, Faixa do receptor - 180, Faixa do Ligante -180,
Faixa de Torção - 360, Faixa de Distância - 40.
Foram realizados dois dockings moleculares: docking A: estrutura da enzima NOS,
especificamente o seu domínio oxygenase, (PDB ID: 1ZVI), e a estrutura do ligante, uma
molécula de FTL (PDB ID: 4WOG) (MONTEIRO-MOREIRA et al., 2015); docking B:
estrutura da FTL como receptor (PDB ID: 4WOG) e os receptores NMDA como ligante.
Para análise dos complexos formados após o docking molecular, foi utilizado o
software PyMol 1.4.7, que permite a manipulação tridimensional da molécula e do complexo
formado.
3.11 Análise Estatística
A análise estatística dos dados foi realizada através do software Graph Prism. Versão 6
para Windows, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA. Os resultados que
obedeceram a uma distribuição paramétrica foram analisados por Análise de Variância
(ANOVA), seguido pelo teste de Dunnett ou Bonferroni (post hoc).
Os resultados estão expressos pela Média ± Erro Padrão da Média (EPM), com
número de animais entre parêntese e foi considerado o nível de significância menor que 0,05
(p<0,05).
43
4 RESULTADOS
4.1 Frutalina: isolamento e purificação
A FTL foi isolada e purificada de acordo com a metodologia descrita por Moreira e
colaboradores (1998) com modificações. Foram realizadas aproximadamente 10
cromatografias de afinidade, aplicando-se 30 ml do extrato bruto, filtrado e centrifugado. A
cromatografia de afinidade utilizando a coluna de galactose-D-sepharose (Figura 8) possui
uma ótima eficiência no isolamento, apresentando rendimento de aproximadamente 3 mg de
FTL para cada grama de farinha das sementes.
Figura 8. Cromatografia de afinidade.
Cromatograma relativo a aplicação de 30mL de extrato-bruto de semente de Fruta-pão (Artocarpus incisa em
NaCl 0,15M), contra uma coluna de D-Galactose imobilizada em agarose de 5mL, num fluxo de
aproximadamente 0,5mL/min, eluída com uma solução 0,2 M de D-Galactose em NaCl 0,15 M.
Após obtenção da FTL, foram necessárias 72 horas de diálise contra água destilada em
membrana semipermeável de celulose, feitas aproximadamente 12 trocas da água durante esse
período. As amostras dialisadas foram submetidas a liofilização e cada cromatografia
proporcionava em torno de 15 mg de frutalina.
A pureza da amostra foi analisada em eletroforese SDS-PAGE 12,5% e ESI-MS
(Figura 8). Na eletroforese foi observado o perfil característico para essa lectina, caracterizado
por duas bandas de massa aparente: a primeira de 15,5 kDa e a segunda de 12 kDa. o espectro
de massas da Frutalina purificada, após desconvolução, mostrou massas diferentes em torno
de 16,5 kDa, o que corrobora com a presença de isoformas do mesmo monômero e confirma
que a amostra está pura.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Abso
rbân
cia
280 n
m
Volume (mL)
Pico 1
D-Galactonse
0,2 M
Pico 2
44
Para verificar a atividade lectínica, foi realizado ensaio da atividade hemaglutinante
com eritrócitos humanos, tipo A+, no qual foi possível observar aglutinação, o que nos
permite afirmar que a FTL estava ativa.
Figura 9. SDS-PAGE 12,5% e ESI / MS
SDS-PAGE 12,5% referente aos marcadores moleculares (A) e as bandas aparentes relativas a FTL (B).
Espectros intactos deconvoluídos de FTL mostraram massas em torno de 16 kDa.
4.2 Avaliação da atividade ansiolítica/ansiogênica
4.2.1 Teste da Placa Perfurada – “Hole-board”
Para investigar o possível efeito ansiolítico ou ansiogênico da FTL, os camundongos
foram submetidos ao teste da placa perfurada. Na tabela 1 é possível observar os resultados
obtidos neste teste, no qual nenhuma das doses da FTL alterou significativamente o
comportamento dos animais nos quatro parâmetros observados (número de head dips,
grooming, rearing e bolos fecais).
45
Tabela 1. Efeito da FTL no teste da placa perfurada.
Grupo Dose
(mg/kg)
“Head
dips”
“Grooming” “Rearing” Bolos fecais
Controle - 16,50 ± 2,75
0,50 ± 0,22
0,66 ± 0,21
1,33 ± 0,61
FTL 0,25 12,17 ± 2,10
0,33 ± 0,33
0,16 ± 0,16
1,16 ± 0,65
0,5 13,17 ± 1,95
0,83 ± 0,40
2,50 ± 1,25
0,50 ± 0,22
1,0 14,00 ± 3,21
0,83 ± 0,30
0,66 ± 0,33
0,16 ± 0,16
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística
foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc.
4.2.2 Teste do labirinto em cruz elevado (LCE)
O LCE é um dos testes mais utilizados na pesquisa para analisar a ação ansiolítica ou
ansiogênica de compostos. Os efeitos da FTL neste teste foram observados em relação ao
tempo de permanência nos braços abertos (TPBA), tempo de permanência nos braços
fechados (TPBF), número de entrada nos braços abertos (NEBA) e número de entrada nos
braços fechados (NEBF). FTL 0,25 mg/Kg aumentou significativamente (11,33 ± 0,80;
*p<0,05) em comparação ao grupo controle (7,50 ± 1,14) o NEBF (Figura 9), permitindo que
seja sugerido um possível efeito do tipo ansiogênico. Não houve diferença estatística nas
outras doses e nos outros parâmetros analisados.
46
Figura 10. Efeito da FTL no teste de labirinto em cruz elevado (LCE).
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística
foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao
controle (*<0,05).
47
4.2.3 Teste do campo aberto (TCA)
Conforme pode ser verificado na Tabela 2, nenhuma das doses da FTL alterou
significativamente os parâmetros observados (número de “crossing”, “grooming” e “rearing”).
Tabela 2. Efeito da FTL no teste de campo aberto
Grupo Dose
(mg/kg)
“Crossing” “Rearing” “Grooming”
Controle - 81,67 ± 7,65
10,00 ± 1,80
2,00 ± 0,51
FTL 0,25 66,83 ± 5,02
12,50 ± 1,33
2,66 ± 0,55
0,5 62,33 ± 12,43
5,83 ± 1,72 2,00 ± 0,85
1,0 60,00 ± 10,26
12,83 ± 2,96
3,00 ± 0,85
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística
foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc.
4.3 Avaliação da atividade antidepressiva
4.3.1 Teste da Suspensão pela Cauda (TSC)
Para avaliar o possível efeito antidepressivo-símile, a FTL foi testada no ensaio de
suspensão pela cauda (TSC). A Figura 10 representa o efeito da FTL sobre os quatro
parâmetros analisados: tempo de imobilidade, “swinging”, “curling” e “pedaling”. FTL
diminuiu significativamente (*p < 0,05) o tempo de imobilidade nas doses de 0,25 mg/kg
(56,50 ± 15,12) e 0,5 mg/kg (59,50 ± 17,40) em comparação ao grupo controle (128,00 ±
15,68) (Figura 4). FTL 1 mg/kg (65,67 ± 19,71) aumentou o tempo de “peddaling” (*p<0,05)
quando comparada ao grupo controle (9,83 ± 3,26), sendo possível sugerir que a FTL tem um
efeito antidepressivo-símile.
48
Figura 11. Efeito da FTL no teste de suspensão pela cauda (TSC)
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística
foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao
controle (*<0,05).
4.3.2 Teste de natação forçada (TNF)
O teste de natação forçada (TNF) é o teste mais utilizado para analisar a atividade do
tipo antidepressiva ou depressora de compostos. O efeito da FTL sobre o TNF está
apresentado na Figura 11. FTL diminuiu significativamente o tempo de imobilidade dos
animais (FTL 0,25 mg/kg; 52,67 ± 13,79; *p<0,05 e FTL 0,5 mg/kg; 24,83 ± 8,01; *p<0,001)
quando comparada ao grupo controle (120,7 ± 17,21), confirmado o efeito tipo
antidepressivo-símile observado no TST.
49
Figura 12. Efeito da FTL no teste de natação forçada (TNF).
C o n tro le 0 ,2 5 0 ,5 1
0
5 0
1 0 0
1 5 0
Te
mp
o d
e i
mo
bil
ida
de
(s
)
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
F T L (m g /k g )
* * *
*
C o n tr o le 0 ,2 5 0 ,5 1
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística
foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao
controle (*<0,05; ***<0,001).
4.4 Análise dos possíveis mecanismos de ação da FTL através da modulação
farmacológica
De acordo com os resultados obtidos, a FTL na dose de 0,5 mg/kg foi escolhida para
ser avaliada quanto as possíveis vias de mecanismo de ação do seu efeito antidepressivo-
símile no TNF.
4.4.1 Participação do sistema monoaminérgico
Ioimbina, um antagonista de receptores α2-adrenérgicos, não previniu o efeito
antidepressivo-símile da (FTL+IBN 109,7 ± 15,42) em comparação ao grupo FTL sozinha
(176,8 ± 8,81), (Figura 12).
50
Figura 13. Participação do sistema monoaminérgico no efeito antidepressivo-símile
da FTL no teste de natação forçada (TNF)
C o n tro le F T L IB N IB N + F T L
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
Te
mp
o d
e i
mo
bil
ida
de
(s
)
* ** *
C o n tr o le F T L I B N F T L + I B N
A
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística
foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao
controle (**<0,01). FTL – Frutalina 0,5 mg/kg; IBN – Ioimbina 1 mg/kg.
4.4.2 Participação da via glutamatérgica
O efeito antidepressivo-símile da FTL (101,2 ± 10,80; ***p<0,001) foi prevenido pelo
pré-tratamento com cetamina, um antagonista de receptores N-metil-D-aspartato (NMDA)
(CET+FTL 142,3 ± 17,88), (Figura 14).
51
Figura 14. Participação do sistema glutamatérgico no efeito antidepressivo-
símile da FTL no teste de natação forçada (TNF)
C o ntro le F T L C E T F T L + C E T
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
Te
mp
o d
e i
mo
bil
ida
de
(s
)
* * *
C o n tr o le F T L C E T F T L + C E T
B
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística
foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao
controle (***<0,001); FTL – Frutalina 0,5 mg/kg; IBN – Ioimbina 1 mg/kg.
4.4.3 Participação da via L-Arginina/NO/cGMP
L-NAME (10 mg/Kg), um inibidor não específico das enzimas NOS e azul de
metileno (10 mg/kg), um inibidor competitivo da enzima guanilato ciclase, preveniram o
efeito antidepressivo-símile da FTL (0,5 mg/kg) (Figura 15).
52
Figura 15. Participação da via L-Arginina/NO/cGMP no efeito antidepressivo-símile da FTL
no teste de natação forçada (TNF)
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística
foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao
controle (**<0,01); L-NAME 10 mg/kg; FTL – Frutalina 0,5 mg/gk; AMET – Azul de metileno 10 mg/kg.
4.5 Envolvimento do domínio lectínico e ação da FTL desnaturada
A desnaturação da FTL preveniou o efeito antidepressivo-símile da lectina, assim
como o pré-tratamento dos animais com a glactose antes da FTL. A FTL também não
promoveu a redução da imobilidade dos camundongos quando administrada conjugada à
galactose (Figura 16).
53
Figura 16. Participação da integridade estrutural e domínio lectiníco no efeito antidepressivo-
símile da FTL no teste de natação forçada (TNF)
C on tr o l e FT L FT L D ES FT L + G L T G L T / FT L
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
Te
mp
o d
e i
mo
bil
ida
de
(s
)
* * * *
C o n tr o le F T L F T L D E S F T L + G L T G L T /F T L
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística
foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao
controle (****<0,0001; FTL – Frutalina 0,5 mg/kg; FTL – Frutalina Desnaturada; FTL+GLT – D-galactose 0,2
M, 15 minutos antes da FTL; GLT/FTL – Frutalina conjugada à D-galactose.
4.6 Efeito da administração repetida de FTL
Conforme pode ser verificado na Figura 16, o efeito antidepressivo-símile da FTL 0,5
mg/kg foi mantido mesmo após 7 dias de tratamento repetido. Não houve diferença entre o
ganho de peso dos animais do grupo controle e tratados com FTL (Figura 17).
54
Figura 17. Efeito da administração repetida na ação antidepressiva-símile da FTL
durante sete dias
D IA 1 D IA 7 D IA 1 D IA 7
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0T
em
po
de
im
ob
ilid
ad
e (
s)
* * *
* *
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
C o n t r o le
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
F T L
D ia 1 D ia 7 D ia 1 D ia 7
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística
foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao
controle (*** p<0,001; ** p<0,01); FTL – Frutalina 0,5 mg/kg.
Figura 18. Efeito da administração repetida da FTL no peso dos camundongos durante sete
dias.
1 2 3 4 5 6 7
9 5
1 0 0
1 0 5
1 1 0
1 1 5
C o n tr o le
F T L 0 ,5 m g /k g
D ia s
Pe
so
(%
)
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística
foi utilizado 2way ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni como post hoc.
55
4.7 Docking Molecular
Foi observado o encaixe da FTL em todos os 10 clusters de maior energia, gerados
pelo docking molecular. Pode-se observar que a o domínio oxygenase da enzima receptora
NOS interage com o ligante fortemente, com ligações que variam de 1,3 a 3,0 angstroms,
garantindo a ação biológica sugerida pelo experimento in vivo (Figura 19).
Figura 19. Docking Molecular A – FTL x Domínio Oxygenase da enzima NOS
Interações químicas fortes entre o domínio oxygenase da enzima NOS (verde) e a Frutalina (ciano), com ligações
de 1.3 a 3.0 angstroms.
Outra informação importante é a alta credibilidade de predição do sítio de encaixe
entre a NOS e a FTL. Pois ao sobrepor todos os 5 clusters de maior energia de ligação, pode-
se perceber que todos se encontram no mesmo sítio, com os mesmos resíduos de aminoácidos
envolvidos (Figura 20).
56
Figura 20. Docking Molecular A – FTL x Domínio Oxygenase da enzima NOS
Clusters sobrepostos de posições de alta compatibilidade entre FTL (colorido) e o domínio oxygenase da enzima
NOS (verde), mostrando que as 5 posições de maior energia estão no mesmo local.
A visualização da interação, juntamente à medição da distancia das ligações e às altas
energias observadas (Tabela 3), comprova o mecanismo de ligação entre resíduos de
aminoácidos da enzima NOS (domínio Oxygenase) e os resíduos de aminoácidos da FTL:
Val24, Gly25, Ser100, Tyr102, Lys141, Tyr146 e Tyr150. Com base nestes resíduos, pode-se
sugerir também a possível glicosilação de alguns aminoácidos da enzina NOS, já que os
resíduos Gly25, Tyr146 e Tyr150 estão diretamente relacionados com a atividade lectínica da
Frutalina, o que sugere que este sítio de reconhecimento tenha grande afinidade a glicanos.
57
Tabela 3. Energia da região de interação entre o domínio Oxygenase da enzima NOS e a FTL
(kcal/mol)
Cluster 01: -887,48
Cluster 02: -814,57
Cluster 03: -811,66
Cluster 04: -810,14
Cluster 05: -784,78
Cluster 06: -776,22
Cluster 07: -751,05
Cluster 08: -723,57
Cluster 09: -719,11
Cluster 10: -716,42
Em relação aos dados obtidos com o docking B, pode-se perceber altíssima energia de
interação entre as moléculas, com ligações que variam de 2.1 a 3.2 angstroms. Os resíduos de
aminoácidos do receptor NMDA envolvidos são: Gln40, Phe342, Lys343, Val345, Gln371,
Ile111, Leu112, Phe114, que possibilitam interações químicas com muitos resíduos da FTL,
inclusive os resíduos associados à atividade lectínica: Gly25, Tyr146, Trp147 e Asp149. Esta
forte interação observada no docking molecular pode sugerir o mecanismo de ligação entre
FTL e o receptor NMDA (Figura 21). A medição da distancia das ligações e às altas energias
observadas podem ser visualizadas na Tabela 4.
58
Figura 21. Docking Molecular B – FTL x receptores NMDA
FTL (púrpura) interagindo com o receptor NMDA, com ligações químicas entre 2.1 e 3.2 angstroms se
estendendo por quase toda a superfície do tetrâmero.
Tabela 4. Energia da região de interação entre a FTL e o receptor NMDA (kcal/mol)
Cluster 01: -16353,91
Cluster 02: -15894,88
Cluster 03: -15682,25
Cluster 04: -15040,66
Cluster 05: -14799,38
Cluster 06: -14764,13
Cluster 07: -14543,02
Cluster 08: -14527,10
Cluster 09: -14476,09
Cluster 10: -14462,69
59
5 DISCUSSÃO
Muitos estudos têm demonstrado que lectinas vegetais possuem atividade no Sistema
Nervoso Central, sendo elas estimulantes ou depressoras, apresentando resultados pré-clínicos
promissores. Dentre as pesquisas na área de Neurobiologia com essa classe de proteínas, elas
têm se destacado como moléculas com atividades de neuroplasticidade, neuroprotetoras e
neuroinflamatórias (EVERTS et al., 1999; JACQUES et al, 2013; GONÇALVES et al.,
2013).
A FTL, uma lectina α-D-galactose ligante, foi isolada em 1998 por Moreira e
colaboradores, vem sendo estudada por muitos anos e tem apresentado muitos potenciais
biológicos, como atividade antitumoral (OLIVEIRA et al., 2011), gastroprotetora (ABDON et
al., 2012) e neuroprotetora frente a toxicidade glutamatérgica “in vitro” (JACQUES, 2012).
Considerando os efeitos neuroprotetores que lectinas vegetais têm apresentado e os potenciais
biológicos da FTL, no presente trabalho realizamos um screening de modelos
neurocomportamentais para avaliar a ação da FTL no SNC de camundongos com enfoque em
distúrbios de ansiedade e depressão.
O trabalho demonstrou, pela primeira vez, que a administração intraperitoneal de FTL,
em camundongos, produziu um efeito do tipo ansiogênico e antidepressivo, assim como
demonstrou também possíveis vias de mecanismos de ação envolvidos no efeito
antidepressivo-símile da FTL.
Para analisar os possíveis efeitos ansiolíticos ou ansiogênicos da FTL, foi realizado o
teste de placa perfurada (hole board). Este modelo se baseia na exposição dos camundongos a
um novo ambiente, no qual os agentes ansiolíticos aumentam o número de mergulhos de
cabeça nos orifícios da placa, ao contrário dos agentes ansiogênicos que diminuem
(TAKEDA; TSUJI; MATSUMYIA, 2006). Outros parâmetros que também observados neste
modelo foram o número de “grooming”, “rearing” e bolos fecais. Na literatura não há dados
sobre lectinas testadas no hole board e a FTL não alterou nenhum dos parâmetros analisados.
Também foi realizado o teste do labirinto em cruz elevado (LCE), que é um dos
modelos mais utilizados nas pesquisas da ansiedade em roedores, e é baseado em respostas a
ambientes perigosos que evocam curiosidade e medo, criando desta forma, um conflito de
aproximação e esquiva (LISTER, 1987). Foi constatado que os agentes ansiolíticos
aumentavam o tempo de permanência e a quantidade de entradas nos braços abertos, ao
contrário dos agentes ansiogênicos que diminuíam o tempo de permanência e quantidade de
entradas nos braços abertos ou aumentam a permanência e quantidade de entradas nos braços
60
fechados. Assim como no hole board, não existem evidencias na literatura de lectinas vegetais
testadas neste modelo. A FTL na dose de 0,25 mg/kg aumentou significativamente a
quantidade de entradas dos camundongos nos braços fechados, o que nos permite supor que a
FTL pode ter um efeito do tipo ansiogênico. Estudos com outras lectinas, como a galectina-3,
uma lectina animal ligante de β-D-galactose, demonstraram que ela pode estar envolvida em
alterações comportamentais e que a sua deficiência provocou diminuição da atividade
locomotora e ansiedade (HOYOS et al., 2014) corroborando com este estudo, demonstrando
que lectinas podem alterar o comportamento dos animais em modelos de ansiedade.
Dando continuidade aos estudos sobre ansiedade, foi realizado o teste de campo aberto
(TCA), no qual o comportamento do animal é determinado pelo conflito entre a motivação
para explorar e a aversão a lugares abertos e desprotegidos. É um teste utilizado para analisar
atividade locomotora dos roedores e de modo coerente, drogas de perfil ansiolítico ou
ansiogênico tendem, respectivamente, a aumentar ou diminuir a ambulação no TCA.
(SCHMITT; HIEMKE, 1998). Nenhuma das doses da FTL alteraram significativamente a
atividade locomotora dos animais em nenhum dos parâmetros, um efeito diferente do
encontrado para outras lectinas, como por exemplo a ConBr, lectina isolada da Canavalia
brasiliensis que possui afinidade de ligação por glucose e manose, e que no TCA causou
aumento na atividade locomotora na dose mais alta (BARAÙNA et al., 2006).
Para avaliar os possíveis efeitos antidepressivos ou depressores, a FTL foi submetida
ao teste de suspensão pela cauda (TSC). Este teste foi desenvolvido por Steru et al. (1985) e
consiste em observar o animal em uma posição estressante, onde a fuga é impossível,
naturalmente, após um tempo de tentativas frustradas, ele desiste e permanece imóvel. Os
parâmetros observados neste trabalho foram o tempo de imobilidade (o animal totalmente
parado), “swinning” (o animal realiza movimentos de um lado para o outro), “curling” (o
animal encurva seu corpo para cima) e “peddaling” (o animal move apenas as patas
continuamente). A FTL diminuiu significativamente o tempo de imobilidade dos animais nas
doses de 0,25 e 0,5 mg/kg, além de aumentar significativamente o tempo de “peddaling” na
dose de 1 mg/kg, indicando que a FTL possui um efeito antidepressivo-símile. Na literatura
não há dados sobre lectinas vegetais testadas neste modelo.
Para confirmar o efeito antidepressivo-símile da FTL, foi realizado o teste de natação
forçada (TNF), o teste mais utilizado em pesquisas que avalia atividade antidepressiva de
compostos. Este teste foi desenvolvido por Porsolt e colaboradores (1977) e se baseia na
mesma premissa do TSC, no qual quando submetemos um animal a um estresse inescapável,
como sua colocação num cilindro contendo água, o animal desempenhará movimentos de
61
fuga dessa situação supostamente desagradável e em poucos minutos adotará a postura imóvel
(ausência total de movimentos ou com movimentos muito leves suficientes para deixar a
cabeça do animal emersa). A FTL diminuiu significativamente o tempo de imobilidade dos
camundongos nas doses de 0,25 e 0,5 mg/kg, conferindo o efeito antidepressivo-símile
observado no TSC. Outras lectinas já foram estudadas no TNF, e a VML, uma lectina D-
galactose ligante, isolada das sementes de Vatairea macrocarpa, induziu um comportamento
do tipo depressivo, evidenciado pelo aumento do tempo de imobilidade dos camundongos no
TNF (GONÇALVES et al., 2013), o que é interessante de ser observado, pois a FTL e a VML
são lectinas vegetais, apresentam afinidade de ligação semelhante a galactose e ambos
apresentaram efeitos diferentes no TNF, podendo ser sugerido o papel duplo de lectinas
vegetais com afinidade por galactose na função neural. Outra lectina analisada no TNF, foi a
ConBr, uma lectina com afinidade de ligação por glucose e manose, extraída de sementes da
espécie Canavalia brasilienses, que assim como a FTL, apresentou atividade antidepressiva-
símile no TNF (BARAÙNA et al., 2006).
Um fator importante para certificar o efeito antidepressivo-símile da FTL, foi a
realização do TCA que demonstrou que a FTL não alterou a atividade locomotora dos
animais, o que nos permite supor que o efeito antidepressivo-símile da FTL não ocorre por
meio de atividade psicoestimulante, o qual pode gerar um resultado falso-positivo quando do
uso do TNF como modelo experimental de depressão. Damaceno et al. (2016) demonstrou
que a FTL também não interferiu na atividade locomotora de camundongos no teste de Rota-
rod, corroborando com o presente estudo.
Apesar da etiologia da depressão ainda não ser bem esclarecida, existem muitas
propostas e teorias acerca das bases etiológicas para esta doença. Uma das principais teorias
envolvem a hipótese monoaminérgica que surgiu em 1965, por Schildkraut, e postula que o
maior processo neuroquímico envolvido na depressão é a disfunção na neurotransmissão
monoaminérgica, no qual há diminuição das monoaminas (norepinefrina, serotonina e
dopamina) na fenda sináptica (SCHILDKRAUT, 1965). Esta hipótese é sustentada
principalmente pelo fato de que a maioria dos antidepressivos utilizados na clínica aumentam
os níveis de monoaminas no cérebro através da inibição da recaptação de monoaminas e/ou
ainda age como inibidor da enzima monoamina oxidase, enzima que biotransforma as
monoaminas (NEMEROFF, 2007). Considerando a importância da hipótese monoaminérgica,
que tem demonstrado participação na neurobiologia da depressão (KIM et al., 2008;
FROKJAER et al., 2009), neste estudo foi analisado a possibilidade do sistema
monoaminérgico estar envolvido na ação antidepressiva-símile da FTL. Para isto, foi utilizado
62
a ioimbina, (um antagonista de receptores α2-adrenérgicos), no qual não preveniu o efeito
anti-imobilidade da FTL, demonstrando que o efeito antidepressivo-símile da FTL não está
envolvido neste sistema. Um efeito diferente foi observado para a lectina ConBr, no qual a
ioimbina preveniu o efeito desta lectina, demonstrando possível participação do efeito
antidepressivo-símile da ConBr nesta via (BARAÙNA et al., 2006).
Além da hipótese monoaminérgica, existem outras vias que podem estar envolvidas na
depressão. Muitas evidências têm associado à depressão a uma disfunção na sinalização
glutamatérgica, especialmente à hiperativação dos receptores NMDA, e que antagonistas
destes receptores possuem ação antidepressiva (TRULLAS; SKOLNICK et al., 1990;
SANACORA et al., 2011).
De acordo com os estudos realizados por Jacques em 2012, a FTL apresentou
atividade neuroprotetora frente à neurotoxicidade glutamatérgica avaliado em modelo de
fatias hipocampais de camundongos tratadas in vitro com glutamato. Considerando estes
dados e a necessidade de novos agentes antidepressivos que apresentem novos mecanismos de
ação, neste trabalho foi analisado a possibilidade do sistema glutamatérgico estar envolvido
na ação antidepressiva-símile da FTL. Para isto, foi utilizado a cetamina, um antagonista não
competitivo de receptores do N-metil-D-aspartato (NMDA), no qual preveniu
significativamente o efeito antidepressivo-símile provocado pela administração da FTL,
mostrando que o bloqueio destes canais impede que a FTL exerça seu efeito. Resultado
semelhante foi o obtido por Rieger et al 2014, cujo estudo evidenciou o envolvimento do
sistema glutamatérgico (através de receptores NMDA) e da via L-Arginina/NO/cGMP no
efeito antidepressivo provocado pela administração central de ConBr. Além disso, alguns
estudos demonstraram que lectinas com afinidade por galactose foram capazes de se ligar
diretamente a receptores NMDA, podendo modular sua atividade através da interação com
resíduos de oligossacarídeos presentes nos receptores (DANYSZ et al., 1995; YUE et al.,
1995; EVERTS et al., 1997). Esse achado foi corroborado com o docking molecular, que
verificou forte interação da FTL com o receptor NMDA.
Damasceno et al. (2016) demonstrou que a FTL apresentou atividade antinociceptiva
indicando uma possível interferência com o sistema glutamatérgico, através de sua interação
com os canais TRPV1 (receptor de potencial transitório vanilóide 1), sugerindo que o efeito
da FTL sobre a nocicepção induzida pelo glutamato, ocorre devido à redução da liberação de
glutamato via bloqueio do canal TRPV1. Corroborando com nosso estudo que demonstrou
envolvimento do sistema glutamatérgico no efeito antidepressivo-símile da FTL e
63
apresentando mais possibilidades para novos estudos da ação antidepressiva-símile da FTL
através de diferentes canais iônicos TRPs (receptor de potencial transitório).
A via L-Arginina/NO/GMPc também tem sido estudada na fisiopatologia da
depressão. O óxido nítrico (NO) é produzido por esta via, por um grupo de proteínas
denominadas óxido nítrico sintase (NOS), que dependem de Ca2+ para sua ação, e atuam
sobre moléculas de L-arginina para produzir NO e L-citrulina. O NO produzido é capaz de
estimular a enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), que promove a conversão de trifosfato de
guanosina (GTP) em monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) (DENNINGER;
MARLETTA, 1999).
A produção excessiva de NO pela indução da NOS por processos como inflamação,
estresse crônico e hiperexcitabilidade glutamatérgica está relacionada à patogênese de
doenças neurodegenerativas e transtornos de humor, como Alzheimer, Parkinson, transtorno
bipolar e depressão (MCLEOD et al., 2001; GUIX et al., 2005; HOEKSTRA et al., 2006;
SINGH; DIKSHIT, 2007). Uma das consequências do excesso de NO é o aumento do estresse
oxidativo pelo aumento de espécies reativas de nitrogênio (ERN), a síntese de mediadores
químicos de processos inflamatórios, bem como a ativação de vias apoptóticas
(CALABRESE et al., 2007). Estudos clínicos demonstram que as concentrações plasmáticas
de nitrato são significativamente maiores em pacientes deprimidos quando comparado aos
controles, sugerindo que a produção de NO está aumentada na depressão (SUZUKI et al.,
2001). Adicionalmente, estudos pré-clínicos mostram que inibidores da NOS e inibidores da
GCs, cujas concentrações são aumentadas pelo NO, possuem propriedades antidepressivas em
modelos animais (DA SILVA et al., 2000; YILDIZ et al., 2000; HEIBERG et al., 2002;
HARKIN et al., 2003; VOLKE et al 2003).
Estudos demonstram que o NO em níveis fisiológicos, apresenta papel associado a
neuromodulação e neuroproteção, porém em concentrações elevadas no organismo, o NO
apresenta neurotoxicidade (CALABRESE et al., 2007). Foi estabelecido que pessoas com
depressão apresentam níveis de NO aumentados, com consequente aumento dos níveis de
GMPc (SUZUKI et al., 2001). Diante disto, substancias que inibem a ação das enzimas NOS
e GCs têm apresentado do efeito antidepressivo (YILDIZ et al., 2000; HARKIN et al., 2003;
KASTER et al., 2005; JOCA; GUIMARÃES, 2006). Considerando o aumento das
concentrações de NO na fisiopatologia da depressão e do envolvimento de NOS e GCs neste
aumento, este trabalho avaliou a participação da via L-Arginina/NO/cGMP na atividade
antidepressiva-símile da FTL. O pré-tratamento com L-NAME (inibidor não específico das
64
enzimas NOS) e azul de metileno (inibidor competitivo da enzima GCs) bloquearam
significativamente o efeito antidepressivo-símile da FTL, demonstrando que seu efeito pode
estar envolvido na via L-Arginina/NO/GMPc. Esse achado foi corroborado com os estudos de
docking molecular, que demonstrou a possível interação da FTL com a enzima NOS.
Para investigar se o efeito antidepressivo-símile da FTL é dependente da integridade
de suas estruturas terciárias e quaternárias, foi realizado desnaturação da FTL (água fervente a
100° C por 10 min), e foi observado que a FTL desnaturada, portanto inativa, não foi capaz de
modificar o tempo de imobilidade dos animais, evidenciando que o seu efeito depende de sua
integridade estrutural. A perda do efeito antidepressivo-símile da FTL também foi observada
quando foram administradas FTL pré-incubada com D-galactose e quando a D-galactose foi
administrada antes da FTL. Desta forma, foi demonstrado que o efeito antidepressivo-símile
da FTL também está relacionado a sua capacidade de reconhecimento e ligação a
glicoconjugados contendo α-D-galactose.
De modo geral, as drogas utilizadas para depressão não diferem entre si na eficácia e
os efeitos terapêuticos se manifestam de forma retardada, dentro de 2 a 4 semanas, como por
exemplo a imipramina e a amitriptilina que apresentam potencialização no efeito apenas após
2 semanas (SVENSSON, 1980, SVENSSON; USDIN, 1978), sendo esta a principal
dificuldade para a adesão ao tratamento, visto que os efeitos colaterais se manifestam
agudamente. Desta forma, foi realizado um ensaio subcrônico de dose repetida durante 7 dias
e foi evidenciado que o potencial efeito antidepressivo-símile da FTL manteve-se após os 7
dias de tratamento. Esses tratamentos repetidos possuem uma importância clínica, pois os
tratamentos continuados, em torno de um ano, reduzem em até 90% os índices de remissão
em alguns tipos de depressão (STAHL, 1996). Estudos mais aprofundados e com maior
período de dias com doses repetidas devem ser realizados para confirmação do efeito
continuado.
Baseado neste conjunto de evidências, podemos concluir que a FTL, uma lectina α-D-
galactose ligante de origem vegetal, possui um possível efeito do tipo ansiogênico e um efeito
antidepressivo-símile em camundongos e seu efeito é dependente da integridade estrutural e
do sítio de reconhecimento a glicoconjugados contendo α-D-galactose. Além disso, o seu
efeito parece estar relacionado ao sistema glutamatérgico e a via L-Arginina/NO/cGMP,
verificado in vivo e in silico. Por fim, nosso estudo corroborou com outros estudos que
demonstraram ações neuroprotetoras de lectinas vegetais.
65
6 CONCLUSÕES
Este estudo demonstrou que a FTL possui um possível efeito ansiogênico-símile e
efeito antidepressivo-símile em dois modelos animais de depressão, sem efeitos adversos
aparentes sobre a locomoção motora. Este efeito é dependente do domínio lectínico e de sua
integridade estrutural. O efeito antidepressivo-símile da FTL é mediado pelos receptores
NMDA e a via L-arginina-NO/GMPc, consistente com o fato de que estas vias estão
criticamente envolvidas na etiologia e fisiopatologia da depressão. Os estudos de docking
molecular demonstraram fortes interações da FTL com a enzima NOS e receptor NMDA,
corroborando com os resultados in vivo. Além disso, estes resultados sugerem que a FTL tem
potencial para ser uma nova droga antidepressiva.
66
REFERÊNCIAS
ABDON, A. P. V.; SOUZA, G. C.; SOUZA, L. N. C et al. Gastroprotective potential of
frutalin, α-D-galactose binding lectin, against ethanol-induced gastric lesions. Fitoterapia,
Fortaleza, v. 83, n. 3, p. 604-608, 2012.
ABELAIRA, H. M.; RÉUS, G. Z.; QUEVEDO, J. Animal models as tools to study the
pathophysiology of depression. Rev. Bras. Psiquiatr. Santa Catarina, v. 35, p. 112-120,
2013.
AFOLABI-BALOGUN, N. B.; INUWA, H. M.; ISHIYAKU, M. F et al. Isolation and
characterization of a mannose-binding insecticidal lectin gene from Allium sativum (garlic)
and its putative role in insect resistance using bioinformatics tools. Infection, Genetics and
Evolution, Nigeria, v. 12, n. 7, p. 1508-1512, 2012.
ALENCAR, N. M.; OLIVEIRA, R. S.; FIGUEIREDO, J. G et al. An antiinflammatory lectin
from Luetzelburguia auriculata seeds inhibits adhesion and rolling of leukocytes and
modulates histamine and PGE2 action in acute inflammation models. Inflamm Res,
Fortaleza, v. 59, n. 4, p. 245-254, 2010.
AMADEO, G. I.; MOREIRA, R. A.; LIMA, R.; TEIXEIRA, D.; KRATJE, R.;
ETCHEVERRIGARAY, M. Screening of lectins from South American plants used as affinity
ligands to purify rhEPO. J. Chem. Eng., São Paulo, v. 20, p. 21-26, 2003.
AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION – APA. Manual Diagnóstico e Estatístico de
Transtornos Mentais – DSM – IV – TR (4th ed. Revised). Tradução Cláudia Dornelles.
Porto Alegre: Artmed, 2002. 880 p.
AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION. DSM-5 – Manual Diagnóstico e Estatístico
de Transtornos Mentais. Porto Alegre: Artmed, 2014.
AN, J. Z. J.; LIU, C. F.; WU, J et al. Bao Anti-HIV I/II activity and molecular cloning of a
novel mannose/sialic acid-binding lectin from rhizome of Polygonatum cyrtonema Hua. Acta
Biochim Biophys Sin, Chengdu, v. 38, p. 70–78, 2006.
ANDRADE L. H.; WANG, Y-P.; ANDREONI, S et al. Mental Disorders in Megacities:
Findings from the São Paulo Megacity Mental Health Survey, Brasil. PLoS ONE, v. 7, n. 2,
e31879, 2012.
ANDRADE, L. H. S. G.; GORENSTEIN, C. Aspectos gerais das escalas de avaliação de
ansiedade. Rev Psiquiatr Clín., Brasil, 25:285-90, 1998.
APARICIO, J. S.; HERMOSO, J.; GRANJEIRO, T. B.; CALVETTE, J. J.; CAVADA, B. S.
The crystal structure of Canavalia brasiliensis lectin suggests a correlation between its
quaternary conformation and its distinct biological properties from Concanavalin A. FEBS
Letters, Brasil, v. 405, p. 114-118, 1997.
67
ARAÚJO, R. M. S.; DA SILVA FERREIRA, R.; NAPOLEÃO, T. H et al. Crataeva tapia
bark lectin is an affinity adsorbent and insecticidal agent. Plant science, Brasil, v. 183, p. 20-
26, 2012.
ATALAH, B. A.; SMAGGHE, G.; VAN DAMME, E. J. Orysata, a jacalin-related lectin from
rice, could protect plants against biting-chewing and piercing-sucking insects. Plant Science,
Bélgica, 221, 21-28, 2014.
BARAUNA, S. C.; KASTER, M. P.; HECKERT, B. T et al. Antidepressant‐like effect of
lectin from Canavalia brasiliensis (ConBr) administered centrally in mice. Pharmacology
Biochemistry and Behavior, Brasil, v. 85, n. 1, p. 160-169, 2006.
BARLOW, D. H., CRASKE, M. G. Transtorno do Pânico e agoraphobia. In: BARLOW,
David H. (org). Manual clínico dos transtornos psicológicos. 2ª ed. Porto Alegre: Artmed,
1999.
BARONDES, S. H.; CASTRONOVO, V.; COOPER, D. N.; CUMMINGS, R. D.;
DRICKAMER, K.; FEIZI, T.; GITT, M. A.; HIRABAYASHI, J.; HUGHES, C.; KASAI, K.;
LEFFLER, H.; LIU, F. T.; LOTAN, R.; MERCURIO, A. M.; MONSIGNY, M.; PILLAI, S.;
POIRER, F.; RAZ, A.; RIGBY, P. W. J.; RINI, J. M.; WANG, J. L. Galectins: a family of
animal beta-galactoside-binding lectins. Cell. Califórnia, v. 76, p. 597–598, 1994.
BARONDES, S. H.; GITT, M. A.; LEFFLER, H.; COOPER, D. N. Multiple soluble
vertebrate galactoside-binding lectins. Biochimie, Califórnia, v. 70, n. 11, p. 1627-1632,
1988.
BELTRÃO, E. I.; CORREIA, M. T.; FIGUEREDO-SILVA, J.; COELHO, L. C. Binding
evaluation of isoform 1 from Cratylia mollis lectin to human mammary tissues. Applied
Biochemistry and Biotechnology, Pernambuco, v. 74, n. 3, p. 125-134, 1998.
BETTIO, L. E. B. Envolvimento dos receptores nmda e da via l-arginina-óxido nítrico-
gmpc no efeito tipo-antidepressivo da guanosina. 100 p. Dissertação de Mestrado em
Neurociências – Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC, Florianópolis, 2012.
BEZERRA, L. P. Glicoproteínas séricas ligantes da lectina de dioclea altissima no estudo
de doenças prostáticas. Dissertação de Mestrado em Bioquímica - Universidade Federal do
Ceará - UFC, 2014.
BIES, C.; LEHR, C-H.; WOODLEY, J. F. Lectin-mediated drug targeting: history and
applications. Advanced Drug Delivery Reviews, Saarbrücken, v. 56, p. 425-435, 2004.
BISHOP, A.; ANDERSON, J. E. NO signaling in the CNS: from the physiological to the
pathological. Toxicology, Alabama, v. 208, p. 193-205, 2005.
BOEHM, S.; HUCK, S. Presynaptic inhibition by concanavalin A: are alpha-latrotoxin
receptors involved in action potential-dependent transmitter release? J Neurochem, Áustria,
v. 71, n. 6, p. 2421-30, 1998.
68
BOING, A. F.; MELO, G. R.; BOING, A. C.; MORETTI-PIRES, R. O.; PERES, K. G.;
PERES, M. A. Association between depression and chronic diseases: results from a
population-based study. Rev. Saúde Pública. Florianópolis, v. 46, n. 4, p. 617-623, 2012.
BOISSIER, J. R; SIMON, P. La reaction dexploration chez la souris. Therapies, [S.l.]: 17, p.
1225-1232, 1962.
BOYD, W. C.; SHAPLEIGH, E. Specific precipitating activity of plant agglutinins (lectins).
Science, Boston, v. 119, p. 419, 1954.
BRAGA, R. Plantas do Nordeste, especialmente do Ceará. Col. Mossoroense 3 ed., Mossoró,
540p, 1976.
BRANDO-LIMA, A. C.; SALDANHA-GAMA, R. F.; HENRIQUES, M. G.; MONTEIRO-
MOREIRA, A. C.; MOREIRA, R. A.; BARJA-FIDALGO, C. Frutalin, a galactose-binding
lectin, induces chemotaxis and rearrangement of actin cytoskelon in human neutrophils:
involvrmrnt of tyrosine kinase and phosphoinositide 3-kinase. Toxicol Appl Pharmacol,
Fortaleza, v. 208, n. 2. p. 145-54, 2005.
BROWN, E. S.; VARGHESE, F. P.; MCEWEN, B. S. Association of depression with
medical illness: does cortisol play a role? Biol Psychiatry. Texas, v. 55, n. 1, p. 1-9, 2004.
BUCCAFUSCO, J. J. Methods of Behavior analysis in neuroscience. 2 ed. Boca Raton,
London, New York: Taylor & Francis Group. 2009.
CALABRESE, V.; MANCUSO, C.; CALVANI, M.; RIZZARELLI, E.; BUTTERFIELD, D.
A.; STELLA, A. M. Nitric oxide in the central nervous system: neuroprotection versus
neurotoxicity. Nat. Rev. Neurosci., Itália, v. 8, n. 10, p. 766-775, 2007.
CAMBY, I.; LE MERCIER, M.; LEFRANC, F.; KISS, R. Galectin-1: a small protein with
major functions. Glycobiology, Bélgica, v. 16, n. 11, p. 137R–157R, 2006.
CAMPANA, P. T., MORAES, D. I., MONTEIRO-MOREIRA, A. C. O., BELTRAMINI, L.
M., Unfolding and refolding studies of frutalin, a tetrameric d-galactose binding lectin.
European Journal of Biochemistry, São Paulo, v. 269, n. 3, p. 753–758, 2002.
CARNEY, R. M.; BLUMENTHAL, J. A.; FREEDLAND, K. E et al. Low heart rate
variability and the effect of depression on post– myocardial infarction mortality. Arch Intern
Med. Washington, v. 165, n. 13, 1486-1491, 2005.
CAROBREZ, A. P. Glutamatergic neurotransmission as molecular target in anxiety. Rev.
Bras. Psiquiatr. São Paulo, v. 25, n. 2, p. 52-58, 2003.
CAROLA, V.; D’OLIMPIO; BRUNAMONTI, E.; MANGIA, F.; RENZI, P. Evaluation of
the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behavior in
inbred mice. Behavioral Brain Research. Roma, v. 134, p. 49-57, 2002.
CARVALHO, S. A.; SILVA, M. V.; GOMES, F. S et al. Purification, characterization and
antibacterial potential of a lectin isolated from Apuleia leiocarpa seeds. International
journal of biological macromolecules, Recife, v. 75, p. 402-408, 2015.
69
CAVADA, B. S.; BARBOSA, T.; ARRUDA, S.; GRANGEIRO, T. B. Revisiting proteus: do
minor changes in lectin structure matter in biological activity? Lessons from and potential
biotechnological uses of the Diocleinae subtribe lectins. Curr Protein Pept Sci. Fortaleza, v.
2, p. 123-135, 2001.
CAVALCANTE, M. S.; TORRES-ROMERO, J. C.; LOBO, M. D. P et al. A panel of
glycoproteins as candidate biomarkers for early diagnosis and treatment evaluation of b-cell
acute lymphoblastic leukemia. Biomed central. Fortaleza, v. 4, n. 1, p. 111-222, 2016.
CHARUNGCHITRAK, S.; PETSOM, A.; SANGVANICH, P.; HARNCHANATAT, A.
Antifungal and antibacterial activities of lectin from the seeds of Archidendron jiringa
Nielsen. Food Chemistry, Tailândia, v. 126, p. 1025–1032, 2011.
COLLINGRIDGE, G. L.; LESTER, R. A. Excitatory amino acid receptors in the vertebrate
central nervous system. Pharmacol Ver. Inglaterra, v. 41, n. 2, p. 143-210, 1989.
CORREIA, M. T. S.; COELHO, L. C. B. B. Purification of a glucose/mannose specific lectin,
Isoform 1, from seeds of Cratylia mollis Mart (camaratu bean). Applied Biochemistry and
Biotechnology, Recife, v. 55, p. 261-273, 1995.
COSTA, R. M. P. B.; VAZ, A. F. M.; OLIVA, M. L. V.; COELHO, L. C. B. B.; CORREIA,
M. T. S.; CUNHA, M. G. C. A new mistletoe Phthirusa pyrifolia leaf lectin with antimicrobial
properties. Process Biochemistry, Recife, v. 45, p. 526–533, 2010.
CRUSIO, W. E.; SCHWEGLER, H., & VAN ABEELEN, J. H. Behavioral responses to
novelty and structural variation of the hippocampus in mice. I. Quantitative-genetic analysis
of behavior in the open-field. Behavioural Brain Research, Alemanha, v. 32, n. 1, p. 75-80,
1989.
CRUZ, A. P. D. M.; ZAGROSSI JÚNIOR, H.; GRAEFF, F. G.; LANDEIRA-FERNANDEZ.
Modelos animais de ansiedade: implicaçöes para a seleçäo de drogas ansiolíticas. Psicol. teor.
pesqui, Brasil, v. 13, n. 3, p. 269-78, 1997.
CRYAN, J. F.; HOLMES, A. The ascent of mouse: Advances in modelling human
Depression and anxiety. NATURE REVIEWS, Switzerland , v. 4, p. 775-779, 2005.
DAMASCENO, M. B. M. V.; de MELO JÚNIOR, J. M.; SANTOS, S. A. A. R.; LEITE, L.
H. I.; VIEIRA-NETO, A. E.; MOREIRA, R. A.; MONTEIRO-MOREIRA, A. C. O.;
CAMPOS, A.R. Frutalin reduces acute and neuropathic nociceptive behaviours in rodent
models of orofacial pain. Chemico-Biological Interactions. Fortaleza, v. 256, p. 9–15, 2016.
DA SILVA, G. D.; MATTEUSSI, A. S.; DOS SANTOS, A. R et al. Evidence for dual effects
of nitric oxide in the forced swimming test and in the tail suspension test in mice.
Neuroreport, Santa Catarina, v. 11, p. 3699-3702, 2000.
DANYSZ, W.; ZAJACZKOWSKI, W.; PARSONS, C. G. Modulation of learning processes
by ionotropic glutamate receptor ligands. Behavioural pharmacol. Alemanha, v. 6, n. 5, p.
455-474, 1995.
70
DE GROOT, M.; ANDERSON, R.; FREEDLAND, K. E et al. Association of depression and
diabetes complications: a meta-analysis. Psychosom Med. Washington, v. 63, n. 4, p. 619-30,
2001.
DENNINGER, J. W.; MARLETTA, M. A. Guanylate cyclase and the .NO/cGMP signaling
pathway. Biochim Biophys Acta, Michigan, v. 1411, n. 2-3, p. 334-50, 1999.
DÍAZ, C. L.; MELCHERS, L. S.; HOOYKASS, P. J. J et al. Root lectins a determinant of
host-plant specificity in the Rhizobiun-legume symbiosis. Nature, Leiden, v. 338, p. 579-581,
1989.
DUMAN, R. S.; LI, N. A neurotrophic hypothesis of depression: role of synaptogenesis in the
actions of NMDA receptor antagonists. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. New Haven,
v. 367, n. 1601, p. 2475-2484, 2012.
ELOLA, M. T.; FINK, N. E. Galectinas: estructura, especificidad glicídica y ligandos
específicos. Acta Bioquím Clín Latinoam, Buenos Aires, v. 34, n. 3, p. 293-330, 2000.
ERNEST, E. Review: St John’s wort superior to placebo and similar to antidepressants for
major depression but with fewer side effects. Evidence Based Mental Health. Exeter, v. 12,
p. 78, 2009.
ESPLUGUES, J. V. NO as a signalling molecule in the nervous system. Br J Pharmacol.
Valência, v. 135, p. 1079-1095, 2002.
EVERTS, I.; PETROSKI, R.; KIZELSZTEIN, P et al. Lectin-induced inhibition of
desensitization of the kainate receptor GluR6 depends on the activation state and can be
mediated by a single native or ectopic N-linked carbohydrate side chain. Journal
Neuroscience, Göttingen, v. 19, n. 3, p. 916–927, 1999.
EVERTS, I.; VILLMANN, C.; HOLLMANN, M. N-glycosylation is not a prerequisite for
glutamate receptor function but is essential for lectin modulation. Molecul Pharmacol.
Göttingen, v. 52, n. 5, p. 861-873, 1997.
FAHEINA-MARTINS, G. V.; DA SILVEIRA, A. L.; CAVALCANTI, B. C et al.
Antiproliferative effects of lectins from Canavalia ensiformis and Canavalia brasiliensis in
human leukemia cell lines. Toxicology in Vitro, João Pessoa, v. 26, p. 1161-1169, 2012.
FAUSTINO, T. T., ALMEIDA, R. B. DE; ANDREATINI, R. Plantas medicinais no
tratamento do transtorno de ansiedade generalizada: uma revisão dos estudos clínicos
controlados. Revista. Brasileira de Psiquiatria, Curitiba, v. 32, n. 4, p. 429-436, 2010.
FAY, A. M.; BOWIE, D. Concanavalin-A reports agonist-induced conformational changes in
the intact GluR6 kainate receptor. J Physiol, Montreal, v. 572, n. Pt 1, p. 201-13, 2006.
FERREIRA, E. S. Identificação de células leucêmicas por citometria de fluxo utilizando
lectinas conjugadas. Recife, 102 p. Tese de Doutorado em Ciências Biológicas -
Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, Recife, 2010.
71
FERREIRA, M. V. P. Frutalina, lectina alfa-D galactose ligante Artocarpus incisa L: Um
novo marcardor celular no estudo da progreção tumoral no câncer de mama humano.
Tese de Doutorado em Bioquimica - Universidade Federal do Ceará - UFC, Fortaleza, 2001.
FERRIGE, A. G.; SEDDON, M. J.; JARVIS, S. Maximum entropy deconvolution in
electrospray mass spectrometry. Rapid communication in Mass spectrometry, Cambridge,
v. 5, n. 8, p. 374–377, 1991.
FLEMING, C.; ULRICH, M. S. G.; SCHRODER, H. C.; MULLER, W. E. G. W.
Determination of lectin characteristics by a novel agglutination technique. Analytical
Biochemistry, Mogúncia, v. 205, p. 251-256, 1992.
FREITAS, A. P.; ASSREUY, A. M.; LOPES, É. A et al. Opioid-like antinociceptive effects
of oral administration of a lectin purified from the seeds of Canavalia brasiliensis. Fundam
Clin Pharmacol. Fortaleza, v. 27, n. 2, p. 201-9, 2013.
FROKJAER, V. G.; VINBERG, M.; ERRITZOE, D et al. High familial risk for mood
disorder is associated with low dorsolateral prefrontal cortex serotonin transporter binding.
Neuroimage. Copenhagen, v. 46, p. 360-6, 2009.
GANGWISCH, J. E.; MALASPINA, D.; POSNER, K et al. Insomnia and sleep duration as
mediators of the relationship between depression and hypertension incidence. Am J
Hypertens. New York, v. 23, n. 1, p. 62-69, 2010.
GARTHWAITE, J.; BOULTON, C. L. Nitric oxide signaling in the central nervous system.
Annu. Rev. Physiol. Beckenham, v. 57, n. 683-706, 1995.
GAUDET, A. D.; SWEET, D. R.; POLINSKI, N. K et al. Galectin-1 in injured rat spinal
cord: Implications for macrophage phagocytosis and neural repair. Molecular and Cellular
Neuroscience, Ohio, v. 64, p. 84-94, 2015.
GAZZANIGA, M.; HEATHERTON, T. Ciência Psicológica: mente, cérebro e
comportamento. São Paulo: Artmed, 2005.
GOLDSTEIN, I. J.; HUGHES, R. C.; MONSIGNY, M et al. Whats hould be called a lectin?
Nature, Michigan, v. 285, p. 66, 1980.
GOMES, F. S.; PROCOPIO, T. F.; NAPOLEAO, T. H et al. Antimicrobial lectin from
Schinus terebinthifolius leaf. Journal of Applied Microbiology (Print), Recife, v. 114, p.
672-679, 2013.
GONÇALVES, F. M.; FREITAS, A. E.; PERES, T. V et al. Vatairea macrocarpa lectin
(VML) induces depressive-like behavior and expression of neuroinflammatory markers in
mice. Neurochemical research, Santa Catarina, v. 38, n.11, p. 2375-2384, 2013.
GUIX, F. X.; URIBESALGO, I.; COMA, M et al. The physiology and pathophysiology of
nitric oxide in the brain. Prog. Neurobiol. Barcelona, v. 76, n. 2, p. 126-152, 2005.
72
HALL, C. S. Emotional behavior in the rat. I. Defecation and urination as measures of
individual differences in emotionality. Journal of Comparative Psychology (1921), [S.l.]: v.
18, n. 3, p.385-403, 1934.
HANDLEY, S. L.; MITHANI S. Effects of alpha-adrenoreceptor agonist in a maze-
exploration model of “fear”motivated behavior. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.
Laston, v. 327, n. 1, p. 1-5, 1984.
HARKIN, A. J.; CONNOR, T. J.; WALSH, M et al. Serotonergic mediation of the
antidepressant-like effects of nitric oxide synthase inhibitors. Neuropharmacol. Irlanda, v.
44, p. 616-623, 2003.
HARRISON, F. L. Soluble vertebrate lectins: ubiquitous but inscrutable protein. Journal of
Cell Science, Cambridge, v. 100, p. 9-14, 1991.
HARVEY, S. C. Hypnotics and sedatives. In Goodman IS, Gilman A (eds): The
Pharmacological Basis of Therapeutics. Ed 7. McMillan, New York, 1985.
HASHIMOTO, K. The role of glutamate on the action of antidepressants. Prog
Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, Japão, v. 35, n. 7, p. 1558-68, 2011.
HEIBERG, I. L.; WEGENER, G.; ROSENBERG, R. Reduction of cGMP and nitric oxide
has antidepressant-like effects in the forced swimming test in rats. Behav. Brain Res.
Dinamarca, v. 134, v. 1-2, p. 479-484, 2002.
HOEKSTRA, R.; FEKKES, D.; PEPPLINKHUIZEN, I et al. Nitric oxide and neopterin in
bipolar affective disorder. Neuropsychobiol. Portugal, v. 54, n. 1, p. 75-81, 2006.
HOLLISTER, L. E. Clinical Pharmacology of Psychotherapeutic Drugs. Ed 2. Churchill
Livingstone, Edinburgh, 1983.
HOWELLS, R. D.; GIOANNINI, T. L.; HILLER, J. M et al. Solubilization and
characterization of active opiate binding sites from mammalian brain. J. Pharmacol. Exp.
Ther, New York, v. 222, n. 629–634, 1982.
HOYOS, H. C.; RINALDI, M.; MENDEZ-HUERGO, S. P et al. Galectin-3 controls the
response of microglial cells to limit cuprizone-induced demyelination. Neurobiol. Disease,
Buenos Aires, v. 62, p. 441-455, 2014.
IMAIZUNI, Y.; SAKAGUCHI, M.; MORISHITA, T et al. Galectin-1 is expressed in early-
type neural progenitor cells and down-regulates neurogenesis in the adult hippocampus.
Molecular Brain, Tóquio, v. 27, p. 4 – 7, 2011.
ISHIBASHI, S.; KUROIWA, T.; SAKAGUCHI, M et al. Galectin-1 regulates neurogenesis
in the subventricular zone and promotes functional recovery after stroke. Exp Neurol,
Tóquio, v. 207, n. 2, p. 302 – 313, 2007.
JACQUES, A. V. Avaliação do efeito neuroprotetor de lectinas frente à neurotoxicidade
glutamatérgica. Dissertação de Mestrado em Bioquímica - Universidade Federal de Santa
Catarina – UFSC, Florianópolis, 2012.
73
JACQUES, A. V.; RIEGER, D. K.; MAESTRI, M et al. Lectin from Canavalia brasiliensis
(ConBr) protects hippocampal slices against glutamate neurotoxicity in a manner dependent
of PI3K/Akt pathway. Neurochemistry International. Santa Catarina, v. 62, p. 836–842,
2013.
JOCA, S. R. L.; GUIMARÃES, F. S. Inhibition of neuronal nitric oxide synthase in the rat
hippocampus induces antidepressant-like effects. Psychopharmacology, Ribeirão Preto, v.
185, n. 3, 298-305, 2006.
KAJITANI, K.; NOMARU, H.; IFUKU, M. Galectin-1 promotes basal and kainate-induced
proliferation of neural progenitors in the dentate gyrus of adult mouse hippocampus. Cell
Death Differ, Japão, v. 16, n. 3, p. 417 – 427, 2009.
KALUEFF, A. V.; TUOHIMAA, P. Grooming analysis algorithm for neurobehavioural stress
research. Brain Res. Protoc. Finlândia, v. 13, p. 151 – 158, 2004a.
KASTER, M. P.; ROSA, A. O.; SANTOS, A. R et al. Involvement of nitric oxide-cGMP
pathway in the antidepressant-like effects of adenosine in the forced swimming test. Int J
Neuropsychopharmacol. Santa Catarina, v. 8, n. 4, 601-6, 2005.
KATON, W. J. Epidemiology and treatment of depression in patients with chronic medical
illness. Dialogues Clin Neurosci. Washington, v. 13, n. 1, p. 7-23, 2011.
KATZUNG, B. G. Farmacologia - Básica e Clínica. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 10.ª
ed., 1.046 p., 2010.
KIJNE, J.; DÍAZ, C.; DE PATER, S. Lectins in the symbiosis between Rhizobia and
leguminous plants. Advance Lectin Research, [S.l.]: v. 5, p. 15-50, 1992.
KIM, C. H.; WALDMAN I. D.; BLAKELY, R. D. Functional gene variation in the human
norepinephrine transporter: association with attention deficit hyperactivity disorder. Ann. N.
Y. Acad. Sci., Cambridge, n. 1129, p. 256-60, 2008.
KIM, Y. J.; CARVALHO, F. C.; SOUZA, J. A. C et al. Topical application of the lectin Artin
M accelerates wound healing in rat oral mucosa by enhancing TGF-β and VEGF production.
Wound Repair and Regeneration, São Paulo, v. 21, p. 456–463, 2013.
KRUK, M. R.; WESTPHAL, K. G. C.; VANERP et al. The hypothalamus: cross-roads of
endocrine and behavioral regulation of grooming and aggression. Neurosci. Biobehav. Rev.
Leiden, v. 23, p. 163–177, 1998.
LACERDA, G. F. M. L. Ansiedade em modelos animais: efeito de drogas nas dimensões
extraídas da análise fatorial. Dissertação de mestrado – Universidade Federal do Paraná -
UFPR, Paraná, 60 p. 2006.
LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage
T4. Nature, Cambridge, v. 227, p. 680-685, 1970.
74
LI, Y. R.; LIU, Q. H.; WANG, H. X. A novel lectin with potent antitumor, mitogenic and
HIV-1 reverse transcriptase inhibitory activities from the edible mushroom Pleurotus
citrinopileatus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, China, v. 1780, p.
51-7, 2008.
LIN, S. S.; LEVITAN, I. B. Concanavalin A: a tool to investigate neuronal plasticity. Trends
Neurosci, Boston, v. 14, n. 7, p. 273-7, 1991.
LIS, H.; SHARON, N. Biological properties of lectins. In: The Lectins: Propertieis Functions,
and Applications in Biology and Medicine. London: Academic Press, p. 265-285, 1986a.
LIS, H.; SHARON, N. Lectins: carbohydrate specific proteins that mediate cellular
recognition. Chemical Reviews, Israel, v. 98, p. 637-674, 1998.
LISTER, R. G. The use of plus-maze to measure anxiety in the mouse.
Psychopharmacology, Bethesda, v. 92, p. 119-126, 1987.
LOH, S. H.; PARK, J. Y.; CHO, E. H et al. Animal lectins: potential receptors for ginseng
polysaccharides. Journal of Ginseng Research, Coréia do Sul, p. 1-9, 2015.
LOUDON, J. B. Drug treatment. In Kendell RE, Zealley AK (eds): Companion to Psychiatric
Studies. Churchill Livingstone, London, p. 700, 1988.
MACKINNON, R. Potassium channels. FEBS Lett. New York, v. 555, p. 62–65, 2003.
MCCAFFERTY, H. R. K.; MOORE, P. H.; ZHU, Y. J. Papaya transformed with the
Galanthus nivalis GNA gene produces a biologically active lectin with spider mite control
activity. Plant Science, Estados Unidos, v. 175, p. 385-93, 2008.
MCLEOD, T. M.; LÓPEZ-FIGUEROA, A.L.; LÓPEZ-FIGUEROA, M. O. Nitric oxide,
stress, and depression. Psychopharmacol. Bull. Michigan, v. 35, n. 1, 24-41, 2001.
MELDRUM, B. S. Glutamate as a Neurotransmitter in the Brain: Review of Physiology and
Pathology. J Nutr. Londres, v. 130, p. 1007S-15S, 2000.
MELO, C. M. L.; PORTO, C. P.; MELO-JUNIOR, M. R et al. Healing activity induced by
Cramoll 1,4 lectin in healthy and immunocompromised mice. International Journal of
Pharmaceutics, Pernambuco, v. 408, n. 1–2, p. 113–119, 2011.
MILHOME, M. V. Frutalina, Lectina alfa-D-galactose ligante de Artocapus incisa L., no
estudo do câncer de tireóide humana. Análise comparativa com a galactina-3. Dissertação
de Mestrado em Bioquímica - Universidade Federal do Ceará - UFC, Fortaleza, 2003.
MONCADA, S.; PALMER, R. M.; HIGGS, E. A. Biosynthesis of nitric oxide from L-
arginine. A pathway for the regulation of cell function and communication. Biochem
Pharmacol. Kent, v. 38, p. 1709-1715, 1989.
MONTEIRO-MOREIRA, A. C. O Caracterização estrutural de três lectinas apresentando
especificidades distintas presentes em sementes de fruta-pão (Artocarpus incisa L.). Tese
75
para obtenção do título de Doutor - Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular,
Universidade Federal do Ceará – UFC, Fortaleza, 2002.
MONTEIRO-MOREIRA, A. C. O.; D’MUNIZ, P. H.; VIEIRA-NETO, A. E et al.
Crystallization and preliminary x-ray diffraction studies of Frutalin, an α-D-galactose-binding
lectin from Artocarpus incisa seeds, Acta Crystallographica, Fortaleza, Session F, 2015.
MOREIRA, R. A., PERRONE, J. C. Purification and Partial Characterization of a Lectin from
Phaseolus vulgaris. Plant Physiology, Rio de Janeiro, v. 59, n. 5, p. 783–787, 1977.
MOREIRA, R. A.; AINOUZ, I. L.; DE OLIVEIRA, J. T et al. Plant lectins, chemical and
biological aspects. Memorias Instituto Oswaldo Cruz, Fortaleza, v. 86, p. 211-218, 1991.
MOREIRA, R. A.; CASTELO-BRANCO, C. C.; MONTEIRO, A. C. O et al. Isolation and
partial characterization of a lectin from Artocarpus incisa L. seeds. Phytochemistry,
Fortaleza, v. 46, n. 1, p. 139–144, 1998.
MOREIRA, R. A.; CAVADA, B. S. Lectin from Canavalia brasiliensis Mart. Isolation,
characterization and behavior during germination. Biol Plant Praga – Checoslov, Fortaleza,
v. 26, n. 26, p. 113-20, 1984.
MORENO, R. A.; MORENO, D. H.; SOARES, M. B. M. Psicofarmacologia de
antidepressivos. Rev. Bras. Psiquiatr. São Paulo, v. 21, n. 1, p. 24-40, 1999.
NASCIMENTO, K. S.; NASCIMENTO, F. L. F.; SILVA, M. T. L et al. Purification of a
thermostable antinociceptive lectin isolated from Andira anthelmia. J. Mol. Recognit.,
Fortaleza, v. 29, n. 6, p. 248–252, 2015.
NEMEROFF, C. B. Anxiolytics: past, present, and future agentes. Journal of Clinical
Psychiatry, Atlanta, v. 64, p. 3-6, 2003.
NEMEROFF, C. B. The burden of severe depression: A review of diagnostic challenges and
treatment alternatives. J. Psychiatr. Res., Atlanta, v. 41, p. 189-206, 2007.
NEPOMUCENO, D. R. Clonagem e expressão de uma lectina de Artocarpus incisa L.
(Frutalina) em Escherichia coli; Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica
e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, 2008.
NESTLER, E. J.; BARROT. M.; DILEONE, R. J et al. Neurobiology of depression. Neuron,
Texas, v. 34, n. 1, p. 13-25, 2002.
NOWELL, P. C. Phytohemagglutinin: an initiator of mitosis in cultures of normal human
leucocytes. Cancer Research, Filadélfia, v. 20, p. 426-426, 1960.
NUTT, D. J. Relationship of neurotransmitters to the symptoms of major depressive disorder.
J Clin Psychiatry. Bristol, v. 69, p. 4-7, 2008.
76
OLIVEIRA C., NICOLAU A., TEIXEIRA J.A. Cytotoxic effects of native and recombinant
frutalin, a plant galactose-binding lectin, on HeLa cervical cancer cells. J Biomed
Biotechnol. Portugal, ID 568932, 9 p. 2011.
OTTERSEN, O. P.; STORM-MATHISEN, J. Glutamate. In: Björklund A, Hökfelt T, eds.
Handbook of chemical neuroanatomy. Vol 18. Amsterdam: Elsevier; 2000.
OUYANG, L.; CHEN, Y.; WANG, X. Y et al. Polygonatum odoratum lectin induces
apoptosis and autophagy via targeting EGFR-mediated Ras-Raf-MEK-ERK pathway in
human MCF-7 breast cancer cells. Phytomedicine, China, v. 21, n. 12, p. 1658-1665, 2014.
PAPAKOSTAS, G. The efficacy tolerability, and safety of contemporary antidepressants.
Journal of Clinic Psychiatry. Boston, v. 71, p. 1-3, 2010.
PENG, H.; LV, H.; WANG, Y et al. Clematis montana lectin, a novel mannose-binding lectin
from traditional Chinese medicine with antiviral and apoptosis-inducing activities. Peptides,
China, v. 30, n. 10, p. 1805-1815, 2009.
PEREIRA, C.; LIMA, A. B.; GAMA, R. S et al. Involvement of AKT and NF kapa-B on
Iymphocyte activation by frutalin, a galactose-binding lectin. Nitric Oxide, Cytokines and
Inflammation - An International Simposium. Copacabana Palace-Jun/2014- Rio de Janeiro,
Brasil.
PETIT-DEMOULIERE, B.; CHENU, F.; BOURIN, M. Forced swimming test in mice: a
review of antidepressant activity. Psychopharmacology (Berl), França, v. 177, n. 3, p. 245-
55, 2005.
PEUMANS, W. J.; VAN DAMME, E. J. M. Lectins as plant defense proteins. Plant
Physiology, Bélgica, v. 109, p. 347-352, 1995.
PEUMANS, W. J.; VAN DAMME, E. J. M. Plant Lectins: Versatile Proteins with Important
Perspectivesin Biotechnology. Biotechnology and Genetic engineering Reviews, Bélgica, v.
15, 1998.
PIMENTA, A. B. Atividade ansiolítica e antidepressiva do extrato bruto das partes
aéreas da Kielmeyera rubriflora em camundongos. Dissertação de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas - Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, Minas Gerais,
2014.
PORSOLT, R. D.; BERTIN, A.; JALFRE, M. Behavioral despair in mice: a primary
screening test for antidepressants. Archives Internationales de Pharmacodynamie et de
Therapie. [S.l.]: v. 229, n. 2, p. 327-36, 1977.
PRUT, L.; BELZUNG, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on
anxiety-like behaviors: a review. European Journal of Pharmacology. França, v. 463, n. 1-
3, p. 3 -33, 2003.
PRYBYLOWSKI, K.; WENTHOLD, R. J. N-Methyl-D-aspartate receptors: subunit assembly
and trafficking to the synapse. J Biol Chem. Marilândia, v. 279, p. 9673-9676, 2004.
77
QU, W. S.; WANG, Y. H.; WANG, J. P. Galectin-1 enhances astrocytic BDNF production
and improves functional outcome in rats following ischemia. Neurochem Res, China, v. 35,
p. 1716-1724, 2010.
QU, W. S.; WANG, Y. H.; MA, J. F et al. Galectin-1 attenuates astrogliosis-associated
injuries and improves recovery of rats following focal cerebral ischemia. J Neurochem,
China, v. 116, n. 2, p. 217-26, 2011.
QUIROGA, A. V.; DANIEL A. B.; MARÍA, C. A. Amaranth lectin presents potential
antitumor properties. LWT-Food Science and Technology La Plata, v. 60, n. 1, p. 478-485,
2015.
RAGONE, D. Breadfruit. Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg. Promoting the conservation
and use of underutilized and neglected crops. Institute. International Plant Genetic
Resources Institute, Rome, Italy, 1997.
RANGEL, T. B.; ASSREUY, A. M.; PIRES, A. F et al. Crystallization and characterization
of na inflammatory lectin purified from the seeds of Dioclea wilsoni. Molecules, Vitória, v.
16, n. 6, p. 5087-5183, 2011a.
RANGEL, T. B.; ROCHA, B. A.; BEZERRA, G. A et al. Crystal structure of a pro-
inflammatory lectin from the seeds of Dioclea wilsonii Standl. Biochimie., Vitória, v. 94, n.
2, p. 525-532, 2011b.
RAY, S.; AHMED, H.; BASU, S.; CHATTERJEE, B.P. Purification, characterization, and
carbohydrate specificity of the lectin of Ficus cunia. Carbohydrate Research, Índia, v. 242,
p. 24763, 1992.
RIEGER, D. K.; COSTA, A. P.; BUDNIA, J et al. Antidepressant-like effect of Canavalia
brasiliensis (ConBr) lectin in mice: evidence for the involvement of the glutamatergic system.
Pharmacol. Biochem. Behavior. 122: 53-60, 2014.
RODRIGUES, N. V. F. C. Estudo da atividade anti-inflamatória da lectina de sementes
de Lonchocarpus araripensis BENTH. Ceará, 77 p. Dissertação de Mestrado em Ciências
Fisiológicas – Universidade Estadual do Ceará – UECE, Fortaleza, 2012.
ROMAN, S.; SAVOIA, M. G. Automatics thoughts and anxiety in soccer team. Psicol. teor.
Prat., Brasil, v. 5, n. 2, p. 13-22, 2003.
ROSENZWEIG-LIPSON, S.; BEYER, C. E.; HUGHES, Z. A et al. Differentiating
antidepressants of the future: efficacy and safety. Pharmacology & therapeutics, Princeton,
v.113, n. 1, p. 134-153, 2007.
RUSSI, M. A.; VANDRESEN-FILHO, S.; RIEGER, D. K et al. ConBr, a lectin from
Canavalia brasiliensis seeds, protects against quinolinic acid-induced seizures in mice.
Neurochem Res., Santa Catarina, v 37, p. 288 –297, 2012.
SANACORA, G.; TRECCANI, G.; POPOLI, M. Towards a glutamate hypothesis of
depression: an emerging frontier of neuropsychopharmacology for mood disorders.
Neuropharmacol. New Haven, v. 62, n. 1, p. 63-77, 2011.
78
SCHERER, W. J.; UDIN, S. B. Concanavalin A reduces habituation in the tectum of the frog.
Brain Res, New York, v. 667, n. 2, p. 209-15, 1994.
SCHILDKRAUT, J. J. The catecholamine hypothesis of affective disorders: a review of
supporting evidence. American Journal of Psychiatry. Bethesda, v. 122, n. 5, p. 509-522,
1965.
SCHMITT, U.; HIEMKE, C. Strain differences in open-field and elevated plus-maze behavior
of rats without and with pretest handling. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior,
Alemanha, v. 54, p. 355-361, 1998.
SHARON, N.; GOLDSTEIN, I. J. Lectins: More than insecticides. Science, Michigan, v. 282,
p. 1049, 1998.
SHARON, N.; LIS, H. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition
molecules. Glycobiology, Israel, v. 14, n. 11, p. 53-60, 2004.
SHARON, N.; LIS, H. Legumes lectins – a large Family of homologus proteins. Federation
American Societies Experimental Journal, Bethesda, v. 4, p. 3198-3208, 1990.
SIKARWAR, M. S.; HUI, B. J.; SUBRAMANIAM, K et al. A Review on Artocarpus altilis
(Parkinson) Fosberg (breadfruit). Journal of Applied Pharmaceutical Science, Malásia, v.
4, n. 08, p. 091-097, 2014.
SILVA J. A. C. História dos benzodiazepinicos. In: Bernik M.A. Benzodiazepínicos: quatro
décadas de experiência. São Paulo, p. 15-28, 1999.
SILVA, H. C.; BARI, A. U.; ROCHA, B. A. M et al. Purification and primary structure of a
mannose/glucose-binding lectin from Parkia biglobosa Jacq. seeds with antinociceptive and
anti-inflammatory properties. J. Mol. Recognit, Fortaleza, v. 26, p. 470–478, 2013.
SILVA, R. Avaliação da atividade cicatrizante em ratos utilizando nanopartícula
contendo lectina de Cratylia mollis. Recife, 75 p. Dissertação de Mestrado em Ciências
Biológicas – Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, 2014.
SINGH, S.; DIKSHIT, M. Apoptotic neuronal death in Parkinson's disease: involvement of
nitric oxide. Brain Res. Rev. Índia, v. 54, n. 2, p. 233-250, 2007.
SKOLNICK, P.; POPIK, P.; TRULLAS, R. Glutamate-based antidepressants: 20 years on.
Trends in Pharmacological Sciences, New York, v. 30, n. 11, p. 563-569, 2009.
SOBRAL, A. P. V.; REGO, M. J.; CAVALACANTI, C. L et al. ConA and UEA-I lectin
histochemistry of parotid gland mucoepidermoid carcinoma. Journal of oral science, Recife,
v. 52, n. 1, p. 49-54, 2010.
SOUSA, F. C. F.; MELO, C. T. V.; CITO, M. C. O et al. Plantas medicinais e seus
constituintes bioativos: Uma revisão da bioatividade e potenciais benefícios nos distúrbios da
ansiedade em modelos animais. Revista Brasileira de Farmacognosia, Fortaleza, v. 18, n. 4,
p. 642-654, 2008.
79
SOUZA, J. D.; SILVA, M. B. R.; ARGOLO, A. C. C et al. A new Bauhinia monandra
galactose-specific lectin purified in milligram quantities from secondary roots with antifungal
and termiticidal activities. International Biodeterioration & Biodegradation, Recife, v. 65,
p. 696-702, 2011.
SPIELBERGER, C. Anxiety: Current Trends in Theory and Research. New York: Academic
Press, vol 1, 1972.
SPITATRO, S. R.; COCHRAN, G. R.; WALKER, R. E et al. Characterization of a new lectin
of soybean vegetative tissue. Plant Physiology, Ohio, v. 110, p. 825-834, 1996.
STAHL, S. M. Essential psychopharmacology. Cambridge University Press, Cambridge,
1996.
STAROSSOM, S. C.; MASCANFRONI, I. D.; IMITOLA, J et al. Galectin-1 deactivates
classically activated microglia and protects from inflammation-induced neurodegeneration.
Immunity, Boston, v. 37, n. 2, p. 249-263, 2012.
STERU, L.; CHERMAT, R.; THIERRY, B.; SIMON, P. The tail suspension test: a new
method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology (Berl). Paris, v. 85, n. 3,
p. 367-70, 1985.
STILLMARK, H. Über Ricin ein giftiges Ferment aus den Samen von Ricinus communis L.
und einige anderen Euphorbiaceen. Inaugural Dissertation, Dorpat, Tartu, 1888.
SUZUKI, E.; YAGI, G.; NAKAKI, T et al. Elevated plasma nitrate levels in depressive
states. J. Affect. Disord., Tóquio, v. 63, p. 221-224, 2001.
SVENSSON, T. H. Effect of chronic treatment with tricyclic antidepressant drugs on
identified brain noradrenergic and serotonergic neurons. Acta Psych. Scand., [S.l.]: v. 61, p.
121-131, 1980.
SVENSSON, T. H.; USDIN, T. Feedback inhibition of brain noradrenaline neurons by
tricyclic antidepressants: a receptor mediation. Science, Suécia, v. 202, p. 1089-1091, 1978.
TAKEDA, H.; TSUJI,M.; MATSUMIYA,T. Changes in head-dipping behavior in the hole-
board test reflect the anxiogenic and/or anxiolytic states in mice. Journal of
Pharmacological Sciences, Tóquio, v. 102, p. 377-386, 2006.
TREIT, D. Animal models for the study of anti-anxiety agents: a review. Neuroscience &
Biobehavioral Reviews, Canadá, v. 9, n. 2, p. 203-222, 1985.
TRULLAS, R.; SKOLNICK, P.; Functional antagonists at the NMDA receptor complex
exhibit antidepressant actions. Eur J Pharmacol. Bethesda, v. 185, n. 1, p. 1-10, 1990.
VAN DAMME E, J. M.; FOUQUAERT, E.; LANNOO, N et al. “Novel concepts about the
role of lectins in the plant cell,”. The Molecular Immunology of Complex Carbohydrates-
3, Vol. 705 ed. A. M. Wu, New York, Springer, 295–324, 2011.
80
VAN DAMME, E. J. M.; PEUMANS, W. J.; PUSZTAI, A.; BARDOCZ, S. The Handbook
of Plant Lectins: Properties and Biomedical Applications. John Wiley and Sons, New York,
p. 31-50, 1998.
VAN EIJSDEN, R. R; DÍAZ, C. L.; DE PATER B. S. Sugar-binding activity of pea (Pisum
sativum) lectin is essential for heterologous infection of transgenic white clover hairy roots by
Rhizobium leguminosarum biovar viciae. Plant Molecular Biology, Amsterdã, v. 29, p. 431-
439, 1995.
VANDENBORRE, G.; SMAGGHE, G.; VAN DAMME, E. J. Plant lectins as defense
proteins against phytophagous insects. Phytochemistry, Bélgica, v. 72, n. 13, p. 1538-1550,
2011.
VANERP, A. M. M.; KRUK, M. R.; MEELIS, W. Effect of environmental stressors on time
course, variability and form of self-grooming in the rat: handling, social contact, defeat,
novelty, restraint and fur moistening. Behav. Brain Res. Leiden, v. 65, p. 47–55, 1994.
VAZ, A. F. M.; COSTA, R, M. P. B.; MELO, A. M. M. A et al. Biocontrol of Fusarium
species by a novel lectin with low ecotoxicity isolated from Sebastiania jacobinensis. Food
Chemistry, Recife, v. 119, p. 1507–1513, 2010.
VIEIRA NETO, A. E. Caracterização estrutural da frutalina, uma lectina α-D-galactose
ligante de sementes de Artocarpus incisa e análise das suas bases moleculares de ligação
alfa-D-galactose. Dissertação de Mestrado em Bioquímica – Universidade Federal do Ceará
– UFC, Fortaleza, 2015.
VIEIRA, R. A. Avaliação dos efeitos centrais do extrato aquoso (ea) de Stachytarpheta
cayennensis Vahl. Dissertação de Mestrado em Farmacologia, Universidade Federal de Santa
Catarina – UFSC, Florianópolis, 2001.
VIJAYAN, M.C.; CHANDRA, N. Lectins Current Opinion. Structural Biology, [S.l.]: v. 9,
p. 707714, 1999.
VIKRAM, D.; KSHITIJA, D.; JATINDER, S et al. Purification and characterization of an
Anti-proliferative and mitogenic plant lectin from tubers of Arisaema speciosum.
Pharmacognosy Journal, Índia, v. 2, n. 9, 266-277, 2010.
VOLKE, V.; WEGENER, G.; BOURIN, M. Antidepressant- and anxiolytic-like effects of
selective neuronal NOS inhibitor 1-(2-trifluoromethylphenyl)-imidazole in mice. Behav
Brain Res. Estônia, v. 140, p. 141-147, 2003.
WHIMBEY, A. E.; DENENBERG, V. H. Two independent behavioral dimensions in
openfield performance. Journal of Comparative and Physiological Psychology, [S.l.]: v.
63, n. 3, p. 500-504, 1967.
WONG, M.L.; LICINIO, J. Research and treatment approaches to depression. Nat Rev
Neurosci. Los Angeles, v. 2, p. 343 – 351, 2001.
81
World Health Organization. Comprehensive Mental Health Action Plan 2013-2020.
Geneva: World Health Organization, 2013. Disponível em: http://
www.who.int/mental_health/publications/action_plan/en/
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Mental health atlas 2011. Geneva: World Health
Organization. 2011 WORLD HEALTH ORGANIZATION. 2014. Disponível em:
http://www.who.int/gho/publications/world_health_statistics/2014/en/ acesso em 28/06/2014.
World Health Organization. mhGAP Intetion Guide for mental, neurological and
substance use disorders in non-specialized health settings; 2010. Visualizado 05/07/2016:
http://whqlibdoc.who.int/publications/2010/9789241548069_eng.pdf
WORLD HEALTH ORGANIZATION. The World Health Report 2001: Mental health:
new understanding, new hope. World Health Organization, 2001.
WU, L.; LIU, T.; XIAO, Y et al Polygonatum odoratum lectin induces apoptosis and
autophagy by regulation of microRNA-1290 and microRNA-15a-3p in human lung
adenocarcinoma A549 cells. International journal of biological macromolecules, China, v.
85, p. 217-26, 2016.
YILDIZ, F.; ERDEN, B. F.; ULAK, G et al. Antidepressant-like effect of 7-nitroindazole in
the forced swimming test in rats. Psychopharmacology, Turquia, v. 149, p. 41-44, 2000.
YUE, K. T.; MACDONALD, J. F.; PEKHLETSKI, R et al. Differential effects of lectins on
recombinant glutamate receptors. Eur. J. Pharmacol. Mol. Ontario, v. 291, n. 3, p. 229–235,
1995.
Top Related