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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

EFEITO ANTIDEPRESSIVO-SÍMILE DA FRUTALINA, LECTINA α-D-

GALACTOSE LIGANTE, ISOLADA DE SEMENTES DE Artocarpus incisa L., EM

CAMUNDONGOS

FORTALEZA

2016

JOÃO RONIELLY CAMPÊLO ARAÚJO

JOÃO RONIELLY CAMPÊLO ARAÚJO

EFEITO ANTIDEPRESSIVO-SÍMILE DA FRUTALINA, LECTINA α-D-

GALACTOSE LIGANTE, ISOLADA DE SEMENTES DE Artocarpus incisa L., EM

CAMUNDONGOS

FORTALEZA

2016

Dissertação de Mestrado submetida à

coordenação do Curso de Pós-Graduação em

Bioquímica da Universidade Federal do Ceará

como requisito parcial para obtenção do grau

de Mestre em Bioquímica. Área de

concentração: Bioquímica Vegetal.

Orientador: Dr. Renato de Azevedo Moreira

JOÃO RONIELLY CAMPÊLO ARAÚJO

EFEITO ANTIDEPRESSIVO-SÍMILE DA FRUTALINA, LECTINA α-D-

GALACTOSE LIGANTE, ISOLADA DE SEMENTES DE Artocarpus incisa L., EM

CAMUNDONGOS

Data: 16/08/2016

BANCA EXAMINADORA

Dissertação de Mestrado submetida à

coordenação do Curso de Pós-Graduação em

Bioquímica da Universidade Federal do Ceará

como requisito parcial para obtenção do grau

de Mestre em Bioquímica. Área de

concentração: Bioquímica Vegetal.

Aos meus pais,

Sebastião Alves de Araújo e Jeanne Maria

Campêlo de Matos Araújo, pelo apoio e

dedicação para que todos os meus sonhos

sejam realizados.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por guiar os meus caminhos e ajudar em todos os momentos da minha vida.

Aos meus pais científicos e Orientadores, Dr. Renato de Azevedo Moreira e Dra. Ana

Cristina de Oliveira Monteiro Moreira, pelo apoio, paciência e dedicação para que este

trabalho pudesse ser realizado com sucesso. Por serem meus grandes exemplos na pesquisa

científica e por terem me acolhido da melhor forma possível em seu grupo de pesquisa.

À minha Co-orientadora, Dra. Adriana Rolim Campos Barros, pelo acolhimento em

seu grupo de pesquisa durante o desenvolvimento do trabalho, além de demonstrar grande

interesse e dedicação. Seu auxílio foi essencial para a realização deste trabalho.

Aos membros da banca examinadora, Professora Dra. Ana Lúcia Ponte Freitas, que

me orientou na disciplina de Ensino em Docência e me ajudou muito na realização das aulas,

e Dr. Gilvan Pessoa Furtado por aceitar o convite e contribuir com seu conhecimento.

Aos grandes amigos e pesquisadores José de Maria, Marina, Sacha, Talita e Andressa

por estarem comigo sempre quando necessário, até nos finais de semana, para que o trabalho

pudesse dar certo. Assim como também Ernani, Olavo, Robson, Isabel, Karine e Tânia.

Aos amigos pesquisadores e colegas do Laboratório F66: Kueirislene, Rossueti e

Hyldécia pela disponibilidade e ajuda nos momentos que precisei. Assim como Rogênio,

Fernanda, Melissa, Juliana, Felipe, Neto, Nydy, Marina, Márcio, Breno, Cícero, Eduardo,

Hermenson, Lorena e Nycolas por terem participado da minha trajetória no mestrado e me

apoiarem no projeto.

Ao CNPq, CAPES e FUNCAP pelo apoio financeiro.

À Universidade Federal do Ceará e Departamento de Bioquímica e Biologia

Molecular pela oportunidade para a realização deste trabalho. Assim como a Universidade de

Fortaleza por proporcionar todo o excelente ambiente de estudo, pesquisa e aprendizado.

Aos meus pais, Sebastião e Jeanne, por serem meu porto seguro e o apoio da minha

vida.

À minha irmã Camilla e primos Soraya e Joabe por estarem comigo no dia-a-dia e

pelo apoio. Aos meus avós, tias e primos.

Aos meus amigos Ana Estela, Alanna Cortez, Gillianne Vidal, Alana Azevedo, Ingrid

Azevedo, Cinthia Melo, Lyanne Texeira e Igor Sá por sempre torcerem pelo meu sucesso.

“O coração do homem pode fazer planos, mas

a resposta certa vem dos lábios do Senhor.”

Provérbios 16: 1.

“Que os vossos esforços desafiem as

impossibilidades, lembrai-vos de que as

grandes coisas do homem foram conquistadas

do que parecia impossível. ” Charles Chaplin

RESUMO

Frutalina (FTL), uma lectina α-D-galactose ligante, obtida de sementes de Artocarpus incisa

L., tem apresentado várias atividades biológicas, como ação na modulação de alvos

moleculares e reversão de neurotoxicidade in vitro, porém, há pouca evidência de seu efeito

sobre doenças no Sistema Nervoso Central (SNC). Diante disto, este estudo avaliou os efeitos

neurocomportamentais da FTL em camundongos. Os camundongos (n = 6 / grupo) foram

tratados com FTL (0,25; 0,5 ou 1 mg/kg; i.p.) ou Veículo (NaCl 0,9 % 10 mL/kg; i.p.;

Controle) e submetidos aos testes da placa perfurada, labirinto em cruz elevado, campo

aberto, suspensão pela cauda ou natação forçada. Num segundo conjunto de experimentos, a

ioimbina (1 mg/kg), cetamina (0,1 mg/kg), L-NAME (10 mg/kg) ou azul de metileno (10

mg/kg) foram administrados (i.p.) 15 min antes da FTL (0,5 mg/kg) e os animais foram

submetidos ao teste de natação forçada. Verificou-se também se o efeito de FTL no teste de

natação forçada era dependente da integridade estrutural e capacidade de interação a

carboidratos. A fim de avaliar o efeito subcrônico da FTL, os camundongos receberam FTL

(0,5 mg/kg) ou veículo durante 7 dias e submetidos ao teste de natação forçada no primeiro e

último dia de tratamento. Foi realizado docking molecular da FTL com NOS e receptor

NMDA. Os resultados mostraram que não houve alterações neurocomportamentais dos

camundongos nos testes de placa perfurada e campo aberto. FTL na dose mais baixa (0,25

mg/kg) aumentou o número de entradas nos braços fechados no teste do labirinto em cruz

elevado, permitindo sugerir um possível efeito do tipo ansiogênico. FTL reduziu o tempo de

imobilidade nos testes de suspensão pela cauda (0,25 e 0,5 mg/kg; p <0,05) e natação forçada

(0,25 mg/kg, p <0,05 e 0,5 mg/kg; p <0,01) apresentando um efeito antidepressivo-símile. A

redução da imobilidade provocada pela FTL foi prevenida pela Cetamina (antagonista de

receptores NMDA), L-NAME (inibidor não-seletivo da NOS) e azul de metileno (inibidor da

cGMP), mas não pela Ioimbina (antagonista α2-adrenérgico). A desnaturação da FTL, bem

como a sua associação à galactose, também preveniu o efeito antidepressivo-símile da lectina.

O efeito antidepressivo-símile da FTL permaneceu o mesmo após tratamento subcrônico (7

dias) e não houve alteração no peso dos animais. Corroborando com os resultados in vivo, os

estudos de docking molecular demonstraram que a FTL interage com a enzima NOS e

receptor NMDA. Nossos resultados demonstraram que a FTL possui efeito antidepressivo-

símile mediado por receptores NMDA e via L-Arginina/NO/cGMP, além de ser dependente

de sua integridade estrutural e capacidade de ligação a α-D-galactose.

Palavras-chave: Artocarpus incisa L. Frutalina. Depressão. NMDA. Via NO/cGMP.

ABSTRACT

Frutalin (FTL), an α-D-galactose-binding lectin isolated from breadfruit seeds (Artocarpus

incisa L.), has a range biological activities, but has not been conclusively shown to act on

CNS disorders. In this study we evaluated the effect of FTL on mouse behavior. Mice

(n=6/group) were treated with FTL (0.25; 0.5 or 1 mg/kg; i.p.) or vehicle (NaCl 0.9 %;10

mL/kg; i.p.) and submitted to hole-board (HBT), elevated plus maze (PMT), open field

(OFT), tail suspension (TST) and forced swimming (FST) tests. In a second set of

experiments, yohimbine (1 mg/kg), ketamine (0.1 mg/kg), L-NAME (10 mg/kg) or methylene

blue (10 mg/kg) were administered (i.p.) 30 min before FTL (0.5 mg/kg). In order to evaluate

the subchronic effect of FTL, animals were injected with FTL (0.5 mg/kg) or vehicle for 7

days and submitted to FST on the first and last day of treatment. A molecular docking was

conducted on the NOS enzyme and NMDA receptor. No changes were observed in HBT and

OFT results. The smallest dose of FTL (0.25 mg/kg) was associated with an increase in the

number of entries into closed arms in PMT (p<0.05). FTL reduced immobility in TST (0.25

and 0.5 mg/kg; p<0.05) and FST (0.25 mg/kg; p<0.05 and 0.5 mg/kg; p<0.01). In FST, the

effect of FTL was dependent on carbohydrate interaction and protein structure integrity and it

was reduced by ketamine (NMDA antagonist), L-NAME (non-selective NOS inhibitor) and

methylene blue (soluble guanylyl cyclase inhibitor). The antidepressant-like effect remained

after subchronic treatment. Matching the results of the experiment in vivo, the docking study

indicated an interaction between FTL and NOS enzyme and NMDA receptor. In conclusion,

FTL was found to have an antidepressant-like effect mediated by the NMDA

receptor/NO/cGMP pathway.

Keywords: Artocarpus incisa L. Frutalin. Depression. NMDA. NO/cGMP pathway.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Estrutura tridimensional da FTL ................................................................. 21

Figura 2 Síntese do óxido nítrico (NO) ...................................................................... 32

Figura 3 Teste de placa perfurada – “hole board” ...................................................... 36

Figura 4 Teste do labirinto em cruz elevado (LCE) ................................................... 37

Figura 5 Teste do campo aberto (TCA) ...................................................................... 38

Figura 6 Representação esquemática do teste de suspensão pela cauda (TSC) ......... 39

Figura 7 Teste de natação forçada (TNF) ................................................................... 40

Figura 8 Cromatografia de afinidade .......................................................................... 43

Figura 9 SDS-PAGE 12,5% e Espectros intactos desconvoluídos ............................. 44

Figura 10 Efeito da FTL no teste de labirinto em cruz elevado (LCE) ........................ 46

Figura 11 Efeito da FTL no teste de suspensão pela cauda (TSC) ............................... 48

Figura 12 Efeito da FTL no teste de natação forçada (TNF) ....................................... 49

Figura 13 Participação do sistema monoaminérgico .................................................... 50

Figura 14 Participação do sistema glutamatérgico ....................................................... 51

Figura 15 Participação da via L-Arginina/NO/cGMP .................................................. 52

Figura 16 Participação da integridade estrutural e domínio lectiníco .......................... 53

Figura 17 Efeito da administração repetida .................................................................. 54

Figura 18 Efeito da administração repetida da FTL no peso dos camundongos .......... 54

Figura 19 Docking Molecular A – FTL x Domínio Oxygenase da enzima NOS ......... 55

Figura 20 Docking Molecular A – FTL x Domínio Oxygenase da enzima NOS ......... 56

Figura 21 Docking Molecular B – FTL x receptores NMDA ...................................... 58

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Efeito da FTL no teste da placa perfurada ................................................... 45

Tabela 2 Efeito da FTL no teste de campo aberto ...................................................... 47

Tabela 3 Energia da região de interação entre o domínio Oxygenase da enzima

NOS e a FTL (kcal/mol) ..............................................................................

57

Tabela 4 Energia da região de interação entre a FTL e o receptor NMDA (kcal/

mol) ..............................................................................................................

58

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMET Azul de metileno

AMPA A-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolproprionato

BBL Lectina de Bauhinia bauhinioides

BDNF Fator neurotrófico derivado do cérebro

CET Cetamina

CGL Lectina de Canavalia gladiata

GMPc Monofosfato guanosina cíclico

ConA Concanavalina A

ConBr Lectina de Canavalia brasilienses

DES Desnaturada

DSM-5 Manual diagnóstico e estatístico de transtornos mentais

EPM Erro padrão da média

ERN Espécies reativas de nitrogênio

ESI – MS Espectrometria de massas com ionização por eletrospray

FTL Frutalina

G Gravidade

GABA Ácido gama aminobutírico

GCs Guanilato ciclase solúvel

GLT Galactose

GLU Glutamato

GTP Trifosfato de guanosina

HeLa Helacyton gartleri

HIV Vírus da imunodeficiência humana

i.p. Intraperitoneal

IBN Ioimbina

IgA Imunoglobulina A

IL-2 Interleucina 2

kDa Quilodalton(s)

M Molar

mA Miliampere(s)

MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina)

NEBA Número de entrada nos braços abertos

NEBF Número de entrada nos braços fechados

NFKappaB Fator nuclear kappa B

Nl Nanolitro(s)

Nm Nanometro(s)

NMDA N-metil D-Aspartato

NO Óxido nítrico

NOS Óxido nítrico sintase

P1 Pico 1 (material não retido)

P2 Pico 2 (fração retida)

PDE-5 Fosfodiesterase-5

pH Potencial hidrogeniônico

PHA Fitohemaglutinina

rhEPO Eritropoietina humana recombinante

RIPs Proteínas inativadoras de ribossomo

SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio

SNC Sistema nervoso central

TCA Teste de campo aberto

TNA Teste de natação forçada

TPBA Tempo de permanência nos braços abertos

TPBF Tempo de permanência nos braços fechados

TRP Receptor de potencial transitório

Tris – HCL Tris(hidroximetil)aminometano – ácido clorídrico

TSC Teste de suspensão pela cauda

V Volume

VGL Lectina de Vatairea guianensis

VML Lectina de Vatairea macrocarpa

Vs Versus

WHO World Health Organization

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 16

1.1 Lectinas ........................................................................................................... 16

1.2 Aplicações de lectinas vegetais ...................................................................... 18

1.3 Frutalina (FTL) .............................................................................................. 20

1.4 Lectinas e o sistema nervoso central (SNC) ................................................ 22

1.5 Considerações gerais sobre distúrbios mentais ........................................... 24

1.6 Ansiedade ....................................................................................................... 25

1.6.1 Modelos experimentais de ansiedade ............................................................. 26

1.7 Depressão ........................................................................................................ 28

1.7.1 Modelos experimentais de depressão ............................................................. 29

1.8 Neurobiologia da depressão .......................................................................... 30

2 OBJETIVOS .................................................................................................. 33

2.1 Objetivo Geral ................................................................................................ 33

2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................... 33

3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 34

3.1 Frutalina: Isolamento e Purificação ............................................................ 34

3.2 Atividade Hemaglutinante 34

3.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS e

Espectometria de Massas (LC/MS) ..............................................................

35

3.4 Animais de experimentação .......................................................................... 35

3.5 Testes de atividade ansiolítica/ansiogênica .................................................. 36

3.5.1 Teste da Placa Perfurada – “Hole-board” ..................................................... 36

3.5.2 Teste do labirinto em cruz elevado (LCE) ...................................................... 36

3.5.3 Teste do campo aberto (TCA) ......................................................................... 37

3.6 Testes de atividade antidepressiva ............................................................... 38

3.6.1 Teste da Suspensão pela Cauda (TSC) ........................................................... 38

3.6.2 Teste de natação forçada (TNF) ..................................................................... 39

3.7 Análise do mecanismo de ação da FTL através de modulação

farmacológica .................................................................................................

40

3.7.1 Participação do sistema monoaminérgico ..................................................... 40

3.7.2 Participação da via glutamatérgica ................................................................ 40

3.7.3 Participação da via L-Arginina/NO/cGMP ................................................... 41

3.8 Avaliação da participação do domínio lectínico e ação da FTL

desnaturada ....................................................................................................

41

3.9 Efeito da administração repetida ................................................................. 41

3.10 Docking Molecular ........................................................................................ 42

3.11 Análise Estatística .......................................................................................... 42

4 RESULTADOS ............................................................................................... 43

4.1 Frutalina: isolamento e purificação ............................................................. 43

4.2 Avaliação da atividade ansiolítica/ansiogênica ........................................... 44

4.3.1 Teste da Placa Perfurada – “Hole-board” ................................................... 44

4.3.2 Teste do labirinto em cruz elevado (LCE) ................................................... 45

4.3.3 Teste do campo aberto (TCA) ....................................................................... 47

4.4 Avaliação da atividade antidepressiva ......................................................... 47

4.4.1 Teste da Suspensão pela Cauda (TSC) ........................................................... 47

4.4.2 Teste de natação forçada (TNF) ..................................................................... 48

4.5 Análise dos possíveis mecanismos de ação da FTL através da

modulação farmacológica .............................................................................

49

4.5.1 Participação do sistema monoaminérgico ..................................................... 49

4.5.2 Participação da via glutamatérgica ................................................................ 50

4.5.3 Participação da via L-Arginina/NO/cGMP ................................................... 51

4.6 Envolvimento do domínio lectínico e ação da FTL desnaturada .............. 52

4.7 Efeito da administração repetida de FTL .................................................... 53

4.8 Docking Molecular ........................................................................................ 55

5 DISCUSSÃO .................................................................................................. 59

6 CONCLUSÕES .............................................................................................. 65

REFERÊNCIAS ............................................................................................ 66

16

1 INTRODUÇÃO

1.1 Lectinas

Dentre as macromoléculas biológicas, as lectinas constituem um importante grupo de

proteínas amplamente estudadas desde o século XIX (SHARON; LIS, 2004). Goldstein et al.

(1980) definiram lectinas como proteínas de origem não imunológica que se ligam de um

modo reversível a carboidratos, sendo capazes de aglutinar células ou precipitar

glicoconjugados sem qualquer tipo de atividade enzimática para os que são alvo da sua

ligação. Elas existem na forma livre ou associadas às células, podendo ser encontradas na

superfície ou no interior dessas (LIS; SHARON, 1998). As lectinas são amplamente

distribuídas na natureza, encontradas numa variedade de organismos como plantas, vírus,

bactérias, fungos, invertebrados (VIJAYAN; CHANDRA, 1999) e vertebrados (BARONDES

et al., 1988; HARRISON, 1991; LOH et al., 2015).

As investigações envolvendo lectinas iniciaram em 1854, quando Bower descobriu

uma emulsão alcoólica de sementes de Ricinus communis, apresentava toxicidade. Após esta

descoberta, iniciaram-se muitas pesquisas envolvendo estes extratos e em 1888 Hermann

Stillmark em sua Tese de Doutorado encontrou que extratos de Ricinus communis causava

aglutinação de eritrócitos. A palavra aglutinina foi então largamente usada para descrever

moléculas e extratos que causam agrupamento ou aglutinação de eritrócitos e outras células.

Dorset e Henley (1917) foram os primeiros a começar os testes com aplicações

biotecnológicas de lectinas, com ensaios envolvendo células humana e elaboração de

fármacos. Foi somente em 1954 que o termo lectina foi introduzido por Boyd e Shapleigh,

para enfatizar a habilidade exibida por algumas aglutininas de plantas em discriminar

eritrócitos do grupo sanguíneo ABO, devido às reações com os resíduos de açúcar expostos

(BIES et al., 2004; BOYD; SHARPLEIGH, 1954).

A era moderna da lectinologia teve início no começo da década de 60, com duas

grandes descobertas realizadas por Nowell (1960); ele estabeleceu que a lectina de Phaseolus

vulgaris, conhecida como fitohemaglutinina (PHA), e a lectina da Canavalia ensiformes

(ConA) são mitogênicas, pois possuem a capacidade de estimular linfócitos a entrar em

mitose, e que a atividade mitogênica da ConA podia ser inibida por pequenas concentrações

de monossacarídeos manose (SHARON; LIS, 2004).

17

O termo lectina foi redefinido com base em critérios funcionais e estruturais, como por

exemplo, ser uma glicoproteína capaz de se ligar reversivelmente a carboidratos, serem

distintas de imunoglobulinas e não causarem modificações estruturais nos carboidratos os

quais possuem especificidade. Atualmente definidas como proteínas que contêm pelo menos

um domínio não catalítico que lhes permite reconhecer seletivamente e se ligar de uma forma

reversível a glicanos específicos que podem estar presentes de forma livre ou fazem parte de

glicoproteínas e glicolípidos (VAN DAMME et al., 2011).

As lectinas são subdivididas em quatro classes (PEUMANS; VAN DAMME, 1998):

• As merolectinas: proteínas que possuem pelo menos um domínio de ligação a

carboidratos e por isso são incapazes de aglutinar células por serem monovalentes.

• As hololectinas: proteínas formadas por dois ou mais domínios de ligação a

carboidratos, que são idênticos ou homólogos; elas compreendem a maioria das

lectinas de plantas.

• As quimerolectinas: proteínas de fusão que possuem pelo menos um domínio de

ligação a carboidrato e um domínio não relacionado, com uma atividade catalítica bem

definida ou outras atividades biológicas (que age independentemente do domínio de

ligação a carboidratos).

• As superlectinas: proteínas que possuem ao menos dois domínios ligantes de

carboidratos que apresentam diferentes especificidades.

Monteiro-Moreira, em 2002, propôs um novo grupo, chamado de multilectinas que

seriam proteínas constituídas de domínios ligantes a carboidratos que são idênticos ou

homólogos, entretanto reconhecem açúcares estruturalmente não relacionados, ou seja, são

lectinas de especificidade múltipla.

De acordo com Vam Damme et al. (1998) também é possível estabelecer uma

classificação em sete famílias: lectinas de leguminosas, lectinas de monocotiledôneas ligantes

a manose, lectinas com domínio heveinico, proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) tipo

2, lectinas relacionadas à jacalina; amarantina e lectinas de floema de Curcubitaceae.

A maioria das lectinas de plantas está presente em cotilédones de sementes, onde

podem ser encontradas no citoplasma ou em corpos proteicos, embora elas também tenham

sido encontradas em raízes, caules, folhas (MOREIRA et al., 1991) e outros tecidos. Já foi

demonstrado que lectinas encontradas nas folhas têm propriedades similares àquelas obtidas

de sementes da mesma planta (SPILATRO et al., 1996); portanto, lectinas encontradas em

tecidos vegetais distintos podem apresentar propriedades similares.

18

A habilidade das lectinas em formar interações com carboidratos ou glicoproteínas

pode ser facilmente detectada por ensaios de aglutinação, em que essas proteínas podem

interagir através de ligações reversíveis com resíduos de carboidratos na superfície das

células, formando uma malha. O ensaio de hemaglutinação é utilizado frequentemente por

possibilitar a fácil visualização desta propriedade aglutinante de eritrócitos por lectinas;

eritrócitos utilizados no ensaio podem ser de origem humana ou de outros animais

(FLEMMING et al., 1992), frescos, ou tratados enzimaticamente ou quimicamente.

Apesar de lectinas apresentarem comumente uma alta eficiência e estabilidade,

existem alguns fatores que influenciam a atividade dessas proteínas, tais como íons, pH e

temperatura. Por exemplo, muitas lectinas necessitam de íons para manter a sua atividade

(SHARON; LIS, 1990). A estabilidade térmica das lectinas também pode ser bastante

variável; lectinas de diversas fontes mostram-se estáveis após serem mantidas congeladas por

meses ou anos, após sucessivos congelamentos e descongelamentos (CORREIA; COELHO,

1995) ou depois de mantidas por poucos dias em temperatura ambiente (RAY et al., 1992).

Apesar da grande quantidade de informação sobre sequência de aminoácidos e

especificidade de lectinas, a função fisiológica das lectinas de plantas tem sido amplamente

estudada e nem sempre definida (SHARON; LIS, 2004). Lectinas encontradas em raízes de

leguminosas podem estar envolvidas no reconhecimento e/ou ligação de bactérias fixadoras

de nitrogênio, como Rizhobium spp., desempenhando papel no estabelecimento da simbiose

(DÍAZ et al., 1989; KIJNE et al., 1992; VAN EIJSDEN et al.,1995). Várias evidências

indicam que as lectinas desempenham um papel de defesa nas plantas, protegendo estas de

microrganismos fitopatogênicos (como bactérias e fungos), de animais predadores e de

insetos (PEUMANS; VAN DAMME, 1995; SHARON; GOLDSTEIN, 1998).

1.2 Aplicações de lectinas vegetais

As lectinas vegetais, por suas características e principalmente pela possibilidade de

ligação reversível a glicoconjugados, fácil isolamento e manuseio, destacam-se como

importantes ferramentas em pesquisas de diversas áreas como Bioquímica, Farmacologia,

Biologia Celular, Biologia Molecular e Biotecnologia. Diversos autores contribuíram com

inúmeros trabalhos de aplicações de lectinas vegetais. Dentre as aplicações temos o uso de

lectinas em cromatografias de afinidade para isolamento e purificação de glicoconjugados,

receptores de hormônios, imunoglobulinas, fatores de crescimento, neurotransmissores e

outros compostos (HOWELLS et al., 1982).

19

Estas moléculas desempenham vários efeitos sobre as células, dentre eles a

aglutinação, o que possibilitou seu emprego na tipagem sanguínea; estimulação mitogênica

sobre células mononucleadas sanguíneas; e a caracterização da estrutura de glicoconjugados

presentes em células animais (LIS; SHARON, 1986a; MOREIRA et al., 1991; VIKRAM et

al., 2010).

Lectinas obtidas de diferentes plantas tem apresentado potencial atividade

antimicrobiana, como atividade antibacteriana contra bactérias Gram positivas e Gram

negativas (COSTA et al., 2010; GOMES et al., 2013; CARVALHO et al., 2015) e atividade

antifúngica contra várias espécies de fungos (VAZ et al., 2010; CHARUNGCHITRAK et al.,

2011; SOUZA et al., 2011). As lectinas, principalmente com especificidade de ligação a

manose, apresentaram atividade antiviral com alta eficácia contra o vírus HIV e a via de ação

pode estar envolvida com a inibição da atividade da transcriptase reversa (AN et al, 2006; LI

et al., 2008; PENG et al., 2009).

Além de seus efeitos contra microrganismos, as lectinas vegetais também têm

habilidade de atuar como moléculas inseticidas contra várias espécies de insetos

(VANDENBORRE et al., 2011; ARAÚJO et al., 2012; ATALAH et al., 2014), além disso,

seus genes são objetos de estudo na Engenharia Genética para serem utilizados na produção

de plantas transgênicas resistentes a pragas (MCCAFFERTY et al., 2008; AFOLABI-

BALOGUN et al., 2012).

Estudos que visam a busca por novos métodos de diagnóstico e terapia do câncer têm

crescido muito nos últimos anos, e as lectinas vegetais mostram-se promissoras nesta área.

Elas estão sendo utilizadas como marcadores tumorais podendo identificar e distinguir células

normais e neoplásicas através da interação com glicocoproteínas intracelulares ou presentes

na membrana celular. Como por exemplo, lectinas que foram capazes de reconhecer

leucemias, câncer de próstata, câncer de mama e câncer nas glândulas parótidas (BELTRÃO

et al., 1998; FERREIRA, 2010; SOBRAL et al., 2010; BEZERRA, 2014). Não apenas como

marcadores tumorais, as lectinas também têm apresentado atividades antitumorais e

anticarcinogênicas em diversas linhagens tumorais, como em células de leucemias,

osteosarcoma, adenocarcinoma, carcinoma de mama, dentre outras (FAHEINA-MARTINS et

al., 2012; OUYANG et al., 2014; QUIROGA et al., 2015; WU et al., 2016).

A ação pró-inflamatoria e antiinflamatoria de lectinas vegetais também têm sido

observada. Dependendo da via de administração utilizada, as lectinas podem ter efeitos

diferentes (RODRIGUES, 2012). Lectinas administradas localmente promovem respostas

proinflamatorias, como indução da migração de neutrófilos e ação endomatogênica, e ao

20

serem administradas por via endovenosa promovem ação antiinflamatoria, como inibição da

migração de neutrófilos e edemas (ALENCAR et al., 2010; RANGEL., 2011a; 2011b).

Diversas lectinas com diferentes tipos de afinidade de ligação, como ligantes de glicose,

manose e sacarose, tem demonstrado atividade antinociceptiva (PIRES et al., 2013; SILVA et

al., 2013; NASCIMENTO et al., 2015), atividade cicatrizante em diferentes lesões, como em

feridas de mucosa oral e feridas cutâneas (MELO et al., 2011; KIM et al., 2013; SILVA,

2014) e atividade gastroprotetora em modelos de lesões gástricas induzidas por etanol

(ABDON et al., 2012).

Lectinas vegetais tem demonstrado efeitos no sistema nervoso central, no qual elas

podem mediar funções neurais e produzir neuroproteção. Algumas lectinas apresentaram

efeitos estimulantes do tipo antidepressivo e inibição de convulsões induzidas (BARAUNA et

al., 2006; RUSSI et al., 2012). Outras lectinas apresentaram efeitos contrários, como indução

de atividade depressora e neuroinflamação (GONGALVES et al., 2013).

1.3 Frutalina (FTL)

A Frutalina (FTL) é obtida das sementes de Artocarpus incisa L. (sinonímia

Artocarpus altilis), popularmente conhecida como fruta-pão, pertencente à família Moraceae,

classe Magnoliadae que possui aproximadamente 75 géneros e 1550 espécies (BRAGA,

1976). A espécie A. incisa é uma árvore de porte médio e pode atingir até 20 metros de altura,

suas folhas são grandes (30 a 90 cm de comprimento por 30 a 45 cm de largura), o caule de

casca lisa e raízes profundas. Em relação aos frutos, há duas variedades: a variedade apyrena

que não possui sementes (variedade não seminífera) e é conhecida como “fruta-pão de massa”

e a variedade com sementes, conhecidas como “fruta-pão de caroço”, que possui fruto que

pode pesar até 6 kg (RAGONE, 1997; SIKASWAR et al., 2014).

A FTL foi isolada em 1998 por Moreira e colaboradores por meio de cromatografia de

afinidade em coluna de galactomanana reticulada de Adenanthera pavonina. É uma

glicoproteína α-D-galactose ligante (podendo reconhecer epímeros de α-D-Manose), contendo

2,1% de carboidratos em sua estrutura. Apresenta elevados teores de aminoácidos ácidos,

hidroxilados e hidrofóbicos e baixo teor de aminoácidos sulfurados e tem a capacidade de

aglutinar hemácias de vários animais, aglutinando fortemente as hemácias humanas, porém

não apresenta qualquer especificidade por antígenos do sistema ABO (MOREIRA et al.,

1998). A FTL apresenta duas bandas proteicas com massas moleculares aparentes de 12 e 15

kDa observadas em eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes

21

(PAGE-SDS), na presença e ausência de β-mercaptoetanol, evidenciando que não apresenta

pontes dissulfeto (MONTEIRO-MOREIRA, 2002).

A Frutalina é caracterizada como um tetrâmero contendo 153 aminoácidos por

monômero (MOREIRA, 1998). Sua estrutura foi obtida por Nepomuceno (2008) através de

modelagem por homologia, utilizando a jacalina, como proteína molde. Vieira-Neto (2015)

demonstrou a estrutura tridimensional através de cristalização e análises dos dados obtidos

por difração de raios-x (Figura 1), mostrando que a FTL apresenta, em cada unidade

monomérica, um β prisma simétrico, com três grupos de 4 folhas beta, cada. O sítio de

reconhecimento a carboidratos, é semelhante ao da Jacalina, e envolve o N-terminal da cadeia

α, demonstrando, na região, um enovelamento característico da família Moraceae. O sítio de

ligação da FTL consiste em uma cavidade próxima ao N-terminal da cadeia α, formada por

quatro resíduos-chave: Gly25, Tyr146, Trp147 e Asp149.

Figura 1. Fonte: Estrutura tridimensional da FTL

Fonte: Vieira-Neto (2015).

Muitos trabalhos têm sido realizados com a FTL e ela tem demonstrado muitas

atividades biológicas em diversas áreas. A FTL foi incluída na triagem para purificação do

hormônio eritropoietina humana recombinante (rhEPO) (AMADEO et al., 2003) e já foi

usada como modelo em estudos de processos de desenovelamento e renovelamento de

proteínas oligoméricas (CAMPANA, 2002).

Tem sido utilizada em estudos envolvendo a resposta imune inata, na qual a FTL

através de ligação a resíduos de galactose na superfície celular, estimula a proliferação de

22

linfócitos e produção de IL-2 pela ativação da via AKt-PI3 e modulação pelo fator NFKappaB

(PEREIRA et al., 2014). Brando - Lima e colaboradores (2005) demonstraram que a FTL é

capaz de induzir migração de neutrófilos humanos in vivo e in vitro através da interação

açúcar-proteína entre a lectina solúvel e a galactose presente na superfície do neutrófilo.

A FTL apresentou efeitos citotóxicos, como indução de apoptose e inibição da

proliferação celular, sobre as células HeLa, linhagem de câncer cervical (OLIVEIRA et al.,

2011). Também demonstrou ser altamente eficaz como marcador tumoral para

reconhecimento de neoplasias de mama (FERREIRA, 2001), tireóide (MILHOME, 2003) e

leucemia linfoblástica aguda (CAVALCANTE et al., 2016) se ligando seletivamente a

resíduos de α-D-galactose. Também é um potente ativador mitogênico de linfócitos humanos

e é capaz de se ligar a IgA (BRANDO-LIMA et al., 2005).

A FTL também apresentou atividade gastroprotetora em modelo experimental de lesão

gástrica aguda induzida por etanol, mostrando ser promissora para o desenvolvimento de

agente fitoterápico no combate a patologias gástricas (ABDON et al., 2012). Apresentou

efeito antinociceptivo observado na dor orofacial aguda e neuropática, podendo ser mediada

por receptores TRPA1, TRPV1 e TRPM8 (DAMASCENO et al., 2016). Ela também foi

capaz de reverter de forma significativa a excitotoxicidade glutamatérgica in vitro, sugerindo

um potencial neuroprotetor para essa lectina (JACQUES, 2012).

1.4 Lectinas e o sistema nervoso central (SNC)

Como já foi observado, as lectinas vegetais são utilizadas em várias pesquisas de

diversas áreas. A utilização destas proteínas na área de neurobiologia tem crescido muito nos

últimos anos e merece mais atenção, tendo em vista que existem poucas pesquisas nesta

temática quando comparamos a outras áreas como utilização de lectinas como agentes

antitumorais e antimicrobianos. A importância de novas pesquisas nesta área se dá ao fato de

que lectinas vegetais tem demonstrado capacidade potencial de modular alvos moleculares

que dentro do sistema nervoso central (SNC) poderiam estar envolvidos na resposta a

determinadas drogas de ação central, na regulação comportamental e na neuroplasticidade

(CAVADA et al., 2001; RUSSI et al., 2012).

A lectina Concanavalina A (ConA), extraída das sementes de Canavalia ensiformes

(Família Fabaceae) possui especificidade de ligação a glucose/manose, foi utilizada em

pesquisas que envolvem o isolamento de glicoproteínas sinápticas e estudo de indução de

mudanças conformacionais em receptores glutamatérgicos (FAY; BOWIE, 2006); também

como ferramenta em estudos da função neural e neuroplasticidade, apresentando melhoria no

23

crescimento de neurites, alterações na especificidade, força e bloqueio de conexões sinápticas

e modulação das respostas e mecanismos de liberação de neurotransmissores (LIN;

LEVITAN, 1991; SCHERER; UDIN, 1994; BOEHM; HUCK, 1998).

A ConBr, lectina extraída das sementes da Canavalia brasilienses (MOREIRA;

CAVADA, 1984), a qual apresenta 99% de similaridade na sequência de aminoácidos da

ConA e a mesma especificidade de ligação por glucose/manose (APARICIO et al., 1997),

apresentou efeito antidepressivo-símile em camundongos no modelo do teste de nado forçado

e foi dependente da ativação dos sistemas serotoninérgicos (via 5HT1 e 5HT2), adrenérgico

(via α1adrenérgico) e dopaminérgico (via receptor tipo D2) (BARAUNA et al., 2006).

Estudos mais recentes mostraram que esta ação tipo antidepressiva provocado pela

administração central de ConBr, pode ocorrer por meio do sistema glutamatérgico (através de

receptores NMDA) (RIEGER et al., 2014). ConBr também apresentou efeito neuroprotetor no

modelo de convulsões induzidas por ácido quinolínico, a qual foi capaz de inibir a severidade

das convulsões (RUSSI et al., 2012).

Jacques (2012) realizou um “screening” da atividade neuroprotetora de lectinas em

modelos de fatias hipocampais de camundongos tratadas in vitro com glutamato, através do

teste de viabilidade MTT. Foram utilizadas as lectinas ConBr e CGL (obtidas de sementes de

Canavalia gladiata) que possuem afinidade de ligação por glucose/manose, e as lectinas FTL

(obtidas de sementes de Artocarpus incisa), BBL (obtidas de Bauhinia bauhinioides) e VGL

(obtidas de sementes de Vatairea guianensis) que possuem afinidade de ligação por galactose.

ConBr, FTL e BBL foram capazes de reverter de forma significativa a excitotoxicidade

glutamatérgica in vitro, sugerindo um potencial neuroprotetor para essas lectinas frente à

neurotoxicidade do glutamato.

As galectinas, são uma família de lectinas endógenas presentes no organismo de

animais, possuem especificidade de ligação por β-galactosídeos, estão distribuídas dentro e

fora das células e estão envolvidas na regulação de vários processos celulares (BARONDES

et al., 1994; ELOLA; FINK, 2000). A galectina-1, uma das galectinas mais estudadas, é

amplamente expressa no SNC e tem se destacado como molécula moduladora de funções

neurais, ações neuroprotetoras e neuroplasticidade (CAMBY et al., 2006; QU et al., 2011;

STAROSSOM et al., 2012; GAUDET et al., 2015). VML, uma lectina isolada das sementes

de Vatairea macrocarpa, assim como a galectina-1 possui afinidade por galactose, foi capaz

de induzir um comportamento do tipo depressivo e aumentar a expressão de proteínas

relacionadas à inflamação e reatividade glial, apresentando efeitos potencialmente tóxicos

sobre o hipocampo de camundongos, aparentemente envolvendo respostas neuroinflamatórias

24

(GONÇALVES et al., 2013). Comparando às ações neuroprotetoras descritas para a lectina

endógena galectina-1 e a ação neuroinflamatória da lectina vegetal VML, é possível sugerir

um papel duplo de lectinas com afinidade por galactose na função neural (GONÇALVES et

al., 2013).

As lectinas com afinidade por galactose tem se destacado como importantes moléculas

moduladoras da função neural (IMAIZUNI et al., 2011; STAROSSOM et al, 2012). A lectina

endógena galectina-1, possui afinidade por galactose e tem sido muito estudada pelos seus

efeitos no SNC (KAJITANI et al., 2009; QU et al., 2010; QU et al., 2011). A administração

de galectina-1 após isquemia focal cerebral conduziu a uma serie de respostas neuroprotetoras

como: recuperação motora dos animais, produção de BDNF, diminuição da perda neuronal,

estimulo da neurogênese e inibição da astrogliose (ISHIBASHI et al., 2007; QU et al., 2010;

QU et al., 2011).

Diante de todos os achados, a FTL, por apresentar inúmeras atividades biológicas

como reconhecimento de neoplasias, ativação mitogênica, modulação de alvos moleculares e

ação gastroprotetora, pode auxiliar na compreensão do papel da interação de lectinas com

afinidade por galactose no SNC e apresentar efeitos neuroprotetores.

1.5 Considerações gerais sobre distúrbios mentais

Segundo o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais - DSM-5

publicado em 2014, um transtorno mental é uma síndrome caracterizada por perturbação

clinicamente significativa na cognição, na regulação emocional ou no comportamento de um

indivíduo que reflete uma disfunção nos processos psicológicos, biológicos ou de

desenvolvimento subjacentes ao funcionamento mental. (DSM-5, 2014).

Os transtornos mentais são doenças crônicas muito prevalentes no mundo e

contribuem para morbidade, incapacitação e mortalidade precoces. De acordo com a

Organização Mundial da Saúde (WHO, 2013), os transtornos mentais atingem

aproximadamente 700 milhões de pessoas no mundo, representando 13% do total de todas as

doenças. Em 2012, um trabalho mostrou que, na região metropolitana de São Paulo, 29,6% da

população apresenta transtorno mental, com grau moderado ou grave em dois terços dos casos

(ANDRADE et al., 2012).

No Brasil, em 2011, os gastos com saúde mental representaram 2,38% dos gastos com

saúde, sendo apenas 0,32% dos gastos totais destinados a hospitais psiquiátricos. O

investimento em hospitais psiquiátricos é baixo quando comparado a outros países, indicando

25

um investimento maior em terapia medicamentosa e criação de rede substitutiva aos hospitais.

Sendo assim, o Brasil segue a tendência mundial de aumentar seus gastos com medicamentos

para desordens psiquiátricas e vale ressaltar que sua política de saúde mental é relativamente

recente, portanto, o investimento nos próximos anos deve ser ainda maior (WHO, 2014).

Diante disto, tem crescido a busca por moléculas fitoterápicas que agem sobre o

Sistema Nervoso Central (SNC) que podem alterar as funções cerebrais e assim produzir

transitórias mudanças de humor, comportamento e percepção (PIMENTA, 2014). Há mais de

50 anos vêm sendo utilizados modelos de estudos em grupos de animais com resultados

convincentes, estes modelos são largamente utilizados no mundo inteiro e são particularmente

úteis na descoberta de fármacos para o tratamento de diversos tipos de distúrbios mentais

como ansiedade e depressão (BUCCAFUSCO, 2009; PIMENTA, 2014).

1.6 Ansiedade

A palavra ansiedade é usada para descrever um estado emocional transitório que varia

de intensidade e no tempo e que se caracteriza por um sentimento de tensão ou apreensão e

por um aumento na atividade do sistema nervoso, ao qual se associa à ocorrência de tremores,

falta de ar, aumento dos batimentos cardíacos, sudorese, alterações gastrointestinais, tonturas,

desmaios e outros sintomas (SPIELBERGER, 1972). Tem sido uma das causas mais comuns

que levam os pacientes a procurarem auxílio médico ou psiquiátrico (ANDRADE;

GORENSTEIN, 1998).

Os transtornos de ansiedade são caracterizados por ansiedade excessiva, medo

persistente e excessivo ou irracional. As pessoas que sofrem com transtornos de ansiedade

sentem-se, frequentemente, irritadas e depressivas, pois não tem capacidade de lidar com as

alterações fisiológicas que ocorrem com o organismo (GAZZANIGA; HEATHERTON,

2005). Os transtornos de ansiedade mais comuns são: de pânico, fobia o transtorno específica,

fobia social, transtorno obsessivo-compulsivo e a desordem de estresse pós-traumático. Essas

desordens diferem uma da outra pela natureza do estímulo, provocando a ansiedade (CRYAN;

HOLMES, 2005).

A ansiedade pode alterar o metabolismo geral do corpo e causar diversas outras

doenças, como taquicardia, na qual respiração se torna mais curta e ofegante em consequência

do bater acelerado do coração, que exige maior oxigenação na circulação, o que pode causar

falta de ar, engasgamento e dores no peito. Com pouco sangue na cabeça, a ansiedade pode

causar tonturas, visão borrada, dores de cabeça, confusão, fuga da realidade e sensações de

26

frio e calor (BARLOW, 1999; ROMAN; SAVOIA, 2003). A ansiedade também pode causar

alterações na atividade do sistema digestivo (causando náuseas, sensação de peso no

estômago, constipação ou diarréia) e sintomas de tensão, que podem acarretar dores. A

ansiedade também envolve a mudança na atenção do indivíduo que podem acarretar ao

indivíduo dificuldade de concentração e problemas de memória (BARLOW, 1999; ROMAN;

SAVOIA, 2003).

O uso de substâncias com o objetivo de obter sedação e alívio para as tensões

cotidianas acompanha o homem desde a Antiguidade. Há relatos sobre o uso de substâncias

capazes de produzir estupor e certo grau de inconsciência, estado em que rituais religiosos,

"mágicos" e procedimentos médicos transcorriam, em escritos de todas as antigas culturas

(HARVEY, 1985). No final do século XIX, o etanol, o paraldeído, o hidrato de cloral e os sais

de brometo já eram utilizados como depressores do sistema nervoso central (SNC) e

introduzidos especificamente como "ansiolíticos" (HOLLISTER, 1983; LOUDON, 1988). Em

1963 foi lançado no mercado um dos fármacos ansiolíticos mais utilizados, o diazepam, que

surgiu como uma alternativa ao clordiazepóxido (SILVA, 1999).

Hoje são inúmeros os fármacos usados com este fim. Do ponto de vista farmacológico

estes fármacos apresentam ação tranquilizante, mio-relaxante, anticonvulsivante,

potencialização do álcool e outros medicamentos, e do ponto de vista químico podem dividir-

se em carbamatos, piperazinas e benzodiazepinas (NEMEROFF, 2003). Entretanto, estes

fármacos apresentam alguns inconvenientes, o que justifica a busca por novas substâncias

ansiolíticas. Como exemplo temos os benzodiazepínicos que provocam sedação, amnésia,

podem causar dependência, síndrome de abstinência e interações com outros depressores do

SNC, por isso, muitos estudos estão sendo conduzidos para encontrar alternativas medicinais

que apresentem efeitos ansiolíticos mais específicos, como por exemplo, o uso de

fitofármacos (FAUSTINO et al. 2010; SOUSA et al. 2008).

1.6.1 Modelos experimentais de ansiedade

Os modelos animais de ansiedade procuram reproduzir uma situação ambiental de

provável ocorrência de diferentes formas de aversão ou desconforto. Geralmente isso é feito

expondo-se animais a ambientes novos ou potencialmente perigosos, estímulos ou contextos

associados a estímulos nociceptivos moderados, dentre outros (CRUZ et al., 1997). Os

padrões comportamentais e as reações fisiológicas ativadas pelo contato com essas fontes

indicadoras de perigo em potencial são utilizados como medidas de ansiedade e geralmente

27

apresentam grande correspondência com as medidas de ansiedade em humanos. (TREIT,

1985).

O desenvolvimento de modelos animais recebeu impulso importante pelo advento de

novas drogas ansiolíticas e pela compreensão da neurobiologia da ansiedade (LACERDA,

2006). Dentre os modelos mais utilizados nessa abordagem temos o teste de campo aberto,

oteste de labirinto em cruz elevado e o teste de placa perfurada.

O teste do labirinto em cruz elevado é um dos modelos mais utilizados na pesquisa da

ansiedade. Foi desenvolvido por Handley e Mithani em 1984, para ratos e validado por Lister

(1987) para camundongos. O aparelho possui 70 cm de comprimento e apresenta dois braços

fechados, de face um para o outro, e dois braços abertos, também perpendiculares, cada qual

medindo 45 x 10 cm. Os braços fechados também apresentavam paredes laterais com 10 cm

de altura. Os autores constataram que drogas ansiolíticas aumentavam a proporção entre

entradas e tempo de permanência nos braços abertos, ao passo que drogas ansiogênicas

diminuíam esta proporção (HANDLEY; MITHANI, 1984).

Outro teste muito utilizado é o teste da Placa Perfurada ou holeboard que foi

desenvolvido por Boissier e Simon em 1962 e atualizado por Takeda, Tsuji e Matsumiya em

2006. O aparelho consistiu de uma arena quadrada medindo 25 x 25 cm, construído em

acrílico, e no piso da arena tinham 4 orifícios de 3 cm de diâmetro, equidistantes. Este teste

tem como base a exposição do camundongo a luta entre a tendência exploratória de um novo

ambiente e a tendência à esquiva gerada pelo medo dos perigos potenciais que um novo

ambiente carrega. Os parâmetros que podem ser observados neste aparelho são a frequência

de mergulhos de cabeça nos orifícios ou head dipping, freqüência de levantamentos

(rearings), tempo de autolimpeza (grooming) e defecação. A premissa do teste é analisar a

diminuição ou aumento da frequência de mergulhos de cabeça dos camundongos nos orifícios

da placa, o que caracteriza drogas ansiogênicas e ansiolíticas, respectivamente (TAKEDA;

TSUJI; MATSUMYIA, 2006).

O teste de campo aberto (TCA) também é utilizado como uma ferramenta nas

pesquisas envolvendo testes comportamentais para ansiedade (Hall, 1934). O comportamento

do animal é determinado pelo conflito entre a motivação para explorar e a aversão a lugares

abertos, desprotegidos e iluminados, logo drogas de perfil ansiolítico ou ansiogênico tendem a

aumentar ou diminuir a ambulação no campo aberto, respectivamente. (WHIMBEY;

DENENBERG, 1967; CRUSIO et al., 1989; SCHMITT; HIEMKE, 1998).

O aparelho consiste de uma arena com aproximadamente 1,2 m de diâmetro,

circundada por uma parede circular de 0,45 m de altura. No teste é observado

28

comportamentos como locomoção (número de cruzamentos no chão da arena pelo animal),

freqüência de levantamentos (rearings), tempo de autolimpeza (grooming), defecação, tempo

gasto para deixar a área central (PRUT; BELZUNG, 2003, CAROLA et al., 2002). O

comportamento de diminuição de cruzamentos associado a diminuição no número de

levantamentos é considerado um efeito sedativo, enquanto que um aumento no número de

levantamentos e cruzamentos é considerado um efeito estimulante (PRUT; BELZUNG,

2003). O comportamento de auto-limpeza se reflete em um movimento de lambidas em

direção céfalo-caudal visando a limpeza da cabeça, patas, cauda e genitálias (VANERP et al.,

1994; KRUK et al., 1998; KALUEFF; TUOHIMAA, 2004).

1.7 Depressão

Segundo a Organização Mundial da Saúde, a depressão é um transtorno mental

caracterizada pela presença de humor deprimido ou perda do interesse e prazer pela maior

parte das atividades. Estima-se que hoje, no mundo, 350 milhões de pessoas vivam com

depressão e que se persistirem as tendências atuais, a carga da depressão subirá a 5,7 % da

carga total de doenças, passando a ser a segunda maior questão de saúde pública (WHO,

2001, 2010). Os principais sintomas são caracterizados por alterações no apetite ou peso, no

sono, e na atividade psicomotora; assim como também por sentimentos de culpa, falta de

concentração, pensamentos recorrentes sobre morte, ideação suicida, planos e/ou tentativas de

suicídio (DSM-IV-TR, AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 2002).

A depressão está associada a mudanças hormonais e fisiológicas no organismo que

podem estar envolvidas em determinadas doenças crônicas (BOING et al., 2012). Já foi

descrito relação de episódios depressivos com aumento nos níveis de cortisol, impacto no

sistema nervoso autônomo e em fatores metabólicos e diminuição na variabilidade da

frequência cardíaca (BROWN et al, 2004; CARNEY et al., 2005; KATON, 2011). Pacientes

com depressão também podem ter muitas complicações em doenças como diabetes,

hipertensão, retinopatia, neuropatia, nefropatia, dentre outras (DE GROOT et al., 2001;

GANGWISCH et al., 2010).

Existem muitos medicamentos antidepressivos no mercado, mas muitas vezes não

possuem uma boa eficácia e mesmo quando são eficazes, possuem algumas limitações para a

escolha de um tratamento, pois é muito comum efeitos adversos a estes medicamentos, que

muitas vezes são bastante severos (ERNEST, 2009; PAPAKOSTAS, 2010).

29

Muitas vias neurais estão envolvidas na fisiopatologia da depressão, logo existem

várias classes de medicamentos antidepressivos. Dentre os mais utilizados para esta desordem

são os Antidepressivos Tricíclicos que atuam no bloqueio de recaptura de monoaminas,

principalmente norepinefrina e serotonina, tendo como exemplo a imipramina, doxepina,

protriptilina e amitriptilina; os antidepressivos os Inibidores da Monoaminoxidase, que é a

enzima envolvida no metabolismo de serotonina, noradrenalina e dopamina, e são

representados pela fenelzina, isocarboxazida e a tranilcipromina; e os Inibidores Seletivos da

Recaptação de Serotonina que incluem a fluoxetina, paroxetina, sertralina, fluvoxamina e o

citalopram (MORENO et al., 1999; NUTT, 2008; KATZUNG, 2010).

No geral, os medicamentos antidepressivos atuam produzindo aumento na

concentração de neurotransmissores na fenda sináptica através da inibição do metabolismo,

bloqueio de recaptura neuronal ou atuação em autoreceptores pré-sinápticos, porém estes

medicamentos requerem de 2 - 4 semanas (ou mais) para a produção de uma melhoria

clinicamente significativa na sintomatologia depressiva. Este início tardio pode ter

consequências terríveis para os pacientes com ideação suicida (15% dos indivíduos

deprimidos cometem suicídio) (ROSENZWEIG-LIPSON et al., 2007; SKOLNICK et al.,

2009).

1.7.1 Modelos experimentais de depressão

Em modelos animais não há condição conhecida que corresponda à exata condição

inata da depressão em seres humanos, no entanto, tais modelos são um excelente método na

identificação de novos antidepressivos, de seu mecanismo de ação e no estudo da

neurobiologia da depressão (VIEIRA, 2001). Vários procedimentos foram descritos, que

produzem em animais estados comportamentais (retirada da interação social, perda de apetite,

atividade motora reduzida, estresse, situações inexplicáveis, entre outros), análogos à

depressão humana (PORSOLT et al., 1977).

Não existem muitos modelos experimentais para testes de depressão, tendo em vista

que as causas e sintomas desta doença são de difícil reprodução em animais. Os modelos teste

do nado forçado (TNF) e o teste de suspensão da cauda (TSC) são modelos com validade

preditiva e os mais utilizados para o desenvolvimento de fármacos antidepressivos

(NESTLER et al., 2002). Estes modelos se baseiam na observação de que, quando os animais

são submetidos a um estresse inescapável, após um período de agitação inicial eles adotam

30

uma postura imóvel, e os fármacos antidepressivos podem reduzir esse tempo de imobilidade

(PORSOLT et al., 1977; PETIT-DEMOULIERE et al, 2005).

O teste de nado forçado (TNF) foi descrito primeiramente por Porsolt et al. (1977), é o

modelo mais utilizado na avaliação de agentes com potencial efeito antidepressivo. Neste

modelo, os camundongos são postos em um recipiente cilíndrico com uma quantidade de água

que impede o apoio das patas no fundo do cilindro e de fuga pela borda superior, promovendo

uma situação supostamente aversiva. No início do teste, o animal desempenhará movimentos

de fuga desta situação e em poucos minutos o adotará a postura imóvel (ausência total de

movimentos ou com movimentos muito leves suficientes para deixar a cabeça do animal

emersa). Uma explicação para este comportamento é que no período inicial de tentativas para

sair da situação, o animal está “lutando” pela sobrevivência, com o passar do tempo o animal

“percebe” que não há possibilidade de conseguir fugir do cilindro e acaba parando os

movimentos e “desistindo” de tentar escapar e assim, de sobreviver à situação.

O teste de suspensão da cauda (TSC) é um modelo clássico para avaliação de fármacos

antidepressivos e foi desenvolvido por Stéru (1985). Este modelo tem o mesmo objetivo do

(TNF), que é expor o animal a uma situação inescapável, no qual há nos primeiros minutos a

agitação que seria a tentativa de fuga, e depois imobilidade. Neste modelo, os animais são

suspensos pela cauda e impedidos de tocar o chão e fugir, o que promove um conflito entre o

estresse físico por causa das tentativas de fuga sem sucesso e a motivação para continuar

tentando. No início do teste os animais desempenharão movimentos para tentativa de fuga, o

estresse físico ultrapassa a motivação para a fuga, e eles adquirem uma postura imóvel, o que

seria a desistência de “lutar” para fugir. De maneira semelhante ao (TNF), os agentes que

possuem efeito antidepressivo são capazes de reduzir o tempo de imobilidade dos animais

submetidos ao TSC.

1.8 Neurobiologia da depressão

A depressão está relacionada com a alteração de vários sistemas de neurotransmissão

(WONG; LICINIO, 2001). Uma das principais teorias bioquímicas da depressão é a hipótese

das monoaminas, proposta por Schildkraut em 1965, na qual afirmava que a depressão pode

ser causada por déficit funcional de neurotransmissores de monoaminas, norepinefrina e 5-

hidroxitriptamina (5-HT). A maioria dos fármacos disponíveis para o tratamento age na

modulação destes sistemas monoaminérgicos, cuja terapia é baseada no aumento das

monoaminas e é utilizada há mais de 50 anos (HASHIMOTO, 2011).

31

Considerando a necessidade de novos fármacos antidepressivos que tenham um início

de ação mais rápido e maior eficácia, tem existido um grande interesse por estudos com

outros sistemas de neurotransmissores na patogênese da depressão, tais como o sistema

glutamatérgico e a via L-arginina-NO (DA SILVA et al., 2000; HARKIN et al., 2003;

SKOLNICK, 2009; DUMAN; LI., 2012; RIEGER et al., 2014).

O glutamato (GLU) é o principal e mais abundante neurotransmissor excitatório do

sistema nervoso central (SNC) dos mamíferos, sendo essencial em mecanismos subjacentes à

plasticidade sináptica que estão envolvidos em processos comportamentais

(COLLINGRIDGE; LESTER, 1989; PRYBYLOWSKI; WENTHOLD, 2004). Nos últimos

anos, tem sido realizado estudos que demostram o envolvimento do glutamato no

desenvolvimento neural, na plasticidade sináptica, no aprendizado, na memória, na dor

neuopática, na ansiedade, na depressão, dentre outros (MELDRUM, 2000; OTTERSEN;

STORM-MATHISEN, 2000).

O GLU pode ser encontrado em vesículas sinápticas para ser liberado de maneira

dependente de Ca++ ou como precursor do ácido gama aminobutírico (GABA) em sinapses

inibitórias (KATZUNG, 2010). Seus receptores são classificados como ionotrópicos (iGLU;

ligados a um canal iônico) e metabotrópicos (mGLU; ligados a mecanismos intracelulares de

transdução de sinal, via proteína G). Os iGLU foram subsequentemente classificados de

acordo com o agonista mais seletivo e subdivididos em: NMDA (n-metil-d-aspartato), AMPA

(a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolproprionato) e cainato (CAROBREZ, 2003). Estudos

recentes demonstraram ação antidepressiva de lectinas via sistema glutamatérgico, através de

receptores NMDA (RIEGER et al., 2014).

Os receptores NMDA quando ativados ocasionam um influxo de cálcio no neurônio,

ativando a enzima óxido nítrico sintase (NOS), que converte a L-arginina em óxido nítrico

(NO) e L-citrulina (MONCADA et al., 1989; ESPLUGUES, 2002; BISHOP; ANDERSON,

2005). O mecanismo de ação do NO, de modo geral, envolve a sua ligação na porção heme da

guanilato ciclase solúvel (GCs), induzindo uma mudança conformacional que leva a enzima a

sintetizar 3’,5’ monofosfato guanosina cíclico (cGMP) a partir do trifosfato de guanosina

(GTP). O cGMP, por sua vez, é degradado pela fosfodiesterase-5 (PDE-5) e seus níveis

modulam a atividade de vários alvos intracelulares, como canais iônicos (GARTHWAITE;

BOULTON, 1995). Diante disto, a via L-Arginina/NO/cGMP pode causar alterações na

excitabilidade neural e propagacão de sinal pelo sistema nervoso através da abertura de canais

de potássio (K+) e consequente hiperpolarização da membrana plasmática do neurônio

(MACKINNON, 2003) (Figura 2).

32

Figura 2. Síntese do óxido nítrico

Os receptores NMDA são estimulados e há o influxo de Ca2+, o qual ativa as enzimas óxido nítrico sintases

(NOS). As NOS convertem a L-arginina em óxido nítrico (NO) e L-citrulina. O NO ativa as enzimas guanilato

ciclase solúvel (GCs) que transformam trifosfato de guanosina (GTP) em 3’,5’ monofosfato guanosina cíclico

(cGMP). A fosfodiesterase-5 (PDE-5) degrada o cGMP e seus níveis modulam os canais de potássio (K) e

consequente hiperpolarização. Fonte: Bettio (2012).

A investigação do papel do óxido nítrico (NO) na depressão também tem sido muito

estudada. Um grande número de trabalhos demonstrou evidências de que o NO está envolvido

na patofisiologia da depressão e que pacientes depressivos possuem um aumento na produção

de NO (SUZUKI et al., 2001; YILDIZ et al., 2000; DA SILVA et al., 2000; VOLKE et al.,

2003) e que substâncias que inibem a NOS ou a GCs tem efeito antidepressivo em modelos

pré-clínicos (YILDIZ et al., 2000; HARKIN et al., 2003; KASTER et al., 2005; JOCA;

GUIMARÃES, 2006).

33

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar o efeito da FTL em modelos neurocomportamentais em camundongos.

2.2 Objetivos Específicos

• Verificar o efeito da FTL em modelos experimentais de ansiedade;

• Investigar o efeito antidepressivo-símile da FTL;

• Analisar a participação dos sistemas monoaminérgico, glutamatérgico e via da L-

Arginina/NO/cGMP no efeito da FTL;

• Determinar se o efeito da FTL é dependente de sua integridade estrutural e capacidade

de reconhecimento e ligação a glicoconjugados.

• Verificar in silico as interações da FTL com sistema glutamatérgico e via da L-

Arginina/NO/cGMP.

34

3 MATERIAl E MÉTODOS

3.1 Frutalina: Isolamento e Purificação

As sementes foram coletadas de frutos maduros de Autocarpus incisa L. (fruta pão de

caroço) provenientes de Maranguape, Estado do Ceará, destegumentadas, desidratadas

(CH3OCH3 1:2 m/v 6/6 h por 24 h) com acetona e secas ao ar livre.

As sementes depois de selecionadas, livres de tegumento e desidratadas, foram

reduzidas a uma farinha fina (60 mesh), peneirada e estocada em frascos fechados,

previamente tarados, à temperatura ambiente.

A extração das proteínas foi realizada suspendendo-se a farinha em solução de NaCl

0,15 M, na proporção 1:10 (m/v) e deixada em agitação contínua por 30 min à temperatura

ambiente. A suspensão obtida foi centrifugada a 10.000 x g por 30 min a 4° C em centrifuga

refrigerada e o sobrenadante obtido foi filtrado e constituiu o extrato bruto.

Um volume de 25 ml do extrato bruto foi submetido a cromatografia de afinidade em

coluna de agarose-D-galactose, previamente equilibrada com NaCl 0,15 M, a um fluxo

constante de 30,0 ml/h mantido por bomba peristáltica, frações de 3,0 ml foram coletadas. O

material não retido (fração P1) foi eluído com NaCl 0,15 M. A fração retida na coluna (fração

P2) foi eluída com solução de galactose 0,2 M em NaCl 0,15 M que resultou na fração

lectinica. A eluição das proteínas foi acompanhada por absorbância a 280 nm em

espectrofotômetro. A fração P2 foi dialisada contra H2O destilada (1:50 v/v, trocas de 8/8 h

por 48 h) e liofilizada.

3.2 Atividade Hemaglutinante

Para detectação de atividade lectínica foram realizados ensaios da atividade

hemaglutinante com eritrócitos humanos, do tipo A+. Os ensaios de atividade hemaglutinante

foram realizados através de diluições seriadas em placas de 96 poços segundo o método de

Moreira e Perrone (1977). Em cada poço foram adicionados 50 µL de solução de NaCl 0,15

M e 50 µL de amostra com lectinas apenas no primeiro poço e após a diluição seriada de 1:2,

foi adicionado o mesmo volume de suspensão de hemácias 2%. O controle negativo continha

volumes iguais de NaCl 0,15 M e solução de hemácias 2%. Após 30 min de incubação a 37º

C e repouso por mais 30 min a temperatura ambiente, a atividade hemaglutinante foi

observada visualmente, sendo o título expresso em unidade de hemaglutinação (UH.mL-1),

que corresponde ao inverso da maior diluição da amostra que apresente nítida aglutinação.

35

3.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS e Espectometria de

Massas (LC/MS)

A pureza das preparações da fração P2 (FTL) foi avaliada por eletroforese em gel de

poliacrilamida em presença de SDS e por espectrometria de massas. A eletroforese foi feita

segundo a metodologia descrita por Laemmli (1970). A placa foi montada com gel de

aplicação a 3,5% de acrilamida em tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 e SDS 1,0% e o gel de

separação a 12,5% em tampão Tris-HCl 3 M pH 8,8 e SDS com pH 8,3. Amostras da FTL

(1,00 mg) foram dissolvidas em 1,0 ml de tampão Tris-HCl 0,0625 M, pH 6,8, glicerol 5% e

SDS 1% e submetida à fervura por 10 min. Azul de bromofenol (0,05%) foi adicionado às

amostras para controle das corridas eletroforéticas que foram realizadas a 200 V, 150 a 200

mA durante aproximadamente 4 h. Os géis foram corados com solução de Coomassie

Brilliant Blue 250 R (0,05%) em metanol: ácido acético glacial: água destilada (1:3:8) e

descorado com ácido acético glacial: metanol: água destilada (1:3:8). Os marcadores de massa

molecular foram: albumina sérica bovina (66 kDa), ovalbumina (45 kDa), anidrase carbônica

(30 kDa), inibidor de tripsina de soja (20,1 kDa), citocromo C (12,4 kDa) e inibidor de

calicreína (6,6 kDa).

FTL foi analisada em espectrômetro de massa SYNAPT HDMS (Waters, Manchester,

Reino Unido), acoplado a um sistema de nanoUPLC-ESI. A amostra foi diluída para 1mg/mL

em 0,1% (v / v) de ácido fórmico. Um microlitro de Frutalina foi usado para realizar uma

cromatografia de fase reversa utilizando um gradiente de 3% a 70% (v / v) de acetonitrila

durante 30 minutos com ácido fórmico a 0,1% (v: v) a uma taxa de fluxo de 300 nl / min em

uma coluna BEH C4, que mede 1,7 mm x 100 mm x 100 mm. Os dados de MS adquiridos

foram processados utilizando técnica que prioriza a obtenção de máxima entropia (MaxEnt)

para obter um espectro desconvoluído (FERRIGE; SEDDON, 1991).

3.4 Animais de experimentação

Foram utilizados camundongos albinos (Mus musculus), variedade Swiss Webster,

adultos, machos ou fêmeas, pesando entre 25 - 40 g, provenientes do Núcleo de Biologia

Experimental (NUBEX) da Universidade de Fortaleza (UNIFOR). Os animais foram

divididos em grupos (n = 6/cada), acondicionados em gaiolas de polipropileno, em

temperatura ambiente de 22 - 24° C, com ciclos de claro/escuro de 12 em 12 h, receberam

ração padrão e água ad libitum. Todos os protocolos seguiram estritamente as normas

36

internacionais de cuidados com os animais de laboratório (Parecer CEUA/UNIFOR

004/2015).

3.5 Testes de atividade ansiolítica/ansiogênica

3.5.1 Teste da Placa Perfurada – “Hole-board”

Os animais foram divididos em 4 grupos (n = 6/cada) e receberam, por via

intraperitoneal (i.p.) FTL (0,25, 0,50 ou 1,0 mg/kg) ou veículo (NaCl 0,9%; 10 ml/kg;

Controle) e 30 minutos depois foram colocados individualmente no “hole-board”. O

equipamento consiste em uma caixa quadrada de madeira (50 x 50 cm) a 10 cm de altura, com

16 orifícios de 2 cm de diâmetro, equidistantes uns dos outros e das bordas (Figura 2). Foram

registrados o número de vezes em que o animal introduziu o focinho nos orifícios da placa

(“hole dips”), o número de comportamentos de autolimpeza (“grooming”), de levantar

(“rearing”) e o número de bolos fecais por um período de 5 minutos (TAKEDA; TSUJI;

MATSUMYIA, 2006).

Figura 3. Teste de placa perfurada - “hole board”

3.5.2 Teste do labirinto em cruz elevado (LCE)

O labirinto em cruz elevado (LEC; Figura 3) consiste de dois braços abertos opostos

(30 x 5 x 25 cm) e dois braços fechados (30 x 5 x 25 cm), também opostos, em forma de cruz

grega. Os braços abertos e fechados são conectados por uma plataforma central (5 x 5 cm). A

plataforma, as paredes laterais dos braços fechados são confeccionadas em acrílico

transparente e o chão em acrílico preto. O aparelho está elevado a altura de 45 cm do nível do

37

chão. Os animais foram colocados no centro do aparelho com a cabeça voltada para os braços

fechados e o seu comportamento foi observado por 5 min.

Os camundongos foram divididos em 4 grupos (n = 6/cada) e tratados, i.p., com FTL

(0,25, 0,50 ou 1,0 mg/Kg) ou veículo (NaCL 0,9%; 10 ml/kg; Controle). Passados 30 min

foram colocados no equipamento e as medidas comportamentais registradas foram: frequência

de entradas e o tempo de permanência nos braços abertos e fechados.

Figura 4. Teste do labirinto em cruz elevado (LCE)

3.5.3 Teste do campo aberto (TCA)

O objetivo do teste foi avaliar a atividade estimulante ou depressora da FTL, podendo

ainda indicar atividades mais específicas como ansiolítica/ansiogênica. Um campo aberto,

confeccionado em acrílico (paredes transparentes e chão preto, 30 x 30 x 15 cm; Figura 4) foi

empregado para avaliar a atividade exploratória dos animais: sua movimentação espontânea

(número de cruzamentos, com as quatro patas, entre as divisões do campo), o número de

comportamentos de autolimpeza (“grooming”) e de levantar (“rearing”), registrados durante

um período de 5 min, após os tratamentos (Figura 4).

Os camundongos foram divididos em 4 grupos (n = 6/cada) e tratados, i.p., com FTL

(0,25, 0,50 ou 1,0 mg/Kg) ou veículo (NaCL 0,9%; 10 ml/kg; Controle). Após 30 min foram

colocados no centro do campo e avaliados.

38

Figura 5. Teste do campo aberto

3.6 Testes de atividade antidepressiva

3.6.1 Teste da Suspensão pela Cauda (TSC)

O teste consiste em observar o animal em uma posição estressante, onde a fuga é

impossível, naturalmente, após um tempo de tentativas frustradas, ele desiste e permanece

imóvel. Esse teste foi realizado conforme a metodologia descrita por Steru et al. (1985)

modificada. Os animais foram divididos em 4 grupos (n = 6/cada) e tratados, i.p., com FTL

(0,25, 0,50 ou 1,0 mg/Kg, i.p.) ou veículo (NaCL 0,9%; 10 ml/kg; Controle). Passados 30

min, os animais foram suspensos, presos com uma fita adesiva a cerca de 1 cm da ponta da

cauda, numa plataforma 58 cm acima da bancada (Figura 5).

Foram registrados o tempo de imobilidade (animal parado), “swinging” (o animal se

balança de um lado para o outro), “curling” (o animal encurva seu corpo para cima) e

“pedaling” (o animal move as apenas as patas continuamente), durante 6 minutos, sendo

cronometrados os 4 últimos minutos.

39

Figura 6. Representação esquemática do teste de suspensão pela cauda (TSC)

Fonte: Abelaira et al (2013).

3.6.2 Teste de natação forçada (TNF)

Os animais foram divididos em grupos (n = 6/cada) e tratados, i.p., com FTL (0,25,

0,50 ou 1,0 mg/Kg, i.p.) ou veículo (NaCL 0,9%; 10 ml/kg; Controle). 30 min depois foram

colocados, individualmente, num cilindro de vidro (altura = 40 cm; diâmetro = 25 cm),

contendo 19 cm de água por um período de 6 min, sendo cronometrado os 4 últimos minutos,

no qual foi registrado o tempo total de imobilidade para cada animal (Figura 6). Foi

considerado como imobilidade quando o animal fez apenas os movimentos mínimos para

manter a cabeça fora da água.

Imobilidade Mobilidade

40

Figura 7. Teste de natação forçada (TNF)

3.7 Análise do mecanismo de ação da FTL através de modulação farmacologica

Para a análise dos mecanismos de ação do efeito antidepressivo da FTL, foram

selecionados o teste de natação forçada e a dose 0,5 mg/Kg por apresentarem os melhores

resultados no estudo.

3.7.1 Participação do sistema monoaminérgico

Para investigar o envolvimento do sistema monoaminérgico na ação antidepressiva da

FTL, os camundongos foram pré-tratados com ioimbina (antagonista α2-adrenérgico; 1

mg/Kg, i.p.), 15 minutos antes da aplicação da FTL (0,5 mg/Kg, i.p.). 30 minutos após os

tratamentos, os camundongos foram submetidos ao teste de natação forçada.

3.7.2 Participação da via glutamatérgica

Para investigar o envolvimento do sistema glutamatérgico na ação antidepressiva da

FTL, os camundongos foram pré-tratados com cetamina (antagonista de receptores N-metil-

D-aspartato (NMDA) 0.1 mg/kg), 15 minutos antes da aplicação da FTL (0,5 mg/Kg, i.p.). 30

minutos após os tratamentos, os camundongos foram submetidos ao teste de natação forçada.

41

3.7.3 Participação da via L-Arginina/NO/cGMP

Para investigar o envolvimento da via nitrérgica na ação antidepressiva da FTL, os

camundongos foram pré-tratados com L-name (inibidor não específico das enzimas óxido

nítrico sintetases NOS; 10 mg/Kg, i.p), 15 minutos antes da aplicação da FTL (0,5 mg/Kg,

i.p.). 30 minutos após os tratamentos, os camundongos foram submetidos ao teste de natação

forçada.

Para investigar o envolvimento da guanilato ciclase na ação antidepressiva da FTL, os

camundongos foram pré-tratados com Azul de metileno (inibidor competitivo da enzima

guanilato ciclase; 10 mg/Kg, i.p), 15 minutos antes da aplicação da FTL (0,5 mg/Kg, i.p.). 30

minutos após os tratamentos, os camundongos foram submetidos ao teste de natação forçada.

3.8 Avaliação da participação do domínio lectínico e ação da FTL desnaturada

Para determinar o envolvimento do domínio lectínico no efeito antidepressivo-símile

da FTL, a ligação entre a lectina e o seu açúcar foi testada através da combinação de FTL (0,5

mg/kg) com D-galactose 0,2 M (incubadas a temperatura de 37°C por 30 min) e através da

aplicação separada de D-galactose 0,2 M seguido da aplicação de FTL (0,5 mg/kg) após 15

min.

Com o intuito de verificar a dependência da integridade estrutural da lectina, a FTL

(0,5 mg/kg) foi submetida a banho fervente durante 10 min a 100°C, afim de promover a sua

desnaturação. FTL desnaturada foi aplicada e 30 min depois os camundongos foram

submetidos ao teste de natação forçada.

Camundongos (n = 6/grupo) foram pré-tratados com veículo (NaCL 0,9%; 10 ml/kg;

Controle), FTL + D-galactose (pré-incubação), FTL e D-galactose (aplicadas separadamente)

ou FTL desnaturada. 30 minutos após os tratamentos, os camundongos foram submetidos ao

teste de natação forçada.

3.9 Efeito da administração repetida

Camundongos foram tratados com FTL (0,5 mg/kg) ou veículo (NaCL 0,9%; 10

ml/kg; Controle). 30 min após os tratamentos, os animais foram submetidos ao teste de

natação forçada. A fim de verificar o efeito da administração repetida da FTL, os

camundongos foram tratados com FTL ou veículo durante 7 dias e submetidos novamente ao

teste de natação forçada. Os pesos dos animais foram verificados todos os dias.

42

3.10 Docking Molecular

Para o docking molecular foi utilizado o software Hex 8.0.0, que realiza a procura por

ordenações e encaixes de forma automática, monitorando a energia de cada situação simulada.

Os encaixes foram realizados sem considerar as moléculas de água e explorando toda a

superfície do receptor. A obtenção de clusters com alta energia de interação foi o fator

determinante do sítio de interação. Para isso foram determinados os seguintes parâmetros:

Correlation type – Shape only, Calculation Device- CPU, Número de Soluções - 10000, Modo

FFT - 3D fast lite, Grid Dimension – 0.6, Faixa do receptor - 180, Faixa do Ligante -180,

Faixa de Torção - 360, Faixa de Distância - 40.

Foram realizados dois dockings moleculares: docking A: estrutura da enzima NOS,

especificamente o seu domínio oxygenase, (PDB ID: 1ZVI), e a estrutura do ligante, uma

molécula de FTL (PDB ID: 4WOG) (MONTEIRO-MOREIRA et al., 2015); docking B:

estrutura da FTL como receptor (PDB ID: 4WOG) e os receptores NMDA como ligante.

Para análise dos complexos formados após o docking molecular, foi utilizado o

software PyMol 1.4.7, que permite a manipulação tridimensional da molécula e do complexo

formado.

3.11 Análise Estatística

A análise estatística dos dados foi realizada através do software Graph Prism. Versão 6

para Windows, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA. Os resultados que

obedeceram a uma distribuição paramétrica foram analisados por Análise de Variância

(ANOVA), seguido pelo teste de Dunnett ou Bonferroni (post hoc).

Os resultados estão expressos pela Média ± Erro Padrão da Média (EPM), com

número de animais entre parêntese e foi considerado o nível de significância menor que 0,05

(p<0,05).

43

4 RESULTADOS

4.1 Frutalina: isolamento e purificação

A FTL foi isolada e purificada de acordo com a metodologia descrita por Moreira e

colaboradores (1998) com modificações. Foram realizadas aproximadamente 10

cromatografias de afinidade, aplicando-se 30 ml do extrato bruto, filtrado e centrifugado. A

cromatografia de afinidade utilizando a coluna de galactose-D-sepharose (Figura 8) possui

uma ótima eficiência no isolamento, apresentando rendimento de aproximadamente 3 mg de

FTL para cada grama de farinha das sementes.

Figura 8. Cromatografia de afinidade.

Cromatograma relativo a aplicação de 30mL de extrato-bruto de semente de Fruta-pão (Artocarpus incisa em

NaCl 0,15M), contra uma coluna de D-Galactose imobilizada em agarose de 5mL, num fluxo de

aproximadamente 0,5mL/min, eluída com uma solução 0,2 M de D-Galactose em NaCl 0,15 M.

Após obtenção da FTL, foram necessárias 72 horas de diálise contra água destilada em

membrana semipermeável de celulose, feitas aproximadamente 12 trocas da água durante esse

período. As amostras dialisadas foram submetidas a liofilização e cada cromatografia

proporcionava em torno de 15 mg de frutalina.

A pureza da amostra foi analisada em eletroforese SDS-PAGE 12,5% e ESI-MS

(Figura 8). Na eletroforese foi observado o perfil característico para essa lectina, caracterizado

por duas bandas de massa aparente: a primeira de 15,5 kDa e a segunda de 12 kDa. o espectro

de massas da Frutalina purificada, após desconvolução, mostrou massas diferentes em torno

de 16,5 kDa, o que corrobora com a presença de isoformas do mesmo monômero e confirma

que a amostra está pura.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

Abso

rbân

cia

280 n

m

Volume (mL)

Pico 1

D-Galactonse

0,2 M

Pico 2

44

Para verificar a atividade lectínica, foi realizado ensaio da atividade hemaglutinante

com eritrócitos humanos, tipo A+, no qual foi possível observar aglutinação, o que nos

permite afirmar que a FTL estava ativa.

Figura 9. SDS-PAGE 12,5% e ESI / MS

SDS-PAGE 12,5% referente aos marcadores moleculares (A) e as bandas aparentes relativas a FTL (B).

Espectros intactos deconvoluídos de FTL mostraram massas em torno de 16 kDa.

4.2 Avaliação da atividade ansiolítica/ansiogênica

4.2.1 Teste da Placa Perfurada – “Hole-board”

Para investigar o possível efeito ansiolítico ou ansiogênico da FTL, os camundongos

foram submetidos ao teste da placa perfurada. Na tabela 1 é possível observar os resultados

obtidos neste teste, no qual nenhuma das doses da FTL alterou significativamente o

comportamento dos animais nos quatro parâmetros observados (número de head dips,

grooming, rearing e bolos fecais).

45

Tabela 1. Efeito da FTL no teste da placa perfurada.

Grupo Dose

(mg/kg)

“Head

dips”

“Grooming” “Rearing” Bolos fecais

Controle - 16,50 ± 2,75

0,50 ± 0,22

0,66 ± 0,21

1,33 ± 0,61

FTL 0,25 12,17 ± 2,10

0,33 ± 0,33

0,16 ± 0,16

1,16 ± 0,65

0,5 13,17 ± 1,95

0,83 ± 0,40

2,50 ± 1,25

0,50 ± 0,22

1,0 14,00 ± 3,21

0,83 ± 0,30

0,66 ± 0,33

0,16 ± 0,16

Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística

foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc.

4.2.2 Teste do labirinto em cruz elevado (LCE)

O LCE é um dos testes mais utilizados na pesquisa para analisar a ação ansiolítica ou

ansiogênica de compostos. Os efeitos da FTL neste teste foram observados em relação ao

tempo de permanência nos braços abertos (TPBA), tempo de permanência nos braços

fechados (TPBF), número de entrada nos braços abertos (NEBA) e número de entrada nos

braços fechados (NEBF). FTL 0,25 mg/Kg aumentou significativamente (11,33 ± 0,80;

*p<0,05) em comparação ao grupo controle (7,50 ± 1,14) o NEBF (Figura 9), permitindo que

seja sugerido um possível efeito do tipo ansiogênico. Não houve diferença estatística nas

outras doses e nos outros parâmetros analisados.

46

Figura 10. Efeito da FTL no teste de labirinto em cruz elevado (LCE).

Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística

foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao

controle (*<0,05).

47

4.2.3 Teste do campo aberto (TCA)

Conforme pode ser verificado na Tabela 2, nenhuma das doses da FTL alterou

significativamente os parâmetros observados (número de “crossing”, “grooming” e “rearing”).

Tabela 2. Efeito da FTL no teste de campo aberto

Grupo Dose

(mg/kg)

“Crossing” “Rearing” “Grooming”

Controle - 81,67 ± 7,65

10,00 ± 1,80

2,00 ± 0,51

FTL 0,25 66,83 ± 5,02

12,50 ± 1,33

2,66 ± 0,55

0,5 62,33 ± 12,43

5,83 ± 1,72 2,00 ± 0,85

1,0 60,00 ± 10,26

12,83 ± 2,96

3,00 ± 0,85

Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística

foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc.

4.3 Avaliação da atividade antidepressiva

4.3.1 Teste da Suspensão pela Cauda (TSC)

Para avaliar o possível efeito antidepressivo-símile, a FTL foi testada no ensaio de

suspensão pela cauda (TSC). A Figura 10 representa o efeito da FTL sobre os quatro

parâmetros analisados: tempo de imobilidade, “swinging”, “curling” e “pedaling”. FTL

diminuiu significativamente (*p < 0,05) o tempo de imobilidade nas doses de 0,25 mg/kg

(56,50 ± 15,12) e 0,5 mg/kg (59,50 ± 17,40) em comparação ao grupo controle (128,00 ±

15,68) (Figura 4). FTL 1 mg/kg (65,67 ± 19,71) aumentou o tempo de “peddaling” (*p<0,05)

quando comparada ao grupo controle (9,83 ± 3,26), sendo possível sugerir que a FTL tem um

efeito antidepressivo-símile.

48

Figura 11. Efeito da FTL no teste de suspensão pela cauda (TSC)

Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística

foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao

controle (*<0,05).

4.3.2 Teste de natação forçada (TNF)

O teste de natação forçada (TNF) é o teste mais utilizado para analisar a atividade do

tipo antidepressiva ou depressora de compostos. O efeito da FTL sobre o TNF está

apresentado na Figura 11. FTL diminuiu significativamente o tempo de imobilidade dos

animais (FTL 0,25 mg/kg; 52,67 ± 13,79; *p<0,05 e FTL 0,5 mg/kg; 24,83 ± 8,01; *p<0,001)

quando comparada ao grupo controle (120,7 ± 17,21), confirmado o efeito tipo

antidepressivo-símile observado no TST.

49

Figura 12. Efeito da FTL no teste de natação forçada (TNF).

C o n tro le 0 ,2 5 0 ,5 1

0

5 0

1 0 0

1 5 0

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

F T L (m g /k g )

* * *

*

C o n tr o le 0 ,2 5 0 ,5 1

Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística

foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao

controle (*<0,05; ***<0,001).

4.4 Análise dos possíveis mecanismos de ação da FTL através da modulação

farmacológica

De acordo com os resultados obtidos, a FTL na dose de 0,5 mg/kg foi escolhida para

ser avaliada quanto as possíveis vias de mecanismo de ação do seu efeito antidepressivo-

símile no TNF.

4.4.1 Participação do sistema monoaminérgico

Ioimbina, um antagonista de receptores α2-adrenérgicos, não previniu o efeito

antidepressivo-símile da (FTL+IBN 109,7 ± 15,42) em comparação ao grupo FTL sozinha

(176,8 ± 8,81), (Figura 12).

50

Figura 13. Participação do sistema monoaminérgico no efeito antidepressivo-símile

da FTL no teste de natação forçada (TNF)

C o n tro le F T L IB N IB N + F T L

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

* ** *

C o n tr o le F T L I B N F T L + I B N

A

Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística

foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao

controle (**<0,01). FTL – Frutalina 0,5 mg/kg; IBN – Ioimbina 1 mg/kg.

4.4.2 Participação da via glutamatérgica

O efeito antidepressivo-símile da FTL (101,2 ± 10,80; ***p<0,001) foi prevenido pelo

pré-tratamento com cetamina, um antagonista de receptores N-metil-D-aspartato (NMDA)

(CET+FTL 142,3 ± 17,88), (Figura 14).

51

Figura 14. Participação do sistema glutamatérgico no efeito antidepressivo-

símile da FTL no teste de natação forçada (TNF)

C o ntro le F T L C E T F T L + C E T

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

* * *

C o n tr o le F T L C E T F T L + C E T

B

Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística

foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao

controle (***<0,001); FTL – Frutalina 0,5 mg/kg; IBN – Ioimbina 1 mg/kg.

4.4.3 Participação da via L-Arginina/NO/cGMP

L-NAME (10 mg/Kg), um inibidor não específico das enzimas NOS e azul de

metileno (10 mg/kg), um inibidor competitivo da enzima guanilato ciclase, preveniram o

efeito antidepressivo-símile da FTL (0,5 mg/kg) (Figura 15).

52

Figura 15. Participação da via L-Arginina/NO/cGMP no efeito antidepressivo-símile da FTL

no teste de natação forçada (TNF)

Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística

foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao

controle (**<0,01); L-NAME 10 mg/kg; FTL – Frutalina 0,5 mg/gk; AMET – Azul de metileno 10 mg/kg.

4.5 Envolvimento do domínio lectínico e ação da FTL desnaturada

A desnaturação da FTL preveniou o efeito antidepressivo-símile da lectina, assim

como o pré-tratamento dos animais com a glactose antes da FTL. A FTL também não

promoveu a redução da imobilidade dos camundongos quando administrada conjugada à

galactose (Figura 16).

53

Figura 16. Participação da integridade estrutural e domínio lectiníco no efeito antidepressivo-

símile da FTL no teste de natação forçada (TNF)

C on tr o l e FT L FT L D ES FT L + G L T G L T / FT L

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

* * * *

C o n tr o le F T L F T L D E S F T L + G L T G L T /F T L

Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística

foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao

controle (****<0,0001; FTL – Frutalina 0,5 mg/kg; FTL – Frutalina Desnaturada; FTL+GLT – D-galactose 0,2

M, 15 minutos antes da FTL; GLT/FTL – Frutalina conjugada à D-galactose.

4.6 Efeito da administração repetida de FTL

Conforme pode ser verificado na Figura 16, o efeito antidepressivo-símile da FTL 0,5

mg/kg foi mantido mesmo após 7 dias de tratamento repetido. Não houve diferença entre o

ganho de peso dos animais do grupo controle e tratados com FTL (Figura 17).

54

Figura 17. Efeito da administração repetida na ação antidepressiva-símile da FTL

durante sete dias

D IA 1 D IA 7 D IA 1 D IA 7

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0T

em

po

de

im

ob

ilid

ad

e (

s)

* * *

* *

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

C o n t r o le

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

F T L

D ia 1 D ia 7 D ia 1 D ia 7

Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística

foi utilizado ANOVA seguido pelo teste de Dunnett como post hoc. Valores significativos comparados ao

controle (*** p<0,001; ** p<0,01); FTL – Frutalina 0,5 mg/kg.

Figura 18. Efeito da administração repetida da FTL no peso dos camundongos durante sete

dias.

1 2 3 4 5 6 7

9 5

1 0 0

1 0 5

1 1 0

1 1 5

C o n tr o le

F T L 0 ,5 m g /k g

D ia s

Pe

so

(%

)

Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Para análise estatística

foi utilizado 2way ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni como post hoc.

55

4.7 Docking Molecular

Foi observado o encaixe da FTL em todos os 10 clusters de maior energia, gerados

pelo docking molecular. Pode-se observar que a o domínio oxygenase da enzima receptora

NOS interage com o ligante fortemente, com ligações que variam de 1,3 a 3,0 angstroms,

garantindo a ação biológica sugerida pelo experimento in vivo (Figura 19).

Figura 19. Docking Molecular A – FTL x Domínio Oxygenase da enzima NOS

Interações químicas fortes entre o domínio oxygenase da enzima NOS (verde) e a Frutalina (ciano), com ligações

de 1.3 a 3.0 angstroms.

Outra informação importante é a alta credibilidade de predição do sítio de encaixe

entre a NOS e a FTL. Pois ao sobrepor todos os 5 clusters de maior energia de ligação, pode-

se perceber que todos se encontram no mesmo sítio, com os mesmos resíduos de aminoácidos

envolvidos (Figura 20).

56

Figura 20. Docking Molecular A – FTL x Domínio Oxygenase da enzima NOS

Clusters sobrepostos de posições de alta compatibilidade entre FTL (colorido) e o domínio oxygenase da enzima

NOS (verde), mostrando que as 5 posições de maior energia estão no mesmo local.

A visualização da interação, juntamente à medição da distancia das ligações e às altas

energias observadas (Tabela 3), comprova o mecanismo de ligação entre resíduos de

aminoácidos da enzima NOS (domínio Oxygenase) e os resíduos de aminoácidos da FTL:

Val24, Gly25, Ser100, Tyr102, Lys141, Tyr146 e Tyr150. Com base nestes resíduos, pode-se

sugerir também a possível glicosilação de alguns aminoácidos da enzina NOS, já que os

resíduos Gly25, Tyr146 e Tyr150 estão diretamente relacionados com a atividade lectínica da

Frutalina, o que sugere que este sítio de reconhecimento tenha grande afinidade a glicanos.

57

Tabela 3. Energia da região de interação entre o domínio Oxygenase da enzima NOS e a FTL

(kcal/mol)

Cluster 01: -887,48

Cluster 02: -814,57

Cluster 03: -811,66

Cluster 04: -810,14

Cluster 05: -784,78

Cluster 06: -776,22

Cluster 07: -751,05

Cluster 08: -723,57

Cluster 09: -719,11

Cluster 10: -716,42

Em relação aos dados obtidos com o docking B, pode-se perceber altíssima energia de

interação entre as moléculas, com ligações que variam de 2.1 a 3.2 angstroms. Os resíduos de

aminoácidos do receptor NMDA envolvidos são: Gln40, Phe342, Lys343, Val345, Gln371,

Ile111, Leu112, Phe114, que possibilitam interações químicas com muitos resíduos da FTL,

inclusive os resíduos associados à atividade lectínica: Gly25, Tyr146, Trp147 e Asp149. Esta

forte interação observada no docking molecular pode sugerir o mecanismo de ligação entre

FTL e o receptor NMDA (Figura 21). A medição da distancia das ligações e às altas energias

observadas podem ser visualizadas na Tabela 4.

58

Figura 21. Docking Molecular B – FTL x receptores NMDA

FTL (púrpura) interagindo com o receptor NMDA, com ligações químicas entre 2.1 e 3.2 angstroms se

estendendo por quase toda a superfície do tetrâmero.

Tabela 4. Energia da região de interação entre a FTL e o receptor NMDA (kcal/mol)

Cluster 01: -16353,91

Cluster 02: -15894,88

Cluster 03: -15682,25

Cluster 04: -15040,66

Cluster 05: -14799,38

Cluster 06: -14764,13

Cluster 07: -14543,02

Cluster 08: -14527,10

Cluster 09: -14476,09

Cluster 10: -14462,69

59

5 DISCUSSÃO

Muitos estudos têm demonstrado que lectinas vegetais possuem atividade no Sistema

Nervoso Central, sendo elas estimulantes ou depressoras, apresentando resultados pré-clínicos

promissores. Dentre as pesquisas na área de Neurobiologia com essa classe de proteínas, elas

têm se destacado como moléculas com atividades de neuroplasticidade, neuroprotetoras e

neuroinflamatórias (EVERTS et al., 1999; JACQUES et al, 2013; GONÇALVES et al.,

2013).

A FTL, uma lectina α-D-galactose ligante, foi isolada em 1998 por Moreira e

colaboradores, vem sendo estudada por muitos anos e tem apresentado muitos potenciais

biológicos, como atividade antitumoral (OLIVEIRA et al., 2011), gastroprotetora (ABDON et

al., 2012) e neuroprotetora frente a toxicidade glutamatérgica “in vitro” (JACQUES, 2012).

Considerando os efeitos neuroprotetores que lectinas vegetais têm apresentado e os potenciais

biológicos da FTL, no presente trabalho realizamos um screening de modelos

neurocomportamentais para avaliar a ação da FTL no SNC de camundongos com enfoque em

distúrbios de ansiedade e depressão.

O trabalho demonstrou, pela primeira vez, que a administração intraperitoneal de FTL,

em camundongos, produziu um efeito do tipo ansiogênico e antidepressivo, assim como

demonstrou também possíveis vias de mecanismos de ação envolvidos no efeito

antidepressivo-símile da FTL.

Para analisar os possíveis efeitos ansiolíticos ou ansiogênicos da FTL, foi realizado o

teste de placa perfurada (hole board). Este modelo se baseia na exposição dos camundongos a

um novo ambiente, no qual os agentes ansiolíticos aumentam o número de mergulhos de

cabeça nos orifícios da placa, ao contrário dos agentes ansiogênicos que diminuem

(TAKEDA; TSUJI; MATSUMYIA, 2006). Outros parâmetros que também observados neste

modelo foram o número de “grooming”, “rearing” e bolos fecais. Na literatura não há dados

sobre lectinas testadas no hole board e a FTL não alterou nenhum dos parâmetros analisados.

Também foi realizado o teste do labirinto em cruz elevado (LCE), que é um dos

modelos mais utilizados nas pesquisas da ansiedade em roedores, e é baseado em respostas a

ambientes perigosos que evocam curiosidade e medo, criando desta forma, um conflito de

aproximação e esquiva (LISTER, 1987). Foi constatado que os agentes ansiolíticos

aumentavam o tempo de permanência e a quantidade de entradas nos braços abertos, ao

contrário dos agentes ansiogênicos que diminuíam o tempo de permanência e quantidade de

entradas nos braços abertos ou aumentam a permanência e quantidade de entradas nos braços

60

fechados. Assim como no hole board, não existem evidencias na literatura de lectinas vegetais

testadas neste modelo. A FTL na dose de 0,25 mg/kg aumentou significativamente a

quantidade de entradas dos camundongos nos braços fechados, o que nos permite supor que a

FTL pode ter um efeito do tipo ansiogênico. Estudos com outras lectinas, como a galectina-3,

uma lectina animal ligante de β-D-galactose, demonstraram que ela pode estar envolvida em

alterações comportamentais e que a sua deficiência provocou diminuição da atividade

locomotora e ansiedade (HOYOS et al., 2014) corroborando com este estudo, demonstrando

que lectinas podem alterar o comportamento dos animais em modelos de ansiedade.

Dando continuidade aos estudos sobre ansiedade, foi realizado o teste de campo aberto

(TCA), no qual o comportamento do animal é determinado pelo conflito entre a motivação

para explorar e a aversão a lugares abertos e desprotegidos. É um teste utilizado para analisar

atividade locomotora dos roedores e de modo coerente, drogas de perfil ansiolítico ou

ansiogênico tendem, respectivamente, a aumentar ou diminuir a ambulação no TCA.

(SCHMITT; HIEMKE, 1998). Nenhuma das doses da FTL alteraram significativamente a

atividade locomotora dos animais em nenhum dos parâmetros, um efeito diferente do

encontrado para outras lectinas, como por exemplo a ConBr, lectina isolada da Canavalia

brasiliensis que possui afinidade de ligação por glucose e manose, e que no TCA causou

aumento na atividade locomotora na dose mais alta (BARAÙNA et al., 2006).

Para avaliar os possíveis efeitos antidepressivos ou depressores, a FTL foi submetida

ao teste de suspensão pela cauda (TSC). Este teste foi desenvolvido por Steru et al. (1985) e

consiste em observar o animal em uma posição estressante, onde a fuga é impossível,

naturalmente, após um tempo de tentativas frustradas, ele desiste e permanece imóvel. Os

parâmetros observados neste trabalho foram o tempo de imobilidade (o animal totalmente

parado), “swinning” (o animal realiza movimentos de um lado para o outro), “curling” (o

animal encurva seu corpo para cima) e “peddaling” (o animal move apenas as patas

continuamente). A FTL diminuiu significativamente o tempo de imobilidade dos animais nas

doses de 0,25 e 0,5 mg/kg, além de aumentar significativamente o tempo de “peddaling” na

dose de 1 mg/kg, indicando que a FTL possui um efeito antidepressivo-símile. Na literatura

não há dados sobre lectinas vegetais testadas neste modelo.

Para confirmar o efeito antidepressivo-símile da FTL, foi realizado o teste de natação

forçada (TNF), o teste mais utilizado em pesquisas que avalia atividade antidepressiva de

compostos. Este teste foi desenvolvido por Porsolt e colaboradores (1977) e se baseia na

mesma premissa do TSC, no qual quando submetemos um animal a um estresse inescapável,

como sua colocação num cilindro contendo água, o animal desempenhará movimentos de

61

fuga dessa situação supostamente desagradável e em poucos minutos adotará a postura imóvel

(ausência total de movimentos ou com movimentos muito leves suficientes para deixar a

cabeça do animal emersa). A FTL diminuiu significativamente o tempo de imobilidade dos

camundongos nas doses de 0,25 e 0,5 mg/kg, conferindo o efeito antidepressivo-símile

observado no TSC. Outras lectinas já foram estudadas no TNF, e a VML, uma lectina D-

galactose ligante, isolada das sementes de Vatairea macrocarpa, induziu um comportamento

do tipo depressivo, evidenciado pelo aumento do tempo de imobilidade dos camundongos no

TNF (GONÇALVES et al., 2013), o que é interessante de ser observado, pois a FTL e a VML

são lectinas vegetais, apresentam afinidade de ligação semelhante a galactose e ambos

apresentaram efeitos diferentes no TNF, podendo ser sugerido o papel duplo de lectinas

vegetais com afinidade por galactose na função neural. Outra lectina analisada no TNF, foi a

ConBr, uma lectina com afinidade de ligação por glucose e manose, extraída de sementes da

espécie Canavalia brasilienses, que assim como a FTL, apresentou atividade antidepressiva-

símile no TNF (BARAÙNA et al., 2006).

Um fator importante para certificar o efeito antidepressivo-símile da FTL, foi a

realização do TCA que demonstrou que a FTL não alterou a atividade locomotora dos

animais, o que nos permite supor que o efeito antidepressivo-símile da FTL não ocorre por

meio de atividade psicoestimulante, o qual pode gerar um resultado falso-positivo quando do

uso do TNF como modelo experimental de depressão. Damaceno et al. (2016) demonstrou

que a FTL também não interferiu na atividade locomotora de camundongos no teste de Rota-

rod, corroborando com o presente estudo.

Apesar da etiologia da depressão ainda não ser bem esclarecida, existem muitas

propostas e teorias acerca das bases etiológicas para esta doença. Uma das principais teorias

envolvem a hipótese monoaminérgica que surgiu em 1965, por Schildkraut, e postula que o

maior processo neuroquímico envolvido na depressão é a disfunção na neurotransmissão

monoaminérgica, no qual há diminuição das monoaminas (norepinefrina, serotonina e

dopamina) na fenda sináptica (SCHILDKRAUT, 1965). Esta hipótese é sustentada

principalmente pelo fato de que a maioria dos antidepressivos utilizados na clínica aumentam

os níveis de monoaminas no cérebro através da inibição da recaptação de monoaminas e/ou

ainda age como inibidor da enzima monoamina oxidase, enzima que biotransforma as

monoaminas (NEMEROFF, 2007). Considerando a importância da hipótese monoaminérgica,

que tem demonstrado participação na neurobiologia da depressão (KIM et al., 2008;

FROKJAER et al., 2009), neste estudo foi analisado a possibilidade do sistema

monoaminérgico estar envolvido na ação antidepressiva-símile da FTL. Para isto, foi utilizado

62

a ioimbina, (um antagonista de receptores α2-adrenérgicos), no qual não preveniu o efeito

anti-imobilidade da FTL, demonstrando que o efeito antidepressivo-símile da FTL não está

envolvido neste sistema. Um efeito diferente foi observado para a lectina ConBr, no qual a

ioimbina preveniu o efeito desta lectina, demonstrando possível participação do efeito

antidepressivo-símile da ConBr nesta via (BARAÙNA et al., 2006).

Além da hipótese monoaminérgica, existem outras vias que podem estar envolvidas na

depressão. Muitas evidências têm associado à depressão a uma disfunção na sinalização

glutamatérgica, especialmente à hiperativação dos receptores NMDA, e que antagonistas

destes receptores possuem ação antidepressiva (TRULLAS; SKOLNICK et al., 1990;

SANACORA et al., 2011).

De acordo com os estudos realizados por Jacques em 2012, a FTL apresentou

atividade neuroprotetora frente à neurotoxicidade glutamatérgica avaliado em modelo de

fatias hipocampais de camundongos tratadas in vitro com glutamato. Considerando estes

dados e a necessidade de novos agentes antidepressivos que apresentem novos mecanismos de

ação, neste trabalho foi analisado a possibilidade do sistema glutamatérgico estar envolvido

na ação antidepressiva-símile da FTL. Para isto, foi utilizado a cetamina, um antagonista não

competitivo de receptores do N-metil-D-aspartato (NMDA), no qual preveniu

significativamente o efeito antidepressivo-símile provocado pela administração da FTL,

mostrando que o bloqueio destes canais impede que a FTL exerça seu efeito. Resultado

semelhante foi o obtido por Rieger et al 2014, cujo estudo evidenciou o envolvimento do

sistema glutamatérgico (através de receptores NMDA) e da via L-Arginina/NO/cGMP no

efeito antidepressivo provocado pela administração central de ConBr. Além disso, alguns

estudos demonstraram que lectinas com afinidade por galactose foram capazes de se ligar

diretamente a receptores NMDA, podendo modular sua atividade através da interação com

resíduos de oligossacarídeos presentes nos receptores (DANYSZ et al., 1995; YUE et al.,

1995; EVERTS et al., 1997). Esse achado foi corroborado com o docking molecular, que

verificou forte interação da FTL com o receptor NMDA.

Damasceno et al. (2016) demonstrou que a FTL apresentou atividade antinociceptiva

indicando uma possível interferência com o sistema glutamatérgico, através de sua interação

com os canais TRPV1 (receptor de potencial transitório vanilóide 1), sugerindo que o efeito

da FTL sobre a nocicepção induzida pelo glutamato, ocorre devido à redução da liberação de

glutamato via bloqueio do canal TRPV1. Corroborando com nosso estudo que demonstrou

envolvimento do sistema glutamatérgico no efeito antidepressivo-símile da FTL e

63

apresentando mais possibilidades para novos estudos da ação antidepressiva-símile da FTL

através de diferentes canais iônicos TRPs (receptor de potencial transitório).

A via L-Arginina/NO/GMPc também tem sido estudada na fisiopatologia da

depressão. O óxido nítrico (NO) é produzido por esta via, por um grupo de proteínas

denominadas óxido nítrico sintase (NOS), que dependem de Ca2+ para sua ação, e atuam

sobre moléculas de L-arginina para produzir NO e L-citrulina. O NO produzido é capaz de

estimular a enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), que promove a conversão de trifosfato de

guanosina (GTP) em monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) (DENNINGER;

MARLETTA, 1999).

A produção excessiva de NO pela indução da NOS por processos como inflamação,

estresse crônico e hiperexcitabilidade glutamatérgica está relacionada à patogênese de

doenças neurodegenerativas e transtornos de humor, como Alzheimer, Parkinson, transtorno

bipolar e depressão (MCLEOD et al., 2001; GUIX et al., 2005; HOEKSTRA et al., 2006;

SINGH; DIKSHIT, 2007). Uma das consequências do excesso de NO é o aumento do estresse

oxidativo pelo aumento de espécies reativas de nitrogênio (ERN), a síntese de mediadores

químicos de processos inflamatórios, bem como a ativação de vias apoptóticas

(CALABRESE et al., 2007). Estudos clínicos demonstram que as concentrações plasmáticas

de nitrato são significativamente maiores em pacientes deprimidos quando comparado aos

controles, sugerindo que a produção de NO está aumentada na depressão (SUZUKI et al.,

2001). Adicionalmente, estudos pré-clínicos mostram que inibidores da NOS e inibidores da

GCs, cujas concentrações são aumentadas pelo NO, possuem propriedades antidepressivas em

modelos animais (DA SILVA et al., 2000; YILDIZ et al., 2000; HEIBERG et al., 2002;

HARKIN et al., 2003; VOLKE et al 2003).

Estudos demonstram que o NO em níveis fisiológicos, apresenta papel associado a

neuromodulação e neuroproteção, porém em concentrações elevadas no organismo, o NO

apresenta neurotoxicidade (CALABRESE et al., 2007). Foi estabelecido que pessoas com

depressão apresentam níveis de NO aumentados, com consequente aumento dos níveis de

GMPc (SUZUKI et al., 2001). Diante disto, substancias que inibem a ação das enzimas NOS

e GCs têm apresentado do efeito antidepressivo (YILDIZ et al., 2000; HARKIN et al., 2003;

KASTER et al., 2005; JOCA; GUIMARÃES, 2006). Considerando o aumento das

concentrações de NO na fisiopatologia da depressão e do envolvimento de NOS e GCs neste

aumento, este trabalho avaliou a participação da via L-Arginina/NO/cGMP na atividade

antidepressiva-símile da FTL. O pré-tratamento com L-NAME (inibidor não específico das

64

enzimas NOS) e azul de metileno (inibidor competitivo da enzima GCs) bloquearam

significativamente o efeito antidepressivo-símile da FTL, demonstrando que seu efeito pode

estar envolvido na via L-Arginina/NO/GMPc. Esse achado foi corroborado com os estudos de

docking molecular, que demonstrou a possível interação da FTL com a enzima NOS.

Para investigar se o efeito antidepressivo-símile da FTL é dependente da integridade

de suas estruturas terciárias e quaternárias, foi realizado desnaturação da FTL (água fervente a

100° C por 10 min), e foi observado que a FTL desnaturada, portanto inativa, não foi capaz de

modificar o tempo de imobilidade dos animais, evidenciando que o seu efeito depende de sua

integridade estrutural. A perda do efeito antidepressivo-símile da FTL também foi observada

quando foram administradas FTL pré-incubada com D-galactose e quando a D-galactose foi

administrada antes da FTL. Desta forma, foi demonstrado que o efeito antidepressivo-símile

da FTL também está relacionado a sua capacidade de reconhecimento e ligação a

glicoconjugados contendo α-D-galactose.

De modo geral, as drogas utilizadas para depressão não diferem entre si na eficácia e

os efeitos terapêuticos se manifestam de forma retardada, dentro de 2 a 4 semanas, como por

exemplo a imipramina e a amitriptilina que apresentam potencialização no efeito apenas após

2 semanas (SVENSSON, 1980, SVENSSON; USDIN, 1978), sendo esta a principal

dificuldade para a adesão ao tratamento, visto que os efeitos colaterais se manifestam

agudamente. Desta forma, foi realizado um ensaio subcrônico de dose repetida durante 7 dias

e foi evidenciado que o potencial efeito antidepressivo-símile da FTL manteve-se após os 7

dias de tratamento. Esses tratamentos repetidos possuem uma importância clínica, pois os

tratamentos continuados, em torno de um ano, reduzem em até 90% os índices de remissão

em alguns tipos de depressão (STAHL, 1996). Estudos mais aprofundados e com maior

período de dias com doses repetidas devem ser realizados para confirmação do efeito

continuado.

Baseado neste conjunto de evidências, podemos concluir que a FTL, uma lectina α-D-

galactose ligante de origem vegetal, possui um possível efeito do tipo ansiogênico e um efeito

antidepressivo-símile em camundongos e seu efeito é dependente da integridade estrutural e

do sítio de reconhecimento a glicoconjugados contendo α-D-galactose. Além disso, o seu

efeito parece estar relacionado ao sistema glutamatérgico e a via L-Arginina/NO/cGMP,

verificado in vivo e in silico. Por fim, nosso estudo corroborou com outros estudos que

demonstraram ações neuroprotetoras de lectinas vegetais.

65

6 CONCLUSÕES

Este estudo demonstrou que a FTL possui um possível efeito ansiogênico-símile e

efeito antidepressivo-símile em dois modelos animais de depressão, sem efeitos adversos

aparentes sobre a locomoção motora. Este efeito é dependente do domínio lectínico e de sua

integridade estrutural. O efeito antidepressivo-símile da FTL é mediado pelos receptores

NMDA e a via L-arginina-NO/GMPc, consistente com o fato de que estas vias estão

criticamente envolvidas na etiologia e fisiopatologia da depressão. Os estudos de docking

molecular demonstraram fortes interações da FTL com a enzima NOS e receptor NMDA,

corroborando com os resultados in vivo. Além disso, estes resultados sugerem que a FTL tem

potencial para ser uma nova droga antidepressiva.

66

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