Download - UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

Transcript
Page 1: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA

SAÚDE

PAULA DOS PASSOS MENEZES

OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA

DE COMPLEXOS SUPRAMOLECULARES DE ÓLEO

ESSENCIAL E SUBSTÂNCIA ISOLADA EM

CICLODEXTRINAS

ARACAJU

2015

Page 2: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

PA

UL

A D

OS

PA

SS

OS

ME

NE

ZE

S

OB

TE

ÃO

E C

AR

AC

TE

RIZ

ÃO

FÍS

ICO

-QU

ÍMIC

A D

E C

OM

PL

EX

OS

SU

PR

AM

OL

EC

UL

AR

ES

DE

ÓL

EO

ES

SE

NC

IAL

E S

UB

ST

ÂN

CIA

ISO

LA

DA

EM

CIC

LO

DE

XT

RIN

AS

20

15

Page 3: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

PAULA DOS PASSOS MENEZES

OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-

QUÍMICA DE COMPLEXOS SUPRAMOLECULARES

DE ÓLEO ESSENCIAL E SUBSTÂNCIA ISOLADA EM

CICLODEXTRINAS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de

Mestre em Ciências da Saúde.

Orientadora: Profa. Dra. Mairim Russo Serafini

ARACAJU

2015

Page 4: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

M543o

Menezes, Paula dos Passos

Obtenção e caracterização físico-química de complexos

supramoleculares de óleo essencial e substância isolada em

ciclodextrinas / Paula dos Passos Menezes ; orientador Mairim

Russo Serafini. – Aracaju, 2015.

119 f. : il.

Dissertação (mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade

Federal de Sergipe, 2015.

1. Essências e óleos essenciais – físico-química. 2. Ciclodextrinas. 3. Plantas medicinais. 4.Terpenos. I. Serafini, Mairim Russo, orient. II. Título.

CDU 615.32.011

Page 5: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

PAULA DOS PASSOS MENEZES

OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-

QUÍMICA DE COMPLEXOS SUPRAMOLECULARES

DE ÓLEO ESSENCIAL E SUBSTÂNCIA ISOLADA EM

CICLODEXTRINAS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de

Mestre em Ciências da Saúde.

Orientadora: Profa. Dra. Mairim Russo Serafini

_______________________________________________ 1º Examinador: Prof. Dr. Jose Lamartine Soares Sobrinho

_______________________________________________

2º Examinador: Prof. Dra. Juliana Cordeiro Cardoso

Page 6: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, fonte inesgotável de estímulo ao meu crescimento profissional

Page 7: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

AGRADECIMENTOS

“Se hoje posso ver mais longe, foi por estar de pé sobre ombro de gigantes”

Isaac Newton

Aqui, agradeço a todos os gigantes que me acolheram sobre seus ombros e

me mostraram o caminho que me faz feliz e realizada.

- A Deus por sua infinita bondade e misericórdia. Obrigada Senhor por iluminar

os meus caminhos e ouvir as minhas preces.

- Aos meus pais José e Joseane, meus primeiros mestres. Que sonham comigo

e vibram intensamente nas minhas vitórias. Obrigada meus amores essa conquista é

dedicada a vocês. Exemplos de garra e perseverança.

- A minha irmã, Patrícia por compartilhar todos os momentos desde os mais

difíceis aos mais felizes.

- Ao meu namorado Vinícius, pelo amor, compreensão, incentivo e paciência.

- A minha amiga e orientadora Mairim Serafini. Minha admiração por você é

enorme. Sempre me espelhei nas suas ações e tem muito de você na pessoa que me

tornei. Obrigada por todos os ensinamentos.

- Ao Prof. Adriano Antunes que apresentou a pesquisa acadêmica e me fez

perceber o quanto é gratificante fazer aquilo que nos fascina. Desenvolver pesquisa

me fascina. Obrigada professor pela amizade e incentivo constante.

- Aos colaboradores do nosso grupo de pesquisa que são fundamentais na

realização deste e de outros trabalhos.

- A todos integrantes do LeFT, que são a força motriz dos produtos gerados no

nosso estimado laboratório. Em especial agradeço a Grace, Yasmim e aos meus

queridos ICs Bruna, Dayanne, Francielly, Igor, Isabella, Saulo e Tattiany pela

dedicação e amizade.

- Aos meus amigos do mestrado Francielly, Heitor, Jucy, Marília, Paulinha e

Priscila pelo carinho e por compartilharem uma fase tão importante da minha vida.

- A todos que fazem o NPGME.

- A Fapitec pelo financiamento através da bolsa concedida para realização do

Mestrado.

Page 8: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

RESUMO OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DE COMPLEXOS SUPRAMOLECULARES DE ÓLEO ESSENCIAL E SUBSTÂNCIA ISOLADA EM CICLODEXTRINAS, PAULA DOS PASSOS MENEZES. ARACAJU, 2015

Os óleos essenciais são metabólitos secundários das plantas constituídos de

terpenos. Tais moléculas orgânicas caracterizam-se por apresentar atividades farmacológicas importantes como anti-inflamatória, antinociceptiva, antimicrobiana, dentre outras. Dessa forma, o óleo essencial da Hyptis pectinata (OEHP), uma planta odorífera nativa dos estados de Alagoas e Sergipe e bastante utilizada pela população, tem despertado interesse dos pesquisadores com o objetivo de validar o seu uso popular. Além disso, o isopulegol (ISOP), um monoterpeno importante na indústria por suas propriedades flavorizantes e medicinais tem sido objeto de investigação na pesquisa científica. Entretanto, o OEHP, bem como o ISOP apresentam características físico-químicas como solubilidade limitada em água, elevada volatilização, fotossensibilidade e fácil oxidação. Nessa perspectiva, uma alternativa para preservar as características dessas substâncias é a formação de complexos supramoleculares envolvendo ciclodextrinas (CDs). As CDs apresentam uma estrutura molecular adequada para a formação de complexos de inclusão uma vez que possuem cavidade apolar e superfície hidrofílica. Assim, os complexos de inclusão de óleos essenciais e CDs melhoram as características físico-químicas dessas moléculas de modo a otimizar a atividade farmacológica das mesmas. Diante disto, o objetivo do presente estudo foi realizar a identificação dos constituintes químicos do OEHP através da cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas com detector de chamas (CG-EM/DIC) e a partir daí preparar as amostras com β-CD e do ISOP em α- e β-CDs através dos métodos da mistura física (MF), malaxagem (MA) e co-evaporação (CE). Além disso, foi realizada a caracterização físico-química das amostras através das técnicas de calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG), espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), microscopia eletrônica de varredura, difração de raios-X (DRX), eficiência de complexação através da CG-EM/DIC, ensaio farmacológico de formalina com o melhor complexo obtido do OEHP e estudo de modelagem molecular (Docking) para o ISOP e CDs. Diante dos resultados obtidos, foram observados três constituintes majoritários no OEHP, (E)-cariofileno (54,07%), óxido de cariofileno (14,91%) e germacreno-D (7,46%). Os resultados de caracterização físico-química demonstraram que o CE foi o melhor método para complexar o (E)-cariofileno e o germacreno-D, o óxido de cariofileno não foi complexado e isso pode estar relacionado a sua baixa afinidade pela cavidade da β-CD. O teste de formalina demonstrou melhor atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do OEHP/β-CD quando comparado com o OEHP puro que pode ser atribuída ao elevado percentual de (E)-cariofileno complexado. Em relação ao ISOP, foi observado que a α-CD forma complexos de inclusão mais estáveis que a β-CD, pela análise de Docking, e a MA/α-CD forneceu uma maior razão de complexação em relação a MF e CE. Já o CE obtido com β-CD apresentou maior taxa de inclusão molecular. Assim, as técnicas utilizadas foram eficientes na complexação do OEHP e ISOP.

Palavras-Chave: α-ciclodextrina; β-ciclodextrina; monoterpeno; plantas medicinais

Page 9: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

ABSTRACT OBTAINMENT AND PHYSICOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF COMPLEXES SUPRAMOLECULARS ESSENTIAL OIL AND SUBSTANCE ISOLATED ON CYCLODEXTRINS, PAULA DOS PASSOS MENEZES. ARACAJU, 2015

The essential oils, which are secondary metabolites produced by plants. These

metabolites are part of the group of terpenes. Such organic molecules are characterized by presenting important pharmacological activities such as anti-inflammatory, antinociceptive, antimicrobial, among others. Thus, the essential oil of Hyptis pectinata (EOHP), a native fragrant plant of the states of Alagoas and Sergipe and widely used by the population, has attracted attention of researchers in order to validate its popular use. In addition, the isopulegol (ISOP), a major monoterpene in the industry for their flavoring properties and medicinal has been the subject of research in scientific research. However, EOHP present ISOP and the physico-chemical characteristics and limited water solubility, high volatilization photosensitivity and easy oxidation. In this perspective, an alternative to preserve the characteristics of these substances is the formation of supramolecular complexes involving cyclodextrins (CDs). The CDs have a molecular structure suitable for the formation of inclusion complexes since they have polar and hydrophilic surface cavity. Thus, the inclusion complex of essential oils and CDs improve the physico-chemical properties of these molecules to optimize the pharmacological activity thereof. Hence, the aim of this study was to identify the chemical constituents of OEHP by gas chromatography coupled to mass spectrometry with flame detector (GC-MS/FID) and from there to prepare the samples with β -CD and ISOP in the α- and β-CD by the methods of the physical mixture (PM), paste complexation (PC) and slurry complexation (SC). Furthermore, the physico-chemical characterization of the samples through the techniques of differential scanning calorimetry (DSC) was performed thermogravimetry/derivative thermogravimetry (TGA/DTG) absorption spectrophotometry in the infrared Fourier transform spectroscopy (FT-IR) scanning electron microscopy, X-ray diffraction (XRD), complexation efficiency by GC-MS/FID, pharmacological test formalin with the best complex obtained from OEHP and study of molecular modeling (docking) to isopulegol and CDs. Based on these results, we observed three major constituents in OEHP, (E) -caryophyllene (54.07%), caryophyllene oxide (14.91%) and germacrene-D (7.46%). The results of physicochemical characterization showed that the EC was the best method to complex (E)-caryophyllene and germacrene-D, caryophyllene oxide has not been complexed and this may be related to its low affinity for the cavity of β- CD. The formalin test showed a better antinociceptive and anti-inflammatory OEHP / β-CD when compared with pure EOHP that can be attributed to the high percentage of (E) -caryophyllene complexed. Regarding isopulegol, it was observed that α-CD complexes more stable inclusion of the β-CD, as showed in the docking analysis and PC/α-CD gave a higher ratio of complexing with respect to PM and SC. But the SC obtained with β-CD showed the highest molecular inclusion. Thus, the techniques used were efficient in the complexation of EOHP and ISOP.

Keywords: α-cyclodextrin; β-cyclodextrin; monoterpene; medicinal herbs

Page 10: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Atividades farmacológicas descritas para a Hyptis pectinata 8

Tabela 2: Atividades farmacológicas descritas para o ISOP 11

Tabela 3: Características das CDs naturais 12

Tabela 4: Medicamentos comercializados contendo CDs 16

Page 11: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura química da cadeia carbônica do isopreno 4

Figura 2: Representação esquemática dos principais constituintes dos

óleos essenciais

5

Figura 3: Estrutura química do (-)-ISOP (esquerda) e do (+)-ISOP (direita) 10

Figura 4: Estrutura química das CDs naturais 12

Figura 5: Estrutura e respectivos tamanhos das cavidades da α-, β- e γ-

CDs

13

Figura 6: Distribuição relativa das CDs utilizadas no mercado farmacêutico 15

Figura 7: Representação esquemática da formação de complexo de

inclusão entre uma CD e p-xileno. As esferas representam as

moléculas de água

17

Figura 8: Ilustração esquemática da associação de uma molécula

hidrofóbica e uma CD em diferentes razões molares

18

Figura 9: Modelo esquemático da farmacocinética dos complexos de

inclusão

19

Figura 10: Comparação esquemática da digestão das CDs naturais por

amilases. As CDs que são digeridas lentamente por amilases são

rapidamente digeridas por bactérias

20

Figura 11: Dissolução e absorção do piroxicam livre e complexado em β-

CD. kd: constante de dissolução, kc: constante de equilíbrio para

formação de complexos de inclusão e ka: constante da razão de

absorção

20

Figura 12: Conformação de menor energia do complexo de inclusão da

miricetina em β-CD obtido por Docking utilizando o software

Hiperchem® (A) e (B) representação esquemática do mesmo

complexo onde amarelo representa a miricetina e as cores

branca e vermelha a β-CD

28

Page 12: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A Fator pré-exponencial

CAPS Cápsula

CDs Ciclodextrinas

CG/EM Cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

CMEβCD O-carboximetil-O-etil-β-CD

COL Colírio

COMP Comprimido

DRX Difração de raios X

DSC Calorimetria exploratória diferencial

ΔG Energia livre de Gibbs

ΔH Entalpia

ΔS Entropia

E Energia de ativação

EA Extrato aquoso

EC Extrato clorofórmico

EE Extrato etanólico

EM Extrato metanólico

EUA Estados Unidos

FDA Food and Drug Administration

FTIR Espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com

transformada de Fourier

HPβCD Hidroxipropil-β-CD

II Infusão intravenosa

ISO International Organization for Standardization

ISOP (-)-isopulegol

Kc Constante de estabilidade

MβCD Metil-β-CD

MEP 2-C-metil-eritritol-4-fosfato

MEV Microscopia eletrônica de varredura

Page 13: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

NA Não houve associação

OE Óleo essencial

OEHP Óleo essencial de Hyptis pectinata

PA Panjab University, India

POM Pomada

RMβCD β-CD randomicamente metilada

SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD

SI Solução intravenosa

SN Solução nasal

SIM Solução intramuscular

SO Substrato

SO Solução oral

SP Solução parenteral

SPS Supositório

RMN Ressonância magnética nuclear

TAβCD Triacetil-β-CD

TB Comprimido

TG/DTG Termogravimetria/termogravimetria Derivada

UEN University of Erlangen-Nuernberg

UFAL Universidade Federal de Alagoas

UFC Universidade Federal do Ceará

UNAM Universidade Nacional Autônoma do México

UFPE Universidade Federal de Pernambuco

UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro

UFS Universidade Federal de Sergipe

UV/vis Ultravioleta/visível

Page 14: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

SUMÁRIO CAPÍTULO I ............................................................................................................................... 1

1 INTRODUÇÃO ……………………………………………………………….………………………2

2 REVISÃO DA LITERATURA ………………………………………………………………………3

2.1 Óleos essenciais ................................................................................................................. 3

2.2. Mono- e sesquiterpenos ................................................................................................... 38

2.3. Limitações farmacotécnicas e estratégias ....................................................................... 41

2.3.1 Lipossomas .................................................................................................................... 41

2.3.2 Nanopartículas ............................................................................................................... 42

2.3.3 Micropartículas ............................................................................................................... 42

2.3.4 Ciclodextrinas ................................................................................................................. 42

2.4 Complexos de inclusão ..................................................................................................... 48

2.5 Métodos de obtenção de complexos de inclusão ............................................................. 52

2.6 Técnicas analíticas de caracterização de complexos de inclusão ................................... 54

3 OBJETIVO GERAL .............................................................................................................. 64

3.1 Objetivos específicos ........................................................................................................ 64

CAPÍTULO II ........................................................................................................................... 65

Physicochemical characterization and analgesic effect of inclusion complexes of essential oil from Hyptis pectinata L. Poit leaves with β-cyclodextrin .......................................................................

CAPÍTULO III .......................................................................................................................... 89

Docking, physico-chemical properties of <alpha>- and <beta>-Cyclodextrin Complex Containing Isopulegol - A comparative study

CAPITULO IV …..………………………………………………………………………………….108 Conclusão geral, perspectivas, referências

4 CONCLUSÃO GERAL……………………………………………………………..……………109

5 PERSPECTIVAS………………………………………………………………………………….110

6 REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 111

ANEXOS

Page 15: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

1

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO, REVISÃO DE LITERATURA E

OBJETIVOS

Page 16: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

2

1 INTRODUÇÃO

Uma análise das estratégias utilizadas na descoberta de novos medicamentos

demonstrou que 36% das moléculas aprovadas nos Estados Unidos pelo Food and

Drug Administration (FDA) entre os anos de 1999 e 2008 foram produtos naturais ou

derivados de produtos naturais (DU; TANG, 2014). Nesse contexto inserem-se os

óleos essenciais que são misturas complexas de compostos orgânicos voláteis

produzidos como metabólitos secundários de plantas e constituídos por terpenos. Os

monoterpenos perfazem 90% dos óleos essenciais e apresentam propriedades

farmacológicas relevantes, tais quais antimicrobiana, hipotensiva, anti-inflamatória e

antipruriginosa (GUIMARAES; QUINTANS; QUINTANS, 2013). Todavia, a

insolubilidade aquosa, baixa razão de dissolução, instabilidade e curta meia-vida

atreladas a facilidade de oxidação e hidrólise limitam a utilização terapêutica dos

terpenos (SIQUEIRA-LIMA et al., 2014; TUREK; STINTZING, 2013).

Dentre os óleos essenciais com potencial terapêutico largamente estudados na

Região Nordeste do Brasil, encontra-se o óleo essencial de Hyptis pectinata (OEHP).

A Hyptis pectinata (L.) Poit (Lamiaceae) é um arbusto odorífero de baixa densidade

foliar que ocorre nos estados de Alagoas e Sergipe, sendo conhecida popularmente

como “sambacaitá” ou “canudinho” (NASCIMENTO, P. F. et al., 2008; PAIXAO et al.,

2013; SANTOS, P. O. et al., 2008). No grupo dos terpenos, encontra-se o (-)-

isopulegol (ISOP), p-ment-8-en-3-ol, um monoterpeno alcóolico encontrado nos óleos

essenciais de várias plantas tais como Eucalyptus citriodora e Corymbia citriodora

com propriedades ansiolíticas e anticonvulsivantes já relatadas na literatura

(CEBORSKA; SZWED; SUWINSKA, 2013). Entretanto, possui as mesmas limitações

de alguns óleos essenciais como odor desagradável e elevada volatilidade (CHEN, Y.

et al., 2014). Dessa forma, pesquisas recentes têm demonstrado que é possível

contornar a baixa solubilidade e melhorar as características físico-químicas de

moléculas instáveis, tais como terpenóides (MENEZES, P. P. et al., 2014; MENEZES,

P.P. et al., 2012; SAMBASEVAM et al., 2013; SERAfiNI et al., 2011; SERAFINI et

al., 2012; XU et al., 2014).

Nesse cenário, inserem-se as ciclodextrinas (CDs), oligossacarídeos cíclicos com

6-8 unidades de glicopiranose (α-, β-, γ-), respectivamente. O limitado número de

grupos hidroxila livres orientados para o interior da cavidade faz com que esta

Page 17: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

3

apresente um caráter hidrofóbico, enquanto o exterior é hidrofílico e isto as

credenciam como veiculadores eficientes de moléculas como compostos inorgânicos,

fármacos, e terpenos em meios aquosos (HĂDĂRUGĂ, N. G., 2012; PORTE; PORTE;

OLIVEIRA, in press; RAJENDIRAN; S.; J., 2013). A formação de complexos de

inclusão com CDs tem sido amplamente utilizada para melhorar a biodisponibilidade

de fármacos fracamente solúveis, aumentando sua solubilidade, dissolução e/ou a

permeabilidade (BADR-ELDIN; ELKHESHEN; GHORAB, 2008; MENEZES, P. P. et

al., 2014; MENEZES, P.P. et al., 2012).

Diante disto, nosso grupo de estudo vem desenvolvendo vários trabalhos no

sentido de melhorar as propriedades físico-químicas dos principais terpenos com

atividades farmacológicas promissoras e com isso otimizando o efeito dessas

moléculas em alguns modelos pré-clínicos (LINS et al., 2014; MENEZES, P. P. et al.,

2014; MENEZES, P.P. et al., 2012; NASCIMENTO, S. S. et al., 2014; PS et al., 2014;

QUINTANS-JUNIOR et al., 2013; QUINTANS JDE; MENEZES; et al., 2013; SERAfiNI

et al., 2011; SIQUEIRA-LIMA et al., 2014). Diante do potencial terapêutico

demonstrado pelos óleos essenciais e substâncias isoladas aliado a reduzida

solubilidade aquosa e características físico-químicas desfavoráveis à administração

destas moléculas, a formação de complexos de inclusão do OEHP e do ISOP torna-

se interessante com o objetivo de caracterizar o material de modo a melhorar a

biodisponibilidade e facilitar a administração destas moléculas.

A presente dissertação está dividida em quatro capítulos, sendo o primeiro

referente a introdução, revisão da literatura e objetivos, cuja finalidade foi fazer uma

abordagem do tema e elucidar os objetivos a serem alcançados; os capítulos 2 e 3

apresentam os artigos gerados no decorrer da pesquisa e por fim, o quarto capítulo

apresenta a conclusão, perspectivas desta pesquisa, bem como as referências

utilizadas.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Óleos essenciais A Organização Internacional de Normatização, do inglês “International Organization

for Standardization” (ISO), define óleo essencial como um “produto obtido de material

vegetal por destilação com água ou vapor ou a partir do epicarpo de frutas cítricas por

um processo mecânico, ou a seco por destilação” (ISO, 1997). Os óleos essenciais

Page 18: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

4

são extraídos de várias plantas aromáticas, geralmente localizadas em países de

clima temperado a quente, como os países mediterrâneos e tropicais, onde eles

representam uma parte importante da farmacopeia tradicional (BAKKALI et al., 2008).

Nas últimas décadas, o potencial terapêutico de óleos essenciais e os seus

constituintes tem sido alvo de pesquisadores na busca de novos medicamentos de

origem vegetal, no tratamento e prevenção de diversas doenças (DE CASSIA DA

SILVEIRA et al., 2014)

Além disso, os óleos essenciais caracterizam-se por serem metabólitos

secundários das plantas, são geralmente incolores, solúveis em lipídios e solventes

orgânicos, apresentam densidade inferior à da água e possuem elevada volatilidade

(BILIA et al., 2014). Eles incluem hidrocarbonetos (monoterpenos e sesquiterpenos)

(Figura 2), bem como compostos oxigenados (álcoois, ésteres, éteres, aldeídos,

cetonas, lactonas, fenóis e éteres fenólicos) (BILIA et al., 2014). Os terpenos

englobam mais de 50.000 estruturas de diversos compostos químicos, os quais são

classificados pelo número de unidades isoprênicas (C5H8) (Figura 1) (BARRETO et

al., 2014; SOUZA et al., 2014).

Figura 1: Estrutura química da cadeia carbônica do isopreno.

Fonte Lin et al, 2013 (LIN et al., 2013)

Ademais, esses metabólitos secundários são constituídos de compostos voláteis

(principalmente mono- e sesquiterpenos, fenilpropanóides, e outros compostos

voláteis) que exercem atividades biológicas em animais, humanos e outras plantas

(ADORJAN; BUCHBAUER, 2010). Em virtude disso, os óleos essenciais são

largamente utilizados na indústria alimentícia, farmacêutica e na agricultura, devido as

suas propriedades antimicrobiana, antiviral, nematicida, fungicida, inseticida, bem

como antioxidantes ou estimulantes do sistema nervoso central (TUREK; STINTZING,

2013).

Page 19: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

5

Tendo em vista a grande diversidade de propriedades farmacológicas descritas

para os óleos essenciais, são necessários protocolos científicos que validem o uso

popular. Nesse contexto, a triagem antinociceptiva e anti-inflamatória engloba os

testes de contorções abdominais induzida por ácido acético, formalina e placa quente.

O teste de contorções abdominais é descrito como um modelo de nocicepção

inflamatória visceral e conduz a avaliação a nível central e periférico de determinadas

substâncias. Isso ocorre porque o ácido acético ativa diretamente os canais catiônicos

localizados nas vias aferentes primárias e desencadeia a liberação dos mediadores

inflamatórios levando a liberação de aspartato e glutamato no fluido cérebro-espinhal.

Após injeção intraperitoneal, o animal apresenta constrição da parede abdominal que

pode ser acompanhada por rotação do tronco e extensão dos membros posteriores

(BRITO et al., 2012; MELO, M. S. et al., 2010).

Partindo desse conceito, o teste da formalina conduz a uma resposta bifásica e é

um instrumento bastante utilizado nos estudos de dor em animais, sendo mais válido

que testes mecânicos e térmicos. A primeira fase do teste ocorre logo após a injeção

de formalina e estende-se por cinco minutos (dor neurogênica ou aguda), sendo

caracterizada pela estimulação química direta dos nociceptores das fibras aferentes

do tipo C e, em parte, das fibras do tipo Aδ estando associada à liberação de

aminoácidos excitatórios, óxido nítrico e substância P. Já a segunda fase (15 a 30

minutos após a injeção de formalina), ocorre a nível periférico e caracteriza-se como

inflamatória por meio da liberação dos mediadores pró-inflamatórios e pode ser

bloqueada pelos inibidores da ciclo-oxigenase (COX). O intervalo de quiescência entre

a primeira e a segunda fase é resultado de uma inibição da transmissão nociceptiva

através de circuitos supra-espinhais e espinhais. Nessa perspectiva, a vantagem

deste método consiste na avaliação de dois tipos distintos de dor, possibilitando a

investigação de analgésicos com diferentes mecanismos de ação (ALMEIDA et al.,

2013; BRITO et al., 2012; DALLEL et al., 1995; QUINTANS, J. S. S. et al., 2014).

Por fim, o teste da placa quente avalia o tempo em que os animais permanecem sobre

uma chapa metálica aquecida (55 ± 0,5ºC) até reagirem ao estímulo térmico com o

comportamento de levantar ou lamber as patas. Os animais são observados 30, 60,

90 e 120 minutos após as substâncias em análise serem administradas, quanto ao

efeito central das mesmas através da ativação dos receptores vanilóides (BARROT,

2012; JULIUS; BASBAUM, 2001).

Page 20: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

6

Assim, diversos estudos têm reportado a atividade farmacológica de óleos

essenciais, principalmente aqueles oriundos das plantas medicinais comuns na região

Nordeste do Brasil. Em 2008, Arrigoni-Blank et al demonstraram o efeito

antinociceptivo do OEHP por vias centrais e periféricas (ADORJAN; BUCHBAUER,

2010; ARRIGONI-BLANK et al., 2008). Caldas et al e Diniz et al, atestaram o potencial

antiulcerogênico do óleo essencial da Hyptis martiusi e Hyptis crenata,

respectivamente certificando o uso popular destas plantas (CALDAS et al., 2011;

DINIZ et al., 2013). Em adição, um estudo de Siqueira et al, evidenciaram o potencial

anticâncer in vitro e in vivo da Xylopia laevigata (QUINTANS JDE; SOARES; et al.,

2013). Os óleos essenciais de Lippia sidoides, Lippia origanoides, Chenopodium

ambrosioides e Ocimum. gratissimum demonstraram baixa toxicidade e significativa

atividade tripanocida no estudo de Borges et al (BORGES et al., 2012).

Portanto, na avaliação da estabilidade de óleos essenciais, deve-se considerar que

a composição química pode variar a depender de fatores tais como, saúde da planta,

fase de crescimento, habitat, incluindo clima, fatores edáficos, bem como a época da

colheita (SCHMIDT, 2010). Hădărugă et al descreveram que alguns constituintes dos

óleos essenciais podem sofrer reação de auto-oxidação em meio a oxigênio ou

moléculas oxidantes. No artigo, os autores chamaram atenção para o limoneno, que

sofre auto-oxidação e forma o diepóxi-limoneno, um composto carcinogênico. Esta

reação ocorre também com o cariofileno, formando o óxido de cariofileno, e pode ser

bloqueada através da complexação em ciclodextrinas (HĂDĂRUGĂ, N. G.;

HĂDĂRUGĂ; ISENGARD, 2012). Por outro lado, alguns terpenóides oxigenados, tais

como mentol, 1,8- cineol e mentona não formam hidro peróxidos por oxidação, mas

são diretamente convertidos em cetonas, ácidos e aldeídos (TUREK; STINTZING,

2013).

Dentre as plantas medicinais produtoras de óleos essenciais do nordeste

brasileiro, encontra-se a Hyptis pectinata. O gênero Hyptis consiste de

aproximadamente 400 espécies distribuídas do sul dos Estados Unidos até a

Argentina e exibe a maior diversidade morfológica no bioma Cerrado brasileiro

(PAIXAO et al., 2013). As plantas pertencentes a este gênero são de grande

importância econômica e etnofarmacológica (FRANCO et al., 2011 ). Além disso,

possuem propriedades medicinais importantes e são muito utilizadas na medicina

popular para o tratamento de várias condições clínicas tais como distúrbios

Page 21: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

7

gastrointestinais, doenças de pele, infecções, congestão nasal, febre, dores e

inflamação (PAIXAO et al., 2013; RAYMUNDO et al., 2011).

Diante disto, a Hyptis pectinata (L.) Poit, pertencente à família Lamiaceae, é

popularmente conhecida no Brasil como "sambacaitá" ou "canudinho", apresenta-se

como um arbusto difundido, aromático, bastante cultivado na região nordeste do

Brasil. Ademais, a Hyptis pectinata é uma planta herbácea com folhas aromáticas e

flores pequenas bilabiais que são agrupados em inflorescências axilares (FALCAO et

al., 2013). No Brasil, esta espécie é extensivamente utilizada pela população, em

especial no Estado de Sergipe, para o tratamento de inflamação, infecções

bacterianas, dor e câncer (SERAFINI et al., 2012) sob as formas de infusos ou

decoctos (ARRIGONI-BLANK et al., 2008).

Tendo em vista a grande diversidade de propriedades farmacológicas descritas

para os óleos essenciais, são necessários protocolos científicos que validem o uso

popular. Nesse contexto, a triagem antinociceptiva e anti-inflamatória engloba os

testes de contorções abdominais induzida por ácido acético, formalina e placa quente.

O teste de contorções abdominais é descrito como um modelo de nocicepção

inflamatória visceral e conduz a avaliação a nível central e periférico de determinadas

substâncias. Isso ocorre porque o ácido acético ativa diretamente os canais catiônicos

localizados nas vias aferentes primárias e desencadeia a liberação dos mediadores

inflamatórios levando a liberação de aspartato e glutamato no fluido cérebro-espinhal.

Após injeção intraperitoneal, o animal apresenta constrição da parede abdominal que

pode ser acompanhada por rotação do tronco e extensão dos membros posteriores

(BRITO et al., 2012; MELO, M. S. et al., 2010).

Partindo desse conceito, o teste da formalina conduz a uma resposta bifásica e é

um instrumento bastante utilizado nos estudos de dor em animais, sendo mais válido

que testes mecânicos e térmicos. A primeira fase do teste ocorre logo após a injeção

de formalina e estende-se por cinco minutos (dor neurogênica ou aguda), sendo

caracterizada pela estimulação química direta dos nociceptores das fibras aferentes

do tipo C e, em parte, das fibras do tipo Aδ estando associada à liberação de

aminoácidos excitatórios, óxido nítrico e substância P. Já a segunda fase (15 a 30

minutos após a injeção de formalina), ocorre a nível periférico e caracteriza-se como

inflamatória por meio da liberação dos mediadores pró-inflamatórios e pode ser

bloqueada pelos inibidores da ciclo-oxigenase (COX). O intervalo de quiescência entre

Page 22: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

8

a primeira e a segunda fase é resultado de uma inibição da transmissão nociceptiva

através de circuitos supra-espinhais e espinhais. Nessa perspectiva, a vantagem

deste método consiste na avaliação de dois tipos distintos de dor, possibilitando a

investigação de analgésicos com diferentes mecanismos de ação (ALMEIDA et al.,

2013; BRITO et al., 2012; DALLEL et al., 1995; QUINTANS, J. S. S. et al., 2014).

Por fim, o teste da placa quente avalia o tempo em que os animais permanecem sobre

uma chapa metálica aquecida (55 ± 0,5ºC) até reagirem ao estímulo térmico com o

comportamento de levantar ou lamber as patas. Os animais são observados 30, 60,

90 e 120 minutos após as substâncias em análise serem administradas, quanto ao

efeito central das mesmas através da ativação dos receptores vanilóides (BARROT,

2012; JULIUS; BASBAUM, 2001).

Assim, diversos estudos têm reportado a atividade farmacológica de óleos

essenciais, principalmente aqueles oriundos das plantas medicinais comuns na região

Nordeste do Brasil. Em 2008, Arrigoni-Blank et al demonstraram o efeito

antinociceptivo do OEHP por vias centrais e periféricas (ADORJAN; BUCHBAUER,

2010; ARRIGONI-BLANK et al., 2008). Caldas et al e Diniz et al, atestaram o potencial

antiulcerogênico do óleo essencial da Hyptis martiusi e Hyptis crenata,

respectivamente certificando o uso popular destas plantas (CALDAS et al., 2011;

DINIZ et al., 2013). Em adição, um estudo de Siqueira et al, evidenciaram o potencial

anticâncer in vitro e in vivo da Xylopia laevigata (QUINTANS JDE; SOARES; et al.,

2013). Os óleos essenciais de Lippia sidoides, Lippia origanoides, Chenopodium

ambrosioides e Ocimum. gratissimum demonstraram baixa toxicidade e significativa

atividade tripanocida no estudo de Borges et al (BORGES et al., 2012).

Na Tabela 1 estão apresentadas as atividades farmacológicas descritas até o

presente momento para o extrato e óleo essencial da Hyptis pectinata, bem como os

constituintes químicos aos quais são atribuídas as suas atividades. Dessa forma,

merece destaque o pioneirismo da Universidade Federal de Sergipe com estudos

utilizando a espécie em discussão com o objetivo de validar o seu uso popular.

Page 23: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

9

Tabela 1: Atividades farmacológicas descritas para a Hyptis pectinata.

Autor, ano Preparação* Atividade farmacológica

Constituintes responsáveis pela ação

Instituição que sediou a pesquisa

De Queiroz et al., 2014 (DE QUEIROZ et al., 2014)

EA Antileishmanicida β-cariofileno (1), óxido de cariofileno (2), ácido

sambacaitárico (3), 3-O-metil ácido sambacaitárico (4), 3-O-

metil ácido rosmarínico (5)

UFAL

Falcão et al., 2013 (FALCAO et al., 2013)

EE Antileishmanicida Compostos 3,4 e 5 UFPE

Paixão et al., 2005 (PAIXAO et al., 2013)

EA Efeito antinociceptivo neurogênico e orofacial

NA** UFS

Raymundo et al., 2011 (RAYMUNDO et al., 2011)

OE Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório

Composto 1 UFRJ

Nascimento et al., 2008 (NASCIMENTO, P. F. et al.,

2008)

OE Antimicrobiana Compostos 1, 2 e β-pineno (6)

UFS

Arrigoni-Blank et al., 2008 (ARRIGONI-BLANK et al.,

2008)

OE Antinociceptiva Ação combinada dos compostos

UFS

Silva et al., 2008 (SILVA, W. J. et al., 2008)

OE Larvicida Composto 2 UFS

Melo et al., 2006 (MELO, G. B. et al., 2006)

EA Regeneração hepatocelular

NA UFS

Lisboa et al., 2005 (LISBOA et al., 2006)

EM Antinociceptiva NA UFS

Melo et al., 2005 (MELO, G. B. et al., 2005)

EA Regeneração hepática NA UFS

Fragoso-Serrano et al., 2005 (FRAGOSO-SERRANO;

GIBBONS; PEREDA-MIRANDA, 2005)

EC Atividade anti-estafilocócica

Pectinolídeo H UNAM

Bispo et al., 2001 (BISPO et al., 2001)

EA Antinociceptiva e anti-edematogênica

NA UFS

*EA (extrato aquoso), EE (extrato etanólico com frações hexânica, metanólica e em acetato de etila), OE (óleo essencial), EM (extrato metanólico com frações hexânica, clorofórmica e em acetato de etila), EC (extrato clorofórmico),

**NA (não houve associação)

9

Page 24: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

38

2.2. Mono- e sesquiterpenos Os terpenos representam o maior e mais diversificado grupo de metabólitos

secundários das plantas (GERSHENZON; DUDAREVA, 2007). De acordo com Irmisch

et al, os terpenos são constituídos de unidades isoprenóides (C5) que se originam tanto

na via do ácido mevalônico quanto na via do 2-C-metil-eritritol-4-fosfato (MEP) (IRMISCH

et al., 2014). A cabeça e a cauda das unidades isoprenóides são condensadas por

feniltransferases que formam o difosfato de geranil e difosfato de geranilgeranila. As

feniltransferases são fundamentais no metabolismo dos terpenos convertendo os

precursores ao grande número de moléculas desse grupo com esqueletos carbônicos

diferentes, como os hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15),

diterpenos (C20) e triterpenos (C30), tetraterpenos (C40) e politerpenos (C>40)

(DEGENHARDT; KOLLNER; GERSHENZON, 2009; KLEINE; MULLER, 2013).

Diante disto, os terpenos são moléculas estruturalmente simples, de baixo peso

molecular, altamente lipofílicas e estudos científicos tem reportado seu potencial clínico

como fármacos analgésicos (QUINTANS, J. S. et al., 2014). Os monoterpenos são

divididos em três subgrupos (Figura 2): acíclicos (geraniol, linalol, mirceno), monocíclicos

(α-terpineol, isopulegol, terpinoleno) e bicíclicos (α-pineno, cânfora, tujona). Em cada um

destes subgrupos, surgem outras classificações: hidrocarbonetos insaturados

(limoneno), álcoois (mentol), aldeídos e cetonas (mirtenal, carvona), lactonas (também

conhecidos como iridóides, nepetalactona) e tropolonas (γ-tujaplicina) (SANTOS, M. R.

V. et al., 2011). Guimarães et al demonstraram recentemente em uma revisão

sistemática, que os monoterpenos podem penetrar a barreira hematoencefálica e agir no

sistema nervoso central modulando importantes neurotransmissores como os

glutamatérgicos, serotoninérgicos, opióides e canabinóides sendo efetivos na dor

neuropática (GUIMARAES et al., 2013).

Os sesquiterpenos apresentam mais de 200 tipos de esqueletos carbônicos

conhecidos e perfazem um percentual de 5% dos constituintes químicos presentes nas

plantas (CUNHA NETO, 2006). Estes metabólitos secundários são predominantemente

formados a partir de pirofosfato farnesil ou nerolidil pirofosfato. Depois de perder o

resíduo pirofosfato, são sucedidas diferentes formas de ciclizações, de modo que há um

rearranjo do esqueleto através de intermediários carbocátions com migração do grupo

hidreto ou um grupo metil. Estas reações ocorrem em condições de baixo pH ou de

baixas temperaturas e originam diversos tipos de estruturas (PETRONILHO; COIMBRA;

Page 25: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

39

ROCHA, 2014). Os sesquiterpenos atraíram considerável atenção dos químicos

orgânicos sintéticos e farmacologistas devido às suas estruturas químicas complexas e

diversificadas atreladas a uma vasta gama de atividades biológicas (LV et al., 2014),

incluindo atividade inseticida (WU, W. et al., 2001), citotóxica (CHEN, J. J. et al., 2006),

antitumoral (ARGHIANI et al., 2014; JIMENEZ et al., 2003), imunossupressora (WANG,

X. et al., 2005) e anti-inflamatória (ZHANG et al., 2014).

Figura 2: Exemplos de mono- e sesquiterpenos de ocorrência em óleos essenciais.

Monoterpenos

Sesquiterpenos

Page 26: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

40

No grupo dos terpenos, merece destaque o (-)-isopulegol (C10H18O) (ISOP)

(Figura 3), um tipo de monoterpeno cíclico que pode ser obtido de óleos essenciais

de plantas como Melissa officinalis L. (BOUNIHI et al., 2013) ou através da

ciclização do (+)-citronelal, principal etapa do processo industrial para obtenção do

mentol (CHEN, Y. et al., 2014). Como o esqueleto do ISOP possui dois centros

estereogênicos em comparação com o (+)-citronelal, a reação de ciclização pode

conduzir a formação de quatro diastereoisômeros, nomeadamente: ISOP, (+)-iso-

ISOP, (+)-neo-ISOP e (+)-neoiso-ISOP (FIEGE, 2012). Além disso, o ISOP é

utilizado na indústria de cosméticos para preparo de fragrâncias finas, shampoos,

sabonetes e produtos não cosméticos como detergentes. Este monoterpeno foi

aprovado pelo FDA como flavorizante, apresenta baixa toxicidade dérmica e oral

e não existem indícios de carcinogenicidade desta molécula (BHATIA et al., 2008).

Figura 3: Estrutura química do (-)-ISOP (esquerda) e do (+)-ISOP (direita).

Fonte: Adaptado de Ceborska, Szwed e Suwinska, 2013 (CEBORSKA et al., 2013)

Nesse contexto, o ISOP como todo terpeno, é altamente volátil, possui baixa

solubilidade e é bastante utilizado na perfumaria em várias composições com notas

de flor de gerânio em função do seu cheiro agradável (ESCANDE; RENARD;

GRISON, 2014). Ademais, o ISOP tem demonstrado efeito na promoção da absorção

percutânea de drogas através da pele com baixa toxicidade, entretanto, sua elevada

volatilidade apresenta-se como uma limitação para este fim (CHEN, Y. et al., 2014).

Paik e colaboradores demonstraram que o óleo essencial de Zanthoxylum schinifolium

contendo ISOP pode induzir apoptose de células HepG2 de hepatócitos humanos

fazendo deste óleo uma alternativa a cura do carcinoma hepatocelular (CEBORSKA

et al., 2013; PAIK et al., 2005).

OH OH

Page 27: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

41

A Tabela 2 apresenta as atividades farmacológicas descritas até o presente

momento para o ISOP.

Tabela 2: Atividades farmacológicas descritas para o ISOP.

Autor, ano Atividade farmacológica Instituição que sediou a pesquisa

Silva et al., 2007 (SILVA, M. I. et al., 2007)

Ansiolítico UFC

Silva et al., 2009 (SILVA, M. I.; MOURA; et al., 2009)

Gastroprotetor UFC

Silva et al., 2009 (SILVA, M. I.; SILVA; et al., 2009)

Anticonvulsivante UFC

Singh et al., 2009 (SINGH, H. P. et al., 2009)

Antioxidante PA

Kessler et al., 2014 (KESSLER et al., 2014)

Modulação dos receptores gabaérgicos α1β2 e α1β2γ2

UEN

2.3. Limitações farmacotécnicas e estratégias Apesar do reconhecido potencial farmacológico dos óleos essenciais e terpenos,

a hidrofobicidade apresenta-se como um desafio na produção de formas

farmacêuticas que os veiculem (SIQUEIRA-LIMA et al., 2014). Diante disto, algumas

estratégias farmacotécnicas já vêm sendo estudadas para superar esta limitação

como complexação com ciclodextrinas, lipossomas, nanopartículas e micropartículas

(KUMAR et al., 2012). Dentre as estratégias, as ciclodextrinas têm larga aplicação na

indústria de medicamentos devido a vantagens, como maior capacidade de

solubilização em relação às moléculas livres permitindo a incorporação de fármacos

pouco solúveis em água com o objetivo de aumentar estabilidade, biodisponibilidade

e conduzir a uma liberação controlada (DEVIL et al., 2010).

2.3.1 Lipossomas Os lipossomas consistem em membranas de bicamada lipídica com tamanho entre

90 a 150 nm, constituídos por fosfolipídios e colesterol, formando um núcleo aquoso.

Os fosfolipídios são compostos por cabeças hidrofílicas e caudas longas hidrofóbicas.

Assim, a sua estrutura permite incorporar moléculas hidrofílicas na cavidade interna e

lipofílicas entre a camada lipídica (ASLAN et al., 2013; CONNIOT et al., 2014;

SHARMA; JAIN; SAREEN, 2013). Os lipossomas possuem como alvo o sistema

fagocitário, em especial os macrófagos. Para garantir que o mesmo seja conduzido

até o local da ação, a superfície do lipossoma pode ser revestida com anticorpos ou

Page 28: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

42

ligantes específicos que asseguram a fagocitose do lipossoma e a liberação do

fármaco no local da ação (ELOY et al., 2014).

2.3.2 Nanopartículas Nanopartículas lipídicas sólidas são sistemas coloidais transportadores que foram

desenvolvidos para encapsular, proteger e distribuir componentes lipofílicos

funcionais, tais como lipídios bioativos e fármacos. A fase líquida lipídica e uma

solução de surfactante aquoso são homogeneizados em uma temperatura acima da

temperatura de fusão dos lipídios, para produzir uma fina dispersão de uma emulsão

de óleo em água (HELGASON et al., 2009). A partícula é estabilizada por surfactantes,

que podem ser compostos de uma única camada, mas normalmente há uma mistura

de surfactantes (WEISS et al., 2008). Nanopartículas lipídicas têm uma estrutura

semelhante à nanoemulsões, com um tamanho que varia normalmente de 50 a 1000

nm. O núcleo lipídico em nanoemulsões é líquido, mas, em nanopartículas, o núcleo

lipídico está no estado sólido (ASSIS et al., 2012). Além disso, a taxa de liberação do

fármaco pode ser controlada pela modificação da cadeia lateral do polímero. As

nanopartículas podem consistir quer de uma matriz polimérica (nanoesferas) ou de

um sistema de reservatório em que um núcleo oleoso ou aquoso está rodeado por

uma fina parede polimérica (nanocápsulas). A maioria das nanopartículas poliméricas

são biodegradáveis e biocompatíveis na natureza e, por conseguinte, adequadas para

incorporar diversos agentes terapêuticos (CONNIOT et al., 2014)

2.3.3 Micropartículas A microencapsulação oferece a vantagem de proteger o fármaco contra as

reações de metabolismo pulmonar e fornece sua liberação prolongada e sustentada.

Formulações de micropartículas com liberação prolongada buscam aumentar a

adesão dos pacientes com terapias de longo prazo, permitindo a administração de

doses menos frequentes, além de reduzir os efeitos colaterais (PHAM; FATTAL;

TSAPIS, 2015). As micropartículas podem ser usadas em sistemas de liberação de

fármacos com a finalidade de contornar problemas de solubilidade e de controlar a

liberação do fármaco a partir da matriz polimérica através da difusão simples (GOYAL

et al., 2014).

2.3.4 Ciclodextrinas A descoberta das ciclodextrinas (CDs) se deu no ano de 1891, quando o

pesquisador francês A. Villiers descobriu uma mistura de substâncias cristalinas

Page 29: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

43

oriundas da degradação do amido em uma cultura de Bacillus amylobacter e as

chamou de celulosina (ZAFAR; FESSI; ELAISSARI, 2014). Entre 1903-1911, o

microbiologista austríaco Franz Schardinger percebeu que o Bacillus macerans

poderia produzir grandes quantidades de dextrinas e as denominou de α- e β-dextrinas

e em 1935 a γ-dextrina foi isolada por K. Freudenberg (KURKOV; LOFTSSON, 2013;

VALLE, 2004; ZAFAR et al., 2014). A primeira patente relacionada as CDs foi descrita

em 1953 na Alemanha, onde foram descritas as propriedades básicas das CDs

naturais (α-, β- e γ-CDs) (LOFTSSON; BREWSTER, 2010).

Com o avanço da ciência, postulou-se que as CDs são oligossacarídeos

cíclicos compostos por unidades de glicose, unidas por ligações α-1,4-glicosídicas

com numerosos grupos hidroxilas que são sítios ativos disponíveis para a formação

de novas ligações (FOLCH-CANO; YAZDANI-PEDRAM; OLEA-AZAR, 2014). Elas

são caracterizadas como substâncias cristalinas, homogêneas e não higroscópicas

(SALUSTIO et al., 2011). As CDs naturais (α-, β- e γ-) (Figura 4) são compostas por

seis, sete e oito unidades de glicopiranose , respectivamente (CRINI, 2014).

Figura 4: Estrutura química das CDs naturais.

Fonte: http://unam.bilkent.edu.tr/.

As CDs têm a estrutura toroidal de um cone truncado com cavidades internas que

variam de 5 a 8 Å (Tabela 3) e (Figura 5). Os C ligados ao H do anel apontam para o

interior da molécula produzindo uma cavidade hidrofóbica. Os pares de elétrons não

ligantes das pontes de oxigênio glicosídicas são dirigidos para o interior da cavidade,

produzindo uma elevada densidade de elétrons e conferindo a CD o caráter de base

de Lewis. Os grupos hidroxila primários e secundários localizam-se nas bordas

estreitas e largas, respectivamente, do cone truncado. Como resultado deste arranjo

espacial dos grupos funcionais nas moléculas de CD, a cavidade apresenta um

Page 30: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

44

carácter relativamente hidrofóbico, enquanto as superfícies externas são hidrofílicas

(VALENTE; SODERMAN, 2014), uma estrutura química interessante para formar

complexos de inclusão com moléculas de baixa solubilidade (MENEZES, P. P. et al.,

2014).

Tabela 3: Características das CDs naturais.

Tipo de CD

Diâmetro da cavidade/Å

Peso molecular (g/mol)

Solubilidade (g.100/mL)

Formas cristalinas

4,7-5,3 972 14,5 Lâminas hexagonais

6,0-6,5 1135 1,85 Paralelogramos monoclínicos

7,5-8,3 1297 23,2 Prismas quadráticos

Fonte: Adaptado de Salústio et al., 2011 e Challa et al., 2005 (CHALLA et al., 2005; SALUSTIO et

al., 2011)

Figura 5: Estrutura e respectivos tamanhos das cavidades da α-, β- e γ- CDs.

Fonte: Adaptado de Crini, 2014 (CRINI, 2014).

A CD fornece um microambiente hidrofóbico com dimensões apropriadas para

formação de complexos de inclusão com a molécula hospedeira (lipofílica). Nesse

caso, a forma motriz da complexação em solução é a liberação de moléculas de água

residuais da cavidade da molécula hóspede (CD) para o meio aquoso conduzindo a

um estado de energia mais baixo e consequentemente mais estável (VALLE, 2004).

Page 31: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

45

Além disso, as CDs naturais possuem solubilidade aquosa (Tabela 3) de 14,5

g.cm-3 (α-CD), 1,85 g.cm-3 (β-CD) e 23,2 g.cm-3 (γ-CD), demonstrando a baixa

solubilidade da β-CD, em relação as demais (TEJASHRI; AMRITA; DARSHANA,

2013). Acredita-se que isso ocorre pela estrutura da β-CD, uma vez que suas

dimensões moleculares são ótimas para a formação de um anel de hidrogênio

intramolecular, capaz de neutralizar a hidratação da CD, reduzindo assim a sua

solubilidade. Devido à baixa solubilidade aquosa, a β-CD não é adequada para

administração por via parenteral (KURKOV; LOFTSSON, 2013; LOFTSSON;

BREWSTER, 2010).

Nos últimos anos, as propriedades físico-químicas e, consequentemente, a

capacidade de inclusão das CDs nativas foram melhoradas por modificação química

e enzimática dos seus grupos hidroxila reativos (GARCIA et al., 2014; SALUSTIO et

al., 2011). Dessa forma, as CDs modificadas de interesse farmacêutico como os

derivados hidrofílicos da β-CD tais quais: hidroxipropil-β-CD (HPβCD), metil-β-CD

(MβCD), β-CD-randomicamente metilada (RMβCD) tem sido utilizadas para melhorar

a solubilidade e razão de dissolução de fármacos pouco solúveis (GIDWANI; VYAS,

2014). Além disso, a aplicação da triacetil-β-CD (TAβCD), uma β-CD modificada

hidrofóbica caracteriza-se por promover a liberação prolongada de moléculas

lipofílicas. Existem também os derivados ionizáveis como a O-carboximetil-O-etil-β-

CD (CMEβCD) que dependem do pH para liberação da molécula complexada e a

sulfobutileter-β-CD (SBEβCD), uma β-CD sulfatada de liberação imediata (SALUSTIO

et al., 2011).

A α-CD é aproximadamente 1,5 vezes mais estável que a γ-CD que é 1,5 vezes

menos estável que a β-CD. Entretanto a formação de complexos de inclusão aumenta

a estabilidade das CDs (KURKOV; LOFTSSON, 2013). Adicionalmente, as CDs são

largamente utilizadas na indústria farmacêutica como carreadores de fármacos com o

objetivo de aumentar a solubilidade, estabilidade e biodisponibilidade de moléculas

bioativas. Ademais, as CDs possuem elevada biocompatibilidade e são aprovadas

pelo FDA, sendo autorizadas para uso humano (PINHO et al., 2014). O primeiro

produto farmacêutico lançado no mercado contendo CD, foi a prostaglandina E2/β-CD

na forma de tabletes sublinguais, no Japão em 1976 (LOFTSSON; BREWSTER,

2010).

Page 32: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

46

Dessa forma, mais de 30 % dos novos produtos farmacêuticos lançados no

mercado mundial contém CDs, e desse percentual, 54,8 % são β-CD (Figura 7)

(TEJASHRI et al., 2013). De acordo com Kurkov e Loftsson, a razão para a elevada

utilização da β-CD reside na facilidade de sua produção e baixo custo, mais de 10.000

toneladas são produzidas anualmente, com um preço médio de cerca de 5 dólares

por kg (KURKOV; LOFTSSON, 2013).

Figura 6: Distribuição relativa das CDs utilizadas no mercado farmacêutico.

Fonte: KURKOV e LOFTSSON, 2013 (KURKOV; LOFTSSON, 2013)

A Tabela 4, adaptada de Loftsson e Brewster, 2010 (LOFTSSON; BREWSTER,

2010) apresenta alguns medicamentos lançados no mercado utilizando CDs.

Page 33: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

47

Tabela 4: Medicamentos comercializados contendo CDs. Adaptada de Loftsson e Brewster, 2010

(LOFTSSON; BREWSTER, 2010).

Fármaco/CD Nome comercial Formulação* Indústria Farmacêutica/País

α-CD

Alprostadil Caverject Dual SI Pfizer/Europa Cefotiam-hexetil HCl Pansporin T COMP Takeda/Japão

Limaprost Opalmon COMP Ono/Japão PGE1 Prostavastin SP Ono/Japão;

Schwarz/Europa

β-CD

Benexate HCL Ulgut, Lonmiel CAPS Teikoku; Shionogi/ Japão

Cefalosporina Meiact COMP Meiji Seika/Japão Cetirizina Cetrizin COMP Losan

Pharma/Alemanha Clordiazepóxido Transillium COMP Gador/Argentina Dexametasona Glymesason POM, COMP Fujinaga/Japão Etinilestradiol e drospirenona

Yaz COMP Bayer/Europa e EUA

Meloxicam Mobitil COMP, SPS Medical Union/Egito Nicotina Nicorette COMP Pfizer/Europa Nimesulida Nimedex COMP Novartis/Europa Nitroglicerina Nitropen COMP Nihon Kayaku/Japão Omeprazol Omebeta COMP Betafarm/Europa

PGE2 Prostarmon E COMP Ono/Japão Piroxicam Brexin, Cicladon COMP, SPS Chiesi/ Europa

Aché/Brasil Ácido tiaprofênico Surgamyl COMP Roussel-

Maestrelli/Europa

HPβCD

Cisaprida Propulsid SPS Janssen/Europa Indometacina Indocid COL Chauvin/Europa Itraconazol Sporanox SO, SI Janssen/Europa e

EUA Mitomicina MitoExtra,

Mitozytrex II Novartis/Europa

SBEβCD

Aripiprazol Abilify SIM Bristol-Myers Squibb e Otsuka Pharm/EUA

Voriconazol Vfend SI Pfizer/EUA, Europa e Japão

Mesilato de ziprasidona Geodon, Zeldox SIM Pfizer/EUA e Europa

RMβCD

17β-estradiol Aerodiol SN Servier/Europa Cloranfenicol Clorocil COL Oftalder/Europa

γ-CD Tc-99 Teboroxime* CardioTec SI Squibb

Diagnostics/EUA

HPγCD

Diclofenaco sódico Voltaren Ophtha COL Novartis/Europa Tc-99 Teboroxime* Cardiotec SI Bracco/EUA

*Produto antigo utilizando a γ-CD foi substituído pela CD modificada correspondente no produto corrente. **SI (solução intravenosa), COMP (comprimido), SP

(solução parenteral), CAPS (cápsula), POM (pomada), SPS (supositório), COL (colírio), SO (solução oral), II (infusão intravenosa), SIM (solução intramuscular),

SN (solução nasal)

Page 34: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

48

2.4 Complexos de inclusão Um complexo de inclusão (Figura 7) é formado por uma molécula hidrofóbica

(guest) e uma CD (host). A atração entre o hóspede e o hospedeiro se dá através de

interações não-covalentes incluindo forças de Van der Walls, interações eletrostáticas,

transferências de cargas, interações dipolo-dipolo, ligações de hidrogênio, fatores

estéricos e forças de dispersão (GIDWANI; VYAS, 2014; VALENTE; SODERMAN,

2014). Entretanto, a principal força envolvida é a substituição de moléculas de água

(Figura 7) da cavidade da CD conduzida por forças repulsivas entre as moléculas

envolvidas (polar-apolar) até o surgimento de forças favoráveis (apolar-apolar) na

cavidade da molécula hospedeira (MURA, 2014).

Figura 7: Representação esquemática da formação de complexo de inclusão entre uma CD e

álcool benzílico. As esferas representam as moléculas de água.

Fonte: Valle, 2004 e Crini, 2014 (CRINI, 2014; VALLE, 2004)

De acordo com Zafar et al, o complexo previne a decomposição natural do

fármaco complexado e promove a liberação do mesmo ao longo do tempo (ZAFAR et

al., 2014). Além disso, otimiza a solubilidade e dissolução da molécula complexada

(DE FREITAS et al., 2012; MENEZES, P. P. et al., 2014; MENEZES, P.P. et al.,

2012). Pesquisas recentes têm demonstrado que os complexos de inclusão

aumentam a biodisponibilidade via oral, reduzem irritações do trato gastrintestinal e

oculares, bem como eliminam odores ou sabores desagradáveis, reduzem efeitos

adversos e previnem interações fármaco-excipiente (GAMSIZ et al., 2013; GARCIA

et al., 2014).

Page 35: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

49

Os complexos de inclusão podem ser formados em solução ou no estado sólido

e são conduzidos por dois fatores: O primeiro é estérico e depende da relação de

tamanho entre a CD e o hóspede. O segundo é a interação termodinâmica entre os

diferentes componentes do sistema (CD, fármaco e solvente). Para um complexo

formar, deve existir uma energia favorável que conduza o fármaco a cavidade da CD

(VALLE, 2004).

Em solução, os complexos são formados e dissociados continuamente, onde a

cavidade da CD é ocupada por moléculas de água de elevada entalpia (interação

apolar-polar) e substituída por moléculas menos polares. A afinidade do fármaco pela

CD se dá através da constante de estabilidade (constante de equilíbrio) do complexo

e ocorre frequentemente nas razões malares de 1:1, 2:1, 1:2 e 2:2 (Figura 8)

(LOFTSSON; BREWSTER, 2010; SALUSTIO et al., 2011). No estado sólido, o

fármaco pode ser complexado na cavidade, ou formar agregados fora da CD formando

um equilíbrio entre o fármaco complexado e o não complexado (SINGH, R. et al.,

2010).

Figura 8: Ilustração esquemática da associação de uma molécula hidrofóbica e uma CD em diferentes

razões molares.

3 Fonte: (CRINI, 2014).

Estudos demonstram que a CD não interfere no efeito do fármaco uma vez que

ela não penetra as membranas biológicas, apenas carreia o princípio ativo e o

protege de degradação enzimática. Primeiro ocorre a etapa de dissolução (Figura 9),

depois o fármaco é liberado, atravessa a membrana e é absorvido (GAMSIZ et al.,

2013; LOFTSSON; BREWSTER, 2011). As CDs são geralmente degradadas por

enzimas ou bactérias e eliminadas na urina por filtração glomerular (Figura 10).

Page 36: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

50

Assim, quaisquer CD remanescente é eliminada por outras vias (KURKOV;

LOFTSSON, 2013).

Figura 9: Modelo esquemático da farmacocinética dos complexos de inclusão.

Fonte: Adaptado de Gamsiz et al., 2013 (GAMSIZ et al., 2013).

De acordo com Scarpignato, a β-CD aumenta a taxa de absorção do piroxicam

através do aumento da razão de dissolução do fármaco, conforme ilustrado na Figura

11. À medida que o fármaco dissolvido começa a penetrar o epitélio intestinal, o

complexo de inclusão, age como um reservatório, dissociando para liberar mais

piroxicam. Na administração oral, a β-CD é minimamente absorvida no trato

gastrintestinal e a pequena fração absorvida é excretada na urina sem ser

metabolizada. Dessa forma, uma vez que o fármaco é absorvido, a CD não apresenta

efeito adicional na sua farmacocinética (SCARPIGNATO, 2013).

Page 37: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

51

Figura 10: Comparação esquemática da digestão das CDs naturais por amilases. As CDs que são digeridas lentamente por amilases são rapidamente digeridas por bactérias.

Fonte: Adaptado de Kurkov e Loftsson, 2013 (KURKOV; LOFTSSON, 2013).

Figura 11: Dissolução e absorção do piroxicam livre e complexado em β-CD. kd: constante de

dissolução, kc: constante de equilíbrio para formação do complexo de inclusão e ka: constante da razão de absorção.

Fonte: Scarpignato, 2013 (SCARPIGNATO, 2013).

Page 38: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

52

2.5 Métodos de obtenção de complexos de inclusão Os métodos comumente utilizados para formação de complexos de inclusão

são co-precipitação, método de ultrassom, spray-drying, liofilização, fluido

supercrítico, co-evaporação e malaxagem (LOFTSSON; BREWSTER, 2012;

SALUSTIO et al., 2009; ZU et al., 2014).

Co-precipitação: este método é largamente utilizado nos laboratórios, envolve

elevadas concentrações de CD e água para dissolvê-la. A solução é submetida

a agitação sob temperaturas altas até formação do precipitado, o qual pode ser

obtido por decantação, filtração ou centrifugação e posteriormente lavado com

água ou solventes orgânicos polares. As desvantagens desse método são a

dificuldade de transposição de escala, uma vez que eleva os custos, além de

não proporcionar grande eficiência de complexação. Não são interessantes

também a grande quantidade de solventes orgânicos tóxicos por ocasionar

importantes efeitos adversos no ser humano e a alta temperatura limita a

utilização de fármacos voláteis como terpenos. Mangolim et al utilizaram o

método da co-precipitação para formar complexo de inclusão do curcumim com

β-CD e demonstraram que o método foi eficiente para melhorar as

características físico-químicas da molécula estudada (GRANDELLI et al., 2012;

MANGOLIM et al., 2014; VALLE, 2004).

Método de ultrassom: é um método de simples preparo que resulta em uma

elevada razão de inclusão e recuperação total do fármaco. O método consiste

na solubilização prévia da CD e do fármaco, em seguida, as soluções são

misturadas. A solução resultante é submetida a banho de ultrassom seguida

da refrigeração, lavagem do precipitado e finalmente liofilizadas. Su e

colaboradores descreveram que este método é eficiente para controlar a

estabilidade e liberação do fármaco bem como aumentar a sua solubilidade

(SU et al., 2012; WANG, D. W. et al., 2013).

Spray-drying: o método consiste em uma solução do fármaco na mistura

etanol:água 50% v/v, que é agitada intermitentemente durante 24 horas. Em

seguida a solução é submetida a secagem por atomização em condições

experimentais controladas que garantem a uniformidade no tamanho das

Page 39: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

53

partículas obtidas. A desvantagem do método reside no baixo rendimento e

elevadas temperaturas as quais os complexos devem ser submetidos,

limitando o uso de fármaco voláteis (DEVIL et al., 2010; PANDIT et al., 2011).

Liofilização: constitui-se na eliminação de solvente da solução através de

congelamento prévio, sendo bastante utilizado para fármacos voláteis. Alguns

estudos têm demonstrado que a técnica de liofilização melhora

substancialmente as características na dissolução de fármacos hidrofóbicos em

virtude da elevada eficiência de complexação do método culminando em um

excelente efeito farmacológico nos complexos de inclusão obtidos por esta

técnica. Além disso, o produto obtido possui características amorfas,

entretanto, más características de fluxo e o procedimento é relativamente lento

(CHOI, M. et al., 2009; HILL; GOMES; TAYLOR, 2013; KARATHANOS et al.,

2007; SANTOS, E. H. et al., 2015; ZU et al., 2014).

Fluido supercrítico: o método tem sido utilizado para aumentar a solubilidade e

razão de dissolução de fármacos de baixa solubilidade. O fluido supercrítico

apresenta vantagens de atoxicidade, estabilidade química, segurança,

biodegradabilidade, fácil remoção do sistema e é eficiente para formar

complexos de inclusão. Além disso, os complexos obtidos por este método

possuem mínimos efeitos adversos ao ser humano quando comparado com os

métodos que utilizam solventes orgânicos. Entretanto, ainda é uma técnica

emergente, o que culmina no elevado custo de produção (AL-MARZOUQI et

al., 2009; BANCHERO; MANNA, 2011; GRANDELLI et al., 2012).

Co-evaporação: consiste em uma suspensão contendo CD, fármaco e uma

reduzida quantidade de água sob constante agitação. O método fornece um

bom rendimento de inclusão e a sua transposição de escala é de fácil condução

uma vez que envolve baixo custo de produção. Muitos estudos do nosso grupo

de pesquisa tem demonstrado que o método é eficiente na formação de

complexos de inclusão de terpenos com excelentes resultados de atividade

antinociceptiva, anti-inflamatória e anti-hiperalgésica em modelo de fibromialgia

(MENEZES, P. P. et al., 2014; MENEZES, P.P. et al., 2012; NASCIMENTO,

Page 40: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

54

S. S. et al., 2014; QUINTANS-JUNIOR et al., 2013; QUINTANS JDE;

MENEZES; et al., 2013; SANTOS, E. H. et al., 2015; SERAfiNI et al., 2011;

SIQUEIRA-LIMA et al., 2014).

Malaxagem: é um método de formação de complexo de inclusão que consiste

em um sistema envolvendo fármaco, CD e água em quantidade suficiente para

formar uma pasta. O procedimento é eficiente, uma vez que apresenta o

mesmo rendimento que outros métodos testados com várias vantagens,

principalmente o curto tempo de obtenção e baixo custo para obter o complexo

(MENEZES, P. P. et al., 2014; MENEZES, P.P. et al., 2012; SALUSTIO et al.,

2009; SERAfiNI et al., 2011).

2.6 Técnicas analíticas de caracterização de complexos de inclusão

Apesar do número crescente de trabalhos utilizando CDs na formação de

complexos de inclusão, a abordagem sobre as técnicas de caracterização continua

sendo de grande interesse no âmbito analítico. As propriedades físico-químicas dos

fármacos e das CDs isoladamente são diferentes daquelas apresentadas quando

estão complexados. Partindo deste conceito, qualquer metodologia que tenha

sensibilidade suficiente para medir estas diferenças pode ser utilizada para

caracterizar estes complexos sob diferentes pontos de vista, permitindo direcionar os

fenômenos de inclusão de acordo com as necessidades (LYRA et al., 2010).

As principais técnicas analíticas utilizadas para caracterizar complexos de

inclusão incluem técnicas espectroscópicas, termoanalíticas e de separação (MURA,

2014).

Caracterização da formação de complexos em estado líquido

- Ultravioleta/visível (UV/vis): a espectroscopia no UV/vis é um método

rápido, econômico e bastante útil no estudo da formação de complexos de inclusão

no estado líquido. Além disso, investiga uma modificação significativa no espectro de

absorção do fármaco livre em relação ao complexado. Dessa forma, dependendo da

posição do grupo cromóforo do fármaco, a transferência da molécula da solução

aquosa para a cavidade da CD pode modificar a absorção no espectro UV da molécula

Page 41: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

55

hóspede devido a substituição total ou parcial da cavidade da CD, o que desencadeia

novas interações no fármaco. As modificações no espetro de um fármaco na presença

de CD evidenciam a formação de complexos de inclusão. No entanto, o método não

é específico e sofre com a presença de substâncias que interferem no resultado. Com

isso, não apresenta evidência direta da formação de complexos de inclusão (MURA,

2014). Os deslocamentos hipsocrômico (para menores comprimentos de onda) e

batocrômico (para maiores comprimentos de onda) do máximo de absorção do

espectro UV do hóspede, e/ou aumento ou diminuição de sua intensidade podem ser

observados como uma consequência da formação de complexos de inclusão. O

deslocamento batocrômico tem sido demonstrado na complexação de moléculas

como por exemplo, genisteína (CANNAVA et al., 2010) e eritromicina (SONG et al.,

2011). Por outro lado, na análise dos complexos do ácido salicílico, ácido nicotínico,

indometacina e hidrocortisona, os deslocamentos no UV foram do tipo hipsocrômico

(MURA, 2014). Tanto a estequiometria quanto a constante de estabilidade do

complexo podem ser calculadas a partir das alterações espectrais utilizando,

respectivamente, a razão molar ou os métodos de variação contínua (Gráfico de

Jobbs) e os métodos de deslocamento espectral (Benesi-Hildebrand ou equação de

Scott). Por exemplo, as proporções estequiométricas dos complexos de inclusão de

tagitinina C com 2,6-di-O-metil-βCD e γ-CD foram determinados por espectroscopia

de UV, de acordo com estudo de Ziémons et al (ZIEMONS et al., 2007), enquanto que

a constante de estabilidade do complexo de inclusão da glibenclamida-β-CD (RADI;

EISSA, 2010) foi obtida a partir da variação no espectro de absorção do fármaco na

presença de concentrações crescentes de CD, segundo a equação Benesi-

Hildebrand. A variação do espectro de UV de hidroxiácido ou lactona de sinvastatina

na presença de HPβCD foi medida para determinar as constantes de estabilidade dos

respectivos complexos, sugerindo a formação de um complexo com estequiometria 1:

1 (UNGARO et al., 2011).

- Ressonância magnética nuclear (RMN): a técnica de RMN refere-se a

elucidação da estrutura de complexos de inclusão e é conhecida por ser um dos

métodos mais úteis e completos na obtenção de informações sobre a geometria

(ALFONSI et al., 2013), estabilidade, estequiometria e energia do processo de

complexação. Além disso, permite visualizar de forma direta as interações que

Page 42: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

56

ocorrem entre as moléculas hóspedes e as CDs, sendo capaz de diferenciar qual parte

da estrutura química do fármaco está sendo complexada (LYRA et al., 2010). A

espectroscopia monodimensional (RMN-H1) detecta durante a complexação o

deslocamento químico para valores de campo mais altos para os H-3 e H-5 localizados

no interior da cavidade, e enquanto que os hidrogênios da superfície externa das CDs

(H-1, H-2, H-4 e H-6) não são afetados ou mostram desvios mínimos (SINGH, R. et

al., 2010). A principal desvantagem desta técnica é a baixa solubilidade das amostras

em água deuterada (RMN-H1) ou em água (RMN), exigindo muitas vezes a utilização

de outros solventes, o que poderia modificar as interações hospedeiro-hóspede em

relação ao meio aquoso. Além disso, as mudanças induzidas são, por vezes, muito

pequenas e podem sofrer ampliação do sinal (MURA, 2014). As técnicas

bidimensionais avançadas, tais como ROESY, revelam imagens detalhadas da

geometria dos complexos de inclusão em solução, permitindo o detalhamento

estrutural de compostos complexos contendo CDs modificadas com variável grau de

substituição (LYRA et al., 2010). Muitos trabalhos tem sido conduzidos utilizando RMN

como técnica de investigação da complexação de moléculas diversas tais como

captopril (AZEVEDO, M. D. B. M. et al., 2011), mitotano (ALFONSI et al., 2013),

albendazol (PRADINES et al., 2014), cianidina-3-O-glucosidio (FERNANDES, A. et

al., 2014), dentre outras.

- Diagrama de solubilidade de fases: A abordagem mais utilizada para o

estudo de complexação é o método descrito por Higuchi & Connors (1965), sendo

considerada a primeira verificação de complexos de inclusão em solução. Esse estudo

analisou os efeitos da adição do agente complexante sobre o composto a ser

solubilizado, permitindo obter a constante de estabilidade (Kc) e a estequiometria de

formação do complexo, a partir da solubilidade intrínseca do substrato (So) e a

inclinação da reta resultante do diagrama de solubilidade (Equação 1) (HIGUCHI;

CONNORS, 1965; LYRA et al., 2010).

K1: 1 =Inclinação

So x (1−Inclinação) Equação 1

De acordo com Shanmuga Priya e colaboradores, esta técnica é utilizada para

determinar a constante de estabilidade aparente do complexo de inclusão

Page 43: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

57

(SHANMUGA PRIYA et al., 2013). As principais constantes publicadas de 123, 490, e

525 M-1 para α-CD, β-CD e γ-CD, respectivamente, foram baseadas em estudos

estatísticos. Valores inferiores à 100 para a constante, sugerem fraca afinidade do

fármaco com as CDs enquanto valores elevados, indicam que o fármaco está

fortemente ligado, o que pode reduzir consideravelmente a sua biodisponibilidade

(LYRA et al., 2010). Yao e colaboradores realizaram este estudo com complexos de

inclusão da miricetina com HPβCD e demonstraram que a estequiometria do

complexo foi 1:1 e que as inclinações forem inferiores a 1, caracterizando a formação

de complexos de inclusão conforme descrito por Higuchi e Connors (HIGUCHI;

CONNORS, 1965; YAO et al., 2014). Outros parâmetros tais como os

termodinâmicos, isto é, mudança na energia livre de Gibbs (ΔG) em função da entalpia

(ΔH) e entropia (ΔS) podem ser obtidos em função da constante de estabilidade do

complexo de inclusão e da temperatura medida em Kelvin, expressa na equação 2,

onde R é a constante universal dos gases (YAO et al., 2014).

∆𝐺𝑖 = −𝑅𝑇𝑙𝑛𝐾𝑖 Equação 2

A ΔH pode ser determinada utilizando-se a equação de Van’t Hoff (3) e a ΔS

conforme descrito na equação 4

ln𝑘2

𝑘1=

∆𝐻

𝑅 𝑥

𝑇2−𝑇1

𝑇2𝑇1 Equação 3

∆𝑆 = ∆𝐻−∆𝐺

𝑇 Equação 4

Em geral, a formação dos complexos de inclusão está associada a valores de

ΔG < 0, proporcionais ao aumento de temperatura (T) e a concentração do agente

solubilizante, devendo também ser considerada a natureza química da molécula

hóspede na previsão da complexação. Nesse caso, também pode ser analisado qual

complexante causa o melhor incremento na solubilidade aquosa, pois quanto maior a

contribuição para o valor negativo de ΔG, melhor o efeito solubilizante (LYRA et al.,

2010).

Page 44: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

58

- Determinação por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE): o

método pode determinar as constantes de associação entre a CD e o fármaco, bem

como do complexo com a fase estacionária, uma vez que as CDs também comportam-

se como fases estacionárias em métodos cromatográficos. Nesta técnica, a formação

do complexo é confirmada pelas modificações das propriedades de retenção de

moléculas hóspedes em presença de concentrações crescentes de CDs, diferente

composição das fases móveis, e sob diferentes condições físico-químicas do pH e

temperatura (MESSIAD; AMIRA-GUEBAILIA; HOUACHE, 2013). Entretanto, não é

capaz de fazer qualquer inferência acerca da estrutura do complexo de inclusão e

pode exigir grandes quantidades de materiais, necessitando do preparo intenso de

amostras para validação de método a fim de assegurar a especificidade/sensibilidade,

linearidade, limites de quantificação e detecção, exatidão, precisão e robustez da

metodologia analítica (ANVISA, 2003). Dessa forma, como um resultado das

interações hospedeiro-hóspede, o tempo de retenção do hóspede pode variar,

tornando-se mais ou menos longo, dependendo da ocorrência de complexação na

fase estacionária ou em fase móvel, respectivamente, fenômeno conhecido como

método Fujimura (ARMSTRONG et al., 1996). Outra abordagem, conhecida como

método Hummel-Dreyer, utiliza uma coluna equilibrada com um eluente transportando

a molécula hóspede; quando o agente complexante é adicionado na solução eluente,

o cromatograma irá mostrar um pico positivo, devido ao complexo, e um pico negativo

no tempo de retenção da molécula livre, correspondente à quantidade de hóspede

complexado (HUMMEL; DREYER, 1962). A constante de estabilidade é calculada

pela variação de intensidade do pico negativo (ou positivo). No método Hummel-

Dreyer o consumo de ligante é inferior (MURA, 2014).

- Determinação por Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de

massas (CG/EM): A CG/EM é uma técnica de elevada sensibilidade e especificidade

capaz de quantificar e identificar constituintes químicos de substâncias voláteis como

óleos essenciais, bem como determinar as razões de inclusão destas moléculas na

cavidade das CDs (ABDEL-KHALIK; BJORKLUND; HANSEN, 2013). Estudos do

nosso grupo de pesquisa têm sido conduzidos utilizando esta técnica e os resultados

demonstraram a razão de inclusão dos terpenos presentes no óleo essencial de Lippia

gracilis em HPβCD e do (-)-linalol em β-CD, evidenciando a razão molar de 1:1 na

Page 45: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

59

complexação deste terpeno (MARRETO et al., 2008; MENEZES, P. P. et al., 2014).

Bhandari et al apresentou em seu estudo, a complexação do óleo de limão pelo

método da pasta. Dentre as análises utilizadas para investigar a complexação,

destaca-se a CG/EM, que demonstrou a complexação dos principais componentes

voláteis do óleo em β-CD. Vale ressaltar que não houve seletividade de um ou outro

composto, a força motriz para que cada molécula fosse complexada foi a afinidade da

mesma pela cavidade da CD (BHANDARI; D'ARCY; PADUKKA, 1999).

- Modelagem molecular (Docking): trata-se de uma técnica teórica bastante

útil para predizer a interação, orientação, razão de inclusão e energia de ligação do

fármaco na cavidade da CD (Figura 11) (DANDAWATE et al., 2014). Existem diversos

softwares que realizam este tipo de análise, dentre eles, Hyperchem 8.0

(CHAKRABORTY; BASU; BASAK, 2014), PatchDock server (STALIN et al., 2014),

Hex 6.3 (IACOVINO et al., 2013) e que fornecem vários modelos possíveis para a

estrutura mais provável do complexo de inclusão com base nos parâmetros

energéticos, geometria, tamanho aproximado da área de interface e energia atômica

das moléculas envolvidas (SRINIVASAN; SIVAKUMAR; STALIN, 2014). Ademais, a

técnica indica o tipo de ligação que promove a complexação, seja ela força de van der

Wallls, interação eletrostática ou ligações de hidrogênio. Este tipo de interação

molecular associado a valores negativos de entalpia demonstram o aumento da

estabilidade do complexo de inclusão (BUDRYN et al., 2015).

Page 46: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

60

Figura 12: Conformação de menor energia do complexo de inclusão da miricetina em β-CD

obtida por Docking utilizando o software Hyperchem. (A) estrutura representada em verde representa

a β-CD e vermelho a miricetina e (B) representação esquemática do mesmo complexo, onde amarelo

representa miricetina e as cores branco e vermelho a β-CD.

Fonte: Chakraborty, Basu e Basak, 2014 (CHAKRABORTY et al., 2014)

Caracterização da formação de complexos em estado sólido

- Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC): as técnicas de análise térmica

são largamente empregadas para avaliar o estado físico de fármacos livres ou

complexados e fornecem informações acerca da complexação na cavidade ou se o

fármaco está aderido na rede cristalina da CD (DANDAWATE et al., 2014). Através

da curva DSC, é possível mensurar a diferença de energia fornecida a substância e a

um material de referência em função da temperatura, tanto em condições de

aquecimento quanto resfriamento (ARAÚJO et al., 2006). A análise de DSC fornece

evidências da formação de complexos de inclusão alterando pontos de fusão,

volatilização, ou sublimação de forma a deslocar estes eventos para diferentes

temperaturas ou promover o seu desaparecimento, a depender do material estudado,

principalmente na diferenciação da complexação ou apenas formação de misturas

físicas (ZHOU et al., 2013). Choi e colaboradores demonstraram a formação de

complexo de inclusão entre o paclitaxel e DMβCD através da técnica de DSC (CHOI,

S. G. et al., 2014). Barbosa e colaboradores estudaram a estabilização do metotrexato

complexado em β-CD e observaram que a CD aumenta a temperatura de degradação

do fármaco elevando a sua estabilidade em relação à forma livre (BARBOSA et al.,

Page 47: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

61

2014). Xu e colaboradores, através do estudo da complexação do honokiol com

SBβCD, demonstraram que o ponto de fusão do fármaco desaparece na curva DSC

correspondente a complexação (XU et al., 2014).

- Termogravimetria/Termogravimetria Derivada (TG/DTG): esta técnica

permite medir a variação de massa de uma substância em função da temperatura,

enquanto a amostra é submetida a uma programação controlada de temperatura

(IONASHIRO, 2004). A derivada correspondente (DTG) transforma os eventos de

perda de massa em picos para melhor visualização destes eventos (ARAÚJO et al.,

2006). Dessa forma, a estabilidade térmica de um composto, analisada por TG pode

diferir das características do material puro, em solução ou em outras formas de

complexação (DING et al., 2013). Danilovas e colaboradores descreveram em seu

estudo a capacidade que a técnica de TG tem de acompanhar a degradação da

amostra analisada e sugerir a formação de complexos de inclusão, através da etapa

de degradação do complexo em relação as amostras isoladas (DANILOVAS;

RUTKAITE; ZEMAITAITIS, 2014). O conhecimento da degradação e o modo de

decomposição sob a influência de calor são altamente recomendadas na otimização

de processamentos. O estudo da cinética dos diferentes processos de decomposição

pode ajudar na identificação dos mecanismos de degradação (JANKOVIC, 2013). Um

evento de decomposição é geralmente complexo, uma vez que envolve diversas

reações químicas simultâneas, o que dificulta na caracterização do material (ALVES-

SILVA et al., 2014). Entretanto, estudos demonstram que a evidência da formação de

complexos de inclusão por TG/DTG envolve o aumento na temperatura de

degradação do material com consequente elevação da estabilidade da amostra

(HUANG et al., 2014).

- Cinética de decomposição: o estudo dos efeitos do aquecimento em

determinada amostra pode ser realizado através da análise cinética por meio dos

métodos isotérmico e não-isotérmico. Dessa forma, define-se cinética de

decomposição, os estudos cinéticos que envolvem a medida do grau de conversão

(α) em função do tempo (t) a temperatura constante (T) (isotérmicos) ou como uma

função de temperatura (T), que é aumentada de acordo com algum programa de

aquecimento usualmente linear, β=dT/dt (não-isotérmico). Em relação ao método não-

Page 48: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

62

isotérmico, as medidas ocorrem em condições realmente não-isotérmicas de modo

que as determinações apresentam valores altamente desejáveis. De acordo com

Kozmidis-Petrovic, este método tem sido bastante aplicado para substâncias amorfas

(KOZMIDIS-PETROVIC´; ŠTRBAC; ŠTRBAC, 2007). Outro método bem conhecido é

o modelo isoconversional que sofre a influência dos parâmetros de Arrhenius

conhecidos como “triplete cinético”, a saber: E, energia de ativação, A fator pré-

exponencial, e g ou f(α), fator de conversão (SEWRY; BROWN, 2002). Segundo

Vyazovkin, se o triplete cinético for determinado corretamente, isto pode ser usado

para reproduzir os dados cinéticos originais bem como para predizer os processos

cinéticos fora da região da temperatura experimental” (VYAZOVKIN; SBIRRAZZUOLI,

2006). Para estes métodos isoconversionais de cinética não-isotérmica, podem ser

utilizados os modelos computacionais de Kissinger, Flynn-Wall-Ozawa e Vyazovkin.

Nesse sentido, as empresas que produzem os equipamentos, fornecem os softwares

de cinética, por isso o método de Ozawa é largamente utilizado, pela facilidade de

acesso e manuseio (KHAWAM; FLANAGAN, 2006). Já o estudo cinético do tipo

isotérmico trata-se de uma medida direta do tempo que resulta em tratamento

simplificado dos dados. Entretanto, possui longos períodos para aquisição destes

dados e não é possível obter um ensaio rigorosamente isotérmico, uma vez que a

temperatura da isoterma geralmente excede o valor estipulado (LÓPEZ-GONZÁLEZ

et al., 2014).

Para medidas dinâmicas a aproximação usual é:

𝑑𝛼

𝑑𝑇 = (

𝑑𝛼

𝑑𝑡) (

𝑑𝑡

𝑑𝑇) = (

𝑑𝛼

𝑑𝑡)(

1

𝛽)

1

𝛽 = razão de aquecimento

𝑑𝛼

𝑑𝑇 =

𝐴

𝛽 exp (-

𝐸

𝑅𝑇) f(α)

Considerando E e A constantes pode-se separar as variáveis na forma de derivada:

𝑑(𝛼)

𝑓(𝛼) =

𝐴

𝛽 exp (-

𝐸

𝑅𝑇) 𝑑𝑇

Page 49: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

63

Ou na forma integral g(α)

g(α)=∫𝑑𝛼

𝑓(𝛼)

𝛼

0=

𝐴

𝛽 ∫ exp(−

𝐸

𝑅𝑇) 𝑑𝑇

𝑇

0

- Espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com

transformada de Fourier (FTIR): é uma ferramenta importante para a caracterização

de complexos de inclusão no estado sólido, devido à perda da vibração de flexão da

molécula hóspede, mediante complexação. Além disso, os estudos espectrais de

FTIR fornecem informações sobre o envolvimento do átomo de hidrogênio em vários

grupos funcionais (KFOURY et al., 2014). Petralito e colaboradores relataram que a

técnica de FTIR é útil para sugerir a complexação de fármacos pouco solúveis como

a diacereína, em CDs. Neste estudo, eles demonstraram que o desaparecimento da

banda da carbonila no espectro sugeriu a formação de ligações de hidrogênio entre o

grupo carbonila da diacereína e o grupo hidroxila da cavidade da HPβCD conduzindo

a complexação do fármaco (PETRALITO et al., 2014). As CDs formam complexos de

inclusão no estado sólido através de interações não-covalentes, tais como interações

hidrofóbicas, interações de van der Waals e ligações de hidrogênio. Quando a

molécula hóspede é complexada, as bandas de absorção resultantes da parte incluída

da molécula hóspede, são geralmente deslocadas em suas posições (PERIASAMY et

al., 2014).

- Microscopia eletrônica de varredura (MEV): é uma técnica bastante

relatada na literatura em estudos de complexos de inclusão. As fotomicrografias

elucidam as diferenças morfológicas dos complexos de inclusão em relação aos

componentes puros. As alterações na estrutura cristalina das moléculas demonstram

a interação entre ambas e consequente formação dos complexos de inclusão

(PERIASAMY et al., 2014).

- Difração de raios-X (DRX): a técnica é utilizada para analisar as alterações

na cristalinidade das amostras, o que evidencia a complexação (CHOI, S. G. et al.,

2014). Rajendiran e colaboradores demonstraram que nos difratogramas de

Page 50: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

64

complexos de inclusão, halos de reflexão característicos das amostras puras

desaparecem indicando uma baixa cristalinidade do complexo (RAJENDIRAN;

MOHANDOSS; SARAVANAN, 2014). Quando o complexo não apresenta halos de

cristalinidade, é considerado amorfo (RACHMAWATI; EDITYANINGRUM;

MAULUDIN, 2013). Uma outra forma de investigar a complexação é através do

aparecimento de novos halos de cristalinidade no difratograma do complexo,

caracterizando assim, uma nova fase sólida (TOROPAINEN et al., 2006).

3 OBJETIVO GERAL

Obter complexos de inclusão do OEHP em β-CD e do ISOP em α- e β-CD, bem

como caracterizá-los físico-quimicamente.

3.1 Objetivos específicos Preparar os complexos do OEHP em β-CD e do isopulegol em α- e β-CD

através dos métodos da malaxagem (PC), co-evaporação (SC) e compará-los

com a mistura física (PM);

Avaliar o perfil térmico das amostras por termogravimetria/termogravimetria

derivada (TG/DTG) e calorimetria exploratória diferencial (DSC);

Caracterizar fisicamente os compostos isoladas e seus complexos de inclusão

por difração de raios X (DRX) e microscopia eletrônica de varredura (MEV);

Caracterizar quimicamente as amostras através da técnica de

espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com transformada

de Fourier (FTIR);

Avaliar a eficiência de complexação do OEHP em β-CD e do ISOP em α- e β-

CD por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas (CG/EM)

através da extração total e superficial dos óleos em estudo;

Realizar o estudo de modelagem molecular do ISOP em α- e β-CDs através da

técnica de Docking a fim de avaliar de forma teórica qual a melhor CD para

complexar o monoterpeno.

Realizar uma triagem antinociceptiva e anti-inflamatória do OEHP e seu

complexo de inclusão através do teste de formalina

Page 51: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

65

CAPÍTULO II

Physicochemical characterization and analgesic effect of inclusion

complexes of essential oil from Hyptis pectinata L. Poit leaves with β-

cyclodextrin

Artigo publicado na Current Pharmaceutical Biotechnology

Fator de impacto 2.511

Qualis Medicina I A2

CAPÍTULO II

Physicochemical characterization and analgesic effect of inclusion complexes of

essential oil from Hyptis pectinata L. Poit leaves with β-cyclodextrin

Artigo publicado na Current Pharmaceutical Biotechnology

Fator de impacto 2.511

Qualis Medicina I A2

Page 52: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

66

Physicochemical characterization and analgesic effect of inclusion complexes of

essential oil from Hyptis pectinata L. Poit leaves with β-cyclodextrin

P.P. Menezes1, A.A.S. Araújo1, G.A.A. Dória1, L.J. Quintans-Júnior2, M.G.B. Oliveira2, M.R.V.

Santos2, J.F. Oliveira3, J.R. Matos3, F.M.S. Carvalho4, P.B. Alves5, I.L. Matos5, D.A. Santos5, R.N.

Marreto6, G. F. Silva7, M.R. Serafini1*

1Departamento de Farmácia, Universidade Federal de Sergipe, Address: Av. Marechal Rondon, s/n, Cidade Universitária, São Cristóvão, Sergipe 49100-000, Brazil.

2 Departamento de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe, Address: Av. Marechal Rondon, s/n, Cidade Universitária, São Cristóvão, Sergipe 49100-000, Brazil.

3Departamento de Química Fundamental, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, Av. Lineu Prestes, 748, São Paulo, SP 05508-000, Brazil.

4 Departamento de Mineralogia e Geotectônia, Instituto de Geociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brazil.

5 Departamento de Química, Universidade Federal de Sergipe, Address: Av. Marechal Rondon, s/n, Cidade Universitária, São Cristóvão, Sergipe 49100-000, Brazil.

6Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Goiás. Praça Universitária, 1166, Setor Universitário, Goiânia, Goiás 74605-010, Brazil

7Departamento de Engenharia Química, Universidade Federal de Sergipe, Address: Av. Marechal Rondon, s/n, Cidade Universitária, São Cristóvão, Sergipe 49100-000, Brazil.

* Department of Pharmacy. Federal University of Sergipe. Address: Av. Marechal Rondon, s/n,

Cidade Universitária, 49100-000, São Cristóvão, Sergipe, Brazil. E-mail:

[email protected] or [email protected], Tel/Fax: +55-11-2105-6640

Page 53: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

67

Abstract

The formation of inclusion complexes of Hyptis pectinata essential oil (EOHP), with potent

activities such as anti-nociceptive, anti-inflammatory, among others, with β-cyclodextrin (β-CD), was

obtained by slurry (SC) and paste procedures (PC). The gas chromatography coupled to the mass

spectrometry (GC/MS) analysis demonstrated a total of 36.4% monoterpenes and 63.6%

sesquiterpenes in the EOHP. The major components of EOHP were identified as (E)-caryophyllene

(54.07%). The analysis of samples (PM, PC and SC) by GC/MS involved the surface and the total

extracted oils. The GC/MS results suggested important differences between in SC and PC methods

indicating the complexation of mono and sesquiterpenoids in different ratios. Furthermore, the thermal

analysis techniques suggests the complexation, especially in SC, which show a

thermogravimetry/derivative thermogravimetry (TG/DTG) peak at 140–270 ºC, probably related to oil

loss. Scanning electron microscopy (SEM) images showed reduction size of the samples mainly in the

SC product. Additionally, EOHP/ β-CD improves pharmacological profile of EOHP alone in formalin-

induced pain protocol in mice.

Keywords: β-cyclodextrin; (E)-caryophyllene; essential oil; Hyptis pectinata; inclusion

complexes.

Chemical compounds studied in this article:

(E)-caryophyllene (PubChem CID: 5281515); caryophyllene oxide (PubChem CID: 14350);

germacrene D (PubChem CID: 5317570)

Introduction

Hyptis pectinata L. Poit. (Lamiaceae), known popularly as “sambacaita”, is an important

medicinal herb common in the states of Alagoas and Sergipe (Northeastern Brazil). In order to validate

its popular use, studies have been carried out to ascertain antinociceptive and antimicrobial activities

[(ARRIGONI-BLANK et al., 2008; RAYMUNDO et al., 2011; SANTOS, P. O. et al., 2008)], as well as the anti-inflammatory effect of

the volatile oil of the leaves. Although only a few samples have been evaluated, it appears that the

essential oils from the H. pectinata leaves exhibit composition variability characterized by the occurrence

of p-cymene (33.7 %) and thymol (26 %) in France [(MALAN et al., 1988)] , (E)-caryophyllene (40 %)

and on the Fiji Islands; also, p-cymene (33.7 %) in Western Africa [(RAYMUNDO et al., 2011)]. Some studies

have shown that the genetic variation among the same species can alter the concentration of active

principles from H. pectinata [(ARRIGONI-BLANK et al., 2008)]. Additionally, the climate, soil, seasonality, time and

Page 54: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

68

type of culture, as well as fertilizers, may affect the composition of active principles. Some variations

have been seen in the chemical constituents in the essential oil among different genotypes from H.

suaveolens species in the Brazilian “cerrado” [(MALAN et al., 1988)].

Water-insoluble bioactive compounds as those present in the essential oil from the H. pectinata can

be solubilized by the inclusion complex formation with cyclodextrins (CDs), and the interaction of such

compounds with light and oxygen is also decreased due to the molecular complexation [(AZEVEDO, N. R. et

al., 2002; HĂDĂRUGĂ, N. G. et al., 2012)]. Cyclodextrins are cyclic oligosaccharides with a lipophilic cavity and a

hydrophilic outer surface. These oligosaccharides are found in nature as α, β and γ- CDs comprised by

6, 7 or 8 glucose units, respectively. The different natural CDs have different solubility and their

properties can be further improved by the chemical modifications in their molecular structure [(SALUSTIO et

al., 2009)]. During the process of the inclusion complex formation, the guest may be totally included in the

hydrophobic cavity of the host or associated with the hydrophobic or hydrophilic part of the molecule

[(HILL et al., 2013)].

Pinho et al reviewed the several applications of the cyclodextrins as complexing agents for plant

bioactive materials. Those authors reported the improvement of material solubility as the main goal in

essential oil complexation. In addition, inclusion complexation may turn liquid active materials into easy-

to-handle solids, and control the high volatility of these compounds [(PINHO et al., 2014)]. Our research group

has prepared inclusion complexes of Lippia gracilis essential oil (a natural larvicide) with hydroxypropyl-

β-cyclodextrin by using different inclusion methods [(MARRETO et al., 2008)]. The resulting complexes were

easy-to-handle powders, with better properties to the intended application. Additionally, our group has

also suggested that an inclusion complex with β-CD and essential oils or related compounds, such as

terpenes, can produce significant improvements in the chemical and pharmacological properties

[(QUINTANS-JUNIOR et al., 2013; QUINTANS JDE; MENEZES; et al., 2013; SERAfiNI et al., 2011; SIQUEIRA-LIMA et al., 2014)].

The main goal of the present work was to analyze the chemical composition of the essential oil from

the H. pectinata and to study the complexation of this material with β-CD using different methods: slurry

(SC) and paste methods (PC), and these were compared with physical mixtures (PM). The complexes

were characterized through differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry/derivative

thermogravimetry (TG/DTG), scanning electron microscopy (SEM), X-ray powder diffraction (XRD) and

gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS). For each inclusion complex obtained, the qualitative

Page 55: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

69

and quantitative analyses of the total oil, surface oil and volatile profiles were performed. Afterwards,

the pharmacological properties of the best complex was evaluated by means of the formalin test.

Material and methods

Material

Hyptis pectinata leaves were collected in November 2012 in Laranjeiras, Sergipe, Brazil

(37.1696, 10°48′12″ (S), 37°10′11″ (W)) 9 meters above the sea level. Herbarium voucher specimens

(registry number 7454) were prepared and deposited at the Department of Biology of the Federal

University of Sergipe. The leaves were dried at circulating air oven (38 ± 2 °C) for two days. Essential

oil was extracted from leaves from H. pectinata by using an apparatus for Clevenger over 2 h, the yield

was 0.7%. The β-CD was purchased from SIGMA (St. Louis, USA).

Preparation of inclusion complexes

Inclusion complexes were prepared through three different procedures (physical mixture, paste

complexation and slurry complexation) as described by Menezes et al [(MENEZES, P. P. et al., 2014)].

These samples were prepared based on (E)-caryophyllene’s molecular weight (204 g.mol-1) and the

molar ratio was maintained as described for the inclusion complex preparation (1:1). The physical

mixture was prepared by adding essential oil from H. pectinata (204 mg) in an agate mortar containing

β-CD (1135 mg) under manual stirring and were then stored in sealed glass vials. Paste complexation

was prepared through homogenization β-CD (1135 mg) in water (1.2:4 w/v) directly in an agate mortar.

After that, the paste was maintained under a constant manual agitation. Then, the material was dried at

room temperature (in a desiccator) until a glass film was formed, which was removed by manual

trituration and stored in airtight glass containers. Finally, the slurry complexation was performed by

adding water to a beaker containing essential oil from H. pectinata (204 mg) and β-CD (1135 mg, 3:4

v/w), under magnetic stirring at 400 rpm for 36 hours constantly (Quimis Q 261A21, Brazil). Then, the

material was dried in a desiccator and removed by manual trituration as described in a paste

complexation method.

Thermal analysis

Differential scanning calorimeter (DSC) and Thermogravimetry/derivative thermogravimetry

(TG/DTG) curves were obtained as described by Serafini et al (2011) [(SERAfiNI et al., 2011)]. DSC curves were

performed in a DSC-60 cell (Shimadzu) using aluminum crucibles containing about 2 mg of samples,

Page 56: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

70

under dynamic nitrogen atmosphere (50 mL/min) and heating rate of 10°C/ min in the temperature range

from 25°C to 500°C. The DSC cell was verified with indium (m.p. 156.6°C; DH fus = 28.54 J/g) and zinc

(m.p. 419.6°C). TG/ DTG curves were obtained with a TGA 60 (Shimadzu) thermobalance in the

temperature range of 25–900°C, in platinum crucibles containing approximately 3 mg of samples, under

dynamic nitrogen atmosphere (50 mL/min) and heating rate of 10°C/min. The TG/DTG was verified with

calcium oxalate monohydrate, according to ASTM standard.

Scanning electron microscopy (SEM)

The samples were mounted on gold tape and visualized with a JSM-7410-F SEM JEOL, at an

accelerated voltage of 1 kV.

X-ray powder diffraction (XRD)

XRD patterns were obtained on a Siemens, model D5000, with tube of CuK, in the interval of

3 to 65o (2) and 1s the pass time, using the powder X-ray diffraction method.

Efficiency complexation by gas chromatography-mass spectrometry analyses (GC/MS)

These parameters of GC/MS technique were adapted from the study of Marreto et al (2008)

[(MARRETO et al., 2008)]. A multi-dimensional GC/MS system (QP2010 Ultra, Shimadzu Corporation, Kyoto,

Japan) equipped with an AOC-20I auto-injector (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) was used for

performing the analyses employing the following conditions: RestekRtx®-5MS fused silica capillary

column (30 m x 0.25 mm i.d x 0.25 mm thickness film, composed by 5 %-diphenyl-95-dimethyl

polysiloxane) was used. Helium (99.999 %) was used as carrier gas at a constant flow of 1.2 mL.min-1

and an injection volume of 2.0 µL was employed (split ratio 1:10). The injector temperature was 250 °C

and the ion source temperature was 200 °C. The oven temperature was programed to 60 °C with an

increase of 3 °C.min-1 to 230 °C. The FID and MS data were acquired simultaneously using a detector

separation system and the flow split ratio was 4:1 (MS: FID). A tube restrictor of 0.62 m x 0.15 mm i.d

(capillary column) was used to connect the splitter to the MS detector; a tube restrictor of 0.74 m x 0.22

mm i.d was used to connect the splitter to the FID detector. Mass spectra were taken at 70 eV, a scan

interval of 0.3 s and fragments from 40 to 350 Da. FID temperature was adjusted to 250 °C, and the

gases supplied to FID were synthetic air, hydrogen and helium at flow rates of 30, 300 and 30 mL.min-

Page 57: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

71

1, respectively. Quantification of each constituent was estimated by normalizing the peak area generated

in the FID—(%). Compound concentrations were calculated from the GC peak areas and are arranged

in order of elution from the GC.

Extraction of total essential oil from H. pectinata

Total oil adsorbed in the β-CD was determined through extraction according to the method

described by Marreto et al [(MARRETO et al., 2008)]. Distilled water (8 mL) plus hexane (4 mL) and 0.2 g of the

sample were put in a round-bottom flask which was kept in a water bath at 85 °C for 20 min, with constant

shaking. The organic phase was decanted (3 times) and concentrated to approximately 1 mL using

rotary evaporator. Afterwards, internal standard (menthol, 2 mg) was added and stored until GC–MS/FID

analysis.

Extraction of surface-adsorbed essential oil from H. pectinata

The amount of essential oil from H. pectinata adsorbed on the surface of β-CD was determined

through washing. Sample (3 g) with hexane (20 mL) was shaken for 20 min. The suspension was filtered

and the residue was washed with hexane (10 mL). Then, hexane (1 mL) and internal standard (menthol,

2 mg) were added to the filtrate, which was concentrated using rotary evaporator and analyzed by

means of GC-MS/FID. Thus, the difference between the total essential oil from H. pectinata (surface-

adsorbed essential oil from H. pectinata and hosted in the cavity) and the surface-adsorbed essential

oil from H. pectinata corresponds to the amount complexed in the β-CD cavity.

Pharmacological procedure

Animals

In pharmacological protocols, we used adult (3months old) female albino Swiss mice (27–35 g),

which were randomly housed in appropriate cages at 21 ± 2°C with free access to food (Purina®, Brazil)

and tap water. All female used in analgesic protocols were in diestrus phase as described by Shane et

al. (2007)(SHANE et al., 2007). The behavioral analysis were carried out by the same visual observer

and in a double-blind manner. The Animal Care and Use Committee at the Federal University of Sergipe

(CEPA / UFS 10/2011) approved experimental protocols and these were according to Guide for the

Care and Use of Laboratory Animals.

Formalin test

This procedure was similar to the method described by Hunkaar and Hole (1987) [(HUNKAAR; HOLE,

1987)]. In this pharmacological protocol, animals received injection (s.c.) of 20 µL of 1% formalin in the

Page 58: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

72

subplantar region of the right hind paw. The time that the mice spent licking their injected paws was

immediately recorded. Nociception was quantified in two phases: 0-5 min. after the formalin injection

(first phase) and 15-30 min. after the formalin injection (second phase). To assess the effect of the test

drug, groups of mice (n = 7, per group) were pre-treated with control (saline), β-CD, OEHP (40 mg/kg,

p.o.) and OEHP/β-CD (40 mg/kg, p.o.) 60 min. before the local injection of formalin. They were

individually placed in a transparent plexiglass-cage observation chamber (25 x 15 x 15 cm). The amount

of time spent licking the injected paw was indicative of pain.

Statistical analysis

The obtained data were evaluated by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by

Tukey’s test. In all cases, differences were considered significant if p < 0.05. All statistical analyses were

held using GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA, USA).

Results and Discussion

These constituents from H. pectinata oil were previously identified, and the compounds are

listed in Table 1. The identified constituents were sesquiterpenoids with high contents of (E)-

caryophyllene (54.07%), germacrene D (7.46%) and caryophyllene oxide (14.91%). The structures of

the major constituents are shown in Fig. 1.

Table 1. Chemical compounds present in EOHP.

Peak RT (min) Compound (%) GC-FID

IRR

exp.*

1 6.535 α-thujene 0.17 945

2 6.770 α-pinene 0.15 951

3 7.950 sabinene 0.13 981

4 8.085 β-pinene 0.92 985

5 8.440 mircene 0.16 993

6 9.400 α-terpinene 0.03 1018

7 9.705 p-cymene 1.15 1026

8 9.905 limonene 0.28 1031

9 10.015 1,8-cineole 0.07 1034

10 10.130 -β-ocimene 0.22 1037

11 10.565 -β-ocimene 1.63 1048

Page 59: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

73

12 11.030 γ-terpinene 1.02 1060

13 12.245 terpinolene 0.04 1091

14 12.705 linalool 0.80 1102

15 16.165 terpinen-4-ol 0.12 1180

16 16.770 α-terpineole 0.04 1194

17 23.475 -elemene 0.29 1341

18 23.975 α-cubebeno 0.05 1352

19 25.225 α-copaene 2.46 1380

20 25.600 β-bourbonene 0.75 1388

21 25.935 β-elemene 1.54 1396

22 26.725 α-gurjunene 0.35 1414

23 27.170 (E)-caryophyllene 54.07 1424

24 27.940 α-guaiene 0.21 1441

25 28.150 6,9-guaiadiene 0.04 1446

26 28.460 geranylacetone 0.07 1453

27 28.670 α-humulene 1.62 1458

28 29.835 germacrene-D 7.46 1484

29 30.560 bicyclogermacrene 1.29 1501

30 30.820 α-bulnesene 0.10 1507

31 31.220 γ-cadinene 0.09 1517

32 31.555 -cadinene 1.23 1526

33 33.040 germacrene-B 0.23 1562

34 34.185 caryophyllene oxide 14.91 1591

35 34.965 ledol 0.16 1610

36 35.205 humulene II epoxide 0.28 1616

37 35.900 1-epi-cubenol 0.19 1633

38 36.100 caryophylla-

4(12),8(13)-dien-5-ol

0.13 1638

39 36.270 caryophylla-

4(12),8(13)-dien-5-ol

0.34 1643

40 36.425 epi--muurolol 0.47 1646

Page 60: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

74

41 36.605 α-muurolol 0.13 1651

42 36.965 α-cadinol 0.62 1660

43 38.195 germacra-

4(15),5,10(14)-trien-1--ol

0.15 1690

44 46.365 (5E,9E)-farnesilacetone

0.08 1915

*RRI = relative retention index using the Van den Dool equation (Van den Dool and Kratz 1963)

[(DOOL; KRATZ, 1963)].

Fig. 1 Structure of the major constituents of Hyptis pectinata essential oil. (a) (E)-caryophyllene,

(b) caryophyllene oxide and (c) germacrene D.

Similar results were observed by Tchoumbougnang et al who identified (E)–caryophyllene (22.10%),

germacrene D (28.00%) and caryophyllene oxide (1.40%) as major compounds in the essential oil from

aromatic plants of tropical Central Africa [(TCHOUMBOUGNANG et al., 2005)]. However, the chemical composition

of essential oil from H. pectinata is variable, and some authors have reported different results. Serafini

et al (2012) identified sesquiterpenoid compounds with high contents of calamusenone (62.61 %), (E)-

caryophyllene (8.45 %), cis-β-guainene (5.67 %) and caryophyllene oxide (3.63 %) in an essential oil

from H. pectinata of Sergipe, Brazil [(SERAFINI et al., 2012)].

The high value of caryophyllene oxide (14.91 %) in essential oil from H. pectinata could occur due

to the reaction with oxygen. “Some compounds easily react with oxygen and conduct to reactive oxidized

derivatives with higher toxicity; the case of limonene (a compound from a wide variety of essential oils

Page 61: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

75

and flavoring formulae) was reported by Clayton and Clayton. The limonene reacts very easily with

oxygen or oxidant compounds and can conduct to diepoxy-limonene, a carcinogenic compound

according to Clayton & Clayton (1981)” [(CLAYTON; CLAYTON, 1981)]. Futhermore, the same reaction

appears in the case of almost all mono- and sesquiterpenes (which are the major compounds of many

essential oils). This reaction can be blocked, i.e. by molecular complexation in CDs [(HĂDĂRUGĂ, D. I. et al.,

2007; HĂDĂRUGĂ, N. G. et al., 2012; HĂDĂRUGĂ, N. G. et al., 2006)].

The formation of inclusion complexes between essential oil from H. pectinata and β-CD was

evaluated by obtaining DSC (Fig. 2) and TG/DTG (Fig. 3) curves of pure compounds, physical mixture,

paste complexation and slurry complexation. The Table 2 lists the mass losses calculated from specific

intervals for each material studied in the present work.

Data analysis of DSC curves (Fig. 2) showed that the major fraction of essential oil from H. pectinata

evaporates up to 160°C. TG/DTG (Fig 3) curves show two stages of weight loss. The first occurred

nearly 30-178°C (∆m=89.7%) and refers to the volatilization of the substances of low molecular weight

such as sesquiterpenoids, including (E)-caryophyllene, germacrene-D, and monoterpenoids. The

second stage occurred in 178-900°C range (∆m=10.3%) and can be associated to the volatilization and

decomposition of the one compound of higher molecular weight (caryophyllene oxide). Henceforth,

TG/DTG curves showed that the thermal decomposition of the oil started and occurs with elemental

carbon formation because of the sample. The disappearance of these events in the complexes is due

to their complexation in the host β-CD.

The DSC curves of the essential oil from H. pectinata/β-CD complexes showed three endothermic

peaks. The first in the range of 25–121°C (which corresponds to the release of water molecules and

essential oil from H. pectinata, probably adsorbed in the surface). The second event occurred in the

range of 121–270°C, where complexed essential oil from H. pectinata was released, and at ∼300°C,

where an event related to the decomposition of cyclodextrin molecules can be observed. In the DSC

curve acquired from pure β-CD, only the peaks corresponding to the release of water molecules (higher

in the case of complexes), melting and decomposition, appeared (Fig. 2). It is important to note that the

DSC curves of slurry complex and paste complex did not show the melting peak of CD at 200ºC, which

denotes the occurrence of complexation. On the other hand, the DSC curve of physical mixture showed

the melting endothermic event evidencing the complexation not through this method.

Page 62: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

76

Fig. 2 DSC curves of essential oil from H. pectinata (EOHP), β-CD, physical mixture (PM), paste complex (PC) and slurry complex (SC) in dynamic nitrogen atmosphere (50 mL.min−1) and hate heat 10 °C.min−1.

The TG curve of the physical mixture showed the superposition of the thermal behavior of the pure

host and guest, indicating multi-step evaporation of the essential oil from H. pectinata and the adsorbed

water content of β-CD up to 270°C (Table 2). That occurred because the essential oil from H. pectinata

shows two continuous weight loss steps, so that the physical mixture exhibits 12.06% up to 140°C and

10.49% up to 270°C. The paste complex showed weight loss of 9.30% up to 140°C and 3.11% up to

270°C. However, the slurry complex samples showed weight losses of 8.91% up to 140ºC and 3.93%

up to 270ºC, and that means that the slurry complex was the best method of complexation, since it was

able to release higher amounts of essential oil in a higher temperature range. This characterized the

complexation phenomenon. Similar results were reported by Menezes et al (2014), who observed

superposition of the thermal behavior in R (-)-linalool and β-CD pure compounds and complexes

[(MENEZES, P. P. et al., 2014)].

Page 63: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

77

Fig. 3 TG curves of essential oil from H. pectinata (EOHP), β-CD, physical mixture (PM), paste

complex (PC) and slurry complex (SC) in dynamic nitrogen atmosphere (50 mL.min−1) and hate heat 10 °C.min−1.

Table 2. Mass losses for essential oil from H. pectinata (EOHP), β-CD, physical mixture (PM)

and essential oil from H. pectinata /β-CD complexes.

Weight loss/%

1st step 2ndstep 3rdstep 4th step

EOHP 89.71# 10.29## - -

-CD 12.51 - 72.88 10.76

PM 12.06 10.49 52.33 21.75 PC 9.30 3.11 64.44 18.04 SC 8.91+ 3.93++ 60.53** 21.25***

# percentage of the EOHP evaporates up to 178 °C;## percentage of the EOHP evaporates up to 900 ºCpercentage of water releasing up to 120 °C;

mass loss related to evaporation of the EOHP and the water release up to 140 ºC; mass loss probably attributed to EOHP release in the interval from 140

to 270 °C; thermal decomposition in the interval from 270 to 365 °C; elemental carbon formation due to sample carbonization in the interval from 365 to

900 °C.

As seen from Fig. 4, there were drastic changes in particle shapes and original morphologies of the

inclusion complexes. The complexes between essential oil from H. pectinata and β-CD appeared as

agglomerates. In contrast, the particle morphologies and size of the corresponding physical mixture

(99.6±7.2 µm) were similar to those of β-CD (82.2 ± 11.6 µm) that demonstrated the non-inclusion of

Page 64: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

78

the essential oil from H. pectinata at the β-CD cavity. The particle sizes of the physical mixture were

much larger than inclusion complex products, paste complex (43.1 ± 8.3 µm) and slurry complex (4.4 ±

2.4 µm). In addition, it can be observed the amorphization characteristics of the paste complex and

slurry complex samples, indicating the formation the inclusion complexes. The result of slurry complex

corroborates to study of Louiz et al that presented the size particle of 3 µm with inclusion complex of 3-

amino-5-methyl pyrazole with β-CD obtained by co-evaporation method [(LOUIZ; LABIADH; ABDERRAHIM, 2015)].

Page 65: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

79

Fig. 4 SEM micrographs of β-CD (A1 and A2), physical mixture (B1 and B2), paste complex (C1

and C2) and slurry complex (D1 and D2) at different magnifications (250x and 500x) of cross-sections

100 and 10 µm, respectively.

This result corroborated with XRD, which showed that different crystal structures for the products

were obtained through paste complex and slurry complex methods. The XRD of the β-CD, physical

Page 66: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

80

mixture, paste and slurry complex are shown in Fig. 5. This result demonstrated inclusion complex

formation induced large shifts in the wide-angle XRD signals of β-CD. Furthermore, the paste and slurry

had different XRD signals in relation to physical mixture and β-CD. The physical mixture showed several

peaks characteristics to crystalline β-CD. Only a slight decrease in peak intensity was observed. In

comparison, the complexes obtained by paste and slurry methods showed the disappearance of

reflections and the appearance of new peaks. Menezes et al (2014) obtained similar results [(MENEZES, P.

P. et al., 2014)]. No inclusion complex was obtained through physical mixture, while paste and slurry complex

products showed weak interactions confirming the DSC and TG/DTG results.

Fig. 5 X-ray diffraction of β-CD, physical mixture (PM), paste complex (PC), and slurry

complex (SC).

Martin Del Valle stated that the ability of a cyclodextrin to form an inclusion complex with a guest

molecule is a function of two key factors. “The first is steric and depends on the size of the CD relative

to the size of the guest molecule or certain key functional groups with the guest. If the guest has the

wrong size, it will not fit properly into the cyclodextrin cavity. The second critical factor is the

thermodynamic interactions between the different components of the system (cyclodextrin, guest,

solvent). For a complex to form there must be a favorable net energetic driving force that pulls the guest

into the CD. Another form can be the low chemistry affi -CD” [(VALLE, 2004)].

This is the case of caryophyllene oxide and humulene II epoxide. These oxygenated sesquiterpenes

are complexed in none of the methods studied here. In 1989, Schmid observed that “the potential guest

Page 67: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

81

for molecular complexation in CDs is quite varied and includes straight or branched chain aliphatic

compounds, aldehydes, ketones, alcohols, organic acids, aromatics, gases and polar compounds such

as halogens, oxyacids and amines” [(SCHMID, 1989)]. In the present work, forty-four compounds were

identified in oil, being 36.4% monoterpenes and 63.6% sesquiterpenes. Their retention indices and

percentage compositions are given in Table 1. The Table 3 lists the identified compounds extracted from

the physical mixture, paste and slurry complex. In all cases, the concentration of the terpenes in

complexed oil was calculated by the subtraction of the amount of the total oil from the amount of the

surface-adsorbing oil. According to the Tables 3, the essential oil from H. pectinata was complexed in

1: 1 molar ratio by the two complexation methods studied, despite being in a low percentage in the

essential oil. Other terpenes such as β-pinene, p-cymene and germacrene-D were totally complexed

through paste and slurry complex.

In this study, the inclusion complexation methods affected the properties of the final product. Slurry

complex leads to a more efficient complexation of essential oil from H. pectinata terpenes, once that the

(E)-caryophyllene was complexed in one molar ratio 1:35.3 and 1:41 in paste and slurry complexes,

respectively. Liu et al (2013) also demonstrated that the complexation of (E)-caryophyllene into β-CD

[(LIU et al., 2013)]. The larger water quantitative and steric factors can be influenced in this phenomenon.

Furthermore, it is important to note that sesquiterpenes were not lost, but retained on the surface of the

complexes.

“Some high molecular weight compounds such as oils have a tendency to associate with themselves

rather than interacting with cyclodextrin. In such cases, using more water allied with good mixing will

allow better dispersion and separation of the oil molecules or isolation of the oil molecules from each

other. When the oil molecules come into contact with the cyclodextrin, they form a more stable complex

rather than they would if less water were present” [(VALLE, 2004)]. That explains why the slurry procedure

was the best complexation method once that it allows higher complexation percentage of the guest

molecules.

Page 68: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

82

Table 3. Characterization of essential oil from H. pectinata, β-CD, physical mixture (PM) and

inclusion complexes obtained by paste complexation (PC) and slurry complexation (SC).

Compound Surface oil Total oil Compl. Oil/% Complexation ratio

Physical mixture (PM)

Menthol 7.64 77.73 70.09 1:9.17

Caryophyllene oxide

32.49 8.40 -

24.09 -

∑ UC# 56.91 13.87 - -

Paste complexation (PC)

Menthol 14.72 52.54 37.82 1:2.56

-pynene - 0.51 0.51 Total

p-cymene - 2.17 2.17 Total

Linalool - 0.96 0.96 Total

copaene - 1.18 1.18 Total

elemene - 0.54 0.54 Total

(E)-caryophyllene

0.40 14.54 14.14 1:35.3

Germacrene-D - 2.26 2.26 Total

Caryophyllene oxide

55.52 19.60 -

35.92 None

∑ UC# 28.19 2.88 - -

Slurry complex (SC)

Menthol 10.74 48.50 37.76 1:3.5

-pynene - 0.34 0.34 Total

p-cymene - 1.80 1.80 Total

Linalool - 0.57 0.57 Total

copaene 1.03 1.17 0.14 1:0.1

elemene 0.18 0.55 0.37 1:2

(E)-caryophyllene

0.49 20.56 14.14 1:41

Germacrene-D - 1.07 1.07 Total

Caryophyllene oxide

57.73 21.33 -

36.40 None

∑ UC# 25.76 2.19 - -

# Unidentified compounds

Dallel and employees described in 1995 that the injection of formalin induces a tissue damage, long-

lasting pain that mimics some features of post-injury pain in man. After the injection into the paw, the

nociceptive behavior consists of a biphasic response [(DALLEL et al., 1995)]. The first phase is related to the

Page 69: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

83

direct chemical stimulation of nociceptive nerve endings, which reflect centrally mediated pain with the

release of substance P [(LE BARS; GOZARIU; CADDEN, 2001)]; the second phase is dependent on peripheral

inflammation and changes in central processing and involves serotonin, histamine, bradykinin, nitric

oxide and prostaglandins [(LE BARS et al., 2001)]. Thus, the formalin test is used to evaluate the mechanisms

of pain and analgesia. Therefore, our results suggest that essential oil from H. pectinata and inclusion

complex obtained by slurry procedure possess central and peripheral profiles because they better

inhibited the first and second phase of formalin when compared with control. However, the inclusion

complex produced outstanding analgesic effect when compared with non-complexed essential oil.

Furthermore, in the second phase, the inclusion complex inhibited more the licking paw suggesting its

anti-inflammatory activity. Studies of Fernandes et al (2007) and Raymundo et al (2011) showed that a

high concentration of (E)-caryophyllene is related with the main anti-inflammatory agent and

antinociceptive responses of Cordia verbenacea and H. pectinata respectively, what corroborates with

the present paper [(FERNANDES, E. S. et al., 2007; RAYMUNDO et al., 2011)]. Farther, (E)-caryophyllene, is a CB2

receptor-selective phytocannabinoid, that act modulating the release of pro-inflammatory mediators, as

cytokines, and through of descending pain-inhibitory mechanisms (GERTSCH et al., 2008). In fact, (E)-

caryophyllene can exert analgesic profile through its ability to modulate inflammatory and neuropathic

pain (KLAUKE et al., 2014).

Our results demonstrated that essential oil from H. pectinata and inclusion complex obtained by

means of slurry procedure reduced licking time in two phases in a formalin test (Fig. 6). Furthermore,

the β-CD is considered safe according to Food and Drug Administration (FDA) can being used for

various purposes without showing toxicity (LOFTSSON; BREWSTER, 2010).

Page 70: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

84

Fig. 6 Effects of inclusion complex obtained by slurry procedure (OEHP/β-CD) on formalin-

induced licking paw nociceptive behaviour. Vehicle (control), β-CD, essential oil from H. pectinata-OEHP

(40 mg/kg, p.o.), OEHP/β-CD (40 mg/kg, p.o.) were administered 60 min. before formalin injection. First

phase (0–5 min.) and second phase (15–30 min.) of the formalin test. Values represent mean ± S.E.M.

(n = 7 per group). *p < 0.05, **p < 0.001 or ***p < 0.0001 versus control and #p < 0.05, ##p < 0.001 and

###p < 0.0001 versus OEHP (one-way ANOVA followed by Tukey’s test).

The results of this study clearly demonstrated that slurry complex showed a better inclusion profile

of the active and major terpenes, except for caryophyllene oxide, which has no affinity for β-CD. The

results of DSC, TG/DTG, SEM, XRD and GC/MS demonstrated that EOHP/β-CD complexes have

different physicochemical characteristics from oil free, suggesting the successful complexation from

slurry and paste complexation methods. The complex obtained by slurry procedure improve

pharmacological profile of oil alone in experimental pain protocol. Hence, cyclodextrins can be an

Page 71: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

85

interesting alternative for the essential oils complexation with possible applicability for the treatment of

painful conditions.

Conflict of interest

The authors report no conflict of interests.

Acknowledgments

The authors would like to acknowledge the financial support provided by the Conselho Nacional

de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Brazil); Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado de Sergipe (FAPITEC-SE/Brazil) and Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP/Brazil). We

also would like to thank teacher Abilio Borghi for the gramar review of the manuscript.

References

1. (a) Arrigoni-Blank, M. F.; Antoniolli, A. R.; Caetano, L. C.; Campos, D. A.; Blank, A. F.; Alves, P. B., Antinociceptive activity of the volatile oils of Hyptis pectinata L. Poit. (Lamiaceae) genotypes. Phytomedicine : international journal of phytotherapy and phytopharmacology 2008, 15 (5), 334-9; (b) Raymundo, L. J.; Guilhon, C. C.; Alviano, D. S.; Matheus, M. E.; Antoniolli, A. R.; Cavalcanti, S. C.; Alves, P. B.; Alviano, C. S.; Fernandes, P. D., Characterisation of the anti-inflammatory and antinociceptive activities of the Hyptis pectinata (L.) Poit essential oil. Journal of ethnopharmacology 2011, 134 (3), 725-32; (c) Santos, P. O.; Costa, M. J. C.; Alves, J. A. B.; Nascimento, P. F. C.; Melo, D. L. F. M.; Barbosa-Júnior, A. M.; Trindade, R. C.; Blank, A. F.; Arrigoni-Blank, M. F.; Alves, P. B.; Nascimento, M. P. F., Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Hyptis pectinata (L.) Poit. Quim. Nova 2008, 31, 1648-1652.

2. Malan, K.; Pelissier, Y.; Marion, C.; Blaise, A.; Bessiere, J. M., The essential oil of Hyptis pectinata. Planta medica 1988, 54 (6), 531-2.

3. (a) Azevedo, N. R.; Campos, H. D.; Portes, T. A.; Seraphin, J. C.; Paula, R. J.; Santos, S. C.; Ferri, P. H., Essential oil chemotypes in Hyptis suaveolens from Brazilian cerrado. Biochem. Syst. Ecol 2002, 30, 205–216; (b) Hădărugă, N. G.; Hădărugă, D. I.; Isengard, H. Z., Water content of natural cyclodextrins and their essential oil complexes: A comparative study between Karl Fischer titration and thermal methods. . Food Chem. 2012, 132, 1741-1748.

4. Salustio, P. J.; Feio, G.; Figueirinhas, J. L.; Pinto, J. F.; Cabral Marques, H. M., The influence of the preparation methods on the inclusion of model drugs in a beta-cyclodextrin cavity. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V 2009, 71 (2), 377-86.

5. Hill, L. E.; Gomes, C.; Taylor, T. M., Characterization of beta-cyclodextrin inclusion complexes containing essential oils (trans-cinnamaldehyde, eugenol, cinnamon bark, and clove bud extracts) for antimicrobial delivery applications. LWT - Food Science and Technology 2013, 51, 86-93.

6. Pinho, E.; Grootveld, M.; Soares, G.; Henriques, M., Cyclodextrins as encapsulation agents for plant bioactive compounds. Carbohydrate polymers 2014, 101, 121-35.

7. Marreto, R. N.; Almeida, E. E. C. V.; Alves, P. B.; Niculau, E. S.; Nunes, R. S.; Matos, C. R. S.; Araújo, A. A. S., Thermal analysis and gas chromatography coupled mass

Page 72: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

86

spectrometry analyses of hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex containing Lippia gracilis essential oil. . Thermochim. Acta. 2008, 475, 53–58.

8. (a) Serafini, M. R.; Menezes, P. P.; Costa, L. P.; Lima, C. M.; Quintans Jr, L. J.; Cardoso, J. C.; Matos, J. R.; Soares-Sobrinho, J. L.; Grangeiro Jr, S.; Nunes, P. S.; Bonjadim, L. R.; Araújo, A. A. S., Interaction of p-cymene with β-cyclodextrin. . J Therm Anal Calorim 2011, DOI 10.1007/s10973-011-1736; (b) Quintans Jde, S.; Menezes, P. P.; Santos, M. R.; Bonjardim, L. R.; Almeida, J. R.; Gelain, D. P.; Araujo, A. A.; Quintans-Junior, L. J., Improvement of p-cymene antinociceptive and anti-inflammatory effects by inclusion in beta-cyclodextrin. Phytomedicine : international journal of phytotherapy and phytopharmacology 2013, 20 (5), 436-40; (c) Quintans-Junior, L. J.; Barreto, R. S.; Menezes, P. P.; Almeida, J. R.; Viana, A. F.; Oliveira, R. C.; Oliveira, A. P.; Gelain, D. P.; de Lucca Junior, W.; Araujo, A. A., beta-Cyclodextrin-complexed (-)-linalool produces antinociceptive effect superior to that of (-)-linalool in experimental pain protocols. Basic & clinical pharmacology & toxicology 2013, 113 (3), 167-72; (d) Siqueira-Lima, P. S.; Araujo, A. A.; Lucchese, A. M.; Quintans, J. S.; Menezes, P. P.; Alves, P. B.; de Lucca Junior, W.; Santos, M. R.; Bonjardim, L. R.; Quintans-Junior, L. J., beta-cyclodextrin complex containing Lippia grata leaf essential oil reduces orofacial nociception in mice - evidence of possible involvement of descending inhibitory pain modulation pathway. Basic & clinical pharmacology & toxicology 2014, 114 (2), 188-96.

9. Menezes, P. P.; Serafini, M. R.; Quintans-Júnior , L. J.; Silva, G. F.; Oliveira, J. F.; Carvalho, F. M. S.; Souza, J. C. C.; Matos, J. R.; Alves, P. B.; Matos, I. L.; Hădărugă, D. I.; Araújo, A. A. S., Inclusion complex of (-)-linalool and b-cyclodextrin. J Therm Anal Calorim 2014, 115, 2429–2437.

10. Shane, R.; Bernal, S. Y.; Rozengurtel, S.; Bodnar, R. J., Estrus phase differences in female rats in morphine antinociception elicited from the ventrolateral periaqueductal gray. The International journal of neuroscience 2007, 117 (6), 811-22.

11. Hunkaar, S.; Hole, K., The formalin test in mice. Pain 1987, 30, 103-104. 12. Dool, H. V. d.; Kratz, P. D., A generalization of the retention index system

including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. Journal of chromatography. A 1963, 11, 463.

13. Tchoumbougnang, F.; Amvan-Zollo, P. H.; Fekam-Boyom F.; Nyegue, M. A.; Bessière, J. M.; Menut, C., Aromatic plants of Tropical Central Africa. XLVIII†. Comparative study of the essential oils of four Hyptis species from Cameroon: H. lanceolata Poit., H. pectinata (L.) Poit., H. spicigera Lam. and H. suaveolens Poit,. Flavour Fragr. J. 2005, 20, 340-343.

14. Serafini, M. R.; Vergne, D. M. C.; Rabelo, T. K.; Menezes, P. P.; Rocha, R. F.; Moreira, J. C. F.; Silva, F. A.; Alves, P. B.; Jesus, H. C. R.; Araújo, A. A. S.; Gelain, D. P., Determination of chemical and physical properties of Hyptis pectinata essential oil and their redox active profile. E3 Journal of Biotechnology and Pharmaceutical Research 2012, 3, 1-9.

15. Clayton, G. D.; Clayton, F. E., Patty’s industrial hygiene and toxicology 3rd ed. ed.; Wiley-Interscience: New York, 1981.

16. (a) Hădărugă, N. G.; Hădărugă, D. I.; Păunescu, V.; Tatu, C.; Ordodi, L.; Bandur, G.; Lupea, A. X., Bioactive nanoparticles. Thermal stability of linoleic acid/α- and β-cyclodextrin complexes. Food chemistry 2006, 99, 500- 508; (b) Hădărugă, D. I.; Hădărugă, N. G.; Rivis, A.; Gruia, A.; Pînzaru, I. A., Thermal and oxidative stability of the Allium sativum L. bioactive compounds/ α- and β -cyclodextrin nanoparticles. Rev. Chim. 2007, 58, 1009–1015.

17. Louiz, S.; Labiadh, H.; Abderrahim, R., Synthesis and spectroscopy studies of the inclusion complex of 3-amino-5-methyl pyrazole with beta-cyclodextrin. Spectrochimica acta. Part A, Molecular and biomolecular spectroscopy 2015, 134, 276-82.

18. Valle, M. D., Cyclodextrins and their uses: a review. Process Biochem. 2004, 5, 1033-1046.

19. Schmid, G., Cyclodextrin glucanotransferse production: yield enhancement by overexpression of cloned genes. Trends Biotechnol. 1989, 7, 244–248.

Page 73: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

87

20. Liu, H.; Yang, G.; Tang, Y.; Cao, D.; Qi, T.; Qi, Y.; Fan, G., Physicochemical characterization and pharmacokinetics evaluation of beta-caryophyllene/beta-cyclodextrin inclusion complex. Int J Pharm 2013, 450 (1-2), 304-10.

21. Dallel, R.; Raboisson, P.; Clavelou, P.; Saade, M.; Woda, A., Evidence for a peripheral origin of the tonic nociceptive response to subcutaneous formalin. Pain 1995, 61 (1), 11-6.

22. Le Bars, D.; Gozariu, M.; Cadden, S. W., Animal models of nociception. Pharmacological Reviews 2001, 53, 597-652.

23. Fernandes, E. S.; Passos, G. F.; Medeiros, R.; da Cunha, F. M.; Ferreira, J.; Campos, M. M.; Pianowski, L. F.; Calixto, J. B., Anti-inflammatory effects of compounds alpha-humulene and (-)-trans-caryophyllene isolated from the essential oil of Cordia verbenacea. European journal of pharmacology 2007, 569 (3), 228-36.

24. Gertsch, J.; Leonti, M.; Raduner, S.; Racz, I.; Chen, J. Z.; Xie, X. Q.; Altmann, K. H.; Karsak, M.; Zimmer, A., Beta-caryophyllene is a dietary cannabinoid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2008, 105 (26), 9099-104.

25. Klauke, A. L.; Racz, I.; Pradier, B.; Markert, A.; Zimmer, A. M.; Gertsch, J.; Zimmer, A., The cannabinoid CB2 receptor-selective phytocannabinoid beta-caryophyllene exerts analgesic effects in mouse models of inflammatory and neuropathic pain. European neuropsychopharmacology : the journal of the European College of Neuropsychopharmacology 2014, 24 (4), 608-20.

26. Loftsson, T.; Brewster, M. E., Pharmaceutical applications of cyclodextrins: basic science and product development. The Journal of pharmacy and pharmacology 2010, 62 (11), 1607-21.

Page 74: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

88

CAPÍTULO III

Docking, physico-chemical properties of α- and β-Cyclodextrin Complex

Containing Isopulegol – A comparative study

Artigo enviado à Thermochimica Acta

Fator de impacto 2.105

Qualis Medicina I B1

Page 75: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

89

Ms. Ref. No.: TCA-D-14-00801R2

Title: Docking, physico-chemical properties of <alpha>- and <beta>-Cyclodextrin

Complex Containing Isopulegol - A comparative study

Thermochimica Acta

Dear Mrs. Paula Passos Menezes,

I can now inform you that the reviewers and editor have evaluated the manuscript

"Docking, physico-chemical properties of <alpha>- and <beta>-Cyclodextrin Complex

Containing Isopulegol - A comparative study" (Mrs. Paula Passos Menezes). I am pleased to

say that it has been favourably received and publication with minor revision is recommended

Yours sincerely,

Nobuyoshi Koga, Ph.D.

Editor

Thermochimica Acta

Page 76: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

90

Original paper

Docking, physico-chemical properties of α- and β-Cyclodextrin Complex

Containing Isopulegol – A comparative study

Paula P. Menezesa*, Grace Anne A. Dóriaa, Adriano A. S. Araujoa, Bruna M. H.

Sousaa, Polliana B. P. Santosa, Lucindo J. Quintans-Júniorb, Rafaely Nascimento Limac,

Péricles Barreto Alvesc, Flávio M. S. Carvalhod, Daniel P. Bezerrae, Francisco J. B.

Mendonça-Júnior f, Luciana Scottig, Marcus T. Scottih, Gabriel F. Silvai, Mairim R.

Serafini a

aDepartment of Pharmacy, Federal University of Sergipe, São Cristóvão, Sergipe,

Brazil

bDepartment of Physiology, Federal University of Sergipe, São Cristóvão,

Sergipe, Brazil

cDepartament of Chemistry, Federal University of Sergipe, São Cristóvão,

Sergipe, Brazil

dDepartament of Mineralogy and Geotectonic, University of São Paulo, São

Paulo, São Paulo Brazil

eGonçalo Moniz Research Center, Oswaldo Cruz Foundation, Salvador, Bahia,

Brazil

fLaboratory of Synthesis and Vectorization Molecules, State University of

Paraíba, Paraíba, Brazil

gFederal University of Paraíba, Paraíba, Brazil

hDepartment of Engineering and the Environment, Federal University of Paraíba,

Rio Tinto, Paraiba, Brazil

iDepartament of Chemical Engineering, Federal University of Sergipe, Sergipe,

Brazil

*Corresponding author. Address: Department of Pharmacy, Federal University of

Sergipe, Av. Marechal Rondon, Jardim Rosa Elze, 49100-000 São Cristóvão, Sergipe,

Brazil. Tel.: +55-79-21056841. Fax: +55-79-21056827.

E-mail: [email protected]

Page 77: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

91

Abstract

Isopulegol (p-ment-8-en-3-ol) (ISOP) is a monoterpenoid alcohol, which is

present in the essential oils of several therapeutic plants and a very important

intermediate in the industrial production of (-)-menthol. Recent studies suggest that

ISOP has anticonvulsant activity and antioxidant properties with low toxicity. The

present work aimed to prepare inclusion complexion with ISOP and α- and β-

ciclodextrin through three different methods, physical mixture (PM), paste method (PC)

and slurry complexation (SC), and the complexes obtained were evaluated. In order to

evaluate the formation of complexes in final products, DSC, TG/DTG, FT-IR, XRD,

GC/GCMS methods and SEM were considered. Thermal analyses of the α- or β-

CD/ISOP revealed the formation of a complex; however, the PC and SC were the best

methods for α- and β-CD, respectively. XRD diffraction characteristics presented

formation of an tendency amorphization material, which suggested the formation of

inclusion complexes. The GC/MS demonstrated that the PC method was the best to

form complexation with α-CD (48.8%) and for β-CD, the SC methods exhibited strong

complexation (68.3%). SEM images showed changes of shape and appearance by

inclusion complexes performed by PC and SC methods when compared with α- and

β-CD. Furthermore, the molecular docking study demonstrated that α-CD/ISOP

inclusion complex formed a more stable complex than β-CD/ISOP inclusion complex.

Keywords: Cyclodextrin, Inclusion complexes, Isopulegol, Monoterpenoid

Page 78: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

92

1. Introduction

The monoterpenoids are compounds derived from the condensation of molecules

of isoprene (CH2 = C (CH3) -CH = CH2), which are present in great abundance in

essential oils. These compounds may be acyclic compounds (myrcene and geraniol),

monocyclic (α-terpineol and terpineol) and bicyclic (α-pinene and camphor)

(DEGENHARDT et al., 2009). The isopulegol (p-ment-8-en-3-ol) (ISOP) is a

monoterpenoid alcohol which is present in the essential oils of several therapeutic

plants (SILVA, M. I. et al., 2007). It is also a very important intermediate in the industrial

production of (-)-menthol, a substance widely used in pharmaceutical products,

agrochemicals, toothpastes and chewing gum (LENARDÃO et al., 2007).

Figure 1: Molecular structures of (a) (−)-isopulegol, and (b) (+)-isopulegol.

Additionally, ISOP showed anticonvulsant activity and bioprotection effect against

seizures induced by pentilenotetrazol (PTZ). Such actions are possibly related to a

positive modulation of receptor γ-aminobutyric acid (GABAA) and to its antioxidant

properties. These facts indicate that the ISOP could be useful as a new neuroprotective

and anticonvulsant natural agent (SILVA, M. I.; SILVA; et al., 2009). The ISOP also

presented depressant- and anxiolytic-like effects (SILVA, M. I. et al., 2007).

In vivo study of toxicity and immunotoxicity has been evaluated with ISOP. This

substance has shown low toxicity during 14 days after administration of a single dose

(BHATIA et al., 2008) and also showed no suppression of antibody-forming cells or

primary antibody response (BELSITO et al., 2008).

However, essential oils or oily compounds, such as the ISOP, present low water

solubility, low absorption due to its physico-chemical properties and are highly volatile.

Therefore, methods that may improve the pharmacokinetics of these compounds have

been investigated and described in the research and applied technology fields. Among

these methods are the inclusion complex in cyclodextrin (MARQUES, 2010).

a)

Page 79: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

93

Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides formed from subunits of α-β-γ-

CDs, which have 6, 7 and 8 glucose monomers, respectively, arranged in a ring shape

(CHEN, W. et al., 2011; TAFAZZOLI; GHIASI, 2009). The diameter of the central

cavity of CDs varies in the following order, α-CD (0.5 -0.6 nm), β-CD (0.6 -0.8 nm), γ-

CD (0.8 -1.0 nm) and allows selectivity for the complexation of different types of

molecules; therefore, the CDs act as molecular encapsulants (GARNERO et al., 2010;

SZEJTLI, 1998). The incorporation of oily compounds in its cavity leads to an increase

in solubility, dissolution, release rates, modification of pharmacokinetics and

disposition of the sustained release of drugs and targeted therapy (MARQUES, 2010).

Considering the pharmacological potential of ISOP and the need to improve its

pharmacokinetic profile, this study aims to elucidate physico-chemical aspects of their

inclusion into α- and β-CDs.

2. Material and methods

2.1 Reagents

The ISOP (lot: #MKBH9947V; purity ≥ 98%), α-CD (lot: #019K1090V; purity ≥ 98%)

and β-CD (lot: #041M1759V; purity ≥ 97%) were purchased from Sigma (St. Louis,

USA). All other chemical reagents were of at least reagent grade and all materials were

used as supplied.

2.2 Preparation of inclusion complexes

Inclusion complexes of α-CD/ISOP and β-CD/ISOP were prepared through three

different methods, physical mixture (PM), paste complexation (PC) and slurry

complexation (SC). The PM was prepared by adding ISOP (154 mg) in an agate mortar

containing powder of α- (972 mg) or β-CD (1135 mg) under manual stirring. The

ISOP/CD molar ratio was maintained as described for the inclusion complex

preparation (1:0.9-α-CD; 1:0.86-β-CD) and were then stored in sealed glass

containers. PC was performed through homogenization α- (972 mg) or β-CD (1135

mg) in water (1.2:4 w/v) directly in an agate mortar. After that, the mixture paste was

kept under a constant manual agitation. Then, the material was dried at room

temperature (in a desiccator) until a glass film was formed, which was removed by

manual trituration and stored in airtight glass containers. Finally, the SC was carried

by adding water to a beaker containing ISOP (154 mg) and α-or β-CD (1135 mg, 3:4

v/w), under magnetic stirring at 400 rpm for 36 hours constantly (Quimis Q 261A21,

Page 80: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

94

Brazil). Then, the material was dried in a desiccator and removed by manual trituration

as described in a PC method according to Marreto et al (MARRETO et al., 2008).

2.3 Thermal analysis

Differential scanning calorimeter (DSC) curves were obtained in a DSC-60 cell

(Shimadzu) performed with aluminum crucibles containing about 2 mg of samples,

under dynamic nitrogen atmosphere (50 mL.min-1) and heating rate of 10°C.min-1 in

the temperature range from 25°C to 500°C. The DSC cell was calibrated with indium

(m.p. 156.6°C; DH fus = 28.5 J.g-1) and zinc (m.p. 419.6°C).

Thermogravimetry/derivative thermogravimetry (TG/ DTG) curves were obtained with

a TGA 60 (Shimadzu) thermobalance in the temperature range of 25–900°C,

performed with platinum crucibles containing approximately 3 mg of samples, under

dynamic nitrogen atmosphere (50 mL.min-1) and heating rate of 10°C.min-1. The

TG/DTG was calibrated with calcium oxalate monohydrate, according to ASTM

standard.

2.4 Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy

The infrared spectra of ISOP, α- and β-CD, as well α-CD/ISOP and β-CD/ISOP

prepared through three different methods (PM, PC and SC) were evaluated and the

data of infrared absorption were obtained in the range of 4000–500 cm−1 in KBr pellets

using an IRTracer-100 (Shimadzu) Fourier Transform Infrared Spectrophotometer, at

room temperature.

2.5 Scanning electron microscopy

The α-, β-CD and the three inclusion methods were mounted on aluminum stubs,

coated with a thin layer of gold and visualized with a scanning electron microscope

(JSM-6390-LV JEOL) at an accelerated voltage of 12 kV.

2.6 X-ray diffractometry (XRD)

Powder X-ray diffractometer results were obtained on a Rigaku with a tube of

CuKa, in the range of 3–65 θ (2h) and 1 sec. of pass time, carried out with the XRD

powder (X-ray diffraction) method.

2.7 Gas chromatography/mass spectrometry (GC/GCMS) analyses

GC analysis were performed using a GC-MS/FID (QP2010 Ultra, Shimadzu

Corporation, Kyoto, Japan) equipped with an autosampler AOC-20i auto-injector

(Shimadzu). Separations were accomplished using an Rtx®-5MS Restek fused silica

capillary column (5 %-diphenyl-95-dimethyl polysiloxane) of (30 m x 0.25 mm i.d., 0.25

Page 81: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

95

µm film thickness at a constant helium (99.999 %) flow rate of 1.2 mL.min-1. Injection

volume of 0.5 µL (5 mg.mL-1) was employed, with split ratio of 1:10. The oven

temperature was programed from 50°C (isothermal for 1.5 min),with an increase of 4

°C.min-1 to 200 °C, then 10 °C.min-1 to 250 ºC, ending with a 5 min isothermal at 250

ºC.

The FID and MS data were simultaneously acquired using a Detector Splitting

System; the split flow ratio was 4:1 (MS: FID). A 0.62 m x 0.15 mm i.d restrictor tube

(capillary column) was used to connect the splitter to the MS detector; a 0.74 m x 0.22

mm i.d restrictor tube of was used to connect the splitter to the FID detector. The MS

data (total ion chromatogram, TIC) were acquired in the full scan mode (m/z of 40-350)

at a scan rate of 0.3 scan.s-1 using the electron ionization (EI) with an electron energy

of 70 eV. The injector temperature was 250 ºC and the ion-source temperature was

250°C. The FID temperature was set to 250 ºC and ion-source temperature was, and

the gas supplies for the FID were hydrogen, air and helium at flow rates of 30, 300 and

30 mL.min-1, respectively. Quantification of each constituent was estimated by

normalizing the peak area generated in the FID—(%). Compound concentrations were

calculated from the GC peak areas and are arranged in order of elution from the GC.

2.7.1 Extraction of total ISOP

Total ISOP adsorbed in the α- or β-CD was determined through extraction

according to the method described by Marreto et al (MARRETO et al., 2008). Distilled

water (8 mL) plus hexane (4 mL) and 0.2 g of the sample were put in a round-bottom

flask which was kept in a water bath at 85°C for 20 min, with constant shaking. The

organic phase was decanted (3 times) and concentrated to approximately 1 mL using

rotary evaporator. Afterwards, internal standard (menthol, 2 mg) was added and stored

until GC–MS/FID analysis.

2.7.2 Extraction of surface-adsorbed ISOP

The amount of ISOP adsorbed on the surface of α- or β-CD was determined

through washing. Sample (3 g) with hexane (20 mL) was shaken for 20 min. The

suspension was filtered and the residue was washed with hexane (10 mL). After that,

hexane (1 mL) and internal standard (menthol, 2 mg) were added to the filtrate, which

was concentrated using rotary evaporator and analyzed by means of GC-MS/FID.

Thus, the difference between the total ISOP (surface-adsorbed ISOP and hosted in

Page 82: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

96

the cavity) and the surface-adsorbed ISOP corresponds to the amount complexed in

the α- or β-CD cavity.

2.8 Molecular Docking between α-, β-CD and ISOP

The chemical structures of the compounds (ISOP and α-, β-CD) were drawn using

Marvin 14.9.8.0, 2014, ChemAxon (http://www.chemaxon.com). The software

Standardizer, JChem 14.9.8.0, 2014, ChemAxon (http://www.chemaxon.com) was used

to canonize structure, add hydrogens, and clean the molecular graph in three

dimensions and finally saved in .sdf format. The process uses a divide-and-conquer

approach. The structure is split into small fragments are organized into a build tree

using their original connectivity information. Conformers generated for the initial

structure (represented by the root node in the build tree) are also optimized. The

building process uses a proprietary extended version of the Dreiding force field

(ALLINGER, 1977).

All geometry optimization and conformational search were performed using

Spartan for Windows 10.0 software (DEWAR et al., 1985). The geometry of the

chemical structure of the compound was initially optimized using MMFF force field

(COHEN, 1996) and, afterwards, we performed a new geometry optimization based

on the semi-empirical method AM1 (Austin Model 1) (LEACH, 2001). We selected the

systematic search method, analyzing until 1000 conformers and selecting until 10

conformers of lowest minimum energy using AM1 and Monte-Carlo algorithm. The

dihedrals were evaluated by rotation in accordance with the standard (default)

conditions of the program. The conformers of lowest minimum energy were selected

and, then performed geometry optimization and vibrational mode calculation using

AM1 (LEACH, 2001).

The docking simulations were performed on the AutoDock 4.2 software. Receptor

and ligand preparation was carried out using and VEGA ZZ 3.0.3 (MOLEGRO) The

structures of ligand and receptor were saved in pqbqt format to be used for docking

calculations. PyRx 0.9 software (WOLF, 2009) - X10] was used to aid the steps of job

submission and analysis of the results. A three dimensional grid box with 50, 44 and

50 points for x, y and z, with a spacing of 0.375 Å, was created. All other parameters

were left at the AutoDock 4.2 default settings (MOLEGRO). The results for each

calculation were analyzed to obtain the affinity energy (Kcal/mol) values for each ligand

conformation in its respective complex and the probable structure inaccuracies were

Page 83: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

97

ignored in the calculations. To verify the number of hydrogen bonds, hydrophobic

interactions, and docking interpretation, the program Discovery Studio 4.0 was

employed.

3. Results and discussion

3.1 Thermal analysis

Thermal analyses of the ISOP, α-, β-CD and α- or β-CD/ISOP revealed the

formation of a complex. The DSC curves ISOP show an endothermic peak between

60° and 160°C corresponding to its volatilization (ΔH= 61.8 J.g-1), as it can be seen in

figs. 2A and 2B. The PM, PC and SC show a sharp endothermic peak in the range of

the volatilization of the pure compound (60°C to 160 °C). The DSC curve of α-CD (fig.

2A) indicates three endothermic events in the range of 52-86° C (ΔH= 33.1 J.g-1) and

86-142 °C (ΔH= 63.6 J.g-1) as described by Giordano et al (GIORDANO; NOVAK;

MOYANO, 2001), which corresponds to the dehydration of the molecule. In addition,

in the range of 274-328°C (ΔH= 187.4 J.g-1) occurs the fusion followed by the

decomposition of cyclodextrin molecules. The DSC curves of the α-CD/PM indicate

two endothermic events: the first in the range of 31–149°C (which corresponds to the

release of water molecules as well as to the release of ISOP, probably adsorbed on

the surface, ΔH= 0.7 J.g-1) and the second in the range of 271–351°C (ΔH= 0.5 J.g-1),

where the fusion followed by decomposition of α-CD molecules appears.

Figure 2. DSC curves of ISOP, α- (A), β-CD (B), physical mixture (PM) and

inclusion complex prepared through Paste complexation (PC) and Slurry complexation

(SC) in dynamic nitrogen atmosphere (50 mL.min−1) and heat rate of 10°C.min−1.

The DSC curves of the PC and SC methods with α-CD (fig. 2A) clearly indicate the

difference in relation of the PM, α-CD and ISOP curves. The PC and SC curves display

three endothermic events, PC (34-120°C, ΔH= 0.3 J.g-1; 127-148°C, ΔH= 0.01 J.g-1

and 300-353°C, ΔH= 0.1 J.g-1) and SC (34-102°C, ΔH= 0.2 J.g-1; 111-140°C, ΔH= 0.01

J.g-1 and 243-348°C, ΔH= 0.6 J.g-1). These first and second events show the release

of water and oil. The last event corresponds to the α-CD fusion followed by

decomposition, as is shown by the α-CD and PM curves.

The β-CD curve (fig. 2B) exhibited a broad thermal peak between 30°C and 113°C

(ΔH= 349.5 J.g-1) that correspondents to the water release. From the range of 210-

230°C (ΔH= 6.6 J.g-1) occurs an additional endothermic event characteristic of the

Page 84: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

98

crystalline phase transition, that disappears in the PC and SC methods evidencing the

complexation. The presence of a thermal event among 280 and 340°C (ΔH= 410.0 J.g-

1) is generally attributed to the fusion followed by decomposition of the β-CD. The DSC

curve of the β-CD/ISOP prepared by PM was similar to that of pure β-CD, indicating

that β-CD is present in free form in this sample and the ISOP adhered to the surface.

The β-CD/ISOP prepared by PC and SC showed better interaction of the components.

These curves show two endothermic events in the step of 30-137°C (ΔH= 349.5 J.g-1)

water and surface oil loss and 295-353°C (ΔH= 245.2 J.g-1) characteristic of the β-CD

fusion. According to Rajendiran et al and Castronuovo and Niccoli the ΔH value

suggests the inclusion complex formation between ISOP with β-CD indicates strong

interactions between ISOP and CD cavity in this orientation. The value of enthalpy is

the result of several factors, among them the endothermic contribution due to the

disruption of hydrogen bonds between water molecules in the cavity, the endothermic

dehydration of the including hydrophobic guest molecule, and the exothermic

contribution stemming from the van der Waals interactions between the guest and the

cyclodextrin cavity. (CASTRONUOVO; NICCOLI, 2013; RAJENDIRAN;

MOHANDOSS; VENKATESH, 2014). The interaction between host-guest causes an

enthalpy–entropy compensating process in the gas phase whereas the same

interaction causes an enthalpy–entropy codriven process in aqueous solution,

because inclusion complexation releases a number of water molecules from the

cavities of CD (RAJENDIRAN; SIVA, 2014).

The TG/DTG curves of ISOP show two weight loss steps characteristics of

volatilization and decomposition. In the range of 25-146°C, the oil lost 98.2% and in

the second step (146-166°C), the weight loss was 1.7% (fig. 3A and 3B). These results

corroborate with the endothermic event in DSC curve that represents the volatilization

of ISOP. The Table 1 exhibits the range and weight loss of ISOP, α-CD, PM/ α-CD,

PC/ α-CD, SC/ α-CD, β-CD, PM/ β-CD, PC/ β-CD and SC/ β-CD. The α-CD in the

range of 25-111°C and 111-293°C had a weight loss of 10.5 and 2.5% respectively.

The first weight loss is associated to the release of water molecules. Giordano et al.

(GIORDANO et al., 2001) described that α-CD has a water loss and structural

rearrangements at 30-130°C with 6.4% of weight loss; Kohata et al (S.; JYODOI; A.,

1993) affirm that, and in the range of 260-270°C, α-CD had also a release of tightly

bound water. Thus, our study shows in the second step that the SC/ α-CD (Δm=3%)

Page 85: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

99

exhibited the weight loss above the α-CD, what can be attributed to the ISOP

complexed, once in this step the α-CD had a weight loss of 2.5% that is attributed to

water tightly bond and the ISOP have been completely volatilized until 166°C. The PM/

α-CD and PC/ α-CD showed weight loss of 1.9% below α-CD, corresponding to water

loss. The TG/DTG curves of β-CD (fig. 3B and Table 1) show four steps of weight loss.

The first step 25-111°C the β-CD lost 11.5% of water according to other studies from

our research group (MENEZES, P. P. et al., 2014; MENEZES, P.P. et al., 2012;

SERAfiNI et al., 2011). Between 111 and 293°C, the TG curve is flat and no mass loss

was detected, and the thermal decomposition (around 65.3%) occurs after 293°C.

Then, a continuous carbonization occurs in a wide temperature range from 421 to

about 900°C (Δm = 21%). The PM/ β-CD, PC/ β-CD and SC/ β-CD lost 2.4, 5.7 and

5.3% respectively between 111-243°C. Therefore, the PC/ β-CD and SC/ β-CD were

able to form inclusion complexes, once in the loss of oil encapsulated was in a major

range of temperature, when compared to water release and surface oil only evaporated

at 166°C. Some authors have described that the formation of inclusion complex

improve the thermal stability of molecules of low solubility (DOS SANTOS; BUERA;

MAZZOBRE, 2011; WANG, XINGE; LUO; XIAO, 2014; WU, H. et al., 2010). This

corroborates with our study that demonstrated ISOP can be form inclusion complex

more stable with CDs (WANG, XINGE et al., 2014).

Del Valle described that oils can be associated in solution, but the increase in water

amount supports the separation of the oil molecules and further the inclusion

complexes formation. For so, some studies suggest the SC as the best method of

inclusion complexes (VALLE, 2004).

Figure 3. TG curves of ISOP, α- (A), β-CD (B), physical mixture (PM) and

inclusion complex prepared through Paste complexation (PC) and Slurry complexation

(SC) in dynamic nitrogen atmosphere (50 mL.min−1) and heat rate of 10 °C.min−1.

Page 86: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

100

Table 1. Mass losses for ISOP, α-CD, -CD, PM, PC and SC complexes in

different temperature intervals.

Sample Δm 1/%

(25-111°C)

Δm2/%

(111-293°C)

Δm 3/%

(293-421°C)

Δm 4/%

(421-900°C)

ISOP 98.2* 1.7* - -

α-CD 10.5 2.5 80.3 0.9

PM/ α-CD 18.8 1.9 70.6 6.2

PC/ α-CD 9.2 1.9 76.3 13.0

SC/ α-CD 12.0 3.0 81.7 9.3

-CD 11.5 0.8 67.0 21

PM/-CD 19.2 2.4 65.3 8.2

PC/-CD 10.4 5.7 75.2 9.5

SC/-CD 6.8 5.3 80.4 8.8

* The range of weight loss of ISOP was 25-146°C and 146-166ºC. The other

samples were 25-111°C, 111-293°C, 293-421°C and 421-900°C according to the

subtitle of the table.

3.2 Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy

The FT-IR spectra of ISOP, α- and β-CD, PM/ α-CD, PC/ α-CD, SC/ α-CD, PM/ β-

CD, PC/ β-CD and SC/ β-CD are presented in fig. 4. IR spectra of ISOP consisted of

the prominent absorption bands at 3495-3307 cm-1 for O–H stretching vibrations.

Between 2944-2838 cm-1 bands, the absorption is related to C–H stretching. The 1642

cm-1 band, indicates the presence of stretching or deformation C=C, characteristic of

an alkene group; at the1378 cm-1 region, it corresponds to the deformation of CH3. It

is possible to observe a band approximately at 1031 cm-1 that is related to the vibration

mode of C-O stretching. The band observed in 891 cm-1 corresponds to the stretching

of R2C=CH2.

The infrared absorption of α-CD showed high absorption in 3389 cm-1 for the

stretching vibrations of the hydroxyl groups present in this molecule. The band

observed at 1637 cm-1 is also related to the presence of O-H groups. At the 2920 cm-

1 region, bands correspond to C–H stretching and at the 1409, 1359, 1329, 1293 e

1242 cm-1 bands are associated for CH2 and CH stretching. Other bands are also

Page 87: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

101

observed and are attributed to C–O stretching band in 1150, 1182 and 1034 cm-1,

probably related to the hydroxyl and ether groups present at the α-CD. Typical bands

characteristic of C-H bonds vibration and C-C skeleton in the region 1034-706 cm-1

belong to the glucopyranose ring (RAJENDIRAN et al., 2013).

The FT-IR spectrum of β-CD shows a prominent absorption band at 3341 cm-1 (for

O-H stretching vibrations), 1647 cm-1 band is also related to the O-H groups. At 2926

cm-1 (for C-H vibrations, and C-H, C-H2 stretching), 1411, 1368, 1335, 1301 and 1246

cm-1 (for C-H stretching), 1154, 1080 and 1027 cm-1 (for C-O stretching from ether and

hydroxyl groups) and 1000-700 cm-1 (for C-H bonds vibration and C-C skeleton) related

to the glucopyranose ring. Similar results are seen in Menezes et al and Sambasevam

et al, that suggest the complexation of geraniol, linalool and azomethine, respectively

by the FT-IR technique (MENEZES, P. P. et al., 2014; MENEZES, P.P. et al., 2012;

SAMBASEVAM et al., 2013).

Inclusion complex spectra of α- and β-CD/ISOP show alkene vibration at the 1644

cm-1 band, which is the most significant band, indicating the presence of ISOP in

complexes. In all α-CD spectra, similar to β-CD, there were some changes due to the

formation of hydrogen bonds between the molecule of ISOP and the β-CD.

However, the relative intensities of the PM method presented a similar spectrum

compared with α- and β-CD bands, respectively. The regions representing PC and SC

methods showed a large band in 1648 and 2927 cm-1, and high intensity in 944 cm-1,

what represents the best complexation methods for α-CD/ISOP. The intensity of the

bands observed in the spectra that match the inclusion complexes prepared with β-CD

obtained through the PM and PC methods present characteristics, which are similar to

the β-CD spectrum. However, the SC/β-CD inclusion complexes showed an increase

in the intensity of the band observed in 932 cm-1, which features that this was the best

method for forming ISOP/β-CD inclusion complex.

Figure 4. FTIR spectra of ISOP, α- (A), β-CD (B), physical mixture (PM) and

inclusion complex prepared through Paste complexation (PC) and Slurry complexation

(SC).

3.3 Scanning electron microscopy

The SEM images of α-, β-CD, PM and the inclusion complexes prepared through

PC and SC are presented at figures 5A and 5B, respectively. Both CDs are composed

Page 88: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

102

by square- and rectangular-shaped crystals in different sizes. The electron microscopic

pictures showed that the structure and the shape of the complexes formed through the

three methods are different. Figure 5A shows α-CD, PM/ α-CD and the inclusion

complexion formed by this crystal, where we can observe the change in the shape and

appearance between them. There were changes in inclusion complexes formed

through the SC method that are amorphous. Figure 5B shows alterations of shape and

appearance using β-CD in PC/ β-CD and SC/ β-CD methods, which are amorphous.

On the other hand, the particle shapes and morphologies of the corresponding PM

were similar to those α- and β-CD, respectively.

Figure 5A. SEM micrographs of cross-sections (x600 and x 1000) of (A) α-CD,

(B) physical mixture (PM), (C) paste complex (PC) and (D) slurry complex (SC).

Figure 5B. SEM micrographs of cross-sections (x600 and x1000) of (A) β-CD,

(B) physical mixture (PM), (C) paste complex (PC) and (D) slurry complex (SC).

3.4 X-ray diffractometry (XRD)

The X-ray diffraction profile of the α- and β-CD, PM, PC and SC are shown at

fig. 6. At the picture 6A and 6B, some sharp reflections at the diffraction angle of 2Ɵ

4.76, 6.12, 9.02, 10.72, 13.98 and 20.70 are present in the X-ray diffractogram of α-

(fig. 6A) and β-CD (fig. 6B), respectively, which shows that they are crystalline

compounds.

Analyzing the diffractograms at fig. 6A and 6B, we can see that the α- and β-

CD/ISOP prepared through the PM method follow the same trend of the α- and β-CD

profile alone, respectively, which confirms the results of DSC and TG of a low degree

of complexation. However, SC/ α-CD and SC/ β-CD, especially, showed a reduction in

the number of these reflections suggesting the formation of an amorphous material

and, consequently, more soluble.

Figure 6. X-ray diffraction of α- (6A), β-CD (6B) and samples prepared through

three different methods, physical mixture (PM), Paste complexation (PC) and Slurry

complexation (SC).

3.5 Total and surface oil of α- and β-CD/ISOP complex

Page 89: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

103

The inclusion complex formation prepared through the three different methods

was determined by GC–MS, as is given in Table 2. The GC/MS of PM, PC and SC

with α- and β-CD demonstrated that PC was the best method of inclusion complex with

α-CD, totaling 48.8% of complexed ISOP. This value represents to ratio between %

ISOP complexed (total oil – surface oil) under % ISOP uncomplexed (surface oil). The

samples with β-CD, exceptionally for the SC, exhibit the strong complexation with

68.3% of complexation ratio. These results confirm the previous results that indicate

the best procedure was PC/ α-CD for α-CD and SC/ β-CD as the best method for

formation of inclusion complexes with β-CD.

Table 2.Characterization of ISOP α- and β-CD by procedures of physical

mixture (PM), paste complexation (PC) and slurry complexation (SC).

Sample Surface

oil/%

Total

oil/

%

ISOP

Complex/%

Complexation

Ratio/%*

PM/α-CD 76.58 94.72 18.14 1:1.24

PC/α-CD 1.24 61.71 60.47 1:48.8

SC/α-CD 2.77 57.97 55.20 1:19.9

PM/β-CD 64.31 77.81 13.50 1:0.2

PC/β-CD 15.41 66.92 51.51 1:3.3

SC/β-CD 0.86 59.62 58.76 1: 68.3

*ratio between % ISOP complexed (total oil – surface oil) under % ISOP

uncomplexed (surface oil).

The GC results corroborate the results obtained by TG. According to Table 2 it

can be seen that the physical mixture favors the incorporation of the compound on the

surface. This can be seen in Table 2 (surface oil /%) and Table 1 (Δm 1 /% - 25-111 °

C), wherein the oil percentage is higher. TG results show that the methods of paste

and coevaporation complexed increase oil content in the cavity. This increase can be

seen in the percentage mass loss of the second stage of decomposition of the complex

(Δm 2 /% - 111-293 ° C) which is confirmed by GC as noted in Table 2 (Complex ISOP

/%).

3.6 Molecular Docking between α-, β-CD and ISOP

According to in silico data (fig 7), the α-CD formed more stable inclusion

complex with lower energy when compared with β-CD. This result indicates that lower

Page 90: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

104

affinity energy suggests stronger binding as described by Ren et al., 2014 (REN et al.,

2014). Thus, the score observed was the most stable ΔE=-4.53kcal.mol-1 for the

inclusion complex with α-CD and less stable with ΔE=-4.13 kcal.mol-1 for β-CD/ISOP.

We believe that the internal space of the cavities to influence interactions. The smallest

cavity in α-CD (0.5-0.6 nm) compared with β-CD (0.6 - 0.8 nm) facilitates the closeness

of atoms, and therefore, the formation of sterics mainly, but also hydrogen bonds that

corroborates with ΔH value. Negative values of ΔH indicated hydrophobic non-covalent

interactions which may be stabilized by hydrogen bonding, as was confirmed by the

molecular docking (BUDRYN et al., 2015). The figure 7 shows that ISOP fits into the

cavity of the α-CD in opposite position of β-CD, in the last the propenyl group of ISOP

is totally inside the cavity unlike the former that the methyl group of ISOP is inserted

together with the cyclohexanol group. The solvent accessibility surface aid to visualize

the bigger cavity of the β-CD and that ISOP fits better in smallest cavity of α-CD.

Figure 7. Best docking results of ISOP with a) α-CD and b) β-CD. The dashed

lines represent the hydrogen bonds interactions and the white surfaces represent

solvent accessibility surfaces.

4. Conclusion

The results showed that α- and β-CDs formed inclusion complexes of ISOP.

That can be attributed to the cavity size of CDs and the affinity of ISOP to it.

Furthermore, the physicochemical characterization indicates that the best inclusion

complexes were formed through the PC/ α-CD and SC/ β-CD methods.

Conflict of interest

The authors have declared that there is no conflict of interest.

Acknowledgements

The authors are grateful to CAPES, CNPq, FINEP and FAPITEC/SE for financial

support and fellowships. We thank Maria Lúcia Vieira Moreno, Cláudio Pereira Figueira

and Prof. Adriana Lanfredi Rangel for the images of SEM in the Gonçalo Moniz

Research Center, Oswaldo Cruz Foundation.

References

Page 91: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

105

[1] J. Degenhardt, T.G. Kollner, J. Gershenzon, Monoterpene and sesquiterpene

synthases and the origin of terpene skeletal diversity in plants, Phytochemistry, 70 (2009)

1621-1637.

[2] M.I. Silva, M.R. de Aquino Neto, P.F. Teixeira Neto, B.A. Moura, J.F. do Amaral,

D.P. de Sousa, S.M. Vasconcelos, F.C. de Sousa, Central nervous system activity of acute

administration of isopulegol in mice, Pharmacology, biochemistry, and behavior, 88 (2007)

141-147.

[3] E.J. Lenardão, G.V. Botteselle, F. Azambuja, G. Perin, R.G. Jacob, Citronellal as

key compound in organic synthesis, Tetrahedron, 63 (2007) 6671–6712.

[4] M.I. Silva, M.A. Silva, M.R. de Aquino Neto, B.A. Moura, H.L. de Sousa, E.P. de

Lavor, P.F. de Vasconcelos, D.S. Macedo, D.P. de Sousa, S.M. Vasconcelos, F.C. de Sousa,

Effects of isopulegol on pentylenetetrazol-induced convulsions in mice: possible involvement

of GABAergic system and antioxidant activity, Fitoterapia, 80 (2009) 506-513.

[5] S.P. Bhatia, D. McGinty, C.S. Letizia, A.M. Api, Fragrance Material Review on

isopulegol, Food and chemical toxicology : an international journal published for the British

Industrial Biological Research Association, 46 Suppl 11 (2008) S185-189.

[6] D. Belsito, D. Bickers, M. Bruze, P. Calow, H. Greim, J.M. Hanifin, A.E. Rogers, J.H.

Saurat, I.G. Sipes, H. Tagami, A toxicologic and dermatologic assessment of cyclic and non-

cyclic terpene alcohols when used as fragrance ingredients, Food and chemical toxicology :

an international journal published for the British Industrial Biological Research Association, 46

Suppl 11 (2008) S1-s71.

[7] H.M.C. Marques, A review on cyclodextrin encapsulation of essential oils and

volatiles. , Flavour Frag. J., 25 (2010) 313–326.

[8] W. Chen, L.J. Yang, S.X. Ma, X.D. Yang, B.M. Fan, J. Lin, Crassicauline α/β-

cyclodextrin host–guest system: Preparation, characterization, inclusion mode, solubilization

and stability., Carbohydr. Polym., 84 (2011) 1321–1328

[9] M. Tafazzoli, M. Ghiasi, Structure and conformation of α-, β- and γ-cyclodextrin in

solution: Theoretical approaches and experimental validation, Carbohydr. Polym., 78 (2009)

10–15.

[10] C. Garnero, A. Zoppi, D. Genovese, M. Longhi, Studies on

trimethoprim:hydroxypropyl-beta-cyclodextrin: aggregate and complex formation,

Carbohydrate research, 345 (2010) 2550-2556.

[11] J. Szejtli, Introduction and General Overview of Cyclodextrin Chemistry, Chemical

reviews, 98 (1998) 1743-1754.

[12] R.N. Marreto, E.E.C.V. Almeida, P.B. Alves, E.S. Niculau, R.S. Nunes, C.R.S.

Matos, A.A.S. Araújo, Thermal analysis and gas chromatography coupled mass spectrometry

Page 92: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

106

analyses of hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex containing Lippia gracilis essential

oil. , Thermochim. Acta. , 475 (2008) 53–58.

[13] N.L. Allinger, A hydrocarbon force-field utilizing V1 and V2 torsional terms, J. Am.

Chem. Soc., 99 (1977) 8127–8134.

[14] M.J.S.E. Dewar, G. Zoebisch, E.F. Healy, S.J.J.P. AM., A new general purpose

quantum mechanical molecular model., J. Am. Chem. Soc. , 107 (1985) 3902–3909.

[15] N.C. Cohen, Guidebook on Molecular Modeling in Drug Design, Academic Press,

San Diego, USA, 1996.

[16] A.R. Leach, Molecular Modeling: Principles and Applications., Prentice Hall,

London, UK, 2001.

[17] Molegro, http://www.clcbio.com/products/molegro/#molecular-viewer, in.

[18] L.K. Wolf, New software and Websites for the Chemical Enterprise, Chem. Eng.

News, 87 (2009) 31.

[19] F. Giordano, C. Novak, J. Moyano, Thermal analysis of cyclodextrins and their

inclusion compounds., Thermochim. Acta. , 380 (2001) 123-151.

[20] N. Rajendiran, T. Mohandoss, G. Venkatesh, Investigation of inclusion complexes

of sulfamerazine with α- and β-cyclodextrins: An experimental and theoretical study,

Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 124 (2014) 441-450.

[21] G. Castronuovo, M. Niccoli, Thermodynamics of inclusion complexes of natural

and modified cyclodextrins with acetylsalicylic acid and ibuprofen in aqueous solution at

298&#xa0;K, Thermochimica Acta, 557 (2013) 44-49.

[22] N. Rajendiran, S. Siva, Inclusion complex of sulfadimethoxine with cyclodextrins:

Preparation and characterization, Carbohydrate polymers, 101 (2014) 828-836.

[23] K. S., K. Jyodoi, O. A., Thermal decomposition of cyclodextrins (α-, β-, γ-, and

modified β-CyD) and of metal-(β-CyD) complexes in the solid phase., Thermochim. Acta, 217

(1993) 187-198.

[24] M.R. Serafini, P.P. Menezes, L.P. Costa, C.M. Lima, L.J. Quintans Jr, J.C.

Cardoso, J.R. Matos, J.L. Soares-Sobrinho, S. Grangeiro Jr, P.S. Nunes, L.R. Bonjadim,

A.A.S. Araújo, Interaction of p-cymene with β-cyclodextrin. , J Therm Anal Calorim, DOI

10.1007/s10973-011-1736 (2011).

[25] P.P. Menezes, M.R. Serafini, B.V. Santana, R.S. Nunes, Q.J. L.J., S. G.F., M. I.A.,

M. Marchioro, B.P. Fraga, M.R.V. Santos, A.A.S. Araujo, Solid-state β-cyclodextrin complexes

containing geraniol, Thermochim. Acta, 548 (2012) 45– 50

[26] P.P. Menezes, M.R. Serafini, L.J. Quintans-Júnior , G.F. Silva, J.F. Oliveira, F.M.S.

Carvalho, J.C.C. Souza, J.R. Matos, P.B. Alves, I.L. Matos, D.I. Hădărugă, A.A.S. Araújo,

Page 93: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

107

Inclusion complex of (-)-linalool and b-cyclodextrin, J Therm Anal Calorim, 115 (2014) 2429–

2437.

[27] X. Wang, Z. Luo, Z. Xiao, Preparation, characterization, and thermal stability of β-

cyclodextrin/soybean lecithin inclusion complex, Carbohydrate polymers, 101 (2014) 1027-

1032.

[28] H. Wu, H. Liang, Q. Yuan, T. Wang, X. Yan, Preparation and stability investigation

of the inclusion complex of sulforaphane with hydroxypropyl-β-cyclodextrin, Carbohydrate

polymers, 82 (2010) 613-617.

[29] C. dos Santos, M.d.P. Buera, M.F. Mazzobre, Phase solubility studies of terpineol

with β-cyclodextrins and stability of the freeze-dried inclusion complex, Procedia Food

Science, 1 (2011) 355-362.

[30] M.D. Valle, Cyclodextrins and their uses: a review, Process Biochem., 5 (2004)

1033-1046.

[31] N. Rajendiran, S. S., S. J., Inclusion complexation of sulfapyridine with α- and β-

cyclodextrins: Spectral and Molecular modeling study., J. Mol. Struct. , 1054-1055 (2013) 215-

222.

[32] K.P. Sambasevam, S. Mohamad, N.M. Sarih, N.A. Ismail, Synthesis and

Characterization of the Inclusion Complex of beta-cyclodextrin and Azomethine, International

journal of molecular sciences, 14 (2013) 3671-3682.

[33] J. Ren, P. Yao, Y. Cao, J. Cao, L. Zhang, Y. Wang, L. Jia, Application of

cyclodextrin-based eluents in hydrophobic charge-induction chromatography: elution of

antibody at neutral pH, Journal of chromatography. A, 1352 (2014) 62-68.

[34] G. Budryn, B. Pałecz, D. Rachwał-Rosiak, J. Oracz, D. Zaczyńska, S. Belica, I.

Navarro-González, J.M.V. Meseguer, H. Pérez-Sánchez, Effect of inclusion of

hydroxycinnamic and chlorogenic acids from green coffee bean in β-cyclodextrin on their

interactions with whey, egg white and soy protein isolates, Food chemistry, 168 (2015) 276-

287.

Page 94: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

108

CAPÍTULO IV

CONCLUSÃO GERAL, PERSPECTIVAS, REFERÊNCIAS

Page 95: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

109

4 CONCLUSÃO GERAL

Uma vez caracterizadas as amostras do OEHP, foi observado que o CE

apresentou capacidade de complexação superior aos outros métodos utilizados e

demonstrou melhor atividade antinociceptiva e anti-inflamatória quando comparado

com o óleo puro. Já o ISOP formou complexos de inclusão preferencialmente com α-

CD pelo método da MA e da CE com β-CD. Assim, a técnica de complexação é

promissora no sentido de otimizar as características físico-químicas e melhorar a

atividade farmacológica de substâncias de baixa solubilidade.

Page 96: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

110

5 PERSPECTIVAS

Realizar estudo de RMN a fim de elucidar a estrutura do complexo formado

entre ISOP em α- e β-CDs

Realizar estudos de dissolução

Realizar testes farmacológicos e toxicológicos dos complexos com OEHP e

ISOP

Realizar o doseamento das amostras a fim de avaliar a concentração final dos

complexos

Investigar a farmacocinética dos complexos de inclusão estudados

Determinar constante de complexação

Realizar estudo de solubilidade

Page 97: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

111

6 REFERÊNCIAS

ABDEL-KHALIK, J.; BJORKLUND, E.; HANSEN, M. Simultaneous determination of endogenous steroid hormones in human and animal plasma and serum by liquid or gas chromatography coupled to tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, v. 928, p. 58-77, Jun 1 2013. ADORJAN, B.; BUCHBAUER, G. Biological properties of essential oils: an updated review. Flavour Frag. J., v. 25, p. 407-426, 2010. AL-MARZOUQI, A. H. et al. Physicochemical properties of antifungal drug-cyclodextrin complexes prepared by supercritical carbon dioxide and by conventional techniques. J Pharm Biomed Anal, v. 49, n. 2, p. 227-33, Feb 20 2009. ALFONSI, R. et al. Characterization of mitotane (o,p'-DDD)--cyclodextrin inclusion complexes: phase-solubility method and NMR. Ann Pharm Fr, v. 71, n. 3, p. 186-92, May 2013. ALLINGER, N. L. A hydrocarbon force-field utilizing V1 and V2 torsional terms. J. Am. Chem. Soc., v. 99, p. 8127–8134, 1977. ALMEIDA, J. R. et al. Borneol, a bicyclic monoterpene alcohol, reduces nociceptive behavior and inflammatory response in mice. ScientificWorldJournal, v. 2013, p. 808460, 2013. ALVES-SILVA, I. et al. Preformulation studies of itraconazole associated with benznidazole and pharmaceutical excipients. Thermochim. Acta, v. 575, p. 27-33, 2014. ANVISA. Legislação-Resolução-RE no. 899, de 29 de maio de 2003. . 2003. Disponível em: < http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/4983b0004745975da005f43fbc4c6735/RE_899_2003_Determina+a+publica%C3%A7%C3%A3o+do+Guia+para+valida%C3%A7%C3%A3o+de+m%C3%A9todos+anal%C3%ADticos+e+bioanal%C3%ADticos.pdf?MOD=AJPERES >. Acesso em: 19/12/2014. ARAÚJO, A. et al. Determinação dos teores de umidade e cinzas de amostras comerciais de guaraná utilizando métodos convencionais e análise térmica. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas v. 42, p. 269-277, 2006. ARGHIANI, N. et al. Investigating anticancer properties of the sesquiterpene ferutinin on colon carcinoma cells, in vitro and in vivo. Life Sci, v. 109, n. 2, p. 87-94, Jul 30 2014. ARMSTRONG, D. W. et al. Efficient Detection Evaluation of cyclodextrin multiple complex formation. J. Am. Chem. Soc., v. 108, p. 1418–142, 1996. ARRIGONI-BLANK, M. F. et al. Antinociceptive activity of the volatile oils of Hyptis pectinata L. Poit. (Lamiaceae) genotypes. Phytomedicine, v. 15, n. 5, p. 334-9, May 2008. ASLAN, B. et al. Nanotechnology in cancer therapy. J Drug Target, v. 21, n. 10, p. 904-13, Dec 2013. ASSIS, L. M. et al. Characteristics of nanoparticles and their potential applications in foods. Brazilian Journal of Food Technology, v. 15, p. 99-109, 2012.

Page 98: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

112

AZEVEDO, M. D. B. M. et al. New formulation of an old drug in hypertension treatment: the sustained release of captopril from cyclodextrin nanoparticles. International Journal of Nanomedicine, v. 6, p. 1005–1016, 2011. AZEVEDO, N. R. et al. Essential oil chemotypes in Hyptis suaveolens from Brazilian cerrado. Biochem. Syst. Ecol, v. 30, p. 205–216, 2002. BADR-ELDIN, S. M.; ELKHESHEN, S. A.; GHORAB, M. M. Inclusion complexes of tadalafil with natural and chemically modified beta-cyclodextrins. I: preparation and in-vitro evaluation. Eur J Pharm Biopharm, v. 70, n. 3, p. 819-27, Nov 2008. BAKKALI, F. et al. Biological effects of essential oils--a review. Food Chem Toxicol, v. 46, n. 2, p. 446-75, Feb 2008. BANCHERO, M.; MANNA, L. Investigation of the piroxicam/hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complexation by means of a supercritical solvent in the presence of auxiliary agents. The Journal of Supercritical Fluids, v. 57, p. 259–266, 2011. BARBOSA, J. A. et al. Triethanolamine stabilization of methotrexate-beta-cyclodextrin interactions in ternary complexes. Int J Mol Sci, v. 15, n. 9, p. 17077-99, 2014. BARRETO, R. S. et al. A systematic review of the wound-healing effects of monoterpenes and iridoid derivatives. Molecules, v. 19, n. 1, p. 846-62, 2014. BARROT, M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience, v. 211, n. 0, p. 39-50, 6/1/ 2012. BELSITO, D. et al. A toxicologic and dermatologic assessment of cyclic and non-cyclic terpene alcohols when used as fragrance ingredients. Food Chem Toxicol, v. 46 Suppl 11, p. S1-s71, Nov 2008. BHANDARI, B. R.; D'ARCY, B. R.; PADUKKA, I. Encapsulation of lemon oil by paste method using beta-cyclodextrin: encapsulation efficiency and profile of oil volatiles. J Agric Food Chem, v. 47, n. 12, p. 5194-7, Dec 1999. BHATIA, S. P. et al. Fragrance Material Review on isopulegol. Food Chem Toxicol, v. 46 Suppl 11, p. S185-9, Nov 2008. BILIA, A. R. et al. Essential oils loaded in nanosystems: a developing strategy for a successful therapeutic approach. Evid Based Complement Alternat Med, v. 2014, p. 651593, 2014. BISPO, M. D. et al. Antinociceptive and antiedematogenic effects of the aqueous extract of Hyptis pectinata leaves in experimental animals. J Ethnopharmacol, v. 76, n. 1, p. 81-6, Jun 2001. BORGES, A. R. et al. Trypanocidal and cytotoxic activities of essential oils from medicinal plants of Northeast of Brazil. Exp Parasitol, v. 132, n. 2, p. 123-8, Oct 2012. BOUNIHI, A. et al. In Vivo Potential Anti-Inflammatory Activity of Melissa officinalis L. Essential Oil. Adv Pharmacol Sci, v. 2013, p. 101759, 2013. BRITO, R. et al. Citronellol, a monoterpene alcohol, reduces nociceptive and inflammatory activities in rodents. Journal of Natural Medicines, v. 66, n. 4, p. 637-644, 2012/10/01 2012.

Page 99: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

113

BUDRYN, G. et al. Effect of inclusion of hydroxycinnamic and chlorogenic acids from green coffee bean in β-cyclodextrin on their interactions with whey, egg white and soy protein isolates. Food Chemistry, v. 168, n. 0, p. 276-287, 2/1/ 2015. CALDAS, G. F. et al. Antiulcerogenic activity of the essential oil of Hyptis martiusii Benth. (Lamiaceae). J Ethnopharmacol, v. 137, n. 1, p. 886-92, Sep 1 2011. CANNAVA, C. et al. Physico-chemical characterization of an amphiphilic cyclodextrin/genistein complex. J Pharm Biomed Anal, v. 51, n. 5, p. 1064-8, Apr 6 2010. CASTRONUOVO, G.; NICCOLI, M. Thermodynamics of inclusion complexes of natural and modified cyclodextrins with acetylsalicylic acid and ibuprofen in aqueous solution at 298&#xa0;K. Thermochimica Acta, v. 557, n. 0, p. 44-49, 4/10/ 2013. CEBORSKA, M.; SZWED, K.; SUWINSKA, K. beta-Cyclodextrin as the suitable molecular container for isopulegol enantiomers. Carbohydr Polym, v. 97, n. 2, p. 546-50, Sep 12 2013. CHAKRABORTY, S.; BASU, S.; BASAK, S. Effect of beta-cyclodextrin on the molecular properties of myricetin upon nano-encapsulation: insight from optical spectroscopy and quantum chemical studies. Carbohydr Polym, v. 99, p. 116-25, Jan 2014. CHALLA, R. et al. Cyclodextrins in drug delivery: an updated review. AAPS PharmSciTech, v. 6, n. 2, p. E329-57, 2005. CHEN, J. J. et al. Cytotoxic dihydroagarofuranoid sesquiterpenes from the stem of Microtropis fokienensis. J Nat Prod, v. 69, n. 4, p. 685-8, Apr 2006. CHEN, W. et al. Crassicauline α/β-cyclodextrin host–guest system: Preparation, characterization, inclusion mode, solubilization and stability. Carbohydr. Polym., v. 84, p. 1321–1328 2011. CHEN, Y. et al. Saturated long-chain esters of isopulegol as novel permeation enhancers for transdermal drug delivery. Pharm Res, v. 31, n. 8, p. 1907-18, Aug 2014. CHOI, M. et al. Physical and light oxidative properties of eugenol encapsulated by molecular inclusion and emulsion–diffusion method. Food Research International, v. 42, p. 148–156, 2009. CHOI, S. G. et al. Thermosensitive and mucoadhesive sol-gel composites of paclitaxel/dimethyl-beta-cyclodextrin for buccal delivery. PLoS One, v. 9, n. 9, p. e109090, 2014. CLAYTON, G. D.; CLAYTON, F. E. Patty’s industrial hygiene and toxicology 3rd ed. New York: Wiley-Interscience, 1981. COHEN, N. C. Guidebook on Molecular Modeling in Drug Design. San Diego, USA: Academic Press, 1996. CONNIOT, J. et al. Cancer immunotherapy: nanodelivery approaches for immune cell targeting and tracking. Front Chem, v. 2, p. 105, 2014. CRINI, G. Review: A History of Cyclodextrins. Chem Rev, Sep 23 2014.

Page 100: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

114

CUNHA NETO, A. Estudos conformacionais de lactonas sesquiterpênicas e compostos relacionados. 2006. Departamento de Química, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. DALLEL, R. et al. Evidence for a peripheral origin of the tonic nociceptive response to subcutaneous formalin. Pain, v. 61, n. 1, p. 11-6, Apr 1995. DANDAWATE, P. et al. Synthesis, characterization, molecular docking and anti-tubercular activity of Plumbagin-Isoniazid Analog and its beta-cyclodextrin conjugate. Bioorg Med Chem Lett, Sep 21 2014. DANILOVAS, P. P.; RUTKAITE, R.; ZEMAITAITIS, A. Thermal degradation and stability of cationic starches and their complexes with iodine. Carbohydr Polym, v. 112, p. 721-8, Nov 4 2014. DE CASSIA DA SILVEIRA, E. S. R. et al. A review on anti-inflammatory activity of phenylpropanoids found in essential oils. Molecules, v. 19, n. 2, p. 1459-80, 2014. DE FREITAS, M. R. et al. Inclusion complex of methyl-beta-cyclodextrin and olanzapine as potential drug delivery system for schizophrenia. Carbohydr Polym, v. 89, n. 4, p. 1095-100, Aug 1 2012. DE QUEIROZ, A. C. et al. Antileishmanial activity of medicinal plants used in endemic areas in northeastern Brazil. Evid Based Complement Alternat Med, v. 2014, p. 478290, 2014. DEGENHARDT, J.; KOLLNER, T. G.; GERSHENZON, J. Monoterpene and sesquiterpene synthases and the origin of terpene skeletal diversity in plants. Phytochemistry, v. 70, n. 15-16, p. 1621-37, Oct-Nov 2009. DEVIL, N. et al. Cyclodextrins in Pharmacy- an overview. Pharmacophore, v. 1, p. 155-165 2010. DEWAR, M. J. S. E. et al. A new general purpose quantum mechanical molecular model. J. Am. Chem. Soc. , v. 107, p. 3902–3909, 1985. DING, Z. et al. Encapsulation of a flavonoid-rich Allium cepa L. var. agrogatum don extract in beta-cyclodextrin for transdermal drug delivery. J Agric Food Chem, v. 61, n. 20, p. 4914-20, May 22 2013. DINIZ, L. R. et al. Gastroprotective effects of the essential oil of Hyptis crenata Pohl ex Benth. on gastric ulcer models. J Ethnopharmacol, v. 149, n. 3, p. 694-700, Oct 7 2013. DOOL, H. V. D.; KRATZ, P. D. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A, v. 11, p. 463, 1963. DOS SANTOS, C.; BUERA, M. D. P.; MAZZOBRE, M. F. Phase solubility studies of terpineol with β-cyclodextrins and stability of the freeze-dried inclusion complex. Procedia Food Science, v. 1, n. 0, p. 355-362, // 2011. DU, J.; TANG, X. L. Natural products against cancer: A comprehensive bibliometric study of the research projects, publications, patents and drugs. J Cancer Res Ther, v. 10 Suppl, p. C27-37, Aug 2014. ELOY, J. O. et al. Liposomes as carriers of hydrophilic small molecule drugs: Strategies to enhance encapsulation and delivery. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 123, n. 0, p. 345-363, 11/1/ 2014. ESCANDE, V.; RENARD, B. L.; GRISON, C. Lewis acid catalysis and Green oxidations: sequential tandem oxidation processes induced by Mn-hyperaccumulating plants. Environ Sci Pollut Res Int, Sep 30 2014.

Page 101: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

115

FALCAO, R. A. et al. Antileishmanial Phenylpropanoids from the Leaves of Hyptis pectinata (L.) Poit. Evid Based Complement Alternat Med, v. 2013, p. 460613, 2013. FERNANDES, A. et al. Structural characterization of inclusion complexes between cyanidin-3-O-glucoside and beta-cyclodextrin. Carbohydr Polym, v. 102, p. 269-77, Feb 15 2014. FERNANDES, E. S. et al. Anti-inflammatory effects of compounds alpha-humulene and (-)-trans-caryophyllene isolated from the essential oil of Cordia verbenacea. Eur J Pharmacol, v. 569, n. 3, p. 228-36, Aug 27 2007. FIEGE, H. Cresols and xylenols. Ullmann’s encyclopedia of industrial chemistry. W, G. Weinheim 2012. FOLCH-CANO, C.; YAZDANI-PEDRAM, M.; OLEA-AZAR, C. Inclusion and functionalization of polymers with cyclodextrins: current applications and future prospects. Molecules, v. 19, n. 9, p. 14066-79, 2014. FRAGOSO-SERRANO, M.; GIBBONS, S.; PEREDA-MIRANDA, R. Anti-staphylococcal and cytotoxic compounds from Hyptis pectinata. Planta Med, v. 71, n. 3, p. 278-80, Mar 2005. FRANCO, C. et al. Bioassay-guided evaluation of antinociceptive properties and chemical variability of the essential oil of Hyptis fruticosa. Phytother Res., v. 25, p. 1693-9, 2011 GAMSIZ, E. D. et al. Model predicting impact of complexation with cyclodextrins on oral absorption. Biotechnol Bioeng, v. 110, n. 9, p. 2536-47, Sep 2013. GARCIA, A. et al. Modified beta-cyclodextrin inclusion complex to improve the physicochemical properties of albendazole. complete in vitro evaluation and characterization. PLoS One, v. 9, n. 2, p. e88234, 2014. GARNERO, C. et al. Studies on trimethoprim:hydroxypropyl-beta-cyclodextrin: aggregate and complex formation. Carbohydr Res, v. 345, n. 17, p. 2550-6, Nov 22 2010. GERSHENZON, J.; DUDAREVA, N. The function of terpene natural products in the natural world. Nat Chem Biol, v. 3, n. 7, p. 408-14, Jul 2007. GERTSCH, J. et al. Beta-caryophyllene is a dietary cannabinoid. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 105, n. 26, p. 9099-104, Jul 1 2008. GIDWANI, B.; VYAS, A. Synthesis, characterization and application of epichlorohydrin-beta-cyclodextrin polymer. Colloids Surf B Biointerfaces, v. 114, p. 130-7, Feb 1 2014. GIORDANO, F.; NOVAK, C.; MOYANO, J. Thermal analysis of cyclodextrins and their inclusion compounds. Thermochim. Acta. , v. 380, p. 123-151, 2001. GOYAL, G. et al. Current nanotechnological strategies for treating glaucoma. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, v. 31, n. 5, p. 365-405, 2014. GRANDELLI, H. et al. Melting point depression of Piroxicam in carbon dioxide + co-solvent mixtures and inclusion complex formation with β-cyclodextrin. v. 71, p. 19–25, 2012.

Page 102: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

116

GUIMARAES, A. G.; QUINTANS, J. S.; QUINTANS, L. J., JR. Monoterpenes with analgesic activity--a systematic review. Phytother Res, v. 27, n. 1, p. 1-15, Jan 2013. HĂDĂRUGĂ, D. I. et al. Thermal and oxidative stability of the Allium sativum L. bioactive compounds/ α- and β -cyclodextrin nanoparticles. Rev. Chim., v. 58, p. 1009–1015, 2007. HĂDĂRUGĂ, N. G. Ficaria verna Huds. extracts and their b-cyclodextrin supramolecular systems. Chemistry Central Journal, v. 6, p. 6-16, 2012. HĂDĂRUGĂ, N. G.; HĂDĂRUGĂ, D. I.; ISENGARD, H. Z. Water content of natural cyclodextrins and their essential oil complexes: A comparative study between Karl Fischer titration and thermal methods. . Food Chem., v. 132, p. 1741-1748, 2012. HĂDĂRUGĂ, N. G. et al. Bioactive nanoparticles. Thermal stability of linoleic acid/α- and β-cyclodextrin complexes. Food Chem, v. 99, p. 500- 508, 2006. HELGASON, T. et al. Effect of surfactant surface coverage on formation of solid lipid nanoparticles (SLN). J Colloid Interface Sci, v. 334, n. 1, p. 75-81, Jun 1 2009. HIGUCHI, T.; CONNORS, K. A. Phase-solubility techniques. In: CN, R. (Ed.). Advances in analytical chemistry and instrumentation. New York: Wiley-Interscience, 1965. p.117-212. HILL, L. E.; GOMES, C.; TAYLOR, T. M. Characterization of beta-cyclodextrin inclusion complexes containing essential oils (trans-cinnamaldehyde, eugenol, cinnamon bark, and clove bud extracts) for antimicrobial delivery applications. LWT - Food Science and Technology, v. 51, p. 86-93, 2013. HUANG, Z. et al. Complexation of chlorpropham with hydroxypropyl-beta-cyclodextrin and its application in potato sprout inhibition. Carbohydr Polym, v. 107, p. 241-6, Jul 17 2014. HUMMEL, J. P.; DREYER, W. J. Measurement of protein-binding phenomena by gel filtration. Biochim Biophys Acta, v. 63, p. 530-2, Oct 8 1962. HUNKAAR, S.; HOLE, K. The formalin test in mice. Pain v. 30, p. 103-104, 1987. IACOVINO, R. et al. beta-Cyclodextrin Inclusion Complex to Improve Physicochemical Properties of Pipemidic Acid: Characterization and Bioactivity Evaluation. Int J Mol Sci, v. 14, n. 7, p. 13022-41, 2013. IONASHIRO, M. Giolito: Princípios Básicos da Termogravimetria e Análise Térmica Diferencial/ Calorimetria Exploratória Diferencial 2004. IRMISCH, S. et al. Terpene synthases and their contribution to herbivore-induced volatile emission in western balsam poplar (Populus trichocarpa). BMC Plant Biol, v. 14, n. 1, p. 270, 2014. ISO, I. O. F. S., 1997. Disponível em: < Organization for Standardization (ISO) >. Acesso em: 24/10/2014. JANKOVIC, B. Thermal characterization and detailed kinetic analysis of Cassava starch thermo-oxidative degradation. Carbohydr Polym, v. 95, n. 2, p. 621-9, Jun 20 2013.

Page 103: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

117

JIMENEZ, I. A. et al. Absolute configuration of sesquiterpenes from Crossopetalum tonduzii and their inhibitory effects on Epstein-Barr virus early antigen activation in Raji cells. J Nat Prod, v. 66, n. 8, p. 1047-50, Aug 2003. JULIUS, D.; BASBAUM, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature, v. 413, n. 6852, p. 203-10, Sep 13 2001. KARATHANOS, V. et al. Study of the solubility, antioxidant activity, and structure of inclusion complex of vanillin with beta-cyclodextrin. Food Chemistry, v. 101, p. 652-658, 2007. KESSLER, A. et al. GABA(A) receptor modulation by terpenoids from Sideritis extracts. Mol Nutr Food Res, v. 58, n. 4, p. 851-62, Apr 2014. KFOURY, M. et al. Cyclodextrin, an efficient tool for trans-anethole encapsulation: chromatographic, spectroscopic, thermal and structural studies. Food Chem, v. 164, p. 454-61, Dec 1 2014. KHAWAM, A.; FLANAGAN, D. R. Basics and applications of solid-state kinetics: a pharmaceutical perspective. J Pharm Sci, v. 95, n. 3, p. 472-98, Mar 2006. KLAUKE, A. L. et al. The cannabinoid CB2 receptor-selective phytocannabinoid beta-caryophyllene exerts analgesic effects in mouse models of inflammatory and neuropathic pain. Eur Neuropsychopharmacol, v. 24, n. 4, p. 608-20, Apr 2014. KLEINE, S.; MULLER, C. Differences in shoot and root terpenoid profiles and plant responses to fertilisation in Tanacetum vulgare. Phytochemistry, v. 96, p. 123-31, Dec 2013. KOZMIDIS-PETROVIC´, A.; ŠTRBAC, G.; ŠTRBAC, D. Kinetics of non-isothermal crystallization of chalcogenide glasses from the Sb32As5S48I15 system. Journal of Non-Crystalline Solids, v. 353, p. 2014-2019, 2007. KUMAR, A. et al. Nanotechnology: A Review. Journal of Pharmacy Research, v. 7, p. 3630-3634, 2012. KURKOV, S. V.; LOFTSSON, T. Cyclodextrins. International Journal of Pharmaceutics, v. 453, p. 167– 180, 2013. LE BARS, D.; GOZARIU, M.; CADDEN, S. W. Animal models of nociception. Pharmacological Reviews, v. 53, p. 597-652., 2001. LEACH, A. R. Molecular Modeling: Principles and Applications. London, UK: Prentice Hall, 2001. LENARDÃO, E. J. et al. Citronellal as key compound in organic synthesis. Tetrahedron, v. 63, p. 6671–6712, 2007. LIN, Y. H. et al. Epoxide as a precursor to secondary organic aerosol formation from isoprene photooxidation in the presence of nitrogen oxides. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 110, n. 17, p. 6718-23, Apr 23 2013. LINS, L. et al. The anticonvulsant effect of geraniol and inclusion complex geraniol: β-cyclodextrin. Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, v. 13, p. 557 - 565, 2014.

Page 104: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

118

LISBOA, A. C. et al. Antinociceptive effect of Hyptis pectinata leaves extracts. Fitoterapia, v. 77, n. 6, p. 439-42, Sep 2006. LIU, H. et al. Physicochemical characterization and pharmacokinetics evaluation of beta-caryophyllene/beta-cyclodextrin inclusion complex. Int J Pharm, v. 450, n. 1-2, p. 304-10, Jun 25 2013. LOFTSSON, T.; BREWSTER, M. E. Pharmaceutical applications of cyclodextrins: basic science and product development. J Pharm Pharmacol, v. 62, n. 11, p. 1607-21, Nov 2010. ______. Pharmaceutical applications of cyclodextrins: effects on drug permeation through biological membranes. J Pharm Pharmacol, v. 63, n. 9, p. 1119-35, Sep 2011. ______. Cyclodextrins as functional excipients: methods to enhance complexation efficiency. J Pharm Sci, v. 101, n. 9, p. 3019-32, Sep 2012. LÓPEZ-GONZÁLEZ, D. et al. Kinetic analysis and thermal characterization of the microalgae combustion process by thermal analysis coupled to mass spectrometry. Applied Energy, v. 114, p. 227–237, 2014. LOUIZ, S.; LABIADH, H.; ABDERRAHIM, R. Synthesis and spectroscopy studies of the inclusion complex of 3-amino-5-methyl pyrazole with beta-cyclodextrin. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, v. 134, p. 276-82, Jan 5 2015. LV, C. et al. New dihydro-beta-agarofuran sesquiterpenes from Parnassia wightiana wall: isolation, identification and cytotoxicity against cancer cells. Int J Mol Sci, v. 15, n. 6, p. 11111-25, 2014. LYRA, M. A. M. et al. Ferramentas analíticas aplicadas à caracterização de complexos de inclusão fármaco-ciclodextrina. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, v. 31, p. 117-124, 2010. MALAN, K. et al. The essential oil of Hyptis pectinata. Planta Med, v. 54, n. 6, p. 531-2, Dec 1988. MANGOLIM, C. S. et al. Curcumin-beta-cyclodextrin inclusion complex: stability, solubility, characterisation by FT-IR, FT-Raman, X-ray diffraction and photoacoustic spectroscopy, and food application. Food Chem, v. 153, p. 361-70, Jun 15 2014. MARQUES, H. M. C. A review on cyclodextrin encapsulation of essential oils and volatiles. . Flavour Frag. J., v. 25, p. 313–326, 2010. MARRETO, R. N. et al. Thermal analysis and gas chromatography coupled mass spectrometry analyses of hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex containing Lippia gracilis essential oil. . Thermochim. Acta. , v. 475, p. 53–58, 2008. MELO, G. B. et al. Proliferative effect of the aqueous extract of Hyptis pectinata on liver regeneration after partial hepatectomy in rats. Acta Cir Bras, v. 21 Suppl 1, p. 33-6, 2006. MELO, G. B. et al. Enhancement of liver regeneration by the association of Hyptis pectinata with laser therapy. Dig Dis Sci, v. 50, n. 5, p. 949-54, May 2005. MELO, M. S. et al. Antinociceptive effect of citronellal in mice. Pharm Biol, v. 48, n. 4, p. 411-6, Apr 2010.

Page 105: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

119

MENEZES, P. P. et al. Inclusion complex of (-)-linalool and b-cyclodextrin. J Therm Anal Calorim, v. 115, p. 2429–2437, 2014. MENEZES, P. P. et al. Solid-state β-cyclodextrin complexes containing geraniol. Thermochim. Acta, v. 548, p. 45– 50 2012. MESSIAD, H.; AMIRA-GUEBAILIA, H.; HOUACHE, O. Reversed phase High Performance Liquid Chromatography used for the physicochemical and thermodynamic characterization of piceatannol/beta-cyclodextrin complex. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, v. 926, p. 21-7, May 1 2013. MOLEGRO. http://www.clcbio.com/products/molegro/#molecular-viewer. Acesso em: 8/14/2013. MURA, P. Analytical techniques for characterization of cyclodextrin complexes in aqueous solution: A review. J Pharm Biomed Anal, Mar 12 2014. NASCIMENTO, P. F. et al. Hyptis pectinata essential oil: chemical composition and anti-Streptococcus mutans activity. Oral Dis, v. 14, n. 6, p. 485-9, Sep 2008. NASCIMENTO, S. S. et al. Linalool and linalool complexed in beta-cyclodextrin produce anti-hyperalgesic activity and increase Fos protein expression in animal model for fibromyalgia. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, v. 387, n. 10, p. 935-42, Oct 2014. PAIK, S. Y. et al. The essential oils from Zanthoxylum schinifolium pericarp induce apoptosis of HepG2 human hepatoma cells through increased production of reactive oxygen species. Biol Pharm Bull, v. 28, n. 5, p. 802-7, May 2005. PAIXAO, M. S. et al. Hyptis pectinata: redox protection and orofacial antinociception. Phytother Res, v. 27, n. 9, p. 1328-33, Sep 2013. PANDIT, V. et al. Preparation and characterization of pioglitazone cyclodextrin inclusion complexes. J Young Pharm, v. 3, n. 4, p. 267-74, Oct 2011. PERIASAMY, R. et al. Spectral investigation and characterization of host-guest inclusion complex of 4,4'-methylene-bis(2-chloroaniline) with beta-cyclodextrin. Carbohydr Polym, v. 114, p. 558-66, Dec 19 2014. PETRALITO, S. et al. Spectroscopic characterization of both aqueous and solid-state diacerhein/hydroxypropyl-beta-cyclodextrin inclusion complexes. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, v. 127, p. 355-60, Jun 5 2014. PETRONILHO, S.; COIMBRA, M. A.; ROCHA, S. M. A critical review on extraction techniques and gas chromatography based determination of grapevine derived sesquiterpenes. Anal Chim Acta, v. 846c, p. 8-35, Oct 10 2014. PHAM, D.-D.; FATTAL, E.; TSAPIS, N. Pulmonary drug delivery systems for tuberculosis treatment. International Journal of Pharmaceutics, v. 478, n. 2, p. 517-529, 1/30/ 2015. PINHO, E. et al. Cyclodextrins as encapsulation agents for plant bioactive compounds. Carbohydr Polym, v. 101, p. 121-35, Jan 30 2014.

Page 106: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

120

PORTE, A.; PORTE, L. H. M.; OLIVEIRA, L. M. Cromatografia gasosa quiral na resolução de enantiômeros envolvidos em flavours de frutas. Química Nova, in press. PRADINES, B. et al. Investigation of the complexation of albendazole with cyclodextrins for the design of new antiparasitic formulations. Carbohydr Res, v. 398, p. 50-5, Oct 29 2014. PS, S.-L. et al. B-Cyclodextrin Complex Containing Lippia grata Leaf Essential Oil Reduces Orofacial Nociception in Mice – Evidence of Possible Involvement of Descending Inhibitory Pain Modulation Pathway. Basic Clin Pharmacol Toxicol. , v. 114, p. 188-96, 2014. QUINTANS-JUNIOR, L. J. et al. beta-Cyclodextrin-complexed (-)-linalool produces antinociceptive effect superior to that of (-)-linalool in experimental pain protocols. Basic Clin Pharmacol Toxicol, v. 113, n. 3, p. 167-72, Sep 2013. QUINTANS JDE, S. et al. Improvement of p-cymene antinociceptive and anti-inflammatory effects by inclusion in beta-cyclodextrin. Phytomedicine, v. 20, n. 5, p. 436-40, Mar 15 2013. QUINTANS JDE, S. et al. Chemical constituents and anticancer effects of the essential oil from leaves of Xylopia laevigata. Planta Med, v. 79, n. 2, p. 123-30, Jan 2013. QUINTANS, J. S. et al. Natural products evaluated in neuropathic pain models - a systematic review. Basic Clin Pharmacol Toxicol, v. 114, n. 6, p. 442-50, Jun 2014. QUINTANS, J. S. S. et al. Phytochemical study and antinociceptive effect of the hexanic extract of leaves from Combretum duarteanum and friedelin, a triterpene isolated from the hexanic extract, in orofacial nociceptive protocols. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 24, n. 1, p. 60-66, 1// 2014. RACHMAWATI, H.; EDITYANINGRUM, C. A.; MAULUDIN, R. Molecular inclusion complex of curcumin-beta-cyclodextrin nanoparticle to enhance curcumin skin permeability from hydrophilic matrix gel. AAPS PharmSciTech, v. 14, n. 4, p. 1303-12, Dec 2013. RADI, A. E.; EISSA, S. Voltammetric and spectrophotometric study on the complexation of glibenclamide with β-cyclodextrin. J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem., v. 68, p. 417-421, 2010. RAJENDIRAN, N.; MOHANDOSS, T.; SARAVANAN, J. Guest:host interactions of lidocaine and prilocaine with natural cyclodextrins: spectral and molecular modeling studies. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, v. 132, p. 387-96, Nov 11 2014. RAJENDIRAN, N.; MOHANDOSS, T.; VENKATESH, G. Investigation of inclusion complexes of sulfamerazine with α- and β-cyclodextrins: An experimental and theoretical study. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, v. 124, n. 0, p. 441-450, 4/24/ 2014. RAJENDIRAN, N.; S., S.; J., S. Inclusion complexation of sulfapyridine with α- and β-cyclodextrins: Spectral and Molecular modeling study. J. Mol. Struct. , v. 1054-1055, p. 215-222, 2013. RAJENDIRAN, N.; SIVA, S. Inclusion complex of sulfadimethoxine with cyclodextrins: Preparation and characterization. Carbohydrate Polymers, v. 101, n. 0, p. 828-836, 1/30/ 2014. RAYMUNDO, L. J. et al. Characterisation of the anti-inflammatory and antinociceptive activities of the Hyptis pectinata (L.) Poit essential oil. J Ethnopharmacol, v. 134, n. 3, p. 725-32, Apr 12 2011.

Page 107: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

121

REN, J. et al. Application of cyclodextrin-based eluents in hydrophobic charge-induction chromatography: elution of antibody at neutral pH. J Chromatogr A, v. 1352, p. 62-8, Jul 25 2014. S., K.; JYODOI, K.; A., O. Thermal decomposition of cyclodextrins (α-, β-, γ-, and modified β-CyD) and of metal-(β-CyD) complexes in the solid phase. Thermochim. Acta, v. 217, p. 187-198, 1993. SALUSTIO, P. J. et al. The influence of the preparation methods on the inclusion of model drugs in a beta-cyclodextrin cavity. Eur J Pharm Biopharm, v. 71, n. 2, p. 377-86, Feb 2009. SALUSTIO, P. J. et al. Advanced technologies for oral controlled release: cyclodextrins for oral controlled release. AAPS PharmSciTech, v. 12, n. 4, p. 1276-92, Dec 2011. SAMBASEVAM, K. P. et al. Synthesis and Characterization of the Inclusion Complex of beta-cyclodextrin and Azomethine. Int J Mol Sci, v. 14, n. 2, p. 3671-82, 2013. SANTOS, E. H. et al. Characterization of carvacrol beta-cyclodextrin inclusion complexes as delivery systems for antibacterial and antioxidant applications. LWT - Food Science and Technology, v. 60, p. 583–592, 2015. SANTOS, M. R. V. et al. Cardiovascular effects of monoterpenes: a review. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 21, p. 764-771, 2011. SANTOS, P. O. et al. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Hyptis pectinata (L.) Poit. Quim. Nova v. 31, p. 1648-1652, 2008. SCARPIGNATO, C. Piroxicam-beta-cyclodextrin: a GI safer piroxicam. Curr Med Chem, v. 20, n. 19, p. 2415-37, 2013. SCHMID, G. Cyclodextrin glucanotransferse production: yield enhancement by overexpression of cloned genes. Trends Biotechnol. , v. 7, p. 244–248, 1989. SCHMIDT, E. Handbook of essential oils. 2010. SERAfiNI, M. R. et al. Interaction of p-cymene with β-cyclodextrin. . J Therm Anal Calorim, v. DOI 10.1007/s10973-011-1736, 2011. SERAFINI, M. R. et al. Determination of chemical and physical properties of Hyptis pectinata essential oil and their redox active profile. E3 Journal of Biotechnology and Pharmaceutical Research, v. 3, p. 1-9, 2012. SEWRY, J.; BROWN, M. ‘‘Model-free’’ kinetic analysis? Thermochimica Acta, v. 390, p. 217–225, 2002. SHANE, R. et al. Estrus phase differences in female rats in morphine antinociception elicited from the ventrolateral periaqueductal gray. Int J Neurosci, v. 117, n. 6, p. 811-22, Jun 2007. SHANMUGA PRIYA, A. et al. Improvement on dissolution rate of inclusion complex of Rifabutin drug with beta-cyclodextrin. Int J Biol Macromol, v. 62, p. 472-80, Nov 2013. SHARMA, A.; JAIN, N.; SAREEN, R. Nanocarriers for diagnosis and targeting of breast cancer. Biomed Res Int, v. 2013, p. 960821, 2013.

Page 108: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

122

SILVA, M. I. et al. Central nervous system activity of acute administration of isopulegol in mice. Pharmacol Biochem Behav, v. 88, n. 2, p. 141-7, Dec 2007. SILVA, M. I. et al. Gastroprotective activity of isopulegol on experimentally induced gastric lesions in mice: investigation of possible mechanisms of action. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, v. 380, n. 3, p. 233-45, Sep 2009. SILVA, M. I. et al. Effects of isopulegol on pentylenetetrazol-induced convulsions in mice: possible involvement of GABAergic system and antioxidant activity. Fitoterapia, v. 80, n. 8, p. 506-13, Dec 2009. SILVA, W. J. et al. Effects of essential oils on Aedes aegypti larvae: alternatives to environmentally safe insecticides. Bioresour Technol, v. 99, n. 8, p. 3251-5, May 2008. SINGH, H. P. et al. Characterization and antioxidant activity of essential oils from fresh and decaying leaves of Eucalyptus tereticornis. J Agric Food Chem, v. 57, n. 15, p. 6962-6, Aug 12 2009. SINGH, R. et al. Characterization of Cyclodextrin Inclusion Complexes - A Review Journal of Pharmaceutical Science and Technology, v. 2, p. 171-183 2010. SIQUEIRA-LIMA, P. S. et al. beta-cyclodextrin complex containing Lippia grata leaf essential oil reduces orofacial nociception in mice - evidence of possible involvement of descending inhibitory pain modulation pathway. Basic Clin Pharmacol Toxicol, v. 114, n. 2, p. 188-96, Feb 2014. SONG, W. et al. Cyclodextrin-erythromycin complexes as a drug delivery device for orthopedic application. Int J Nanomedicine, v. 6, p. 3173-86, 2011. SOUZA, M. T. et al. Structure-activity relationship of terpenes with anti-inflammatory profile - a systematic review. Basic Clin Pharmacol Toxicol, v. 115, n. 3, p. 244-56, Sep 2014. SRINIVASAN, K.; SIVAKUMAR, K.; STALIN, T. 2,6-Dinitroaniline and beta-cyclodextrin inclusion complex properties studied by different analytical methods. Carbohydr Polym, v. 113, p. 577-87, Nov 26 2014. STALIN, T. et al. Preparation and characterizations of solid/aqueous phases inclusion complex of 2,4-dinitroaniline with beta-cyclodextrin. Carbohydr Polym, v. 107, p. 72-84, Jul 17 2014. SU, J. et al. Preparation of natural borneol/2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin inclusion complex and its effect on the absorption of tetramethylpyrazine phosphate in mouse. Chem Pharm Bull (Tokyo), v. 60, n. 6, p. 736-42, 2012. SZEJTLI, J. Introduction and General Overview of Cyclodextrin Chemistry. Chem Rev, v. 98, n. 5, p. 1743-1754, Jul 30 1998. TAFAZZOLI, M.; GHIASI, M. Structure and conformation of α-, β- and γ-cyclodextrin in solution: Theoretical approaches and experimental validation. Carbohydr. Polym., v. 78, p. 10–15, 2009. TCHOUMBOUGNANG, F. et al. Aromatic plants of Tropical Central Africa. XLVIII†. Comparative study of the essential oils of four Hyptis species from Cameroon: H. lanceolata Poit., H. pectinata (L.) Poit., H. spicigera Lam. and H. suaveolens Poit,. Flavour Fragr. J. , v. 20, p. 340-343., 2005.

Page 109: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

123

TEJASHRI, G.; AMRITA, B.; DARSHANA, J. Cyclodextrin based nanosponges for pharmaceutical use: a review. Acta Pharm, v. 63, n. 3, p. 335-58, Sep 2013. TOROPAINEN, T. et al. Preparation of budesonide/gamma-cyclodextrin complexes in supercritical fluids with a novel SEDS method. J Pharm Sci, v. 95, n. 10, p. 2235-45, Oct 2006. TUREK, C.; STINTZING, F. Stability of Essential OIls: A Review. Comprehensive Reviews In Food Science and Food Safety, v. 12, p. 40-53, 2013. UNGARO, F. et al. Use of cyclodextrins as solubilizing agents for simvastatin: effect of hydroxypropyl-beta-cyclodextrin on lactone/hydroxyacid aqueous equilibrium. Int J Pharm, v. 404, n. 1-2, p. 49-56, Feb 14 2011. VALENTE, A. J.; SODERMAN, O. The formation of host-guest complexes between surfactants and cyclodextrins. Adv Colloid Interface Sci, v. 205, p. 156-76, Mar 2014. VALLE, M. D. Cyclodextrins and their uses: a review. Process Biochem., v. 5, p. 1033-1046, 2004. VYAZOVKIN, S.; SBIRRAZZUOLI, N. Isoconversional Kinetic Analysis of Thermally Stimulated Processes in Polymers. Thermal Anal. Cal, v. 83, p. 45-51, 2006. WANG, D. W. et al. Inclusion of quinestrol and 2,6-di-O-methyl-beta-cyclodextrin: Preparation, characterization, and inclusion mode. Carbohydr Polym, v. 93, n. 2, p. 753-60, Apr 2 2013. WANG, X. et al. Immunosuppressive sesquiterpenes from Tripterygium wilfordii. Chem Pharm Bull (Tokyo), v. 53, n. 6, p. 607-10, Jun 2005. WANG, X.; LUO, Z.; XIAO, Z. Preparation, characterization, and thermal stability of β-cyclodextrin/soybean lecithin inclusion complex. Carbohydrate Polymers, v. 101, n. 0, p. 1027-1032, 1/30/ 2014. WEISS, J. et al. Solid lipid nanoparticles as delivery systems for bioactive food components. Food Biophisics, v. 3, p. 146-154, 2008. WOLF, L. K. New software and Websites for the Chemical Enterprise. Chem. Eng. News, v. 87, p. 31, 2009. WU, H. et al. Preparation and stability investigation of the inclusion complex of sulforaphane with hydroxypropyl-β-cyclodextrin. Carbohydrate Polymers, v. 82, n. 3, p. 613-617, 10/15/ 2010. WU, W. et al. Five new insecticidal sesquiterpenoids from Celastrus angulatus. J Nat Prod, v. 64, n. 3, p. 364-7, Mar 2001. XU, C. et al. Investigation of inclusion complex of honokiol with sulfobutyl ether-β-cyclodextrin. . Carbohydr Polym., p. 9-15, 2014. YAO, Y. et al. Development of a myricetin/hydroxypropyl-beta-cyclodextrin inclusion complex: preparation, characterization, and evaluation. Carbohydr Polym, v. 110, p. 329-37, Sep 22 2014. ZAFAR, N.; FESSI, H.; ELAISSARI, A. Cyclodextrin containing biodegradable particles: from preparation to drug delivery applications. Int J Pharm, v. 461, n. 1-2, p. 351-66, Jan 30 2014.

Page 110: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

124

ZHANG, D. et al. Periconianone A, a new 6/6/6 carbocyclic sesquiterpenoid from endophytic fungus Periconia sp. with neural anti-inflammatory activity. Org Lett, v. 16, n. 5, p. 1410-3, Mar 7 2014. ZHOU, Q. et al. Baicalein and hydroxypropyl-gamma-cyclodextrin complex in poloxamer thermal sensitive hydrogel for vaginal administration. Int J Pharm, v. 454, n. 1, p. 125-34, Sep 15 2013. ZIEMONS, E. et al. Study of the physicochemical properties in aqueous medium and molecular modeling of tagitinin C/cyclodextrin complexes. J Pharm Biomed Anal, v. 43, n. 3, p. 910-9, Feb 19 2007. ZU, Y. et al. The high water solubility of inclusion complex of taxifolin-γ-CD prepared and characterized by the emulsion solvent evaporation and the freeze drying combination method. International Journal of Pharmaceutics, v. 148-158, p. 148-158, 2014.

Page 111: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

125

ANEXOS

Page 112: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE … · POM Pomada RMβCD β-CD randomicamente metilada SBEβCD Sulfobutiléter-β-CD SI Solução intravenosa SN Solução nasal .

126

ANEXO 1: PROTOCOLO DE APROVAÇÃO NO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA

COM ANIMAIS DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE