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UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRAtildeO PRETO

Departamento de Patologia

EXPRESSAtildeO PRECOCE DE CD34 CD68 α-ACTINA DE MUacuteSCULO LISO E COX-2 NO ESTROMA PERICRIPTAL DURANTE CARCINOGEcircNESE COLOcircNICA

INDUZIDA QUIMICAMENTE EM RATOS

ALINE TURATTI

Ribeiratildeo Preto

2006

UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRAtildeO PRETO

Departamento de Patologia

EXPRESSAtildeO PRECOCE DE CD34 CD68 α-ACTINA DE MUacuteSCULO LISO E

COX-2 NO ESTROMA PERICRIPTAL DURANTE CARCINOGEcircNESE COLOcircNICA

INDUZIDA QUIMICAMENTE EM RATOS

Orientador Prof Dr Seacutergio Britto Garcia

Ribeiratildeo Preto

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes Graduaccedilatildeo do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Patologia Experimental

2006UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRAtildeO PRETO

Departamento de Patologia

EXPRESSAtildeO PRECOCE DE CD34 CD68 α-ACTINA DE MUacuteSCULO LISO E COX-2 NO ESTROMA PERICRIPTAL DURANTE CARCINOGEcircNESE COLOcircNICA

INDUZIDA QUIMICAMENTE EM RATOS

ALINE TURATTI

Ribeiratildeo Preto

2006

Turatti Aline

Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos

52 p il 29 cm

Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo PretoUSP ndash Aacuterea Patologia Experimental

Orientador Prof Dr Seacutergio Britto Garcia

1 CD34 ndash 2 CD68 ndash 3 α-SMA ndash 4 COX-2 - 5 estroma pericriptal ndash 6 carcinogecircnese colocircnica ndash 7 DMH

Autorizo a reproduccedilatildeo e divulgaccedilatildeo total ou parcial deste trabalho por meio convencional ou eletrocircnico para fins de estudo e pesquisa desde que citada a fonte

FICHA CATALOGRAacuteFICA

Dedico este Trabalho

Aos meus pais Lecircda e Turattipor serem meus maiores e melhores exemplos de amor uniatildeo e coragem

Minha irmatilde Wendy Tia-Lu e Voacute Idapor tudo que significam pra mim

Voiaacute Vocirc Careca e Juju que tantas saudades nos deixaram

ldquoDe tudo ficam trecircs coisas

A certeza de que estamos sempre

comeccedilando

A certeza de que precisamos continuar

A certeza de que seremos interrompidos

antes de terminar

Portanto devemos

Fazer da interrupccedilatildeo um caminho novo

Da queda um passo de danccedila

Do medo uma escada

Do sonho uma ponte

Da procura um encontrordquo

[Fernando Pessoa]

AGRADECIMENTO ESPECIAL

ldquoA felicidade natildeo estaacute na partida nem na

chegada mas na travessiardquo

[Guimaratildees Rosa]

Ao meu orientador e amigo

Prof Dr Seacutergio Britto Garcia

Por sua incomparaacutevel capacidade de extrair das pessoas o que de melhor

elas podem oferecer Obrigada pela oportunidade de aprendizado constante e pela

enorme participaccedilatildeo em minha formaccedilatildeo cientiacutefica eacutetica e profissional

AGRADECIMENTOS

A CAPES pela bolsa concedida

Agrave Rosangela Orlandin Lopes pela amizade carinho e por todo auxiacutelio teacutecnico

Agrave Rosangela M Castania de Paiva pela amizade fraterna

Agrave Neide Terezinha Gonccedilalves Luciara T Santana e Edna Pio pela atenccedilatildeo e gentileza

A todos os funcionaacuterios do Departamento de Patologia em especial Adriana Luisa Gonccedilalves de Almeida Antonio de Paacutedua Martins Daniel Barcelini Deise Luacutecia Chesca Simotildees e Maria Aparecida Apolinaacuterio Caetano pela boa vontade e amizade constante

Agrave Tacircnia M Beltramini Trevilato por me direcionar para o caminho cientiacutefico

Agrave Maria Capelini Turatti por estar presente em todos os momentos e por me guiar profissionalmente desde a Graduaccedilatildeo (este eacute o fruto do nosso trabalho)

Ao Prof Dr Miguel Angel Sala Di Matteo pelo auxiacutelio na etapa estatiacutestica

Aos amigos Marcelo Viniacutecius Oliveira Vespuacutecio e Patriacutecia Modiano pela amizade e colaboraccedilatildeo incondicional

Agrave querida Juliana Rodrigues da Costa pelo carinho e companheirismo desde as primeiras etapas desta caminhada

Ao quarteto Mariana Marggiori Camila S Rosa Daniella L Nunes e Daniel Kelly por poder compartilhar meus sonhos fracassos e sucessos mais profundos sem reserva

Aos meus anjos-da-guarda Priscilla e Marcelo Rezende

Aos amigos em especial agrave Maacutercia Cristina M Guimaratildees Renata Toscano Simotildees Waynice N Garcia Cleverson Rodrigues Karina Magalhatildees Alves da Mata Marcela Kazue Hassumi Luane Taiacutesa da Costa Barros e Lisandra Vanessa Martins

A todos aqueles que direta ou indiretamente participaram incentivaram e colaboraram para a realizaccedilatildeo deste trabalho

Cada um que passa em nossa vida

passa sozinho pois cada pessoa eacute uacutenica

e nenhuma substitui outra

Cada um que passa em nossa vida

passa sozinho mas natildeo vai soacute

nem nos deixa soacutes

Leva um pouco de noacutes mesmos

deixa um pouco de si mesmo

Haacute os que levam muito

mas haacute os que natildeo levam nada

Essa eacute a maior responsabilidade de nossa vida

e a prova de que duas almas

natildeo se encontram ao acaso

[Antoine de Saint-Exupeacutery]SUMAacuteRIO

Lista de Abreviaturas i

Lista de Figuras e Tabelas ii

Resumo iii

Abstract iv

1INTRODUCcedilAtildeO 1

11 Cacircncer Colorretal 1

12 Carcinogecircnese

13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese

14 Focos de Criptas Aberrantes 9

15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal 10

2 OBJETIVOS 13

3 MATERIAL amp MEacuteTODOS

31 Animais 15

32 Delineamento experimental 15

33 Preparo da DMH 16

34 Coleta e Processamento do material 17

35 Imunohistoquiacutemica 18

36 Anaacutelise Morfomeacutetrica 19

37 Anaacutelise Estatiacutestica 20

4 RESULTADOS 22

41 Observaccedilotildees Gerais

42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA 22

5 DISCUSSAtildeO

6 CONCLUSAtildeO 38

7 REFEREcircNCIAS 40

8 ANEXOS 51

LISTA DE ABREVIATURAS

AOM Azoximetano

APC Adenomatous polyposis coli

ASMA α-actina de muacutesculo liso

BM Membrana basal

CAFs Fibroblastos associados ao cacircncer

CF Criptas filhas

CFi Iacutendice de fissatildeo de criptas

COX Ciclooxigenase

DAB 33-diaminobenzidina tetrahidroclorido

DMH 12-dimetilhidrazina

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

DP Desvio Padratildeo

FAP Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar

FCA Focos de Criptas Aberrantes

FEA Foco de estroma ativado

HampE Hematoxilina amp Eosina

INCA Instituto Nacional do Cacircncer

kDa K Dalton

K-ras Kirsten rat sarcoma

mRNA Aacutecido ribonucleacuteico mensageiro

MIN Neoplasia intestinal muacuteltipla

MVD Densidade microvascular

NACM Mucosa colocircnica de aparecircncia normal

NMU N-metil-N-nitrosoureacuteia

PMFs Miofibroblastos pericriptais

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 Esquema do delineamento experimental

Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68 COX-2 e

ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo

Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampE

Mucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos

delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de

Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na

Figura B e o limite da mucosa normal e ASF na Figura C ()

(A e B = 400X C e D = 200X)

Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras

brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)

Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma

de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)

Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas

MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal e no FEA

Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2)

densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de

Estroma Ativado

Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A

ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal

com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34

no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta)

C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal

com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo

CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas

positivas

Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)

A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal

com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo

ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas

positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de

aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -

imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande

nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)

Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios

Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos

experimentais

Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de

Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006

RESUMO

Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas

epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em

situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a

importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente

que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em

regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento

e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel

sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a

maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o

carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento

de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico

encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo

aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2

positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero

aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam

ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir

correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses

achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma

tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura

este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser

acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos

marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica

Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)

Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo

Ribeiratildeo Preto 2006

ABSTRACT

There has been considerable that the activity of epithelial cells with their

stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and

pathological situations including cancer A number of reports stress the

importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate

that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in

their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma

development and progression Comparatively less information is available about

the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated

with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal

ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found

in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased

immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2

positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a

increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal

stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes

may be correlated These findings are novel but expected and consistent with

previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis

Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the

epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this

may point to the finding of new markers of neoplastic transformation

Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma

colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)

1 Introduccedilatildeo

11 Cacircncer Colorretal

Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se

tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se

desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes

de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo

crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de

alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994

EVAN amp LITTLEWOOD 1998)

O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias

primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno

(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os

cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam

ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et

al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias

malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos

deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a

Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1

de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que

corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)

A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia

ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas

urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de

cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa

de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)

No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as

neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste

demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus

2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal

para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens

(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior

incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as

possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -

Ministeacuterio da Sauacutede 2006)

A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o

mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios

paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em

diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de

risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem

atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)

Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite

ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia

ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)

12 Carcinogecircnese

Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de

neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um

processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas

de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de

alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)

Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em

camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a

promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK

1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas

das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do

desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e

progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da

carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo

permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas

inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por

carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo

estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave

iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo

O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas

iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de

genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular

Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente

promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem

progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo

estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-

neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva

instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)

13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese

Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o

estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e

patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com

a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo

autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas

neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes

estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura

heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo

ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem

reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de

determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes

relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e

indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas

estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma

embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp

FUSENIG 2002)

Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos

estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do

cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos

como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de

fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH

et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos

adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em

respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui

somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta

desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o

aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e

proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)

Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos

associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo

processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os

miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor

(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete

o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI

et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da

cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na

regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos

natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos

sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)

Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo

de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e

vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL

1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso

exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na

geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem

a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou

ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina

caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor

caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o

padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL

et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)

A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma

caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer

(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na

tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos

decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp

MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades

surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos

tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp

WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em

contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do

tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)

Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de

diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram

encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo

(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute

caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares

lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al

2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha

circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e

parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da

membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos

neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande

nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)

Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma

etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos

tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma

tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976

DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que

os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em

relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila

desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o

desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a

partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas

neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se

aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores

quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)

Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente

expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a

ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de

mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte

de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo

nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar

o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a

COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos

no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)

Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa

intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem

demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira

exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento

da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma

esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)

Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da

morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da

carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel

que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no

processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo

da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma

divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute

estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK

et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a

fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas

Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de

humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e

et al 1988)

Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de

adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no

processo de desenvolvimento normal da mucosa

Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o

espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado

ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em

relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees

se esparramam no coacutelon humano normal

14 Focos de Criptas Aberrantes

Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)

satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de

forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo

carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo

em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)

Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente

empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a

carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas

ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas

e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer

(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA

mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas

alteradas (BIRD 1987)

Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado

com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam

morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas

espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas

adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa

colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose

Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)

Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias

mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de

mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no

gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon

estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento

de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)

Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar

o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de

carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al

1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos

nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou

proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal

15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal

O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais

utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-

nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de

especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al

2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito

(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)

Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos

aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o

aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento

A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos

experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees

nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD

1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um

pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de

DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga

injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se

quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz

metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais

colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um

periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)

2 Objetivos

Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de

marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)

do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar

quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo

com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases

mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon

3 Material amp Meacutetodos

31 Animais

Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia

250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de

Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio

do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de

temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg

e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de

Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP

32 Delineamento Experimental

Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de

adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito

animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125

mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito

anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em

cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes

receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24

respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu

uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram

mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono

33 Preparo da DMH

Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich

Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia

de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de

soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-

se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em

soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo

aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo

hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas

Figura 1 Esquema do delineamento experimental

34 Coleta e Processamento do Material

Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e

submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com

cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos

longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua

graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo

com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em

formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas

Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas

foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees

crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram

submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos

Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon

foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente

para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos

foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e

montados em lacircmina

A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a

contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para

posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de

aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck

amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas

35 Imunohistoquiacutemica

As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos

de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo

com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas

foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em

meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases

teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e

ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de

cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por

12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo

secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes

a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e

contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas

As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a

imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no

citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o

nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada

cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal

Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios

Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo

α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100

CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150

CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200

COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100

36 Anaacutelise Morfomeacutetrica

Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos

marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um

microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)

Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e

utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada

animal

Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno

aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com

intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)

Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro

ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos

de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi

quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os

vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais

Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram

avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos

microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos

intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar

ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas

O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi

contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como

criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de

criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo

somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por

campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes

Nenhum vieacutes significante foi encontrado

37 Anaacutelise Estatiacutestica

A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de

variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5

(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram

expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40

4 Resultados

41 Observaccedilotildees Gerais

Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o

periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo

resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos

ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por

isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com

base descritiva

Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do

experimento

GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn

3664

29938 plusmn

728

29875 plusmn

954

39875 plusmn

4189

49500 plusmn

5879

44333 plusmn

4041

42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA

Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados

com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho

dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram

com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento

com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)

O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento

do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas

somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na

mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por

FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e

tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)

Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68

COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo

CD34 G6 lt G12 (plt005)

CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)

COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)

G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica

O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo

sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade

microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos

apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)

Figura 2

Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)

Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica

Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica

Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do

estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e

representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de

miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em

pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com

carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim

como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o

tratamento com DMH

Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas

como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais

do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora

com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi

encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)

Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em

macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura

9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas

endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)

Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)

Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica

Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado

Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas

Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)

5 Discussatildeo

No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)

ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos

focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais

controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34

CD68 ASMA e COX-2 positivas

Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve

um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para

expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem

foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto

grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)

Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis

destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa

(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou

um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram

positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em

adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas

estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de

adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse

explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste

trabalho

Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as

criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear

nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter

perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais

pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora

consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na

carcinogecircnese

Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos

bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute

particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos

(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que

elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente

literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes

celulares estromais dos tecidos epiteliais

Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas

epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos

fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de

fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES

2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma

associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos

para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente

estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna

de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)

O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e

CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos

animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas

precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de

aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram

observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)

e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon

Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no

cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)

Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute

a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em

tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento

espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a

superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio

gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais

Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2

positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De

maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo

farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel

importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)

BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de

Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos

em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em

outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e

heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda

para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos

comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de

COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles

Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um

resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos

para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor

especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo

no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-

2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e

cacircnceres

Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos

cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos

tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al

1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-

regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via

de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al

2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa

um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em

mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos

A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste

trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-

estroma na carcinogecircnese colocircnica

(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam

acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio

(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos

FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a

transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial

(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam

influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que

iniciaria a carcinogecircnese epitelial

Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e

que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para

confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a

complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na

formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre

epiteacutelio e estroma

1 Conclusatildeo

Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que

1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos

de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da

MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2

2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado

(FEA)

3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem

ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon

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8 Anexos

81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas

ASMAmeacutedia plusmn DP n

N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24

67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135

218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631

CD34meacutedia plusmn DP n

N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24

34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148

52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605

883

CD68meacutedia plusmn DP n

N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24

50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230

95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868

88883

COX-2meacutedia plusmn DP n

N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24

0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000

7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527

8883

82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas

CFimeacutedia plusmn DP n

N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24

0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208

0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400

883

83 Densidade Microvascular

MVDmeacutedia plusmn DP n

N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24

5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516

10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502

883

84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas

meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2

G1G2G6G12G24

1650 plusmn 54962833 plusmn 6658

4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557

150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081

2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000

Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
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