Download - (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

Transcript
Page 1: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

(12) PEDIDO INTERNACIONAL PUBLICADO SOB O TRATADO DE COOPERAÇÃO EM MATÉRIA DE PATENTES(PCT)

ά llll l l I I I I III III III I I I I II I IISecretaria Internacional —

) Número de Publicação Internacional(43) Data de Publicação Internacional ' ' WO 2013/082682 Al13 de Junho de 2013 (13.06.2013) W P O I P C T

(51) Classificação Internacional de Patentes : Geraldo - Caixa Postal 6. 13 1, CEP: 13083-970 Campinas -C12P 7/06 (2006.01) C12P 7/00 (2006.01) SP (BR).B01D 11/04 (2006.01)

(81) Estados Designados (sem indicação contrária, para todos(21) Número do Pedido Internacional os tipos de proteção nacional existentes) : AE, AG, AL,

PCT/BR20 12/000470 AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BN, BR, BW,BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK,

(22) Data do Depósito Internacional : DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM,23 de Novembro de 2012 (23.1 1.2012) GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KM, KN,

(25) Língua de Depósito Internacional : Português KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LY, MA, MD,ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI,

(26) Língua de Publicação : Português NO, NZ, OM, PA, PE, PG, PH, PL, PT, QA, RO, RS, RU,

(30) Dados Relativos à Prioridade : RW, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, TJ,

PI1 105 142-6 TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA,

7 de Dezembro de 201 1 (07. 12.201 1) BR ZM, ZW.

(71) Requerente : UNIVERSIDADE ESTADUAL DE (84) Estados Designados (sem indicação contrária, para todos

CAMPINAS - UNICAMP [BR/BR]; Rua Roxo Moreira os tipos de proteção regional existentes) : ARIPO (BW,

1831 - Distrito de Barão, Geraldo - Caixa Postal 6.13 1, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, RW, SD, SL, SZ,

CEP: 13083-970 Campinas - SP (BR). TZ, UG, ZM, ZW), Eurasiático (AM, AZ, BY, KG, KZ,RU, TJ, TM), Europeu (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ,

(72) Inventores : MAUGERI FILHO, Francisco; Rua DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, ΓΓ, LT,Monteiro Lobato, 80, CEP: 13083-862 Campinas - SP LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI,(BR). ZAUSTEN, Remigius Reinerus Maria; Rua SK, SM, TR), OAPI (BF, BJ, CF, CG, Cl, CM, GA, GN,Monteiro Lobato, 80, CEP: 13083-862 Campinas - SP GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG).(BR). VAZ-ROSSELL, Carlos Eduardo; Rua GiuseppeMáximo Scolfaro, 10.000, CEP: 13083-970 Campinas - SP Publicado:

(BR). — com relatório de pesquisa internacional (Art. 21(3))

(74) Mandatário : LAVRAS COSTALLAT SILVADO,Fernanda; Rua Roxo Moreira 183 1 - Distrito de Barão,

(54) Title : PROCESS OF EXTRACTIVE FERMENTATION AND USE THEREOF

(54) Título : PROCESSO DE FERMENTAÇÃO EXTRATIVA E USO DO MESMO

f AAD

A

fermentação C evaporaçãoB BB *"

_ _ meio EEdestilação e

.C C J )retificação

DD centrifugação

Figura 1

(57) Abstract : The present invention relates to a process of extractive fermentation. More specifically, the present invention relates∞ to a process of extractive fermentation that uses only one solvent capable of removing products and inhibitors simultaneously, andalso of cooling down the médium. In addition, the present invention relates to the use of said process. The present invention relates

0 specifically to the use of biodiesel, such as biodiesel from soybean oil, corn oil, castor oil, palm oil or macaúba palm oil, inter alia,o0 as a biocompatible extracting agent for the in situ extraction of fermentation inhibiting components and/or product, specifically the

fermentation product and inhibiting compounds present in musts from hydrolytic processes that use lignocellulosic raw material,starchy raw material, directly extractable carbohydrates, highly exhausted molasses with a high content of inhibitors, such as biotin,inter alia, or similar musts rich in carbohydrates, as well as for cooling down the fermentation médium by means of the actualsolvent.

(57) Resumo :(Continua na página seguinte)

Page 2: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

w o 2013/082682 Al I I II II I «III I 11 lll l l lll l l l llll II I II

A presente invenção se refere a um processo de fermentação extrativa. Mais especificamente, a presente invenção se refere a umprocesso de fermentação extrativa que emprega um único solvente capaz de remover produtos e inibidores simultaneamente, alémde resfriar o meio. Além disso, a presente invenção se refere ao uso do processo. Especificamente, a presente invenção se refere aouso do biodiesel, tais como biodiesel de óleo de soja, de milho, de mamona, de dendezeiro, de macaúba, entre outros, como agenteextrator biocompativel para a extração in-situ de produto e/ou componentes inibidores da fermentação, especificamente o produtoda fermentação e compostos inibidores presentes nos mostos provenientes de processos hidroliticos de matéria-prima ligno-celulósica, amilácea, carboidratos diretamente extraiveis, melaços fortemente esgotados com alto conteúdo de inibidores como,entre outros, biotina, ou mostos similares ricos em carboidratos, como também para o resfriamento do meio da fermentação pelopróprio solvente.

Page 3: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

PROCESSO DE FERMENTAÇÃO EXTRATIVA E USO DO MESMO

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a um processo de

fermentação extrativa. Mais especificamente, a presente

invenção se refere a um processo de fermentação extrativa

que emprega um único solvente capaz de remover produtos e

inibidores simultaneamente, e/ou resfriar o meio. Além

disso, a presente invenção se refere ao uso do processo,

por exemplo, para obtenção de etanol.

Antecedentes da Invenção

É fato conhecido que a obtenção de produtos de

fermentação, como ácidos orgânicos, solventes e álcoois, a

partir de carboidratos depende muito dos custos de matéria-

prima e custos de capital e energia, tornando outros

fatores de importância secundária. Desenvolvimento de

tecnologia de produção de combustíveis, alcoóis, solventes

ou ácidos orgânicos de segunda geração tem como princípio a

conversão de biomassa, geralmente ligno-celulósica,

amilácea e similares, ou carboidratos diretamente

extraíveis, transformando-as em produtos de interesse

económico de maior valor agregado.

Na fermentação alcoólica convencional e principalmente

na fermentação alcoólica de segunda geração, a

produtividade da mesma é limitada por efeitos de inibição,

Page 4: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

seja pelo produto da fermentação ou por inibidores

introduzidos na extração dos carboidratos da matéria-prima

ou inibidores provenientes da hidrólise de biomassa ligno-

celulósica. O mesmo problema surge também na fermentação

para a produção de outros produtos como, por exemplo,

acetona, butanol, e produtos do tipo ácido orgânico como

ácido acético, ácido propiônico, ácido láctico, ácido

succinico, ácido butanóico, entre outros ou qualquer

combinação destes. Tecnologias desenvolvidas e atualmente

usadas na indústria pretendem diminuir este efeito de

inibição por detoxif icação do meio antes da fermentação

e/ou remoção do produto após a fermentação.

Para evitar a introdução de inibidores durante o

processo de extração de carboidratos da matéria-prima, por

exemplo cana de açúcar ou beterraba, a temperatura

empregada nesta etapa deve ser mantido baixa, em detrimento

de maiores rendimentos de extração destes carboidratos que

podiam ser obtidos para temperaturas maiores.

Para fermentações de biomassa hidrolisado, pesquisas

têm sido realizadas para desenvolver meios de remoção de

componentes inibidores do caldo hidrolitico antes da

introdução do mesmo no estágio de fermentação.

Um método convencionalmente aplicado é o tratamento

alcalino do caldo, por exemplo, a caleação: aumento de pH a

Page 5: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

9-10 com hidróxido de cálcio. Além da neutralização do

caldo e sedimentação de sais com ácido sulfúrico na forma

de gipsita, compostos como furfural e HMF são quimicamente

alterados, diminuindo a toxicidade destes inibidores, o

qual foi descrito por Martinez e colaboradores, no trabalho

intitulado "Detoxification of dilute acid hydrolysates of

lignocellulose with lime" publicado na Biotechnology

Progress 17; 287-293 em 2001. Porém, o método tem a

desvantagem de reduzir a qualidade e a quantidade de

açúcar .

Para tratamentos baseados em adsorção de inibidores,

como a adsorção por carvão ativo ou troca iônica, uma

excelente adsorção dos compostos pode dificultar a

regeneração do carvão ou resina, de forma que sua

utilização se torna inviável, o qual foi comprovado por

Sainio e colaboradores no trabalho intitulado "Adsorptive

removal of fermentation inhibitors from concentrated

hydrolyzates of lignocellulosic biomass" publicado na

Bioresource Technology 102; 6048-6057 em 2011.

A aplicação de todos estes métodos possue efeitos

positivos na fermentação, mas a instalação e uso de um

estágio separado de tratamento do mosto antes da

fermentação encarece o processo, exceto para tratamentos

in-situ, como a detoxif icação microbiológica in-situ ou

Page 6: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

extração liquido-líquido utilizando um solvente

biocompatível .

O mais simples tratamento microbiológico in-situ

emprega a própria levedura de fermento, eventualmente em

elevada concentração, para diminuir a toxicidade do meio,

ou pela imobilização, reciclo de células ou alimentação

controlada na fermentação batelada-alimentada, conforme

descreveu Talebnia e Taherzadeh, no trabalho intitulado "In

situ detoxif ication and continuous cultivation of dilute-

acid hydrolyzate to ethanol by encapsulated S . cerevisiae"

publicado no Journal of Biotechnology 125, 377-384, em

2006.

Porém, a desvantagem destes métodos é a limitada taxa

de detoxif icação pela levedura, prejudicando o crescimento

e produtividade e aumentando o tempo do processo

fermentativo, além do acúmulo de inibidores que não podem

ser convertidos como vários ânions de ácidos orgânicos

conforme comprovou Almeida e colaboradores no trabalho

intitulado: "Increased tolerance and conversion of

inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces

cerevisiae" publicado no Journal of Chemical Technology and

Biotechnology, 82 (2007) 340-349 em 2007.

O regime de fermentação extrativa contínua a vácuo foi

estudado por Átala em sua tese de doutorado intitulada

Page 7: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

"Montagem, instrumentação controle e desenvolvimento

experimental de um processo fermentativo extrativo de

produção de etanol", FEA/UNICAMP em 2004 para remover o

etanol do meio durante a fermentação com um evaporador a

vácuo do tipo flash. O sistema, diminui a concentração de

etanol no meio até em torno de 5 °GL, ou seja, abaixo do

nível de inibição. Em consequência, a fermentação,

alimentada com fluxo com alto teor de açúcar (até em torno

de 500g/L) , mostrou menor inibição pelo etanol produzido,

alta viabilidade e produtividade volumétrica. Além disso, a

concentração de etanol no fluxo de vapor proveniente do

evaporador pode reduzir custos na recuperação do produto

conforme descreveu Junqueira e colaboradores no trabalho

intitulado "Simulation and optimization of the continuous

vacuum extractive fermentation for bioethanol production

and evaluation of the influence on distillation process"

publicado no Computer Aided Chemical Engineering 26; 827-

832 em 2009. A alta concentração de substrato resulta em

menor quantidade de água utilizado no processo integral de

produção de etanol, implicando menor gasto energético, e

flegmassa e vinhaça mais concentrados. O último resulta em

menor custo de secagem e transporte de vinhaça para os

campos de cana para fertilização dos mesmos. Também foi

previsto um resfriamento eficiente da dorna, pelo próprio

Page 8: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

sistema a vácuo.

Neste sistema, ainda não foi estudado o uso de caldo

hidrolitico como substrato, a economia do uso de membrana

para reciclo de células e o evaporador flash na escala

industrial em combinação com a taxa elevada do reciclo pelo

sistema. O evaporador a vácuo pode provavelmente diminuir

as concentrações de inibidores voláteis como furfural e

ácido acético, enquanto outros inibidores como baunilha e

4-hidroxibenzaldeído podem acumular caso a massa celular

não seja bastante elevada para conversão efetiva dos

mesmos. Também, o estresse elevado do fermento, gerado pela

alta taxa de reciclo de levedura pode influenciar

negativamente a viabilidade da mesma em sistema de escala

industrial, embora este efeito não tenha sido observado na

escala de bancada. No entanto, é possível que a baixa

concentração de etanol seja de importância maior para

manter alta viabilidade. Neste contexto, é importante

lembrar que o fator de estresse devido à presença do

produto e de inibidores no caldo hidrolitico pode se somar

ao estresse que ocorre na membrana celular através do

sistema de reciclo de células. Por exemplo, os inibidores

fenólicos justamente perturbam a integridade da membrana

celular e outros inibidores provocam desvio de ATP para

reparos intracelulares, em detrimento de manutenção da

Page 9: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

integridade da membrana celular.

A fermentação extrativa liquido-liquido envolve a

utilização de um solvente biocompativel durante a

fermentação alcoólica para remover o produto da fermentação

pelo solvente e , sobretudo, diferente de tecnologias

semelhantes propostos anteriormente por outros autores, os

inibidores no meio provenientes do processo de extração de

carboidratos da matéria-prima e/ou de caldo hidrolitico,

além de extração de calor deste meio de fermentação.

Há alguns exemplos no estado da técnica onde o

solvente empregado não é biocompativel, necessitando a

separação da levedura do meio ou vinho antes da extração ou

utilização de uma membrana para evitar contato direto entre

o fermento e o solvente, como por exemplo, decanol (Minier

., Goma G., 1998, Eckert e Schugerl, 1987, Kapucu e

colaboradores, 1999) , isso-octano, octano, gasolina,

querosene e diesel (Rahman e colaboradores, 2007) , fluidos

supercriticos, como gases comprimidos CO2, etano e propano

(Bothun e colaboradores, 2003) para remoção de etanol, ou

éter etílico ou acetato de etila (Cruz e colaboradores,

1999) . Nestes casos é impossível também a aplicação do

solvente como agente de refrigeração in-situ.

Por outro lado, existem ainda exemplos de utilização

de um solvente biocompativel. Kollerup e Daugulis, no

Page 10: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

trabalho intitulado "Ethanol production by extractive

fermentation - solvent identif ication and prototype

development" publicado no The Canadian Journal of Chemical

Engineering, 64, 598 - 606 em 1986, fizeram uma avaliação

teórica de 1361 possíveis solventes para extração de etanol

através de propriedades como coeficientes de partição,

biocompatibilidade, disponibilidade e custo. Para a

biocompatibilidade foi observado que solventes com uma

cadeia de carbono com número de átomos de carbonos menor do

que 12 têm efeitos tóxicos ou inibidores no crescimento da

levedura (Minier e Goma, 1982) . Exemplos destes e outros

solventes descritos no estado da técnica são uso de óleo

oléico (Daugulis e colaboradores, 1987, Roffler e

colaboradores, 1987, Weilnhammer e Blass, 1994), dodecanol

(Gyamerah e Glover, 1996, Minier e Coma, 1981) e ácido

oléico para remoção de etanol (Jassal e colaboradores,

1994) ou para produção simultânea de biodiesel (Oliveira e

colaboradores, 1998, Csányi e colaboradores, 2004) , ácido

ricinoleico ou outros ácidos graxos (Waibel e

colaboradores, 2010, Boudreau e Hill, 2006) .

O uso de biodiesel, ésteres metílicos de ácidos graxos

de óleos vegetais, para remoção de etanol, butanol ou

acetona também foram avaliados e descritos no estado da

técnica (Waibel colaboradores, 2010, Grobben colaboradores,

Page 11: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

1993, Ishizaki colaboradores, 1999) , mas não para remoção

de inibidores provenientes do processo de extração dos

carboidratos da matéria-prima, inibidores provenientes do

caldo hidrolitico e muito menos a utilização do solvente

para agente refrigerante do meio de fermentação. Utilizando

álcool oléico em um processo de sacarificação e fermentação

extrativa com celulase, Moritz e Duff (1996) chegaram perto

de realizar a extração simultânea de produto e inibidores

do caldo hidrolitico, mas sua literatura não mostra esta

compreensão .

Outros estudos mostram resultados positivos utilizando

polímeros para extração de etanol (Seiler e colaboradores,

2003, Offeman e colaboradores, 2008) e , para extração de

compostos fenólicos do caldo hidrolitico, polímeros cuja

separação do meio é induzida por um aumento da temperatura

(Hasmann e colaboradores, 2008) . A utilização de variações

de polietilenoglicol foi revisado por Banik e colaboradores

(2003) . A remoção de etanol por adsorventes, em combinação

de levedura imobilizada foi estudada por Cartón e

colaboradores (1998) .

Somente para a remoção in-situ de etanol (sem remoção

de demais inibidores ou refrigeração do meio) , com solvente

biocompatível, o processo foi testado na escala de bancada

e modelado, mostrando retornos de custos de investimento

Page 12: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

para usinas existentes e novos usinas (Daugulis e

colaboradores, 1991, 1994) . O processo propiciou a

utilização de elevadas concentrações de açúcar, menor

inibição de etanol durante a fermentação e menor requisito

de energia.

A patente norte-americana US 4,865,973, depositada em

13 de agosto de 1986 em nome de UNIV KINGSTON e intitulada:

"Process for extractive fermentation" descreve um processo

para a produção de etanol por fermentação acoplado a uma

unidade de extração do produto formado, citando o ácido

ricinoléico e outros ácidos graxos como opções de solvente.

É descrito também que a extração é in situ e listadas como

vantagens: diminuição dos custos devido ao tamanho do

fermentador, redução dos custos de recuperação do produto

devido a maiores concentrações finais e redução do pré-

tratamento e custo de tratamento de resíduos, devido ao

menor fluxo aquoso. Além disso, o agente extratante pode

ser recirculado. A fermentação descrita no referido

documento ocorre de 20 a 80°C.

Empregar um solvente com características iguais ou

semelhantes ao biodiesel pode ter um efeito semelhante para

a remoção de inibidores desde que todas as demais condições

do processo também sejam iguais. Porém, a extração dos

inibidores não é apenas um efeito colateral, mas uma

Page 13: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

tecnologia de pré-tratamento em si, reconhecendo o fato que

a remoção deve ser tal que a concentração final dos

inibidores no meio de fermentação deve ser igual ou menor à

concentração máxima que ainda permite um desempenho

satisfatório do micro-organismo . Sabendo que os inibidores

mostram efeitos de inibição sinérgicos, agravado por certas

faixas de pH e temperatura, o nível da remoção desejável de

inibidores se torna um complexo cálculo, envolvendo

coeficientes de partição de cada inibidor e a dependência

destes coeficientes ao temperatura, pH, concentração de

etanol e sais no sistema bifásico. Por isto, o nível de

remoção colateral de inibidores empregando o solvente no

primeiro lugar apenas para remoção do produto como sugerido

pelos outros autores do estado da técnica, dificilmente é

satisfatório no uso de caldo hidrolítico como matéria-

prima, ainda mais porque a concentração natural dos

inibidores dependa muito de modo de preparo desta matéria-

prima, seja por hidrólise ácida ou hidrólise enzimática. O

último também vale para inibidores em mostos obtidos por

extração de carboidratos da matéria-prima, como cana-de-

açúcar ou beterraba, cujas concentrações dependem

principalmente da temperatura empregada neste processo de

extração .

Nestes casos, será necessário empregar uma etapa de

Page 14: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

pré-tratamento do mosto em um estágio anterior da

fermentação, enquanto que a tecnologia proposta pela

presente invenção pretende, justamente, entre outros,

tornar tal etapa obsoleta.

Contudo, a remoção simultânea e satisfatória de

inibidores empregando um solvente para remoção in situ de

produto da fermentação, não é óbvia e não foi descrito e

muito menos sugerido no estado da técnica. A remoção dos

inibidores pode acontecer, mas a remoção suficiente para um

bom desempenho do processo fermentativo depende, entre

outros, da taxa de vazão do solvente, temperatura, pH,

concentração de compostos polares, como também o produto da

fermentação, concentrações de outros componentes como sais,

que podem promover ou limitar a remoção dos inibidores além

de contribuir à inibição total, mesmo que a remoção do

produto seja satisfatória para os processos de extração

liquido-liquido do produto como sugerido no estado da

técnica .

Observa-se que a utilização do solvente como agente de

refrigeração do meio, não é descrito por outros autores. O

resfriamento convencional, por reciclo externo do meio da

fermentação através de trocadores de calor ou serpentinas

de resfriamento na dorna, é desvantajoso por formação de

incrustações a partir do próprio meio, entre ouros. Estas

Page 15: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

incrustações dificultam o transporte de calor, aumentam o

risco de contaminação, promovem formação de biofilmes e

complicam a troca de calor pela baixa condução térmica e a

limitação dos gradientes de temperatura disponíveis. Outras

desvantagens de tais equipamentos de refrigeração são

choque térmico para a levedura; estresse físico para

levedura causado pelo fluxo alto do meio na tubulação e a

ainda a necessidade de equipamento de resfriamento externo.

Para que um agente possa funcionar como agente de

refrigeração, a entalpia específica do solvente no momento

de introdução do mesmo no meio da fermentação, a taxa de

vazão do solvente, e a integral da capacidade de calor do

solvente sobre a faixa de temperatura entre a temperatura

do solvente e a temperatura final do meio, são fatores

determinantes na capacidade de resfriamento pelo solvente.

De fato, o solvente só funciona como agente de refrigeração

quando o mesmo é introduzido com temperatura abaixa da

temperatura do meio de fermentação.

O que é revelado na presente invenção é a refrigeração

completa do meio pelo solvente, tornando obsoleto um

sistema secundário de refrigeração convencional. Para este

objetivo, a temperatura e taxa de vazão do solvente

precisam ser calculados com precisão, prevendo a geração de

calor por atividade metabólica e agitação do meio. Afinal,

Page 16: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

a temperatura do meio não pode ser muito baixa, nem muito

alta, para garantir um bom desempenho da fermentação. Esta

requisição torna o usufruto do solvente como agente de

refrigeração, permitindo resfriamento por contato direto,

dispensando superfícies de troca térmica. Sendo assim, o

uso do solvente para fins de refrigeração do meio não foi

previsto, descrito ou muito menos sugerido em nenhum

documento do estado da técnica.

O pedido de patente internacional WO 2009/042950,

depositado em 26 de setembro de 2008, em nome de LS9 INC e

outros e intitulado: "Reductíon of the toxic effect of

impurities from raw materiais by extractive fermentation"

descreve a produção de etanol e butanol por fermentação

seguida da extração in situ e o agente também é reciclado.

Contudo, no referido documento o solvente utilizado não é

definido .

O pedido de patente internacional WO 2010/100642,

depositado em 02 de março de 2010 em nome de EYAL RES

CONSULTANTS LTD e EYAL AHARON e intitulado: "Fermentation

processes" descreve um método de produção de pelo menos um

produto de fermentação e um derivado do mesmo,

compreendendo entre as etapas, a de fornecer uma solução

aquosa fermentável compreendendo um composto fermentável .

No referido documento ocorre remoção de inibidores com

Page 17: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

octanol, e sugestões de tratamento com carvão ativo,

adsorção, tratamento com calor, base, trocador de íons e

separação utilizando membrana. Uma desvantagem do referido

documento está na remoção de inibidores fora da dorna, a

qual necessita o impedimento da geração de inibidores no

processo de extração de carboidratos da matéria-prima

usando temperaturas baixas, e/ou uma etapa de pré-

tratamento do mosto a base de ligno-celulose, que requer

maior investimento em equipamento e menor eficiência do

processo em geral.

O artigo de Grobben N . e colaboradores, intitulado

"Production of acetone, butanol and ethanol (ABE) from

potato wastes : fermentation with integrated membrane

extraction" publicado no Applied Microbal Biotechnology 39,

494-498, em 1993 descreve a produção de butanol, acetona e

etanol (ABE) a partir de resíduos de batata através de

fermentação com extração de membrana integrada. O referido

artigo menciona somente a aplicação de biodiesel como

solvente extratante. Além disso, o referido artigo não

menciona e nem sugere o uso in-situ do solvente.

O artigo de Boudreau T . M., e colaboradores,

intitulado "Improved ethanol-water separation using fatty

acids", publicado na Process Biochemistry 41, 980-983 em

2006, descreve uma separação aperfeiçoada de etanol-agua

Page 18: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

usando ácidos graxos. O artigo descreve a extração de

somente o produto e sem a utilização do solvente como

agente de refrigeração.

Neste caso, será necessário empregar uma etapa de pré-

tratamento do caldo em um estágio anterior da fermentação

para fermentação de mosto a base de caldo hidrolítico,

enquanto que a tecnologia proposta pela presente invenção

pretende, entre outros, justamente tornar tal etapa

obsoleta .

Como pode ser observado, nenhum documento do estado da

técnica descreve ou muito menos sugere abordagens de

combinar o pré-tratamento do mosto com a remoção de produto

inibidor do meio de fermentação por extração liquido-

liquido. Portanto, esta lacuna é a matéria principal da

presente invenção. Além disso, não há exemplos no estado da

técnica de refrigeração do meio de fermentação pelo

solvente, muito menos em combinação com extração simultânea

de produto e/ou inibidores. A extração líquido-líquido pode

tornar a fermentação um processo mais eficiente, causando

menos estresse à levedura e resultando em menor custo

energético .

Sumário da Invenção

Para solucionar os problemas acima mencionados, a

presente invenção, baseada em fermentação extrativa,

Page 19: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

propiciará vantagens significativas em relação aos

processos fermentativos convencionais, possibilitando um

aumento do seu desempenho e apresentando uma relação

custo/beneficio mais favorável.

A presente invenção se refere a um processo

fermentativo extrativo para mostos provenientes de

processos hidroliticos de matéria-prima ligno-celulósica,

amilácea, carboidratos diretamente extraíveis, melaços

fortemente esgotados com alto conteúdo de inibidores como,

entre outros, biotina, ou mostos similares, ricos em

carboidratos e com objetivos de fermentação.

Especificamente, a presente invenção se refere ao uso de um

solvente biocompativel, tais como biodiesel de óleo de

soja, de milho, de mamona, de palmeira-de-óleo-af ricana

(dendezeiro) , de macaúba, entre outros, como agente

extrator para a extração in-situ e simultânea de produto

e/ou componentes inibidores da fermentação, especificamente

o produto da fermentação e compostos inibidores presentes

no mosto, e/ou como agente refrigerante do meio da

fermentação, sendo o último em combinação ou não com as

finalidades de extração de produto e/ou inibidores.

A produtividade da fermentação em termos de produtos

como etanol, butanol, propanodiol, 2-3 butanodiol, acetona,

enzima, aminoácidos, como o ácido glutâmico, lisina e

Page 20: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

glutamato monossódico, ácidos orgânicos como ácido acético,

ácido propiônico, ácido láctico, ácido succinico, ácido

butanóico, matéria-prima para bioplásticos e outros

produtos, é limitada pela concentração do próprio produto,

ou seja, existe um efeito de inibição pelo produto. Além

disto, fermentação de biomassa de ligno-celulose ou outro

tipo de biomassa, é limitada pela inibição química do

processo devido a inibidores presentes nesta matéria-prima.

Estes inibidores, sendo os principais furfural, HMF,

compostos fenólicos e ácidos carboxílicos, inibem a

fermentação em termos de crescimento microbiano e taxa de

produção. Mesmo efeito ocorre causado por inibidores

presentes em outros tipos de mosto como mostos preparados

com açúcares diretamente extraíveis da matéria-prima, como

cana-de-açúcar ou beterraba, quando a temperatura do

processo de extração dos carboidratos desta matéria-prima é

mais elevada, muitas vezes resultando em maiores

rendimentos de extração.

O mosto final pode também conter componentes orgânicos

como, por exemplo, a biotina, que inibem fermentações mais

específicas como a biosíntese de aminoácidos, como o ácido

glutâmico, lisina e glutamato monossódico.

A presente invenção possibilita a remoção de todos

estes compostos do meio de fermentação, acelerando o

Page 21: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

processo. Assim, a tecnologia proposta pela presente

invenção efetivamente viabilizará a produção de

biocombustiveis a partir de biomassa, ou seja, combustíveis

de segunda geração, assim como outros produtos a partir de

biomassa hidrolisada, possibilita o uso de maiores

temperaturas nos processos de extração de carboidratos de

matérias primas como cana-de-açúcar e beterraba, resultando

em maiores rendimentos deste processo, e possibilitará e

promoverá o uso de mostos em qeral que contêm compostos com

efeitos inibidores extraíveis pelo solvente.

Na presente invenção, a etapa de pré-tratamento do

mosto e a da remoção do produto são integradas. Desta

forma, a remoção in-situ de produto e demais inibidores do

meio de fermentação com solvente biocompatível, sem ou com

utilização do solvente como agente refrigerante, de fato

elimina a necessidade de uma unidade extra de tratamento do

meio e pode aumentar o retorno sobre o investimento total

do processo de produção, tanto por aumento da produtividade

e do rendimento, quanto por diminuição de custos

energéticos e de água utilizada no processo integral.

O próprio solvente pode também ser utilizado para o

resfriamento do processo fermentativo. A fermentação é um

processo exotérmico, ou seja, calor está sendo gerado

durante a conversão do substrato. Este calor pode ser

Page 22: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

efetivamente retirado do meio de fermentação utilizando o

próprio solvente em sistema continuo, sendo que o solvente

pode ser introduzido na dorna com baixa energia interna

após resfriamento prévio e eventual estocagem do mesmo.

Desta forma, a temperatura da fermentação pode ser mantida

em torno da ótima, devido a grande superfície de troca de

calor, resultado da propriedade de liquidez do solvente e

rapidez de se misturar com o meio, resultando em menores

gradientes de temperatura na dorna e , consequentemente,

elevando a eficiência em geral, tanto em termos de custos

energéticos, como em termos de custos de equipamento de

refrigeração e manutenção.

Breve Descrição das Figuras

A estrutura e operação da presente invenção,

juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais

bem entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e

a seguinte descrição:

A Figura 1 mostra o processo da presente invenção de

forma simplificada, onde (A) é a entrada de mosto

(substrato) ; (B) é uma opcional entrada do micro-organismo

reciclado; (C) é a entrada de solvente; (D) é a saída de

solvente e produto; (E) é a saída de vinho com fermento;

(F) é a saída de mistura de produto e água; (G) é a saída

de vinho clarificado; (H) é a saída do produto purificado e

Page 23: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

(I) é a saída de resíduos e sub-produtos .

A Figura 2 mostra o diagrama de blocos de um processo

com a tecnologia proposta pela presente invenção.

A Figura 3 mostra a biocompatibilidade do biodiesel

(4A) e óleo de mamona (4B) e produção de dióxido de carbono

durante a fermentação sem fase orgânica (linha pontilhada) ,

com biodiesel (círculo preto) e com óleo de mamona

(triângulo branco) .

A Figura 4 mostra um desenho esquemático explicando

como o solvente tem a capacidade de absorção de certa

quantidade de água, ocorre concentração de açúcar durante a

extração, levando a fermentação a um rendimento maior

A Figura 5 mostra um gráfico de barras com a absorção

de água e etanol em oléo de mamona e biodiesel para várias

concentrações de etanol na fase aquosa.

As Figuras 6 , 7 e 8 mostram os resultados para a

fermentação A , B e C , onde (A) é a fermentação sem

inibidores, sem solvente; (B) é a fermentação com

inibidores, sem solvente; e (C) é a fermentação com

inibidores, com solvente.

As Figuras 9 e 10 mostram os perfis de concentração de

furfural, furfuril-álcool, baunilha e álcool baunílico

durante a fermentação sem solvente e com solvente,

respectivamente .

Page 24: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

A Figura 11 mostra um gráfico de comparação de

viscosidade entre óleo de mamona e biodiesel para várias

temperaturas .

A Figura 12 mostra um fluxograma de uma planta de

fermentação extrativa conforme a presente invenção.

A Figura 13 mostra um fluxograma de uma planta de

fermentação extrativa com uma dorna, conforme uma primeira

modalidade da presente invenção.

A Figura 14 mostra um fluxograma de uma planta de

fermentação extrativa com três dornas, apenas a primeira

dorna mantendo uma camada orgânica conforme uma segunda

modalidade da presente invenção.

A Figura 15 mostra um fluxograma de uma planta de

fermentação extrativa para fermentação em regime de

batelada ou batelada alimentada, com uma dorna conforme uma

terceira modalidade da presente invenção.

A Figura 16 mostra um fluxograma de uma planta de

fermentação extrativa para fermentação continua com

resfriamento e remoção de inibidores em todas as dornas,

conforme uma quarta modalidade da presente invenção.

A Figura 17 mostra uma modalidade da presente invenção

de um processo esquemático com fluidos e unidades de

processamento de um sistema de fermentação extrativa. Os

estágios do processo na linha pontilhada foram modelados.

Page 25: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

Descrição Detalhada da Invenção

Embora a presente invenção possa ser suscetivel a

diferentes modalidades, é mostrada nos desenhos e na

seguinte discussão detalhada, uma modalidade preferida com

o entendimento de que a presente modalidade deve ser

considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e

não pretende limitar a presente invenção ao que foi

ilustrado e descrito aqui.

A presente invenção se refere a um processo de

fermentação extrativa. Mais especificamente, a presente

invenção se refere a um processo de fermentação extrativa

que emprega um único solvente capaz de remover produtos e

inibidores simultaneamente, além de resfriar o meio. Além

disso, a presente invenção se refere ao uso do processo.

A presente invenção revela um processo de fermentação

extrativa com alta produtividade, que será capaz de tornar

máxima e rápida a conversão de carboidratos fermentescíveis

obtidos por extração ou hidrólise química em produtos.

0 que ocorre é que alguns compostos contidos nos

hidrolisados puros, sendo os principais furfural, HMF,

compostos fenólicos e ácidos carboxílicos, inibem a

fermentação em termos de crescimento e taxa de produção.

A tecnologia proposta pela presente invenção

possibilita a remoção in-situ destes componentes por meio

Page 26: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

de um agente extrator biocompativel . Este procedimento de

eliminação do efeito inibidor destes componentes resultará

em um incremento da produtividade do micro-organismo,

viabilidade, eficiência da fermentação, e elevado

estabilidade do processo, assim como favorecendo uma

fermentação rápida e com alta taxa de conversão do

substrato. No caso dos produtos extracelulares, além dos

inibidores presentes no mosto o próprio produto da

fermentação, que inibe o processo a partir de certa

concentração, também será removido pelo solvente. Para

produtos intracelulares, como por exemplo, lipídeos,

polihidroxialcanoatos e várias enzimas, a presente invenção

aplica-se a remoção dos inibidores provenientes do mosto

e/ou ao resfriamento do meio de fermentação.

Matérias-primas e insumos

A matéria-prima preferencial vislumbrada para a

aplicação da tecnologia envolve hidrolisados de material

sólido ligno-celulósicos, amiláceos, como bagaço de cana-

de-açúcar, hidrolisado de amido de milho ou mandioca. Podem

também envolver o uso de carboidratos diretamente

extraíveis, como carboidratos convencionalmente usadas na

fermentação: melaço, caldo de cana, extrato de beterraba e

melaços fortemente esgotados com alto conteúdo de

inibidores, como biotina, além de mostos similares, ricos

Page 27: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

em carboidratos e com objetivos de fermentação ou ainda

qualquer combinação ou derivado dos mesmos, daqui em diante

denominado como 'mosto' . Sendo carboidratos a denominação

geral de substratos para fermentação como sacarose,

glicose, frutose, xilose, arabinose, entre outros.

Para certas fermentações, a escolha da matéria-prima

do mosto ou a concentração dos carboidratos no mosto é

limitada pela presença de inibidores naturais como a

biotina.

Uma das principais vantagens da tecnologia proposta

pela presente invenção é justamente a remoção de inibidores

presentes no mosto, provenientes do caldo de extrato da

matéria-prima, do licor hidrolisado, ou de outra fonte,

como ácidos carboxilicos, como ácido acético, derivados de

furano, como furfural e hidroxi-metil furfural, e compostos

fenólicos, como a baunilha, álcool coniferilico, catechol,

entre outros. Compostos naturais no mosto que exibem

propriedades inibidoras, como biotina, também podem ser

removidos pela tecnologia proposta.

A presente invenção é baseada no uso de um agente

extrator biocompatível, aqui em diante denominado como

'solvente' , durante a fermentação. O solvente utilizado

como fase orgânica, especificamente parte da especificidade

da presente invenção envolve um biodiesel selecionado do

Page 28: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

grupo que compreende óleos vegetais tais como óleo de soja,

óleo de milho, óleo de mamona, biodiesel de dendezeiro e

biodiesel de macaúba . Outros líquidos biocompativeis também

podem ser utilizados, como álcoois com cadeia longa (álcool

oléico, fitol, isofitol, álcool estearílico, álcool

cetíloco, octildodecanol) , ácidos graxos (ácido

ricinoléico, ácido oléico, ácido linoléico, ácido

linolênico, ácido láurico, ácido palmítico, ácido

palmitoléico, ácido esteárico) , etanoatos (dodecil acetato,

butil dodecanoato) , ou outros substâncias de cadeia longa

como dibutilsebacate, di (2-etilhexil) sebacato,

dibutiladipato, d (2-etilhexil) adipato, di(2-

etilhexil) ftalato, di (3, 5 ,5-trimetilhexil )phthalato,

glicerol tridecanoato, 2-dodecanone e dodecanal .

Preferencialmente é empregado um éster metílico ou éster

etílico de um ácido graxo, como o ácido ricinoléico.

0 ácido ricinoléico (ácido cis-12-hidroxioctadeca-9-

enoico) é uma molécula de cadeia longa, tendo um grupo

hidroxila na posição C-12. Este grupo hidroxila aumenta a

polaridade da molécula, favorecendo coeficientes de

partição de inibidores e produtos de fermentação com

características polares. A dupla ligação em posição C-9

favorece menor viscosidade. A fonte do ácido graxo pode ser

um produto agrícola como óleo de mamona que possui uma

Page 29: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

porcentagem de 85 a 90% de ésteres de ácido ricinoléico.

O solvente tem um ponto de ebulição maior do que o

produto e os inibidores voláteis, e seu tamanho é tal que

limita a difusão e integração com a parede celular do

micro-organismo, o que prejudicaria a viabilidade e o

crescimento do mesmo.

Mais especificamente, o solvente tem as seguintes

propriedades essenciais e favoráveis:

• Coeficientes de partição favoráveis aos componentes a

ser extraídos (inibidores e/ou produto) ;

• Seletividade alta para os componentes de interesse

(produto e inibidores) em comparação com outros componentes

(substrato e minerais) ;

• Imiscível em água e com solubilidade desprezível na

fase aquosa;

• Capacidade de absorção de certa quantidade de água,

elevada pela fração de etanol no solvente, que efetivamente

concentra o substrato na fase aquosa diminuindo a perda do

mesmo e assim aumentando o rendimento do produto;

· Baixa toxicidade (fato positivo para o elemento humano

- operadores da empresa, para o ambiente e para o organismo

empregado na fermentação (bio-compatibilidade) ;

• Possibilidade de recuperação do produto do solvente e

Page 30: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

sua regeneração;

• Não formação de emulsões (estáveis) durante a

fermentação e o processamento down-stream' em condições de

baixa turbulência do meio;

· Separação rápida de fases orgânica e aquosa;

• Alta estabilidade química, independente de utilização

de altas temperaturas na recuperação ou outros componentes

como ácidos presentes no processo;

• Baixo ponto de fusão e viscosidade na faixa de

temperatura utilizada, e ponto de ebulição acima da faixa

da temperatura utilizada;

• Baixo custo e possibilidade de produção do mesmo no

local ;

Possibilidade de ser utilizado como combustível,

biodiesel, após vários ciclos de uso como solvente do

processo .

O solvente pode ser injetado a baixas temperaturas, de

forma a atuar no resfriamento do meio fermentado, para

manter a temperatura desejada. O produto de fermentação é

extraído pelo solvente, que é retirado do biorreator, sendo

em seguida retificado com retirada de produto e

contaminantes inibidores, e reciclado continuamente, livre

de produtos e inibidores . O diagrama apresentado na Figura

Page 31: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

1 ilustra o processo de forma simplificada.

O processo da presente invenção propicia a utilização

de elevadas concentrações de carboidratos, menor inibição

pelos inibidores provenientes do mosto e pelo produto

inibidor (etanol, butanol, acetona, propanodiol, 2-3

butanodiol, ácidos orgânicos, solventes, enzimas,

aminoácidos, como o ácido glutâmico, lisina e glutamato

monossódico, terpenos, matéria-prima para bioplásticos,

entre outros) durante a fermentação e menor requisito de

energia .

Produtos

A presente invenção revela um processo de fermentação

extrativa com alta produtividade, que será capaz de tornar

máxima e rápida a conversão de carboidratos fermentescíveis

obtidos por extração ou hidrólise química em produtos como:

butanol, acetona, propanodiol, 2-3 butanodiol, xilitol,

ácidos orgânicos como ácido acético, ácido propiônico,

ácido láctico, ácido succínico, ácido butanóico, ácido

cítrico, enzimas, aminoácidos como o ácido glutâmico,

lisina e glutamato monossódico, terpenos, matéria-prima

para bioplásticos, lipídeos, polihidroxialcanoatos, o

próprio fermento, ou outros produtos orgânicos ou qualquer

combinação destes, aqui em diante denominado como

^produto' .

Page 32: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

O foco da presente invenção é etanol, mas as

características dos sistemas bifásicos envolvendo a

distribuição de um componente com polaridades menores do

que a polaridade de etanol, que é o caso para, por exemplo,

butanol, acetona e a maioria dos aminoácidos e outros

produtos mencionados acima, inevitavelmente mostrarão um

bom desempenho em termos de extração, melhor até do que o

próprio etanol. Isto porque, comparando com o etanol, os

coeficientes de partição de componentes com menor

polaridade são maiores, e como a seletividade para estes

componentes são maiores, então a extração para a fase

orgânica será favorecida.

Nota se que vários produtos mencionados podem ser

produzidos como produtos intracelulares, produtos

extracelulares , ou uma combinação disso, dependendo do(s)

micro-organismo (s) empregado (s) e a sua capacidade de

transporte do produto pela parede celular.

Para produção de biomassa ou produtos intracelulares

como, por exemplo, em muitos casos lipídeos,

polihidroxialcanoatos, várias enzimas e aminoácidos, a

presente invenção aplica-se apenas à remoção de inibidores

provenientes do mosto e/ou ao resfriamento do meio de

fermentação .

O que ocorre é que alguns compostos contidos nos

Page 33: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

hidrolisados puros, sendo os principais furfural, HMF,

compostos fenólicos e ácidos carboxilicos, inibem a

fermentação em termos de crescimento e taxa de produção.

Efeitos similares de inibição ocorrem para mostos

preparados por extração de carboidratos da matéria-prima,

por exemplo, da cana-de-açúcar ou beterraba, processo em

que altas temperaturas promovem altos rendimentos de

extração, porém provocam a geração de tais inibidores.

Equipamentos

A fermentação extrativa pode ser executada de forma

continua, batelada ou batelada alimentada e com preferência

de forma continua. A dorna de fermentação, necessária para

a execução do processo fermentativo, deve ter uma entrada

para o solvente, com preferência na parte inferior da

mesma, possivelmente integrada no agitador ou nos

defletores, contando com uma pressão bastante alta para

superar o peso da coluna das fases aquosa e orgânica do

conteúdo da dorna.

O volume da dorna deve ser maior do que a soma da fase

aquosa e a fase orgânica empregada, sendo que a razão do

volume destas fases pode ser ajustada para qualquer razão

entre 1:0.01 á 1:20.

Demais equipamentos necessários para a produção e

recuperação do produto e a reciclagem do solvente podem

Page 34: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

ser: misturador de meio, coluna de absorção, decantador,

cascata de destiladores, destilador, retificador,

centrífuga, válvula ou equipamento para sangramento de uma

fração de células do fermento, equipamento para reativação

celular de eventual fermento reciclado, trocadores de

calor, e outros

A Figura 2 representa o diagrama de blocos de um

processo com a tecnologia proposta pela presente invenção.

Processo biológico

O processo biológico para conversão de substrato para

produto envolve uma fermentação empregando um micro¬

organismo como, mas não limitado a , levedura, como

Saccharomyces cerevisia ou bactéria, como Zymomonas

mobilis , geneticamente modificado ou não, entre outros ou

em quaisquer combinações destes, aqui em diante denominado

como fermento' . O fermento consome fontes de carbono como

sacarose, glicose, frutose e/ou xilose, arabinose ou

quaisquer combinação destes, e converte-os em produtos tais

como etanol, butanol, acetona, propanodiol, 2-3 butanodiol,

xilitol, ácidos orgânicos como ácido acético, ácido

propiônico, ácido láctico, ácido succínico, ácido

butanóico, ácido cítrico, enzimas, aminoácidos como o ácido

glutâmico, lisina e glutamato monossódico, terpenos,

matéria-prima para bioplásticos, lipídeos,

Page 35: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

polihidroxialcanoatos, o próprio fermento ou outros

produtos orgânicos ou qualquer combinação destes. O

processo pode ser executado em condições anaeróbicas ou

empregando aeração, dependendo das necessidades

microbiológicas do fermento empregado para produção do

produto desejado. Eventuais inibidores presentes no meio de

fermentação são removidos do meio pelo solvente,

completamente ou parcialmente. Produtos extracelulares,

muitas vezes um fator inibidor a partir de certas

concentrações como no caso de etanol para Saccharomyces

cerevisiae, também são parcialmente removidos do meio pelo

solvente. Desta maneira, o desempenho do micro-organismo em

termos de taxa de crescimento, viabilidade, produtividade

volumétrica e especifica e rendimento pode ser otimizado,

assim como o uso de energia do processo total de produção

incluindo a recuperação e purificação do produto e o

reciclo do solvente.

A fermentação é um processo exotérmico, ou seja, calor

está sendo gerado durante a conversão do substrato. Este

calor pode ser efetivamente retirado do meio de fermentação

utilizando o próprio fluxo de solvente em sistema continuo,

sendo que o solvente pode ser introduzido na dorna com

baixa energia interna após resfriamento prévio e eventual

estocagem do mesmo. Desta forma, a temperatura da

Page 36: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

fermentação pode ser mantida em torno da ótíma, com menores

gradientes de temperatura na dorna e com mais eficiência em

geral, tanto em termos de custos energéticos quanto em

termos de custos de equipamento e manutenção.

O processo de fermentação extrativa de acordo com a

presente invenção compreende as seguintes etapas:

a ) Entrada de um mosto rico em carboidratos no

biorreator;

b ) Entrada de um inoculo no biorreator;

c ) Injeção do solvente no biorreator;

d ) Remoção do solvente do biorreator;

e ) Recuperação do solvente;

f ) Purificação da fase vapor;

g ) Remoção da fase aquosa do biorreator;

h ) Recuperação do micro-organismo .

Na presente invenção, a etapa de detoxif icação do

mosto, previstas em casos como descritos acima, e de

remoção do produto do meio de fermentação, são integrados.

Desta forma, a remoção in-situ de produto e demais

inibidores do meio de fermentação com solvente

biocompativel de fato facilita a concentração do produto,

elimina uma unidade extra de tratamento do mosto e diminui

o custo total de produção de etanol, tanto em termos de

aumento de produtividade quanto em termos de minimizar

Page 37: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

custos energéticos e de água utilizada no processo

integral .

A etapa (a) é de alimentação do biorreator com mosto

proveniente de processos hidroliticos de matéria-prima

ligno-celulósica, amilácea, carboidratos diretamente

extraiveis, melaços fortemente esgotados com alto conteúdo

de inibidores, como biotina, entre outros ou mostos

similares ricos em carboidratos, onde o conteúdo do

fermentador é composto por uma fase aquosa e outra

orgânica.

A etapa (b) é de entrada de um inoculo no biorreator,

por reciclagem, onde uma pequena fração do micro-organismo

é adicionada, ou por reativação, empregando tratamento

aeróbico, tratamento ácido e/ou alimentação de nutrientes.

Esta etapa pode ou não ser opcional, e esta escolha depende

do tipo de produto, sendo indicada na produção de produtos

extracelulares e não aplicada para a produção de produtos

intracelulares, onde a parede celular do fermento será

perfurada ou destruída para obtenção de produtos como

lipídios, enzimas, polihidroxialcanoatos, entre outros.

A etapa (c) é de injeção do solvente no biorreator,

que ocorre pelo fundo do biorreator ou através de furos nos

propulsores e/ou defletores. 0 solvente é injetado no

fermentados a baixas temperaturas, variando entre -10 e 25

Page 38: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

°C . O solvente pode conter oxigénio estéril para auxiliar

nos mecanismos de manutenção do micro-organismo . A

densidade do solvente é relativamente baixa, o que faz com

que este flua naturalmente para a parte superior do

biorreator, onde se forma uma camada orgânica, sendo que

outra fração permanece parcialmente dispersa na fase

aquosa. Por outro lado, a agitação do meio pode resultar em

maior mistura do solvente no meio de fermentação,

aumentando a superfície de troca de calor e o tempo em que

esta superfície está exposta ao meio. O solvente funciona,

portanto, como um extrator ΐ η-situ do produto, inibidores

e/ou calor do meio de fermentação.

Na etapa (d) , o solvente é removido do biorreator, com

agitação limitada do meio, preferencialmente da parte

superior, onde o mesmo é consequentemente mais rico em

produto, por decantação ou centrifugação, após ou durante a

fermentação .

Na etapa seguinte (e) o solvente é enviado para uma

unidade de recuperação do mesmo. Como o solvente tem uma

volatilidade menor que a água e o produto, os últimos podem

então ser recuperados pelo aquecimento e evaporação a vácuo

e pode ser reintroduzido no biorreator.

Inibidores voláteis podem ser removidos também nesta

etapa. Para produtos sensíveis a altas temperaturas, como

Page 39: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

no caso de várias enzimas, ou produtos de baixa

volatilidade, como no caso de aminoácidos, esta etapa pode

ser modificada para prevenir o prejuízo à estrutura

molecular do mesmo ou possibilitar a sua purificação. Neste

caso podem ser aplicados outros métodos de separação como a

utilização de um segundo solvente com maior volatilidade,

ultraf iltração, aplicação de campos eletromagnéticos,

diminuição da solibilidade do produto, por exemplo, por

aplicação de baixa temperatura ou modificação da polaridade

do solvente, entre outros.

A fase vapor, composta por produto da fermentação e

água, é enviada para setores de purificação, como colunas

de separação ou destilação e retificação (etapa (f )).

A camada aquosa é bombeada do biorreator como vinho

(etapa (g) ) e , opcionalmente, o micro-organismo pode ser

recuperado por centrifugação, ultraf iltração, separação por

membrana ou qualquer método de separação e concentração de

células, na etapa (h) .

Como mencionado anteriormente, para produtos

intracelulares, a etapa (h) pode ser utilizada para a

concentração das células. Já para produtos extracelulares,

como por exemplo no caso de etanol produzido por levedura,

a maior parte do inoculo pode ser re-utilizada, enquanto

que a fase leve é enviada para o setor de tratamento final

Page 40: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

como vinho clarificado, podendo ser as colunas de

destilação ou separação e retificação. O setor de

tratamento final gera o produto e resíduos ou subprodutos,

como vinhaça, flegmassa e óleo-fúsel, por exemplo.

Podem-se citar os seguintes benefícios da tecnologia

proposta pela presente invenção:

• Reduzir o custo energético do processo integral de

fermentação e recuperação do produto;

• Controle da inibição causada pelo produto da

fermentação e/ou pelos produtos secundários originados do

mosto, resultando em maior eficiência de fermentação e

maior produtividade volumétrica e estabilidade de processo;

• Maior viabilidade dos micro-organismos, elevada

estabilidade microbiana geral e menores riscos de aplicação

de micro-organismos geneticamente modificados;

• Uso de maiores concentrações de açúcar, implicando

menor necessidade de água, energia e menos resíduos no

final do processo (por exemplo, para a vinhaça do processo

de produção de etanol que é atualmente de 11 a 13 L/L EtOH,

pode passar a 3-5 L/L EtOH) ;

• Aplicação em processo contínuo ou batelada alimentada.

Durante fermentação contínua, uma vantagem adicional é a

redução da perda de substrato: a taxa de escoamento de

Page 41: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

solvente pode ser utilizada como um fator extra de controle

para eliminar comportamento oscilatório no bioprocesso;

• Resfriamento implícito do meio de fermentação pelo

solvente, introduzindo-o na dorna com baixa energia

interna, eliminando a necessidade de dispendiosa

instrumentação externa de refrigeração, que introduz um

fator de stress desnecessário ao micro-organismo;

• Utilização do solvente pode também resultar em menores

concenrações de impurezas na vinhaça, promovendo a opção de

reciclo da vinhaça no processo, resultando em menores

quantidades de água utilizado no processo e menos energia

necessária para tratamento da vinhaça;

• O solvente agirá como tampão de inibidores,

assegurando por muito tempo certa quantidade limitada de

inibidores também na fase aquosa, que pode atuar como anti¬

biótica natural, porque organismos contaminantes como vírus

e bactérias são expostos a efeitos inibidores similares aos

efeitos para o micro-organismo produtor (ex. levedura);

• Assegurar por muito tempo certa quantidade limitada de

inibidores na fase aquosa pode aumentar o rendimento da

fermentação porque para certas concentrações de furfural o

rendimento de etanol sobre glicose pode ser mais elevado

devido à balança na via metabólica de NADA(P) e inibição

Page 42: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

expressão reprimida ou induzida de enzimas chaves.

• Utilização de um solvente renovável com base

biológica, como o biodiesel sugerido nesta invenção, pode

diminuir o custo do extrator, por ser produzido em ampla

escala e opção de produção no local pela própria usina e ,

após de várias reciclagens no processo fermentativo, pode

ser re-utilizado como combustível.

Como exemplo, a presente invenção pode ser aplicada na

fermentação alcoólica convencional e , mais

preferencialmente, na fermentação alcoólica de segunda

geração. Porém, a tecnologia proposta pela presente

invenção pode ser aplicada também na fermentação para a

produção de outros produtos com propriedades adequadas para

extração pelo solvente, sendo, por exemplo, acetona,

butanol, propanodiol, 2-3 butanodiol, ácido acético, ácido

lático, ácido propiônico, ácido butanóico, ácido succínico,

enzimas, aminoácidos, como o ácido glutâmico, lisina e

glutamato monossódico, terpenos, matéria-prima para

bioplásticos, entre outros ou qualquer combinação destes. O

processo da presente invenção também possibilita a

recuperação de sub-produtos provenientes do caldo

hidrolisado como furfural e compostos fenólicos, que tem

valor económico. Na produção de hidrogénio especificamente,

a composição de cerca 35-50% de etanol-água no fluxo de

Page 43: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

solvente proveniente do fermentador é ideal na reformação a

vapor de etanol por catálise, eliminando uma etapa de

destilação neste processo.

Como pode ser observado, o diferencial do processo da

presente invenção está no uso do biodiesel, como agente

extrator biocompativel para a extração ί η-situ e simultânea

de produto e componentes inibidores da fermentação,

especificamente o produto da fermentação e compostos

inibidores presentes no mosto, sendo provenientes do

hidrolisado da biomassa, do processo de extração de

carboidratos da matéria-prima, ou diretamente provenientes

da matéria-prima. Outro diferencial é o uso do solvente

como agente refrigerante no processo fermentativo, em

combinação ou não com o uso como agente de extração de

componentes inibidores.

Outros agentes extratores, tóxicos ou biocompativeis,

foram explorados no estado da técnica, in-situ, ou fora da

dorna, mas não o biodiesel proposto pela presente invenção,

muito menos para o combinatório dos objetivos de extração

de componentes inibidores e/ou refrigeração.

O diferencial de uso do preferido solvente, biodiesel,

no processo da presente invenção é grande, sendo que ele é

renovável e sua produção sustentável. Além de ser um agente

extrator adequado em termos de biocompatibilidade,

Page 44: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

propriedades extrativas e propriedades físicas, tal como

baixa viscosidade.

O preferido solvente tem vantagens implícitas como

produção no local a partir de óleo vegetal e re-utilização

como combustível após várias reciclagens, como proposto no

processo da presente invenção.

EXEMPLO I

Comparação de óleo vegetal e biodiesel com base em óleo

vegetal como solvente orgânico para extração de inibidores

de fermentação in-situ em bagaço hidrolisado.

O óleo de mamona e seu etilester, de agora em diante

indicado como "biodiesel", são comparados em termos de

biocompatibilidade, coeficientes de partição para vários

inibidores, substratos e etanol, viscosidade e absorção de

água. A absorção de água pode ser significante por

concentrar o substrato na fase aquosa, por um lado, mas

diluir o produto de fermentação na fase orgânica, por outro

lado. As fermentações de licor hidrolítico sintético

também são realizadas para verificar o esperado aumento do

desempenho de etanol solvente-mediado .

Biocompatibilidade

A biocompatibilidade dos solventes (óleo de mamona e

biodiesel com base neste óleo) foi determinada utilizando

quatro frascos Erlenmeyer (125mL) , equipados com pescoço de

Page 45: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

cisne para saída de dióxido de carbono. O pescoço de cisne

continha aproximadamente 2 L de ácido sulfúrico para

secagem do gás de exaustão. O meio de fermentação foi

composto de 10 g/L peptona, 10 g/L extrato de levedura, 2,5

g/L K2HP0 e 60 g/L glicose e foi autoclavado a 121 °C por

15 min. O meio do inoculo foi similar e utilizou-se uma

cepa industrial de Saccharomyces cerevisiae (Santa Adélia) ,

previamente repicada em placas de petri com agar-agar da

mesma composição. Após 12 horas de incubação, 50 mL do

inoculo foi adicionado a cada frasco. A dois frascos também

se adicionaram 10 L de um dos solventes. O peso de cada

frasco foi monitorado durante a fermentação, utilizando uma

balança analítica (Scientech SA210) , indicando a perda de

dióxido de carbono. A variação dos pesos dos frascos com e

sem solvente orgânico foram comparados para verificar a

biocompatibilidade dos solventes. A Figura 3 mostra o

perfil de peso para a fermentação com e sem solvente. Pode-

se ver que não há, praticamente, diferença entre os dois

processos, provando a biocompatibilidade de ambos os

solventes.

No fim da fermentação, todos os frascos com solventes

extrativos tiveram uma perda de 3% dióxido de carbono a

menos por litro do que os frascos sem solvente, mas como

houve retardo consistente no perfil de perda de peso dos

Page 46: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

frascos com solvente orgânico, isso pode ser indicador de

que houve acúmulo de dióxido de carbono na camada orgânica,

ao invés da falta de biocompatibilidade .

Absorção de água e etanol

O solvente tem a capacidade de absorção de certa

quantidade de água, que se eleva na medida em que se eleva

a fração de etanol no solvente, o que efetivamente

concentra o substrato na fase aquosa como ilustrado na

figura 4 . Visto que o micro-organismo empregado na

fermentação converte o substrato até que este atinja uma

determinada concentração no final da fermentação ou na

saída de uma fermentação contínua, a perda total do

substrato, em termos da quantia absoluta, diminui, ou seja,

o rendimento da fermentação aumenta.

A absorção de água no solvente foi determinada para

várias concentrações de etanol na fase aquosa (0 a 200

g/L) . Para ambos os solventes, biodiesel e óleo de mamona,

foi construído um sistema bifásico a partir de 5 gramas de

água Milli-Q, 5 gramas de solvente orgânico e uma quantia

de etanol.

O sistema foi mantido em banho-maria a 34 °C sem

agitação por 48 horas para que se estabelecesse um completo

equilíbrio. Depois deste período amostras da fase orgânica

foram transferidas para um balão de evaporador rotativo,

Page 47: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

com um peso conhecido, e mantido sob baixa pressão (0.5

bar) a 35°C em evaporador rotativo (Marconi MA120) .

Determinou-se o peso do balão com balança analítica em

intervalos de 5 minutos até o peso estabilizar,

significando a completa remoção do etanol e água

previamente presentes na fase orgânica. Uma amostra da fase

aquosa foi retirada, filtrada com um exemplar de filtron

0.22 (Millipore) , e a concentração de etanol foi analisada

com HPLC, equipado com um auto-sampler (Varian 90 95) , um

detector de UV (Varian 9095) , um detector de índice

refrativo (Varian RI-4) , uma bomba binária (Varian 9010) e

usando uma coluna de separação Aminex HPX-87H (Bio-Rad,

7.8*300 mm), com um Biorad micro-guard Cation-H125-0129

pre-coluna, a 25° C , e 5 mM H SO como a fase móvel a

0.7ml/min. As concentrações de etanol e água na fase

orgânica foram calculadas a partir do balanço de massa do

sistema bifásico, utilizando a conhecida massa total de

água e etanol presentes no sistema e a concentração de

etanol na fase aquosa.

Como resultado, foi observado que o biodiesel absorveu

quantidades significantes de água e em média duas vezes

mais água do que etanol. Não há relação constante de água

absorvida e etanol absorvido, como sugerido por Malinowski

et al. (1993) para álcool oleico. Na Figura 5 pode-se

Page 48: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

observar que com o aumento das concentrações de etanol na

fase aquosa, ambos os solventes orgânicos absorveram mais

etanol e água e a razão entre água e etanol absorvida

diminui. O biodiesel absorveu 2.4 a 6.8 vezes mais água do

que o óleo de mamona, enquanto a absorção de etanol foi

aproximadamente a mesma para ambos os solventes orgânicos.

Embora uma relação clara da razão água-etanol na fase

orgânica com a concentração de etanol na fase aquosa não

pudesse ser concluída pelos dados experimentais, um aumento

na proporção de absorção etanol/água pode ser vista como

aumento de concentração de etanol, especialmente para

biodiesel .

Isto significa que com uma concentração mais alta de

etanol na fase aquosa, o etanol é relativamente mais

absorvido. Isso é muito mais significativo no caso de

biodiesel, onde ambas frações de água e etanol absorvidas

são maior com aumento da concentração de etanol. Enquanto

que a diferença em absorção de água é considerável entre

biodiesel e óleo de mamona, a diferença em absorção de

etanol reside mais dentro dos padrões de desvio dos

experimentos .

Frise-se que, com outro produto, por exemplo butanol,

outras quantidades podem ser esperadas.

No todo, o biodiesel apresenta uma vantagem sobre o

Page 49: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

óleo de mamona quanto à maior absorção de água e pode assim

como efeito concentrar substratos na fase aquosa durante a

fermentação, o que leva a uma redução na perda de

substratos em fermentações continuas ou aumento na produção

e rendimento para fermentação em regime batelada e batelada

alimentada .

Coeficientes de partição

Os coeficientes de partição (ver equação abaixo) foram

determinados para subprodutos de hidrólise: furfural, 5-

hidroximetil-f urfural, baunilha, seringaldeido, aldeído

coniferílico e ácido acético. Também foram determinados os

coeficientes de partição para a glicose, sacarose, frutose,

xilose e para glicerol e etanol.

W— —

P (coeficiente de partição)org

onde: mp é o coeficiente de partição (-) ,

w rg : a fração mássica do componente na fase orgânica (-) ,

waq : a fração mássica do componente na fase aquosa.

Todos os coeficientes foram determinados para seis

diferentes concentrações de etanol na fase aquosa na faixa

de 0 a 200 g/L. Para cada um destes componentes e para cada

concentração de etanol, foi estabelecido o sistema bifásico

em um tubo Eppendorf contendo 1 grama de uma solução de

Page 50: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

lg/L do componente, exceto para etanol, em água Milli-Q

como a fase aquosa e 1 grama de biodiesel como a fase

orgânica. O sistema bifásico foi mantido fechado e não

agitado por 48 horas em um banho-maria a 34°C antes de

centrifugar por 5 minutos a 2000 RPM. Uma amostra de cerca

de 500 mg da fase orgânica foi adicionada a 700 mg água

Milli-Q, formando um segundo sistema bifásico de extração

reversa do componente. Este sistema bifásico reverso também

foi mantido sem agitação por 48 horas a 34 °C. As fases

aquosas dos sistemas bifásicos originais e bifásicos

reversos foram analisadas em um equipamento HPLC . As

medições de HPLC para glicose, xilose, glicerol e etanol

foram feitas usando uma coluna de intercâmbio de ion (Bio-

Rad, Aminex HPX-87H 7.8* 300mm) , a 25°C e 5 mMH 2S0 como

fase móvel a 0.7ml/min; a deteção foi feita por um detector

de índice de refração (Varian RI-4) . Ácido acético e ácido

láctico foram separadas com a mesma coluna, mas

quantificadas com um detector UV (Varian 9095) a 210nm.

Furfural, furfural 5-hydroxymetilo, baunilha, syringaldeído

e conif erylaldeído, foram retidos usando uma coluna C-18

(pBondapak, 10 µιη, 3.9*300nm) e quantificados com detecção

UV (Varian 9095) em extensão de ondas que eram mais

apropriadas para cada composto individualmente. Uma solução

de acetonitrila em água foi usada como eluente (lml/min) .

Page 51: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

Os eluentes foram preparados com água Milli-Q, filtrada com

0.45 filtro µ (Millipore) .

A partir do balanço de massa sobre o sistema bifásico

original e reverso, foram determinados os coeficientes de

partição para cada componente e para cada concentração de

etanol na fase aquosa. Todas as medidas foram executadas em

duplicatas ou triplicatas e os resultados resumidos na

tabela 1.

Os coeficientes de partição dependem muito da

quantidade de etanol presente no sistema bifásico.

Coeficientes de partição para HMF e furfural aumentam com o

aumento da concentração de etanol. Por entanto, para

baunilha, seringaldeido e aldeído coniferilico os

coeficientes de partição tendem a diminuir com maior

concentração de etanol no sistema.

Pode ser visto também que para estes componentes

existem coeficientes de partição máximas para concentrações

de etanol dentro da faixa escolhida de 0 a 200 g/L e , mais

especifico, para concentrações abaixo de 80 g/L.

Coincidentemente, este valor é em torno da concentração de

etanol que é visto como a concentração a partir da qual a

inibição por etanol é significativa, em temperaturas

padrões de fermentação de acordo com o trabalho de Rivera e

colaboradores, de 2006 e incorporado aqui por referência em

Page 52: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

sua totalidade. Durante a fermentação etanólica, os maiores

coeficientes de partição de biodiesel podem então ser

explorados sem prejuízo de inibição por etanol.

Para os substratos sacarose, glicose, frutose e

xilose, os coeficientes de partição são relativamente

pequenos, até desprezíveis, com valores de 0,04 para

glicose e frutose até 1,2· IO 3 para xilose. A seletividade

para açúcares é baixa e os coeficientes de partição para os

substratos estudados são desprezíveis e ainda diminuem para

maiores quantidades de etanol no sistema.

Coeficientes de partição de glicerol, ácido acético e

ácido láctico são relativamente baixos e não maiores do que

0,3. Para a extração destes componentes, biodiesel não tem

um desempenho ideal. Contudo, a concentração ótima de

etanol na fase aquosa para exploração máxima de

coeficientes de partição de glicerol, ácido acético e ácido

láctico encontra-se abaixo de 80 g/L.

O mesmo experimento foi feito, sendo que foi

substituído o biodiesel por óleo de mamona. Do balanço de

massa sobre os sistemas bifásicos, sendo o sistema original

e o sistema secundário como acima descrito para biodiesel,

os coeficientes de partição foram determinados para cada

componente e para cada concentração de etanol na fase

aquosa .

Page 53: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

Os coeficientes de partição medidos são representados

na Tabela 1 . Até as concentrações de etanol de 100g/L na

fase aquosa, o biodiesel supera o desempenho do óleo de

mamona como agente extrator para todos os componentes

inibidores de fermentação medidos, sendo HMF, furfural,

baunilha, siringaldeido e coniferil aldeído ácido acético e

ácido lático. Aparentemente, todos esses compostos têm mais

afinidade com biodiesel do que o óleo de mamona.

Entretanto, essa afinidade depende fortemente da quantia de

etanol presente no sistema de duas fases. Os coeficientes

de partição para HMF e furfural aumentam com a crescente

concentração de etanol, pelo menos até 100g/L de etanol na

fase aquosa.

Este também é o caso para coeficientes de partição de

baunilha, siringaldeido e coniferilaldeído no caso do óleo

de mamona como solvente orgânico, mas no caso do biodiesel,

cada coeficiente de partição, tende a diminuir mais rápido

com a quantia crescente de etanol no sistema. Também pode

ser visto que os valores máximos dos coeficientes de

partição desses compostos são atingidos para concentrações

de etanol dentro da faixa de concentração de etanol

escolhida de 0 a 200g/L, mas que as concentrações de etanol

para atingir estes valores máximos, não são os mesmos para

biodiesel e óleo de mamona. Para o biodiesel como solvente

Page 54: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

orgânico, as coeficientes de partição máximas podem ser

encontradas para concentrações de etanol mais baixas de do

que para o óleo de mamona. Coincidentemente, para o

biodiesel, essas máximas são encontradas no etanol abaixo

de 80 g/L, concentração na qual o etanol se torna um

inibidor para a fermentação, na maioria das temperaturas

padrão de fermentação (Rivera et al., 2006). Durante a

fermentação de etanol, as propriedades extrativas de

biodiesel podem assim serem exploradas ao máximo enquanto a

inibição pelo etanol ainda pode ser mantido baixa.

Para os substratos sacarose, glicose, frutose e

xilose, nenhuma diferença significante pode ser vista entre

as coeficientes de partição para biodiesel e óleo de

mamona, mas em todos os casos os coeficientes de partição

são relativamente pequenos, com valores medidos variando

entre 0.04 para glicose e abaixo de 1.2 Ί 0 3 para xilose.

Além disso, coeficientes de partição para os substratos

estudados diminuem frente a uma quantidade aumentada de

etanol no sistema, para ambos, biodiesel e óleo de mamona.

Assim, como desejado, a seletividade para o açúcar é

desprezível em ambos os casos, biodiesel e óleo de mamona

como solvente orgânico. O uso de qualquer desses solventes

durante a fermentação consequentemente não conduzirá a

nenhuma diminuição significante em concentrações de açúcar

Page 55: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

na fase aquosa.

No geral, a ótima concentração de etanol na fase

aquosa para máxima exploração dos coeficientes de partição

para glicerol, o ácido acético e ácido lático podem ser

encontrados abaixo de 80 g/L.

Tabela 1 : Coeficiente de partição de vários compostos para

biodiese (BD) e Óleo de Mamona (CO) na presença de

concentrações diferentes de etanol. na fase aquosa

CO < 0,01 0,37 1,1 0,5 2,5 0,025 0,040 0,040 0,0026 0,044 0,006 0,0019

37 BD 0,26 2,1 3,7 1,8 28 0,018 0,033 0,034 0,0018 0,068 0,127 0,096 0,12

CO < 0,01 0,45 1,0 0,4 2,6 0,0092 0,027 0,027 0,0032 0,023 0,048 0,0024 0,09

74 BD 0,17 2,3 2,8 1,4 29 0,0073 0,022 0,022 0,0012 0,084 0,2 5 8 0,070 0,12

CO 0,012 0,85 1,5 0,6 3,8 0,011 0,024 0,024 0,0038 0,021 0,068 0,0042 0,11

110 BD 0,40 2,4 1,8 0,97 22 0,0046 0,020 0,023 0,0014 0,041 0,304 0 , 0 6 5 0,12

CO < 0,01 1,5 5,4 1,98 16 0,0061 0,019 0,019 0,0034 0,018 0,076 0,0084 0,12

149 BD 0,49 2,5 1,5 0,86 18 0,0093 0,020 0,021 0,0014 0,054 0,337 0,071 0,15

CO 0,15 1,4 4,5 1,84 13 0,0075 0,022 0,019 0,0022 0,018 0,104 0,013 0,14

183 BD 0,61 2,5 1,4 0,81 15 0,0022 0,014 0,014 0,0016 0,038 0,346 0,068 0.15

CO 0,19 1,4 4,1 1,72 9,7 0,0058 0,017 0,018 0,0018 0,016 0,102 0,013 0,17

Fermentações

Foram executadas fermentações para ilustrar a

viabilidade técnica da presente invenção. Como inibidores

foram escolhidos furfural, ácido acético e baunilha,

representando os grupos principais de inibidores: furanos,

ácidos carboxílicos e compostos fenólicos.

Estes inibidores, foram introduzidos no pré-inoculo, no

Page 56: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

inoculo e nas fermentações finais na razão furfural :ácido

acético :baunilha de 1:2.2:0.6 g/L, que é uma razão

representativa para caldo hidrolitico. Além destes

inibidores, os meios foram preparados com 10 g/L de

peptona, 10 g/L extrato de levedura, 2.5 g/L de K2HPO 4 e

110 g/L de glicose, esterilizados em autoclave a 121°C por

15 minutos. A incubação do inoculo foi feita em Erlenmeyer,

utilizando um agitador (Tecnallab TE420) a 34°C e 150rpm e

monitorando a densidade ótica a cada 12 horas, usando um

espectrof otômetro (Beckman Coulter DU 640) a 600nm.

A biomassa das fermentações finais foi determinada pela

massa seca de cada amostra, tendo cada uma sido lavada duas

vezes com água milliQ. Estas fermentações finais,

executadas empregando uma cepa de Saccharomyces cerevisiae

industrial (Usina Santa Adélia) em faixas de temperatura

entre 30 e 37 °C e pH entre 4.0 e 4.5, foram distintas de

seguinte forma:

A . Fermentação sem inibidores, sem solvente

B . Fermentação com inibidores, sem solvente

C . Fermentação com inibidores, com solvente

Os volumes das fermentações A e B foram de 1L de meio.

Para a fermentação C , um total de 400mL do solvente foi

adicionado a 800mL de meio. Antes da fermentação, o

solvente foi lavado 4 vezes em bateladas de cada 500mL cada

Page 57: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

com 2500mL de água destilada a 25°C, utilizando

borbulhamento de ar comprimido com fluxo de 0.2 L-min -

durante 2 horas. Com este método, bolhas de ar levam uma

micro-camada de água limpa para a fase orgânica, na parte

de superior do sistema bifásico. Na superfície desta fase a

bolha quebra, espalhando a água na superfície da camada de

biodiesel e submerge em seguida, levando impurezas até a

fase aquosa inferior. Entre cada ciclo de lavagem, o

solvente foi deixado por duas horas antes da drenagem da

camada aquosa. Amostras desta fase aquosa foram analisadas

com HPLC para garantir a remoção completa de traços de

glicerol, etanol e outras impurezas. Depois de repetir o

processo da lavagem, o solvente foi transvazado, secado e

clarificado em evaporador rotativo (Marconi MA 120) a 55 °C

e 0.5 bar .

Massa seca do fermento e concentrações de substrato,

inibidores e produto (etanol) foram determinados através de

amostras obtidas durante as fermentações. As Figuras 6 , 7 e

8 mostram os resultados para a fermentação A , B e C .

As Figuras 9 e 10 mostram os perfis de concentração de

furfural, furfuril-álcool, baunilha e álcool baunílico

durante a fermentação sem solvente (Figura 9 ) e com

solvente (Figura 10) . O resultado destas fermentações

mostra a viabilidade do invento processo, que pode ser

Page 58: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

resumido de seguinte forma: comparando-se a fermentação sem

inibidores (A) , que demorou 24 horas, com a fermentação com

inibidores e sem solvente (B) , que demorou 90 horas para

ser concluída, verifica-se que houve um aumento de quase 4

vezes no tempo de fermentação.

Assim, a introdução de solvente no fermentador com

inibidores, reduziu o tempo total de fermentação, que

voltou a ser de 24 horas, ou seja, quatro vezes menor,

aproximadamente. Corrigindo o volume aquoso para 20% menos,

estas quantias correspondem a uma redução de tempo de

fermentação de 67%.

Além da desintoxicação do meio pelo solvente, ocorre a

desintoxicação natural por via metabólica do fermento.

Quanto ao furfural e a baunilha, o mecanismo de

desintoxicação microbiológica funciona com a redução de

furfural a álcool furfurílico e baunilha à álcool

baunílico. A princípio, o furfural é reduzido com uma taxa

que decresce quando a concentração de furfural torna-se

menor. A redução de baunilha, ao contrário, é mais vagarosa

ou negligente inicialmente, e depois a completa conversão

de furfural, suas taxas aumentam até toda a baunilha tenha

sido reduzida.

A fermentação com inibidores, mas sem solvente (Figura

9 ) permanece em fase lag até furfural e baunilha serem

Page 59: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

convertidos a níveis menos tóxicos, no o caso a partir de

60 horas. A partir deste momento, a fermentação continua de

maneira convencional durante as mesmas 24 horas, como visto

para fermentação sem inibidores (A) .

Na presença do solvente (Figura 10) , a fermentação

alcoólica começa logo após de introdução de levedura ao

meio, Neste caso, os inibidores são distribuídos entre a

fase aquosa e a fase orgânica. A concentração dos

inibidores na fase aquosa é consequentemente menor do que

na fermentação B , e a levedura que está somente susceptível

aos inibidores nesta fase aquosa, tem u a necessidade menor

de desintoxicar o meio para manter um desempenho

fermentativo viável.

Na presença do biodiesel, o mesmo padrão de redução

pode ser visto como foi o caso para a fermentação sem

solvente, com exceção de duas observações principais.

Primeiramente, há uma fase de retardo de 5 horas antes do

furfural começar a ser reduzido significantemente, enquanto

que a redução dos inibidores na fermentação B começa

diretamente depois da introdução do inoculo no meio. Embora

que o inoculo cresceu sob condições inibidoras iguais para

ambas as fermentações, a levedura tinha que induzir

novamente sua capacidade metabólica para reduzir o

furfural, mas foi acionada a fazer isso mais tarde em

Page 60: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

fermentação C e em uma menor extensão. As concentrações

mais baixas de furfural, baunilha e ácido acético na fase

aquosa podem ter reduzido a necessidade de uma reação

imediata à presença desses compostos tóxicos. Em segundo

lugar, a taxa máxima de redução especifica de furfural,

calculada a partir da somma da redução na fase aquosa e na

fase orgânica, é maior no sistema bifásico (0.27 g-g - )

do que na fermentação sem solvente (0.05 g-g^-h ). Para

baunilha, uma diferença semelhante é vista: 0.20 g g 'h ~1

redução especifica versus 0.03 g g h- ; . Aparentemente, o

mais baixo nivel de inibição sinérgica na presença de uma

fase orgânica permite uma redução de furfural e baunilha

mais efetiva. Assim, enquanto na presença de uma fase

orgânica a concentração de furfural à qual a levedura é

exposta (0.9 g-l - na fase aquosa) é mais baixa do que na

fermentação sem a fase orgânica (2 g l~ ) a taxa de redução

especifica é de cinco para seis vezes mais alta.

Portanto, para fermentação de licor hidrolisado,

manter a concentração dos inibidores limitada é importante

tanto para a taxa de crescimento da levedura quanto para a

redução mais rápida dos inibidores e , assim, para a

produtividade do processo fermentativo em geral.

A alta taxa de redução de furfural resultou na redução

total do furfural em 13 horas, bem antes do fim da

Page 61: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

fermentação. Isto tem implicações para o rendimento de

etanol comparado com glicerol, que é maior enquanto

furfural está presente no meio em baixas concentrações. Por

outro lado, a taxa de crescimento especifica e taxa de

produção especifica de etanol sofrem na presença de

inibidores .

As concentrações de ácido acético não são mostradas,

mas aumentaram levemente durante as fermentações. A tabela

2 resume diversos parâmetros de fermentações para cada lote

de fermentação.

Tabela 2 : Concentrações iniciais de inibidores e parâmetros

de fermentação na seguinte ordem: máximo crescimento

especifico, redução de furfural e baunilha e taxas de

etanol , etanol, glicerol e produção de biomassa .

furfural vanillin acetic acid biodiesel

g - g r 1 g r 1 % g g - g g - g g h-1 g g - - g g- g g- g-9"

0 0 0 0 0,47 - - 1,7 3,4 0.46 0.040 0.043

2 1,2 4,4 0 0,09 0,05 0,03 1,2 3,0 0.41 0.014 0.018

2 1,2 4,4 33,3 0,13 0,27 0,20 1,3 4,1 0.45 >0.026 0.045

Em contraste, foi mostrado no estado da técnica que a

redução das taxas de furfural aumentou com concentrações

mais altas de furfural até 4 g 1 do furfural. Para

concentrações ainda maiores, as taxas de redução diminuíram

Page 62: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

conforme apresentado no trabalho de Palmqvist et al ., em

1999 e incorporado aqui em sua totalidade por referência.

Provavelmente, o efeito da toxicidade sinérgica da

baunilha e ácido acético em combinação com o furfural

diminui a concentração de furfural, para a qual a taxa de

redução do mesmo é máximo. Uma implicação importante desta

observação é que para fermentações executadas em regime

batelada alimentada, com mosto contendo inibidores como

furfural, independente da aplicação de uma fase orgânica,

as taxas de conversão de furfural e baunilha podem ser mais

favoráveis do que para a fermentação em regime batalada,

sendo que a alimentação regulada no regime de batelada

alimentada permite manter as concentrações dos inibidoras

constantes, mas baixas. Entretanto para a viabilidade de

uma fermentação continua, a inibição do crescimento pode

ser o real fator limitador ao invés da taxa máxima

conversão dos inibidores, mesmo sendo que a taxa de

conversão será menor do que para fermentações em regime

batelada ou batelada alimentada como se nota também por

Horvath et al., 2001, incorporado aqui em sua totalidade

por referência.

Ainda por cima, antes de chegar às condições de

^washout' da biomassa na fermentações em regime continuo,

os baixos níveis de conversão do substrato causarão a perda

Page 63: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

do mesmo e baixos níveis da taxa de produção de etanol.

Assim especialmente para fermentações contínuas, o sistema

proposto de duas fases é uma opção prometedora para a

produtividade e rendimento aumentado com menor dependência

de taxas de redução dos inibidores pelo próprio fermento.

Portanto, o processo de fermentação da presente

invenção pode ser otimizado para a obtenção de máximo

rendimento, otimizando-se a vazão de substrato alimentado e

vazão da fase orgânica pelo sistema, e no caso de

fermentação em batelada ou batelada alimentada, mantendo-se

em nível ótimizado a concentração de inibidores presentes

no meio, até o final da fermentação.

Viscosidade

Para ambos os solventes, biodiesel e óleo de mamona,

foram feitas medidas de viscosidade usando um reômetro

Physica MCR301 (Anton Paar GMbh, Graz, Áustria), equipado

com placa paralela de aço (75mm de diâmetro, abertura de

0.5mm) . As medidas para montagem da curva de fluxo foram

realizadas em triplicatas com a taxa de cisalhamento

variando de 0 a 300s -1 . Um programa de passos sobe-desce-

sobe (up-down-up) foi realizado a fim de avaliar a

tixotropia do produto avaliado.

O comportamento do fluxo do biodiesel e do óleo de

mamona foi modelado a fim de obter parâmetros reológicos

Page 64: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

(tensão de cisalhamento (σ0), índice de consistência (K) e

índice de comportamento do fluido (n) ), de acordo com o

modelo Herschel-Bulkley e incorporado aqui por referência

em sua totalidade, das quais foi determinada a viscosidade.

O efeito de temperatura sobre a viscosidade do

biodiesel e óleo de mamona foi estudado dentro da faixa de

5 a 40 °C, usando um intervalo de temperatura de 5°C entre

cada medida. Os resultados desse efeito da temperatura na

viscosidade foram avaliados de acordo com a equação de

Arrhenius, e incorporado aqui por referência em sua

totalidade .

σ - σ ο+ (modelo Herschel-Bulkley)

ÍEA 1ln( ) = ln(77 ) +

(equação de Arrhenius)

Onde η : viscosidade (Pa s ), Ea : energia de ativação para

fluido viscoso (Jmol^K -1), T : temperatura (K) .

Para ambos, biodiesel e óleo de mamona, a tensão de

cisalhamento demonstrou uma forte relação linear com a taxa

de cisalhamento com intercessão a zero nos dois eixos e uma

regressão média de 0.9999 para todas as temperaturas.

Consequentemente não há tensão de cisalhamento (σο) e a

índice de comportamento de fluxo (n) é igual a 1 ,

conduzindo a um comportamento Newtoniano com um índice de

Page 65: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

consistência (K) igual à viscosidade (η) na mesma

temperatura .

A Figura 11 mostra o efeito da temperatura sobre a

viscosidade do biodiesel e óleo de mamona. Grafiçando o

logaritmo natural da viscosidade contra o inverso da

temperatura em Kelvin observa-se uma relação claramente

linear para ambos os solventes, com regressões de 0.999.

Para os dois, biodiesel e óleo de mamona, o aumento de

temperaturas resultou em viscosidades decrescentes.

Entretanto, o biodiesel, consistentemente teve uma

viscosidade mais baixa que o óleo de mamona, para todas as

temperaturas, o que era esperado já que o biodiesel foi

originalmente desenvolvido para ser combustível substituto

de petróleo com baixa viscosidade. Para o biodiesel e óleo

mamona, l"|o é encontrado 3 .126 10 8 e 5.751 '11

respectivamente; ηο de biodiesel é portanto mais alto que o

de óleo de mamona, mas ambos são relativamente pequenos. E

foi encontrado 33556 para biodiesel e 57431 para óleo de

mamona, o que significa que a energia de ativação

necessária para iniciar o fluxo é consideravelmente mais

baixa para biodiesel, e pode ser entendida, que a

temperatura necessária para baixa viscosidade é muito mais

alta para o óleo de mamona.

Page 66: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

Escolha do agente extrator preferido

Ambos, biodiesel e óleo de mamona, demonstram ótima

biocompatibilidade com levedura industrial. Porém, conforme

demonstrado nos itens acima, o biodiesel em base de óleo de

mamona, solvente sugerido na presente invenção, tem

diversas características que o tornam uma escolha

interessante como agente de extração para fermentação

extrativa in-situ de inibidores como provenientes da

biomassa ligno-celulósica hidrolisada ou outros mostos e

matérias-primas definidos acima com fins de fermentação. É

relativamente barato e um bioproduto renovável que pode ser

produzido localmente. É biodegradável e um produto que,

depois de diversos ciclos de utilização como agente

extrator e/ou agente refrigerante, pode ainda ser vendido

ou usado com biocombustível para a própria frota da usina

ou subsidiários.

Mais específico, o biodiesel tem a menor densidade em

comparação com o óleo de mamona, favorecendo sua separação

do caldo de fermentação.

Outra vantagem do biodiesel é que absorve mais água e

etanol do que o óleo de mamona, o que, de fato, concentra

substrato na fase aquosa. Para uma fermentação em regime

batelada ou batelada alimentada, isso significa que o

açúcar é mais concentrado no final da fermentação,

Page 67: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

promovendo a produtividade máxima neste estágio da

fermentação, e aumenta o rendimento de fermentação em

regime continuo.

Os coeficientes de partição para os principais

inibidores de fermentação são mais altos para biodiesel,

resultando na remoção desses inibidores do caldo de

fermentação em favor do processo de fermentação como um

todo .

Para uma fermentação em regime batelada ou batelada

alimentada, a produção de etanol começa mais cedo e as

taxas de produção serão mais altas do que sem um solvente

extrativo. Para uma otimização do uso das capacidades

extrativas do biodiesel, a concentração de etanol na fase

aquosa deveria ser ligeiramente mais abaixa que 50-80 g/l,

coincidentemente a concentração em que o etanol se torna

inibidor.

A comparação de uma fermentação convencional sem

inibidores, uma fermentação com inibidores e uma

fermentação com inibidores e biodiesel, confirmam o efeito

positivo do uso de biodiesel para uma série de fermentação

com furfural, baunilha e ácido acético em termos de tempo

de fermentação total, taxas de crescimento e taxas de

produção de etanol .

Operações Unitárias envolvidas e Fluxograma de modalidades

Page 68: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

do Processo da Presente Invenção

A Figura 12 mostra um exemplo de um possível

fluxograma de uma planta de produção de etanol por

fermentação extrativa, baseada na tecnologia proposta pela

presente invenção. Segundo o diagrama, o meio é preparado

no misturador. Após o preparo e um procedimento de

tratamento térmico, o meio é resfriado por um trocador de

calor e introduzido no fermentador, onde o substrato será

convertido em produto (seja etanol, butanol, acetona,

enzima, aminoácido, entre outros) por um micro-organismo

(seja Saccharomyces cerevisia, Zymomonas mobilis, entre

outros, geneticamente modificado ou não) . A mistura de

vinho e solvente orgânico na saída do fermentador é enviada

para um decantador, aonde o solvente será separado por

diferença de densidade, eventual aplicação de calor, outro

método de separação ou qualquer combinação destes .

Em seguida, como em processo de produção convencional,

o vinho é clarificado em unidades de centrifugação e , via

outro trocador de calor, introduzido no sistema de

destilação. No caso de produto extracelular, o micro

organismo pode ser reciclado e introduzido numa unidade

onde se pode ocorrer eventual sangria de células, seguido

por uma unidade para reativação das células por tratamento

ácido, aeróbico, com nutrientes ou demais métodos com fins

Page 69: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

de reativação.

Um produto volátil como o etanol, butanol ou acetona,

parcialmente presente no gás de saida do fermentador, é

recuperado pela coluna de absorção do produto. O solvente

orgânico, que foi separado no decantador, absorve calor via

trocadores de calor, antes de entrar num sistema, por

exemplo, uma cascata de destiladores, com o fim de

recuperação do solvente, o produto e água, de preferência

usando apenas vapor de baixa pressão. Antes de ser re¬

introduzido no fermentador, o solvente é resfriado a uma

temperatura abaixa da temperatura de fermentação pelo

trocador de calor e um sistema de resfriamento sob baixa

pressão. Produto e água recuperados do solvente são

introduzidos diretamente no sistema de purificação, como,

por exemplo, um retificador.

Outras configurações possíveis são mostradas nas

Figuras 13 e 14.

A Figura 13 mostra a remoção de inibidores e produto

com refrigeração simultânea, com recuperação do produto,

solvente, água e inibidores em sistema com apenas um

biorreator.

A Figura 14 mostra o uso de mais biorreatores em

série, neste caso três dornas de fermentação. Nesta

configuração, a primeira dorna é responsável pela

Page 70: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

fermentação da maior parte do substrato alimentado,

enquanto a segunda e terceira dorna são responsáveis pela

fermentação do restante do substrato. Apenas na primeira

dorna é necessário a remoção de inibidores e produto pelo

solvente o suficiente para obter concentrações bastante

baixas de pelo menos a maioria dos inibidores na saída da

primeira dorna, assim garantindo uma mínima inibição

sinérgica e a fermentação efetiva tanto nesta dorna como

nas dornas conectadas em serie.

A Figura 15 mostra um fluxograma de uma planta de

fermentação extrativa para fermentação em batelada ou

batelada alimentada com uma dorna conforme uma terceira

modalidade da presente invenção. Durante a fermentação, o

solvente está sendo reciclado pelo sistema, aumentando a

produtividade da fermentação por meio de extração contínua

dos inibidores, do produto e por estar mantendo o meio de

fermentação na temperatura ótima. Após a fermentação, a

fase aquosa retirada da dorna é centrifugada e o resto do

produto presente nesta fase é recuperado e purificado pela

etapa de destilação e retificação.

A Figura 16 mostra um fluxograma de uma planta de

fermentação extrativa para fermentação contínua com

resfriamento e remoção de inibidores em várias dornas,

conforme uma quarta modalidade da presente invenção, onde o

Page 71: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

solvente é enviado por todas as dornas em sentido

contracorrente ao meio fermentado. Assim, as concentrações

de todos os inibidores e o produto são minimizadas na

última dorna, garantindo uma produtividade e um rendimento

máximo no processo integral.

Modalidade Preferencial da Presente Invenção

MODELAGEM DE FERMENTAÇÃO DE ETANOL EXTRATIVO EM COMBINAÇÃO

COM RECUPERAÇÃO DE PRODUTO IN-SITU, MÉDIA DESINTOXICAÇÃO E

RESFRIAMENTO.

Um processo de fermentação continuo foi modelado com

uma série de três fermentadores , representando uma armação

industrial realística.

A Figura 17 mostra uma visão esquemática do processo.

Em um primeiro estágio, o mosto, composto de suco

clarificado e caldo hidrolisado, é misturado, concentrado

por evaporação, resfriado e alimentado ao primeiro

fermentador como fluxo (B) . A água evaporada (A) pode ser

usado para limpeza do solvente depois da remoção do etanol

na unidade de recuperação de etanol, mas isso não é

considerado no modelo. O primeiro fermentador é o maior em

volume, contém uma fase orgânica e é responsável pela

conversão de cerca 40-70 % do substrato. A fase aquosa

contém todo o substrato e levedura. A fase orgânica é

parcialmente dispersada na fase aquosa, mas tende a migrar

Page 72: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

para o topo do fermentador devido a sua baixa densidade. A

fração do etanol produzido, inibidores e uma pequena

quantia de água do processo são extraídos para a fase

orgânica, assim melhorando o desempenho e produtividade da

fermentação e concentrando o substrato. Otimizadas

concentrações de etanol no volume aquoso também permitem a

máxima partição da maioria dos inibidores hidrolisados para

a fase orgânica.

Outros fluxos que entram no fermentador são o eventual

micro-organismo concentrado e reativado da unidade de

reativação das células (Q) e solvente reciclado e

refrigerado (I) que não contém inibidores e etanol. A

temperatura do solvente na entrada da dorna é ajustada para

permitir refrigeração do meio da fermentação, enquanto

permanecer em torno de três graus acima do ponto da

solidificação ou turvação deste solvente. Na simulação, uma

variedade de temperaturas de fermentação alvo é avaliada

por sua influência no desempenho da fermentação.

A mistura de vinho e solvente é retirada da parte de

cima do biorreator onde a concentração de solvente é mais

alta devido à diferença de densidade entre o solvente e a

fermentação média. Este fluido (D) é conduzido a uma

unidade decantadora da qual o solvente, rico em etanol e

água, é atraído do topo (E) enquanto o vinho decantado ou

Page 73: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

fase aquosa (J) é recuperado no fundo do decantador. Por

ter um ponto de ebulição mais alto que ambos, etanol e

água, o solvente enriquecido com etanol (E) é aquecido e o

etanol e água são separados do solvente por evaporação, um

estágio que não é incluído no modelo. A ração de água e

etanol recuperada do solvente (F) é conduzida diretamente a

um retificador, unidade da qual o etanol pode ser

recuperado com alto grau de pureza (R) . O fluido de vinho

decantado (J) é alimentado a um segundo e terceiro

fermentador, os quais são colocados em séries através do

fluxo (K) .

Os dois fermentadores contêm apenas uma fase aquosa de

um terço do tamanho da fase aquosa do primeiro fermentador

e servem para conversão do substrato restante. Porque a

maior parte do etanol produzido no primeiro fermentador foi

removida, a inibição por acumulação adicional de etanol

produzido nestes últimos dois fermentadores é limitada. A

remoção adicional de inibidores hidrolisados também não é

necessária porque a concentração desses inibidores já

deveria ser pelo menos baixa o suficiente para viabilizar a

fermentação no primeiro fermentador e quantias baixas de

furfural têm demonstrado ter um efeito positivo para o

rendimento de etanol. O resfriamento do segundo e do

terceiro fermentador é feito convencionalmente, presumindo

Page 74: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

temperaturas de fermentação iguais às temperaturas alvo do

primeiro fermentador e considerando que a geração de calor

nestas dornas é limitado devido a pequena quantidade de

substrato a ser convertido nestes volumes. Após da saida do

fluido do terceiro fermentador (L) , a levedura neste fluido

é separada por centrifugação e conduzido para unidades d

sangramento e tratamento da mesma por fluxo (N) , enquanto o

vinho clarificado (M) é bombeado para destilação e unidades

retificadoras, purificando o etanol (R) de fluidos de

produtos secundários, vinhaça e óleos de fusão (S) , um

estágio do processo que por si mesmo não incluido no

modelo. Uma porção menor da levedura é sangrada (O) e a

fração restante (P) é tratada por arejamento, ácido,

aeração e nutrientes em uma unidade de tratamento para

leveduras antes de re-introduzir no fermentador através de

fluxo (Q) .

A escolha do solvente, um etil-éster de ácido

ricinoléico ou biodiesel de óleo de mamona, foi elaborado

conforme o trabalho descrito nos itens acima e baseado nas

propriedades desejadas: coeficientes de partição favoráveis

para produto e inibidores, alta seletividade para estes

compostos comparada ao substrato, alta biocompatibilidade,

baixa solubilidade na fase aquosa, alta capacidade de

absorção de água para concentrar o substrato do

Page 75: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

fermentador, características termodinâmicas favoráveis para

remoção do produto do solvente e regeneração do solvente

como alto ponto de ebulição, sem formação de emulsões

estáveis, rápida separação da fase aquosa, alta

estabilidade química em altas temperaturas, baixa

viscosidade, baixo custo, possivelmente fabricada

localmente e reutilização para outros propósitos, entre

outros .

A cinética do processo microbiológico de fermentação

com aplicação na presente invenção foi modelado usando

funções cinéticas de temperaturas e concentrações de

substrato, etanol, biomassa e inibidores hidrolisados, os

quais foram elaborados no trabalho de Zautsen et al ., 2011

(submetido em Nov. 2011 para publicação sob título

'Kinetics of ethanol fermentation and inhibition by

hydrolyzed lignocellulosic biomass' ), e incorporados aqui

em sua totalidade por referência. Para a maioria das etapas

do processo, apenas balanços de massa simplificados foram

modelados. A recuperação de etanol e reciclagem de

solvente, destilagem e retificação não foram modelados. A

energia calorífica introduzida nas dornas dos biorreatores

por atividade metabólica relacionada à produção de etanol e

a energia dissipada pelos agitadores nestas dornas foram

incluídas no modelo. A energia introduzida por movimento de

Page 76: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

mistura foi apenas considerada para os fermentadores e o

calor introduzido por dissolução exotérmica de produção de

etanol não foi considerado.

Dimensões e suposições

O primeiro fermentador foi dimensionado com um volume

de fase aquosa de 600m3, enquanto o segundo e terceiro

fermentadores ambos continham 200m3 de caldo. A fase

orgânica no primeiro fermentador teve um volume de 20% da

fase aquosa. A taxa de diluição da fase aquosa do primeiro

fermentador foi fixada para 0.125h -1, pelo ajusto da taxa

de alimentação, reconhecendo as diferentes densidades de

todos os fluidos com suas composições e temperaturas. Os

custos das matérias-primas caldo de cana clarificado .e

licor hidrolitico foram relacionados como 3:1.

Os componentes considerados no modelo foram substrato,

biomassa, etanol, furfural, baunilha, ácido acético, água,

biodiesel como solvente e dióxido de carbono. Sacarose,

glicose, frutose e xilose foram consideradas como

substratos iguais, sem diferenciação para conversão

cinética que dependeria das características e capacidades

específicas da linhagem da levedura aplicada no processo

real. Caldo de cana clarificado e liquor hidrolitico são

supostos a não evaporar durante a preparação do "mosto",

embora em um esquema mais realístico, as concentrações de

Page 77: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

alguns inibidores mais voláteis como ácido acético e

furfural podem muito bem serem reduzidos neste estágio.

Compostos presentes em melaço e xarope que inibem a

fermentação tais como sulfeto, ácidos orgânicos, altas

concentrações de sal, cálcio e magnésio e sólidos

insolúveis não são considerados. Todavia as taxas de

conversão biológica de inibidores diferem para cada

composto furânico ou fenólico, dependendo principalmente do

grupo funcional distinto. A inibição por furfural e HMF é

considerada cumulativa, e é representada no modelo por

furfural como sua soma total de furanos, como é a baunilha,

um aldeído fenólico, escolhido como representante para a

soma de todos os fenóis. O ácido acético representa todos

os ácidos orgânicos. As densidades dos líquidos são

calculadas como a soma média das densidades de todos os

componentes e onde for possível com dependência de

temperatura. O Etanol foi recuperado a 100% do fluxo

solvente de saída e o solvente de fluxo de saída foi

reintroduzido seco no primeiro fermentador e livre de

compostos inibidores previamente extraídos. A temperatura

limite mais baixa para solvente entrando no fermentador foi

determinada como três graus acima de seu ponto de

solidificação, que é aproximadamente -5°C. A cinética do

transporte de compostos da fase aquosa à orgânica não foi

Page 78: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

considerada e condições de mistura em todos os equipamentos

envolvidos foram considerados ideais. O número de Reynolds

Re foi fixado a IO6 como foi o número da potência Np em 5.5

para a turbina do misturador com regulagém. Para cálculo de

potência e turbulência, três misturadores foram supostos

por fermentador, cada um com um diâmetro igualando-se a 30%

de diâmetro da dorna, e a razão entra a altura e o diâmetro

da dorna foi dois para todos os fermentadores . Nestas

condições, a velocidade de ponta do agitador foi entre 3.3

e 6.4 m-s - , dependendo da viscosidade e densidade do caldo

e da fase orgânica. Os valores das coeficientes de partição

dos componentes sobre a fase orgânica e aquosa no

fermentador e no fluxo de saida do biorreator foram iguais

aos coeficientes de partição como medidos em 3 °C em

equilíbrio para concentrações diferentes de etanol na fase

aquosa.

A viabilidade celular foi modelada somente dependente

da temperatura, com taxas de morte celular relativas ao

desvio da temperatura do mosto da temperatura máxima,

estabelecida em 39°C, e somente a fração viável da levedura

contribuiu para o crescimento celular e a produção de

etanol enquanto a fração restante acrescentou à perda do

rendimento do produto. A taxa de produção de dióxido de

carbono foi presumida como equivalente a 95.7% da produção

Page 79: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

do etanol por peso, e a captura de etanol na exaustão de

CO2 não foi considerado, nem de água, por nenhum dos três

biorreatores . A geração de água devido a processos químicos

metabólicos não foi considerada. A densidade da levedura

foi presumida a 1200 Kg m- . Para cada 1000 litros de

etanol produzido, uma fração de 20kg de creme de levedura

foi sangrada e o restante foi reativada e retornada ao

fermentador. Nenhum calor foi introduzido pelo processo de

centrifugação ou em qualquer outro estágio do processo,

exceto na fermentação como detalhado acima. A transferência

de calor do meio da fermentação para o solvente foi

presumida como rápida em todos os casos, de maneira que as

temperaturas da fase orgânica e o caldo da fermentação

foram iguais logo após da introdução do solvente na dorna.

Método de cálculo

O processo de fermentação foi modelado usando Python

como linguagem de computação. Um método de cálculo numérico

foi escolhido para o qual milhões de combinações de valores

de parâmetros de entrada foram avaliadas em paralelo. O

cálculo continuava até os variáveis de estado foram

constantes para todas as combinações de valores de

parâmetros de entrada.

Resultados

Os resultados do cálculo mostraram as faixas para as

Page 80: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

melhores condições de fermentação, otimizando a

produtividade volumétrica e minimizando os custos de

matéria-prima . Como ponto de referência para avaliar o

desempenho da fermentação extrativa, foi feito primeiro uma

simulação para a fermentação convencional, ou seja, sem

solvente como agente extrator.

Fermentação convencional

Fermentações sem solvente também foram simuladas

usando dimensões e suposições iguais para permitir a

comparação com fermentação com a proposta tecnologia de

extração aplicada. Neste caso, três parâmetros de entrada

foram variados: a proporção de licor hidrolítico no mosto,

a concentração final de substrato no mosto de alimentação e

a temperatura da fermentação.

Os resultados mostraram que a otimização da taxa de

produção volumétrica, e a minimização dos custos de

matéria-prima, ambos dependem da razão entre caldo

clarificado e licor hidrolítico e da concentração de

substrato. Porque o resfriamento foi fornecido

convencionalmente para esta fermentação, a quantia de

inibidores no mosto final foi o único fator limitador para

a fermentação. Para baixas f ações de licor hidrolítico, a

taxa de crescimento foi suficientemente alta para prevenir

perda total da levedura por diluição do meio.

Page 81: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

Para mosto contendo apenas suco, as taxas de produção

volumétricas foram maximizadas usando uma concentração de

substrato de em torno de 24%. Concentrações mais altas de

substratos reduziram a taxa do crescimento e

consequentemente as taxas de produção de etanol

(volumétrico) . Embora na concentração ideal de 24% de

substrato, o rendimento total (dados não demonstrados) foi

meramente 53% do máximo teórico devido a uma produção mais

alta de biomassa em detrimento de etanol.

O custo de substrato por volume de etanol produzido

foi menor apenas para os substratos de mais baixas

concentrações de açúcares usados nas simulações, mas não

alcançando menos que 20% dos valores calculados menores

para ambos, fermentação convencional e fermentação

extrativa. As concentrações mais altas de substratos

causaram conversão incompleta de açúcares, e , portanto,

diminuiu o rendimento geral, que está diretamente

relacionado à produção por custo de substrato.

Para fermentações convencionais, as proporções de

caldo hidrolitico não podiam ser maiores do que 2% e

temperaturas de fermentação ideais para taxas de produção

volumétrica ideal foram aproximadamente 32° C , enquanto que

para um menor custo de substrato, as temperaturas ideais

foram mais altas perto de 37°C.

Page 82: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

Fermentação extrativa

Para fermentações com solvente, a taxa do fluxo do

solvente foi usada como um quarto parâmetro independente e

expresso como taxa de diluição de solvente sobre o volume

aquoso.

Resultados mostraram a dependência da taxa de produção

volumétrica e os custos de substrato por volume de etanol

produzido, como a da proporção do caldo hidrolitico e da

taxa de diluição do solvente. A quantidade de inibidores no

mosto final foi um fator limitador para o desempenho da

fermentação para qualquer taxa de diluição de solvente

dada, causando depleção de levedura para altas

concentrações destes inibidores, mas não tão grave como no

caso da fermentação convencional.

Outro fator limitador foi o resfriamento oferecido

pelo solvente. Para baixas taxas de diluição de solvente,

ambas as taxas de produções volumétricas, e a produção por

custo de substrato entraram em colapso devido ao

resfriamento insuficiente. Acima de uma taxa de diluição de

0.25h _ , o solvente forneceu resfriamento suficiente para

todas as composições do mosto. Com taxas de diluição do

solvente maiores, as taxas de produção volumétrica

aumentaram devido à remoção de etanol e inibidores

provenientes do caldo hidrolitico. E ainda mais, as taxas

Page 83: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

aumentadas de diluição do solvente permitiram que frações

mais altas de hidrolisado fossem fermentadas e diminuíram o

custo mínimo de substrato, embora mesmo a taxa de diluição

de l h não foi suficiente para viabilizar a fermentação de

um hidrolisado puro. Entretanto, as consequências

económicas de altas taxas de diluição de solvente, em

termos de custos de operação e energia, não foram

calculadas e são propensas a aumentar o total de custos da

produção, limitando assim a viabilidade do uso de taxas

muito altas de diluição do solvente.

Para a produção por custo de substrato, com o suco

sendo três vezes mais caro que o hidrolisado, uma

composição otimizada de mosto foi encontrada, diferente

para cada taxa de diluição de solvente.

Para uma composição de mosto com a proporção de caldo

hidrolítico fixo a 30%, concentrações de substrato acima de

20% requeriam consideráveis taxas de diluição de solventes

para obter altas taxas de produção volumétrica. Para taxas

de produção volumétrica, diferentes concentrações

otimizadas de substrato foram encontradas para diferentes

taxas de diluição de solventes. Por outro lado, custos

mínimos de substrato foram apenas obtidos para

concentrações mínimas de substratos e diminuíram levemente

com a taxa de diluição de solvente acima do ápice da

Page 84: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

provisão do resfriamento.

Para esta mesma proporção de caldo hidrolitico fixo a

30%, mostos com concentrações de substrato mais elevadas

geraram taxas de fermentação mais altas e elevaram a

produção de calor por atividade metabólica.

Consequentemente, taxas de diluição de solventes mais altas

foram necessárias para fornecer resfriamento suficiente

para concentrações mais altas de substratos.

Para a taxa de produção volumétrica, uma concentração

otimizada de substrato foi encontrada a um porcentagem mais

baixa do que para a fermentação convencional e difere de

uma concentração otimizada de substrato para máximo

rendimento ou minimo custo de substrato, que foram ótimos

ambos a mais baixa concentração de substrato de 15%.

Como também foi notado para fermentações sem remoção

de inibidores e em regime continuo, no trabalho de Horvath

et al . 2001 e incorporado aqui em sua totalidade por

referência, perca total de fermento devido a taxa de

diluição do meio já ocorre a relativamente baixos níveis de

concentrações de inibidores.

O efeito tóxico sinérgico da baunilha, ácido acético e

furfural diminuiu a concentração de furfural para a qual a

taxa de redução de furfural foi ao máximo. A inibição do

crescimento foi um fator limitador para taxas máximas de

Page 85: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

conversão de inibidores específicos por redução metabólica.

Contudo foi provado, por meio de modelagem e

simulação, que a fermentação extrativa em regime contínua,

permitiu uma extração simultânea in-situ de inibidores

presentes no hidrolisado e etanol como produto de

fermentação, bem como resfriamento efetivo do processo de

fermentação pelo mesmo agente extrativo.

Para a fermentação extrativa modelada, o furfural

migrou para a fase orgânica como ocorreu com a baunilha e

ácido acético, cada um com diferentes coeficientes de

partição dependendo das concentrações de etanol no sistema,

melhorando as taxas de conversão de inibidor, aumento de

taxas e taxas de produção de etanol, especialmente a taxas

de solvente aumentadas.

Assim, o modelo combinou remoção de diversas

inibidores por extração e conversão biológica, ambas

afetada por temperaturas e composição do caldo de

fermentação. Diferentes valores para a proporção de caldo

hidrolítico no mosto, concentração de substrato,

temperaturas alvo de fermentação e taxas de diluição de

solvente foram avaliadas, enquanto incluindo a geração de

calor mecânico e metabólico, efeito de inibição pelo

produto etanol, coeficientes de partição dos diferentes

compostos e efeitos de temperatura na conversão cinética

Page 86: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

inibidora. Deste modo, efeitos combinatórios no desempenho

de diversas chaves de indicadores de fermentação foram

revelados .

A taxa de diluição do solvente precisava apenas ser

alto o suficiente para assegurar o crescimento de levedura

tão rápido quanto a taxa de diluição da fase aquosa, sobre

os três fermentadores, e providenciando refrigeração

suficiente do meio de fermentação. Antes de chegar a

condições de washout' do fermento, devido a altas

concentrações de inibidor ou de substrato, baixas taxas de

conversão de açúcar causaram perda de substrato e baixas

taxas de produção de etanol .

As taxas otimizadas de diluição de solvente reduziram

de melhor forma a inibição para ambos, inibidores

provenientes de caldo hidrolitico e o produto etanol,

melhorando as taxas de fermentação.

No contexto de diferentes regimes de fermentações, as

concentrações de inibidor podem ser mantidas baixas em

relação à concentração de biomassa para fermentação em

regime batelada do licor hidrolitico, por controle da taxa

de alimentação do mosto para fermentação em regimes

batelada-alimentada ou continua, e taxa de diliução da fase

orgânica no caso da fermentação continua como apresentada

nesta simulação. Porém, para fermentações em regime

Page 87: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

batelada ou continuo sem a aplicação de uma fase orgânica,

isto não é possível. Consequentemente, taxas de conversão

de furfural e baunilha foram mais altas na fermentação

extrativa apresentada do que na fermentação contínua

convencional, permitindo a fermentação de frações de caldo

hidrolítico no mosto mais altas, gerando taxas de produção

volumétricas mais altas e diminuindo os custos totoal de

substrato .

Deve-se ainda notar que as concentrações de inibidores

provenientes do caldo hidrolítico foram pressupostos a não

diminuir durante a preparação do mosto, que representa um

cenário piorado considerando a alta volatilidade de

inibidores como ácido acético. Dependendo da fonte de licor

hidrolítico e do método e severidade da hidrolise da

matéria-prima, pode-se esperar que as concentrações finais

de inibidores no alimento do mosto são mais baixas que os

valores presumidos neste trabalho, levando a resultados até

mesmo mais favoráveis. Ao todo, pode ser concluído que para

fermentação contínua, o sistema de fermentação extrativa

duas-fases líquido-a-líquido é uma integração eficiente e

uma promissora integração de redução ín-situ da

concentração de inibidores, recuperação do produto e

resfriamento da fermentação.

Resumo

Page 88: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

Os ésteres orgânicos, mais conhecidos como biodieseis,

à base de ácidos graxos como, por exemplo, ácido

ricinoléico ou ácido oléico, são os solventes mais

adequados para ser empregados no processo de fermentação

extrativa conforme revelado pela presente invenção, uma vez

que possuem características fundamentais, tais como:

Biocompatibilidade - o solvente tem uma alta

biocompatibilidade, de importância vital para o desempenho

do bioprocesso. O tamanho da molécula sendo maior do que 12

carbonos impede a miscibilidade da molécula com a parede

celular do fermento e , assim, garante a biocompatibilidade,

desde que não há grupos especiais na molécula que podem

tornar o mesmo em componente tóxico;

Viscosidade, ponto de ebulição e densidade - A

estrutura, contendo pelo mínimo uma ligação dupla por ser

um éster metílico, etílico ou propílico, faz com que a

superfície de interação molecular do solvente seja limitada

na terceira dimensão, resultando em uma viscosidade

limitada e densidade baixa em comparação à fase aquosa,

ambas são propriedades favoráveis. Por outro lado, o

tamanho da molécula, a superfície da mesma e a quantidade

de pontes de hidrogénio que podem ser formados entre as

moléculas, garantem um ponto de ebulição alto e bastante

diferenciado do produto da fermentação e dos demais

Page 89: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

componentes voláteis, permitindo a recuperação do produto e

do próprio solvente de forma economicamente viável;

Polaridade - A polaridade da molécula,

principalmente determinada pelo tamanho da cadeia principal

da molécula e pelos grupos e ligações polares, promove a

extração de substâncias polares e apoiares (inibidores e

produtos como etanol, butanol, acetona entre outros.), mas

justamente não as substâncias que são tão polares como os

açúcares (substrato) . Por razões ambientais, o solvente não

pode dissolver na fase aquosa. Por outro lado, água pode

ser absorvida na fase orgânica e assim concentrar o

substrato. Muitos possíveis grupos polares, como OH, NH3,

ésteres, entre outros e combinações dos mesmos podem formar

uma polaridade ideal .

Coeficientes de partição - capacidades de

absorção e coeficientes de partição altas para o produto e

inibidores provenientes do mosto e seletividade baixa para

substrato.

> Viabilidade económica - a alta disponibilidade no

mercado local e baixo preço da sua matéria-prima, no caso

de biodieseis um óleo vegetal como óleo de mamona, são

fatores muito importantes para que tal molécula possa ser

economicamente viável ou não, além da opção de re¬

utilização do solvente por outros fins, como, por exemplo,

Page 90: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

biocombustível;

Toxicidade - a baixa toxicidade é importante

tanto para operários no local da utilização do solvente, no

caso a usina, como para a eventual introdução no meio-

ambiente, no caso que frações mínimas do solvente misturam

com um fluxo de saido do processo que será exposto ao meio-

ambiente, por exemplo, a vinhaça ou célula sangrada.

Emulsão - não formar emulsões (estáveis) durante

a fermentação e/ou processos downstream;

Estabilidade química do solvente - o solvente não

pode degradar o produto ou causar sua degradação, ou ainda

reagir com o produto para formar outro, independente da

utilização de altas temperaturas nos processos de

recuperação ou da presença de componentes reativos, como os

ácidos, no meio fermentativo;

Em sistema bifásico vale para ambos solventes, óleo de

mamona e biodiesel em base deste óleo, para maiores

concentrações de etanol na fase aquosa, os coeficientes de

partição dos principais inibidores são mais elevados e a

razão entre absorção de etanol e água também é maior,

especialmente para biodiesel. Biodiesel absorve

relativamente mais água, resultando em maior capacidade de

concentração de substrato no meio da fermentação.

Page 91: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

As fermentações em fermentadores de 1L em regime

batelado, mostraram o efeito positivo do uso de biodiesel

como solvente na fermentação extrativo liquido-liquido, na

presença de inibidores furfural, baunilha e ácido acético

no mosto. As taxas de redução de furfural e baunilha em

produtos sem efeito inibidor foram mais elevadas na

presença do solvente, diminuindo a fase lag e aumentando a

taxa de crescimento e a produtividade especifica e

volumétrica, enquanto mesmas concentrações destes

inibidores frequentemente inibibem a fermentação

convencional, diminuindo a viabilidade e até levando a

morte completa do inoculo antes do mesmo sair da fase lag.

Uma série de experimentos permitiu a construção de um

modelo cinético da redução de furfural e baunilha, na

presença de ácido acético e para várias temperaturas e

concentrações destes inibidores. O modelo descreve, entre

outros, as taxas de conversão de furfural e baunilha, a

taxa de crescimento e taxa de produção de etanol em função

da temperatura, substrato e concentração de inibidores e

produto, ajustado por estimação de parâmetros e validado

para várias possíveis combinações chaves das variáveis

independentes envolvidas.

A modelagem e simulação de um sistema integrado de

fermentação extrativa liquido-liquido com recuperação de

Page 92: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

solvente e resfriamento do meio de fermentação pelo próprio

solvente da presente invenção, permitiram a otimização da

taxa de diluição de solvente, a concentração de substrato,

a temperatura alvo da fermentação e a fração de caldo

hidrolitico. Utilizando um modelo de custos relativos das

matérias primas, obtém uma relação importante entre os

custos da mistura do mosto e a produtividade do processo,

baseado no rendimento total do mesmo e admitindo o limite

para a utilização de caldo hidrolitico. Sobretudo, mostrou-

se a vantagem da utilização do biodiesel como agente

extratante de inibidores proveniente de caldo hidrolitico,

etanol e agente de resfriamento para o processo

fermentativo, permitindo a fermentação de maiores frações

de caldo hidrolitico e elevando a produtividade e

rendimento do processo integrado.

Assim, embora tenham sido mostrados apenas algumas

modalidades e modelos da presente invenção, será entendido

que várias omissões, substituições e alterações no processo

de fermentação extrativa para mostos provenientes de

processos hidroliticos de matéria-prima ligno-celulósica,

amilácea, carboidratos diretamente extraiveis, melaços

fortemente esgotados com alto conteúdo de inibidores

naturais como, entre outros, biotina, ou mostos similares,

ricos em carboidratos e com objetivos de fermentação, da

Page 93: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

presente invenção, que emprega um solvente capaz de remover

produtos e inibidores simultaneamente, alem de resfriar o

meio, podem ser feitas por um técnico versado no assunto,

sem se afastar do espirito e escopo da presente invenção.

É expressamente previsto que todas as combinações ou

omissões dos elementos que desempenham a mesma função

substancialmente da mesma forma, para alcançar resultados

semelhantes, estão dentro do escopo da invenção.

Substituições de elementos de uma modalidade descrita por

outra ou omissões dos mesmos são também totalmente

pretendidas e contempladas.

Também é preciso entender que os desenhos não estão

necessariamente em escala, mas que eles são apenas de

natureza conceituai. A intenção é , portanto, ser limitada,

tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas.

Page 94: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de fermentação extrativa caracterizado

por compreender as seguintes etapas:

a ) Entrada de um mosto rico em carboidratos no

biorreator;

b ) Entrada de um inoculo no biorreator;

c ) Injeção do solvente no biorreator;

d ) Remoção do solvente do biorreator;

e ) Recuperação do solvente;

f ) Purificação da fase vapor;

g ) Remoção da fase aquosa do biorreator;

h ) Recuperação do micro-organismo .

2 . Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,

caracterizado pelo fato da etapa (a) compreender a

alimentação de um mosto selecionado dentre hidrolisados de

material ligno-celulósicos, amiláceos, carboidratos

diretamente extraiveis e mostos similares ricos em

carboidratos .

3 . Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,

caracterizado pelo fato da etapa (b) compreender a entrada

do inoculo por reciclagem ou reativação.

4 . Processo, de acordo com a reivindicação 3 ,

caracterizado pelo fato da reativação compreender

tratamento aeróbico, tratamento ácido e/ou alimentação de

Page 95: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

nutrientes .

5 . Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,

caracterizado pelo fato da etapa (b) ser realizada

opcionalmente .

6 . Processo, de acordo com as reivindicações 1 ,

caracterizado pelo fato da etapa (c) compreender a entrada

do solvente pelo fundo do fermentador ou através de furos

nos propulsores e/ou defletores.

7 . Processo, de acordo com as reivindicações 6 ,

caracterizado pelo fato do solvente ser injetado a uma

temperatura variando entre -10 e 25 °C.

8 . Processo, de acordo com a reivindicação 6 ,

caracterizado pelo fato de que o solvente é um biodiesel.

9 . Processo, de acordo com a reivindicação 8 ,

caracterizado pelo fato de que o referido biodiesel ser

selecionado do grupo dos óleos vegetais tais como óleo de

soja, óleo de milho, óleo de mamona, óleo de dendezeiro,

óleo de macaúba.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ,

caracterizado pelo fato de que o referido biodiesel ser

selecionado do grupo dos álcoois com cadeia longa tais como

álcool oléico, fitol, isofitol, álcool estearilico, álcool

cetiloco, octildodecanol .

11. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ,

Page 96: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

caracterizado pelo fato de que o referido biodiesel ser

selecionado do grupo dos ácidos graxos tais como ácido

ricinoléico, ácido oléico, ácido linoléico, ácido

linolênico, ácido láurico, ácido palmítico, ácido

palmitoléico, ácido esteárico.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ,

caracterizado pelo fato de que o referido biodiesel ser

selecionado do grupo dos etanoatos tais como dodecil

acetato, butil dodecanoato.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ,

caracterizado pelo fato de que o referido biodiesel ser

selecionado dentre outras substâncias de cadeia longa como

dibutilsebacate, di (2-etilhexil) sebacato, dibutiladipato,

di (2-etilhexil) adipato, di (2-etilhexil) ftalato, di (3,5,5-

trimetilhexil) phthalato, glicerol tridecanoato, 2-

dodecanone e dodecanal .

14. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ,

caracterizado pelo fato de que o solvente é

preferencialmente um éster metílico, éster etílico ou éster

propílico de um ácido graxo.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ,

caracterizado pelo fato de que o solvente é mais

preferencialmente o ácido ricinoléico.

16. Processo, de acordo com as reivindicações 1 ,

Page 97: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

caracterizado pelo fato da etapa (d) compreender a remoção

dos inibidores e/ou dos produtos pelo solvente.

17. Processo, de acordo com as reivindicações 16,

caracterizado pelo fato de que o solvente é separado da

fase aquosa por decantação ou centrifugação.

18. Processo, de acordo com as reivindicações 16,

caracterizado pelo fato de que a remoção do solvente é

realizada durante ou após a fermentação.

19. Processo, de acordo com as reivindicações 1 ,

caracterizado pelo fato da etapa (e) compreender a

recuperação do solvente por aquecimento ou evaporação a

vácuo e re-introdução no biorreator.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,

caracterizado pelo fato da etapa (f) compreender a

purificação da fase vapor por colunas de separação ou

destilação e retificação.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,

caracterizado pelo fato da etapa (g) compreender o

bombeamento da camada aquosa.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,

caracterizado pelo fato da etapa (h) compreender a

recuperação do micro-organismo por centrifugação,

ultraf iltração, separação por membrana ou qualquer método

de separação e concentração de células.

Page 98: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

23. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,

caracterizado pelo fato da etapa (h) ser realizada

opcionalmente .

24. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,

caracterizado pelo fato de que utiliza um solvente

biocompativel capaz de remover simultaneamente in-situ os

produtos da fermentação e os inibidores da hidrólise da

matéria-prima, além de resfriar o meio.

25. Processo, de acordo com as reivindicações 1 ,

caracterizado pelo fato de que a etapa de detoxificação do

mosto e remoção do produto serem integradas.

26. Processo, de acordo com as reivindicações 1 ,

caracterizado por poder ser executado de forma continua,

batelada ou batelada alimentada.

27. Processo, de acordo com a reivindicação 26,

caracterizado por ser realizado, preferencialmente, em

forma continua.

28. Uso do processo conforme definido pelas

reivindicações de 1 a 27, caracterizado pelo fato de ser

aplicável na fermentação alcoólica convencional e de

segunda geração.

29. Uso do processo conforme definido pelas

reivindicações de 1 a 27, caracterizado pelo fato de ser

aplicável na fermentação de produtos microbiológicos tais

Page 99: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

como álcoois, ácidos orgânicos, enzimas, aminoácidos,

terpenos, matéria-prima para bioplásticos, lipídeos,

polihidroxialcanoatos .

Page 100: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d
Page 101: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d
Page 102: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d
Page 103: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d
Page 104: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d
Page 105: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d
Page 106: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d
Page 107: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d
Page 108: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d
Page 109: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d
Page 110: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d
Page 111: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d
Page 112: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

.

PCT/BR201 2/000470

A . CLASSIFÍCATION OF SUBJECT M A T T E

C12P7/06 (2006.01), B01D11/04 (2006.01), C12P 7/00 (2006.01)

According to International Patent Classifícation (IPC) or to both national classifícation and IPC

B . FIELDS SEARCHED

Minimum documentation searched (classifícation s ste followed by classifícation symbols)

C12P, B01D

Docunientation searched other than minimum documentation to the extent that such documents are included in the fields searched

Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practicable, search .terms used)

Epodoc, Espacenet

C. DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT

Category* Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages Relevant to claim No.

X US 4865973 A (UNIV KINGSTON [CA]) 1 to 2912 September 1989 ( 1989-09- 12)col. 1, lines 9-13; col. 2, lines 34-47; col. 2, Mnes 57 a col. 3, Mnes 3;

tables of columns 3&4, col. 7 , lines 4 1-46; claims

WO 2008 147705 A l ( KRUKONIS VAL [US])UÍDecember 2008 (2008-12-04)

MX 20 100 12736 A (JJ FLORIDA PROPERTIES LLC [US])20 July 201 1 (201 1-07-20)

WO 2009042950 A l ( SANCHEZ-RIERAFERNANDO [US])2 April 2009 (2009-04-02)

Further documents are listed in the continuation of Box C. See patent family annex.

Special categories of cited documents: "T" .later document published after tlie international filing date or prioritydocument defining the general state of the artwhich is not considered date and not in conflict with the application but cited to understandto be of particular relevance the principie or theory únderlying the invention

earlier application or patent but published on or after the international "X" document of particular relevance; the claimed invention cannot befiling date considered novel or cannot be considered to involve an inventivedocument which may throw doubts on priority claim(s) or which is step when the document is taken alonecited to establish the publication date of another citation or otherspecial reason (as specifíed) "Y document of particular relevance; the claimed invention cannot be

considered to involve an inventive step when the document isdocument referring to an oral disclosure, use, exhibition or other combined with one or more other such documents, such combinationmeans being obvious to a person skilled in the artdocument published prior to the international filing date but laterthan "&" document member of the sarhe patent familythe priority date claimed

Date of the actual completion of the international Date of mailing of the international search report

13/01/2013 27/02/2013Name and mailing address of the ISA/ Authorized officer

INSTITUTO NACIONAL DA Elielton Rezende CoelhoPROPRIEDADE INDUSTRIALRua' Sao Bento n° , 17° andar +55 2 1 3037-3984/3742cep: 20090-010, Centro - Rio de Janeiro/RJ Telephone No.

Form PCT/ISA/210 (second sheet) (July 2009)

Page 113: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

C (Continuation). DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT

Category* Citation of document, with indication, where appropriate of the reievant passages Reievant to claim No.

WO 20101 19339 A2 ( PATNAIK RANJAN [US] )2 1 October 201 0 (20 10- 10-2 1)

Curtis L Ivfunson e Judson King: "Factors influencing solvent selectionfor extraction of ethanol from aqueous solutions."Ind. Eng. Chem. Process Des. Dev.Vol. 23(1), pp 109-1 15. 1984.

Finn Kollerup and Andrew J . Daugulis: "Ethanol production by extractivefermentation - solvent identifícation and prototype development"The. Cafiadian Journal of Chemical EngineeringVol. 64(4); Pages 529-704. 1986.

Form PCT/ISA/210 (continuation of second sheet) (July 2009)

Page 114: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

.Information on patent family members

PCT/BR201 2/000470

US 4865973 A 1989-09-12 CA 1280705 C 1991-02-26DE 3689966 D l 1994-08-18EP 0216221 A2 1987-04-01JP 62065675 A 1987-03-24JP 8029108 B 1996-03-27

WO 2008147705 A l 2008-12-04 AU 2008257031 A l 2008- 12-04CA 2687573 A l 20.08-12-04CN 101765378 A 2010-06-30EP 2150135 A 1 . 2010-02-10I 202252 D O 2010-06-16US 2010069686 A l 2010-03-18US 8263814 B2 2012-09-11

MX 2010012736 A 2011-07-20 CN 102597250 A 2012-07-18EP 2291527 A l 2011-03-09IL 209466 D O 2011-01-31US 2009291481 A l 2009- 11-26WO 2009143059 A l 2009-11-26

WO 2009042950 Al 2009-04-02 AU 2008304180 A l 2009-04-02CA 2692266 A l 2009-04-02CN 101802208 A 20.10-08-11US 2009084025 A 2009-04-02US 8313934 B2 2012- 11-20

WO 201011-9339 A2 2010-10-21 CA 2756538 A l 2010- 10-21CN 102439162 A 2012-05-02EP 2419517 A2 2012-02-22JP 2012523245 A 2012-10-04US 2011097773 A l 2011-04-28WO 20 O 19339 A3 2011-02-24

Form PCT/ISA/210 (patent family annex) (July 2009)

Page 115: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

RELATÓRIO DE PESQUISA INTERNACIONAL Depósito internacional N°

PCT/BR201 2/000470

A . CLASSIFICAÇÃO D O OBJETOC12P7/06 (2006.01), B01D11/04 (2006.01), C12P 7/00 (2006.01)

De acordo com a Classificação Internacional de Patentes (IPC) ou conforme a classificação nacional e IPC

B. DOMÍNIOS ABRANGIDOS PELA PESQUISA

Documentação mínima pesquisada (sistema de classificação seguido pelo símbolo da classificação)

C12P, B01D

Documentação adicional pesquisada, além da mínima, na medida em que tais documentos estão incluídos nos domínios pesquisados

Base de dados eletrônica consultada durante a pesquisa internacional (nome da base de dados e, se necessário, termos usados na pesquisa)

Epodoc, Espacenét

c . DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES .

Relevante para asCategpria* Documentos citados, com indicação de partes relevantes, se apropriado

reivindicações N °

X U S 4865973 A (UNIV KINGSTON [CA]) 1 a 2 912 setembro 1989 ( 1989-09- 12)col. 1, lns 9-13; col. 2, Ins 34-47; col. 2, ln. 57 a col. 3, ln. 3; Tabela das colunas 3 e4 ; col. 7, lns 41-46; reivindicações

W O 2008 147705 A l ( KRUKONIS VAL J [US])04 dezembro 2008 (2008-12-04)

MX 20 100 12736 A (JJ FLORIDA PROPERTIES LLC [US])20 julho 201 1 (201 1-07-20) ' '

W O 2009042950 A l ( SANCHEZ-RIERAFERNANDO [US])02 abril 2009 (2009-04-02)

Documentos adicionais estão listados na continuação do quabro C 1 Ver o anexo de famílias das patentes

* Categorias especiais dos documentos citados: ' documento publicado depois da data de depósito internacional, ou deA" documento que define o estado geral da técnica, mas não c considerado de ' prioridade e que não conãita como depósito, porém citado para entender o

particular relevância. princípio ou teoria na qual se baseia a invenção.

" E" pedido ou patente anterior, mas publicada após ou na data do depósito " X documento de particular relevância; a invenção reivindicada não pode serinternacional considerada nova e não pode ser considerada envolver umaattvidade

L" documento que pode lançar dúvida na(s) reivintiicação(Oes) de prioridade ou inventiva quando o documento é considerado isoladamente.

na qual é citado para determinara data de outra citação ou por outra razão V documen de particular relevância; a invenção reivindicada não pode serespecial considerada envol ver atividade inventiva quando o documento é combinado

0 " documento referente a uma divulgação oral, uso, exibição ou por outros meios. comum outro documento ou mais de m tal combinação sendo óbvia paraumtécnico no assunto.

' P" documento publicado antes do depósito internacional, porém posterior a datade prioridade reivindicada. " &" documento membro da mesma àm ia de patentes.

Data da conclusão da pesquisa internacional Data do envio do relatório de pesquisa internacional:

' . 13/01/13 2 7Nome e endereço postal da ISA/BR Funcionário autorizado

INSTITUTO NACIONAL DAPROPRIEDADE INDUSTRIALRua ' Sao Bento n° , 17° andar Elielton Rezende Coelhocep: 20090-010, Centro - Rio de Janeiro/RJ

N° de fax: +55 2 1 3037-3663 N° de telefone: +55 2 1 3037-3984/3742Formulário PÇT/ISA/210 (segunda página) (Julho 2009)

Page 116: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

RELATÓRIO DE PESQUISA INTERNACIONAL Depósito internacional N°

PCT/BR201 2/000470

C. DOCUM ENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES

Relevante para asCategoria* Documentos citados, com indicação de partes relevantes, se apropriado

reivindicações N°

WO 2010119339 A2 ( PATNAI RANJAN [US] )2 1 outubro 2010 (2010-10-21)'

Curtis L Munson e Judson King: "Factors influencing solvent selectionfor extraction of ethanol from aqueous solutions."Ind. Eng. Chem. Process Des. Dev.Vol. 23(1), pp 109-115. 1984.

Finn Kollerup and Andrew J . Daugulis: "Ethanol production by extractivefermentation - solvent identifícation and prototype development"The. Cahadian Journal of Chemical EngineeringVol. 64(4); Pages 529-704. 1986.

Formulário PCT7ISA/210 (continuação da segunda página) (Julho 2009)

Page 117: (PCT) Ù llllll II II I I - patentimages.storage.googleapis.com · concentração d e etanol n o fluxo d e vapor proveniente d o evaporador pode reduzir custos n a recuperação d

RELATÓRIO DE PESQUISA INTERNACIONAL Depósito internacional N°Informação relativa a membros da família da patentes PCT/BR201 2/000470

Documentos de patente Data de publicação Membro(s) da família d patentes ' Data de publicaçãocitados no relatório de pesquisa

US 4865973 A 1989-09-12 CA 1280705 C 1991-02-26DE 3689966 D l 1994-08-18EP 0216221 A2 1987-04-01JP 62065675 A 1987-03-24JP 8029108 B 1996-03-27

WO 2008147705 A l 2008-12-04 AU 2008257031 A l 2008- 12-04CA 2687573 A l 20.08-12-04CN 101765378 A 2010-06-30EP 2150135 A 1 . 2010-02-10I 202252 D O 2010-06-16US 2010069686 A l 2010-03-18US 8263814 B2 2012-09-11

MX 2010012736 A 2011-07-20 CN 102597250 A 2012-07-18EP 2291527 A l 2011-03-09IL 209466 D O 2011-01-31US 2009291481 A l 2009- 11-26WO 2009143059 A l 2009-11-26

WO 2009042950 Al 2009-04-02 AU 2008304180 A l 2009-04-02CA 2692266 A l 2009-04-02CN 101802208 A 20.10-08-11US 2009084025 A 2009-04-02US 8313934 B2 2012- 11-20

WO 201011-9339 A2 2010-10-21 CA 2756538 A l 2010- 10-21CN 102439162 A 2012-05-02EP 2419517 A2 2012-02-22JP 2012523245 A 2012-10-04US 2011097773 A l 2011-04-28WO 20 O 19339 A3 2011-02-24

Formulário PCT/ISA/210 (anexo da família de patentes) (Julho 2009)