UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA
SAÚDE
PAULA DOS PASSOS MENEZES
OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA
DE COMPLEXOS SUPRAMOLECULARES DE ÓLEO
ESSENCIAL E SUBSTÂNCIA ISOLADA EM
CICLODEXTRINAS
ARACAJU
2015
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PAULA DOS PASSOS MENEZES
OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-
QUÍMICA DE COMPLEXOS SUPRAMOLECULARES
DE ÓLEO ESSENCIAL E SUBSTÂNCIA ISOLADA EM
CICLODEXTRINAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de
Mestre em Ciências da Saúde.
Orientadora: Profa. Dra. Mairim Russo Serafini
ARACAJU
2015
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
M543o
Menezes, Paula dos Passos
Obtenção e caracterização físico-química de complexos
supramoleculares de óleo essencial e substância isolada em
ciclodextrinas / Paula dos Passos Menezes ; orientador Mairim
Russo Serafini. – Aracaju, 2015.
119 f. : il.
Dissertação (mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade
Federal de Sergipe, 2015.
1. Essências e óleos essenciais – físico-química. 2. Ciclodextrinas. 3. Plantas medicinais. 4.Terpenos. I. Serafini, Mairim Russo, orient. II. Título.
CDU 615.32.011
PAULA DOS PASSOS MENEZES
OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-
QUÍMICA DE COMPLEXOS SUPRAMOLECULARES
DE ÓLEO ESSENCIAL E SUBSTÂNCIA ISOLADA EM
CICLODEXTRINAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de
Mestre em Ciências da Saúde.
Orientadora: Profa. Dra. Mairim Russo Serafini
_______________________________________________ 1º Examinador: Prof. Dr. Jose Lamartine Soares Sobrinho
_______________________________________________
2º Examinador: Prof. Dra. Juliana Cordeiro Cardoso
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, fonte inesgotável de estímulo ao meu crescimento profissional
AGRADECIMENTOS
“Se hoje posso ver mais longe, foi por estar de pé sobre ombro de gigantes”
Isaac Newton
Aqui, agradeço a todos os gigantes que me acolheram sobre seus ombros e
me mostraram o caminho que me faz feliz e realizada.
- A Deus por sua infinita bondade e misericórdia. Obrigada Senhor por iluminar
os meus caminhos e ouvir as minhas preces.
- Aos meus pais José e Joseane, meus primeiros mestres. Que sonham comigo
e vibram intensamente nas minhas vitórias. Obrigada meus amores essa conquista é
dedicada a vocês. Exemplos de garra e perseverança.
- A minha irmã, Patrícia por compartilhar todos os momentos desde os mais
difíceis aos mais felizes.
- Ao meu namorado Vinícius, pelo amor, compreensão, incentivo e paciência.
- A minha amiga e orientadora Mairim Serafini. Minha admiração por você é
enorme. Sempre me espelhei nas suas ações e tem muito de você na pessoa que me
tornei. Obrigada por todos os ensinamentos.
- Ao Prof. Adriano Antunes que apresentou a pesquisa acadêmica e me fez
perceber o quanto é gratificante fazer aquilo que nos fascina. Desenvolver pesquisa
me fascina. Obrigada professor pela amizade e incentivo constante.
- Aos colaboradores do nosso grupo de pesquisa que são fundamentais na
realização deste e de outros trabalhos.
- A todos integrantes do LeFT, que são a força motriz dos produtos gerados no
nosso estimado laboratório. Em especial agradeço a Grace, Yasmim e aos meus
queridos ICs Bruna, Dayanne, Francielly, Igor, Isabella, Saulo e Tattiany pela
dedicação e amizade.
- Aos meus amigos do mestrado Francielly, Heitor, Jucy, Marília, Paulinha e
Priscila pelo carinho e por compartilharem uma fase tão importante da minha vida.
- A todos que fazem o NPGME.
- A Fapitec pelo financiamento através da bolsa concedida para realização do
Mestrado.
RESUMO OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DE COMPLEXOS SUPRAMOLECULARES DE ÓLEO ESSENCIAL E SUBSTÂNCIA ISOLADA EM CICLODEXTRINAS, PAULA DOS PASSOS MENEZES. ARACAJU, 2015
Os óleos essenciais são metabólitos secundários das plantas constituídos de
terpenos. Tais moléculas orgânicas caracterizam-se por apresentar atividades farmacológicas importantes como anti-inflamatória, antinociceptiva, antimicrobiana, dentre outras. Dessa forma, o óleo essencial da Hyptis pectinata (OEHP), uma planta odorífera nativa dos estados de Alagoas e Sergipe e bastante utilizada pela população, tem despertado interesse dos pesquisadores com o objetivo de validar o seu uso popular. Além disso, o isopulegol (ISOP), um monoterpeno importante na indústria por suas propriedades flavorizantes e medicinais tem sido objeto de investigação na pesquisa científica. Entretanto, o OEHP, bem como o ISOP apresentam características físico-químicas como solubilidade limitada em água, elevada volatilização, fotossensibilidade e fácil oxidação. Nessa perspectiva, uma alternativa para preservar as características dessas substâncias é a formação de complexos supramoleculares envolvendo ciclodextrinas (CDs). As CDs apresentam uma estrutura molecular adequada para a formação de complexos de inclusão uma vez que possuem cavidade apolar e superfície hidrofílica. Assim, os complexos de inclusão de óleos essenciais e CDs melhoram as características físico-químicas dessas moléculas de modo a otimizar a atividade farmacológica das mesmas. Diante disto, o objetivo do presente estudo foi realizar a identificação dos constituintes químicos do OEHP através da cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas com detector de chamas (CG-EM/DIC) e a partir daí preparar as amostras com β-CD e do ISOP em α- e β-CDs através dos métodos da mistura física (MF), malaxagem (MA) e co-evaporação (CE). Além disso, foi realizada a caracterização físico-química das amostras através das técnicas de calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG), espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), microscopia eletrônica de varredura, difração de raios-X (DRX), eficiência de complexação através da CG-EM/DIC, ensaio farmacológico de formalina com o melhor complexo obtido do OEHP e estudo de modelagem molecular (Docking) para o ISOP e CDs. Diante dos resultados obtidos, foram observados três constituintes majoritários no OEHP, (E)-cariofileno (54,07%), óxido de cariofileno (14,91%) e germacreno-D (7,46%). Os resultados de caracterização físico-química demonstraram que o CE foi o melhor método para complexar o (E)-cariofileno e o germacreno-D, o óxido de cariofileno não foi complexado e isso pode estar relacionado a sua baixa afinidade pela cavidade da β-CD. O teste de formalina demonstrou melhor atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do OEHP/β-CD quando comparado com o OEHP puro que pode ser atribuída ao elevado percentual de (E)-cariofileno complexado. Em relação ao ISOP, foi observado que a α-CD forma complexos de inclusão mais estáveis que a β-CD, pela análise de Docking, e a MA/α-CD forneceu uma maior razão de complexação em relação a MF e CE. Já o CE obtido com β-CD apresentou maior taxa de inclusão molecular. Assim, as técnicas utilizadas foram eficientes na complexação do OEHP e ISOP.
Palavras-Chave: α-ciclodextrina; β-ciclodextrina; monoterpeno; plantas medicinais
ABSTRACT OBTAINMENT AND PHYSICOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF COMPLEXES SUPRAMOLECULARS ESSENTIAL OIL AND SUBSTANCE ISOLATED ON CYCLODEXTRINS, PAULA DOS PASSOS MENEZES. ARACAJU, 2015
The essential oils, which are secondary metabolites produced by plants. These
metabolites are part of the group of terpenes. Such organic molecules are characterized by presenting important pharmacological activities such as anti-inflammatory, antinociceptive, antimicrobial, among others. Thus, the essential oil of Hyptis pectinata (EOHP), a native fragrant plant of the states of Alagoas and Sergipe and widely used by the population, has attracted attention of researchers in order to validate its popular use. In addition, the isopulegol (ISOP), a major monoterpene in the industry for their flavoring properties and medicinal has been the subject of research in scientific research. However, EOHP present ISOP and the physico-chemical characteristics and limited water solubility, high volatilization photosensitivity and easy oxidation. In this perspective, an alternative to preserve the characteristics of these substances is the formation of supramolecular complexes involving cyclodextrins (CDs). The CDs have a molecular structure suitable for the formation of inclusion complexes since they have polar and hydrophilic surface cavity. Thus, the inclusion complex of essential oils and CDs improve the physico-chemical properties of these molecules to optimize the pharmacological activity thereof. Hence, the aim of this study was to identify the chemical constituents of OEHP by gas chromatography coupled to mass spectrometry with flame detector (GC-MS/FID) and from there to prepare the samples with β -CD and ISOP in the α- and β-CD by the methods of the physical mixture (PM), paste complexation (PC) and slurry complexation (SC). Furthermore, the physico-chemical characterization of the samples through the techniques of differential scanning calorimetry (DSC) was performed thermogravimetry/derivative thermogravimetry (TGA/DTG) absorption spectrophotometry in the infrared Fourier transform spectroscopy (FT-IR) scanning electron microscopy, X-ray diffraction (XRD), complexation efficiency by GC-MS/FID, pharmacological test formalin with the best complex obtained from OEHP and study of molecular modeling (docking) to isopulegol and CDs. Based on these results, we observed three major constituents in OEHP, (E) -caryophyllene (54.07%), caryophyllene oxide (14.91%) and germacrene-D (7.46%). The results of physicochemical characterization showed that the EC was the best method to complex (E)-caryophyllene and germacrene-D, caryophyllene oxide has not been complexed and this may be related to its low affinity for the cavity of β- CD. The formalin test showed a better antinociceptive and anti-inflammatory OEHP / β-CD when compared with pure EOHP that can be attributed to the high percentage of (E) -caryophyllene complexed. Regarding isopulegol, it was observed that α-CD complexes more stable inclusion of the β-CD, as showed in the docking analysis and PC/α-CD gave a higher ratio of complexing with respect to PM and SC. But the SC obtained with β-CD showed the highest molecular inclusion. Thus, the techniques used were efficient in the complexation of EOHP and ISOP.
Keywords: α-cyclodextrin; β-cyclodextrin; monoterpene; medicinal herbs
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Atividades farmacológicas descritas para a Hyptis pectinata 8
Tabela 2: Atividades farmacológicas descritas para o ISOP 11
Tabela 3: Características das CDs naturais 12
Tabela 4: Medicamentos comercializados contendo CDs 16
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura química da cadeia carbônica do isopreno 4
Figura 2: Representação esquemática dos principais constituintes dos
óleos essenciais
5
Figura 3: Estrutura química do (-)-ISOP (esquerda) e do (+)-ISOP (direita) 10
Figura 4: Estrutura química das CDs naturais 12
Figura 5: Estrutura e respectivos tamanhos das cavidades da α-, β- e γ-
CDs
13
Figura 6: Distribuição relativa das CDs utilizadas no mercado farmacêutico 15
Figura 7: Representação esquemática da formação de complexo de
inclusão entre uma CD e p-xileno. As esferas representam as
moléculas de água
17
Figura 8: Ilustração esquemática da associação de uma molécula
hidrofóbica e uma CD em diferentes razões molares
18
Figura 9: Modelo esquemático da farmacocinética dos complexos de
inclusão
19
Figura 10: Comparação esquemática da digestão das CDs naturais por
amilases. As CDs que são digeridas lentamente por amilases são
rapidamente digeridas por bactérias
20
Figura 11: Dissolução e absorção do piroxicam livre e complexado em β-
CD. kd: constante de dissolução, kc: constante de equilíbrio para
formação de complexos de inclusão e ka: constante da razão de
absorção
20
Figura 12: Conformação de menor energia do complexo de inclusão da
miricetina em β-CD obtido por Docking utilizando o software
Hiperchem® (A) e (B) representação esquemática do mesmo
complexo onde amarelo representa a miricetina e as cores
branca e vermelha a β-CD
28
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A Fator pré-exponencial
CAPS Cápsula
CDs Ciclodextrinas
CG/EM Cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
CMEβCD O-carboximetil-O-etil-β-CD
COL Colírio
COMP Comprimido
DRX Difração de raios X
DSC Calorimetria exploratória diferencial
ΔG Energia livre de Gibbs
ΔH Entalpia
ΔS Entropia
E Energia de ativação
EA Extrato aquoso
EC Extrato clorofórmico
EE Extrato etanólico
EM Extrato metanólico
EUA Estados Unidos
FDA Food and Drug Administration
FTIR Espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com
transformada de Fourier
HPβCD Hidroxipropil-β-CD
II Infusão intravenosa
ISO International Organization for Standardization
ISOP (-)-isopulegol
Kc Constante de estabilidade
MβCD Metil-β-CD
MEP 2-C-metil-eritritol-4-fosfato
MEV Microscopia eletrônica de varredura
NA Não houve associação
OE Óleo essencial
OEHP Óleo essencial de Hyptis pectinata
PA Panjab University, India
POM Pomada
RMβCD β-CD randomicamente metilada
SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD
SI Solução intravenosa
SN Solução nasal
SIM Solução intramuscular
SO Substrato
SO Solução oral
SP Solução parenteral
SPS Supositório
RMN Ressonância magnética nuclear
TAβCD Triacetil-β-CD
TB Comprimido
TG/DTG Termogravimetria/termogravimetria Derivada
UEN University of Erlangen-Nuernberg
UFAL Universidade Federal de Alagoas
UFC Universidade Federal do Ceará
UNAM Universidade Nacional Autônoma do México
UFPE Universidade Federal de Pernambuco
UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
UFS Universidade Federal de Sergipe
UV/vis Ultravioleta/visível
SUMÁRIO CAPÍTULO I ............................................................................................................................... 1
1 INTRODUÇÃO ……………………………………………………………….………………………2
2 REVISÃO DA LITERATURA ………………………………………………………………………3
2.1 Óleos essenciais ................................................................................................................. 3
2.2. Mono- e sesquiterpenos ................................................................................................... 38
2.3. Limitações farmacotécnicas e estratégias ....................................................................... 41
2.3.1 Lipossomas .................................................................................................................... 41
2.3.2 Nanopartículas ............................................................................................................... 42
2.3.3 Micropartículas ............................................................................................................... 42
2.3.4 Ciclodextrinas ................................................................................................................. 42
2.4 Complexos de inclusão ..................................................................................................... 48
2.5 Métodos de obtenção de complexos de inclusão ............................................................. 52
2.6 Técnicas analíticas de caracterização de complexos de inclusão ................................... 54
3 OBJETIVO GERAL .............................................................................................................. 64
3.1 Objetivos específicos ........................................................................................................ 64
CAPÍTULO II ........................................................................................................................... 65
Physicochemical characterization and analgesic effect of inclusion complexes of essential oil from Hyptis pectinata L. Poit leaves with β-cyclodextrin .......................................................................
CAPÍTULO III .......................................................................................................................... 89
Docking, physico-chemical properties of <alpha>- and <beta>-Cyclodextrin Complex Containing Isopulegol - A comparative study
CAPITULO IV …..………………………………………………………………………………….108 Conclusão geral, perspectivas, referências
4 CONCLUSÃO GERAL……………………………………………………………..……………109
5 PERSPECTIVAS………………………………………………………………………………….110
6 REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 111
ANEXOS
1
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO, REVISÃO DE LITERATURA E
OBJETIVOS
2
1 INTRODUÇÃO
Uma análise das estratégias utilizadas na descoberta de novos medicamentos
demonstrou que 36% das moléculas aprovadas nos Estados Unidos pelo Food and
Drug Administration (FDA) entre os anos de 1999 e 2008 foram produtos naturais ou
derivados de produtos naturais (DU; TANG, 2014). Nesse contexto inserem-se os
óleos essenciais que são misturas complexas de compostos orgânicos voláteis
produzidos como metabólitos secundários de plantas e constituídos por terpenos. Os
monoterpenos perfazem 90% dos óleos essenciais e apresentam propriedades
farmacológicas relevantes, tais quais antimicrobiana, hipotensiva, anti-inflamatória e
antipruriginosa (GUIMARAES; QUINTANS; QUINTANS, 2013). Todavia, a
insolubilidade aquosa, baixa razão de dissolução, instabilidade e curta meia-vida
atreladas a facilidade de oxidação e hidrólise limitam a utilização terapêutica dos
terpenos (SIQUEIRA-LIMA et al., 2014; TUREK; STINTZING, 2013).
Dentre os óleos essenciais com potencial terapêutico largamente estudados na
Região Nordeste do Brasil, encontra-se o óleo essencial de Hyptis pectinata (OEHP).
A Hyptis pectinata (L.) Poit (Lamiaceae) é um arbusto odorífero de baixa densidade
foliar que ocorre nos estados de Alagoas e Sergipe, sendo conhecida popularmente
como “sambacaitá” ou “canudinho” (NASCIMENTO, P. F. et al., 2008; PAIXAO et al.,
2013; SANTOS, P. O. et al., 2008). No grupo dos terpenos, encontra-se o (-)-
isopulegol (ISOP), p-ment-8-en-3-ol, um monoterpeno alcóolico encontrado nos óleos
essenciais de várias plantas tais como Eucalyptus citriodora e Corymbia citriodora
com propriedades ansiolíticas e anticonvulsivantes já relatadas na literatura
(CEBORSKA; SZWED; SUWINSKA, 2013). Entretanto, possui as mesmas limitações
de alguns óleos essenciais como odor desagradável e elevada volatilidade (CHEN, Y.
et al., 2014). Dessa forma, pesquisas recentes têm demonstrado que é possível
contornar a baixa solubilidade e melhorar as características físico-químicas de
moléculas instáveis, tais como terpenóides (MENEZES, P. P. et al., 2014; MENEZES,
P.P. et al., 2012; SAMBASEVAM et al., 2013; SERAfiNI et al., 2011; SERAFINI et
al., 2012; XU et al., 2014).
Nesse cenário, inserem-se as ciclodextrinas (CDs), oligossacarídeos cíclicos com
6-8 unidades de glicopiranose (α-, β-, γ-), respectivamente. O limitado número de
grupos hidroxila livres orientados para o interior da cavidade faz com que esta
3
apresente um caráter hidrofóbico, enquanto o exterior é hidrofílico e isto as
credenciam como veiculadores eficientes de moléculas como compostos inorgânicos,
fármacos, e terpenos em meios aquosos (HĂDĂRUGĂ, N. G., 2012; PORTE; PORTE;
OLIVEIRA, in press; RAJENDIRAN; S.; J., 2013). A formação de complexos de
inclusão com CDs tem sido amplamente utilizada para melhorar a biodisponibilidade
de fármacos fracamente solúveis, aumentando sua solubilidade, dissolução e/ou a
permeabilidade (BADR-ELDIN; ELKHESHEN; GHORAB, 2008; MENEZES, P. P. et
al., 2014; MENEZES, P.P. et al., 2012).
Diante disto, nosso grupo de estudo vem desenvolvendo vários trabalhos no
sentido de melhorar as propriedades físico-químicas dos principais terpenos com
atividades farmacológicas promissoras e com isso otimizando o efeito dessas
moléculas em alguns modelos pré-clínicos (LINS et al., 2014; MENEZES, P. P. et al.,
2014; MENEZES, P.P. et al., 2012; NASCIMENTO, S. S. et al., 2014; PS et al., 2014;
QUINTANS-JUNIOR et al., 2013; QUINTANS JDE; MENEZES; et al., 2013; SERAfiNI
et al., 2011; SIQUEIRA-LIMA et al., 2014). Diante do potencial terapêutico
demonstrado pelos óleos essenciais e substâncias isoladas aliado a reduzida
solubilidade aquosa e características físico-químicas desfavoráveis à administração
destas moléculas, a formação de complexos de inclusão do OEHP e do ISOP torna-
se interessante com o objetivo de caracterizar o material de modo a melhorar a
biodisponibilidade e facilitar a administração destas moléculas.
A presente dissertação está dividida em quatro capítulos, sendo o primeiro
referente a introdução, revisão da literatura e objetivos, cuja finalidade foi fazer uma
abordagem do tema e elucidar os objetivos a serem alcançados; os capítulos 2 e 3
apresentam os artigos gerados no decorrer da pesquisa e por fim, o quarto capítulo
apresenta a conclusão, perspectivas desta pesquisa, bem como as referências
utilizadas.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Óleos essenciais A Organização Internacional de Normatização, do inglês “International Organization
for Standardization” (ISO), define óleo essencial como um “produto obtido de material
vegetal por destilação com água ou vapor ou a partir do epicarpo de frutas cítricas por
um processo mecânico, ou a seco por destilação” (ISO, 1997). Os óleos essenciais
4
são extraídos de várias plantas aromáticas, geralmente localizadas em países de
clima temperado a quente, como os países mediterrâneos e tropicais, onde eles
representam uma parte importante da farmacopeia tradicional (BAKKALI et al., 2008).
Nas últimas décadas, o potencial terapêutico de óleos essenciais e os seus
constituintes tem sido alvo de pesquisadores na busca de novos medicamentos de
origem vegetal, no tratamento e prevenção de diversas doenças (DE CASSIA DA
SILVEIRA et al., 2014)
Além disso, os óleos essenciais caracterizam-se por serem metabólitos
secundários das plantas, são geralmente incolores, solúveis em lipídios e solventes
orgânicos, apresentam densidade inferior à da água e possuem elevada volatilidade
(BILIA et al., 2014). Eles incluem hidrocarbonetos (monoterpenos e sesquiterpenos)
(Figura 2), bem como compostos oxigenados (álcoois, ésteres, éteres, aldeídos,
cetonas, lactonas, fenóis e éteres fenólicos) (BILIA et al., 2014). Os terpenos
englobam mais de 50.000 estruturas de diversos compostos químicos, os quais são
classificados pelo número de unidades isoprênicas (C5H8) (Figura 1) (BARRETO et
al., 2014; SOUZA et al., 2014).
Figura 1: Estrutura química da cadeia carbônica do isopreno.
Fonte Lin et al, 2013 (LIN et al., 2013)
Ademais, esses metabólitos secundários são constituídos de compostos voláteis
(principalmente mono- e sesquiterpenos, fenilpropanóides, e outros compostos
voláteis) que exercem atividades biológicas em animais, humanos e outras plantas
(ADORJAN; BUCHBAUER, 2010). Em virtude disso, os óleos essenciais são
largamente utilizados na indústria alimentícia, farmacêutica e na agricultura, devido as
suas propriedades antimicrobiana, antiviral, nematicida, fungicida, inseticida, bem
como antioxidantes ou estimulantes do sistema nervoso central (TUREK; STINTZING,
2013).
5
Tendo em vista a grande diversidade de propriedades farmacológicas descritas
para os óleos essenciais, são necessários protocolos científicos que validem o uso
popular. Nesse contexto, a triagem antinociceptiva e anti-inflamatória engloba os
testes de contorções abdominais induzida por ácido acético, formalina e placa quente.
O teste de contorções abdominais é descrito como um modelo de nocicepção
inflamatória visceral e conduz a avaliação a nível central e periférico de determinadas
substâncias. Isso ocorre porque o ácido acético ativa diretamente os canais catiônicos
localizados nas vias aferentes primárias e desencadeia a liberação dos mediadores
inflamatórios levando a liberação de aspartato e glutamato no fluido cérebro-espinhal.
Após injeção intraperitoneal, o animal apresenta constrição da parede abdominal que
pode ser acompanhada por rotação do tronco e extensão dos membros posteriores
(BRITO et al., 2012; MELO, M. S. et al., 2010).
Partindo desse conceito, o teste da formalina conduz a uma resposta bifásica e é
um instrumento bastante utilizado nos estudos de dor em animais, sendo mais válido
que testes mecânicos e térmicos. A primeira fase do teste ocorre logo após a injeção
de formalina e estende-se por cinco minutos (dor neurogênica ou aguda), sendo
caracterizada pela estimulação química direta dos nociceptores das fibras aferentes
do tipo C e, em parte, das fibras do tipo Aδ estando associada à liberação de
aminoácidos excitatórios, óxido nítrico e substância P. Já a segunda fase (15 a 30
minutos após a injeção de formalina), ocorre a nível periférico e caracteriza-se como
inflamatória por meio da liberação dos mediadores pró-inflamatórios e pode ser
bloqueada pelos inibidores da ciclo-oxigenase (COX). O intervalo de quiescência entre
a primeira e a segunda fase é resultado de uma inibição da transmissão nociceptiva
através de circuitos supra-espinhais e espinhais. Nessa perspectiva, a vantagem
deste método consiste na avaliação de dois tipos distintos de dor, possibilitando a
investigação de analgésicos com diferentes mecanismos de ação (ALMEIDA et al.,
2013; BRITO et al., 2012; DALLEL et al., 1995; QUINTANS, J. S. S. et al., 2014).
Por fim, o teste da placa quente avalia o tempo em que os animais permanecem sobre
uma chapa metálica aquecida (55 ± 0,5ºC) até reagirem ao estímulo térmico com o
comportamento de levantar ou lamber as patas. Os animais são observados 30, 60,
90 e 120 minutos após as substâncias em análise serem administradas, quanto ao
efeito central das mesmas através da ativação dos receptores vanilóides (BARROT,
2012; JULIUS; BASBAUM, 2001).
6
Assim, diversos estudos têm reportado a atividade farmacológica de óleos
essenciais, principalmente aqueles oriundos das plantas medicinais comuns na região
Nordeste do Brasil. Em 2008, Arrigoni-Blank et al demonstraram o efeito
antinociceptivo do OEHP por vias centrais e periféricas (ADORJAN; BUCHBAUER,
2010; ARRIGONI-BLANK et al., 2008). Caldas et al e Diniz et al, atestaram o potencial
antiulcerogênico do óleo essencial da Hyptis martiusi e Hyptis crenata,
respectivamente certificando o uso popular destas plantas (CALDAS et al., 2011;
DINIZ et al., 2013). Em adição, um estudo de Siqueira et al, evidenciaram o potencial
anticâncer in vitro e in vivo da Xylopia laevigata (QUINTANS JDE; SOARES; et al.,
2013). Os óleos essenciais de Lippia sidoides, Lippia origanoides, Chenopodium
ambrosioides e Ocimum. gratissimum demonstraram baixa toxicidade e significativa
atividade tripanocida no estudo de Borges et al (BORGES et al., 2012).
Portanto, na avaliação da estabilidade de óleos essenciais, deve-se considerar que
a composição química pode variar a depender de fatores tais como, saúde da planta,
fase de crescimento, habitat, incluindo clima, fatores edáficos, bem como a época da
colheita (SCHMIDT, 2010). Hădărugă et al descreveram que alguns constituintes dos
óleos essenciais podem sofrer reação de auto-oxidação em meio a oxigênio ou
moléculas oxidantes. No artigo, os autores chamaram atenção para o limoneno, que
sofre auto-oxidação e forma o diepóxi-limoneno, um composto carcinogênico. Esta
reação ocorre também com o cariofileno, formando o óxido de cariofileno, e pode ser
bloqueada através da complexação em ciclodextrinas (HĂDĂRUGĂ, N. G.;
HĂDĂRUGĂ; ISENGARD, 2012). Por outro lado, alguns terpenóides oxigenados, tais
como mentol, 1,8- cineol e mentona não formam hidro peróxidos por oxidação, mas
são diretamente convertidos em cetonas, ácidos e aldeídos (TUREK; STINTZING,
2013).
Dentre as plantas medicinais produtoras de óleos essenciais do nordeste
brasileiro, encontra-se a Hyptis pectinata. O gênero Hyptis consiste de
aproximadamente 400 espécies distribuídas do sul dos Estados Unidos até a
Argentina e exibe a maior diversidade morfológica no bioma Cerrado brasileiro
(PAIXAO et al., 2013). As plantas pertencentes a este gênero são de grande
importância econômica e etnofarmacológica (FRANCO et al., 2011 ). Além disso,
possuem propriedades medicinais importantes e são muito utilizadas na medicina
popular para o tratamento de várias condições clínicas tais como distúrbios
7
gastrointestinais, doenças de pele, infecções, congestão nasal, febre, dores e
inflamação (PAIXAO et al., 2013; RAYMUNDO et al., 2011).
Diante disto, a Hyptis pectinata (L.) Poit, pertencente à família Lamiaceae, é
popularmente conhecida no Brasil como "sambacaitá" ou "canudinho", apresenta-se
como um arbusto difundido, aromático, bastante cultivado na região nordeste do
Brasil. Ademais, a Hyptis pectinata é uma planta herbácea com folhas aromáticas e
flores pequenas bilabiais que são agrupados em inflorescências axilares (FALCAO et
al., 2013). No Brasil, esta espécie é extensivamente utilizada pela população, em
especial no Estado de Sergipe, para o tratamento de inflamação, infecções
bacterianas, dor e câncer (SERAFINI et al., 2012) sob as formas de infusos ou
decoctos (ARRIGONI-BLANK et al., 2008).
Tendo em vista a grande diversidade de propriedades farmacológicas descritas
para os óleos essenciais, são necessários protocolos científicos que validem o uso
popular. Nesse contexto, a triagem antinociceptiva e anti-inflamatória engloba os
testes de contorções abdominais induzida por ácido acético, formalina e placa quente.
O teste de contorções abdominais é descrito como um modelo de nocicepção
inflamatória visceral e conduz a avaliação a nível central e periférico de determinadas
substâncias. Isso ocorre porque o ácido acético ativa diretamente os canais catiônicos
localizados nas vias aferentes primárias e desencadeia a liberação dos mediadores
inflamatórios levando a liberação de aspartato e glutamato no fluido cérebro-espinhal.
Após injeção intraperitoneal, o animal apresenta constrição da parede abdominal que
pode ser acompanhada por rotação do tronco e extensão dos membros posteriores
(BRITO et al., 2012; MELO, M. S. et al., 2010).
Partindo desse conceito, o teste da formalina conduz a uma resposta bifásica e é
um instrumento bastante utilizado nos estudos de dor em animais, sendo mais válido
que testes mecânicos e térmicos. A primeira fase do teste ocorre logo após a injeção
de formalina e estende-se por cinco minutos (dor neurogênica ou aguda), sendo
caracterizada pela estimulação química direta dos nociceptores das fibras aferentes
do tipo C e, em parte, das fibras do tipo Aδ estando associada à liberação de
aminoácidos excitatórios, óxido nítrico e substância P. Já a segunda fase (15 a 30
minutos após a injeção de formalina), ocorre a nível periférico e caracteriza-se como
inflamatória por meio da liberação dos mediadores pró-inflamatórios e pode ser
bloqueada pelos inibidores da ciclo-oxigenase (COX). O intervalo de quiescência entre
8
a primeira e a segunda fase é resultado de uma inibição da transmissão nociceptiva
através de circuitos supra-espinhais e espinhais. Nessa perspectiva, a vantagem
deste método consiste na avaliação de dois tipos distintos de dor, possibilitando a
investigação de analgésicos com diferentes mecanismos de ação (ALMEIDA et al.,
2013; BRITO et al., 2012; DALLEL et al., 1995; QUINTANS, J. S. S. et al., 2014).
Por fim, o teste da placa quente avalia o tempo em que os animais permanecem sobre
uma chapa metálica aquecida (55 ± 0,5ºC) até reagirem ao estímulo térmico com o
comportamento de levantar ou lamber as patas. Os animais são observados 30, 60,
90 e 120 minutos após as substâncias em análise serem administradas, quanto ao
efeito central das mesmas através da ativação dos receptores vanilóides (BARROT,
2012; JULIUS; BASBAUM, 2001).
Assim, diversos estudos têm reportado a atividade farmacológica de óleos
essenciais, principalmente aqueles oriundos das plantas medicinais comuns na região
Nordeste do Brasil. Em 2008, Arrigoni-Blank et al demonstraram o efeito
antinociceptivo do OEHP por vias centrais e periféricas (ADORJAN; BUCHBAUER,
2010; ARRIGONI-BLANK et al., 2008). Caldas et al e Diniz et al, atestaram o potencial
antiulcerogênico do óleo essencial da Hyptis martiusi e Hyptis crenata,
respectivamente certificando o uso popular destas plantas (CALDAS et al., 2011;
DINIZ et al., 2013). Em adição, um estudo de Siqueira et al, evidenciaram o potencial
anticâncer in vitro e in vivo da Xylopia laevigata (QUINTANS JDE; SOARES; et al.,
2013). Os óleos essenciais de Lippia sidoides, Lippia origanoides, Chenopodium
ambrosioides e Ocimum. gratissimum demonstraram baixa toxicidade e significativa
atividade tripanocida no estudo de Borges et al (BORGES et al., 2012).
Na Tabela 1 estão apresentadas as atividades farmacológicas descritas até o
presente momento para o extrato e óleo essencial da Hyptis pectinata, bem como os
constituintes químicos aos quais são atribuídas as suas atividades. Dessa forma,
merece destaque o pioneirismo da Universidade Federal de Sergipe com estudos
utilizando a espécie em discussão com o objetivo de validar o seu uso popular.
9
Tabela 1: Atividades farmacológicas descritas para a Hyptis pectinata.
Autor, ano Preparação* Atividade farmacológica
Constituintes responsáveis pela ação
Instituição que sediou a pesquisa
De Queiroz et al., 2014 (DE QUEIROZ et al., 2014)
EA Antileishmanicida β-cariofileno (1), óxido de cariofileno (2), ácido
sambacaitárico (3), 3-O-metil ácido sambacaitárico (4), 3-O-
metil ácido rosmarínico (5)
UFAL
Falcão et al., 2013 (FALCAO et al., 2013)
EE Antileishmanicida Compostos 3,4 e 5 UFPE
Paixão et al., 2005 (PAIXAO et al., 2013)
EA Efeito antinociceptivo neurogênico e orofacial
NA** UFS
Raymundo et al., 2011 (RAYMUNDO et al., 2011)
OE Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório
Composto 1 UFRJ
Nascimento et al., 2008 (NASCIMENTO, P. F. et al.,
2008)
OE Antimicrobiana Compostos 1, 2 e β-pineno (6)
UFS
Arrigoni-Blank et al., 2008 (ARRIGONI-BLANK et al.,
2008)
OE Antinociceptiva Ação combinada dos compostos
UFS
Silva et al., 2008 (SILVA, W. J. et al., 2008)
OE Larvicida Composto 2 UFS
Melo et al., 2006 (MELO, G. B. et al., 2006)
EA Regeneração hepatocelular
NA UFS
Lisboa et al., 2005 (LISBOA et al., 2006)
EM Antinociceptiva NA UFS
Melo et al., 2005 (MELO, G. B. et al., 2005)
EA Regeneração hepática NA UFS
Fragoso-Serrano et al., 2005 (FRAGOSO-SERRANO;
GIBBONS; PEREDA-MIRANDA, 2005)
EC Atividade anti-estafilocócica
Pectinolídeo H UNAM
Bispo et al., 2001 (BISPO et al., 2001)
EA Antinociceptiva e anti-edematogênica
NA UFS
*EA (extrato aquoso), EE (extrato etanólico com frações hexânica, metanólica e em acetato de etila), OE (óleo essencial), EM (extrato metanólico com frações hexânica, clorofórmica e em acetato de etila), EC (extrato clorofórmico),
**NA (não houve associação)
9
38
2.2. Mono- e sesquiterpenos Os terpenos representam o maior e mais diversificado grupo de metabólitos
secundários das plantas (GERSHENZON; DUDAREVA, 2007). De acordo com Irmisch
et al, os terpenos são constituídos de unidades isoprenóides (C5) que se originam tanto
na via do ácido mevalônico quanto na via do 2-C-metil-eritritol-4-fosfato (MEP) (IRMISCH
et al., 2014). A cabeça e a cauda das unidades isoprenóides são condensadas por
feniltransferases que formam o difosfato de geranil e difosfato de geranilgeranila. As
feniltransferases são fundamentais no metabolismo dos terpenos convertendo os
precursores ao grande número de moléculas desse grupo com esqueletos carbônicos
diferentes, como os hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15),
diterpenos (C20) e triterpenos (C30), tetraterpenos (C40) e politerpenos (C>40)
(DEGENHARDT; KOLLNER; GERSHENZON, 2009; KLEINE; MULLER, 2013).
Diante disto, os terpenos são moléculas estruturalmente simples, de baixo peso
molecular, altamente lipofílicas e estudos científicos tem reportado seu potencial clínico
como fármacos analgésicos (QUINTANS, J. S. et al., 2014). Os monoterpenos são
divididos em três subgrupos (Figura 2): acíclicos (geraniol, linalol, mirceno), monocíclicos
(α-terpineol, isopulegol, terpinoleno) e bicíclicos (α-pineno, cânfora, tujona). Em cada um
destes subgrupos, surgem outras classificações: hidrocarbonetos insaturados
(limoneno), álcoois (mentol), aldeídos e cetonas (mirtenal, carvona), lactonas (também
conhecidos como iridóides, nepetalactona) e tropolonas (γ-tujaplicina) (SANTOS, M. R.
V. et al., 2011). Guimarães et al demonstraram recentemente em uma revisão
sistemática, que os monoterpenos podem penetrar a barreira hematoencefálica e agir no
sistema nervoso central modulando importantes neurotransmissores como os
glutamatérgicos, serotoninérgicos, opióides e canabinóides sendo efetivos na dor
neuropática (GUIMARAES et al., 2013).
Os sesquiterpenos apresentam mais de 200 tipos de esqueletos carbônicos
conhecidos e perfazem um percentual de 5% dos constituintes químicos presentes nas
plantas (CUNHA NETO, 2006). Estes metabólitos secundários são predominantemente
formados a partir de pirofosfato farnesil ou nerolidil pirofosfato. Depois de perder o
resíduo pirofosfato, são sucedidas diferentes formas de ciclizações, de modo que há um
rearranjo do esqueleto através de intermediários carbocátions com migração do grupo
hidreto ou um grupo metil. Estas reações ocorrem em condições de baixo pH ou de
baixas temperaturas e originam diversos tipos de estruturas (PETRONILHO; COIMBRA;
39
ROCHA, 2014). Os sesquiterpenos atraíram considerável atenção dos químicos
orgânicos sintéticos e farmacologistas devido às suas estruturas químicas complexas e
diversificadas atreladas a uma vasta gama de atividades biológicas (LV et al., 2014),
incluindo atividade inseticida (WU, W. et al., 2001), citotóxica (CHEN, J. J. et al., 2006),
antitumoral (ARGHIANI et al., 2014; JIMENEZ et al., 2003), imunossupressora (WANG,
X. et al., 2005) e anti-inflamatória (ZHANG et al., 2014).
Figura 2: Exemplos de mono- e sesquiterpenos de ocorrência em óleos essenciais.
Monoterpenos
Sesquiterpenos
40
No grupo dos terpenos, merece destaque o (-)-isopulegol (C10H18O) (ISOP)
(Figura 3), um tipo de monoterpeno cíclico que pode ser obtido de óleos essenciais
de plantas como Melissa officinalis L. (BOUNIHI et al., 2013) ou através da
ciclização do (+)-citronelal, principal etapa do processo industrial para obtenção do
mentol (CHEN, Y. et al., 2014). Como o esqueleto do ISOP possui dois centros
estereogênicos em comparação com o (+)-citronelal, a reação de ciclização pode
conduzir a formação de quatro diastereoisômeros, nomeadamente: ISOP, (+)-iso-
ISOP, (+)-neo-ISOP e (+)-neoiso-ISOP (FIEGE, 2012). Além disso, o ISOP é
utilizado na indústria de cosméticos para preparo de fragrâncias finas, shampoos,
sabonetes e produtos não cosméticos como detergentes. Este monoterpeno foi
aprovado pelo FDA como flavorizante, apresenta baixa toxicidade dérmica e oral
e não existem indícios de carcinogenicidade desta molécula (BHATIA et al., 2008).
Figura 3: Estrutura química do (-)-ISOP (esquerda) e do (+)-ISOP (direita).
Fonte: Adaptado de Ceborska, Szwed e Suwinska, 2013 (CEBORSKA et al., 2013)
Nesse contexto, o ISOP como todo terpeno, é altamente volátil, possui baixa
solubilidade e é bastante utilizado na perfumaria em várias composições com notas
de flor de gerânio em função do seu cheiro agradável (ESCANDE; RENARD;
GRISON, 2014). Ademais, o ISOP tem demonstrado efeito na promoção da absorção
percutânea de drogas através da pele com baixa toxicidade, entretanto, sua elevada
volatilidade apresenta-se como uma limitação para este fim (CHEN, Y. et al., 2014).
Paik e colaboradores demonstraram que o óleo essencial de Zanthoxylum schinifolium
contendo ISOP pode induzir apoptose de células HepG2 de hepatócitos humanos
fazendo deste óleo uma alternativa a cura do carcinoma hepatocelular (CEBORSKA
et al., 2013; PAIK et al., 2005).
OH OH
41
A Tabela 2 apresenta as atividades farmacológicas descritas até o presente
momento para o ISOP.
Tabela 2: Atividades farmacológicas descritas para o ISOP.
Autor, ano Atividade farmacológica Instituição que sediou a pesquisa
Silva et al., 2007 (SILVA, M. I. et al., 2007)
Ansiolítico UFC
Silva et al., 2009 (SILVA, M. I.; MOURA; et al., 2009)
Gastroprotetor UFC
Silva et al., 2009 (SILVA, M. I.; SILVA; et al., 2009)
Anticonvulsivante UFC
Singh et al., 2009 (SINGH, H. P. et al., 2009)
Antioxidante PA
Kessler et al., 2014 (KESSLER et al., 2014)
Modulação dos receptores gabaérgicos α1β2 e α1β2γ2
UEN
2.3. Limitações farmacotécnicas e estratégias Apesar do reconhecido potencial farmacológico dos óleos essenciais e terpenos,
a hidrofobicidade apresenta-se como um desafio na produção de formas
farmacêuticas que os veiculem (SIQUEIRA-LIMA et al., 2014). Diante disto, algumas
estratégias farmacotécnicas já vêm sendo estudadas para superar esta limitação
como complexação com ciclodextrinas, lipossomas, nanopartículas e micropartículas
(KUMAR et al., 2012). Dentre as estratégias, as ciclodextrinas têm larga aplicação na
indústria de medicamentos devido a vantagens, como maior capacidade de
solubilização em relação às moléculas livres permitindo a incorporação de fármacos
pouco solúveis em água com o objetivo de aumentar estabilidade, biodisponibilidade
e conduzir a uma liberação controlada (DEVIL et al., 2010).
2.3.1 Lipossomas Os lipossomas consistem em membranas de bicamada lipídica com tamanho entre
90 a 150 nm, constituídos por fosfolipídios e colesterol, formando um núcleo aquoso.
Os fosfolipídios são compostos por cabeças hidrofílicas e caudas longas hidrofóbicas.
Assim, a sua estrutura permite incorporar moléculas hidrofílicas na cavidade interna e
lipofílicas entre a camada lipídica (ASLAN et al., 2013; CONNIOT et al., 2014;
SHARMA; JAIN; SAREEN, 2013). Os lipossomas possuem como alvo o sistema
fagocitário, em especial os macrófagos. Para garantir que o mesmo seja conduzido
até o local da ação, a superfície do lipossoma pode ser revestida com anticorpos ou
42
ligantes específicos que asseguram a fagocitose do lipossoma e a liberação do
fármaco no local da ação (ELOY et al., 2014).
2.3.2 Nanopartículas Nanopartículas lipídicas sólidas são sistemas coloidais transportadores que foram
desenvolvidos para encapsular, proteger e distribuir componentes lipofílicos
funcionais, tais como lipídios bioativos e fármacos. A fase líquida lipídica e uma
solução de surfactante aquoso são homogeneizados em uma temperatura acima da
temperatura de fusão dos lipídios, para produzir uma fina dispersão de uma emulsão
de óleo em água (HELGASON et al., 2009). A partícula é estabilizada por surfactantes,
que podem ser compostos de uma única camada, mas normalmente há uma mistura
de surfactantes (WEISS et al., 2008). Nanopartículas lipídicas têm uma estrutura
semelhante à nanoemulsões, com um tamanho que varia normalmente de 50 a 1000
nm. O núcleo lipídico em nanoemulsões é líquido, mas, em nanopartículas, o núcleo
lipídico está no estado sólido (ASSIS et al., 2012). Além disso, a taxa de liberação do
fármaco pode ser controlada pela modificação da cadeia lateral do polímero. As
nanopartículas podem consistir quer de uma matriz polimérica (nanoesferas) ou de
um sistema de reservatório em que um núcleo oleoso ou aquoso está rodeado por
uma fina parede polimérica (nanocápsulas). A maioria das nanopartículas poliméricas
são biodegradáveis e biocompatíveis na natureza e, por conseguinte, adequadas para
incorporar diversos agentes terapêuticos (CONNIOT et al., 2014)
2.3.3 Micropartículas A microencapsulação oferece a vantagem de proteger o fármaco contra as
reações de metabolismo pulmonar e fornece sua liberação prolongada e sustentada.
Formulações de micropartículas com liberação prolongada buscam aumentar a
adesão dos pacientes com terapias de longo prazo, permitindo a administração de
doses menos frequentes, além de reduzir os efeitos colaterais (PHAM; FATTAL;
TSAPIS, 2015). As micropartículas podem ser usadas em sistemas de liberação de
fármacos com a finalidade de contornar problemas de solubilidade e de controlar a
liberação do fármaco a partir da matriz polimérica através da difusão simples (GOYAL
et al., 2014).
2.3.4 Ciclodextrinas A descoberta das ciclodextrinas (CDs) se deu no ano de 1891, quando o
pesquisador francês A. Villiers descobriu uma mistura de substâncias cristalinas
43
oriundas da degradação do amido em uma cultura de Bacillus amylobacter e as
chamou de celulosina (ZAFAR; FESSI; ELAISSARI, 2014). Entre 1903-1911, o
microbiologista austríaco Franz Schardinger percebeu que o Bacillus macerans
poderia produzir grandes quantidades de dextrinas e as denominou de α- e β-dextrinas
e em 1935 a γ-dextrina foi isolada por K. Freudenberg (KURKOV; LOFTSSON, 2013;
VALLE, 2004; ZAFAR et al., 2014). A primeira patente relacionada as CDs foi descrita
em 1953 na Alemanha, onde foram descritas as propriedades básicas das CDs
naturais (α-, β- e γ-CDs) (LOFTSSON; BREWSTER, 2010).
Com o avanço da ciência, postulou-se que as CDs são oligossacarídeos
cíclicos compostos por unidades de glicose, unidas por ligações α-1,4-glicosídicas
com numerosos grupos hidroxilas que são sítios ativos disponíveis para a formação
de novas ligações (FOLCH-CANO; YAZDANI-PEDRAM; OLEA-AZAR, 2014). Elas
são caracterizadas como substâncias cristalinas, homogêneas e não higroscópicas
(SALUSTIO et al., 2011). As CDs naturais (α-, β- e γ-) (Figura 4) são compostas por
seis, sete e oito unidades de glicopiranose , respectivamente (CRINI, 2014).
Figura 4: Estrutura química das CDs naturais.
Fonte: http://unam.bilkent.edu.tr/.
As CDs têm a estrutura toroidal de um cone truncado com cavidades internas que
variam de 5 a 8 Å (Tabela 3) e (Figura 5). Os C ligados ao H do anel apontam para o
interior da molécula produzindo uma cavidade hidrofóbica. Os pares de elétrons não
ligantes das pontes de oxigênio glicosídicas são dirigidos para o interior da cavidade,
produzindo uma elevada densidade de elétrons e conferindo a CD o caráter de base
de Lewis. Os grupos hidroxila primários e secundários localizam-se nas bordas
estreitas e largas, respectivamente, do cone truncado. Como resultado deste arranjo
espacial dos grupos funcionais nas moléculas de CD, a cavidade apresenta um
44
carácter relativamente hidrofóbico, enquanto as superfícies externas são hidrofílicas
(VALENTE; SODERMAN, 2014), uma estrutura química interessante para formar
complexos de inclusão com moléculas de baixa solubilidade (MENEZES, P. P. et al.,
2014).
Tabela 3: Características das CDs naturais.
Tipo de CD
Diâmetro da cavidade/Å
Peso molecular (g/mol)
Solubilidade (g.100/mL)
Formas cristalinas
4,7-5,3 972 14,5 Lâminas hexagonais
6,0-6,5 1135 1,85 Paralelogramos monoclínicos
7,5-8,3 1297 23,2 Prismas quadráticos
Fonte: Adaptado de Salústio et al., 2011 e Challa et al., 2005 (CHALLA et al., 2005; SALUSTIO et
al., 2011)
Figura 5: Estrutura e respectivos tamanhos das cavidades da α-, β- e γ- CDs.
Fonte: Adaptado de Crini, 2014 (CRINI, 2014).
A CD fornece um microambiente hidrofóbico com dimensões apropriadas para
formação de complexos de inclusão com a molécula hospedeira (lipofílica). Nesse
caso, a forma motriz da complexação em solução é a liberação de moléculas de água
residuais da cavidade da molécula hóspede (CD) para o meio aquoso conduzindo a
um estado de energia mais baixo e consequentemente mais estável (VALLE, 2004).
45
Além disso, as CDs naturais possuem solubilidade aquosa (Tabela 3) de 14,5
g.cm-3 (α-CD), 1,85 g.cm-3 (β-CD) e 23,2 g.cm-3 (γ-CD), demonstrando a baixa
solubilidade da β-CD, em relação as demais (TEJASHRI; AMRITA; DARSHANA,
2013). Acredita-se que isso ocorre pela estrutura da β-CD, uma vez que suas
dimensões moleculares são ótimas para a formação de um anel de hidrogênio
intramolecular, capaz de neutralizar a hidratação da CD, reduzindo assim a sua
solubilidade. Devido à baixa solubilidade aquosa, a β-CD não é adequada para
administração por via parenteral (KURKOV; LOFTSSON, 2013; LOFTSSON;
BREWSTER, 2010).
Nos últimos anos, as propriedades físico-químicas e, consequentemente, a
capacidade de inclusão das CDs nativas foram melhoradas por modificação química
e enzimática dos seus grupos hidroxila reativos (GARCIA et al., 2014; SALUSTIO et
al., 2011). Dessa forma, as CDs modificadas de interesse farmacêutico como os
derivados hidrofílicos da β-CD tais quais: hidroxipropil-β-CD (HPβCD), metil-β-CD
(MβCD), β-CD-randomicamente metilada (RMβCD) tem sido utilizadas para melhorar
a solubilidade e razão de dissolução de fármacos pouco solúveis (GIDWANI; VYAS,
2014). Além disso, a aplicação da triacetil-β-CD (TAβCD), uma β-CD modificada
hidrofóbica caracteriza-se por promover a liberação prolongada de moléculas
lipofílicas. Existem também os derivados ionizáveis como a O-carboximetil-O-etil-β-
CD (CMEβCD) que dependem do pH para liberação da molécula complexada e a
sulfobutileter-β-CD (SBEβCD), uma β-CD sulfatada de liberação imediata (SALUSTIO
et al., 2011).
A α-CD é aproximadamente 1,5 vezes mais estável que a γ-CD que é 1,5 vezes
menos estável que a β-CD. Entretanto a formação de complexos de inclusão aumenta
a estabilidade das CDs (KURKOV; LOFTSSON, 2013). Adicionalmente, as CDs são
largamente utilizadas na indústria farmacêutica como carreadores de fármacos com o
objetivo de aumentar a solubilidade, estabilidade e biodisponibilidade de moléculas
bioativas. Ademais, as CDs possuem elevada biocompatibilidade e são aprovadas
pelo FDA, sendo autorizadas para uso humano (PINHO et al., 2014). O primeiro
produto farmacêutico lançado no mercado contendo CD, foi a prostaglandina E2/β-CD
na forma de tabletes sublinguais, no Japão em 1976 (LOFTSSON; BREWSTER,
2010).
46
Dessa forma, mais de 30 % dos novos produtos farmacêuticos lançados no
mercado mundial contém CDs, e desse percentual, 54,8 % são β-CD (Figura 7)
(TEJASHRI et al., 2013). De acordo com Kurkov e Loftsson, a razão para a elevada
utilização da β-CD reside na facilidade de sua produção e baixo custo, mais de 10.000
toneladas são produzidas anualmente, com um preço médio de cerca de 5 dólares
por kg (KURKOV; LOFTSSON, 2013).
Figura 6: Distribuição relativa das CDs utilizadas no mercado farmacêutico.
Fonte: KURKOV e LOFTSSON, 2013 (KURKOV; LOFTSSON, 2013)
A Tabela 4, adaptada de Loftsson e Brewster, 2010 (LOFTSSON; BREWSTER,
2010) apresenta alguns medicamentos lançados no mercado utilizando CDs.
47
Tabela 4: Medicamentos comercializados contendo CDs. Adaptada de Loftsson e Brewster, 2010
(LOFTSSON; BREWSTER, 2010).
Fármaco/CD Nome comercial Formulação* Indústria Farmacêutica/País
α-CD
Alprostadil Caverject Dual SI Pfizer/Europa Cefotiam-hexetil HCl Pansporin T COMP Takeda/Japão
Limaprost Opalmon COMP Ono/Japão PGE1 Prostavastin SP Ono/Japão;
Schwarz/Europa
β-CD
Benexate HCL Ulgut, Lonmiel CAPS Teikoku; Shionogi/ Japão
Cefalosporina Meiact COMP Meiji Seika/Japão Cetirizina Cetrizin COMP Losan
Pharma/Alemanha Clordiazepóxido Transillium COMP Gador/Argentina Dexametasona Glymesason POM, COMP Fujinaga/Japão Etinilestradiol e drospirenona
Yaz COMP Bayer/Europa e EUA
Meloxicam Mobitil COMP, SPS Medical Union/Egito Nicotina Nicorette COMP Pfizer/Europa Nimesulida Nimedex COMP Novartis/Europa Nitroglicerina Nitropen COMP Nihon Kayaku/Japão Omeprazol Omebeta COMP Betafarm/Europa
PGE2 Prostarmon E COMP Ono/Japão Piroxicam Brexin, Cicladon COMP, SPS Chiesi/ Europa
Aché/Brasil Ácido tiaprofênico Surgamyl COMP Roussel-
Maestrelli/Europa
HPβCD
Cisaprida Propulsid SPS Janssen/Europa Indometacina Indocid COL Chauvin/Europa Itraconazol Sporanox SO, SI Janssen/Europa e
EUA Mitomicina MitoExtra,
Mitozytrex II Novartis/Europa
SBEβCD
Aripiprazol Abilify SIM Bristol-Myers Squibb e Otsuka Pharm/EUA
Voriconazol Vfend SI Pfizer/EUA, Europa e Japão
Mesilato de ziprasidona Geodon, Zeldox SIM Pfizer/EUA e Europa
RMβCD
17β-estradiol Aerodiol SN Servier/Europa Cloranfenicol Clorocil COL Oftalder/Europa
γ-CD Tc-99 Teboroxime* CardioTec SI Squibb
Diagnostics/EUA
HPγCD
Diclofenaco sódico Voltaren Ophtha COL Novartis/Europa Tc-99 Teboroxime* Cardiotec SI Bracco/EUA
*Produto antigo utilizando a γ-CD foi substituído pela CD modificada correspondente no produto corrente. **SI (solução intravenosa), COMP (comprimido), SP
(solução parenteral), CAPS (cápsula), POM (pomada), SPS (supositório), COL (colírio), SO (solução oral), II (infusão intravenosa), SIM (solução intramuscular),
SN (solução nasal)
48
2.4 Complexos de inclusão Um complexo de inclusão (Figura 7) é formado por uma molécula hidrofóbica
(guest) e uma CD (host). A atração entre o hóspede e o hospedeiro se dá através de
interações não-covalentes incluindo forças de Van der Walls, interações eletrostáticas,
transferências de cargas, interações dipolo-dipolo, ligações de hidrogênio, fatores
estéricos e forças de dispersão (GIDWANI; VYAS, 2014; VALENTE; SODERMAN,
2014). Entretanto, a principal força envolvida é a substituição de moléculas de água
(Figura 7) da cavidade da CD conduzida por forças repulsivas entre as moléculas
envolvidas (polar-apolar) até o surgimento de forças favoráveis (apolar-apolar) na
cavidade da molécula hospedeira (MURA, 2014).
Figura 7: Representação esquemática da formação de complexo de inclusão entre uma CD e
álcool benzílico. As esferas representam as moléculas de água.
Fonte: Valle, 2004 e Crini, 2014 (CRINI, 2014; VALLE, 2004)
De acordo com Zafar et al, o complexo previne a decomposição natural do
fármaco complexado e promove a liberação do mesmo ao longo do tempo (ZAFAR et
al., 2014). Além disso, otimiza a solubilidade e dissolução da molécula complexada
(DE FREITAS et al., 2012; MENEZES, P. P. et al., 2014; MENEZES, P.P. et al.,
2012). Pesquisas recentes têm demonstrado que os complexos de inclusão
aumentam a biodisponibilidade via oral, reduzem irritações do trato gastrintestinal e
oculares, bem como eliminam odores ou sabores desagradáveis, reduzem efeitos
adversos e previnem interações fármaco-excipiente (GAMSIZ et al., 2013; GARCIA
et al., 2014).
49
Os complexos de inclusão podem ser formados em solução ou no estado sólido
e são conduzidos por dois fatores: O primeiro é estérico e depende da relação de
tamanho entre a CD e o hóspede. O segundo é a interação termodinâmica entre os
diferentes componentes do sistema (CD, fármaco e solvente). Para um complexo
formar, deve existir uma energia favorável que conduza o fármaco a cavidade da CD
(VALLE, 2004).
Em solução, os complexos são formados e dissociados continuamente, onde a
cavidade da CD é ocupada por moléculas de água de elevada entalpia (interação
apolar-polar) e substituída por moléculas menos polares. A afinidade do fármaco pela
CD se dá através da constante de estabilidade (constante de equilíbrio) do complexo
e ocorre frequentemente nas razões malares de 1:1, 2:1, 1:2 e 2:2 (Figura 8)
(LOFTSSON; BREWSTER, 2010; SALUSTIO et al., 2011). No estado sólido, o
fármaco pode ser complexado na cavidade, ou formar agregados fora da CD formando
um equilíbrio entre o fármaco complexado e o não complexado (SINGH, R. et al.,
2010).
Figura 8: Ilustração esquemática da associação de uma molécula hidrofóbica e uma CD em diferentes
razões molares.
3 Fonte: (CRINI, 2014).
Estudos demonstram que a CD não interfere no efeito do fármaco uma vez que
ela não penetra as membranas biológicas, apenas carreia o princípio ativo e o
protege de degradação enzimática. Primeiro ocorre a etapa de dissolução (Figura 9),
depois o fármaco é liberado, atravessa a membrana e é absorvido (GAMSIZ et al.,
2013; LOFTSSON; BREWSTER, 2011). As CDs são geralmente degradadas por
enzimas ou bactérias e eliminadas na urina por filtração glomerular (Figura 10).
50
Assim, quaisquer CD remanescente é eliminada por outras vias (KURKOV;
LOFTSSON, 2013).
Figura 9: Modelo esquemático da farmacocinética dos complexos de inclusão.
Fonte: Adaptado de Gamsiz et al., 2013 (GAMSIZ et al., 2013).
De acordo com Scarpignato, a β-CD aumenta a taxa de absorção do piroxicam
através do aumento da razão de dissolução do fármaco, conforme ilustrado na Figura
11. À medida que o fármaco dissolvido começa a penetrar o epitélio intestinal, o
complexo de inclusão, age como um reservatório, dissociando para liberar mais
piroxicam. Na administração oral, a β-CD é minimamente absorvida no trato
gastrintestinal e a pequena fração absorvida é excretada na urina sem ser
metabolizada. Dessa forma, uma vez que o fármaco é absorvido, a CD não apresenta
efeito adicional na sua farmacocinética (SCARPIGNATO, 2013).
51
Figura 10: Comparação esquemática da digestão das CDs naturais por amilases. As CDs que são digeridas lentamente por amilases são rapidamente digeridas por bactérias.
Fonte: Adaptado de Kurkov e Loftsson, 2013 (KURKOV; LOFTSSON, 2013).
Figura 11: Dissolução e absorção do piroxicam livre e complexado em β-CD. kd: constante de
dissolução, kc: constante de equilíbrio para formação do complexo de inclusão e ka: constante da razão de absorção.
Fonte: Scarpignato, 2013 (SCARPIGNATO, 2013).
52
2.5 Métodos de obtenção de complexos de inclusão Os métodos comumente utilizados para formação de complexos de inclusão
são co-precipitação, método de ultrassom, spray-drying, liofilização, fluido
supercrítico, co-evaporação e malaxagem (LOFTSSON; BREWSTER, 2012;
SALUSTIO et al., 2009; ZU et al., 2014).
Co-precipitação: este método é largamente utilizado nos laboratórios, envolve
elevadas concentrações de CD e água para dissolvê-la. A solução é submetida
a agitação sob temperaturas altas até formação do precipitado, o qual pode ser
obtido por decantação, filtração ou centrifugação e posteriormente lavado com
água ou solventes orgânicos polares. As desvantagens desse método são a
dificuldade de transposição de escala, uma vez que eleva os custos, além de
não proporcionar grande eficiência de complexação. Não são interessantes
também a grande quantidade de solventes orgânicos tóxicos por ocasionar
importantes efeitos adversos no ser humano e a alta temperatura limita a
utilização de fármacos voláteis como terpenos. Mangolim et al utilizaram o
método da co-precipitação para formar complexo de inclusão do curcumim com
β-CD e demonstraram que o método foi eficiente para melhorar as
características físico-químicas da molécula estudada (GRANDELLI et al., 2012;
MANGOLIM et al., 2014; VALLE, 2004).
Método de ultrassom: é um método de simples preparo que resulta em uma
elevada razão de inclusão e recuperação total do fármaco. O método consiste
na solubilização prévia da CD e do fármaco, em seguida, as soluções são
misturadas. A solução resultante é submetida a banho de ultrassom seguida
da refrigeração, lavagem do precipitado e finalmente liofilizadas. Su e
colaboradores descreveram que este método é eficiente para controlar a
estabilidade e liberação do fármaco bem como aumentar a sua solubilidade
(SU et al., 2012; WANG, D. W. et al., 2013).
Spray-drying: o método consiste em uma solução do fármaco na mistura
etanol:água 50% v/v, que é agitada intermitentemente durante 24 horas. Em
seguida a solução é submetida a secagem por atomização em condições
experimentais controladas que garantem a uniformidade no tamanho das
53
partículas obtidas. A desvantagem do método reside no baixo rendimento e
elevadas temperaturas as quais os complexos devem ser submetidos,
limitando o uso de fármaco voláteis (DEVIL et al., 2010; PANDIT et al., 2011).
Liofilização: constitui-se na eliminação de solvente da solução através de
congelamento prévio, sendo bastante utilizado para fármacos voláteis. Alguns
estudos têm demonstrado que a técnica de liofilização melhora
substancialmente as características na dissolução de fármacos hidrofóbicos em
virtude da elevada eficiência de complexação do método culminando em um
excelente efeito farmacológico nos complexos de inclusão obtidos por esta
técnica. Além disso, o produto obtido possui características amorfas,
entretanto, más características de fluxo e o procedimento é relativamente lento
(CHOI, M. et al., 2009; HILL; GOMES; TAYLOR, 2013; KARATHANOS et al.,
2007; SANTOS, E. H. et al., 2015; ZU et al., 2014).
Fluido supercrítico: o método tem sido utilizado para aumentar a solubilidade e
razão de dissolução de fármacos de baixa solubilidade. O fluido supercrítico
apresenta vantagens de atoxicidade, estabilidade química, segurança,
biodegradabilidade, fácil remoção do sistema e é eficiente para formar
complexos de inclusão. Além disso, os complexos obtidos por este método
possuem mínimos efeitos adversos ao ser humano quando comparado com os
métodos que utilizam solventes orgânicos. Entretanto, ainda é uma técnica
emergente, o que culmina no elevado custo de produção (AL-MARZOUQI et
al., 2009; BANCHERO; MANNA, 2011; GRANDELLI et al., 2012).
Co-evaporação: consiste em uma suspensão contendo CD, fármaco e uma
reduzida quantidade de água sob constante agitação. O método fornece um
bom rendimento de inclusão e a sua transposição de escala é de fácil condução
uma vez que envolve baixo custo de produção. Muitos estudos do nosso grupo
de pesquisa tem demonstrado que o método é eficiente na formação de
complexos de inclusão de terpenos com excelentes resultados de atividade
antinociceptiva, anti-inflamatória e anti-hiperalgésica em modelo de fibromialgia
(MENEZES, P. P. et al., 2014; MENEZES, P.P. et al., 2012; NASCIMENTO,
54
S. S. et al., 2014; QUINTANS-JUNIOR et al., 2013; QUINTANS JDE;
MENEZES; et al., 2013; SANTOS, E. H. et al., 2015; SERAfiNI et al., 2011;
SIQUEIRA-LIMA et al., 2014).
Malaxagem: é um método de formação de complexo de inclusão que consiste
em um sistema envolvendo fármaco, CD e água em quantidade suficiente para
formar uma pasta. O procedimento é eficiente, uma vez que apresenta o
mesmo rendimento que outros métodos testados com várias vantagens,
principalmente o curto tempo de obtenção e baixo custo para obter o complexo
(MENEZES, P. P. et al., 2014; MENEZES, P.P. et al., 2012; SALUSTIO et al.,
2009; SERAfiNI et al., 2011).
2.6 Técnicas analíticas de caracterização de complexos de inclusão
Apesar do número crescente de trabalhos utilizando CDs na formação de
complexos de inclusão, a abordagem sobre as técnicas de caracterização continua
sendo de grande interesse no âmbito analítico. As propriedades físico-químicas dos
fármacos e das CDs isoladamente são diferentes daquelas apresentadas quando
estão complexados. Partindo deste conceito, qualquer metodologia que tenha
sensibilidade suficiente para medir estas diferenças pode ser utilizada para
caracterizar estes complexos sob diferentes pontos de vista, permitindo direcionar os
fenômenos de inclusão de acordo com as necessidades (LYRA et al., 2010).
As principais técnicas analíticas utilizadas para caracterizar complexos de
inclusão incluem técnicas espectroscópicas, termoanalíticas e de separação (MURA,
2014).
Caracterização da formação de complexos em estado líquido
- Ultravioleta/visível (UV/vis): a espectroscopia no UV/vis é um método
rápido, econômico e bastante útil no estudo da formação de complexos de inclusão
no estado líquido. Além disso, investiga uma modificação significativa no espectro de
absorção do fármaco livre em relação ao complexado. Dessa forma, dependendo da
posição do grupo cromóforo do fármaco, a transferência da molécula da solução
aquosa para a cavidade da CD pode modificar a absorção no espectro UV da molécula
55
hóspede devido a substituição total ou parcial da cavidade da CD, o que desencadeia
novas interações no fármaco. As modificações no espetro de um fármaco na presença
de CD evidenciam a formação de complexos de inclusão. No entanto, o método não
é específico e sofre com a presença de substâncias que interferem no resultado. Com
isso, não apresenta evidência direta da formação de complexos de inclusão (MURA,
2014). Os deslocamentos hipsocrômico (para menores comprimentos de onda) e
batocrômico (para maiores comprimentos de onda) do máximo de absorção do
espectro UV do hóspede, e/ou aumento ou diminuição de sua intensidade podem ser
observados como uma consequência da formação de complexos de inclusão. O
deslocamento batocrômico tem sido demonstrado na complexação de moléculas
como por exemplo, genisteína (CANNAVA et al., 2010) e eritromicina (SONG et al.,
2011). Por outro lado, na análise dos complexos do ácido salicílico, ácido nicotínico,
indometacina e hidrocortisona, os deslocamentos no UV foram do tipo hipsocrômico
(MURA, 2014). Tanto a estequiometria quanto a constante de estabilidade do
complexo podem ser calculadas a partir das alterações espectrais utilizando,
respectivamente, a razão molar ou os métodos de variação contínua (Gráfico de
Jobbs) e os métodos de deslocamento espectral (Benesi-Hildebrand ou equação de
Scott). Por exemplo, as proporções estequiométricas dos complexos de inclusão de
tagitinina C com 2,6-di-O-metil-βCD e γ-CD foram determinados por espectroscopia
de UV, de acordo com estudo de Ziémons et al (ZIEMONS et al., 2007), enquanto que
a constante de estabilidade do complexo de inclusão da glibenclamida-β-CD (RADI;
EISSA, 2010) foi obtida a partir da variação no espectro de absorção do fármaco na
presença de concentrações crescentes de CD, segundo a equação Benesi-
Hildebrand. A variação do espectro de UV de hidroxiácido ou lactona de sinvastatina
na presença de HPβCD foi medida para determinar as constantes de estabilidade dos
respectivos complexos, sugerindo a formação de um complexo com estequiometria 1:
1 (UNGARO et al., 2011).
- Ressonância magnética nuclear (RMN): a técnica de RMN refere-se a
elucidação da estrutura de complexos de inclusão e é conhecida por ser um dos
métodos mais úteis e completos na obtenção de informações sobre a geometria
(ALFONSI et al., 2013), estabilidade, estequiometria e energia do processo de
complexação. Além disso, permite visualizar de forma direta as interações que
56
ocorrem entre as moléculas hóspedes e as CDs, sendo capaz de diferenciar qual parte
da estrutura química do fármaco está sendo complexada (LYRA et al., 2010). A
espectroscopia monodimensional (RMN-H1) detecta durante a complexação o
deslocamento químico para valores de campo mais altos para os H-3 e H-5 localizados
no interior da cavidade, e enquanto que os hidrogênios da superfície externa das CDs
(H-1, H-2, H-4 e H-6) não são afetados ou mostram desvios mínimos (SINGH, R. et
al., 2010). A principal desvantagem desta técnica é a baixa solubilidade das amostras
em água deuterada (RMN-H1) ou em água (RMN), exigindo muitas vezes a utilização
de outros solventes, o que poderia modificar as interações hospedeiro-hóspede em
relação ao meio aquoso. Além disso, as mudanças induzidas são, por vezes, muito
pequenas e podem sofrer ampliação do sinal (MURA, 2014). As técnicas
bidimensionais avançadas, tais como ROESY, revelam imagens detalhadas da
geometria dos complexos de inclusão em solução, permitindo o detalhamento
estrutural de compostos complexos contendo CDs modificadas com variável grau de
substituição (LYRA et al., 2010). Muitos trabalhos tem sido conduzidos utilizando RMN
como técnica de investigação da complexação de moléculas diversas tais como
captopril (AZEVEDO, M. D. B. M. et al., 2011), mitotano (ALFONSI et al., 2013),
albendazol (PRADINES et al., 2014), cianidina-3-O-glucosidio (FERNANDES, A. et
al., 2014), dentre outras.
- Diagrama de solubilidade de fases: A abordagem mais utilizada para o
estudo de complexação é o método descrito por Higuchi & Connors (1965), sendo
considerada a primeira verificação de complexos de inclusão em solução. Esse estudo
analisou os efeitos da adição do agente complexante sobre o composto a ser
solubilizado, permitindo obter a constante de estabilidade (Kc) e a estequiometria de
formação do complexo, a partir da solubilidade intrínseca do substrato (So) e a
inclinação da reta resultante do diagrama de solubilidade (Equação 1) (HIGUCHI;
CONNORS, 1965; LYRA et al., 2010).
K1: 1 =Inclinação
So x (1−Inclinação) Equação 1
De acordo com Shanmuga Priya e colaboradores, esta técnica é utilizada para
determinar a constante de estabilidade aparente do complexo de inclusão
57
(SHANMUGA PRIYA et al., 2013). As principais constantes publicadas de 123, 490, e
525 M-1 para α-CD, β-CD e γ-CD, respectivamente, foram baseadas em estudos
estatísticos. Valores inferiores à 100 para a constante, sugerem fraca afinidade do
fármaco com as CDs enquanto valores elevados, indicam que o fármaco está
fortemente ligado, o que pode reduzir consideravelmente a sua biodisponibilidade
(LYRA et al., 2010). Yao e colaboradores realizaram este estudo com complexos de
inclusão da miricetina com HPβCD e demonstraram que a estequiometria do
complexo foi 1:1 e que as inclinações forem inferiores a 1, caracterizando a formação
de complexos de inclusão conforme descrito por Higuchi e Connors (HIGUCHI;
CONNORS, 1965; YAO et al., 2014). Outros parâmetros tais como os
termodinâmicos, isto é, mudança na energia livre de Gibbs (ΔG) em função da entalpia
(ΔH) e entropia (ΔS) podem ser obtidos em função da constante de estabilidade do
complexo de inclusão e da temperatura medida em Kelvin, expressa na equação 2,
onde R é a constante universal dos gases (YAO et al., 2014).
∆𝐺𝑖 = −𝑅𝑇𝑙𝑛𝐾𝑖 Equação 2
A ΔH pode ser determinada utilizando-se a equação de Van’t Hoff (3) e a ΔS
conforme descrito na equação 4
ln𝑘2
𝑘1=
∆𝐻
𝑅 𝑥
𝑇2−𝑇1
𝑇2𝑇1 Equação 3
∆𝑆 = ∆𝐻−∆𝐺
𝑇 Equação 4
Em geral, a formação dos complexos de inclusão está associada a valores de
ΔG < 0, proporcionais ao aumento de temperatura (T) e a concentração do agente
solubilizante, devendo também ser considerada a natureza química da molécula
hóspede na previsão da complexação. Nesse caso, também pode ser analisado qual
complexante causa o melhor incremento na solubilidade aquosa, pois quanto maior a
contribuição para o valor negativo de ΔG, melhor o efeito solubilizante (LYRA et al.,
2010).
58
- Determinação por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE): o
método pode determinar as constantes de associação entre a CD e o fármaco, bem
como do complexo com a fase estacionária, uma vez que as CDs também comportam-
se como fases estacionárias em métodos cromatográficos. Nesta técnica, a formação
do complexo é confirmada pelas modificações das propriedades de retenção de
moléculas hóspedes em presença de concentrações crescentes de CDs, diferente
composição das fases móveis, e sob diferentes condições físico-químicas do pH e
temperatura (MESSIAD; AMIRA-GUEBAILIA; HOUACHE, 2013). Entretanto, não é
capaz de fazer qualquer inferência acerca da estrutura do complexo de inclusão e
pode exigir grandes quantidades de materiais, necessitando do preparo intenso de
amostras para validação de método a fim de assegurar a especificidade/sensibilidade,
linearidade, limites de quantificação e detecção, exatidão, precisão e robustez da
metodologia analítica (ANVISA, 2003). Dessa forma, como um resultado das
interações hospedeiro-hóspede, o tempo de retenção do hóspede pode variar,
tornando-se mais ou menos longo, dependendo da ocorrência de complexação na
fase estacionária ou em fase móvel, respectivamente, fenômeno conhecido como
método Fujimura (ARMSTRONG et al., 1996). Outra abordagem, conhecida como
método Hummel-Dreyer, utiliza uma coluna equilibrada com um eluente transportando
a molécula hóspede; quando o agente complexante é adicionado na solução eluente,
o cromatograma irá mostrar um pico positivo, devido ao complexo, e um pico negativo
no tempo de retenção da molécula livre, correspondente à quantidade de hóspede
complexado (HUMMEL; DREYER, 1962). A constante de estabilidade é calculada
pela variação de intensidade do pico negativo (ou positivo). No método Hummel-
Dreyer o consumo de ligante é inferior (MURA, 2014).
- Determinação por Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de
massas (CG/EM): A CG/EM é uma técnica de elevada sensibilidade e especificidade
capaz de quantificar e identificar constituintes químicos de substâncias voláteis como
óleos essenciais, bem como determinar as razões de inclusão destas moléculas na
cavidade das CDs (ABDEL-KHALIK; BJORKLUND; HANSEN, 2013). Estudos do
nosso grupo de pesquisa têm sido conduzidos utilizando esta técnica e os resultados
demonstraram a razão de inclusão dos terpenos presentes no óleo essencial de Lippia
gracilis em HPβCD e do (-)-linalol em β-CD, evidenciando a razão molar de 1:1 na
59
complexação deste terpeno (MARRETO et al., 2008; MENEZES, P. P. et al., 2014).
Bhandari et al apresentou em seu estudo, a complexação do óleo de limão pelo
método da pasta. Dentre as análises utilizadas para investigar a complexação,
destaca-se a CG/EM, que demonstrou a complexação dos principais componentes
voláteis do óleo em β-CD. Vale ressaltar que não houve seletividade de um ou outro
composto, a força motriz para que cada molécula fosse complexada foi a afinidade da
mesma pela cavidade da CD (BHANDARI; D'ARCY; PADUKKA, 1999).
- Modelagem molecular (Docking): trata-se de uma técnica teórica bastante
útil para predizer a interação, orientação, razão de inclusão e energia de ligação do
fármaco na cavidade da CD (Figura 11) (DANDAWATE et al., 2014). Existem diversos
softwares que realizam este tipo de análise, dentre eles, Hyperchem 8.0
(CHAKRABORTY; BASU; BASAK, 2014), PatchDock server (STALIN et al., 2014),
Hex 6.3 (IACOVINO et al., 2013) e que fornecem vários modelos possíveis para a
estrutura mais provável do complexo de inclusão com base nos parâmetros
energéticos, geometria, tamanho aproximado da área de interface e energia atômica
das moléculas envolvidas (SRINIVASAN; SIVAKUMAR; STALIN, 2014). Ademais, a
técnica indica o tipo de ligação que promove a complexação, seja ela força de van der
Wallls, interação eletrostática ou ligações de hidrogênio. Este tipo de interação
molecular associado a valores negativos de entalpia demonstram o aumento da
estabilidade do complexo de inclusão (BUDRYN et al., 2015).
60
Figura 12: Conformação de menor energia do complexo de inclusão da miricetina em β-CD
obtida por Docking utilizando o software Hyperchem. (A) estrutura representada em verde representa
a β-CD e vermelho a miricetina e (B) representação esquemática do mesmo complexo, onde amarelo
representa miricetina e as cores branco e vermelho a β-CD.
Fonte: Chakraborty, Basu e Basak, 2014 (CHAKRABORTY et al., 2014)
Caracterização da formação de complexos em estado sólido
- Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC): as técnicas de análise térmica
são largamente empregadas para avaliar o estado físico de fármacos livres ou
complexados e fornecem informações acerca da complexação na cavidade ou se o
fármaco está aderido na rede cristalina da CD (DANDAWATE et al., 2014). Através
da curva DSC, é possível mensurar a diferença de energia fornecida a substância e a
um material de referência em função da temperatura, tanto em condições de
aquecimento quanto resfriamento (ARAÚJO et al., 2006). A análise de DSC fornece
evidências da formação de complexos de inclusão alterando pontos de fusão,
volatilização, ou sublimação de forma a deslocar estes eventos para diferentes
temperaturas ou promover o seu desaparecimento, a depender do material estudado,
principalmente na diferenciação da complexação ou apenas formação de misturas
físicas (ZHOU et al., 2013). Choi e colaboradores demonstraram a formação de
complexo de inclusão entre o paclitaxel e DMβCD através da técnica de DSC (CHOI,
S. G. et al., 2014). Barbosa e colaboradores estudaram a estabilização do metotrexato
complexado em β-CD e observaram que a CD aumenta a temperatura de degradação
do fármaco elevando a sua estabilidade em relação à forma livre (BARBOSA et al.,
61
2014). Xu e colaboradores, através do estudo da complexação do honokiol com
SBβCD, demonstraram que o ponto de fusão do fármaco desaparece na curva DSC
correspondente a complexação (XU et al., 2014).
- Termogravimetria/Termogravimetria Derivada (TG/DTG): esta técnica
permite medir a variação de massa de uma substância em função da temperatura,
enquanto a amostra é submetida a uma programação controlada de temperatura
(IONASHIRO, 2004). A derivada correspondente (DTG) transforma os eventos de
perda de massa em picos para melhor visualização destes eventos (ARAÚJO et al.,
2006). Dessa forma, a estabilidade térmica de um composto, analisada por TG pode
diferir das características do material puro, em solução ou em outras formas de
complexação (DING et al., 2013). Danilovas e colaboradores descreveram em seu
estudo a capacidade que a técnica de TG tem de acompanhar a degradação da
amostra analisada e sugerir a formação de complexos de inclusão, através da etapa
de degradação do complexo em relação as amostras isoladas (DANILOVAS;
RUTKAITE; ZEMAITAITIS, 2014). O conhecimento da degradação e o modo de
decomposição sob a influência de calor são altamente recomendadas na otimização
de processamentos. O estudo da cinética dos diferentes processos de decomposição
pode ajudar na identificação dos mecanismos de degradação (JANKOVIC, 2013). Um
evento de decomposição é geralmente complexo, uma vez que envolve diversas
reações químicas simultâneas, o que dificulta na caracterização do material (ALVES-
SILVA et al., 2014). Entretanto, estudos demonstram que a evidência da formação de
complexos de inclusão por TG/DTG envolve o aumento na temperatura de
degradação do material com consequente elevação da estabilidade da amostra
(HUANG et al., 2014).
- Cinética de decomposição: o estudo dos efeitos do aquecimento em
determinada amostra pode ser realizado através da análise cinética por meio dos
métodos isotérmico e não-isotérmico. Dessa forma, define-se cinética de
decomposição, os estudos cinéticos que envolvem a medida do grau de conversão
(α) em função do tempo (t) a temperatura constante (T) (isotérmicos) ou como uma
função de temperatura (T), que é aumentada de acordo com algum programa de
aquecimento usualmente linear, β=dT/dt (não-isotérmico). Em relação ao método não-
62
isotérmico, as medidas ocorrem em condições realmente não-isotérmicas de modo
que as determinações apresentam valores altamente desejáveis. De acordo com
Kozmidis-Petrovic, este método tem sido bastante aplicado para substâncias amorfas
(KOZMIDIS-PETROVIC´; ŠTRBAC; ŠTRBAC, 2007). Outro método bem conhecido é
o modelo isoconversional que sofre a influência dos parâmetros de Arrhenius
conhecidos como “triplete cinético”, a saber: E, energia de ativação, A fator pré-
exponencial, e g ou f(α), fator de conversão (SEWRY; BROWN, 2002). Segundo
Vyazovkin, se o triplete cinético for determinado corretamente, isto pode ser usado
para reproduzir os dados cinéticos originais bem como para predizer os processos
cinéticos fora da região da temperatura experimental” (VYAZOVKIN; SBIRRAZZUOLI,
2006). Para estes métodos isoconversionais de cinética não-isotérmica, podem ser
utilizados os modelos computacionais de Kissinger, Flynn-Wall-Ozawa e Vyazovkin.
Nesse sentido, as empresas que produzem os equipamentos, fornecem os softwares
de cinética, por isso o método de Ozawa é largamente utilizado, pela facilidade de
acesso e manuseio (KHAWAM; FLANAGAN, 2006). Já o estudo cinético do tipo
isotérmico trata-se de uma medida direta do tempo que resulta em tratamento
simplificado dos dados. Entretanto, possui longos períodos para aquisição destes
dados e não é possível obter um ensaio rigorosamente isotérmico, uma vez que a
temperatura da isoterma geralmente excede o valor estipulado (LÓPEZ-GONZÁLEZ
et al., 2014).
Para medidas dinâmicas a aproximação usual é:
𝑑𝛼
𝑑𝑇 = (
𝑑𝛼
𝑑𝑡) (
𝑑𝑡
𝑑𝑇) = (
𝑑𝛼
𝑑𝑡)(
1
𝛽)
1
𝛽 = razão de aquecimento
𝑑𝛼
𝑑𝑇 =
𝐴
𝛽 exp (-
𝐸
𝑅𝑇) f(α)
Considerando E e A constantes pode-se separar as variáveis na forma de derivada:
𝑑(𝛼)
𝑓(𝛼) =
𝐴
𝛽 exp (-
𝐸
𝑅𝑇) 𝑑𝑇
63
Ou na forma integral g(α)
g(α)=∫𝑑𝛼
𝑓(𝛼)
𝛼
0=
𝐴
𝛽 ∫ exp(−
𝐸
𝑅𝑇) 𝑑𝑇
𝑇
0
- Espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com
transformada de Fourier (FTIR): é uma ferramenta importante para a caracterização
de complexos de inclusão no estado sólido, devido à perda da vibração de flexão da
molécula hóspede, mediante complexação. Além disso, os estudos espectrais de
FTIR fornecem informações sobre o envolvimento do átomo de hidrogênio em vários
grupos funcionais (KFOURY et al., 2014). Petralito e colaboradores relataram que a
técnica de FTIR é útil para sugerir a complexação de fármacos pouco solúveis como
a diacereína, em CDs. Neste estudo, eles demonstraram que o desaparecimento da
banda da carbonila no espectro sugeriu a formação de ligações de hidrogênio entre o
grupo carbonila da diacereína e o grupo hidroxila da cavidade da HPβCD conduzindo
a complexação do fármaco (PETRALITO et al., 2014). As CDs formam complexos de
inclusão no estado sólido através de interações não-covalentes, tais como interações
hidrofóbicas, interações de van der Waals e ligações de hidrogênio. Quando a
molécula hóspede é complexada, as bandas de absorção resultantes da parte incluída
da molécula hóspede, são geralmente deslocadas em suas posições (PERIASAMY et
al., 2014).
- Microscopia eletrônica de varredura (MEV): é uma técnica bastante
relatada na literatura em estudos de complexos de inclusão. As fotomicrografias
elucidam as diferenças morfológicas dos complexos de inclusão em relação aos
componentes puros. As alterações na estrutura cristalina das moléculas demonstram
a interação entre ambas e consequente formação dos complexos de inclusão
(PERIASAMY et al., 2014).
- Difração de raios-X (DRX): a técnica é utilizada para analisar as alterações
na cristalinidade das amostras, o que evidencia a complexação (CHOI, S. G. et al.,
2014). Rajendiran e colaboradores demonstraram que nos difratogramas de
64
complexos de inclusão, halos de reflexão característicos das amostras puras
desaparecem indicando uma baixa cristalinidade do complexo (RAJENDIRAN;
MOHANDOSS; SARAVANAN, 2014). Quando o complexo não apresenta halos de
cristalinidade, é considerado amorfo (RACHMAWATI; EDITYANINGRUM;
MAULUDIN, 2013). Uma outra forma de investigar a complexação é através do
aparecimento de novos halos de cristalinidade no difratograma do complexo,
caracterizando assim, uma nova fase sólida (TOROPAINEN et al., 2006).
3 OBJETIVO GERAL
Obter complexos de inclusão do OEHP em β-CD e do ISOP em α- e β-CD, bem
como caracterizá-los físico-quimicamente.
3.1 Objetivos específicos Preparar os complexos do OEHP em β-CD e do isopulegol em α- e β-CD
através dos métodos da malaxagem (PC), co-evaporação (SC) e compará-los
com a mistura física (PM);
Avaliar o perfil térmico das amostras por termogravimetria/termogravimetria
derivada (TG/DTG) e calorimetria exploratória diferencial (DSC);
Caracterizar fisicamente os compostos isoladas e seus complexos de inclusão
por difração de raios X (DRX) e microscopia eletrônica de varredura (MEV);
Caracterizar quimicamente as amostras através da técnica de
espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com transformada
de Fourier (FTIR);
Avaliar a eficiência de complexação do OEHP em β-CD e do ISOP em α- e β-
CD por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas (CG/EM)
através da extração total e superficial dos óleos em estudo;
Realizar o estudo de modelagem molecular do ISOP em α- e β-CDs através da
técnica de Docking a fim de avaliar de forma teórica qual a melhor CD para
complexar o monoterpeno.
Realizar uma triagem antinociceptiva e anti-inflamatória do OEHP e seu
complexo de inclusão através do teste de formalina
65
CAPÍTULO II
Physicochemical characterization and analgesic effect of inclusion
complexes of essential oil from Hyptis pectinata L. Poit leaves with β-
cyclodextrin
Artigo publicado na Current Pharmaceutical Biotechnology
Fator de impacto 2.511
Qualis Medicina I A2
CAPÍTULO II
Physicochemical characterization and analgesic effect of inclusion complexes of
essential oil from Hyptis pectinata L. Poit leaves with β-cyclodextrin
Artigo publicado na Current Pharmaceutical Biotechnology
Fator de impacto 2.511
Qualis Medicina I A2
66
Physicochemical characterization and analgesic effect of inclusion complexes of
essential oil from Hyptis pectinata L. Poit leaves with β-cyclodextrin
P.P. Menezes1, A.A.S. Araújo1, G.A.A. Dória1, L.J. Quintans-Júnior2, M.G.B. Oliveira2, M.R.V.
Santos2, J.F. Oliveira3, J.R. Matos3, F.M.S. Carvalho4, P.B. Alves5, I.L. Matos5, D.A. Santos5, R.N.
Marreto6, G. F. Silva7, M.R. Serafini1*
1Departamento de Farmácia, Universidade Federal de Sergipe, Address: Av. Marechal Rondon, s/n, Cidade Universitária, São Cristóvão, Sergipe 49100-000, Brazil.
2 Departamento de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe, Address: Av. Marechal Rondon, s/n, Cidade Universitária, São Cristóvão, Sergipe 49100-000, Brazil.
3Departamento de Química Fundamental, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, Av. Lineu Prestes, 748, São Paulo, SP 05508-000, Brazil.
4 Departamento de Mineralogia e Geotectônia, Instituto de Geociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brazil.
5 Departamento de Química, Universidade Federal de Sergipe, Address: Av. Marechal Rondon, s/n, Cidade Universitária, São Cristóvão, Sergipe 49100-000, Brazil.
6Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Goiás. Praça Universitária, 1166, Setor Universitário, Goiânia, Goiás 74605-010, Brazil
7Departamento de Engenharia Química, Universidade Federal de Sergipe, Address: Av. Marechal Rondon, s/n, Cidade Universitária, São Cristóvão, Sergipe 49100-000, Brazil.
* Department of Pharmacy. Federal University of Sergipe. Address: Av. Marechal Rondon, s/n,
Cidade Universitária, 49100-000, São Cristóvão, Sergipe, Brazil. E-mail:
[email protected] or [email protected], Tel/Fax: +55-11-2105-6640
67
Abstract
The formation of inclusion complexes of Hyptis pectinata essential oil (EOHP), with potent
activities such as anti-nociceptive, anti-inflammatory, among others, with β-cyclodextrin (β-CD), was
obtained by slurry (SC) and paste procedures (PC). The gas chromatography coupled to the mass
spectrometry (GC/MS) analysis demonstrated a total of 36.4% monoterpenes and 63.6%
sesquiterpenes in the EOHP. The major components of EOHP were identified as (E)-caryophyllene
(54.07%). The analysis of samples (PM, PC and SC) by GC/MS involved the surface and the total
extracted oils. The GC/MS results suggested important differences between in SC and PC methods
indicating the complexation of mono and sesquiterpenoids in different ratios. Furthermore, the thermal
analysis techniques suggests the complexation, especially in SC, which show a
thermogravimetry/derivative thermogravimetry (TG/DTG) peak at 140–270 ºC, probably related to oil
loss. Scanning electron microscopy (SEM) images showed reduction size of the samples mainly in the
SC product. Additionally, EOHP/ β-CD improves pharmacological profile of EOHP alone in formalin-
induced pain protocol in mice.
Keywords: β-cyclodextrin; (E)-caryophyllene; essential oil; Hyptis pectinata; inclusion
complexes.
Chemical compounds studied in this article:
(E)-caryophyllene (PubChem CID: 5281515); caryophyllene oxide (PubChem CID: 14350);
germacrene D (PubChem CID: 5317570)
Introduction
Hyptis pectinata L. Poit. (Lamiaceae), known popularly as “sambacaita”, is an important
medicinal herb common in the states of Alagoas and Sergipe (Northeastern Brazil). In order to validate
its popular use, studies have been carried out to ascertain antinociceptive and antimicrobial activities
[(ARRIGONI-BLANK et al., 2008; RAYMUNDO et al., 2011; SANTOS, P. O. et al., 2008)], as well as the anti-inflammatory effect of
the volatile oil of the leaves. Although only a few samples have been evaluated, it appears that the
essential oils from the H. pectinata leaves exhibit composition variability characterized by the occurrence
of p-cymene (33.7 %) and thymol (26 %) in France [(MALAN et al., 1988)] , (E)-caryophyllene (40 %)
and on the Fiji Islands; also, p-cymene (33.7 %) in Western Africa [(RAYMUNDO et al., 2011)]. Some studies
have shown that the genetic variation among the same species can alter the concentration of active
principles from H. pectinata [(ARRIGONI-BLANK et al., 2008)]. Additionally, the climate, soil, seasonality, time and
68
type of culture, as well as fertilizers, may affect the composition of active principles. Some variations
have been seen in the chemical constituents in the essential oil among different genotypes from H.
suaveolens species in the Brazilian “cerrado” [(MALAN et al., 1988)].
Water-insoluble bioactive compounds as those present in the essential oil from the H. pectinata can
be solubilized by the inclusion complex formation with cyclodextrins (CDs), and the interaction of such
compounds with light and oxygen is also decreased due to the molecular complexation [(AZEVEDO, N. R. et
al., 2002; HĂDĂRUGĂ, N. G. et al., 2012)]. Cyclodextrins are cyclic oligosaccharides with a lipophilic cavity and a
hydrophilic outer surface. These oligosaccharides are found in nature as α, β and γ- CDs comprised by
6, 7 or 8 glucose units, respectively. The different natural CDs have different solubility and their
properties can be further improved by the chemical modifications in their molecular structure [(SALUSTIO et
al., 2009)]. During the process of the inclusion complex formation, the guest may be totally included in the
hydrophobic cavity of the host or associated with the hydrophobic or hydrophilic part of the molecule
[(HILL et al., 2013)].
Pinho et al reviewed the several applications of the cyclodextrins as complexing agents for plant
bioactive materials. Those authors reported the improvement of material solubility as the main goal in
essential oil complexation. In addition, inclusion complexation may turn liquid active materials into easy-
to-handle solids, and control the high volatility of these compounds [(PINHO et al., 2014)]. Our research group
has prepared inclusion complexes of Lippia gracilis essential oil (a natural larvicide) with hydroxypropyl-
β-cyclodextrin by using different inclusion methods [(MARRETO et al., 2008)]. The resulting complexes were
easy-to-handle powders, with better properties to the intended application. Additionally, our group has
also suggested that an inclusion complex with β-CD and essential oils or related compounds, such as
terpenes, can produce significant improvements in the chemical and pharmacological properties
[(QUINTANS-JUNIOR et al., 2013; QUINTANS JDE; MENEZES; et al., 2013; SERAfiNI et al., 2011; SIQUEIRA-LIMA et al., 2014)].
The main goal of the present work was to analyze the chemical composition of the essential oil from
the H. pectinata and to study the complexation of this material with β-CD using different methods: slurry
(SC) and paste methods (PC), and these were compared with physical mixtures (PM). The complexes
were characterized through differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry/derivative
thermogravimetry (TG/DTG), scanning electron microscopy (SEM), X-ray powder diffraction (XRD) and
gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS). For each inclusion complex obtained, the qualitative
69
and quantitative analyses of the total oil, surface oil and volatile profiles were performed. Afterwards,
the pharmacological properties of the best complex was evaluated by means of the formalin test.
Material and methods
Material
Hyptis pectinata leaves were collected in November 2012 in Laranjeiras, Sergipe, Brazil
(37.1696, 10°48′12″ (S), 37°10′11″ (W)) 9 meters above the sea level. Herbarium voucher specimens
(registry number 7454) were prepared and deposited at the Department of Biology of the Federal
University of Sergipe. The leaves were dried at circulating air oven (38 ± 2 °C) for two days. Essential
oil was extracted from leaves from H. pectinata by using an apparatus for Clevenger over 2 h, the yield
was 0.7%. The β-CD was purchased from SIGMA (St. Louis, USA).
Preparation of inclusion complexes
Inclusion complexes were prepared through three different procedures (physical mixture, paste
complexation and slurry complexation) as described by Menezes et al [(MENEZES, P. P. et al., 2014)].
These samples were prepared based on (E)-caryophyllene’s molecular weight (204 g.mol-1) and the
molar ratio was maintained as described for the inclusion complex preparation (1:1). The physical
mixture was prepared by adding essential oil from H. pectinata (204 mg) in an agate mortar containing
β-CD (1135 mg) under manual stirring and were then stored in sealed glass vials. Paste complexation
was prepared through homogenization β-CD (1135 mg) in water (1.2:4 w/v) directly in an agate mortar.
After that, the paste was maintained under a constant manual agitation. Then, the material was dried at
room temperature (in a desiccator) until a glass film was formed, which was removed by manual
trituration and stored in airtight glass containers. Finally, the slurry complexation was performed by
adding water to a beaker containing essential oil from H. pectinata (204 mg) and β-CD (1135 mg, 3:4
v/w), under magnetic stirring at 400 rpm for 36 hours constantly (Quimis Q 261A21, Brazil). Then, the
material was dried in a desiccator and removed by manual trituration as described in a paste
complexation method.
Thermal analysis
Differential scanning calorimeter (DSC) and Thermogravimetry/derivative thermogravimetry
(TG/DTG) curves were obtained as described by Serafini et al (2011) [(SERAfiNI et al., 2011)]. DSC curves were
performed in a DSC-60 cell (Shimadzu) using aluminum crucibles containing about 2 mg of samples,
70
under dynamic nitrogen atmosphere (50 mL/min) and heating rate of 10°C/ min in the temperature range
from 25°C to 500°C. The DSC cell was verified with indium (m.p. 156.6°C; DH fus = 28.54 J/g) and zinc
(m.p. 419.6°C). TG/ DTG curves were obtained with a TGA 60 (Shimadzu) thermobalance in the
temperature range of 25–900°C, in platinum crucibles containing approximately 3 mg of samples, under
dynamic nitrogen atmosphere (50 mL/min) and heating rate of 10°C/min. The TG/DTG was verified with
calcium oxalate monohydrate, according to ASTM standard.
Scanning electron microscopy (SEM)
The samples were mounted on gold tape and visualized with a JSM-7410-F SEM JEOL, at an
accelerated voltage of 1 kV.
X-ray powder diffraction (XRD)
XRD patterns were obtained on a Siemens, model D5000, with tube of CuK, in the interval of
3 to 65o (2) and 1s the pass time, using the powder X-ray diffraction method.
Efficiency complexation by gas chromatography-mass spectrometry analyses (GC/MS)
These parameters of GC/MS technique were adapted from the study of Marreto et al (2008)
[(MARRETO et al., 2008)]. A multi-dimensional GC/MS system (QP2010 Ultra, Shimadzu Corporation, Kyoto,
Japan) equipped with an AOC-20I auto-injector (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) was used for
performing the analyses employing the following conditions: RestekRtx®-5MS fused silica capillary
column (30 m x 0.25 mm i.d x 0.25 mm thickness film, composed by 5 %-diphenyl-95-dimethyl
polysiloxane) was used. Helium (99.999 %) was used as carrier gas at a constant flow of 1.2 mL.min-1
and an injection volume of 2.0 µL was employed (split ratio 1:10). The injector temperature was 250 °C
and the ion source temperature was 200 °C. The oven temperature was programed to 60 °C with an
increase of 3 °C.min-1 to 230 °C. The FID and MS data were acquired simultaneously using a detector
separation system and the flow split ratio was 4:1 (MS: FID). A tube restrictor of 0.62 m x 0.15 mm i.d
(capillary column) was used to connect the splitter to the MS detector; a tube restrictor of 0.74 m x 0.22
mm i.d was used to connect the splitter to the FID detector. Mass spectra were taken at 70 eV, a scan
interval of 0.3 s and fragments from 40 to 350 Da. FID temperature was adjusted to 250 °C, and the
gases supplied to FID were synthetic air, hydrogen and helium at flow rates of 30, 300 and 30 mL.min-
71
1, respectively. Quantification of each constituent was estimated by normalizing the peak area generated
in the FID—(%). Compound concentrations were calculated from the GC peak areas and are arranged
in order of elution from the GC.
Extraction of total essential oil from H. pectinata
Total oil adsorbed in the β-CD was determined through extraction according to the method
described by Marreto et al [(MARRETO et al., 2008)]. Distilled water (8 mL) plus hexane (4 mL) and 0.2 g of the
sample were put in a round-bottom flask which was kept in a water bath at 85 °C for 20 min, with constant
shaking. The organic phase was decanted (3 times) and concentrated to approximately 1 mL using
rotary evaporator. Afterwards, internal standard (menthol, 2 mg) was added and stored until GC–MS/FID
analysis.
Extraction of surface-adsorbed essential oil from H. pectinata
The amount of essential oil from H. pectinata adsorbed on the surface of β-CD was determined
through washing. Sample (3 g) with hexane (20 mL) was shaken for 20 min. The suspension was filtered
and the residue was washed with hexane (10 mL). Then, hexane (1 mL) and internal standard (menthol,
2 mg) were added to the filtrate, which was concentrated using rotary evaporator and analyzed by
means of GC-MS/FID. Thus, the difference between the total essential oil from H. pectinata (surface-
adsorbed essential oil from H. pectinata and hosted in the cavity) and the surface-adsorbed essential
oil from H. pectinata corresponds to the amount complexed in the β-CD cavity.
Pharmacological procedure
Animals
In pharmacological protocols, we used adult (3months old) female albino Swiss mice (27–35 g),
which were randomly housed in appropriate cages at 21 ± 2°C with free access to food (Purina®, Brazil)
and tap water. All female used in analgesic protocols were in diestrus phase as described by Shane et
al. (2007)(SHANE et al., 2007). The behavioral analysis were carried out by the same visual observer
and in a double-blind manner. The Animal Care and Use Committee at the Federal University of Sergipe
(CEPA / UFS 10/2011) approved experimental protocols and these were according to Guide for the
Care and Use of Laboratory Animals.
Formalin test
This procedure was similar to the method described by Hunkaar and Hole (1987) [(HUNKAAR; HOLE,
1987)]. In this pharmacological protocol, animals received injection (s.c.) of 20 µL of 1% formalin in the
72
subplantar region of the right hind paw. The time that the mice spent licking their injected paws was
immediately recorded. Nociception was quantified in two phases: 0-5 min. after the formalin injection
(first phase) and 15-30 min. after the formalin injection (second phase). To assess the effect of the test
drug, groups of mice (n = 7, per group) were pre-treated with control (saline), β-CD, OEHP (40 mg/kg,
p.o.) and OEHP/β-CD (40 mg/kg, p.o.) 60 min. before the local injection of formalin. They were
individually placed in a transparent plexiglass-cage observation chamber (25 x 15 x 15 cm). The amount
of time spent licking the injected paw was indicative of pain.
Statistical analysis
The obtained data were evaluated by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by
Tukey’s test. In all cases, differences were considered significant if p < 0.05. All statistical analyses were
held using GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA, USA).
Results and Discussion
These constituents from H. pectinata oil were previously identified, and the compounds are
listed in Table 1. The identified constituents were sesquiterpenoids with high contents of (E)-
caryophyllene (54.07%), germacrene D (7.46%) and caryophyllene oxide (14.91%). The structures of
the major constituents are shown in Fig. 1.
Table 1. Chemical compounds present in EOHP.
Peak RT (min) Compound (%) GC-FID
IRR
exp.*
1 6.535 α-thujene 0.17 945
2 6.770 α-pinene 0.15 951
3 7.950 sabinene 0.13 981
4 8.085 β-pinene 0.92 985
5 8.440 mircene 0.16 993
6 9.400 α-terpinene 0.03 1018
7 9.705 p-cymene 1.15 1026
8 9.905 limonene 0.28 1031
9 10.015 1,8-cineole 0.07 1034
10 10.130 -β-ocimene 0.22 1037
11 10.565 -β-ocimene 1.63 1048
73
12 11.030 γ-terpinene 1.02 1060
13 12.245 terpinolene 0.04 1091
14 12.705 linalool 0.80 1102
15 16.165 terpinen-4-ol 0.12 1180
16 16.770 α-terpineole 0.04 1194
17 23.475 -elemene 0.29 1341
18 23.975 α-cubebeno 0.05 1352
19 25.225 α-copaene 2.46 1380
20 25.600 β-bourbonene 0.75 1388
21 25.935 β-elemene 1.54 1396
22 26.725 α-gurjunene 0.35 1414
23 27.170 (E)-caryophyllene 54.07 1424
24 27.940 α-guaiene 0.21 1441
25 28.150 6,9-guaiadiene 0.04 1446
26 28.460 geranylacetone 0.07 1453
27 28.670 α-humulene 1.62 1458
28 29.835 germacrene-D 7.46 1484
29 30.560 bicyclogermacrene 1.29 1501
30 30.820 α-bulnesene 0.10 1507
31 31.220 γ-cadinene 0.09 1517
32 31.555 -cadinene 1.23 1526
33 33.040 germacrene-B 0.23 1562
34 34.185 caryophyllene oxide 14.91 1591
35 34.965 ledol 0.16 1610
36 35.205 humulene II epoxide 0.28 1616
37 35.900 1-epi-cubenol 0.19 1633
38 36.100 caryophylla-
4(12),8(13)-dien-5-ol
0.13 1638
39 36.270 caryophylla-
4(12),8(13)-dien-5-ol
0.34 1643
40 36.425 epi--muurolol 0.47 1646
74
41 36.605 α-muurolol 0.13 1651
42 36.965 α-cadinol 0.62 1660
43 38.195 germacra-
4(15),5,10(14)-trien-1--ol
0.15 1690
44 46.365 (5E,9E)-farnesilacetone
0.08 1915
*RRI = relative retention index using the Van den Dool equation (Van den Dool and Kratz 1963)
[(DOOL; KRATZ, 1963)].
Fig. 1 Structure of the major constituents of Hyptis pectinata essential oil. (a) (E)-caryophyllene,
(b) caryophyllene oxide and (c) germacrene D.
Similar results were observed by Tchoumbougnang et al who identified (E)–caryophyllene (22.10%),
germacrene D (28.00%) and caryophyllene oxide (1.40%) as major compounds in the essential oil from
aromatic plants of tropical Central Africa [(TCHOUMBOUGNANG et al., 2005)]. However, the chemical composition
of essential oil from H. pectinata is variable, and some authors have reported different results. Serafini
et al (2012) identified sesquiterpenoid compounds with high contents of calamusenone (62.61 %), (E)-
caryophyllene (8.45 %), cis-β-guainene (5.67 %) and caryophyllene oxide (3.63 %) in an essential oil
from H. pectinata of Sergipe, Brazil [(SERAFINI et al., 2012)].
The high value of caryophyllene oxide (14.91 %) in essential oil from H. pectinata could occur due
to the reaction with oxygen. “Some compounds easily react with oxygen and conduct to reactive oxidized
derivatives with higher toxicity; the case of limonene (a compound from a wide variety of essential oils
75
and flavoring formulae) was reported by Clayton and Clayton. The limonene reacts very easily with
oxygen or oxidant compounds and can conduct to diepoxy-limonene, a carcinogenic compound
according to Clayton & Clayton (1981)” [(CLAYTON; CLAYTON, 1981)]. Futhermore, the same reaction
appears in the case of almost all mono- and sesquiterpenes (which are the major compounds of many
essential oils). This reaction can be blocked, i.e. by molecular complexation in CDs [(HĂDĂRUGĂ, D. I. et al.,
2007; HĂDĂRUGĂ, N. G. et al., 2012; HĂDĂRUGĂ, N. G. et al., 2006)].
The formation of inclusion complexes between essential oil from H. pectinata and β-CD was
evaluated by obtaining DSC (Fig. 2) and TG/DTG (Fig. 3) curves of pure compounds, physical mixture,
paste complexation and slurry complexation. The Table 2 lists the mass losses calculated from specific
intervals for each material studied in the present work.
Data analysis of DSC curves (Fig. 2) showed that the major fraction of essential oil from H. pectinata
evaporates up to 160°C. TG/DTG (Fig 3) curves show two stages of weight loss. The first occurred
nearly 30-178°C (∆m=89.7%) and refers to the volatilization of the substances of low molecular weight
such as sesquiterpenoids, including (E)-caryophyllene, germacrene-D, and monoterpenoids. The
second stage occurred in 178-900°C range (∆m=10.3%) and can be associated to the volatilization and
decomposition of the one compound of higher molecular weight (caryophyllene oxide). Henceforth,
TG/DTG curves showed that the thermal decomposition of the oil started and occurs with elemental
carbon formation because of the sample. The disappearance of these events in the complexes is due
to their complexation in the host β-CD.
The DSC curves of the essential oil from H. pectinata/β-CD complexes showed three endothermic
peaks. The first in the range of 25–121°C (which corresponds to the release of water molecules and
essential oil from H. pectinata, probably adsorbed in the surface). The second event occurred in the
range of 121–270°C, where complexed essential oil from H. pectinata was released, and at ∼300°C,
where an event related to the decomposition of cyclodextrin molecules can be observed. In the DSC
curve acquired from pure β-CD, only the peaks corresponding to the release of water molecules (higher
in the case of complexes), melting and decomposition, appeared (Fig. 2). It is important to note that the
DSC curves of slurry complex and paste complex did not show the melting peak of CD at 200ºC, which
denotes the occurrence of complexation. On the other hand, the DSC curve of physical mixture showed
the melting endothermic event evidencing the complexation not through this method.
76
Fig. 2 DSC curves of essential oil from H. pectinata (EOHP), β-CD, physical mixture (PM), paste complex (PC) and slurry complex (SC) in dynamic nitrogen atmosphere (50 mL.min−1) and hate heat 10 °C.min−1.
The TG curve of the physical mixture showed the superposition of the thermal behavior of the pure
host and guest, indicating multi-step evaporation of the essential oil from H. pectinata and the adsorbed
water content of β-CD up to 270°C (Table 2). That occurred because the essential oil from H. pectinata
shows two continuous weight loss steps, so that the physical mixture exhibits 12.06% up to 140°C and
10.49% up to 270°C. The paste complex showed weight loss of 9.30% up to 140°C and 3.11% up to
270°C. However, the slurry complex samples showed weight losses of 8.91% up to 140ºC and 3.93%
up to 270ºC, and that means that the slurry complex was the best method of complexation, since it was
able to release higher amounts of essential oil in a higher temperature range. This characterized the
complexation phenomenon. Similar results were reported by Menezes et al (2014), who observed
superposition of the thermal behavior in R (-)-linalool and β-CD pure compounds and complexes
[(MENEZES, P. P. et al., 2014)].
77
Fig. 3 TG curves of essential oil from H. pectinata (EOHP), β-CD, physical mixture (PM), paste
complex (PC) and slurry complex (SC) in dynamic nitrogen atmosphere (50 mL.min−1) and hate heat 10 °C.min−1.
Table 2. Mass losses for essential oil from H. pectinata (EOHP), β-CD, physical mixture (PM)
and essential oil from H. pectinata /β-CD complexes.
Weight loss/%
1st step 2ndstep 3rdstep 4th step
EOHP 89.71# 10.29## - -
-CD 12.51 - 72.88 10.76
PM 12.06 10.49 52.33 21.75 PC 9.30 3.11 64.44 18.04 SC 8.91+ 3.93++ 60.53** 21.25***
# percentage of the EOHP evaporates up to 178 °C;## percentage of the EOHP evaporates up to 900 ºCpercentage of water releasing up to 120 °C;
mass loss related to evaporation of the EOHP and the water release up to 140 ºC; mass loss probably attributed to EOHP release in the interval from 140
to 270 °C; thermal decomposition in the interval from 270 to 365 °C; elemental carbon formation due to sample carbonization in the interval from 365 to
900 °C.
As seen from Fig. 4, there were drastic changes in particle shapes and original morphologies of the
inclusion complexes. The complexes between essential oil from H. pectinata and β-CD appeared as
agglomerates. In contrast, the particle morphologies and size of the corresponding physical mixture
(99.6±7.2 µm) were similar to those of β-CD (82.2 ± 11.6 µm) that demonstrated the non-inclusion of
78
the essential oil from H. pectinata at the β-CD cavity. The particle sizes of the physical mixture were
much larger than inclusion complex products, paste complex (43.1 ± 8.3 µm) and slurry complex (4.4 ±
2.4 µm). In addition, it can be observed the amorphization characteristics of the paste complex and
slurry complex samples, indicating the formation the inclusion complexes. The result of slurry complex
corroborates to study of Louiz et al that presented the size particle of 3 µm with inclusion complex of 3-
amino-5-methyl pyrazole with β-CD obtained by co-evaporation method [(LOUIZ; LABIADH; ABDERRAHIM, 2015)].
79
Fig. 4 SEM micrographs of β-CD (A1 and A2), physical mixture (B1 and B2), paste complex (C1
and C2) and slurry complex (D1 and D2) at different magnifications (250x and 500x) of cross-sections
100 and 10 µm, respectively.
This result corroborated with XRD, which showed that different crystal structures for the products
were obtained through paste complex and slurry complex methods. The XRD of the β-CD, physical
80
mixture, paste and slurry complex are shown in Fig. 5. This result demonstrated inclusion complex
formation induced large shifts in the wide-angle XRD signals of β-CD. Furthermore, the paste and slurry
had different XRD signals in relation to physical mixture and β-CD. The physical mixture showed several
peaks characteristics to crystalline β-CD. Only a slight decrease in peak intensity was observed. In
comparison, the complexes obtained by paste and slurry methods showed the disappearance of
reflections and the appearance of new peaks. Menezes et al (2014) obtained similar results [(MENEZES, P.
P. et al., 2014)]. No inclusion complex was obtained through physical mixture, while paste and slurry complex
products showed weak interactions confirming the DSC and TG/DTG results.
Fig. 5 X-ray diffraction of β-CD, physical mixture (PM), paste complex (PC), and slurry
complex (SC).
Martin Del Valle stated that the ability of a cyclodextrin to form an inclusion complex with a guest
molecule is a function of two key factors. “The first is steric and depends on the size of the CD relative
to the size of the guest molecule or certain key functional groups with the guest. If the guest has the
wrong size, it will not fit properly into the cyclodextrin cavity. The second critical factor is the
thermodynamic interactions between the different components of the system (cyclodextrin, guest,
solvent). For a complex to form there must be a favorable net energetic driving force that pulls the guest
into the CD. Another form can be the low chemistry affi -CD” [(VALLE, 2004)].
This is the case of caryophyllene oxide and humulene II epoxide. These oxygenated sesquiterpenes
are complexed in none of the methods studied here. In 1989, Schmid observed that “the potential guest
81
for molecular complexation in CDs is quite varied and includes straight or branched chain aliphatic
compounds, aldehydes, ketones, alcohols, organic acids, aromatics, gases and polar compounds such
as halogens, oxyacids and amines” [(SCHMID, 1989)]. In the present work, forty-four compounds were
identified in oil, being 36.4% monoterpenes and 63.6% sesquiterpenes. Their retention indices and
percentage compositions are given in Table 1. The Table 3 lists the identified compounds extracted from
the physical mixture, paste and slurry complex. In all cases, the concentration of the terpenes in
complexed oil was calculated by the subtraction of the amount of the total oil from the amount of the
surface-adsorbing oil. According to the Tables 3, the essential oil from H. pectinata was complexed in
1: 1 molar ratio by the two complexation methods studied, despite being in a low percentage in the
essential oil. Other terpenes such as β-pinene, p-cymene and germacrene-D were totally complexed
through paste and slurry complex.
In this study, the inclusion complexation methods affected the properties of the final product. Slurry
complex leads to a more efficient complexation of essential oil from H. pectinata terpenes, once that the
(E)-caryophyllene was complexed in one molar ratio 1:35.3 and 1:41 in paste and slurry complexes,
respectively. Liu et al (2013) also demonstrated that the complexation of (E)-caryophyllene into β-CD
[(LIU et al., 2013)]. The larger water quantitative and steric factors can be influenced in this phenomenon.
Furthermore, it is important to note that sesquiterpenes were not lost, but retained on the surface of the
complexes.
“Some high molecular weight compounds such as oils have a tendency to associate with themselves
rather than interacting with cyclodextrin. In such cases, using more water allied with good mixing will
allow better dispersion and separation of the oil molecules or isolation of the oil molecules from each
other. When the oil molecules come into contact with the cyclodextrin, they form a more stable complex
rather than they would if less water were present” [(VALLE, 2004)]. That explains why the slurry procedure
was the best complexation method once that it allows higher complexation percentage of the guest
molecules.
82
Table 3. Characterization of essential oil from H. pectinata, β-CD, physical mixture (PM) and
inclusion complexes obtained by paste complexation (PC) and slurry complexation (SC).
Compound Surface oil Total oil Compl. Oil/% Complexation ratio
Physical mixture (PM)
Menthol 7.64 77.73 70.09 1:9.17
Caryophyllene oxide
32.49 8.40 -
24.09 -
∑ UC# 56.91 13.87 - -
Paste complexation (PC)
Menthol 14.72 52.54 37.82 1:2.56
-pynene - 0.51 0.51 Total
p-cymene - 2.17 2.17 Total
Linalool - 0.96 0.96 Total
copaene - 1.18 1.18 Total
elemene - 0.54 0.54 Total
(E)-caryophyllene
0.40 14.54 14.14 1:35.3
Germacrene-D - 2.26 2.26 Total
Caryophyllene oxide
55.52 19.60 -
35.92 None
∑ UC# 28.19 2.88 - -
Slurry complex (SC)
Menthol 10.74 48.50 37.76 1:3.5
-pynene - 0.34 0.34 Total
p-cymene - 1.80 1.80 Total
Linalool - 0.57 0.57 Total
copaene 1.03 1.17 0.14 1:0.1
elemene 0.18 0.55 0.37 1:2
(E)-caryophyllene
0.49 20.56 14.14 1:41
Germacrene-D - 1.07 1.07 Total
Caryophyllene oxide
57.73 21.33 -
36.40 None
∑ UC# 25.76 2.19 - -
# Unidentified compounds
Dallel and employees described in 1995 that the injection of formalin induces a tissue damage, long-
lasting pain that mimics some features of post-injury pain in man. After the injection into the paw, the
nociceptive behavior consists of a biphasic response [(DALLEL et al., 1995)]. The first phase is related to the
83
direct chemical stimulation of nociceptive nerve endings, which reflect centrally mediated pain with the
release of substance P [(LE BARS; GOZARIU; CADDEN, 2001)]; the second phase is dependent on peripheral
inflammation and changes in central processing and involves serotonin, histamine, bradykinin, nitric
oxide and prostaglandins [(LE BARS et al., 2001)]. Thus, the formalin test is used to evaluate the mechanisms
of pain and analgesia. Therefore, our results suggest that essential oil from H. pectinata and inclusion
complex obtained by slurry procedure possess central and peripheral profiles because they better
inhibited the first and second phase of formalin when compared with control. However, the inclusion
complex produced outstanding analgesic effect when compared with non-complexed essential oil.
Furthermore, in the second phase, the inclusion complex inhibited more the licking paw suggesting its
anti-inflammatory activity. Studies of Fernandes et al (2007) and Raymundo et al (2011) showed that a
high concentration of (E)-caryophyllene is related with the main anti-inflammatory agent and
antinociceptive responses of Cordia verbenacea and H. pectinata respectively, what corroborates with
the present paper [(FERNANDES, E. S. et al., 2007; RAYMUNDO et al., 2011)]. Farther, (E)-caryophyllene, is a CB2
receptor-selective phytocannabinoid, that act modulating the release of pro-inflammatory mediators, as
cytokines, and through of descending pain-inhibitory mechanisms (GERTSCH et al., 2008). In fact, (E)-
caryophyllene can exert analgesic profile through its ability to modulate inflammatory and neuropathic
pain (KLAUKE et al., 2014).
Our results demonstrated that essential oil from H. pectinata and inclusion complex obtained by
means of slurry procedure reduced licking time in two phases in a formalin test (Fig. 6). Furthermore,
the β-CD is considered safe according to Food and Drug Administration (FDA) can being used for
various purposes without showing toxicity (LOFTSSON; BREWSTER, 2010).
84
Fig. 6 Effects of inclusion complex obtained by slurry procedure (OEHP/β-CD) on formalin-
induced licking paw nociceptive behaviour. Vehicle (control), β-CD, essential oil from H. pectinata-OEHP
(40 mg/kg, p.o.), OEHP/β-CD (40 mg/kg, p.o.) were administered 60 min. before formalin injection. First
phase (0–5 min.) and second phase (15–30 min.) of the formalin test. Values represent mean ± S.E.M.
(n = 7 per group). *p < 0.05, **p < 0.001 or ***p < 0.0001 versus control and #p < 0.05, ##p < 0.001 and
###p < 0.0001 versus OEHP (one-way ANOVA followed by Tukey’s test).
The results of this study clearly demonstrated that slurry complex showed a better inclusion profile
of the active and major terpenes, except for caryophyllene oxide, which has no affinity for β-CD. The
results of DSC, TG/DTG, SEM, XRD and GC/MS demonstrated that EOHP/β-CD complexes have
different physicochemical characteristics from oil free, suggesting the successful complexation from
slurry and paste complexation methods. The complex obtained by slurry procedure improve
pharmacological profile of oil alone in experimental pain protocol. Hence, cyclodextrins can be an
85
interesting alternative for the essential oils complexation with possible applicability for the treatment of
painful conditions.
Conflict of interest
The authors report no conflict of interests.
Acknowledgments
The authors would like to acknowledge the financial support provided by the Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Brazil); Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de Sergipe (FAPITEC-SE/Brazil) and Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP/Brazil). We
also would like to thank teacher Abilio Borghi for the gramar review of the manuscript.
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88
CAPÍTULO III
Docking, physico-chemical properties of α- and β-Cyclodextrin Complex
Containing Isopulegol – A comparative study
Artigo enviado à Thermochimica Acta
Fator de impacto 2.105
Qualis Medicina I B1
89
Ms. Ref. No.: TCA-D-14-00801R2
Title: Docking, physico-chemical properties of <alpha>- and <beta>-Cyclodextrin
Complex Containing Isopulegol - A comparative study
Thermochimica Acta
Dear Mrs. Paula Passos Menezes,
I can now inform you that the reviewers and editor have evaluated the manuscript
"Docking, physico-chemical properties of <alpha>- and <beta>-Cyclodextrin Complex
Containing Isopulegol - A comparative study" (Mrs. Paula Passos Menezes). I am pleased to
say that it has been favourably received and publication with minor revision is recommended
Yours sincerely,
Nobuyoshi Koga, Ph.D.
Editor
Thermochimica Acta
90
Original paper
Docking, physico-chemical properties of α- and β-Cyclodextrin Complex
Containing Isopulegol – A comparative study
Paula P. Menezesa*, Grace Anne A. Dóriaa, Adriano A. S. Araujoa, Bruna M. H.
Sousaa, Polliana B. P. Santosa, Lucindo J. Quintans-Júniorb, Rafaely Nascimento Limac,
Péricles Barreto Alvesc, Flávio M. S. Carvalhod, Daniel P. Bezerrae, Francisco J. B.
Mendonça-Júnior f, Luciana Scottig, Marcus T. Scottih, Gabriel F. Silvai, Mairim R.
Serafini a
aDepartment of Pharmacy, Federal University of Sergipe, São Cristóvão, Sergipe,
Brazil
bDepartment of Physiology, Federal University of Sergipe, São Cristóvão,
Sergipe, Brazil
cDepartament of Chemistry, Federal University of Sergipe, São Cristóvão,
Sergipe, Brazil
dDepartament of Mineralogy and Geotectonic, University of São Paulo, São
Paulo, São Paulo Brazil
eGonçalo Moniz Research Center, Oswaldo Cruz Foundation, Salvador, Bahia,
Brazil
fLaboratory of Synthesis and Vectorization Molecules, State University of
Paraíba, Paraíba, Brazil
gFederal University of Paraíba, Paraíba, Brazil
hDepartment of Engineering and the Environment, Federal University of Paraíba,
Rio Tinto, Paraiba, Brazil
iDepartament of Chemical Engineering, Federal University of Sergipe, Sergipe,
Brazil
*Corresponding author. Address: Department of Pharmacy, Federal University of
Sergipe, Av. Marechal Rondon, Jardim Rosa Elze, 49100-000 São Cristóvão, Sergipe,
Brazil. Tel.: +55-79-21056841. Fax: +55-79-21056827.
E-mail: [email protected]
91
Abstract
Isopulegol (p-ment-8-en-3-ol) (ISOP) is a monoterpenoid alcohol, which is
present in the essential oils of several therapeutic plants and a very important
intermediate in the industrial production of (-)-menthol. Recent studies suggest that
ISOP has anticonvulsant activity and antioxidant properties with low toxicity. The
present work aimed to prepare inclusion complexion with ISOP and α- and β-
ciclodextrin through three different methods, physical mixture (PM), paste method (PC)
and slurry complexation (SC), and the complexes obtained were evaluated. In order to
evaluate the formation of complexes in final products, DSC, TG/DTG, FT-IR, XRD,
GC/GCMS methods and SEM were considered. Thermal analyses of the α- or β-
CD/ISOP revealed the formation of a complex; however, the PC and SC were the best
methods for α- and β-CD, respectively. XRD diffraction characteristics presented
formation of an tendency amorphization material, which suggested the formation of
inclusion complexes. The GC/MS demonstrated that the PC method was the best to
form complexation with α-CD (48.8%) and for β-CD, the SC methods exhibited strong
complexation (68.3%). SEM images showed changes of shape and appearance by
inclusion complexes performed by PC and SC methods when compared with α- and
β-CD. Furthermore, the molecular docking study demonstrated that α-CD/ISOP
inclusion complex formed a more stable complex than β-CD/ISOP inclusion complex.
Keywords: Cyclodextrin, Inclusion complexes, Isopulegol, Monoterpenoid
92
1. Introduction
The monoterpenoids are compounds derived from the condensation of molecules
of isoprene (CH2 = C (CH3) -CH = CH2), which are present in great abundance in
essential oils. These compounds may be acyclic compounds (myrcene and geraniol),
monocyclic (α-terpineol and terpineol) and bicyclic (α-pinene and camphor)
(DEGENHARDT et al., 2009). The isopulegol (p-ment-8-en-3-ol) (ISOP) is a
monoterpenoid alcohol which is present in the essential oils of several therapeutic
plants (SILVA, M. I. et al., 2007). It is also a very important intermediate in the industrial
production of (-)-menthol, a substance widely used in pharmaceutical products,
agrochemicals, toothpastes and chewing gum (LENARDÃO et al., 2007).
Figure 1: Molecular structures of (a) (−)-isopulegol, and (b) (+)-isopulegol.
Additionally, ISOP showed anticonvulsant activity and bioprotection effect against
seizures induced by pentilenotetrazol (PTZ). Such actions are possibly related to a
positive modulation of receptor γ-aminobutyric acid (GABAA) and to its antioxidant
properties. These facts indicate that the ISOP could be useful as a new neuroprotective
and anticonvulsant natural agent (SILVA, M. I.; SILVA; et al., 2009). The ISOP also
presented depressant- and anxiolytic-like effects (SILVA, M. I. et al., 2007).
In vivo study of toxicity and immunotoxicity has been evaluated with ISOP. This
substance has shown low toxicity during 14 days after administration of a single dose
(BHATIA et al., 2008) and also showed no suppression of antibody-forming cells or
primary antibody response (BELSITO et al., 2008).
However, essential oils or oily compounds, such as the ISOP, present low water
solubility, low absorption due to its physico-chemical properties and are highly volatile.
Therefore, methods that may improve the pharmacokinetics of these compounds have
been investigated and described in the research and applied technology fields. Among
these methods are the inclusion complex in cyclodextrin (MARQUES, 2010).
a)
93
Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides formed from subunits of α-β-γ-
CDs, which have 6, 7 and 8 glucose monomers, respectively, arranged in a ring shape
(CHEN, W. et al., 2011; TAFAZZOLI; GHIASI, 2009). The diameter of the central
cavity of CDs varies in the following order, α-CD (0.5 -0.6 nm), β-CD (0.6 -0.8 nm), γ-
CD (0.8 -1.0 nm) and allows selectivity for the complexation of different types of
molecules; therefore, the CDs act as molecular encapsulants (GARNERO et al., 2010;
SZEJTLI, 1998). The incorporation of oily compounds in its cavity leads to an increase
in solubility, dissolution, release rates, modification of pharmacokinetics and
disposition of the sustained release of drugs and targeted therapy (MARQUES, 2010).
Considering the pharmacological potential of ISOP and the need to improve its
pharmacokinetic profile, this study aims to elucidate physico-chemical aspects of their
inclusion into α- and β-CDs.
2. Material and methods
2.1 Reagents
The ISOP (lot: #MKBH9947V; purity ≥ 98%), α-CD (lot: #019K1090V; purity ≥ 98%)
and β-CD (lot: #041M1759V; purity ≥ 97%) were purchased from Sigma (St. Louis,
USA). All other chemical reagents were of at least reagent grade and all materials were
used as supplied.
2.2 Preparation of inclusion complexes
Inclusion complexes of α-CD/ISOP and β-CD/ISOP were prepared through three
different methods, physical mixture (PM), paste complexation (PC) and slurry
complexation (SC). The PM was prepared by adding ISOP (154 mg) in an agate mortar
containing powder of α- (972 mg) or β-CD (1135 mg) under manual stirring. The
ISOP/CD molar ratio was maintained as described for the inclusion complex
preparation (1:0.9-α-CD; 1:0.86-β-CD) and were then stored in sealed glass
containers. PC was performed through homogenization α- (972 mg) or β-CD (1135
mg) in water (1.2:4 w/v) directly in an agate mortar. After that, the mixture paste was
kept under a constant manual agitation. Then, the material was dried at room
temperature (in a desiccator) until a glass film was formed, which was removed by
manual trituration and stored in airtight glass containers. Finally, the SC was carried
by adding water to a beaker containing ISOP (154 mg) and α-or β-CD (1135 mg, 3:4
v/w), under magnetic stirring at 400 rpm for 36 hours constantly (Quimis Q 261A21,
94
Brazil). Then, the material was dried in a desiccator and removed by manual trituration
as described in a PC method according to Marreto et al (MARRETO et al., 2008).
2.3 Thermal analysis
Differential scanning calorimeter (DSC) curves were obtained in a DSC-60 cell
(Shimadzu) performed with aluminum crucibles containing about 2 mg of samples,
under dynamic nitrogen atmosphere (50 mL.min-1) and heating rate of 10°C.min-1 in
the temperature range from 25°C to 500°C. The DSC cell was calibrated with indium
(m.p. 156.6°C; DH fus = 28.5 J.g-1) and zinc (m.p. 419.6°C).
Thermogravimetry/derivative thermogravimetry (TG/ DTG) curves were obtained with
a TGA 60 (Shimadzu) thermobalance in the temperature range of 25–900°C,
performed with platinum crucibles containing approximately 3 mg of samples, under
dynamic nitrogen atmosphere (50 mL.min-1) and heating rate of 10°C.min-1. The
TG/DTG was calibrated with calcium oxalate monohydrate, according to ASTM
standard.
2.4 Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy
The infrared spectra of ISOP, α- and β-CD, as well α-CD/ISOP and β-CD/ISOP
prepared through three different methods (PM, PC and SC) were evaluated and the
data of infrared absorption were obtained in the range of 4000–500 cm−1 in KBr pellets
using an IRTracer-100 (Shimadzu) Fourier Transform Infrared Spectrophotometer, at
room temperature.
2.5 Scanning electron microscopy
The α-, β-CD and the three inclusion methods were mounted on aluminum stubs,
coated with a thin layer of gold and visualized with a scanning electron microscope
(JSM-6390-LV JEOL) at an accelerated voltage of 12 kV.
2.6 X-ray diffractometry (XRD)
Powder X-ray diffractometer results were obtained on a Rigaku with a tube of
CuKa, in the range of 3–65 θ (2h) and 1 sec. of pass time, carried out with the XRD
powder (X-ray diffraction) method.
2.7 Gas chromatography/mass spectrometry (GC/GCMS) analyses
GC analysis were performed using a GC-MS/FID (QP2010 Ultra, Shimadzu
Corporation, Kyoto, Japan) equipped with an autosampler AOC-20i auto-injector
(Shimadzu). Separations were accomplished using an Rtx®-5MS Restek fused silica
capillary column (5 %-diphenyl-95-dimethyl polysiloxane) of (30 m x 0.25 mm i.d., 0.25
95
µm film thickness at a constant helium (99.999 %) flow rate of 1.2 mL.min-1. Injection
volume of 0.5 µL (5 mg.mL-1) was employed, with split ratio of 1:10. The oven
temperature was programed from 50°C (isothermal for 1.5 min),with an increase of 4
°C.min-1 to 200 °C, then 10 °C.min-1 to 250 ºC, ending with a 5 min isothermal at 250
ºC.
The FID and MS data were simultaneously acquired using a Detector Splitting
System; the split flow ratio was 4:1 (MS: FID). A 0.62 m x 0.15 mm i.d restrictor tube
(capillary column) was used to connect the splitter to the MS detector; a 0.74 m x 0.22
mm i.d restrictor tube of was used to connect the splitter to the FID detector. The MS
data (total ion chromatogram, TIC) were acquired in the full scan mode (m/z of 40-350)
at a scan rate of 0.3 scan.s-1 using the electron ionization (EI) with an electron energy
of 70 eV. The injector temperature was 250 ºC and the ion-source temperature was
250°C. The FID temperature was set to 250 ºC and ion-source temperature was, and
the gas supplies for the FID were hydrogen, air and helium at flow rates of 30, 300 and
30 mL.min-1, respectively. Quantification of each constituent was estimated by
normalizing the peak area generated in the FID—(%). Compound concentrations were
calculated from the GC peak areas and are arranged in order of elution from the GC.
2.7.1 Extraction of total ISOP
Total ISOP adsorbed in the α- or β-CD was determined through extraction
according to the method described by Marreto et al (MARRETO et al., 2008). Distilled
water (8 mL) plus hexane (4 mL) and 0.2 g of the sample were put in a round-bottom
flask which was kept in a water bath at 85°C for 20 min, with constant shaking. The
organic phase was decanted (3 times) and concentrated to approximately 1 mL using
rotary evaporator. Afterwards, internal standard (menthol, 2 mg) was added and stored
until GC–MS/FID analysis.
2.7.2 Extraction of surface-adsorbed ISOP
The amount of ISOP adsorbed on the surface of α- or β-CD was determined
through washing. Sample (3 g) with hexane (20 mL) was shaken for 20 min. The
suspension was filtered and the residue was washed with hexane (10 mL). After that,
hexane (1 mL) and internal standard (menthol, 2 mg) were added to the filtrate, which
was concentrated using rotary evaporator and analyzed by means of GC-MS/FID.
Thus, the difference between the total ISOP (surface-adsorbed ISOP and hosted in
96
the cavity) and the surface-adsorbed ISOP corresponds to the amount complexed in
the α- or β-CD cavity.
2.8 Molecular Docking between α-, β-CD and ISOP
The chemical structures of the compounds (ISOP and α-, β-CD) were drawn using
Marvin 14.9.8.0, 2014, ChemAxon (http://www.chemaxon.com). The software
Standardizer, JChem 14.9.8.0, 2014, ChemAxon (http://www.chemaxon.com) was used
to canonize structure, add hydrogens, and clean the molecular graph in three
dimensions and finally saved in .sdf format. The process uses a divide-and-conquer
approach. The structure is split into small fragments are organized into a build tree
using their original connectivity information. Conformers generated for the initial
structure (represented by the root node in the build tree) are also optimized. The
building process uses a proprietary extended version of the Dreiding force field
(ALLINGER, 1977).
All geometry optimization and conformational search were performed using
Spartan for Windows 10.0 software (DEWAR et al., 1985). The geometry of the
chemical structure of the compound was initially optimized using MMFF force field
(COHEN, 1996) and, afterwards, we performed a new geometry optimization based
on the semi-empirical method AM1 (Austin Model 1) (LEACH, 2001). We selected the
systematic search method, analyzing until 1000 conformers and selecting until 10
conformers of lowest minimum energy using AM1 and Monte-Carlo algorithm. The
dihedrals were evaluated by rotation in accordance with the standard (default)
conditions of the program. The conformers of lowest minimum energy were selected
and, then performed geometry optimization and vibrational mode calculation using
AM1 (LEACH, 2001).
The docking simulations were performed on the AutoDock 4.2 software. Receptor
and ligand preparation was carried out using and VEGA ZZ 3.0.3 (MOLEGRO) The
structures of ligand and receptor were saved in pqbqt format to be used for docking
calculations. PyRx 0.9 software (WOLF, 2009) - X10] was used to aid the steps of job
submission and analysis of the results. A three dimensional grid box with 50, 44 and
50 points for x, y and z, with a spacing of 0.375 Å, was created. All other parameters
were left at the AutoDock 4.2 default settings (MOLEGRO). The results for each
calculation were analyzed to obtain the affinity energy (Kcal/mol) values for each ligand
conformation in its respective complex and the probable structure inaccuracies were
97
ignored in the calculations. To verify the number of hydrogen bonds, hydrophobic
interactions, and docking interpretation, the program Discovery Studio 4.0 was
employed.
3. Results and discussion
3.1 Thermal analysis
Thermal analyses of the ISOP, α-, β-CD and α- or β-CD/ISOP revealed the
formation of a complex. The DSC curves ISOP show an endothermic peak between
60° and 160°C corresponding to its volatilization (ΔH= 61.8 J.g-1), as it can be seen in
figs. 2A and 2B. The PM, PC and SC show a sharp endothermic peak in the range of
the volatilization of the pure compound (60°C to 160 °C). The DSC curve of α-CD (fig.
2A) indicates three endothermic events in the range of 52-86° C (ΔH= 33.1 J.g-1) and
86-142 °C (ΔH= 63.6 J.g-1) as described by Giordano et al (GIORDANO; NOVAK;
MOYANO, 2001), which corresponds to the dehydration of the molecule. In addition,
in the range of 274-328°C (ΔH= 187.4 J.g-1) occurs the fusion followed by the
decomposition of cyclodextrin molecules. The DSC curves of the α-CD/PM indicate
two endothermic events: the first in the range of 31–149°C (which corresponds to the
release of water molecules as well as to the release of ISOP, probably adsorbed on
the surface, ΔH= 0.7 J.g-1) and the second in the range of 271–351°C (ΔH= 0.5 J.g-1),
where the fusion followed by decomposition of α-CD molecules appears.
Figure 2. DSC curves of ISOP, α- (A), β-CD (B), physical mixture (PM) and
inclusion complex prepared through Paste complexation (PC) and Slurry complexation
(SC) in dynamic nitrogen atmosphere (50 mL.min−1) and heat rate of 10°C.min−1.
The DSC curves of the PC and SC methods with α-CD (fig. 2A) clearly indicate the
difference in relation of the PM, α-CD and ISOP curves. The PC and SC curves display
three endothermic events, PC (34-120°C, ΔH= 0.3 J.g-1; 127-148°C, ΔH= 0.01 J.g-1
and 300-353°C, ΔH= 0.1 J.g-1) and SC (34-102°C, ΔH= 0.2 J.g-1; 111-140°C, ΔH= 0.01
J.g-1 and 243-348°C, ΔH= 0.6 J.g-1). These first and second events show the release
of water and oil. The last event corresponds to the α-CD fusion followed by
decomposition, as is shown by the α-CD and PM curves.
The β-CD curve (fig. 2B) exhibited a broad thermal peak between 30°C and 113°C
(ΔH= 349.5 J.g-1) that correspondents to the water release. From the range of 210-
230°C (ΔH= 6.6 J.g-1) occurs an additional endothermic event characteristic of the
98
crystalline phase transition, that disappears in the PC and SC methods evidencing the
complexation. The presence of a thermal event among 280 and 340°C (ΔH= 410.0 J.g-
1) is generally attributed to the fusion followed by decomposition of the β-CD. The DSC
curve of the β-CD/ISOP prepared by PM was similar to that of pure β-CD, indicating
that β-CD is present in free form in this sample and the ISOP adhered to the surface.
The β-CD/ISOP prepared by PC and SC showed better interaction of the components.
These curves show two endothermic events in the step of 30-137°C (ΔH= 349.5 J.g-1)
water and surface oil loss and 295-353°C (ΔH= 245.2 J.g-1) characteristic of the β-CD
fusion. According to Rajendiran et al and Castronuovo and Niccoli the ΔH value
suggests the inclusion complex formation between ISOP with β-CD indicates strong
interactions between ISOP and CD cavity in this orientation. The value of enthalpy is
the result of several factors, among them the endothermic contribution due to the
disruption of hydrogen bonds between water molecules in the cavity, the endothermic
dehydration of the including hydrophobic guest molecule, and the exothermic
contribution stemming from the van der Waals interactions between the guest and the
cyclodextrin cavity. (CASTRONUOVO; NICCOLI, 2013; RAJENDIRAN;
MOHANDOSS; VENKATESH, 2014). The interaction between host-guest causes an
enthalpy–entropy compensating process in the gas phase whereas the same
interaction causes an enthalpy–entropy codriven process in aqueous solution,
because inclusion complexation releases a number of water molecules from the
cavities of CD (RAJENDIRAN; SIVA, 2014).
The TG/DTG curves of ISOP show two weight loss steps characteristics of
volatilization and decomposition. In the range of 25-146°C, the oil lost 98.2% and in
the second step (146-166°C), the weight loss was 1.7% (fig. 3A and 3B). These results
corroborate with the endothermic event in DSC curve that represents the volatilization
of ISOP. The Table 1 exhibits the range and weight loss of ISOP, α-CD, PM/ α-CD,
PC/ α-CD, SC/ α-CD, β-CD, PM/ β-CD, PC/ β-CD and SC/ β-CD. The α-CD in the
range of 25-111°C and 111-293°C had a weight loss of 10.5 and 2.5% respectively.
The first weight loss is associated to the release of water molecules. Giordano et al.
(GIORDANO et al., 2001) described that α-CD has a water loss and structural
rearrangements at 30-130°C with 6.4% of weight loss; Kohata et al (S.; JYODOI; A.,
1993) affirm that, and in the range of 260-270°C, α-CD had also a release of tightly
bound water. Thus, our study shows in the second step that the SC/ α-CD (Δm=3%)
99
exhibited the weight loss above the α-CD, what can be attributed to the ISOP
complexed, once in this step the α-CD had a weight loss of 2.5% that is attributed to
water tightly bond and the ISOP have been completely volatilized until 166°C. The PM/
α-CD and PC/ α-CD showed weight loss of 1.9% below α-CD, corresponding to water
loss. The TG/DTG curves of β-CD (fig. 3B and Table 1) show four steps of weight loss.
The first step 25-111°C the β-CD lost 11.5% of water according to other studies from
our research group (MENEZES, P. P. et al., 2014; MENEZES, P.P. et al., 2012;
SERAfiNI et al., 2011). Between 111 and 293°C, the TG curve is flat and no mass loss
was detected, and the thermal decomposition (around 65.3%) occurs after 293°C.
Then, a continuous carbonization occurs in a wide temperature range from 421 to
about 900°C (Δm = 21%). The PM/ β-CD, PC/ β-CD and SC/ β-CD lost 2.4, 5.7 and
5.3% respectively between 111-243°C. Therefore, the PC/ β-CD and SC/ β-CD were
able to form inclusion complexes, once in the loss of oil encapsulated was in a major
range of temperature, when compared to water release and surface oil only evaporated
at 166°C. Some authors have described that the formation of inclusion complex
improve the thermal stability of molecules of low solubility (DOS SANTOS; BUERA;
MAZZOBRE, 2011; WANG, XINGE; LUO; XIAO, 2014; WU, H. et al., 2010). This
corroborates with our study that demonstrated ISOP can be form inclusion complex
more stable with CDs (WANG, XINGE et al., 2014).
Del Valle described that oils can be associated in solution, but the increase in water
amount supports the separation of the oil molecules and further the inclusion
complexes formation. For so, some studies suggest the SC as the best method of
inclusion complexes (VALLE, 2004).
Figure 3. TG curves of ISOP, α- (A), β-CD (B), physical mixture (PM) and
inclusion complex prepared through Paste complexation (PC) and Slurry complexation
(SC) in dynamic nitrogen atmosphere (50 mL.min−1) and heat rate of 10 °C.min−1.
100
Table 1. Mass losses for ISOP, α-CD, -CD, PM, PC and SC complexes in
different temperature intervals.
Sample Δm 1/%
(25-111°C)
Δm2/%
(111-293°C)
Δm 3/%
(293-421°C)
Δm 4/%
(421-900°C)
ISOP 98.2* 1.7* - -
α-CD 10.5 2.5 80.3 0.9
PM/ α-CD 18.8 1.9 70.6 6.2
PC/ α-CD 9.2 1.9 76.3 13.0
SC/ α-CD 12.0 3.0 81.7 9.3
-CD 11.5 0.8 67.0 21
PM/-CD 19.2 2.4 65.3 8.2
PC/-CD 10.4 5.7 75.2 9.5
SC/-CD 6.8 5.3 80.4 8.8
* The range of weight loss of ISOP was 25-146°C and 146-166ºC. The other
samples were 25-111°C, 111-293°C, 293-421°C and 421-900°C according to the
subtitle of the table.
3.2 Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy
The FT-IR spectra of ISOP, α- and β-CD, PM/ α-CD, PC/ α-CD, SC/ α-CD, PM/ β-
CD, PC/ β-CD and SC/ β-CD are presented in fig. 4. IR spectra of ISOP consisted of
the prominent absorption bands at 3495-3307 cm-1 for O–H stretching vibrations.
Between 2944-2838 cm-1 bands, the absorption is related to C–H stretching. The 1642
cm-1 band, indicates the presence of stretching or deformation C=C, characteristic of
an alkene group; at the1378 cm-1 region, it corresponds to the deformation of CH3. It
is possible to observe a band approximately at 1031 cm-1 that is related to the vibration
mode of C-O stretching. The band observed in 891 cm-1 corresponds to the stretching
of R2C=CH2.
The infrared absorption of α-CD showed high absorption in 3389 cm-1 for the
stretching vibrations of the hydroxyl groups present in this molecule. The band
observed at 1637 cm-1 is also related to the presence of O-H groups. At the 2920 cm-
1 region, bands correspond to C–H stretching and at the 1409, 1359, 1329, 1293 e
1242 cm-1 bands are associated for CH2 and CH stretching. Other bands are also
101
observed and are attributed to C–O stretching band in 1150, 1182 and 1034 cm-1,
probably related to the hydroxyl and ether groups present at the α-CD. Typical bands
characteristic of C-H bonds vibration and C-C skeleton in the region 1034-706 cm-1
belong to the glucopyranose ring (RAJENDIRAN et al., 2013).
The FT-IR spectrum of β-CD shows a prominent absorption band at 3341 cm-1 (for
O-H stretching vibrations), 1647 cm-1 band is also related to the O-H groups. At 2926
cm-1 (for C-H vibrations, and C-H, C-H2 stretching), 1411, 1368, 1335, 1301 and 1246
cm-1 (for C-H stretching), 1154, 1080 and 1027 cm-1 (for C-O stretching from ether and
hydroxyl groups) and 1000-700 cm-1 (for C-H bonds vibration and C-C skeleton) related
to the glucopyranose ring. Similar results are seen in Menezes et al and Sambasevam
et al, that suggest the complexation of geraniol, linalool and azomethine, respectively
by the FT-IR technique (MENEZES, P. P. et al., 2014; MENEZES, P.P. et al., 2012;
SAMBASEVAM et al., 2013).
Inclusion complex spectra of α- and β-CD/ISOP show alkene vibration at the 1644
cm-1 band, which is the most significant band, indicating the presence of ISOP in
complexes. In all α-CD spectra, similar to β-CD, there were some changes due to the
formation of hydrogen bonds between the molecule of ISOP and the β-CD.
However, the relative intensities of the PM method presented a similar spectrum
compared with α- and β-CD bands, respectively. The regions representing PC and SC
methods showed a large band in 1648 and 2927 cm-1, and high intensity in 944 cm-1,
what represents the best complexation methods for α-CD/ISOP. The intensity of the
bands observed in the spectra that match the inclusion complexes prepared with β-CD
obtained through the PM and PC methods present characteristics, which are similar to
the β-CD spectrum. However, the SC/β-CD inclusion complexes showed an increase
in the intensity of the band observed in 932 cm-1, which features that this was the best
method for forming ISOP/β-CD inclusion complex.
Figure 4. FTIR spectra of ISOP, α- (A), β-CD (B), physical mixture (PM) and
inclusion complex prepared through Paste complexation (PC) and Slurry complexation
(SC).
3.3 Scanning electron microscopy
The SEM images of α-, β-CD, PM and the inclusion complexes prepared through
PC and SC are presented at figures 5A and 5B, respectively. Both CDs are composed
102
by square- and rectangular-shaped crystals in different sizes. The electron microscopic
pictures showed that the structure and the shape of the complexes formed through the
three methods are different. Figure 5A shows α-CD, PM/ α-CD and the inclusion
complexion formed by this crystal, where we can observe the change in the shape and
appearance between them. There were changes in inclusion complexes formed
through the SC method that are amorphous. Figure 5B shows alterations of shape and
appearance using β-CD in PC/ β-CD and SC/ β-CD methods, which are amorphous.
On the other hand, the particle shapes and morphologies of the corresponding PM
were similar to those α- and β-CD, respectively.
Figure 5A. SEM micrographs of cross-sections (x600 and x 1000) of (A) α-CD,
(B) physical mixture (PM), (C) paste complex (PC) and (D) slurry complex (SC).
Figure 5B. SEM micrographs of cross-sections (x600 and x1000) of (A) β-CD,
(B) physical mixture (PM), (C) paste complex (PC) and (D) slurry complex (SC).
3.4 X-ray diffractometry (XRD)
The X-ray diffraction profile of the α- and β-CD, PM, PC and SC are shown at
fig. 6. At the picture 6A and 6B, some sharp reflections at the diffraction angle of 2Ɵ
4.76, 6.12, 9.02, 10.72, 13.98 and 20.70 are present in the X-ray diffractogram of α-
(fig. 6A) and β-CD (fig. 6B), respectively, which shows that they are crystalline
compounds.
Analyzing the diffractograms at fig. 6A and 6B, we can see that the α- and β-
CD/ISOP prepared through the PM method follow the same trend of the α- and β-CD
profile alone, respectively, which confirms the results of DSC and TG of a low degree
of complexation. However, SC/ α-CD and SC/ β-CD, especially, showed a reduction in
the number of these reflections suggesting the formation of an amorphous material
and, consequently, more soluble.
Figure 6. X-ray diffraction of α- (6A), β-CD (6B) and samples prepared through
three different methods, physical mixture (PM), Paste complexation (PC) and Slurry
complexation (SC).
3.5 Total and surface oil of α- and β-CD/ISOP complex
103
The inclusion complex formation prepared through the three different methods
was determined by GC–MS, as is given in Table 2. The GC/MS of PM, PC and SC
with α- and β-CD demonstrated that PC was the best method of inclusion complex with
α-CD, totaling 48.8% of complexed ISOP. This value represents to ratio between %
ISOP complexed (total oil – surface oil) under % ISOP uncomplexed (surface oil). The
samples with β-CD, exceptionally for the SC, exhibit the strong complexation with
68.3% of complexation ratio. These results confirm the previous results that indicate
the best procedure was PC/ α-CD for α-CD and SC/ β-CD as the best method for
formation of inclusion complexes with β-CD.
Table 2.Characterization of ISOP α- and β-CD by procedures of physical
mixture (PM), paste complexation (PC) and slurry complexation (SC).
Sample Surface
oil/%
Total
oil/
%
ISOP
Complex/%
Complexation
Ratio/%*
PM/α-CD 76.58 94.72 18.14 1:1.24
PC/α-CD 1.24 61.71 60.47 1:48.8
SC/α-CD 2.77 57.97 55.20 1:19.9
PM/β-CD 64.31 77.81 13.50 1:0.2
PC/β-CD 15.41 66.92 51.51 1:3.3
SC/β-CD 0.86 59.62 58.76 1: 68.3
*ratio between % ISOP complexed (total oil – surface oil) under % ISOP
uncomplexed (surface oil).
The GC results corroborate the results obtained by TG. According to Table 2 it
can be seen that the physical mixture favors the incorporation of the compound on the
surface. This can be seen in Table 2 (surface oil /%) and Table 1 (Δm 1 /% - 25-111 °
C), wherein the oil percentage is higher. TG results show that the methods of paste
and coevaporation complexed increase oil content in the cavity. This increase can be
seen in the percentage mass loss of the second stage of decomposition of the complex
(Δm 2 /% - 111-293 ° C) which is confirmed by GC as noted in Table 2 (Complex ISOP
/%).
3.6 Molecular Docking between α-, β-CD and ISOP
According to in silico data (fig 7), the α-CD formed more stable inclusion
complex with lower energy when compared with β-CD. This result indicates that lower
104
affinity energy suggests stronger binding as described by Ren et al., 2014 (REN et al.,
2014). Thus, the score observed was the most stable ΔE=-4.53kcal.mol-1 for the
inclusion complex with α-CD and less stable with ΔE=-4.13 kcal.mol-1 for β-CD/ISOP.
We believe that the internal space of the cavities to influence interactions. The smallest
cavity in α-CD (0.5-0.6 nm) compared with β-CD (0.6 - 0.8 nm) facilitates the closeness
of atoms, and therefore, the formation of sterics mainly, but also hydrogen bonds that
corroborates with ΔH value. Negative values of ΔH indicated hydrophobic non-covalent
interactions which may be stabilized by hydrogen bonding, as was confirmed by the
molecular docking (BUDRYN et al., 2015). The figure 7 shows that ISOP fits into the
cavity of the α-CD in opposite position of β-CD, in the last the propenyl group of ISOP
is totally inside the cavity unlike the former that the methyl group of ISOP is inserted
together with the cyclohexanol group. The solvent accessibility surface aid to visualize
the bigger cavity of the β-CD and that ISOP fits better in smallest cavity of α-CD.
Figure 7. Best docking results of ISOP with a) α-CD and b) β-CD. The dashed
lines represent the hydrogen bonds interactions and the white surfaces represent
solvent accessibility surfaces.
4. Conclusion
The results showed that α- and β-CDs formed inclusion complexes of ISOP.
That can be attributed to the cavity size of CDs and the affinity of ISOP to it.
Furthermore, the physicochemical characterization indicates that the best inclusion
complexes were formed through the PC/ α-CD and SC/ β-CD methods.
Conflict of interest
The authors have declared that there is no conflict of interest.
Acknowledgements
The authors are grateful to CAPES, CNPq, FINEP and FAPITEC/SE for financial
support and fellowships. We thank Maria Lúcia Vieira Moreno, Cláudio Pereira Figueira
and Prof. Adriana Lanfredi Rangel for the images of SEM in the Gonçalo Moniz
Research Center, Oswaldo Cruz Foundation.
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108
CAPÍTULO IV
CONCLUSÃO GERAL, PERSPECTIVAS, REFERÊNCIAS
109
4 CONCLUSÃO GERAL
Uma vez caracterizadas as amostras do OEHP, foi observado que o CE
apresentou capacidade de complexação superior aos outros métodos utilizados e
demonstrou melhor atividade antinociceptiva e anti-inflamatória quando comparado
com o óleo puro. Já o ISOP formou complexos de inclusão preferencialmente com α-
CD pelo método da MA e da CE com β-CD. Assim, a técnica de complexação é
promissora no sentido de otimizar as características físico-químicas e melhorar a
atividade farmacológica de substâncias de baixa solubilidade.
110
5 PERSPECTIVAS
Realizar estudo de RMN a fim de elucidar a estrutura do complexo formado
entre ISOP em α- e β-CDs
Realizar estudos de dissolução
Realizar testes farmacológicos e toxicológicos dos complexos com OEHP e
ISOP
Realizar o doseamento das amostras a fim de avaliar a concentração final dos
complexos
Investigar a farmacocinética dos complexos de inclusão estudados
Determinar constante de complexação
Realizar estudo de solubilidade
111
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ANEXOS
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ANEXO 1: PROTOCOLO DE APROVAÇÃO NO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
COM ANIMAIS DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
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