Download - UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

Transcript
Page 1: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 Pelotas, 2007

 

João Rodrigo Gil de los Santos

Construção e avaliação de vacinas de toxina α recombinante de Clostridium perfringens A

 

 

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

Agrícola

 

                      

Tese  

 

Page 2: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Page 3: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

1

JOÃO RODRIGO GIL DE LOS SANTOS

 

 

 

Construção e avaliação de vacinas de toxina α recombinante de Clostridium perfringens A

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Orientador: Carlos Gil Turnes

Pelotas, 2007

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola daUniversidade Federal de Pelotas, comorequisito parcial à obtenção do título deDoutor em Ciências (área de conhecimento:Doenças Infecciosas de Animais).

Page 4: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

2

          

Dados de catalogação na fonte: Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel

G463c Gil de los Santos, João Rodrigo

Construção e avaliação de vacinas de toxina α recombi-nante de Clostridium perfringens A / João Rodrigo Gil de los Santos ; orientador Carlos Gil Turnes. – Pelotas, 2007. – 82f. : il. – Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Bio-tecnologia Agrícola. Centro de Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2007.

1.Biotecnologia. 2.Enterite necrótica aviar. 3. Clostridium

perfringens A. 4.Toxina α recombinante. 5.Vacinas. I.Gil Tur-nes, Carlos . II.Titulo.

CDD: 615.372

Page 5: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

3

 

                 

Banca examinadora:

Prof. Dr. Fabricio Rochedo Conceição, Fundação Universidade do Rio Grande

Prof. Dr. Itabajara da Silva Vaz Jr, Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Dr. Ricardo Alfredo Soncini, Sadia SA

Prof. Dr. Carlos Gil Turnes, Universidade Federal de Pelotas

Page 6: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

4

AGRADECIMENTOS

A Deus, por tudo o que Ele me ofereceu.

Ao meu pai, que além de amigo, aconselha-me pelos caminhos da vida e

orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me.

A minha mãe, cujos conselhos foram essenciais para a conclusão do curso.

A minha futura esposa, Rafaela, cuja compreensão, amizade e amor

sustentaram a realização deste trabalho.

Ao amigo Fabricio Rochedo Conceição, sempre disposto a ensinar-me.

Aos amigos Alceu e Rodrigo, que cuidaram dos animais utilizados nos

experimentos.

A todos que de alguma forma contribuíram.

Muito Obrigado

 

 

 

 

Page 7: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

5

RESUMO

GIL DE LOS SANTOS, João Rodrigo. Construção e avaliação de vacinas de

toxina α recombinante de Clostridium perfringens A. 2007. 82 f. Tese

(Doutorado) - Programa de Pós - Graduação em Biotecnologia Agrícola.

Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

A Enterite Necrótica Aviar (ENA) é uma enterotoxemia aguda, causada pelos

Clostridium perfringens A e C, cujo controle baseia-se na adição de antibióticos na

ração. A restrição dessa prática pelo mercado consumidor, que tornou seu controle o

maior desafio para o setor avícola, exigiu a adoção de novas estratégias para o

controle, entre elas a imunização. Vacinas recombinantes vêm despertando grande

interesse entre pesquisadores e empresas do setor. O objetivo deste trabalho foi

elaborar vacinas de toxina α recombinante de C. perfringens (rAT) utilizando como

adjuvantes Al(OH)3 (rAT+Al(OH)3) e subunidade B recombinante da enterotoxina

termolábil de Escherichia coli (rLTB) (rAT+rLTB), e construir e avaliar uma proteína

quimérica contendo rAT fusionada a rLTB (rLTB-AT). A rAT+Al(OH)3 foi inócua e

protetora contra agressão de toxina α nativa (sT) em camundongos, e imunogênica

em frangos de corte, sem afetar a produtividade. A rAT+rLTB demonstrou relação

dose-proteção em camundongos, entanto a rLTB-AT não protegeu camundongos

contra agressão de sT. A rAT demonstrou ser uma alternativa para controlar a ENA.

Palavras-chave: Enterite Necrótica Aviar, Clostridium perfringens A, toxina α

recombinante, vacinas.

 

Page 8: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

6

ABSTRACT

GIL DE LOS SANTOS, João Rodrigo. Construction and evaluation of Clostridium

perfringens A recombinant α toxin vaccines. 2007. 82 f. Tese (Doutorado) -

Programa de Pós - Graduação em Biotecnologia Agrícola. Universidade Federal de

Pelotas, Pelotas.

Avian Necrotic Enteritis (NE) is an acute enterotoxaemia caused by Clostridium

perfringens A and C. The control of the disease is based on antibiotics added to

animal feed. The ban of this practice by consumer markets, considered the biggest

challenge to industrial aviculture, demanded the adoption of other alternatives for its

control, among others, immunization with recombinant vaccines. The aim of this work

was to produce and evaluate C. perfringens recombinant α toxin (rAT) vaccines

adjuvanted with either Al(OH)3 (rAT+Al(OH)3 or recombinant B subunit of the heat-

labile enterotoxin of Escherichia coli (rLTB) (rAT+rLTB), and a chimeric protein

containing the α toxin fused to rLTB (rLTB-AT). The rAT+Al(OH)3 was innocuous and

protected mice against a challenge with native α toxin (sT), and it was immunogenic

and did not affect productivity parameters in broilers. The rAT+rLTB showed a dose-

protection relationship in mice, while rLTB-AT did not protect mice against sT

challenge. The rAT could be an alternative for controlling NE.

Key words: Avian Necrotic Enteritis, Clostridium perfringens A, recombinant α toxin,

vaccines.

Page 9: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

7

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 7

2 ARTIGO 1: Enterite Necrótica Aviar 10

3 ARTIGO 2: Evaluation of Clostridium perfringens recombinant α toxin vaccines

in mice 32

Summary 33

Introduction 34

Material and Methods 35

Results 40

Discussion 45

References 47

4 ARTIGO 3: Evaluation of Clostridium perfringens recombinant α toxin vaccines in

broilers 52

Summary 53

Introduction 54

Material and Methods 55

Results 58

Discussion 61

References 64

5 CONCLUSÕES 68

6 ATIVIDADES FUTURAS 68

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69

Page 10: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

7

1 INTRODUÇÃO

Atualmente a carne de frango está em primeiro lugar na produção animal no

Brasil. No primeiro trimestre de 2007 foi abatido mais de 1 bilhão de frangos, o que

representa mais de 2 milhões de toneladas de produto, com um aumento no abate

de 2,1% em relação ao mesmo período de 2006. Comercializaram-se no mercado

externo 697,2 mil toneladas de frangos no primeiro trimestre de 2007, com aumento

de 14,3% com relação ao mesmo período de 2006 e 18,2% no faturamento (IBGE,

2007).

Parte desses índices foi obtida utilizando antimicrobianos adicionados às

rações animais, prática comum e necessária na avicultura industrial, para controlar

doenças e manter ou melhorar índices de produtividade. O Clostridium perfringens

sorotipo A, um dos cinco sorotipos da espécie, agente etiológico da gangrena

gasosa em humanos e animais, de infecções alimentares em humanos (ROBERTS,

1959) e da Enterite Necrótica Aviar (ENA) (PARISH, 1961), é facilmente controlado

por essa prática. Porém, a União Européia baniu, a partir de 2006, a utilização de

antibióticos promotores de crescimento nas rações animais (COUNCIL OF

EUROPEAN UNION, 2003), comprometendo a eficiência dos sistemas intensivos de

produção animal. Uma das doenças mais afetadas por essa medida é a ENA

(KALDHUSDAL & LOVLAND, 2002), um problema freqüente (HOFACRE et al.,

1998) e economicamente importante (ENGSTRÖM et al., 2003) em vários países. A

doença é apontada como um dos maiores desafios para o futuro da avicultura

mundial após a restrição ao uso de antibióticos (PHILLIPS, 2002; SESTI, 2002;

KALDHUSDAL, 2003).

Page 11: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

8

A ENA é uma enterotoxemia aguda, que se apresenta em forma clínica ou

subclínica (VAN IMMERSEEL et al., 2004) causada por Clostridium perfringens A e

C. Caracteriza-se por lesões ulcerativas e necrose confluente da mucosa do

intestino delgado e debilidade que se apresenta rapidamente, e afeta principalmente

animais entre duas e cinco semanas de idade, aparecendo subitamente, geralmente

associada à imunossupressão, provocando morte rápida com elevada prevalência

(SCHOCKEN-ITURRINO & ISHI, 2000). Embora os casos de ENA não sejam

reportados às autoridades sanitárias, é conhecido seu impacto negativo na produção

avícola. Estimou-se que nos Estados Unidos o custo dessa doença é de mais de U$

0,05 por animal (VAN DER SLUIS, 2000), podendo o produtor ter prejuízo de até

33% na produção, devido à piora da conversão alimentar, redução do peso vivo e

aumento na condenação de carcaças (LOVLAND & KALDHUSDAL, 2001).

O controle e a prevenção da ENA foram baseados, durante as últimas

décadas, na administração de antibióticos, como promotores de crescimento, na

ração. Entretanto, a restrição a essa prática lançou o desafio de criar novas

estratégias para controlar a doença. Várias alternativas vêm sendo estudadas em

todo o mundo, dentre elas, as vacinas, especialmente as recombinantes, de

produção mais simples e controlável que as tradicionais, vêm despertando grande

interesse entre pesquisadores e empresas do setor. Embora, animais que

sobreviveram à doença desenvolvam imunidade (PRESCOTT, 2000), não há

vacinas eficazes comercialmente disponíveis (KULKARNI et al., 2007).

C. perfringens A produz como antígeno maior a toxina α, uma fosfolipase letal

para camundongos, dermonecrótica e com ação hemolítica, e como antígenos

menores leucocidina, fibrinolisina e hialuronidase, entre outros (STERNE &

WARRACK, 1964). Diversas vacinas baseadas na toxina α nativa ou recombinante

Page 12: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

9

do C. perfringens foram testadas com resultados variáveis. A clonagem da toxina α

em Escherichia coli (LESLIE et al., 1989) e o desenvolvimento de vacinas com

toxina α recombinante (WILLIAMSON & TITBALL, 1993; SCHOEPE, et al, 2001;

STEVENS et al., 2004) estimularam pesquisadores a utilizar essa tecnologia para

desenvolver vacinas capazes de controlar a ENA.

A fim de induzir imunidade protetora, as vacinas clostridiais necessitam de

adjuvantes tais como hidróxido de alumínio, alume, ou a recentemente desenvolvida

subunidade B recombinante da enterotoxina termolábil de E. coli (rLTB), que provou

ser um eficiente adjuvante de mucosa estimulando respostas sistêmicas e

secretórias (VERWEIJ et al, 1998), e pode ser conjugada a antígenos por fusão

genética (CONCEIÇÃO et al., 2006).

Hipótese

Toxina α recombinante de C. perfringens (rAT) produzida a partir de genes de

cepas autóctones é imunogênica e protege frente à agressão de toxina α nativa.

Objetivos

Produzir rAT a partir de genes de cepas isoladas de surtos ocorridos no

Brasil.

Elaborar vacinas utilizando como adjuvantes Al(OH)3 e rLTB.

Construir e avaliar uma proteína quimérica contendo a rAT fusionada a rLTB.

Avaliar inocuidade e potência das vacinas em camundongos.

Avaliar inocuidade e imunogenicidade das vacinas em frangos de corte.

Page 13: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

10

2 ARTIGO 1

ENTERITE NECRÓTICA AVIAR

(Revisão submetida à Ciência Rural)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Page 14: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

11

ENTERITE NECRÓTICA AVIAR

Avian Necrotic Enteritis

João Rodrigo Gil de los Santos1, Fabricio Rochedo Conceição2, Carlos Gil-Turnes3

RESUMO

A Enterite Necrótica Aviar (ENA) é uma enterotoxemia aguda que aparece

subitamente e provoca morte rápida afetando principalmente animais jovens. Embora seu

impacto negativo na produção, devido ao aumento da conversão alimentar e condenação de

carcaças, seja já conhecido, questões relacionadas à etiologia, patogenia e controle desta

importante enfermidade necessitam de maiores esclarecimentos. Nos últimos anos o controle

da ENA baseou-se na aplicação de antibióticos na ração animal, prática banida pelo mercado

consumidor, que exigiu o desenvolvimento de novas estratégias de controle. Esta revisão

aborda informações sobre a etiologia, epizootiologia, patogenia, diagnóstico e controle da

doença, em especial a utilização de probióticos e vacinas como alternativas de controle da

ENA.

Palavras-chave: Enterite Necrótica Aviar, Clostridium perfringens A, probióticos, vacinas.

ABSTRACT

Avian Necrotic Enteritis is an acute enterotoxaemia that appears suddenly producing

rapid deaths, affecting mainly young animals. Although the negative impact of the disease in

poultry production, due to an increase on food conversion and carcass condemnations, is

                                                            1Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Agrícola, Centro de Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Campus Universitário s/n, 96010-900, Pelotas, RS, Brasil. E-mail: [email protected]

2Departamento de Patologia, Fundação Universidade Federal do Rio Grande. 3Faculdade de Veterinária e Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas.

Page 15: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

12

known for years, factors related to etiology, pathogeny and control of this important disease

need better clarifications. For long time its control was based on the use of antibiotics in

poultry feed, whose use was banned by several consumer markets, requiring the development

of new control strategies. Informations on the etiology, epizootiology, pathogeny, diagnosis

and control are reviewed, emphasizing the role of probiotics and vaccines as control

alternatives.

Key words: Avian Necrotic Enteritis, Clostridium perfringens A, probiotics, vaccines.

INTRODUÇÃO

No primeiro trimestre de 2007 a carne de frango ocupou o primeiro lugar na produção

animal no Brasil. Nesse período foi abatido mais de 1 bilhão de frangos, representando mais

de 2 milhões de toneladas de carcaças, sendo comercializados no mercado externo 697,2 mil

toneladas, com um aumento de 14,3% com relação ao mesmo período de 2006 (IBGE, 2007).

Parte dos altos índices de produtividade do setor avícola foi obtida com a utilização de

antibióticos na ração animal. Porém, o marcado incremento da resistência bacteriana,

incluindo o C. perfringens (JOHANSSON et al., 2004; MARTEL et al., 2004), à grande

maioria dos antibióticos, foi relacionado a seu uso indiscriminado como promotores de

crescimento. Além disso, C. perfringens oriundo de frangos de corte também pode ser

transmitido a humanos através da cadeia alimentar (VAN IMMERSEEL et al. 2004), como

foi comprovado por SINGH et al. (2005), que isolaram a bactéria de 70,4% de amostras de

carne de frango obtidas em lojas de varejo na Índia. Esses fatos, entre outros, levaram a União

Européia a banir, a partir de 2006, o uso de antibióticos como promotores de crescimento nas

rações animais (COUNCIL OF EUROPEAN UNION, 2003), comprometendo a eficiência

dos sistemas intensivos de produção animal, sustentada em grande parte na utilização de

antibióticos como promotores de crescimento ou como preventivos de doenças infecciosas.

Page 16: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

13

Uma das doenças mais afetadas por essa medida é a ENA (KALDHUSDAL & LOVLAND,

2002), um problema freqüente (HOFACRE et al., 1998) e economicamente importante

(ENGSTRÖM et al., 2003) em vários países.

A ENA é uma enterotoxemia aguda, que se apresenta em forma clínica ou subclínica

(VAN IMMERSEEL et al., 2004) causada por Clostridium perfringens A e C. Caracteriza-se

por lesões ulcerativas e necrose confluente da mucosa do intestino delgado e debilidade que

se apresenta rapidamente. Afeta principalmente animais jovens, entre duas e cinco semanas de

idade, aparecendo subitamente, geralmente associada à imunossupressão, provocando morte

rápida com elevada prevalência (SCHOCKEN-ITURRINO & ISHI, 2000). Embora os casos

de ENA não sejam reportados às autoridades sanitárias, é conhecido seu impacto negativo na

produção avícola. Estimou-se que nos Estados Unidos o custo dessa doença é de mais de U$

0.05 por animal (VAN DER SLUIS, 2000), podendo provocar prejuízos de até 33% na

produção, principalmente devido ao aumento da conversão alimentar, redução do peso vivo e

aumento na condenação de carcaças devido a Colangio-hepatite (LOVLAND &

KALDHUSDAL, 2001).

O controle e a prevenção da doença foram baseados durante as últimas décadas na

administração de antibióticos na ração, prática comum e necessária para manter e melhorar os

índices de produtividade e competitividade.

ETIOLOGIA

A ENA é causada pelo C. perfringens, bactéria gram positiva, anaeróbia, esporulada e

toxigênica. C. perfringens é classificado em cinco sorotipos em função das toxinas maiores

(HATHEWAY, 1990; PETIT et al., 1999). Os sorotipos A e C, produtores de toxina α e α e β

respectivamente, são considerados os agentes causadores da doença (BABA et al., 1997;

Page 17: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

14

LOVLAND & KALDHUSDAL, 2001), embora a participação de ambos ainda não seja

totalmente esclarecida. ENGSTRÖM et al. (2003) detectaram por PCR o gene codificador da

toxina α (cpa) exclusivamente em 53 isolados oriundos de intestino e fígado de frangos na

Suécia, indicando que todos eles pertenciam ao sorotipo A. NAUERBY et al. (2003)

encontraram o mesmo resultado em 279 isolados de frangos de corte de 25 granjas da

Dinamarca, assim como JOHANSSON et al. (2004) em isolados de frangos de corte, galinhas

poedeiras e perus, de granjas da Suécia e Dinamarca, utilizando testes bioquímicos e PCR

multiplex. HEIKINHEIMO & KORKEALA (2005) analisaram por PCR multiplex 118

isolados de conteúdo intestinal de frangos de corte, e encontraram que todos possuíam o cpa,

mas não os genes codificadores das toxinas β (cpb), ε (etx), ι (iA) e enterotoxina (cpe), que

caracterizam os outros sorotipos de C. perfringens, indicando que todos os isolados

pertenciam ao sorotipo A. Resultados semelhantes foram encontrados por

GHOLAMIANDEKHORDI et al. (2006), sugerindo que o agente causador da ENA é o C.

perfringens sorotipo A.

EPIZOOTIOLOGIA

C. perfringens é um patógeno oportunista (FIORENTIN, 2006) presente no intestino

das aves e no ambiente, inclusive na água (SARTORI et al., 2006). Coloniza o animal nos

primeiros dias de vida, e causa doença principalmente em animais de duas a cinco semanas de

idade. Coccidiose tem sido considerada como um importante fator predisponente da ENA

(VAN IMMERSEEL et al., 2004). CRAVEN et al. (2001a) encontraram as maiores

concentrações da bactéria em fezes de animais com duas e quatro semanas de vida, decaindo

na sexta semana. Isolaram a bactéria de paredes de aviários, ventiladores, comedouros,

bebedouros, armadilhas para insetos e botas de operadores, com maior freqüência na

Page 18: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

15

primavera e verão, demonstrando que a estrutura do aviário e seus equipamentos, assim como

o incubatório, podem ser fontes de infecção de C. perfringens para aves (CRAVEN et al.,

2001b).

Fatores ambientais tais como qualidade da cama, densidade populacional e local de

criação, têm grande importância na multiplicação da bactéria e, conseqüentemente, são

considerados fatores de risco para a ENA. OMEIRA et al. (2006) avaliaram as características

microbiológicas de camas em diferentes sistemas de produção e observaram que poedeiras

(0,25m2/ave) e frangos de corte (0,1m2/ave) em sistema intensivo, apresentaram

concentrações menores de C. perfringens que criações não confinadas (0,33m2/ ave)

sugerindo que animais em contato com o solo ingerem maior número de esporos da bactéria

que animais criados exclusivamente sobre cama em ambiente controlado. McDEVITT et al.

(2006) relacionaram o aumento da incidência de ENA à maior densidade animal, devido ao

aumento da concentração de esporos na cama, associado a sua baixa qualidade (umidade e

altos níveis de compostos nitrogenados), além do risco de dispersão por contato direto ou

aerossol.

Ingredientes da ração também foram relacionados à doença (DEKICH, 1998).

KALDHUSDAL e SKJERVE (1996) comunicaram que o milho atuou como fator de proteção

e, cevada e trigo como fatores de risco para a doença. Observações semelhantes foram feitas

por ANNETT et al. (2002) ao comprovar in vitro que as concentrações da bactéria em meio

tioglicolato contendo sobrenadantes não digeridos de cevada e trigo foram maiores que com

milho, sugerindo que rações a base de cevada e trigo estimulariam a multiplicação do C.

perfringens no trato gastrintestinal das aves.

A concentração e as características das proteínas das rações também foram

consideradas fatores predisponentes da ENA. DREW et al. (2004) comprovaram aumento da

Page 19: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

16

concentração de C. perfringens A no íleo e ceco de galinhas quando a concentração de

proteína crua de farinha de peixe foi incrementada de 230 para 400g kg-1, não ocorrendo o

mesmo em animais alimentados com ração a base de proteína de soja, sugerindo que tanto o

nível de proteína crua quanto à fonte protéica utilizados na composição de rações afetam a

multiplicação de C. perfringens no intestino. DAHIYA et al (2005) relacionaram os efeitos

das concentrações de glicina na ração sobre a população de C. perfringens no intestino e as

lesões de ENA em frangos de 28 dias de idade desafiados com o microrganismo, constatando

que as maiores concentrações da bactéria no ceco foram obtidas com rações contendo de 3,3 a

3,9%, e que as lesões intestinais variavam de grau 0 a 4 nos grupos que receberam 3 e 4% de

glicina.

Insetos também poderiam veicular o agente. DHILLON et al. (2004) reportaram um

surto de ENA em galinhas poedeiras de uma granja recém construída. Constataram a presença

de moscas no conteúdo do papo dos animais mortos e nos comedouros, e isolaram C.

perfringens de macerados de moscas capturadas nos galpões afetados. Os autores sugerem

que o surto foi conseqüência da ingestão do C. perfringens presente nas moscas ou suas

secreções, considerando esses insetos vetores mecânicos na transmissão da bactéria.

VITTORI et al. (2007) isolaram C. perfringens de 100% de 40 amostras de besouros adultos

Alphitobius diaperinus (“Cascudinho”) capturados em granjas avícolas industriais de

Descalvado e Sertãozinho, SP, Brasil, sugerindo que o Cascudinho pode ser um vetor

potencial da veiculação do C. perfringens.

PATOGENIA

A ENA é causada pela ação de toxinas produzidas quando, em condições favoráveis,

há rápida multiplicação de C. perfringens no intestino delgado (SCHOCKEN-ITURRINO &

Page 20: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

17

ISHI, 2000; THOMPSON et al., 2006). As lesões características da ENA são produzidas pela

toxina α (WILLIAMS, 2005), a qual vem sendo associada com a doença (TITBALL et al.,

1999), sendo considerada o principal fator de patogenicidade da bactéria (DAHIYA et al.,

2006; KEYBURN et al., 2006; THOMPSON et al., 2006). A toxina, que destrói a membrana

celular de enterócitos devido a sua propriedade de fosfolipase C (STERNE & BATTY, 1975),

é uma metalofosfolipase que possui dois domínios, o C-terminal, que penetra na membrana

celular sendo responsável pela fixação da proteína na célula, e o N-terminal, que desempenha

a função enzimática propriamente dita e hidrolisa os fosfolipídios das membranas celulares

separando as porções polar e apolar, formando di-acil-glicerol e ácido fosfatídico, provocando

a lise da membrana celular (SAKURAI et al., 2004).

HOFSHAGEN & STENWIG (1992) demonstraram que C. perfringens isolados de

casos de ENA produziram títulos maiores de toxina α que cepas isoladas de animais sadios.

Reforçando o conceito de que esta toxina é o principal fator de patogenicidade na ENA,

HEIER et al. (2001) observaram que lotes de frangos de corte com altos títulos de anticorpos

maternos anti-toxina α apresentaram menores índices de mortalidade que animais com baixos

títulos. Entretanto, a participação da toxina α de C. perfringens na patogênese foi questionada

por KEYBURN et al. (2006), que desafiaram frangos de corte com bactérias cujos genes de

toxina α foram deletados, observando que as lesões eram similares às produzidas pela bactéria

selvagem.

KULKARNI et al. (2006), procurando identificar antígenos exclusivos a cepas

patogênicas de C. perfringens envolvidos na patogênese, identificaram anticorpos contra seis

proteínas (uma de 190 kDa; Piruvato-ferridoxina-oxidoredutase; Fator G; Perfringolisina O;

Gliceraldeido-3-fosfato dehidrogenase e Bifosfato aldolase), em frangos sobreviventes à

agressão, sugerindo sua participação na patogênese da ENA, ainda que os soros desses

animais também possuíssem anticorpos contra a toxina α. THOMPSON et al. (2006), visando

Page 21: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

18

também avaliar a participação de outros antígenos na ENA, compararam as taxas de lesões

produzidas em frangos por cepas de C. perfringens não produtoras e uma cepa produtora de

toxina α, comprovando que não mais de 20% apresentaram lesões nos primeiros frente a

100% nos controles positivo, sugerindo que a toxina desempenha um papel importante na

patogenia da doença.

DIAGNÓSTICO

Em sistemas industriais de produção avícola a identificação da forma sub-clínica da

doença torna-se difícil por não haver testes adequados, ainda que LOVLAND &

KALDHUSDAL (1999) associaram a hepatite por C. perfringens a outras doenças

relacionadas à bactéria, sugerindo que o exame de carcaças no abatedouro poderia auxiliar a

monitorar a ocorrência da ENA. Na forma clínica, porém, é possível fazer o diagnóstico em

função da epidemiologia, frangos de corte com idade de duas a cinco semanas de idade,

intervenção de fatores imunossupressores tais como alterações bruscas de temperatura, falhas

no sistema de arraçoamento, alta densidade populacional, outras doenças, mortalidade alta (de

5 a 15% do lote), curso rápido sem sinais clínicos e alterações patológicas tais como

hiperemia e lesões ulcerativas na mucosa do intestino delgado e cecos, que se apresentam

friáveis, distendidos, com coloração esverdeada escura, fétidos e com gases.

O desenvolvimento de uma ELISA para quantificar toxina α (HALE & STILES,

1999), sugeriu que seria possível diagnosticar as formas clínica e sub-clínica da ENA.

LOVLAND et al. (2003) utilizaram esta técnica para detectar anticorpos anti-toxina α em

frangos de corte, constatando a presença de altos títulos em 59% a 79% dos animais

provenientes de lotes com alta prevalência de lesões hepáticas e intestinais associadas a C.

perfringens, e só em 27% dos animais provenientes de lotes com baixa incidência de lesões.

Page 22: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

19

Resultados similares foram obtidos por McCOURT et al. (2005) mediante a utilização de

ELISA para detectar células de C. perfringens e toxina α em conteúdo intestinal de frangos.

Os testes apresentaram uma sensibilidade entre 102 e 106 UFC mL-1 de cepas isoladas de casos

clínicos, e de 60ng mL-1 de toxina. As soroconversões de animais aparentemente saudáveis

foram inferiores a 4 entanto as dos afetados foram superiores a 10. Ainda que os testes

demonstrassem ser eficientes, o fato que as amostras utilizadas para detecção do antígeno

provinham do conteúdo intestinal, inviabilizando a amostragem de animais vivos, impediu a

aplicação dessa metodologia devido à necessidade de sacrificar uma amostra significativa de

animais do lote, inaceitável na avicultura industrial.

CONTROLE

O controle da ENA foi baseado, nas últimas décadas, na administração de antibióticos

na ração (ENGBERG et al., 2000; BRENNAN et al., 2001; KNARREBORG et al., 2002;

BRENNAN et al., 2003). A interdição de seu uso como promotores de crescimento, decretada

pela União Européia (COUNCIL OF THE EUROPEAN UNION, 2003) lançou o desafio de

criar novas estratégias para controlar a doença. Surgiu então o interesse em avaliar métodos

alternativos tais como o uso de prebióticos (TAKEDA et al., 1995; SILVA & NORNBERG,

2003; MCREYNOLDS et al., 2007), enzimas (JACKSON et al., 2003; ZANG et al., 2006),

alimentos funcionais (MITSCH et al., 2004), probióticos (LA RAGIONE et al., 2004;

BARBOSA et al., 2005; KIZERWETTER-SWIDA & BINEK, 2005) e vacinas. Tanto o setor

industrial quanto o acadêmico tem demonstrado grande interesse no uso dos dois últimos para

o controle da ENA.

Page 23: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

20

Probióticos

Probióticos são suplementos alimentares compostos de microrganismos vivos que

beneficiam a saúde do hospedeiro através do equilíbrio da microbiota intestinal (FULLER,

1989; KAUR et al., 2002). Sua aplicação na indústria avícola vem sendo amplamente

estudada nos últimos anos, tanto para o controle de doenças quanto por seu efeito na

eficiência alimentar (GIL de los SANTOS & GIL-TURNES, 2005).

HOFACRE et al. (1998) observaram que o produto Aviguard®, constituído por flora

polibacteriana de aves, reduziu a incidência de ENA em frangos de corte. LA RAGIONE &

WOODWARD (2003) comprovaram que a administração de esporos viáveis de Bacillus

subtilis a aves livres de patógenos específicos desafiadas com C. perfringens, reduziu o

numero de patógenos no baço, duodeno, cólon e ceco, e relataram resultados similares com

um probiótico de Lactobacillus johnsonii (LA RAGIONE et al., 2004). TEO & TAN (2005),

por sua vez, demonstraram que Bacillus subtilis inibiu o crescimento de C. perfringens em

cultivo associado. HAGHIGHI et al. (2006) demonstraram que um probiótico comercial

contendo Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum, e Streptococcus faecalis

estimulou a produção de IgA anti-toxina α de C. perfringens no intestino de pintos não

vacinados.

Vacinas

Aves que sobreviveram à ENA ficaram imunes, sugerindo que a imunidade pode

controlar a doença (PRESCOTT, 2000). LOVLAND et al. (2004) demonstraram pela primeira

vez que progênies de matrizes imunizadas com um toxóide de C. perfringens A apresentaram

títulos de antitoxinas significativamente superiores aos controles, assim como menor

porcentagem de animais com lesões de ENA. A produção industrial de toxóides de C.

perfringens, porém, é um processo laborioso. A clonagem do gene da toxina α em

Page 24: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

21

Escherichia coli (LESLIE et al., 1989) e a produção de vacinas contendo toxina α

recombinante (WILLIAMSON & TITBALL, 1993; SCHOEPE et al., 2001; STEVENS et al.,

2004; SCHOEPE, 2006) abriram uma nova perspectiva de produção industrial de antígenos

de Clostridium.

KEYBURN et al. (2007) vacinaram animais com a toxina α nativa e com proteínas

recombinantes secretadas de C. perfringens (piruvato-ferridoxina-oxidoredutase;

gliceraldeido-3-fosfato dehidrogenase; frutose 1,6-bifosfato aldolase e uma proteína

hipotética), comprovando que todas as vacinas apresentaram efeito protetor frente a um

desafio moderado, e que, frente a desafio severo, a toxina α apresentou o melhor resultado,

reafirmando sua importância tanto na patogenia do C. perfringens, quanto na imunidade a

esse patógeno. Entretanto, ao tentarem produzir a toxina α recombinante, concluiram que

pareceria ser tóxica para E. coli. Nosso grupo, porém, logrou produzir toxina α recombinante

em E. coli que protegeu camundongos frente a desafio com mais de 10 DL50 de toxina nativa

e induziu soroconversão em pintos vacinados aos 7 dias de idade (GIL de los SANTOS,

2007).

CONCLUSÃO

A avicultura industrial, que durante várias décadas dependeu da utilização de

antibióticos nas rações animais, necessita manter e melhorar os índices de eficiência alimentar

bem como controlar doenças após a proibição de seu uso como promotores de crescimento. O

controle da ENA é considerado um dos maiores desafios para o setor. Entre as alternativas

para consegui-lo, poderão ser utilizados probióticos, que mantém o equilíbrio da microbiota

do trato gastrintestinal de aves, previnem infecções, reduzem condenações de carcaças e a

mortalidade, melhoram a conversão alimentar, o ganho de peso e a qualidade das carcaças,

Page 25: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

22

conservando os índices de produtividade alcançados com a utilização de antimicrobianos, e

vacinas, especialmente as recombinantes, de produção mais simples e controlável que as

tradicionais. Nutrição adequada e o controle de fatores imunossupressores, conjuntamente

com um eficiente programa de biosseguridade, são essências para o êxito do controle da ENA.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANNETT, C.B. et al. Necrotic enteritis: effect of barley, wheat and corn diets on proliferation

of Clostridium perfringens type A. Avian Pathology, v.31, p.599- 602, 2002.

BABA, E. et al. Clostridial population and the intestinal lesions in chickens infected with

Clostridium perfringens and Eimeria necatrix. Veterinary Microbiology, v.54, p.301-308,

1997.

BARBOSA, T.M. et al. Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract.

Applied and Environmental Microbiology, v.71, p.968–978, feb, 2005.

BRENNAN, J. et al. Efficacy of in-feed tylosin phosphate for the treatment of Necrotic

Enteritis in broiler chickens. Poultry Science, v.80, p.1451-1454, 2001.

BRENNAN, J. et al., The efficacy of bacitracin methylene disalicylate when fed in

combination with narasin in the management of Necrotic Enteritis in broiler chickens.

Poultry Science, v.82, p.360-363, 2003.

COUNCIL OF EUROPEAN UNION, 2003. Council Regulation on the authorization of

the additive avilamycin in feedingstuffs. Capturado em 17 out. 2003. Online. Disponível na

Internet: http://register.consilium.eu.int/pdf/en/03/st06/st06120en03.pdf

CRAVEN, S.E. et al. Incidence of Clostridium perfringens in broiler chickens and their

environment during production and processing. Avian Diseases, v.45, n.4, p. 887-896, oct-

dec, 2001a.

Page 26: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

23

CRAVEN, S.E. et al. Prevalence of Clostridium perfringens in commercial broiler hatcheries.

Avian Diseases, v.45, n.4, p.1050-1053, oct-dec, 2001b.

DAHIYA, J.P. et al. Dietary glycine concentration affects intestinal Clostridium perfringens

and Lactobacilli populations in broiler chickens. Poultry Science, v.84, p.1875-1885, 2005.

DAHIYA, J.P. et al. Potential strategies for controlling necrotic enteritis in broiler chickens in

post-antibiotic era. Animal Feed Science and Technology, v.129, p.60-88, 2006.

DEKICH, M.A. broiler industry strategies for control of respiratory and enteric diseases.

Poultry Science, v.77, p.1176-1180, 1998.

DHILLON, A.S. et al. High mortality in egg layers as a result of necrotic enteritis. Avian

Diseases, v.48, n.3, p.675-680, sep, 2004.

DREW, M.D. et al. Effects of dietary protein source and level on intestinal populations of

Clostridium perfringens in broiler chickens. Poultry Science, v.83, n.3, p.414-420, mar,

2004.

ENGBERG, R.M. et al. effect of zinc bacitracin and salinomycin on intestinal microflora and

performance of broilers. Poultry Science, v.79, p.1311-1319, 2000.

ENGSTRÖM, B.E. et al. Molecular typing of isolates of Clostridium perfringens from

healthy and diseased poultry. Veterinary Microbiology, v.94, n.3, p.225-235, jul, 2003.

FIORENTIN, L. Aspectos bacteriológicos da reutilização da cama de aviário. In: V

SEMINÁRIO INTERNACIONAL DE AVES E SUÍNOS – AVESUI, 2005, Florianópolis,

SC. Anais... Itu, SP: GUSSULLI AGRIBUSINESS, v.1, p.113-122, 2006.

FULLER, R. Probiotics in man and animals. Applied Bacteriology, v.66, n.5, p.365-378,

1989.

Page 27: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

24

GHOLAMIANDEKHORDI A.R. et al. Molecular and phenotypical characterization of

Clostridium perfringens isolates from poultry flocks with different disease status. Veterinary

Microbiology, v.113, n.1-2, p.143-152, mar, 2006.

GIL DE LOS SANTOS, J.R. Efeito de probióticos na translocação de Salmonella

enteritidis e na eficiência alimentar de frangos de corte. 2004. 80f. Dissertação (Mestrado

em Veterinária) – Programa de Pós-Graduação em Veterinária, Universidade Federal de

Pelotas.

GIL de los SANTOS, J.R. Construção e avaliação de vacinas de toxina α recombinante de

Clostridium perfringens A. 2007. 82f. Tese (Doutorado em Biotecnologia Agrícola) –

Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Agrícola, Universidade Federal de Pelotas.

GIL de los SANTOS, J.R.; GIL-TURNES, C. Probióticos em avicultura. Ciência Rural,

v.35, n.3, p.741-747, mai-jun, 2005.

GIL de los SANTOS, J.R. et al. Bacillus cereus var. toyoii and Saccharomyces boulardii

increased feed efficiency in broilers infected with Salmonella enteritidis. British Poultry

Science, v.46, n.4, p.494-497, aug, 2005.

HAGHIGHI, H.R. et al. Probiotics stimulate production of natural antibodies in chickens.

Clinical and Vaccine Immunology, v.13, n.9, p.975-980, sep, 2006.

HALE, M.L.; STILES, B.G. Detection of Clostridium perfringens alpha toxin using a capture

antibody ELISA. Toxicon, v.37, n.3, p.471-484, mar, 1999.

HATHEWAY, C.H. Toxigenic Clostridia. Clinical Microbiology Reviews, v.3, n.1, p.66-98,

jan, 1990.

Page 28: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

25

HEIER, B.T. et al. A field study of naturally occurring specific antibodies against Clostridium

perfringens alpha toxin in Norwegian broiler flocks. Avian Diseases, v.45, n.3, p.724-732,

jul-sep, 2001.

HEIKINHEIMO, A. & KORKEALA, H. Multiplex PCR assay for toxinotyping Clostridium

perfringens isolates obtained from Finnish broiler chickens. Letters in Applied

Microbiology, v.40, p.407-411, 2005.

HOFACRE, C.L. et al. Use of Aviguard and Other intestinal bioproducts in experimental

Clostridium perfringens-associated Necrotizing Enteritis in broiler chickens. Avian Diseases,

v.42, p.579-584, 1998.

HOFSHAGEN, M.; STENWIG, H. Toxin production by Clostridium perfringens isolated

from broiler chickens and capercaillies (Tetrao urogallus) with and without Necrotizing

Enteritis. Avian Diseases, v.36, n.4, p.837-843, oct-dec, 1992.

IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Capturado em 01 set. 2007. Online.

Disponível na Internet: http://www.ibge.gov.br

JACKSON, M.E. et al. Beneficial effect of beta-mannanase feed enzyme on performance of

chicks challenged with Eimerla sp. and Clostridium perfringens. Avian Diseases, v.47, n.3,

p.759-63, jul-sep, 2003.

JOHANSSON, A. et al. Antimicrobial susceptibility of Swedish, Norwegian and Danish

isolates of Clostridium perfringens from poultry, and distribution of tetracycline resistance

genes. Veterinary Microbiology, v.99, p.251-257, 2004.

KALDHUSDAL, M.; LOVLAND, A. Clostridial Necrotic Enteritis and Cholangiohepatitis -

“Biography”. In: THE ELANCO GLOBAL ENTERITIS SYMPOSIUM, Cambridge, UK.

Page 29: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

26

Anais... p. G3-G13, 2002. Capturado em 8 dez. 2003. Online. Disponível na Internet:

http://www.poultry-health.com/fora/inthelth/kaldhusdal02.pdf

KALDHUSDAL, M. & SKJERVE, E. Association between cereal contents in the diet and

incidence of necrotic enteritis in broiler chickens in Norway. Preventive Veterinary

Medicine, v.28, p.1-16, 1996.

KALDHUSDAL, M. Maintaining gut health in meat-type poultry without antibacterial

growth promoters and ionophores. In: 14TH EUROPEAN SYMPOSIUM ON POULTRY

NUTRITION, Lillehammer, Norway. Anais... p.151-157, 2003. Capturado em 8 dez. 2003.

Online. disponível na Internet: http://www-afac.slu.se/WPSA%20Lillehammer%20Magne.pdf

KAUR, I.P. et al. Probiotics: potential pharmaceutical applications. European Journal of

Pharmaceutical Sciences, v.15, p.1-9, 2002.

KEYBURN, A.L. et al. Alpha-toxin of Clostridium perfringens is not an essential virulence

factor in Necrotic Enteritis in chickens. Infection and Immunity, v.74, n.11, p.6496-6500,

nov, 2006.

KIZERWETTER-SWIDA, M.; BINEK, M. Selection of potentially probiotic Lactobacillus

strains towards their inhibitory activity against poultry enteropathogenic bacteria. Polish

Journal of Microbiology, v.54, n.4, p.287-94, 2005.

KNARREBORG, A. et al. Effects of dietary fat source and subtherapeutic levels of antibiotic

on the bacterial community in the ileum of broiler chickens at various ages. Applied and

Environmental Microbiology, v.68, n. 12, p.5918-5924, dec, 2002.

KULKARNI, R.R. et al. Clostridium perfringens antigens recognized by broiler chickens

immune to Necrotic Enteritis. Clinical and Vaccine Immunology, v.13, n.12, p.1358-1362,

dec, 2006.

Page 30: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

27

KULKARNI, R.R. et al. Immunization of broiler chickens against Clostridium perfringens-

induced necrotic enteritis. Clinical and Vaccine Immunology, in press, 2007.

doi:10.1128/CVI.00162. Capturado em 8 ago. 2007. Online. Disponível na Internet:

http://cvi.asm.org/cgi/reprint/CVI.00162-07v1.pdf

LA RAGIONE, R.M.; WOODWARD, M.J. Competitive exclusion by Bacillus subtilis spores

of Salmonella enterica serotype Enteritidis and Clostridium perfringens in young chickens.

Veterinary Microbiology, v.94, n.3, p.245-256, 2003.

LA RAGIONE, R.M. et al. In vivo characterization of Lactobacillus johnsonii FI9785 for use

as a defined competitive exclusion agent against bacterial pathogens in poultry. Letters in

Applied Microbiology, v.38, p.197-205, 2004.

LESLIE, D. et al. Phospholipase C and haemolytic activities of Clostridium perfringens

alpha-toxin cloned in Escherichia coli: sequence and homology with a Bacillus cereus

phospholipase C. Molecular Microbiology, v.3, n.3, p.383-392, 1989.

LOVLAND, A.; KALDHUSDAL, M. Liver lesions seen at slaughter as an indicator of

Necrotic enteritis in broiler flocks. FEMS Immunology and Medical Microbiology,

v.24, n.3, p.345-351, jul, 1999.

LOVLAND, A.; KALDHUSDAL, M. Severely impaired production performance in broiler

flocks with high incidence of Clostridium perfringens-associated hepatitis. Avian Pathology,

v.30, p.73-81, 2001.

LOVLAND, A. et al. Diagnosing Clostridium perfringens-associated necrotic enteritis in

broiler flocks by an immunoglobulin G anti-alpha-toxin enzyme-linked immunosorbent assay.

Avian Pathology, v.32, n.5, p.527-534, oct, 2003.

Page 31: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

28

LOVLAND, A. et al. Maternal vaccination against subclinical necrotic enteritis in broilers.

Avian Pathology, v.33, n.1, p.83-92, feb, 2004.

MARTEL, A. et al. Susceptibility of Clostridium perfringens strains from broiler chickens to

antibiotics and anticoccidials. Avian Pathology, v.33, n.1, p.3-7, feb, 2004.

McCOURT, M.T. et al. Sandwich ELISA detection of Clostridium perfringens cells and α-

toxin from field cases of necrotic enteritis of poultry. Veterinary Microbiology, v.106, n.3-4,

p.259-264, apr, 2005.

McDEVITT R.M. et al. Necrotic enteritis; a continuing challenge for the poultry industry.

World’s Poultry Science Journal, v.62, jun, 2006.

McREYNOLDS, J.L. et al. Dietary lactose and its effect on the disease condition of Necrotic

Enteritis. Poultry Science, v.86, n.8, p.1656-1661, 2007.

MITSCH, P. et al. The effect of two different blends of essential oil components on the

proliferation of Clostridium perfringens in the intestines of broiler chickens. Poultry Science,

v.83, p.669-675, 2004.

NAUERBY, B. et al. Analysis by pulsed-field gel electrophoresis of the genetic diversity

among Clostridium perfringens isolates from chickens. Veterinary Microbiology, v.94, n.3,

p.257-266, jul., 2003.

NILO, L. Clostridium perfringens in animal disease: A review of current knowledge. The

Canadian Veterinary Journal, v.21, n.5, p.141-148, may, 1980.

OMEIRA, N. et al. Microbiological and chemical properties of litter from different chicken

types and production systems. Science of the Total Environment, v.367, p.156-162, 2006.

Page 32: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

29

PETIT, L. et al. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology,

v.7, n.3, p.104-110, mar, 1999.

PHILLIPS, R. The antibiotic-probiotic dance: role in food safety. In: 13TH WESTERN

MEETING OF POULTRY CLINICIANS AND PATHOLOGISTS. Anais... 2002. Capturado

em 27 jan. 2004. Online. Disponível na Internet:

http://www.westvet.com/Antibiotic%20Probiotic%20Dance.htm

PRESCOTT, J. Vaccine-based control of Necrotic Enteritis of broiler chickens. Ministry of

Agriculture and Food, Ottawa, Canada. Capturado em 23 jan. 2004. Online. Disponível na

Internet: http://www.omaf.gov.on.ca/english/livestock/poultry/facts/necrente.htm

SAKURAI, J. et al. Clostridium perfringens alpha-toxin: Characterization and mode of

action. Journal of Biochemistry, v.136, n.5, p.569-574, 2004.

SARTORI, D.P. et al. Evaluation of acid phosphatase as a confirmation test for Clostridium

perfringens isolated from water. Letters in Applied Microbiology, v.42, n.4, p.418-424,

2006.

SCHOCKEN-ITURRINO, R.P; ISHI, M. Clostridioses em aves. In: BERCHIERI Jr, A.,

MACARI, M. Doenças das aves. Campinas: Facta, 2000. Cap. 4.6, p.242-243.

SCHOEPE, H. et al. Naturally occurring clostridium perfringens nontoxic alpha-toxin variant

as a potential vaccine candidate against alpha-toxin-associated diseases. Infection and

Immunity, v.69, n.11, p. 7194–7196, nov, 2001.

SCHOEPE, H. et al. Immunization with an alphatoxin variant 121A/91-R212H protects mice

against Clostridium perfringens alphatoxin. Anaerobe, v.12, p. 44–48, 2006.

Page 33: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

30

SESTI, L. "Doenças Avícolas" - Qual é a mais preocupante? Avisite especial, 2002.

Capturado em 23 jan. 2004. Online. Disponível na Internet:

http://www.avisite.com.br/reportagem/saude_avicola/default2.asp

SILVA, L.P.; NORNBERG, J.L. Prebióticos na nutrição de não ruminantes. Ciência Rural,

v.33, n.5, p.983-990, set-out, 2003.

SINGH R.V. et al. Studies on occurrence and characterization of Clostridium perfringens

from select meat. Journal of Food Safety, v.25, p.146-156, 2005.

STERNE, M.; BATTY, I. Pathogenic clostridia. London: Butterworths, 1975. 144p.

STEVENS, D.L. et al. Immunization with the C-domain of α-toxin prevents lethal infection,

localizes tissue injury, and promotes host response to challenge with Clostridium perfringens.

Journal of Infectious Diseases, v.190, p.767-773, 2004.

TAKEDA, T. et al. The effects of dietary lactose and rye on cecal colonization of Clostridium

perfringens in chicks. Avian Diseases, v.39, n.2, p.375-381, apr-jun, 1995.

TEO, A.Y.L.; TAN, H.M. Inhibition of Clostridium perfringens by a novel strain of bacillus

subtilis isolated from the gastrointestinal tracts of healthy chickens. Applied and

Environmental Microbiology, v.71, n.8, p.4185-4190, aug, 2005.

THOMPSON, D.R. et al. Live attenuated vaccine-based control of necrotic enteritis of broiler

chickens. Veterinary Microbiology, v.113, n.1-2, p.25-34, mar, 2006.

TITBALL, R.W. et al. The Clostridium perfringens α-toxin. Anaerobe, v.5, p.51-64, 1999.

VAN DER SLUIS, W. Clostridial enteritis is an often underestimated problem. World

Poultry, v.16, n.7, p.42-43, 2000.

Page 34: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

31

VAN IMMERSEEL et al. Clostridium perfringens in poultry: An emerging threat for animal

and public health. Avian Pathology, v.33, n.6, p.537-549, dec, 2004.

VITTORI, J. et al. Alphitobius diaperinus como veiculador de Clostridium perfringens em

granjas avícolas do interior paulista – Brasil. Ciência Rural, v.37, n.3, p.894-896, mai-jun,

2007.

WILKIE, D.C. et al. The effect of hen-egg antibodies on Clostridium perfringens colonization

in the gastrointestinal tract of broiler chickens. Preventive Veterinary Medicine, v.74, n.4,

p.279-292, 2006.

WILLIAMS, R.B. Intercurrent coccidiosis and necrotic enteritis of chickens: rational,

integrated disease management by maintenance of gut integrity. Avian Pathology, v.34, n.3,

p.159-180, jun, 2005.

WILLIAMSON, E.D.; TITBALL, R.W. A genetically engineered vaccine against the alpha-

toxin of Clostridium perfringens protects mice against experimental gas gangrene. Vaccine,

v.11, n.12, p.1253-1258, sep, 1993.

ZANG, G. et al. In vitro inhibitory effect of hen egg white lysozyme on Clostridium

perfringens type A associated with broiler necrotic enteritis and its α-toxin production.

Letters in Applied Microbiology, v.42, n.2, p.138-143, 2006.

Page 35: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

32

3 ARTIGO 2

EVALUATION OF Clostridium perfringens RECOMBINANT α TOXIN

VACCINES IN MICE

(Artigo a ser submetido à Vaccine)

Page 36: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

33

Evaluation of Clostridium perfringens recombinant α toxin vaccines

in mice

João Rodrigo Gil de los Santosa, Fabricio Rochedo Conceiçãob*, Carlos Gil-Turnesc

aCentro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, Brazil.

bDepartamento de Patologia, Fundação Universidade Federal do Rio Grande, Brazil.

cFaculdade de Veterinária e Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, Brazil.

*Corresponding author: Fundação Universidade Federal do Rio Grande, Departamento de Patologia.

Rua General Osório s/n, FURG - Campus Saúde, Centro, 96200-190, Rio Grande-RS, Brazil. E-mail:

[email protected]. Phone: + 55 53 32330318.

Summary

Clostridium perfringens serotype A is the etiological agent of Avian Necrotic

Enteritis and immunization is one of the most promising alternatives for its control.

Vaccines of C. perfringens recombinant α toxin (rAT) were tested in mice and

compared with a vaccine prepared with standard toxin (sT). Mice were vaccinated at

8 and 11 weeks of age, and their antibodies measured by ELISA. Vaccinated animals

and controls were challenged with 10 LD50 of sT. Western blots showed that rAT

reacted with antibodies elicited by sT and vice-versa. In the potency test rAT+Al(OH)3

was as effective as sT, while the vaccines containing recombinant subunit B of the

Escherichia coli heat-labile enterotoxin (rLTB) as adjuvant showed a dose/protection

relationship, and the chimera did not protect. The recombinant α toxin vaccine is a

candidate to control of Avian Necrotic Enteritis.

Page 37: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

34

Key words: Avian Necrotic Enteritis, Clostridium perfringens serotype A,

recombinant vaccines.

1. Introduction

Clostridium perfringens serotype A, one of the five serotypes of the species, is

the etiological agent of gas gangrene in humans and animals, Avian Necrotic

Enteritis (NE) and food poisoning in humans [1], diseases that are successfully

controlled by several antibiotics used therapeutically or prophylactically. The disease

produces high mortality in chicken 2 to 5 weeks old [7], and a reduction in

productivity in older animals estimated in more than U$ 0.05 per animal in the USA

[8], with losses of 33% on the production due mainly to decrease in live weight and

increase in feed conversion and carcass condemnation [9]. Since its discovery [2] it

was controled adding antibiotics to poultry feed, but since 2006 the European Union

[3] banned their use as feed additives, bringing a new challenge to poultry industry

[4, 5, 6].

Various alternatives to NE control were studied all around the world. Although

animals that survived the disease developed immunity [10], there are not effective

vaccines commercially available [11]. C. perfringens serotype A produces the major

antigen α toxin that is lethal for mice, dermonecrotic and has phospholipase and

hemolytic properties, and the minor antigens leucocidin, fibrinolysin and

hyaluronidase, among others [12]. Several vaccines based on native or recombinant

C. perfringens α toxin were tested with variable results. Cloning of α toxin in

Escherichia coli [13] and the development of recombinant α toxin vaccines for other

purposes [14,15,16], stimulated researchers to use this technology in the production

of candidate NE vaccines. In order to induce protective immunity, clostridial vaccines

Page 38: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

35

need adjuvants such as aluminum hydroxide, alum or the recently developed

recombinant subunit B of the E. coli heat-labile enterotoxin (rLTB), that proved to be

an efficient mucosal adjuvant stimulating systemic and secretory antibody responses

[17, 18].

The objective of this work was to produce and evaluate vaccines based on

recombinant C. perfringens α toxin to be used in NE control.

2. Material and Methods

2.1. Bacterial strains, culture conditions and DNA extraction

A strain of C. perfringens isolated from a NE field case was grown in Cooked

Meat Medium (CMM) overnight at 37ºC. Genomic DNA was extracted by methods

described by Sambrook and Russel [19]. E. coli Top10F (Invitrogen) was used for

cloning procedures and E. coli BL21 DE3 pLYS (Invitrogen) used for expression of

the recombinant proteins. These strains were grown at 37ºC in Luria-Bertani (LB)

medium with 150 µg mL-1 of ampicilin.

2.2. Cloning, expression and purification of the recombinant proteins

To obtain recombinant α toxin (rAT) and recombinant LTB (rLTB) the α toxin

and LTB genes were amplified by PCR and the products cloned into vector pAE [20],

generating the pAE/AT and pAE/LTB plasmids, respectively. To obtain recombinant

chimeric protein containing the α toxin fused to rLTB (rLTB-AT), the α toxin gene was

cloned in frame with the C-terminal region of the LTB gene into pAE/LTB, generating

Page 39: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

36

the pAE/LTB-AT plasmid. All cloning procedures were carried out according to

standard procedures [19]. The expression of the recombinant proteins by E. coli

BL21 DE3 pLYS was induced with 0.4 mM of Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside

(IPTG), during 3 h, after the absorbance at 600 nm reached 0.6-0.8. Pellets of the

cultures were obtained by centrifugation at 6000×g for 10 min at 4°C, suspended in

lysis buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 15 mM Imidazole and 1 mg mL-1 of

lysozyme) and sonicated. After centrifugation at 10000×g for 30 min at 4°C, the

supernatants were purified by affinity chromatography in a nickel-charged Sepharose

column using the ÄKTAprime chromatography system (GE Healthcare,

Buckinghamshire, UK) following manufacturer’s instructions. The eluted solutions of

purified recombinant proteins were dialyzed overnight in PBS pH 7.4, concentrated

with sugar, quantified with the BCATM Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA)

following manufacturer’s instructions and the purity was assessed by SDS-PAGE.

2.3. Characterization of recombinant proteins

The denaturated purified recombinant proteins were separated in a 12% SDS-

PAGE and electrotransferred to a 0.45 µm nitrocellulose membrane (Hybond-C

Extra, Amersham Biosciences UK Ltd., Buckinghamshire, UK). After transfer the

membrane was blocked for 1 h with 5% non fat dry milk and incubated by another

hour with 1:2000 peroxidase conjugated anti-6×His MAb (Sigma-Aldrich), 1:2000

rabbit IgG anti-CT (Sigma-Aldrich) or 1:200 anti-α toxin mouse polyclonal serum

produced with C. perfringens phospholipase C type I (sT) (Product Nº P7633, Sigma-

Aldrich Inc., St. Louis, USA). Goat anti-rabbit peroxidase conjugated antibodies

(Sigma) or goat anti-mouse polyvalent immunoglobulins peroxidase conjugate

Page 40: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

37

(Sigma) (1:2000) were used as reposted. The immunoreactive protein bands were

visualized with DAB-chromogen substrate (9 mL Tris-HCl 50 mM, 1 mL nickel

sulphate 0.3%, 10 µL of 30% hydrogen peroxide and 6 mg 3.3-diaminobenzidine

tetrahydrochloride). Blue Step Low Range Protein Marker (Amresco Inc., OH, USA)

was used as molecular mass standard.

The lecithovitelinase and dermonecrotic activity of rAT were evaluated by the

method described by Sterne and Batty [21].

2.4. Vaccines and immunization

Isogenic Balb-c male mice were divided in 11 groups of 4 animals each. The

animals received feed and water ad libitum. The proteins and doses injected to the

groups are shown in table 1. The animals were injected twice with an interval of 21

days, intramuscularly, being the first dose at 8 weeks of age.

Page 41: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

38

Table 1: Vaccines and doses of each group.

Groups Protein Adjuvant Dose (µg)

1 sT Al(OH)3 25

2 sT Al(OH)3 50

3 sT rLTB 25

4 sT rLTB 50

5 rAT Al(OH) 3 25

6 rAT Al(OH) 3 50

7 rAT rLTB 25

8 rAT rLTB 50

9 rLTB-AT None 25

10 rLTB-AT None 50

Control --- --- ---

The doses of rLTB-AT were adjusted to obtain 25 and 50 µg rAT. The dose of

rLTB (7.3 µg) was the correspondent to the rLTB-AT.

2.5. Antibody response

Serum from each animal was obtained at days 0, 21, 35 and 49 days after the

first dose of vaccine (av). Antibody titers were evaluated by an Enzyme Linked

Immuno-Sorbent Assay (ELISA). Polystyrene microtiter plates (CRAL Artigos para

Page 42: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

39

Laboratórios Ltda, Cotia, SP, Brazil) were coated with 0.5 µg of sT or rAT suspended

in carbonate-bicarbonate buffer pH 9.6, incubated overnight at 4ºC. Mouse sera

diluted 1:50 were added in duplicate to the wells and incubated for 1.5 h at 37ºC.

After washing with PBS-T, goat anti-mouse polyvalent immunoglobulins peroxidase

conjugate (Sigma-Aldrich) (1:2000) was added and incubated for 1.5 h at 37ºC. After

washing with PBS-T, OPD-chromogen substrate (1 mL Phosphate-citrate Buffer pH

4.0, 1 µL 30% hydrogen peroxide, 0.4 mg ortophenyle diamine). Absorbancies were

measured in an ELISA spectrophotometer at 492nm (Dynatech MR 700). Titres are

expressed as seroconversions, dividing the mean of the respectives absorbencies by

that of the same group at the day of the first vaccination.

The denaturated sT was separated in a 12% SDS-PAGE and

electrotransferred to a 0.45 µm nitrocellulose membrane (Hybond-C Extra,

Amersham Biosciences UK Ltd., Buckinghamshire, UK). After transfer the membrane

was blocked by 1 h with 5% non fat dry milk and incubated by another hour with

1:200 anti-α toxin mouse polyclonal serum produced with sT, rAT and rLTB-AT. Goat

anti-mouse polyvalent immunoglobulins peroxidase conjugate (Sigma) (1:2000) were

used as regarded. The immunoreactive protein bands were visualized with DAB-

chromogen substrate (9 mL Tris-HCl 50 mM, 1 mL nickel sulphate 0.3%, 10 µL of

30% hydrogen peroxide and 6 mg 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride).

2.6. Potency test

Vaccinated mice were challenged by the intra-venous route (iv) with 10 LD50 of

sT, in accordance with the requirements for provisional licensing of C. perfringens α

toxin vaccines of the United States Department of Agriculture [22]. LD50 of sT and rAT

Page 43: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

40

were determined in Balb-c mice of the same age, inoculated by the iv or

intraperitoneal (ip) routes with decimal dilutions of the respective toxin, and

calculated by the Reed & Muench method.

2.7 Statistical analysis

The significance of the differences of absorbancies means was estimated by

ANOVA using the Statistix software 8 version (Analytical Software, Tallahassee, FL,

USA).

3. Results

3.1. Cloning, expression and purification of the recombinant proteins

All the recombinant proteins were successfully produced in E. coli (Figure 1).

The molecular mass of the constructs were 13.8, 43.7 and 56.5 kDa for the rLTB, rAT

and rLTB-AT, respectively.

Figure 1: 12% SDS-PAGE of rLTB, rAT and rLTB-AT. M, Blue Step Low Range

Protein Marker; 1, rTLB; 2, rAT; 3, rLTB-AT.

120 ―94 ―

47 ―

37 ―

28 ―

19 ―

M 1 2 3 kDa

Page 44: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

41

3.2. Properties of rAT

The sequence of rAT showed an identity of 99% or more with C. perfringens α

toxin gene of 100 references (GenBank). The molecular mass of the construct was

43.7 kDa. rAT showed phospholipase and dermonecrotic properties. Mouse LD50 of

sT was 10.4 µg and 22.4 µg (corresponding to 298 µg kg-1 and 628 µg kg-1 of live

weight) when inoculated by the iv or ip routes, respectively, and that of the

recombinant protein was 21.4 µg by the iv route (corresponding to 610 µg kg-1 of live

weight).

3.3. Immune response and potency test

Twenty four h after the first dose of vaccine, 75% of the animals of groups 2

and 3 and 100% of group 4, died. Seroconversions and protection indices in mice 49

days after the first dose of vaccine are shown in table 2. Antibodies elicited by sT

vaccine reacted with rAT and rLTB-AT (Figure 2) and antibodies elicited by rAT and

rLTB-AT vaccines, reacted with sT (Figure 3).

Page 45: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

42

Table 2: Seroconversion of mice 49 days after the first dose of vaccine, determined

by ELISA with sT or rAT and protection indices.

Groups Seroconversion*

sT / rAT

Protection

(%)

sT+Al(OH) 3 25 µg 5.2a / 3.5ab 100

rAT+Al(OH)3 25 µg 3.2ab / 2.4a 100

rAT+Al(OH)3 50 µg 1.5ab / 2.7a 100

rAT+rLTB 25 µg 2.0bc / 3.5a 33

rAT+rLTB 50 µg 1.5b / 2.3ab 50

rLTB-AT 25 µg 1.4cd / 2.6b 0

rLTB-AT 50 µg 1.1bc / 1.7ab 0

Control 1.4d / 1.0c 0

*same letters in the same column mean no significant differences of the

absorbencies at α=0.05.

Page 46: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

43

Figure 2: Western blot of pool of group 1 sera against sT, rAT and rLTB-AT. M, Blue

Step Low Range Protein Marker; 1, sT; 2, rAT; 3, rLTB-AT; 4, rLTB; 5, 6xHis

recombinant protein (negative control).

Figure 3: Western blot of sera of vaccinated groups against sT. M, Blue Step Low

Range Protein Marker; 1, vaccine 1, 0 av; 2, vaccine 1, 49 av; 3, vaccine 5, 0 av; 4,

vaccine 5, 49 av; 5, vaccine 7, 0 av; 6, vaccine 7, 49 av; 7, vaccine 9, 0 av; 8,

vaccine 9, 49 av.

At day 49 the higher seroconversions against rAT were those of groups 1

(sT+Al(OH)3) and 7 (25 µg of rAT+rLTB), followed by groups 5 and 6 (rAT+Al(OH)3)

and 9 (25µg Chimera) (Figure 4). Using sT as antigen in ELISA, the higher

seroconversions were those produced by vaccine 1 followed by vaccines 5 and 6

(Figure 5). Excluding both groups vaccinated with rAT+Al(OH)3, where a booster

M 1 2 3 4 5kDa

M 1 2 3 4 5 6 7 8kDa

120 ―

94 ―

47 ―

120 ― 94 ―

47 ―

37 ―

28 ―

19 ―

37 ―

Page 47: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

44

effect was not produced, in the other groups the booster effect of the second dose

almost doubled the seroconversions.

Mice vaccinated with native or recombinant toxin using Al(OH)3 as adjuvant,

resisted a challenge of 10 LD50 of sT. Animals vaccinated with rAT co-administered

with LTB showed a dose/protection relationship, as shown by 50% protection of the

animals inoculated with 50 µg of antigen and 33% by those inoculated with 25 µg

(Table 2).

 

0123456

0 21 35 49

Days

Ser

ocon

vers

ion

Control sT+Al(OH)3 25 µg rAT+Al(OH)3 25 µgrAT+Al(OH)3 50 µg rAT+rLTB 25 µg rAT+rLTB 50 µgrLTB-AT 25 µg rLTB-AT 50 µg

 

Figure 4: Seroconversions of mice determined with rAT.

 

Page 48: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

45

0123456

0 21 35 49

Days

Sero

conv

ersi

on

Control sT+Al(OH)3 25 µg rAT+Al(OH)3 25 µgrAT+Al(OH)3 50 µg rAT+rLTB 25 µg rAT+rLTB 50 µgrLTB-AT 25 µg rLTB-AT 50 µg

 

Figure 5: Seroconversion of mice determined with sT.

4. Discussion

Since the description of NE by Parish [2], the development of efficient control

measures were intended by several researchers. The use of antibiotics as feed

additives proved to be the more reliable control measure of those tested, but this

practice was questioned for the first time by the Swann Committee [23], that called

attention on the risks it could have for both human and animal populations. Recently,

the European Community [3] banned the use of antibiotics in animal feeds, and

several other countries shall adopt the same restriction in the near future, challenging

the productivity of poultry industry.

Heier et al. [24] reported that flocks with high titres of maternal antibodies

against α toxin had lower mortality during the production period than flocks with low

titres. However, until 2004, when Lovland et al. [25] showed that a C. perfringens A

toxoid adjuvanted with Al(OH)3 induced significant levels of antibodies in breeders

Page 49: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

46

that could suggest a protective effect on their progeny, there were no effective

vaccines to control the disease.

Kulkarni et al. [11] reported that an immunization scheme for breeders using

two doses of C. perfringens α toxoid followed by a booster of active toxin, protected

broilers against a severe challenge. The authors used a toxoided version of a

commercially available toxin, and reported that they were not able to obtain

recombinant toxin because the toxin seemed to be toxic for transformed E. coli,

impairing its production by this technology.

The industrial production of C. perfringens α toxin is a laborious process.

Cloning the gene in Escherichia coli [13] and the production of vaccines with

recombinant toxins [14, 15, 16, 26] opened a new perspective to overcome the

difficulties of obtaining this antigen from Clostridium cultures.

We cloned C. perfringens α toxin in E. coli and obtained yields of at least 1475

mouse protecting doses per L from transformed cultures. The recombinant toxin

preserved the lecithinase and dermonecrotic properties of the native toxin. The LD50

of the recombinant toxin was at least twice that of the standard toxin and was

innocuous for mice injected with twice the quantity of standard toxin that killed 100%

of the animals. Western blots of sera from animals vaccinated with the recombinant

toxin reacted with the standard toxin; on the other hand, sera from animals

vaccinated with the standard toxin reacted with the recombinant toxin, showing

antigenic homology between both.

Our results showed the effect of different adjuvants in protection. Mice

vaccinated with Al(OH)3 adjuvanted toxin survived the severe challenge prescribed

by the USDA [22], but when it was co-administered with E. coli LTB was not as

Page 50: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

47

effective, showing a relationship between protection and antigen dose. A chimeric

protein containing the α toxin fused with LTB did not protect mice.

Due to the difficulties in reproducing NE experimentally, potency tests consider

the possibility to license provisionally vaccines that elicit antitoxins. The USDA [22]

considers that a vaccine that induces an antitoxin response of at least 4 IU of

antitoxin may be licensed provisionally, and if it does not reach that threshold it may

be licensed if more than 80% of the vaccinated animals survive a challenge of 10

LD50 that kills at least 80% of the controls. The vaccines containing 25 and 50 µg of

our recombinant α toxin adjuvanted with aluminum hydroxide protected mice

challenged by the iv route with 10 LD50 of standard toxin, attaining this requirements

and being candidates to be subjected to field trials.

Acknowledgements

This research was financed by CNPq grant Nº 474509/2004-4 and FAPERGS grant

Nº 05.2329.9. Luciano Pinto did the sequencing; Rodrigo C. Cunha and Alceu G. dos

Santos Jr. assisted in the experiments with animals.

5. References

[1] Roberts DS. Clostridial Diseases. In: Stableforth AW, Galloway IA, editors.

Infectious Diseases of Animals. Diseases due to Bacteria. London, Butterworths

Scientific Publications, 1959.

Page 51: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

48

[2] Parish WE. Necrotic enteritis in the fowl (Gallus gallus domesticus). 1.

Histopathology of the disease and isolation of a strain of Clostridium welchii. Journal

of Comparative Pathology 1961;71:377-393.

[3] Council of European Union. Council Regulation on the authorization of the

additive avilamycin in feedingstuffs. 2003. Accessed on 17 october 2003. Online:

http://register.consilium.eu.int/pdf/en/03/st06/st06120en03.pdf

[4] Sesti L. "Doenças Avícolas" - Qual é a mais preocupante? Avisite especial 2002.

Accessed in 23 january 2004. Online:

http://www.avisite.com.br/reportagem/saude_avicola/default2.asp

[5] Phillips R. The Antibiotic-Probiotic Dance: Role in Food Safety. In: 13TH Western

Meeting of Poultry Clinicians and Pathologists. Proceedings 2002. Accessed in 27

january 2004. Online:

http://www.westvet.com/Antibiotic%20Probiotic%20Dance.htm

[6] Kaldhusdal M. Maintaining gut health in meat-type poultry without antibacterial

growth promoters and ionophores. In: 14th European Symposium on Poultry

Nutrition, Lillehammer, Norway. Proceedings 2003: 151-157, 2003. Accessed in 8

december 2004. Online:

http://www-afac.slu.se/WPSA%20Lillehammer%20Magne.pdf

[7] Schocken-Iturrino RP, Ishi M. Clostridioses em aves. In: Berchieri Jr A, Macari M.

Doenças das aves. Campinas, Facta, 2000:242-243.

[8] Van der Sluis W. Clostridial enteritis is an often underestimated problem. World

Poultry 2000;16(7):42-43.

Page 52: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

49

[9] Lovland A, Kaldhusdal M. Severely impaired production performance in broiler

flocks with high incidence of Clostridium perfringens-associated hepatitis. Avian

Pathology 2001;30:73-81.

[10] Prescott J. Vaccine-Based Control of Necrotic Enteritis of Broiler Chickens.

Ministry of Agriculture and Food, Ottawa, Canada, 2000. Accessed in 23 january

2004. Online:

http://www.omaf.gov.on.ca/english/livestock/poultry/facts/necrente.htm

[11] Kulkarni RR, Parreira VR, Sharif S, Prescott, JF. Immunization of broiler

chickens against Clostridium perfringens-induced necrotic enteritis. Clinical and

Vaccine Immunology 2007. Published online ahead of print on 18 july 2007.

doi:10.1128/CVI.00162. Accessed in 23 january 2004. Online:

http://cvi.asm.org/cgi/reprint/CVI.00162-07v1.pdf

[12] Sterne M, Warrack GH. The types of Clostridium perfringens. Journal of

Pathology and Bacteriology 1964;89:279-283.

[13] Leslie D, Fairweather N, Pickard D, Dougan G, Kehoe M. Phospholipase C and

haemolytic activities of Clostridium perfringens alpha-toxin cloned in Escherichia coli:

sequence and homology with a Bacillus cereus phospholipase C. Molecular

Microbiology 1989;3(3):383-392.

[14] Williamson ED, Titball RW. A genetically engineered vaccine against the alpha-

toxin of Clostridium perfringens protects mice against experimental gas gangrene.

Vaccine 1993;11(12):1253-1258.

[15] Schoepe H, Pache C, Neubauer A, Potschka H, Schlapp T, Wieler LH, et al.

Naturally Occurring Clostridium perfringens Nontoxic Alpha-Toxin Variant as a

Page 53: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

50

Potential Vaccine Candidate against Alpha-Toxin-Associated Diseases. Infection and

Immunity 2001;69(11)7194-7196.

[16] Stevens DL, Titball RW, Jepson M, Bayer CR, Hayes-Schroer SM, Bryant AE.

Immunization with the C-domain of α-toxin prevents lethal infection, localizes tissue

injury, and promotes host response to challenge with Clostridium perfringens. Journal

of Infectious Diseases 2004;190:767-773.

[17] Verweij WR, Haan L, Holtrop M, Agsteribbe E, Brandst R, van Scharrenburg

GJM, Wilschut J. Mucosal immunoadjuvant activity of recombinant Escherichia coli

heat-labile enterotoxin and its B subunit: Induction of sistemic IgG and secretory IgA

responses in mice by intranasal immunization with influenza virus surface antigen.

Vaccine 1998;16:3476-3482.

[18] Conceição FR, Moreira AN, Dellagostin OA. A recombinant chimera composed

of R1 repeat region of Mycoplasma hyopneumoniae P97 adhesin with Escherichia

coli heat-labile enterotoxin B subunit elicits immune response in mice. Vaccine

2006;24(29-30):5734-5743.

[19] Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a Laboratory Manual, Third Edition,

New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

[20] Ramos CR, Abreu PA, Nascimento AL, Ho PL. A high-copy T7 Escherichia coli

expression vector for the production of recombinant proteins with a minimal N-

terminal His-tagged fusion peptide. Brazilian Journal of Medical and Biological

Research 2004;37(8):1103-1109.

[21] Sterne M, Batty I. Pathogenic clostridia. London: Butterworths, 1975.

Page 54: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

51

[22] United States Department of Agriculture. Conditional Licenses for Products

Containing Clostridium perfringensserotypeA. Center for Veterinary Biologics Notice

Nº 02-25 2002. Accessed in 28 march 2007. Online:

http://www.aphis.usda.gov/animal_health/vet_biologics/publications/notice_02_25.pdf

[23] Swann Committee BVA and RCVS evidence to the Swann Committee.

Veterinary Record 1969;jan:91-92.

[24] Heier BT, Lovland A, Soleim KB, Kaldhusal M, Jarp J. A field study of naturally

occurring specific antibodies against Clostridium perfringens alpha toxin in

Norwegian broiler flocks. Avian Diseases 2001;45(3):724-732.

[25] Lovland A, Kaldhusdal M, Redhead K, Skjerve E, Lillehaugal A. Maternal

vaccination against subclinical necrotic enteritis in broilers. Avian Pathology

2004;33(1):83-92.

[26] Schoepe H, Neubauer A, Schlapp T, Wieler LH, Baljer G. Immunization with an

alphatoxin variant 121A/91-R212H protects mice against Clostridium perfringens

alphatoxin. Anaerobe 2006;12(1):44-48.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Page 55: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

52

4 ARTIGO 3

EVALUATION OF Clostridium perfringens RECOMBINANT α TOXIN

VACCINES IN BROILERS

(Artigo a ser submetiodo à British Poultry Science)

Page 56: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

53

Evaluation of Clostridium perfringens recombinant α toxin vaccines

in broilers

J.R. GIL de los SANTOS1, F.R. CONCEIÇÃO2*, C. GIL-TURNES3

1Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brazil.

2Departamento de Patologia, Fundação Universidade Federal do Rio Grande, Rio Grande, RS, Brazil.

3Faculdade de Veterinária e Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, RS, Brazil.

Summary

Vaccines containing Clostridium perfringens recombinant α toxin (rAT)

adjuvanted with Al(OH)3 or recombinant subunit B of the E. coli heat-labile

enterotoxin (rLTB), and a recombinant chimeric protein of rAT fused to rLTB (rLTB-

AT) were tested in broilers. The immune response and the effect on live weight at 42

days of age were compared to that of controls. The highest seroconversions were

produced in chickens vaccinated with one dose of the rAT adjuvanted with Al(OH)3.

Six groups vaccinated with vaccines containing either Al(OH)3 or rLTB-AT had body

weight higher than the control (α=0.05). We concluded that the recombinant vaccine

is a candidate to control Avian Necrotic Enteritis.

                                                            * Corresponding author: Fundação Universidade Federal do Rio Grande, Departamento de Patologia. Rua General Osório s/n, FURG - Campus Saúde, Centro, 96200-190, Rio Grande-RS, Brazil. E-mail: [email protected]. Phone: + 55 53 32330318.

Page 57: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

54

INTRODUCTION

Avian Necrotic Enteritis (NE) is an acute enterotoxaemia caused by

Clostridium perfringens that affects animals between two and five weeks of age with

high mortality rates (Van Immerseel et al., 2004) and older animals sub-clinically,

producing hepatic and intestinal lesions, with high economic impact due to a

decrease in live weight and an increase in feed conversion and carcass

condemnations (Lovland and Kaldhusdal, 2001). In USA the cost of the disease was

estimated in more than U$ 0.05 per animal (Van der Sluis, 2000).

During the last decades NE was controlled by antibiotics added to feed. The

European Community banned the use of antibiotics as feed additives (Council of

European Union, 2003), calling attention to the use of probiotics and vaccines, that

appeared as the more promising alternatives for its control. The disease was

appointed as the most important challenge to the poultry industry after the ban of

antibiotics (Sesti, 2002; Phillips, 2002; Kaldhusdal, 2003).

Although animals that survived the disease developed immunity (Prescott,

2000), there are not effective vaccines commercially available (Kulkarni et al. 2007).

Several vaccines based on native or recombinant Clostridium perfringens α toxin

were tested with variable results. Cloning of α toxin, the major antigen of C.

perfringens (Sterne and Warrack, 1964; Titball et al., 1999; Williams, 2005; Dahiya et

al., 2006) in Escherichia coli (Leslie et al., 1989), and the production of recombinant

α toxin vaccines (Williamson and Titball, 1993; Schoepe et al., 2001; Stevens et al.,

2004) stimulated researchers to use this technology in the production of candidate

NE vaccines.

The objective of this work was to evaluate immunogenicity of a the C.

perfringens recombinant α toxin (rAT) in vaccines adjuvanted with Aluminum

Page 58: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

55

Hydroxyde and the recombinant E. coli heat-labile enterotoxin subunit B (rLTB). A

recombinant chimeric protein (rLTB-AT) containing the toxin fused to LTB was also

evaluated.

MATERIAL AND METHODS

Vaccines and immunization

Female one-day-old Ross P8 broilers were divided in 13 groups of 5 animals

each, fed commercial feed and water ad libitum throughout the experiment. Vaccines

constructed with a rAT (Gil de los Santos, 2007) were used in the experiment. The

animals were vaccinated intramuscularly with 0.2 mL of the respective vaccine at 7

days of age and those that were revaccinated also at 14 days of age. The vaccines

and doses applied to each group are shown in table 1.

All the experiments with animals were approved by the Federal University of

Pelotas Animal Care Committee, in accordance with Brazilian Federal Laws.

Page 59: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

56

Table 1: Vaccines and doses of each group.

Groups Protein Adjuvant Dose (µg) Nº of doses

Control --- --- ---

1 rAT Al(OH)3 25 1

2 rAT Al(OH)3 50 1

3 rAT Al(OH)3 25 2

4 rAT Al(OH)3 50 2

5 rAT rLTB 25 1

6 rAT rLTB 50 1

7 rAT rLTB 25 2

8 rAT rLTB 50 2

9 rLTB-AT None 25 1

10 rLTB-AT None 50 1

11 rLTB-AT None 25 2

12 rLTB-AT None 50 2

The doses of rLTB-AT were adjusted to obtain 25 and 50 µg rAT. The dose of rLTB (7.3 µg)

was the correspondent to the rLTB-AT.

Page 60: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

57

Antibody response

Serum from each animal was obtained at days 0, 7, 21 and 35 days after the

first dose of vaccine (av). Antibody titers were evaluated by an Enzyme Linked

Immuno-Sorbent Assay (ELISA). Polystyrene microtiter plates (CRAL Artigos para

Laboratórios Ltda, Cotia, SP, Brazil) were coated with 0.5 µg of standard toxin (sT) or

rAT suspended in carbonate-bicarbonate buffer pH 9.6, incubated overnight at 4ºC.

Mice sera diluted 1:50 were added in duplicate to the wells and incubated for 1.5 h at

37ºC. After washing with PBS-T, goat anti-chicken polyvalent immunoglobulins

peroxidase conjugate (Sigma-Aldrich) (1:2000) was added and incubated for 1.5 h at

37ºC. After washing with PBS-T, OPD-chromogen substrate (1 mL Phosphate-citrate

Buffer pH 4.0, 10 µL of 30% hydrogen peroxide, 0.4 mg ortophenyle diamine) was

added. Absorbancies were measured in an ELISA spectrophotometer at 492 nm

(Dynatech MR 700).

Titres are expressed as seroconversions, dividing the mean of the respective

absorbencies by that of the same group at the day of the first vaccination.

Statistical analysis

The significance of the differences of absorbencies and weight gain means

were estimated by ANOVA using the Statistix software 8 version (Analytical Software,

Tallahassee, FL, USA).

Page 61: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

58

RESULTS

Immune response

Seroconversions and weight gain indices in broilers 35 days av are shown in

table 2. Excluding vaccine 11, the higher seroconversions were obtained 35 days av

(Figures 1, 2, 3 and 4). The higher seroconversions were induced by the rAT vaccine

using Al(OH)3 as adjuvant inoculated only once, independently of the amount of

antigen (vaccines 1 and 2). Seroconversions of the animals vaccinated twice were

lower; the revaccination produced a fall in the seroconversions at 42 days of age.

Vaccines using co-administered rLTB as adjuvant, or rLTB-AT induced

seroconversions similar that of the controls.

Page 62: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

59

Table 2: Weight gain and seroconversion of broilers 35 days after the first dose of

vaccine, determined with sT or rAT.

Group Nº of doses Weight gain Seroconversion

sT rAT

Control 1720.0de 2.8 2.1

rAT+Al(OH)3 25 µg 1 1877.7abc 3.4 2.2

rAT+Al(OH)3 50 µg 1 1875.0ab 3.5 3.2

rAT+Al(OH)3 25 µg 2 1857.8ab 2.4 2.0

rAT+Al(OH)3 50 µg 2 1640.1e 2.8 2.3

rAT+rLTB 25 µg 1 1816.9bcde 2.2 2.5

rAT+rLTB 50 µg 1 1790.1cde 1.3 1.8

rAT+rLTB 25 µg 2 1824.7bcde 2.0 1.7

rAT+rLTB 50 µg 2 1800.8abcd 2.0 1.9

rLTB-AT 25 µg 1 1861.0abc 1.6 1.4

rLTB-AT 50 µg 1 1677.0de 1.4 1.9

rLTB-AT 25 µg 2 1861.5abc 2.2 2.1

rLTB-AT 50 µg 2 1948.6a 2.2 1.9

*same letters in the same column mean no significant differences at α=0.05.

Page 63: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

60

00,5

11,5

22,5

33,5

4

0 7 21 35

Days

Sero

conv

ersi

on Control

Vaccine 1

Vaccine 2

Vaccine 5

Vaccine 6

Vaccine 9

Vaccine 10

Figure 1: Seroconversions of broilers at 35 av vaccinated once determined with sT.

00,5

11,5

22,5

33,5

4

0 7 21 35

Days

Sero

conv

ersi

on Control

Vaccine 1

Vaccine 2

Vaccine 5

Vaccine 6

Vaccine 9

Vaccine 10

Figure 2: Seroconversions of broilers at 35 av vaccinated twice determined with sT.

0

1

2

3

4

0 7 21 35

Days

Sero

conv

ersi

on ControlVaccine 1Vaccine 2Vaccine 5Vaccine 6Vaccine 9Vaccine 10

Figure 3: Seroconversions of broilers at 35 av vaccinated once determined with rAT.

Page 64: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

61

0

1

2

3

4

0 7 21 35

Days

Sero

conv

ersi

on ControlVaccine 3Vaccine 4Vaccine 7Vaccine 8Vaccine 11Vaccine 12

Figure 4: Seroconversions of broilers at 35 av vaccinated twice determined with rAT.

Although without statistical significance, the higher seroconversion (3.2)

against rAT was obtained in the chicks vaccinated with one dose of 50 µg

rAT+Al(OH)3. Media were slightly higher when sT (2.3 vs. 2.1) although in

unvaccinated chickens seroconversions detected by sT was 2.8 against 2.1 with rAT.

DISCUSSION

Immunization is one of the strategies that was proposed to control NE in

poultry reared without antibiotics. Recently LOVLAND et al. (2004) showed that

Clostridium toxoids adjuvanted with Al(OH)3 elicited a strong IgG response in

breeders against C. perfringens α toxin that was transferred to their offspring. It is

accepted that this toxin is a main factor in the etiology of NE (Heier et al., 2001;

Lovland et al., 2004; Kulkarni et al, 2007).

Information about the immune response in poultry to C. perfringens α toxin is

scarce. Most of it concerns to experiments in mice that were not validated in poultry.

The main limitation in assessing the effectiveness of vaccines against NE in poultry is

the difficulty to establish a standardized protocol to perform a potency test, due to the

Page 65: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

62

variability in the responses to challenge. Several countries defined potency tests to

other clostridial vaccines but not to C. perfringens A vaccines (Pharmaceutical

Society of Great Britain, 1965; United States Departament of Agriculture, 1966). The

USDA (United States Departament of Agriculture, 2002) established a potency test

for these vaccines based on the antibody response against α toxin or on the

resistance to a challenge of 10 DL50 of the toxin, although for the definitive licensing

of the product, field trials are demanded.

Our experiment was designed to compare the immunogenicity and the effect

on productivity of three vaccines containing recombinant α toxin, in broilers.

Considering that C. perfringens A is a member of the normal microbiota of fowls, and

that antibodies against α toxin are normally transferred to the chickens via egg yolk

(Lovland et al., 2004), we opted to vaccinate at seven days of age, revaccinating

some groups one week latter to determine the booster effect of the vaccines, in order

to asses immunity at two to five weeks of age, when the acute form of the disease is

prevalent.

The recombinant α toxin used to prepare the vaccines was previously tested

in mice attaining the requirements of the USDA (Gil de los Santos, 2007). Therefore

we used the same vaccines with the same doses to vaccinate chickens born from

commercial flocks. The immunological response was assessed by ELISA using a

standard toxin and our recombinant toxin, and the results were expressed as

seroconversions (Gil-Turnes et al., 1999; Conceição et al., 2006). Considering that

our recombinant toxin was not detoxified and that it preserves some of the

characteristics of the native toxin, such as lethal, phospholipase and dermonecrotic

properties, we studied the effect it could have on productivity parameters of the

vaccinees.

Page 66: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

63

The vaccines containing Al(OH)3 induced the higher seroconversions (3.5), in

agreement with those in mice (GIL de los SANTOS, 2007) and with the results of

Lovland et al. (2004) that used an α toxoid to vaccinate hens. Seroconversions

induced by the other vaccines were very close among them, varying between 1.3 and

2.5. Booster at 14 days of age did not affect seroconversions at 42 days of age. The

booster effect of re-vaccination was not detected. Kulkarni et al. (2007) obtained the

best results of their experiment when they primed chickens with two doses of a

recombinant α toxoid and boosted with the active toxin. Their recombinant α toxoid

did not protect against challenge probably due to modifications on conformational

epitopes of the toxin that may impair the immune response (Kulkarni et al., 2007),

explaining why our recombinant α toxin protected 100% of mice challenged with 10

LD50 of the standard toxin (GIL de los SANTOS, 2007).

The vaccines did not affect body weight at 42 days of age. Six groups

vaccinated with vaccines containing either Al(OH)3 or rLTB-AT had body weight

higher than the control (α=0.05). Among them was that which gave the highest

seroconversion. The vaccine containing recombinant α toxin and Al(OH)3 as adjuvant

was innocuous for chicken, elicited an immune response and did not affect

productivity parameters, being a candidate to be used in the control of NE.

Acknowledgements

This research was financed by CNPq grant Nº 474509/2004-4 and FAPERGS

grant Nº 05.2329.9. Rodrigo C. Cunha and Alceu G. dos Santos Jr. assisted in the

experiments with animals.

Page 67: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

64

REFERENCES

CONCEIÇÃO, F.R., MOREIRA, A.N., DELLAGOSTIN, O.A. (2006). A recombinant

chimera composed of R1 repeat region of Mycoplasma hyopneumoniae P97

adhesin with Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit elicits immune

response in mice. Vaccine, 24: 5734-5743.

COUNCIL OF EUROPEAN UNION (2003). Council Regulation on the authorization

of the additive avilamycin in feedingstuffs. Accessed on 17 october 2003. Online:

http://register.consilium.eu.int/pdf/en/03/st06/st06120en03.pdf

DAHIYA J.P., WILKIE D.C., VAN KESSEL A.G. & DREW M.D (2006). Potential

strategies for controlling necrotic enteritis in broiler chickens in post-antibiotic era.

Animal Feed Science and Technology, 129: 60-88.

GIL de los SANTOS, J.R. (2007). Construção e Avaliação de vacinas de toxina α

recombinante de Clostridium perfringens A. D. Sc. Thesis, Universidade Federal

de Pelotas.

HEIER, B.T., LOVLAND, A., SOLEIM, K.B., KALDHUSAL, M. & JARP, J. (2001). A

field study of naturally occurring specific antibodies against Clostridium

perfringens alpha toxin in Norwegian broiler flocks. Avian Diseases, 45: 724-732.

KALDHUSDAL, M. (2003). Maintaining gut health in meat-type poultry without

antibacterial growth promoters and ionophores. Proceeding of 14th European

Symposium on Poultry Nutrition, Lillehammer, pp. 151-157. Accessed in 8

december 2004. Online:

http://www-afac.slu.se/WPSA%20Lillehammer%20Magne.pdf

Page 68: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

65

KULKARNI, R.R., PARREIRA, V.R., SHARIF, S. & PRESCOTT, J.F. (2007).

Immunization of broiler chickens against Clostridium perfringens-induced necrotic

enteritis. Clinical and Vaccine Immunology. Published online ahead of print on 18

july 2007. doi:10.1128/CVI.00162. Accessed in 23 january 2004. Online:

http://cvi.asm.org/cgi/reprint/CVI.00162-07v1.pdf

LESLIE, D., FAIRWEATHER, N., PICKARD, D., DOUGAN, G. & KEHOE, M. (1989).

Phospholipase C and haemolytic activities of Clostridium perfringens alpha-toxin

cloned in Escherichia coli: sequence and homology with a Bacillus cereus

phospholipase C. Molecular Microbiology, 3: 383-392.

LOVLAND, A. & KALDHUSDAL, M. (2001). Severely impaired production

performance in broiler flocks with high incidence of Clostridium perfringens-

associated hepatitis. Avian Pathology, 30: 73-81.

LOVLAND, A., KALDHUSDAL, M., REDHEAD, K., SKJERVE, E. & LILLEHAUGAL,

A. (2004) Maternal vaccination against subclinical necrotic enteritis in broilers.

Avian Pathology, 33: 83-92.

PHARMACEUTICAL SOCIETY OF GREAT BRITAIN (1965). The second British

Veterinary Codex. Pharmaceutical Press, London, England.

PHILLIPS, R. (2002) The Antibiotic-Probiotic Dance: Role in Food Safety.

Proceeding of the 13TH Western Meeting of Poultry Clinicians and Pathologists.

Accessed in 27 january 2004. Online:

http://www.westvet.com/Antibiotic%20Probiotic%20Dance.htm

Page 69: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

66

PRESCOTT, J. (2000). Vaccine-Based Control of Necrotic Enteritis of Broiler

Chickens. Ministry of Agriculture and Food, Ottawa, Canada, 2000. Accessed in

23 january 2004. Online:

http://www.omaf.gov.on.ca/english/livestock/poultry/facts/necrente.htm

SCHOEPE, H., PACHE, C., NEUBAUER, A., POTSCHKA, H., SCHLAPP, T.,

WIELER, L.H., & BALJER, G. (2001). Naturally Occurring Clostridium perfringens

Nontoxic Alpha-Toxin Variant as a Potential Vaccine Candidate against Alpha-

Toxin-Associated Diseases. Infection and Immunity, 69: 7194-7196.

SESTI L. (2002). "Doenças Avícolas" - Qual é a mais preocupante? Avisite especial.

Accessed in 23 january 2004. Online:

http://www.avisite.com.br/reportagem/saude_avicola/default2.asp

STERNE. M. & WARRACK, G.H. (1964). The types of Clostridium perfringens.

Journal of Pathology and Bacteriology, 89: 279-283.

STEVENS, D.L., TITBALL, R.W., JEPSON, M., BAYER, C.R., HAYES-

SCHROER, S.M. & BRYANT, A.E. (2004). Immunization with the C-domain of α-

toxin prevents lethal infection, localizes tissue injury, and promotes host response

to challenge with Clostridium perfringens. Journal of Infectious Diseases, 190:

767-773.

TITBALL, R.W., NAYLOR, C.E., & BASAK, A.K. (1999). The Clostridium perfringens

α-toxin. Anaerobe, 5: 51-64.

TURNES, C.G., ALEIXO, J.A.G., MONTEIRO, A.V., DELLAGOSTIN, O.A. (1999).

DNA inoculation with a plasmid vector carrying the faeG adhesin gene of

Page 70: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

67

Escherichia coli K88ab induced immune responses in mice and pigs Vaccine, 17:

2089-2095.

UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE (1966). The Code of Federal

Regulations - CRF 9. Animal and Plant Health Inspection Service.

UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE. Conditional Licenses for

Products Containing Clostridium perfringens Type A. Center for Veterinary

Biologics Notice Nº 02-25 2002. Accessed in 28 march 2007. Online:

http://www.aphis.usda.gov/animal_health/vet_biologics/publications/notice_02_25

.pdf

VAN DER SLUIS, W. (2000) Clostridial enteritis is an often underestimated problem.

World Poultry, 16: 42-43.

VAN IMMERSEEL, F., DE BUCK, J., PASMANS, F., HUYGHEBAERT, G.,

HAESEBROUCK, F. & DUCATELLE, R. (2004). Clostridium perfringens in

poultry: an emerging threat for animal and public health. Avian Pathology, 33:

537-549.

WILLIAMS, R.B. Intercurrent coccidiosis and necrotic enteritis of chickens: rational,

integrated disease management by maintenance of gut integrity. Avian Pathology,

34: 159-180.

WILLIAMSON, E.D. & TITBALL, R.W. (1993). A genetically engineered vaccine

against the alpha-toxin of Clostridium perfringens protects mice against experimental

gas gangrene. Vaccine, 11:1253-1258. 

Page 71: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

68

5 CONCLUSÕES

- A rAT+Al(OH)3 foi inócua para camundongos e frangos de corte.

- A rAT+Al(OH)3 protegeu camundongos contra desafio com sT.

- Houve relação entre dose e proteção em vacinas rAT+rLTB em camundongos.

- A rLTB-AT não protegeu camundongos contra desafio com sT.

- A rAT foi imunogênica para frangos de corte

- A rAT não provocou alterações na produtividade de frangos de corte.

6 ATIVIDADES FUTURAS

- Avaliar a imunogenicidade de rAT+Al(OH)3 em lotes de frangos de corte de

produção industrial.

- Expressar rAT em Pichia pastoris.

- Avaliar a imunidade passiva de progênies oriundas de matrizes vacinadas com

rAT+Al(OH)3.

- Avaliar rAT como antígeno em ELISA.

Page 72: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

69

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANNETT, C.B.; VISTE, J.R.; CHIRINO-TREJO, M.; CLASSEN, H.L.; MIDDLETON,

D.M.; SIMKO, E. Necrotic enteritis: effect of barley, wheat and corn diets on

proliferation of Clostridium perfringens type A. Avian Pathology, v.31, n.6, p.599-

602, 2002.

BABA, E.; IKEMOTO, T.; FUKATA, T.; SASAI, K.; ARAKAWA, A.;

MCDOUGALD, L.R. Clostridial population and the intestinal lesions in chickens

infected with Clostridium perfringens and Eimeria necatrix. Veterinary

Microbiology, v.54, n.3-4 p.301-308, 1997.

BARBOSA, T.M.; SERRA, C.R.; LA RAGIONE, R.M.; WOODWARD, M.J.; AND

HENRIQUES, A.O. Screening for Bacillus isolates in the Broiler Gastrointestinal

Tract. Applied and Environmental Microbiology, v.71, n.2, p.968–978, 2005.

BRENNAN, J.; MOORE, G.; POE, S.E.; ZIMMERMANN, A.; VESSIE, G.; BARNUM,

D.A.; WILSON, J. Efficacy of In-Feed Tylosin Phosphate for the Treatment of

Necrotic Enteritis in Broiler Chickens. Poultry Science, v.80, p.1451-1454, 2001.

BRENNAN, J.; SKINNER, J.; BARNUM, D.A.; WILSON, J. The Efficacy of Bacitracin

Methylene Disalicylate when Fed in Combination with Narasin in the Management

of Necrotic Enteritis in Broiler Chickens. Poultry Science, v.82, n.3, p.360-363,

2003.

CONCEIÇÃO, F.R.; MOREIRA, A.N.; DELLAGOSTIN, O.A. A recombinant chimera

composed of R1 repeat region of Mycoplasma hyopneumoniae P97 adhesin with

Page 73: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

70

Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit elicits immune response in mice.

Vaccine, v.24, n. 29-30, p.5734-5743, 2006.

COUNCIL OF EUROPEAN UNION. Council Regulation on the authorization of the

additive avilamycin in feedingstuffs. 2003. Acessado em 17 out. 2003. Online:

<http://register.consilium.eu.int/pdf/en/03/st06/st06120en03.pdf>

CRAVEN, S.E.; STERN, N.J.; BAILEY, J.S.; COX N.A. Incidence of Clostridium

perfringens in Broiler Chickens and Their Environment During Production and

Processing. Avian Diseases, v.45, n.4, p. 887-896, 2001a.

CRAVEN, S.E.; COX N.A; STERN, N.J.; MAULDIN, J.M. Prevalence of Clostridium

perfringens in commercial broiler hatcheries. Avian Diseases, v.45, n.4, p.1050-

1053, 2001b.

DAHIYA, J.P.; HOEHLER, D.; WILKIE, D.C.; VAN KESSEL, A.G.; DREW, M.D.

Dietary Glycine Concentration Affects Intestinal Clostridium perfringens and

Lactobacilli Populations in Broiler Chickens. Poultry Science, v.84, n.12, p.1875-

1885, 2005.

DAHIYA, J.P.; WILKIE, D.; VAN KESSEL, A.; DREW, M. Potential strategies for

controlling necrotic enteritis in broiler chickens in post-antibiotic era. Animal Feed

Science and Technology, v.129, n.1-2, p.60-88, 2006.

DEKICH, M.A. Broiler Industry Strategies for Control of Respiratory and Enteric

Diseases. Poultry Science, v.77, p.1176-1180, 1998.

DHILLON, A.S.; ROY, P.; LAUERMAN, L.; SCHABERG, D.; WEBER, S.; BANDLI,

D.; WIER, F. High mortality in egg layers as a result of necrotic enteritis. Avian

Diseases, v.48, n.3, p.675-680, 2004.

Page 74: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

71

DREW, M.D.; VAN KESSEL, A.G.; LAARVELD, B.; SYED, N.A.; DREW, M.D.;

GOLDADE, B.G. Effects of dietary protein source and level on intestinal

populations of Clostridium perfringens in broiler chickens. Poultry Science, v.83,

n.3, p.414-420, 2004.

ENGBERG, R.M.; HEDEMANN, M.S.; LESER, T.D.; JENSEN, B.B. Effect of Zinc

Bacitracin and Salinomycin on Intestinal Microflora and Performance of Broilers.

Poultry Science, v.79, p.1311-1319, 2000.

ENGSTRÖM, B.E.; FERMÉR, C.; LINDBERG, A.; SAARINEN, E.; BÅVERUD, V.;

GUNNARSSON, A. Molecular typing of isolates of Clostridium perfringens from

healthy and diseased poultry. Veterinary Microbiology, v.94, n.3, p.225-235,

2003.

FIORENTIN, L. Aspectos bacteriológicos da reutilização da cama de aviário. In: V

SEMINÁRIO INTERNACIONAL DE AVES E SUÍNOS – AVESUI, 2005,

Florianópolis, SC. Anais... Itu, SP: GUSSULLI AGRIBUSINESS, v.1, p.113-122,

2006.

FULLER, R. Probiotics in man and animals. Applied Bacteriology, v.66, n.5, p.365-

378, 1989.

GHOLAMIANDEKHORDI A.R.; DUCATELLE, R.; HEYNDRICKX, M.;

HAESEBROUCK, F.; VAN IMMERSEEL, F. Molecular and phenotypical

characterization of Clostridium perfringens isolates from poultry flocks with

different disease status. Veterinary Microbiology, v.113, n.1-2, p.143-152, 2006.

GIL DE LOS SANTOS, J.R. Efeito de probióticos na translocação de Salmonella

enteritidis e na eficiência alimentar de frangos de corte. 2004. 80f.

Page 75: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

72

Dissertação (Mestrado em Veterinária) – Programa de Pós-Graduação em

Veterinária, Universidade Federal de Pelotas.

GIL de los SANTOS, J.R.; STORCH, OB.; GIL-TURNES, C. Bacillus cereus var.

toyoii and Saccharomyces boulardii increased feed efficiency in broilers infected

with Salmonella enteritidis. British Poultry Science, v.46, n.4, p.494-497, 2005.

GIL de los SANTOS, J.R.; GIL-TURNES, C. Probióticos em avicultura. Ciência

Rural, v.35, n.3, p.741-747, 2005.

Gil-TURNES, C.; ALEIXO, J.A.G.; MONTEIRO, A.V.; DELLAGOSTIN, O.A. (1999).

DNA inoculation with a plasmid vector carrying the faeG adhesin gene of

Escherichia coli K88ab induced immune responses in mice and pigs Vaccine,

v.17, p.2089-2095.

HAGHIGHI, H.R.; GONG, J.; GYLES, C.L.; HAYES, M.A.; ZHOU, H.; SANEI, B.;

CHAMBERS, J.R.; SHARIF, S. Probiotics Stimulate Production of Natural

Antibodies in Chickens. Clinical and Vaccine Immunology, v.13, n.9, p.975-980,

2006.

HALE, M.L.; STILES, B.G. Detection of Clostridium perfringens alpha toxin using a

capture antibody ELISA. Toxicon, v.37, n.3, p.471-484, 1999.

HATHEWAY, C.H. Toxigenic Clostridia. Clinical Microbiology Reviews, v.3, n.1,

p.66-98, 1990.

HEIER, B.T.; LOVLAND, A.; SOLEIM, K.B.; KALDHUSAL, M.; JARP, J. A field study

of naturally occurring specific antibodies against Clostridium perfringens alpha

toxin in Norwegian broiler flocks. Avian Diseases, v.45, n.3, p.724-732, 2001.

Page 76: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

73

HEIKINHEIMO, A.; KORKEALA, H. Multiplex PCR assay for toxinotyping Clostridium

perfringens isolates obtained from Finnish broiler chickens. Letters in Applied

Microbiology, v.40, p.407-411, 2005.

HOFACRE, C.L.; FROYMAN, R.; GAUTRIAS, B.; GEORGE, B.; GOODWIN, M.A.;

BROWN, J. Use of Aviguard and Other Intestinal Bioproducts in Experimental

Clostridium perfringens-associated Necrotizing Enteritis in Broiler Chickens.

Avian Diseases, v.42, n.3, p.579-584, 1998.

HOFSHAGEN, M.; STENWIG, H. Toxin Production by Clostridium perfringens

Isolated from Broiler Chickens and Capercaillies (Tetrao urogallus) with and

without Necrotizing Enteritis. Avian Diseases, v.36, n.4, p.837-843, 1992.

IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Capturado em 01 set. 2007.

Online: <http://www.ibge.gov.br>

JACKSON, M.E.; ANDERSON, D.M.; HSIAO, H.Y.; MATHIS, G.F.; FODGE, D.W.

Beneficial effect of beta-mannanase feed enzyme on performance of chicks

challenged with EimerIa sp. and Clostridium perfringens. Avian Diseases, v.47,

n.3, p.759-63, 2003.

JOHANSSON, A.; GREKO, C.; ENGSTROM, B.E.; KARLSSON, M. Antimicrobial

susceptibility of Swedish, Norwegian and Danish isolates of Clostridium

perfringens from poultry, and distribution of tetracycline resistance genes.

Veterinary Microbiology, v.99, p.251-257, 2004.

KALDHUSDAL, M. Maintaining gut health in meat-type poultry without antibacterial

growth promoters and ionophores. In: 14th European Symposium on Poultry

Page 77: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

74

Nutrition, Lillehammer, Norway. Proceedings 2003: 151-157, 2003. Acessado em

8 dez. 2004. Online:

<http://www-afac.slu.se/WPSA%20Lillehammer%20Magne.pdf>

KALDHUSDAL, M.; SKJERVE, E. Association between cereal contents in the diet

and incidence of necrotic enteritis in broiler chickens in Norway. Preventive

Veterinary Medicine, v.28, p.1-16, 1996.

KALDHUSDAL, M.; LOVLAND, A. Clostridial Necrotic Enteritis and

Cholangiohepatitis - “Biography”. In: THE ELANCO GLOBAL ENTERITIS

SYMPOSIUM, Cambridge, UK. Anais... p. G3-G13, 2002. Capturado em 8 dez.

2003. Online:

<http://www.poultry-health.com/fora/inthelth/kaldhusdal02.pdf>

KAUR, I.P.; CHOPRA, K.; SAINI, A. Probiotics: potential pharmaceutical applications.

European Journal of Pharmaceutical Sciences, v.15, n.1, p.1-9, 2002.

KEYBURN, A.L.; SHEEDY, S.A.; FORD, M.E.; WILLIAMSON, M.M.; AWAD, M.M.;

ROOD, J.I.; MOORE, R.J. Infection and Immunity, v.74, n.11, p.6496-6500,

2006.

KIZERWETTER-SWIDA, M.; BINEK, M. Selection of potentially probiotic

Lactobacillus strains towards their inhibitory activity against poultry

enteropathogenic bacteria. Polish Journal of Microbiology, v.54, n.4, p.287-94,

2005.

KNARREBORG, A.; SIMON, M.A.; ENGBERG, R.M.; JENSEN, B.B.; TANNOCK,

G.W. Effects of Dietary Fat Source and Subtherapeutic Levels of Antibiotic on the

Page 78: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

75

Bacterial Community in the Ileum of Broiler Chickens at Various Ages. Applied

and Environmental Microbiology, v.68, n. 12, p.5918-5924, 2002.

KULKARNI, R.R.; PARREIRA, V.R.; SHARIF, S.; PRESCOTT, J.F. Clostridium

perfringens Antigens Recognized by Broiler Chickens Immune to Necrotic

Enteritis. Clinical and Vaccine Immunology, v.13, n.12, p.1358-1362, dec,

2006.

KULKARNI, R.R.; PARREIRA, V.R.; SHARIF, S.; PRESCOTT, J.F. Immunization of

broiler chickens against Clostridium perfringens-induced necrotic enteritis. Clinical

and Vaccine Immunology 2007. Publicado online em 18 jul. 2007.

doi:10.1128/CVI.00162. Acessado em 23 jan. 2004. Online:

<http://cvi.asm.org/cgi/reprint/CVI.00162-07v1.pdf>

LA RAGIONE, R.M.; WOODWARD, M.J. Competitive exclusion by Bacillus subtilis

spores of Salmonella enterica serotype Enteritidis and Clostridium perfringens in

young chickens. Veterinary Microbiology, v.94, n.3, p.245-256, 2003.

LA RAGIONE, R.M. NARBAD, R.M.; GASSON, A.; WOODWARD, M.J. In vivo

characterization of Lactobacillus johnsonii FI9785 for use as a defined competitive

exclusion agent against bacterial pathogens in poultry. Letters in Applied

Microbiology, v.38, n.3, p.197-205, 2004.

LESLIE, D.; FAIRWEATHER, N.; PICKARD, D.; DOUGAN, G.; KEHOE, M.

Phospholipase C and haemolytic activities of Clostridium perfringens alpha-toxin

cloned in Escherichia coli: sequence and homology with a Bacillus cereus

phospholipase C. Molecular Microbiology, v.3, n.3, p.383-392, 1989.

Page 79: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

76

LOVLAND, A.; KALDHUSDAL, M. Liver lesions seen at slaughter as an indicator of

Necrotic enteritis in broiler flocks. FEMS Immunology and Medical

Microbiology, v.24, n.3, p.345-351, 1999.

LOVLAND, A.; KALDHUSDAL, M. Severely impaired production performance in

broiler flocks with high incidence of Clostridium perfringens-associated hepatitis.

Avian Pathology, v.30, p.73-8, 2001.

LOVLAND, A.; KALDHUSDAL, M.; REITAN, L.J. Diagnosing Clostridium perfringens-

associated necrotic enteritis in broiler flocks by an immunoglobulin G anti-alpha-

toxin enzyme-linked immunosorbent assay. Avian Pathology, v.32, n.5, p.527-

534, 2003.

LOVLAND, A.; KALDHUSDAL, M.; REDHEAD, K.; SKJERVE, E.; LILLEHAUGAL, A.

Maternal vaccination against subclinical necrotic enteritis in broilers. Avian

Pathology, v.33, n.1, p.83-92, 2004.

MARTEL, A.; DEVRIESE, L.A.; CAUWERTS, K.; DE GUSSEM, K.; DECOSTERE,

A.; HAESEBROUCK, F. Susceptibility of Clostridium perfringens strains from

broiler chickens to antibiotics and anticoccidials. Avian Pathology, v.33, n.1, p.3-

7, 2004.

McCOURT, M.T.; FINLAY, D.A.; LAIRD, C.; SMYTH, J.A.; BELL, C.; BALL, H.J.

Sandwich ELISA detection of Clostridium perfringens cells and α-toxin from field

cases of necrotic enteritis of poultry. Veterinary Microbiology, v.106, n.3-4,

p.259-264, 2005.

Page 80: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

77

McDEVITT, R.M.; BROOKER, J.D.; ACAMOVIC, T.; SPARKS, N.H.C. Necrotic

enteritis; a continuing challenge for the poultry industry. World’s Poultry Science

Journal, v.62, n.2, p.221-247, 2006.

McREYNOLDS, J.L.; BYRD, J.A.; GENOVESE, K.J.; POOLE, T.L.; DUKE S.E.;

FARNELL, M.B.; NISBET, D.J. Dietary Lactose and its Effect on the Disease

Condition of Necrotic Enteritis. Poultry Science, v.86, n.8, p.1656-1661, 2007.

MITSCH, P.; ZITTERL-EGLSEER, K.; KÖHLER, B.; GABLER, C.; LOSA, R.;

ZIMPERNIK, I. The Effect of Two Different Blends of Essential Oil Components

on the Proliferation of Clostridium perfringens in the Intestines of Broiler Chickens.

Poultry Science, v.83, n.4, p.669-675, 2004.

NAUERBY, B.; PEDERSEN, K.; MADSEN, M. Analysis by pulsed-field gel

electrophoresis of the genetic diversity among Clostridium perfringens isolates

from chickens. Veterinary Microbiology, v.94, n.3, p.257-266, 2003.

NILO, L. Clostridium perfringens in Animal Disease: A Review of Current Knowledge.

The Canadian Veterinary Journal, v.21, n.5, p.141-148, 1980.

OMEIRA, N.; BARBOUR, E.K.; NEHME, P.A.; HAMADEH, S.K.; ZURAYK, R.;

BASHOUR, I. Microbiological and chemical properties of litter from different

chicken types and production systems. Science of the Total Environment,

v.367, n.1, p.156-162, 2006.

PARISH, W.E. Necrotic enteritis in the fowl (Gallus gallus domesticus). 1.

Histopathology of the disease and isolation of a strain of Clostridium welchii.

Journal of Comparative Pathology, v.71, p.377-393, 1961.

Page 81: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

78

PETIT, L.; GILBERT, M.; POPOFF, M.R. Clostridium perfringens: toxinotype and

genotype. Trends in Microbiology, v.7, n.3, p.104-110, 1999.

PHARMACEUTICAL SOCIETY OF GREAT BRITAIN (1965). The second British

Veterinary Codex. Pharmaceutical Press, London, England.

PHILLIPS, R. The Antibiotic-Probiotic Dance: Role in Food Safety. In: 13TH Western

Meeting of Poultry Clinicians and Pathologists. Proceedings… 2002. Acessado

em 27 jan. 2004. Online:

<http://www.westvet.com/Antibiotic%20Probiotic%20Dance.htm>

PRESCOTT, J. Vaccine-Based Control of Necrotic Enteritis of Broiler Chickens.

Ministry of Agriculture and Food, Ottawa, Canada, 2000. Acessado em 23 jan.

2004. Online:

<http://www.omaf.gov.on.ca/english/livestock/poultry/facts/necrente.htm>

RAMOS, C.R.; ABREU, P.A.; NASCIMENTO, A.L.; HO, P.L. A high-copy T7

Escherichia coli expression vector for the production of recombinant proteins with

a minimal N-terminal His-tagged fusion peptide. Brazilian Journal of Medical

and Biological Research, v.37, n.8, p.1103-1109, 2004.

ROBERTS, D.S. Clostridial Diseases. In: STABLEFORTH, A.W.; GALLOWAY, I.A.

Infectious Diseases of Animals. Diseases due to Bacteria. London,

Butterworths Scientific Publications, 1959.

SAKURAI, J., NAGAHAMA, M.; ODA, M. Clostridium perfringens Alpha-Toxin:

Characterization and Mode of Action. Journal of Biochemistry, v.136, n.5,

p.569-574, 2004.

Page 82: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

79

SAMBROOK, J.; RUSSELL, D.W. Molecular cloning: a Laboratory Manual, Third

Edition, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

SARTORY, D.P.; WALDOCK, R.; DAVIES, C.E.; FIELD, A.M. Evaluation of acid

phosphatase as a confirmation test for Clostridium perfringens isolated from

water. Letters in Applied Microbiology, v.42, n.4, p.418-424, 2006.

SCHOCKEN-ITURRINO, R.P; ISHI, M. Clostridioses em aves. In: BERCHIERI Jr, A.,

MACARI, M. Doenças das aves. Campinas: Facta, 2000. Cap. 4.6, p.242-243.

SCHOEPE, H.; NEUBAUER, A.; SCHLAPP, T.; WIELER, L.H.; BALJER, G.

Immunization with an alphatoxin variant 121A/91-R212H protects mice against

Clostridium perfringens alphatoxin. Anaerobe, v.12, n.1, p.44-48, 2006.

SCHOEPE, H.; PACHE, C.; NEUBAUER, A.; POTSCHKA, H.; SCHLAPP, T.;

WIELER, L.H.; BALJER, G. Naturally Occurring Clostridium perfringens Nontoxic

Alpha-Toxin Variant as a Potential Vaccine Candidate against Alpha-Toxin-

Associated Diseases. Infection and Immunity, v.69, n.11, p.7194-7196, 2001.

SESTI, L. (2002). "Doenças Avícolas" - Qual é a mais preocupante? Avisite

especial. Acessado em 23 jan. 2004. Online:

<http://www.avisite.com.br/reportagem/saude_avicola/default2.asp>

SILVA, L.P.; NORNBERG, J.L. Prebióticos na nutrição de não ruminantes. Ciência

Rural, v.33, n.5, p.983-990, 2003.

SINGH, R.V.; BHILEGAONKAR, K.N.; AGARWAL, R.K. Studies on occurrence and

characterization of Clostridium perfringens from select meat. Journal of Food

Safety, v.25, n.2, p.146-156, 2005.

Page 83: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

80

STERNE, M.; BATTY, I. Pathogenic clostridia. London: Butterworths, 1975. 144p.

STERNE, M.; WARRACK, G.H. The types of Clostridium perfringens. Journal of

Pathology and Bacteriology, v.89, p.279-283, 1964.

STEVENS, D.L.; TITBALL, R.W.; JEPSON, M.; BAYER, C.R.; HAYES-

SCHROER, S.M.; BRYANT, A.E. Immunization with the C-domain of α-toxin

prevents lethal infection, localizes tissue injury, and promotes host response to

challenge with Clostridium perfringens. Journal of Infectious Diseases, v.190,

p.767-773, 2004.

SWANN COMMITTEE BVA and RCVS evidence to the Swann Committee.

Veterinary Record, jan., p.91-92, 1969.

TAKEDA, T.; FUKATA, T.; MIYAMOTO, T.; SASAI, K.; BABA, E.; ARAKAWA, A. The

effects of dietary lactose and rye on cecal colonization of Clostridium perfringens

in chicks. Avian Diseases, v.39, n.2, p.375-381, 1995.

TEO, A.Y.L.; TAN, H.M. Inhibition of Clostridium perfringens by a novel strain of

bacillus subtilis isolated from the gastrointestinal tracts of healthy chickens.

Applied and Environmental Microbiology, v.71, n.8, p.4185-4190, 2005.

THOMPSON, D.R.; PARREIRA, V.R;, KULKARNI, R.R.; PRESCOTT, J.F. Live

attenuated vaccine-based control of necrotic enteritis of broiler chickens.

Veterinary Microbiology, v.113, n.1-2, p.25-34, 2006.

TITBALL, R.W.; NAYLOR, C.E.; BASAK, A.K. The Clostridium perfringens α-toxin.

Anaerobe, v.5, p.51-64 1999.

UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE (1966). The Code of Federal

Reguations - CRF 9. Animal and Plant Health Inspection Service.

Page 84: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

81

UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE. Conditional Licenses for

Products Containing Clostridium perfringens Type A. Center for Veterinary

Biologics Notice Nº 02-25 2002. Acessado em 28 mar. 2007. Online:

<http://www.aphis.usda.gov/animal_health/vet_biologics/publications/notice_02_2

5.pdf>

VAN DER SLUIS, W. Clostridial enteritis is an often underestimated problem. World

Poultry, v.16, n.7, p.42-43, 2000.

VAN IMMERSEEL, F.; DE BUCK, J.; PASMANS, F.; HUYGHEBAERT, G.;

HAESEBROUCK, F.; DUCATELLE, R. Clostridium perfringens in poultry: an

emerging threat for animal and public health. Avian Pathology, v.33, n.6, 537-

549, 2004.

VERWEIJ, W.R.; HAAN, L.; HOLTROP, M.; AGSTERIBBE, E.; BRANDST, R.; VAN

SCHARRENBURG, G.J.M.; WILSCHUT, J. Mucosal immunoadjuvant activity of

recombinant Escherichia coli heat-labile enterotoxin and its B subunit: Induction of

sistemic IgG and secretory IgA responses in mice by intranasal immunization with

influenza virus surface antigen. Vaccine, v.16, p.3476-3482, 1998.

VITTORI, J.; SCHOCKEN-ITURRINO, R.P.; TROVÓ, K.P.; RIBEIRO, C.A.M.;

BARBOSA, G.G.; SOUZA, L.M.; PIGATTO, C.P. Alphitobius diaperinus como

veiculador de Clostridium perfringens em granjas avícolas do interior paulista -

Brasil. Ciência Rural, v.37, n.3, p.894-896, 2007.

WILKIE, D.C.; VAN KESSEL, A.G.; DUMONCEAUX, T.J.; DREW, M.D. The effect of

hen-egg antibodies on Clostridium perfringens colonization in the gastrointestinal

tract of broiler chickens. Preventive Veterinary Medicine, v.74, n.4, p.279-292,

2006.

Page 85: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

82

WILLIAMS, R.B. Intercurrent coccidiosis and necrotic enteritis of chickens: rational,

integrated disease management by maintenance of gut integrity. Avian

Pathology, v.34, n.3, p.159-180, 2005.

WILLIAMSON, E.D.; TITBALL, R.W. A genetically engineered vaccine against the

alpha-toxin of Clostridium perfringens protects mice against experimental gas

gangrene. Vaccine, v.11, n.12, p.1253-1258, 1993.

ZHANG, G.; DARIUS, S.; SMITH, S.R.; RITCHIE, S.J. In vitro inhibitory effect of hen

egg white lysozyme on Clostridium perfringens type A associated with broiler

necrotic enteritis and its α-toxin production. Letters in Applied Microbiology,

v.42, n.2, p.138-143, 2006. 

Page 86: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas

Page 87: UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASlivros01.livrosgratis.com.br/cp044862.pdf · orienta-me na carreira profissional, estando sempre disposto a ensinar-me. A minha mãe, cujos conselhos

Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo