Download - Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

Transcript
Page 1: Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

������������ � ��� ��������� �� ����������� � ���������������� ��������

����� ������� ������ �� ��!��� "������� #��!��$

%�� �� &��������$ "���' �( �������

����������� �� � ����� �� � � ����� �������� � � ����������������� �� ����� ��� � ���� ��� �� ���� �� �� � �! "#$�� %&'#�##���� �� %���(�) �����*�+ '" ,-. '- /' ,.) 0�!+ '" ,-. '- "� ".)�&�� �+ 1� 2���3�����$� ���� ��� �� 4��� �� ��� ��� �� 5* � �� ��4 5647 -8�#�5����� �� ����� ��� 9���� �� :������� ;������� '8#"$&4���� �����

4��� ��� $. ��2����� $##�) �������� $- <��� $##�

)�������� ���� ������� ���� ������� ����� � ��� ��� ������� ��� �� �������� ������� ����� ���������� ��� ����������� �� ��� ������������ ��� ��� ����� ����� ���� ���� �� ������ ����� ��������� 6����� ��������� ����� ���� �� ��������� ���� ��� ������������ � !" ��#�� ���� ���� � $%�&' (�� ������ ������ ��� ������� �� ��������� � � �� ����� �)� �� ����� �� �� ��������� � ��� ����� ����� ��� �� ��� � �� ��������� �� ����' *������ �� �� ����� ���� �� ������������� � ���� ������ �+������ �������� ���������� ������ � $%�&� � ���) ��������� �� ���������� ��� ����� �� �� �� ��� ���� �,-. ��' *��� ������ ������ � � ��� �� ���� ���� ����� ����� � �������� ����� ��� �������� �� �������� ���� �)��� �� � �� �������� � �� ������� ��� ��) ������� �� ��� ����' (��� ����� ��� ,%����� ������ ���� ������� �� �������' ��� �+��� �� ,���� �.����� ������� ��� ��+�������������� �������� �������������� �� �� ��� �� !%% ���� � �� ������� ��������� ��� ������ � �� ,������� ������' (�������� � ���� �� ���� ������ ��� �+�� � ���������� ���) �)�� �� ������ ����� ��� � �� ������� ���� � ��������� �������' � !%%, /�� 0� ��1 2��� *�' � ���*� � �� *+, $3.-$34� !%%,'-��.����, ���� ������5 ����� ���� ��5 ������� ����� �5 �������� ����5 ������������

�/��0 1���0/

����� ����� ����� �� �� �� � �� ����� � ���������� ���� � �� � � � �� �� ������ ��� ���� ����� �� ������ � ������ ������ ���� ������ �� �������� � ������ � � � ���� ����� ������� �� ��� ����� ������ ����� ! ��� � "���� #$$$� ������ � %���� #$$$� &���� ����� #$$�'� (�� ��� ���)����� �� �� � �*����� +����� � ���� �*�� �)������ �� ���� ���� �� � � �� ����,������ ��+� ��, ���� �� �,� ���,�� -&�. � /&

�0 � "�&

�0 �)

���� "�� �� ��� ����� ������� � "���� ����'�&��� �����������,�� � ����� �� ����� ��� ��� ��)

�������, ��������� �� ���� ����� �� ����� ��,��,����

� ���� ������ � ��������� ������ � � ����� �� ������� ��� �� .$$�1' � ��*� � 2 �����*�� ���#�-����3 �� �� ��� ���0'� 4����� ���� ��� ����� � ����)����� �� ����� ������ ��� ������ �������� ������,������ ��� ����� � ���������� ���� � ��� �� ��, ���������� � � �� 5���� ���� �� �� �,��, ������ ��� �)��� �� ��� ��������� �� ��� � ���� �� ����� (��� ��)����� ���������� � *� ����� ����� � �������,66,����77 ����� ����� ���)���������� � ��� � ����� ���� ��, ��� ������� ���� �� �������� � �8��� ����� ����������� �� ��� � �� ��� �&���� ����� �����-� ��� � �� ��� ����'�1��� �� �� �#$$$' 5�� ������� ��� ����� ����� ����

�� ��9)��� �����+��� �� 9)�� �����+ ��� � � ��+��� ���������� :9�# �� ���� �� ����� ����� �������� ����� �� ���� �� ��������� "�������������� ,���� �� ����� ����� �� ��+�� ��� ��������������� !������,�� �� �� �#$$$' ������ ��� ��)���� �� � �� �� � � ��+� �� ������ ���������� ���)�����)9)��������� +����� ��� ;��������� �� ����<� ��=�' � ��� ������� � 9>�1� (��� ����� ��� ��� �������� ������� �� ��� �� ���� �� � ,����� ������������ � ��, ��� ������ � �� ���� ������������ �� ��������, ��� ����� ����� �� ����� � �)��, ���� � ���� ��� �� ��� � �� � �� ,� �� ������� � ? ��� @ � �� �� �#$$$' ���� ���� � ��)������ �� ����� ���� � � ��+� �� ���� � ��������+����� � ���� ��� � - �� �)�����)9)���������) +����� ���� ;������� �� � ��� ;��������� ��� �.$�1� -��� ����� ����� ���� ��� ��� ��� ���������, ��������� � �� ������5� ���� �� ������ (�� ������+��� ��� �� �� �� �� ��������� �� � ��� ������)��+� ����&�� ��� 5�� ���� �� ��� ����� ����� ��� ������ ������

��� �� ������ �)����������� ������� � � ������ ��5�� ����� ����� �� ���� �� ��� ��������� �� ���, ������� ������ �� ����� ��� ���� �� ��� ���� ���)����� ���� � ��� ������� � <$�1'� �)1����������� ������ ��� �� �� � ���� ����� �� � � ������ ������ � ���� ������ �� ���) ����� ��� �� �������� ��� /���� A��B @� �����

� !%%, /�� 0� �� 1 2��� *�'

Page 2: Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

�% � ���� �� ��� ���<� C��� �� ��� ���0� @����*� �� �������'� �� ��� ������� ��� ���� ��� � ��, ��� ��)���� �@�+ �� �� ��� ���> � @����*� �� ��� #$$$' ������� ���� �@�+ �� �� ��� ���.� ���>�'� �� ��� � �� �����+�� ��� ������ �� �) �����)@)������� ������ �����4(/!' �� �� ������5� ����� ���� �) �����)@)������������ ���� �4(!!' � �)���� ���� � ����� �� �)��������� ����� ����� ���� ������ ��� �� ��� ���� �� ��� �� � �� ������ ���������� ��, ��� ������ ���������� ���� ��� ���� ���� ��� ����' � ������ ����� 1 ���)�� �� � "���� #$$$� 4*� �� ��� #$$�'D ��' �)�����)9)��������� +����� ���� ;������� ��� E!����FE-&�. F� ���'�)�����)9)��������� +����� ��E����;����������'����)���F ��� �� ���;����� E!����FE(�#G�F� ����' �)�����)9)��������� +����� ���� ;������� ��� E-����FE-&�. F����' �)�����)9)��������� +����� ��� ;��������� ���E-?���FE/&�0 F� � ��' �������������� ������� ���;�)��� E?(H4�FE(�#G�F�

%)�2��)�� )/ %2�30 �

� ������� �� 2����

�)1���������� �1(' �!1 9�.�#���' ���� �� ���� ������� ���� � 4(!! ���� ����� � ���� "�,� 1����� � 1�� "������ � ����� ������ � ���� ���)�� � ���� "�,� )4�����)&��* 1����� � 1�� ����� �� ��� ��,��� ������ � �� ����

��� ���� � ���� �������

�&%�*��&'&���*�� � ��=� �� >����?��2����@%� �6A@���

7 A

(�� ����� ����� � ���� �� ������, �� "� ��+ �� ������0'D .�.$ , �� !?���-�� �#9�$ ����' � #��9 , ������ ���� ;������� �� �#9�$ ����' ���� ���� �� #<�@ �� ������� 4���� #. �� ��� �� ����� ������� � 5����� �����,� � �� ������ � ������ ������ ������ � ����� !��� ����� �� ��� ����� ���� 1�#1�#�<$ �@'� 5��� ����� �� ��� ���� �� ��� ������ ��������� ������� � ����, ���� ��,� � ���� ��$�#

����' � <$�1 ��� #. � �� �� 9��< , �� E!����FE-&�. F ��� � ��� ����.� ��� � ����'�

�&%�*��&'&���*�� � ��=� �� �����&>� ?��&6&@B�� ?�����*��C 7��0��A ���*�����0�� ��@%� �6A@>0!6

�A�(�� ����� ����� � ��� ��� ������, �� ��� �����)

��� �� -����3 �� �� �� ����0'D �9��0 , �0���� ����' ��!����-�� �#$�< ,��@�G(�# �0��������'���������� <$ �@ �� ��� � ��� �>$�1'� !��� ����� ���� 1�#1�#�# � <$ �@'� �������� ���� ���� ����� ������� �����, ���� ��,� � ���� ��$�# ����' � �$$�1 ��� #. � ���� #9�� , �� E!����FE(�#G�F ��.���� � ����'�

�&�����&'&���*�� � ��=� �� >����?��2�����@�� �6A@���

7 A�

(�� ����� ����� � ���� �� ������, �� "� ��+ �� ������0'� "���� ���� ;������� �� �<��9 ,� <9�� ����'� � �� ������� �� -����1�� ���9$ ,� <9������' �� ������ �<$ �@' � ���� ������ ����� 4����#. � ���� ������,� ��� �� ����� ������� � 5����������,� ���, �� ������ � ��� ������ � ���������� ��,� � ����� ,����, ���9� , �� E-����FE-&�. F ��<� ��� � ����'�

�&�����&'&���*�� � ��=� �� D�!�?���*��*����@�� �6A@��3

�A

(�� ����� ����� � ���� �� ������, �� ��������� �� �����' ������D ��� ;������������� �� ���9���' � ����� � �� ������� �� �)�)�����)9)��������� +����� ������� ��>0�< ,� � ���' �� <$$ �@�� � ���� 4���� ������, ��� �# �� ��� ����� ���� ���)�� � ��� � �� ���� (�� ����� ����� ����� �������� � �� ���� � ��� ����� ��� � ���, ���� �����,�� ����� (�� ����� ����� � ���� ��� ���� ��,�� ���� ��$�# ����' � >$�1 ��� #. � �� ��, �� #<#�� , ��E-����FE/&�0 F ��� � ��� ���� ��� � ����'�

���*�� >� ������� �� � �B>� ?�����*��C7��0�� 9� ��� @�> 96A@>0!6

�A(�� �� �������� ��� -����-&�. � ��D �$

���� �� 4���� � 990 �.�$. ,' � �$ ���� �� @�G(�#���<. ,' ���� ����� �� <$ �@ �� ������ � ���������� ����� 4���� #. �� ��� �� ����� ������� � 5�)���� �����,� ���, �� ������� (�� ������ � ���������� ����� ������ � ��� ����� ����� ��� ������,� � ���� ��$�# ����' � >$�1 ��� #. �� ,����, .�9> ,�� ��� � ��� ��<� ��� � ����'� ��G?: �4������ 0�9$$ ?�+� ����=(?"'�D 9�.� ��� 0�'� 9�#� �� 9�'� ���$���� 0�'� ��9� ��� 90�'� $��� ��� A I 0�0 �+� ��'��91G?: �4������� <$ ?�+� ����=(?"'�D �#9�<������<#� �#�.�� 0#�<#� 9#�<�� 9#�.�� #0�.�� #9�9$� #9�#9�##�>�� �.�9#� /������)��� @"�?" ��=+'D �$�.��� �$.#����$>$��� �$����� ��#0��� ��<.���

���������������� ��������

H��)����� ������)5�� �����,� � ��� ����� �� $�� ?4(!! �� �)���� ��� ���� ����, $�. ? �������� ����� � �� ����)� ��� �� � �� � �@ ��� � ���������� ����, �<< �@ �� � �� ����� ������ E!����FE-&�. F�E!����FE(�#G�F� E-����FE-&�. F� E-���

�FE/&�0 �� �E?(H4�FE(�#G�F� (�� �� ����� � � ��� �� ��,#$ �@ �� � �,=�@ �� �)����������� �� � ��� � ��� � <$�1 ���� � *��, ��� � �� 4� ��,�� � ���� ������ ��#<)�@ ������ ���� ���� ��� � ����� �� .>< �@

$37 8*9(:&;<9�9=> ?<@ 8*9:<=*<::A*<=� B9�' C$� <9' $� @:&:D8:A $� !%%,

Page 3: Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

�� <$� ��=�' ����� �� �� ��� ��� �� ������ " �������� ��,������ � *�� ��� < ���� � ���� � ��+� ����,�)������� ��� ����� ����� ��,� ��� ��/@1'� !�)�������� ���� �������� �� ����� ���

3��� )������

"���� �� � ������ �������� ���� ���� ���������� �/@1 ���, @�1������� :/)�� ������ ��< �����,�� � 9�� �� ������ � � ������ < �� � ������ �+� � �$ �� ���� �+�'� " ���� ���� ����� ���, ���� �,� ���� �/� � 4D �$� �=� ����������� � �� �=� ����� ��� /� � -D <$� �=� ����������� � �� �=� ����� ��' � � �@ ����� ;�� � ��� !������ ���5�� ������������ � #>0 ��� H�� ���� �� �������� ������� � �5�� ��� ����� �� ��+��� �� � ������ � ���� ���) �����)@)������� ������ ���� �4(/!' ��� ����

2���� ��������� � � � ������� � ���� �������

���� �8����� ����)� ��� �� � �� � �@ ��� � ���������� ����, �<< �� �� ����� ����� E!����FE(�#G�F�E-����FE-&�. F� E-���

�FE/&�0 F� � E?(H4�FE(�#G�F�

#$ �@ �� � �,=�@ �� �)����������� �� � ��� ���� � � ��� ������� ����� �� � <$�1 �� ��� ������� ���� ��� (���� � �8����� ����� �#< �@ �� ��)�� �� ������� �$�� ? 4(!! �� �)���� ��� ���� $�. ?�������� ����' � � �� � �� �� �� � ��� �� ������ ������� ������ ����� &�� ����� ���� �� ���������� �� ���� ��� � � � �� ����� ���� ����� ����� �8����� ����� � <$�1� � ���� �#< �@ �� �������� �� ������� � � � ������ ����� (�� ��) ����� � �� � ��+� �� �/@1 ������ �����

�2�1��� )/ ���1���0/

���������������� ������� � ���� �������

-���, *������ ��� ��������� ������ ��� �� ����� )���� �� � ���� �� ���� �� ����� ����� � � ��,���

������� �� ��� ����������� ������� ������ �� ����� ����� ��� � 4 � � �� ��� �� "����� � ��� ������������ ��� ����������� ���������� �� ��� � ��)�� ����� ���)��+��� �������� �� ������� � �����������' � ������ ������������ �� ,���� ��� �)���� ��� ��� ������5� ����'� (��� ��� �J������ ����+��� ������� � � �� ������ �� ��� �������� � ������ ���)���� ���������� � ��� � ��� � ��� ����������� �� ����� � �� �����������'� �� ��� � �� ���� � ����� �%��� �� ��� ����� H�� �� �� ��� ���<� - ����� ��� ����' ������ ��� ��� ������� �� ��� �)����)������� ������� ��� ���� ������ � ���� ������ ����� ������� �� �������� �����4(/! ������ � � ��+� �� �)����������� �

�������� �� 5�� ����� �����D E!����FE-&�. F�!����FE(�#G�F� E-����FE-&�. F� E-?��

�FE/&�0 F �E?(H4�F E(&#G�F� (�� ��+��� �� ����� � ��� ��������� �� �)����������� ��������+� ����� � ���)������ ����� �� � *��, ����,�� �� ��� ����� �������� �� ��� ����� �� ��+��� ���� ��� �� ����� ��� �"���� �� ��������� � ���� ������ ���� ������)����������� ������� � � �� ��� �� ����� ��)� � 4 � �� ����� &�,��� �4 ��� ��� ���� ����� ������ �� ��������� �� 4(!! � � ��+� �� �)���������)�� �� ���� ���� ��)���� ���' � E-����FE-&�. F ���������� ����� � <$�1 � #� ��=�' � ��� �������� 4� � �� ���� ��� ��+��� ������� � �� ���� ��� +��� ����9$ ��� �� �� ����� �� �)���� ��� ����� �� �� ��+���� ���� ����� &�� ��� E-����FE-&�. F ������ ������)��� ���5�� �� 4(/! ��������� � ������� /��5���� �� ��� ����� ����� ����� �� ���� ���� �� &�,��� �-����� ��� �8��� �� ������ ���� �� ��� �������� ��������� �)����������� �� �)���� ��� ����� � #� ��=�'� ��� �������� ����� ��� ��,��� ������� � ������ �<$�1� ( ��� � ��� ��� �������� ������� � ����������� � ����� �������� �� �)����������� �� 4(/!������ �� ���� ��)���� ���' � ��� �8����� ���������� �� �� ����� ��� � #� ��=�' � ��� ������� � <$�1� (�� �� �� ��+��� ����� ������� ������ � �� ��� ����� ����� ���� ��� ��� ��� ��� ����)�����������)� � ��+� �� ������5� ���� �� ������

������ �� "������ �� 4(/! ���� 4(!! � �)���� ��� � � ��+� �� �)������������

�9E?<9 :( ?�'� ��&;>D9(A>F2*< 8:;?B*9GA *< *9<*& �*HG*@2 $3$

Page 4: Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

�����,� ��� ����� � �������� � �� � ����� �� � �� � ���)���� ���� 4�� ����� � � �� ���� ��� �� ��� ����5������� � � ����� � ��������� �� ���� ����� ����� � ����� ����� ����� ���� ��� ��+����"���� � ����� �-����3 �� �� ��� ���0� "�� �� ��� �����

������� � "���� ����� 1 ����� �� � "����#$$$� 4*� �� ��� #$$�' � �� ������ ���� � ����� � � ������ � �� � �������� ������ ����� � ���������������������� ������������� � ������ �������� ��)���� ���������� ����' �� ����� ����� �������� �� �������� (�� ������ ���������� ��� ���� � �������� � ��� ������� *�� � � ����� ��� � ��+��, ��� ��)� ���� �� �)����������� �� ����� ����� ��� �� ����� � 8��� ���� ��� ��+��� ������� � � )�� ��������� ����� ������������ ���� ��� �� ����� ������1 ����� �� � "��� �#$$$' � 4*� �� �� �#$$�'

� ��+� ��� ��� ���� �� �) �*��)9)��������� +���������� ����� �� ;��������� ����������� (��� �)���� ������� �� � ��� ���� �� ���� ����� ����� � ���� � ��� �� �� � �� ��� ����� ������ ������ ���� ������� ���� ����'� 4����� ���� ������ ���� ������� ������� � �� ���� ��� �� �� ���,�� �� ��� �*�� ������)

��� �� ��� ��� +����� ���, �� ��� � ���� � ��� �����+�� ���� � ����� � �� ��� ���� � � �� ������� (���1 ����� �� � "��� �#$$$' ������� �� � ��� ��)� ���� �� ����� ����� � �������� �� ��� ���� ������� ���� ����, ���� �) �*�� ,���� � �� ��� � ������� ���� ���� ����, ���, �) �*�� ,����� -� ���, ����������� � ��� �� ����� ����� �� ��� ���* ���� ���� �5� �� ��� ���� ������D E!����FE-&�. F KE!����FE(�#G�F K E-����FE-&�. F K E-���

�FE/&�0 FKE?(H4�F E(�#G�F� -� ���� ���� ���� � �� ( ��� ���� � � �� ��� ��� ��� �������� ������� � �� ��)��� �� ��� ���� � �� ��� ��� ���� �� ��� ����� ���������� ��� ��������� �� E!����FE-&�. F� (�� � � � ������������ ���� � ��� � � ���� �� ������� ��� � � ���)������� ������ � ��*� � 2 �����*�����#� -����3 �� �� ��� ���0'� %��������*� �� �� �����'������ ��� �)����������� � ���� ���� �� ������������ �� �8����� � ���)������� ��, ��� ������ ���������� �� ��� ��������� �� ��� ��� ���� ���� ���������� �� ����� ������ � ����� �� � ��� ��������� ��� �� �� ��� ��, ��� ������ ��������� ����� �� � �� ��� ��, ���� �8��� E!����FE-&�. F �� ����)����������� ������� � ��� � ��� ������� ���� �� �������� �� ��� ����� ����� ����� ���� ��� ��+������������ �������, ������� �� ��� ���� �� � ����������, �@�+ �� �� ��� ���> '� �������� ��� ���� ��� ��� ���� �� E-����FE-&�. F ���� �� ������� �� ���� ����� ��� �� � � ����� ������� ����, ��� �� ����������� ��� ���� �� ����������� �� ��� ��+��� � ��������� ��,��� �� � �� � �� �)���� ��� ���� � � �� �� ������H� ��� ����� � �� �� � ������� �� � ����� �����

��� � ��� ��� ������� ������ 9. �/ � <>. �/ ���E!����FE(�#G�F � E?(H4�F E(�#G�F� �����������'�-����3 �� �� ��� ���0� "�� �� ��� ����' ���� ������ ����� �)���� ��� ����� �# �/'� ��� ���,�� �� ��� ��)

���� �� �4' (���)����� �� 4(!! ��������� �� �)����������� �� ������ 4(/! �� �� ������5� ���� �� �)���� ��� ��' � E-����FE-&�. F��'� � #� ��=�' � ��� ������� � <$�1� �-' !8��� �� ������ ���� �� 4(/! ������ � � ��+� �� �)����������� �� �)���� ��� � #� ��=�'� ��� ��������

���� �� "�������� ������� � ���������� �������� �� �)�����)������ � � ��+��,�) �����)@)������� ������ ���� ������ �� ��������

����� ����� � #� ��=�' � ��� ������� � <$�1�

"�������� 4������� "����������

?�� �L=�, ��+' ��'

�)/��� ��� #9�# M $�� �$�� M #��

E!����FE-&�. F $�. M $�� �$$�$ M $�$

E!����FE(&#G�F �9�0 M $�< ><�# M #��

E-����FE-&�. F .�� M $�# >��< M 9�#

E-����FE/&�0 F ��� M $�� >0�# M .�$

E?(H4�FE(�#G�F #�9 M $�� 00�. M #��

$33 8*9(:&;<9�9=> ?<@ 8*9:<=*<::A*<=� B9�' C$� <9' $� @:&:D8:A $� !%%,

Page 5: Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

�������� �*�� �� �� �� ��� � ���� � ��� ���� ��+ )���� �� ��, ���� �� �,� �� ���� �������� � "��������' ���� ����� ��������� ��� ��� ����� ����� ����� � �� � ����� � �� ��� ������� �� ��� �� ���������� � ������ ���� E!����FE-&�. F �� E?(H4

�FE(�#G

�F � � � �� � )�� ���� �������, � � ������� � ���� �� ����� ��� ��+�� ��� �������� ����������� ����� ����� ����� ����� E!����FE-&�. F ������� ���� �������� ��������(�� ���������� � � ����� �� ��� �� ����� ��� ( ��� �'

���� ��,�� �������� ���� ��� ����� � �� ��� �*���� �� ���,�� �� � ����� ����� ����� �� ������� ��� � �� � ���� ��� �������� (���� ������ ��������� �� �������� �� ���� ��� ������ �� ���� �� �� �� ����,��)��� ���� �=�� ������� � ��� �,����� ���� ��+ ���� �� ��� �� �,� �� ��� ���� � ����������'� �� ��� � � �� ��� ��� +�����)� � ����� �������� � ���� �� � ����� ��, ��� �� �� ���,�� �� ;����)� ���, �*�� ��������� �� ���� ��� � ���� � ������ �� ,�� ��� �,��� �� ������������� �� ����� ������-����3 �� �� ��� ���0� 4������, �� ��� ����'� (��� ����������� �� ���������� � �� ,������� ���� ��� ��)��� � �� ������������� �� ��� ��� � (��������� ����� �� � ��� ������� �#� �=�'� ��� ����� � �� ����)��������� �� ��� ����� ���� �� ��� �� ���� � ��)��� � �� � ��� ������� ���� ��� �������� ������, �����+��� ����� �� ��� ��������� � � �� ��� ������� ������ � ��� ��������� ����� � � �� ������������ ��) ,��� ��� "����� �' �� ����,� ���.� @����*� �� ���#$$$'� �� ��� � �� ��� ��� ���������� ����� �����E!����FE-&�. F� ����� ������ ��,� ������� �� ��� ��� �������,� ��,�� � �� ��� ����� � ��� ������� ���� ��� ������� �� ���� ��� ��� �����������

2���� ��������� � ���� �������

(� *��� ��� ����� ��;����� �� ���� ����� ����� ����� ��+���� ��� � ������ �� �)����������� � ������ ����� ���� ���� � ������� ��� ������� �� ��)�� �� �4(!!' � <$�1� �� � ���� ���� �� � �)����������� ������� � ������ �� ������� �� �� � )��� ����� � ������ ���� ��,��� �� � ��� ������,����� �.9���1'� ����� ���� ��� �� �� ������� ��� �,� �@�+ �� �� ��� ���.� ���>�'�

(�� ����������� �� ���� ���� �� �)����������� ��)+��� � ���� ��� ���� ������ �� ����)�������)��� � ���� ���� ���� �@�+ �� �� ��� ���.����>�'� �������� ��� � �� ������� �� ����� ����� ��$$� �� ��� ��� ����, �$N�<�' ���� �� ��� ������������� �� ��� ��������, ���)��� � ���� ���� ����)�����

! � !$ � �����*������� * ��

��' � ��� 5��)���� � ���� ���� � �� ���)� ��� � !$ � ! �� ����� � � ���� � �������� )���� �� ����� ��+���� ������������ 4����� ���� ����! I !$=#� ��� ���� ��' � � �� �5�� � �� ���� �������=#'� � �� ��=# I ��#=��&�,��� # ��� ��� � ���� ���� ���5�� �� �)������)

����� �� ���� �8����� ����� ����� �E!����FE(�#G�F�E-����FE-&�. F� E-���

�FE/&�0 F � E?(H4�FE(�#G�F'

� �)���� ��� ��� � <$�1� 4 � � �� ���� �� �) ���� ���� ���5�� 5��� ��� ���� ���� ��� 5��)����*������ ���� � # K $��>'� ������, � ���� ���� �� ���� ���� ���� � �� ���� �� � � ��)���� ���� ����

���� �� &���)���� � ���� ���� ���5�� �� �)����������� �� ��)�� � ��� E�� �)���� ���� �� E!����FE(�#G�F� �� E-����FE-&�. F� ��E-����FE/&�0 F� �� E?(H4

�FE(�#G�F �� ��� ����� �� ���� �� �<$�1� "��� ���� 5��� �� ���� � ��,����� � ����

���� ��� &���)���� � ���� ���� � �� ���� �� � � ��)���� ���� �� �)����������� �������� �� ����� ���� �� �8����� ����� ����� � #O �=�� ��� ������� � <$�1�

������ ���� �� ��� ���� ��

?�� * ����' ��=# ��' * � �$# ����' ��=# ��'

�)/��� ��� .�.< M $��# $��< N N

E!����FE(�#G�F $�0. M $�$# ��$� <�0# M $��� �#�99

E-����FE-&�. F $�90 M $�$� ���9 .��� M $�9< �.��<

E-����FE/&�0 F $�.. M $�$# ��<� #�90 M $��# #��9.

E?(H4�FE(�#G�F $�#0 M $�$� #�09 <�00 M $�#� �#�#.

*D P� ���� ���� � �� ���� ��� ��=#D � �� ���� �����

�9E?<9 :( ?�'� ��&;>D9(A>F2*< 8:;?B*9GA *< *9<*& �*HG*@2 $3C

Page 6: Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

�� ( ��� ��� P� ���� ���� ���5�� �� �)����������� ����� ������� �� ��� ���� �� ���� ������' ���������� � ���� � ���5��� 4 � � �� ���� ��� �)���� �������� ������ � � � �� �� ��� �)����������� �)������� ���������, � ��)���� ���� �� $��< �� �� ,����������� ��� �� ����� ���5�� ���� �� &�,��� �4� ����������� �� �� �� ��� ����� ����� ������� ��� � ��� ���)���� �� ��+��� � ������� ���� �� ��� ���� � �� ���� ���� ���� � �� ���� �� � ����� � �� ��� � ��)��������� 4����� ���� ( ��� �� ��� ��� ��� ����� � ��� ��)���� ���� � �� ���� ��� �� ,������� ���� ��� ��)��� � �� ������������� �� ��� ����� ������ �� ��� � ����� ����� � �� ������������� �� ��� ���� ���� ������� ������ ���� �� ��� ����� � � ��� � ��� ���� ���������� ��������� ������, ��� ����� �������)��� �����) ����� � � ��� ����, ��� ��+��� � ������ ��� ��� ��� ���� ��������� (� ���� �� ��� �8��� �� ���������� �� ��+��� � ���� ����� ��� ���� � ����+ ����� � ����� � � �� �5�� ��� � ��� �� �)������������ ��)���� ���� �� ���� ��� � �� ������ ��� ���,��)���� ���'� &�,��� 9 ��� ��� ��� ���� � ����+ ���� ����� �� ����� ����� �� �)����������� � ������ �<$�1� �� �� � �� ��� ������� �� ��� �������� ���� ���4(!!' �� ��� � ���� ���� ��� ����� ��� ��+��� ���� ,�� ��� ��������� �����, ��� � ��� ������� ��� ��)���� ���� �� ��� ����� ������ �� ��� � �� �� � � ����� �� � ��� ��� ���� � ����+ ���� ��� ��� �� ���,E-����FE/&�0 F �� ��� ������� �� ���� �� � �� ���#$$� (�� ��� ������� �� ��� �)����������� ����� �� ������ ������ �� ��� ������� �� ���� �� � �������� �� ����� ��� � 0$�1� ����� ��� � ��)����� ����� � �.$ ���� �@�+ �� �� ��� ���.'� 4��� ��������� ���� �� ,������� ���� ��� ��������� �� !����)��,�� �� �� �#$$$'� ����� ����� ����� ��,�� � ����+���+��� �� ,�� ��� ������ �� � ��� �������� ��

��, ��� ������� 4����� ���� ? ��� @ � �� �� �#$$$'������� �� � ���� ���� � ��������+� ��� � ���� ���� ��� �� ������5� ���� �� ������ ����� ��� ���� ��)+��� � �� �8������ �� � ��������+� ���� �����(��� � �� �,,�� �� � ��� �� �� ��������+� ���� )���� ���� ������� ��+��� � ������ �� ����� ����� ���� ��� ����� � ��� ���� � ����+ ���� �8��� �� ������� ���� � �� � ��� �� ��� � � ����� ����,���� �� ��� ��)+��� �@����*� �� ��� #$$$'�

�0/��1��0/�

����� ����� � �� ���� ���� �� �� ���������� ��� ��� �)����������� �������� �� ������ 4����� �������� ������ �� ���� ���� �� � ����+� ��� ��+��������� ��, ,�� ��� �)����������� � ��)����� (�� ��� ����� ����+ ���� �� ���� ����� ����� ���� �� ��� �� �� ����������� �� ��� ���� �� ��� ����� � �� ���,�� �� ������������� �*�� �� �� �� � ���� ��= � ���� �+��4��� ��� ������� �� ���� �� ,�� ��� ������� ��)+��� � ������� E-����FE/&�0 F � ���� �� �� ������ � ����+��, ,���� ����� ����� ��� �� ,�� ����� ���� �� ��, ��� ������ ��� �� ��� � ���)���������� � ��� �� ��+�� ��� �������� �������

(�� ���* � � ��� ��� ������� �� ��� 1�1Q( ,� ��

-�H��)$.�#)1$#)$��

��������

4*� "GR%� -������*� A&� " � �� 4� #$$�� ��� ��� � �� ����)

������ ���� ����� �����S 1��� 1����� �D.�9N.�.�

4������, P � �� @� @�� Q"� ����� !� ��� ���� �� ����� ����� �

����� ����� ����� ���� ��������� ���� �� � ���� �� �� � ��

, ����� ��,� ���� 4� � 1��� >�D9�>9N9�>0�

- ���:A� ���T� !� 4��������+ /� ����� !�� ������� �� ��������+�

����� � � � ��+� ������� ������ �� ��� ������� �� ��������

������ �� ������������ !�+��� ?����� (������ #.D.�$N.���

-����3 �� /� P� 4/� / � ,���,��� G� % �� � �� � � %� C� U �+���

?� ���0� ����������� ��,��� ��������� ������ ������ ����

������ ��� ����, 1��� 9<D��0�N��>��

-� ��� � @4� � ��� P� -��*� � !A� -������*� A&� ����� C����

�������, ���, ����� ����� � 1H#� G ���� 9��D#�N#��

1 ����� �� 4A� "��� %:� #$$$� /�� ���� ��� �� ��� �) �*��)9)

��������� +����� ������)������ ���� ����� ����� ���� ���

��� ��������� ��� G��� ��� A /�� H�, 1��� �9D<��N<�<�

1��� "C� ������� AP� R �, )?�� R� "��� %:� @�� CA #$$$�

:��� ������ ���� ���� ������ ��� ��, ��� ������ �� �����)

�� � �������� ���� ����� -�������� -����, 0�D##>N#99�

! ��� ?A� "��� %:� #$$$� ����� ������ C���� ������ ��� ���

������� /��� 4��� 1��� >#D�9��N�9���

!������,�� ?� ?�� �� 4A� :��� 4A� #$$$� !�+�� ��� � � ��� ��

���� ���� �� 2) � �� �� �� ����� ������ 4� ����� ���� �� ��+�)

� ��� � � ��� �� ��, ��� ������� -��������� /��, �0D��#�N��9��

&���� ���� ?� ����� P��,��� ������� ����� ����� � � ���� ��� �

��������,� ����������� 1��� !�,�� G�� >0D9#N9>�

&���� ���� ?� #$$�� G�� ����+�� ��� ����� ������ 1��� !�,��

G�� >�D#�N#<�

C��� �� @�B ��+)& ���V � :� A��� W� R����� !G� ���0� -����,�� ���

����� ������ � ��+�� ��� ���� ��� �� ����� ����������

!�+��� ?����� (������ ��D�0#N��9�

���� �� :�� ���� � ����+ ���� �� ����� ����� �� �)����������� �<$�1� �� ��� ����� � ������� �� ��� ���� �� �4(!!'�

$3I 8*9(:&;<9�9=> ?<@ 8*9:<=*<::A*<=� B9�' C$� <9' $� @:&:D8:A $� !%%,

Page 7: Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

� ����, /A� ���.� (������� ��� ��������� ��� ���� � ��� ��

������������� � ��� D (������ ���� � �������� ���� ���

���������� � ��,� � � ���� !�+��� ?����� (������

�0D�>�N#$0�

������� AP� "��� %:� ����� (�� �� � ��� ����� �� �) �*��)9)

��������� +����� ���� ;������ ��� ����� ����� � ����� �����

���� �� A 1��� "�� P ���� (� � �9D#�99N#�9��

������� AC� ��� ��� �P� "� ���*� :/� R��� 4!� :�,�� :P�

����� :���)������ ���� ����� ����� ����� ��� ��� 66��� �77

�����)����� ���� ������ 1��� 1����� �0D�>0<N�>00�

% � ���� %� "�, � � �� "�,�� � "� � � �� �� ���<� !8��� ��

� ��� ������� �� ��� �� �������������� �� �)����������� � � ����� ��, ��� ��� � -��������� @��� �>D��0�N��00�

%�������*� Q@� ?�+� �� RR� -���� 4-� "��,��� ?R� ? �����*

%� ����� P�� ��� ���� � � ����D ��� ��������� ��� �������� ��

��, ��� ������ �� ����� ��� �� ���� � ���� !�� A -������

���D9�N.��

%��� �� &�T����� %� G������� �� ����� !�+�� ��� �� �����

�� �����)��, ��� ��� � R�� /����� ������ �� �)������)����� �� ����������� ��, ��� ������� A -��������� �D

#>�N#�$�

@����*� RQ� @�+ �� /� ����� A@� ����� %������ � ��� �� � ���)

� ���� �� ��������+� �)����������� �� � ���)�������

��, ��� ������ �� *��������� ������� -��������� -����,

0<D�>$N)�><�

@����*� RQ� @�+ �� /� ����� A@� #$$$� P��,���, ��+�� ��� *��)

������� ������ �� ��, ��� ��� ���� ��� � ��� �������� !�)

+��� ?����� (������ #0D0$�N0�9�

@�+ �� /� 1���� P� ����� A@� ���.� !8��� �� ������ �� �)����)������� ������� ������D ���� ����� � ��� �� ��� ��+���

� ����+ ����� A -��������� 9<D�N���

@�+ �� /� � P��,� (� ����� A@� ���> � ������������� � � ���

������� ��� ������� �� � ���)������� ������ ������ �� *��)

������� ������ � � ��+� �� �)������������ -��������� @�����D�$$<N�$$��

@�+ �� /� � P��,� (� ����� A@� ���>�� P�� ��� ��������=��������

��� ������� �� ��� �)����������� � ���� ���� ����� �� �� � � ��� !�� A -������ #.�D�$N�<�

? ��� @ � :� � � : ����T* &� "��� %:� "����� :4� #$$$�

@�� �)� � ��+� �� ����� �� ����� ������ H�, @��� #D.���N.����

H�� �� �� ����� Q� %�� � �� 4� "�, � � (� ���<� (� ������5)

� ���� � � ��+� �� ����������)������� ����������� �� ����)

���D (�� �8��� �� ����� ��+ ���� �� � �� �� ���� ,���� �� ����,

�� ���������� ����� -��������� -����, .�D.#N.��

"� ��+ /42� P����� A!@� !������ "� P� "��+ :&� P����� A� ���0�

(�� �� �� ��� ����� ����� �� ���)�� � � � ����� ����,�� ����

�� ����� �� ������ ��������� /�������� �<D�#�>N�#���

"�� A� &����� ?� ? �& �� �� P:� ����� :���)������ ���� ������

�� � � �� �� ���� �� ������� ���� A /�� 1��� -

�$#D��<�N��0.�

������ /� %��� � #$$$� ����� �����XG�� ������� ���

�� ������ ��� � � � ���� 4�,�� 1��� ��� ! 9�D9>>#N9>���

����� (� ����� :���)������ ���� ����� ������ "������ ��� ��)

���� � � � ���� 1��� :�� ��D#$>�N#$�9�

��*� A"� 2 �����*� ?A� ���#� 4�� � � ��� �)�����)9)���������)

+����� � � ����� ������ A 1��� "�� 1��� 1����� �9D�0<N

�0>�

�9E?<9 :( ?�'� ��&;>D9(A>F2*< 8:;?B*9GA *< *9<*& �*HG*@2 $34