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CHAPITRE III : LES HORMONES VEGETALES

III-A -LES FACTEURS QUI CONTROLENT LE DEVELOPPEMENT ET LEURS INTERACTIONS : Le développement d’une plante ne se déroule pas au hasard mais à la fois de façon :

Ξ Harmonieuse Ξ Coordonnée Ξ Reproductible

Harmonieuse : une plante est généralement équilibrée dans ses proportions , la taille relative des différents organes est proportionnée le rapport surface aérienne / surfaces parties souterraine demeure relativement constant. Coordonnée : apparition séquentielle d’organes. Une semence lors de sa germination émet d’abord une radicule qui pénètre dans le sol et fixe la jeune plantule qui va développer sa partie aérienne. (les fleurs apparaissent après les feuilles) Reproductible : pour une espèce donnée, si les conditions sont identiques les dimensions de l’individu arrivé à maturité sont comparables, les périodes de floraison ou de fructification se retrouvent à des époques comparables. Le développement comprend une série d’événements au niveau cellulaire : division, élongation, différenciation, mort cellulaire qui sont intégrés à l’échelle du tissu et de l’organe via des interactions cellulaires générant en particulier des gradients morphogénétiques. Le développement se déroule donc selon un plan propre à chaque espèce qui dans les conditions normales correspond à la mise en place séquentielle de programmes génétiques de développement se recouvrant partiellement. Par exemple, dans la floraison les gènes d’identité du méristème floral comme « leafy » interviennent dans la conversion méristème végétatif – méristème floral mas activent également l’activation des gènes d’identité d’organes floraux intervenant plus rapidement. Dans le cas du développement végétal l’environnement a un poids particulier, une très forte influence sur le développement. Il s’agit des contrôle externes. Contrôles externes Les facteurs de l’environnement peuvent agir selon des effets que nous qualifierons de trophiques en conditionnant l’intensité du métabolisme cellulaire (T°, lumière,etc…), parfois selon des effets mécaniques (exemple vent). Et enfin selon une 3ème catégorie d’effets beaucoup plus subtile que nous appellerons effets signaux, une modification du milieu extérieur correspondant pour la plante à un signal qui va influencer son développement. Ces effets signaux peuvent faire intervenir les hormones comme intermédiaires ou agir après avoir été enregistré au niveau de la plante par des récepteurs capable de percevoir ces signaux et de les transformer en information utilisable par la plante.

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Les photorécepteurs comme le phytochrome représentent un exemple typique de perception de l’environnement lumineux et de contrôle de développement. Les contrôles internes : Ils sont directement liés à la constitution génétique des individus, à leur génome qui contient une information de base (protéines enzymes facteur de transcription) et une information d’organisation susceptibles de percevoir, d’intégrer les signaux externes et de coordonner leurs effets. III-B-GENERALITES SUR L’HORMONOLOGIE VEGETALE :

III-B- a - Notion d’hormone et comparaison hormones végétales – hormones animales :

La notion d’hormone (du grec hormao : exciter le terme fait son apparition en 1905) s’applique à des substances organiques biologiquement actives et fait intervenir 3 idées essentielles :

1. activité à de très faibles concentrations (aucun rôle énergétique ni nutritif) 2. synthèse par l’organisme lui-même 3. transport du site de synthèse au site d’action où elle influence spécifiquement des

cellules cibles. Hormones végétales : composés organiques synthétisé par la plante qui à de très faibles concentrations ont une action sur le métabolisme et le développement généralement dans des tissus différents du lieu de production. Les hormones végétales comme les hormones animales sont impliquées dans les communications intercellulaires. Certaines substances qui ont des effets analogues à ceux des hormones mais qui ne sont pas synthétisées par les végétaux sont appelées régulateurs de croissance. Ce sont généralement des substances chimiques de synthèse qui sont abondamment utilisées en agriculture et horticulture. L’étude des hormones, messagers chimiques agissant sur le métabolisme et le développement, est très avancée chez les animaux, où on a pu montrer que :

- des structures chimiques variées jouaient le rôle d’hormone : stéroïdes, peptides comme : l’insuline, protéines comme l’hormone de croissance, dérivés d’acides aminés (adrénaline), gaz comme le monoxyde d’azote

- les hormones agiraient par le biais de récepteurs membranaires ou cytosoliques - la production d’hormones était souvent cyclique (cycle d’ovulation chez la femme,

hormone de croissance produite la nuit..) - les avancées du génie génétique ont conduit à la production d’hormones (protéines)

recombinantes à des fins thérapeutiques : insuline, hormone de croissance, érythropoïétine…

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Les hormones végétales tout en présentant un certain nombre de points communs avec les hormones animales (perception, voies de transduction…) s’en distinguent sous différents aspects.

- Molécules de faibles PM < 500 lié aux difficultés de translocation de cellules à cellules

- Structures chimiques généralement différentes à l’exception des brassinostéroïdes voisins des stéroïdes animaux

- Produites dans différentes régions de l’organisme (même si une zone de production majoritaire est fréquente) et active à la fois au lieu de synthèse et à distance. Ceci à la différence des hormones animale, où la distinction site de production (ex : glande endocrine) et site d’action est plus claire.

- Enfin les hormones végétales agissent fréquemment de façon additive, antagoniste, ou en synergie sur divers phénomènes physiologiques (action moins ciblée que les hormones animales).

Ce dernier point met l’accent sur la difficulté des études d’hormonologie végétale. Une hormone n’agit généralement pas seule sur un phénomène mais en présence d’autres hormone qui agissent dans le même sens ou en sens contraire.

III-B– b- Les différents types d’hormones végétales : La véritable mise en évidence d’une hormone végétale remonte à 1926 il s’agit des travaux de WENT sur l’auxine. Jusqu’en 1950 on considéra que l’auxine représentait la seule phytohormone mais après cette date d’autres hormones végétales ont été découvertes, dont l’importance s’est confirmée avec les années. Chronologiquement il s’agit des gibberellines (1950), des cytokinines (1955), de l’éthylène (1960), de l’acide abcissique (1965) et des brassinostéroïdes (1995). A l’heure actuelle on connaît donc 6 types d’hormones végétales pour lesquels on peut distinguer :

Des hormones stimulatrices (qui induisent ou stimulent un phénomène physiologique) :

- Auxines - Gibberellines - Cytokinines - Brassinostéroïdes

pour ces hormones on observe des familles de molécules actives

En parallèle on distingue des hormones à effets mixtes comme

- l’éthylène - l’acide abcissique

dans ce cas une seule structure active a été identifiée. D’autres molécules à rôle de « médiateur chimiques » chez les végétaux comme les polyamines, le jasmonate, le salicylate, les oligosaccharides …n’ont pas encore obtenu le statut d’hormone végétale vraie.

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III-B – c- Méthodes d’études des hormones végétales et de leurs mécanismes d’action :

a Approches biochimiques

Elles sont utilisées pour le dosage des hormones, la mesure d’activité des enzymes des voies de synthèse, caractérisation biochimique des récepteurs… Examen du cas particulier du dosage des hormones. Historiquement 3 méthodes ont été retenues

1. les tests biologiques sensibles, peu spécifiques parfois complexes à mettre en œuvre

2. les méthodes physico-chimiques sensibles et spécifiques mais demandant une instrumentation lourde (HPLC –GC – spectro de masse)

3. les test immunochimiques ou radioimmunoessais ultrasensibles et très spécifiques exigeant des anticorps vis-à-vis des hormones et une hormone sous forme radioactive (expériences de compétition).

b Approches de biologie moléculaire et de génie génétique, elles sont utiles pour

la :

- Caractérisation des gènes impliqués dans les voies de biosynthèse des hormones, des gènes qui répondent à l’application d’hormones (Northern blot, RT – PCR, hybridation in situ…)

- Analyse des promoteurs des gènes répondant aux hormones : éléments cis / facteurs trans

- Recherche de gènes par la technique de « promoteur trapping » - Modulation des taux d’hormones par génie génétique aspects

fondamentaux et appliqués, y compris l’utilisation de promoteurs spécifiques

c Approche génétique

Caractérisation de mutants de sensibilité aux hormone de mutants de production d’hormones

d Approche pharmacologique

Basée sur l’apport de drogues, inhibiteurs y compris par microinjection pour disséquer les étapes des voies de transduction du signal hormonal.

III-B – d- Notion de récepteur hormonal :

La reconnaissance d’un signal chimique (hormone) par une cellule et sa transformation en information utilisable ne peuvent se réaliser que si la cellule contient au moins un constituant qui est capable de se lier initialement à l’hormone : le récepteur doit ainsi avoir une forte affinité et une forte spécificité vis-à-vis de l’hormone.

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Les seules molécules qui présentent assez de variations dans leur composition et leur structure pour répondre à ces exigences de spécificité sont les protéines il est donc admis que les récepteurs hormonaux sont généralement des protéines . La liaison hormone-récepteur activerait le récepteur de façon à ce qu’il puisse assurer la transduction du signal hormonal. Cette activation correspond généralement à un changement de conformation qui stimule une activité enzymatique sur la molécule de récepteur (ex : protéine kinase) ou induit une capacité nouvelle d’interaction avec une autre protéine. Cette première étape est suivie d’une série d’événements moléculaires, la chaîne de transduction, qui aboutit finalement à des modifications « décisionnelles »

- Transcription de nouveaux gènes - Degré d’ouverture de canaux ioniques - etc

Le récepteur (son abondance) peut se révéler un facteur limitant dans l’action hormonale. On a parlé d’état de compétence d’un tissu selon la plus ou moins grande abondance de récepteurs. Enfin étant donné les effets pléiotropiques des hormones végétales (effets diversifiés) il a été envisagé une pluralité de récepteurs affectés à des effets cibles spécifiques ( ex : cas de l’éthylène).

III-B- e- Un exemple d’approche biochimique pour la caractérisation de récepteur hormonal : le marquage par photoaffinité

Technique utilisée pour la caractérisation de protéines fixatrices de l’acide abscissique (ABA) sur le plasmalemme des cellules de garde au niveau des stomates de Vicia Faba. Les stomates jouent le rôle fondamental dans la régulation des échanges gazeux et des échanges d’eau entre la plante et son environnement. Il s’agit d’un ensemble cellulaire, l’appareil stomatique (cellules de garde – pore stomatique souvent entouré de cellules épidermiques différentes par leur taille et leur forme des autres cellules épidermiques voisines- les cellules subsidiaires). Ces stomates peuvent être ouverts ou fermés et dans ce dernier cas les échanges gazeux et l’évapotranspiration sont alors très réduits. Le mécanisme de fermeture des stomates repose sur une fuite d’agents osmotiques au niveau des cellules de garde les faisant passer d’un état turgescent à un état moins turgescent ou semi-plasmolysé déterminant ainsi le resserrement du pore stomatique. Lors du stress hydrique les stomates se ferment en réponse à l’ABA, un stimulus hormonal, dont la concentration augmente dans les feuilles (supposé être libéré ou synthétisé « de novo » au niveau du mésophylle foliaire) et plus spécifiquement au niveau des cellules de garde. L’ABA entraîne une fuite de K+ au niveau des cellules de garde.

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Le gros problème de l’étude des interactions hormone / récepteur réside dans le caractère labile des liaisons chimiques faibles qui s’établissent entre les 2 partenaires. Une approche pour résoudre ce problème réside dans le marquage par photoaffinité. Le principe du marquage de protéines, de récepteurs par photoaffinité est le suivant : certaines molécules comportent des groupements chimiques qui par photoactivation deviennent très réactifs et peuvent former des liaisons covalentes irréversibles. Si la molécule est par ailleurs radioactive, ou fluorescentes on peut ainsi marquer de façon stable la protéine réceptrice. L’ABA contient un groupement cétone qui peut être photoactivé par irradiation par des longueurs d’onde de 330 nm. Ceci peut fournir un moyen de marquer irréversiblement des récepteurs protéiques potentiels de l’ABA sans utiliser d’hormones modifiées. Quand l’hormone naturelle ne contient pas de groupement photoactivable on peut travailler avec des dérivés d’hormones sur lesquels on a greffé des groupements photoactivables (groupement azido dans le cas de l’auxine) avec bien sûr conservation de l’activité biologique. Protocole expérimental : On prépare des protoplastes d’épiderme de fève en pelant les épidermes de Fève et en les mettant en contact avec des enzymes de digestion des parois ce qui libère le protoplaste entouré par la membrane plasmique. Par un procédé de centrifugation différentielle on peut même obtenir spécifiquement des protoplastes de cellules de garde. Les protoplastes sont ensuite incubés avec de l’ABA tritié ³H-cis(S)-ABA. La forme active de l’ABA sur la fermeture des stomates….. On irradie la suspension de manière à provoquer le marquage par photoaffinité d’éventuels sites récepteurs. Des contrôles sont effectués

1. avec l’énantiomère cis(R) ABA qui est biologiquement inactif 2. avec une protéine banale l’albumine de sérum de bœuf pour évaluer la possibilité de

fixations aspécifiques. L’interprétation des différents résultats montre qu’il existe une fixation spécifique et aspécifique de l’ABA physiologiquement actif au niveau des protoplastes de cellules de garde. Cette fixation est moins importante au niveau des protoplastes de mésophylle foliaire. La fixation de l’hormone radioactive sur son site de fixation obéit à une cinétique de saturation et peut être déplacée par de l’hormone froide non radioactive de façon très spécifique (isomère physiologiquement actif seul efficace pour le déplacement). Des traitements ménagés des protoplastes des cellules de garde par une protéase, la trypsine supprime complètement la fixation de l’ABA en conservant l’intégrité du protoplaste. Les sites de fixation seraient donc des protéines. Ces expériences ne démontrent cependant pas le caractère fonctionnel du récepteur, la protéine ayant liée l’ABA pouvant être un transporteur ou une enzyme de dégradation.

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III-B- f- Un exemple d’approche génétique pour la caractérisation de récepteur hormonal : le cas des récepteurs de l’éthylène

Le récepteur de l’éthylène est un des récepteurs les mieux caractérisés au plan moléculaire et génétique. Sa caractérisation repose sur l’étude de mutants de sensibilité à l’éthylène dont le mutant ETR1 d’Arabidopsis qui ne présente plus le phénomène de triple réponse lors d’application d’éthylène. Le clonage positionnel du gène muté et l’analyse du produit du gène a montré une analogie marquée avec une famille de protéines « senseurs » de l’environnement chez les bactéries : les systèmes à deux composantes constitués d’un domaine de perception du signal et de transmission du signal : une histidine Kinase et d’un domaine receveur : le régulateur de réponse. La perception du signal entraîne généralement une autophosphorylation dans un domaine conservé de l’histidine Kinase la phosphate étant ensuite transféré à un résidu aspartate du receveur. Ce type de système à double composante se retrouve chez les bactéries dans la perception de la lumière, de l’oxygène et chez les plantes a été aussi impliqué dans la réponse à la lumière et aux cytokinines. Dans ces différents exemples on retrouve le domaine conservé des histidines Kinases HNGFG. D’autres caractéristiques communes entre le gène ETR1 et des gènes bactériens suggère une origine évolutive à partir des bactéries. Le gène ETR 1 a été exprimé dans des levures ce qui leur confère l’aptitude à fixer l’éthylène. Il s’agit donc bien d’un récepteur d’éthylène car on associe ici les preuves génétiques et biochimiques. Un ion cuivre est nécessaire pour la fixation de l’éthylène sur le récepteur d’Arabidopsis et le cuivre est co-purifié avec la protéine récepteur. Une cystéine en position 65 est par ailleurs indispensable pour l’interaction entre le cuivre et la protéine. Au total le récepteur qui est un dimère interagit avec l’éthylène ce qui résulte en un changement conformationnel de site de liaison propagé en suite au domaine transmetteur. Par analyse du génome, plusieurs gènes ETR ont été caractérisés chez Arabidopsis (au moins une famille de 5 membres) qui comprennent des domaines communs mais aussi des spécificités. Ceci permet de les classer en 2 sous familles ETR1 et ERS1 qui ont en commun le domaine conservé de l’histidine Kinase, ETR2, EIN4, ERS2 qui ne l’ont pas. Ces différents gènes pourraient coder des récepteurs affectés à des réponses spécifiques ou à des tissus spécifiques. Il faut noter cependant qu’il n’existe qu’une redondance fonctionnelle partielle entre les différents gènes de récepteurs car les mutants insensibles à l’éthylène au niveau de la triple réponse n’auraient pu sinon être obtenus.

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III – C- L’ACIDE ß INDOLACETIQUE ET LES AUXINES Rappelons tout d’abord les étapes essentielles dans la connaissance de l’AIA. Darwin 1880 observation du phototropisme chez les coléoptiles de graminées excitation perçue au sommet et transmise vers la base Went 1926 récupération par diffusion d’une substance active sur la croissance

appelée auxine, d’auxein = croître. Mise au point d’un test biologique permettant d’apprécier les teneurs en substance active

Kögl 1934 identification chimique de l’auxine à l’acide ß indolacétique (isolé initialement à partir d’urine humaine) puis caractérisation de cette structure dans les tissus végétaux (Zea mays) par Haagen – Smith en 1942

1925-1970 recensement des différentes réponses des plantes à l’action de l’AIA. Caractérisation de substances naturelles ou synthétiques à action auxinique.

1970-1990 études sur le mode d’action de l’AIA au niveau moléculaire en

particulier dans le phénomène de grandissement cellulaire développement des substances à action auxinique en agriculture. 1990-2005 perception / transduction du message auxinique. Exploitation de la

génomique et de mutants pour la compréhension de la production et des mécanismes d’action de l’AIA.

III –C– a- Nature chimique des auxines : Nous utilisons le terme auxine au pluriel car au-delà de l’identification chimique de l’acide ß indolacétique d’autres substances se sont révélées actives sur les tests biologiques initialement définis pour quantifier l’AIA. Ces tests ne sont pas en fait absolument spécifiques de l’AIA mais d’une famille de composé à action biologique commune : les auxines. Auxines naturelles : il s’agit de structure à noyau indole très voisine de l’AIA. Il faut cependant noter que la plupart de ces substances sont impliquées dans les voies de synthèse de l’AIA, en tant qu’intermédiaires, et il n’est pas clairement établi si elles ont une action auxinique par elles mêmes ou si leur effet résulte de leur conversion rapide en AIA lors du test biologique (effet de précurseurs). D’autres substances non indoliques comme l’acide phénylacétique ont une action auxinique cependant plus faible, à même concentration, que l’AIA. Auxines de synthèse : il s’agit de molécules qui miment les effets des auxines naturelles. Ce sont généralement des structures de type indolique ou bien :

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de type phénoxycarboxylique de type naphtalène acétique de type benzoïque

Les plus connues de ces molécules sont le NAA et le 2-4 dichlorophénoxyacétique qui à de fortes concentrations sont utilisées comme herbicide (effet hyperauxinique toxique car la molécule qui n’est pas dégradée s’accumule). Des études importantes ont été réalisées dans une optique relation structure-fonction pour dégager des points communs entre toutes ces structures actives. La plupart de ces molécules ont un noyau insaturé et un groupement carboxylique. Une théorie intéressante a été proposée par Thimann (1969). Elle fait apparaître des analogies marquées dans la répartition des charges dans l’espace (charge positive à 5,5 Ǻ de la charge négative portée par le carboxyle). Ces observations suggèrent la fixation de l’hormone sur un récepteur selon un processus de complémentarité de charges. Par exemple la charge positive de l’azote de l’indole et la charge négative du carboxyle dans le cas l’AIA seraient associées à deux sites de charges complémentaires sur le récepteur. La spécificité de la reconnaissance est confirmée par le fait que de légères modifications d’une molécule peuvent supprimer son activité, le 2-4 D est actif mais le 2-6 D est inactif. Par ailleurs des molécules à structures proches des auxines inhibent compétitivement l’auxine. Ce sont des anti-auxines : exemple 2-4-6 trichlorophénoxyacétique. Ces substances occuperaient les sites récepteurs de l’AIA ou un site particulier du récepteur sans induire la suite des événements et la chaîne de transduction du signal auxine.

III – C- b- Répartition et évolution dans la plante : Initialement caractérisée dans les coléoptiles de graminées, l’AIA et les autres auxines semblent présentes chez toutes les plantes vasculaires. Chez les formes végétales inférieures (Bryophytes, algues, champignons) la répartition et l’action biologique sont très limitées. L’AIA est également produit par les bactéries Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas syringae mais par des voies de synthèse différentes. Le rôle de la molécule pour la bactérie n’est pas clair mais elle intervient dans l’interaction plante/bactérie. Chez les plantes les sites de synthèse maximum sont souvent les sites d’accumulation (apex, jeunes feuilles) mais il faut aussi noter comme nous le verrons plus loin que l’AIA à un transport polarisé qui conduit à sa migration de l’apex vers la base. D’une manière générale les racines sont plus pauvres en auxine que les parties aériennes (les concentrations dans les tissus végétaux varient de 10 à 300 µg/kg matériel frais). La fig. ( ) donne une évolution des teneurs en différentes auxines dans les différents rangs foliaires de plantes de tabac à la suite d’une séparation des molécules par chromatographie en phase gazeuse.

III–C- c- Facteurs intervenants dans la régulation du taux d’auxine – Biosynthèse – Dégradation – Transport – Inactivation :

L’auxine comme les autres hormones doit pour jouer son rôle de messager chimique ne pas demeurer à une concentration constante dans les tissus mais voir ses teneurs fluctuer. C’est la « vague auxinique » qui va déterminer une réponse dans le temps, adaptée au contexte de morphogenèse et de la différenciation.

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Le taux d’auxine active dans un tissu qui va contrôler l’intensité des réponses physiologiques, en parallèle avec la sensibilité de ce tissu à l’auxine peut être potentiellement régulé par différents facteurs qui relèvent du métabolisme de l’auxine ou de son transport.

+ Biosynthèse + Dégradation + Inactivation réversible + Transport + Compartimentation

Ces mécanismes qui sont particulièrement bien connus dans le cas de l’ »AIA peuvent intervenir pour l’ensemble des hormones nous les étudierons particulièrement dans le cas de l’AIA. Biosynthèse : Le tryptophane est un précurseur de l’AIA ceci a été clairement démontré par des expériences d’apport de tryptophane marqué dans le cas de plantes obtenues en conditions stériles (pour éviter des effets de contamination bactérienne). Cependant selon les végétaux les voies de conversion du tryptophane en AIA différent et on a pu identifier au moins 3 séquences principales de conversion.

La voie de l’indoleacétonitrile La voie de la tryptamine La voie de l’acide indole pyruvique

On n’a pas jusqu’à présent caractérisé de mutants déficients en AIA (mutants de synthèse) soit parce que la déficience est léthale soit parce que l’AIA est synthétisé par plusieurs routes. Effectivement en dehors des voies passant par le tryptophane il existerait une (des) voie(s) ne faisant pas intervenir cet acide aminé. Ainsi le mutant orp de maïs (pour orange péricarpe) comporte une mutation dans la voie de synthèse du tryptophane. Les graines germent mais les plantules meurent après le stade 4 feuilles si il n’y a pas de supplémentation en tryptophane. Or ces plantules contiennent de l’AIA. Le précurseur serait dans ce cas un dérivé indolique antérieur au tryptophane. Pour un même plante la contribution des voies dépendante ou indépendante du tryptophane pourrait varier en fonction du développement (ex : chez Arabidopsis). Le transport : Transport polarisé de l’AIA : (Rubery – Raven – Goldsmith) En effet il s’agit d’un transport polarisé de l’apex vers la base. Des expériences simples qui sont représentées sur le schéma ( ) ont permis de confirmer ce phénomène. Ce transport est donc suppose être unidirectionnel. Par ailleurs il s’agit d’un transport actif de cellules à cellules stimulé par l’ATP, dépendant de la T°, de la présence d’O2 et sensible aux inhibiteurs métaboliques (cyanure, azide de sodium). La vitesse de transport est de 10 à 20 mm/heure.

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La polarité diminue à mesure que l’on s’éloigne de l’apex et au niveau des racines les résultats obtenus sont contradictoires. Ce transport de l’auxine qui conduit l’auxine des sites de synthèse principaux : les apex, vers le reste de la plante peut être artificiellement perturbé par des analogues d’auxine du type TIBA : acide triiodo-benzoïque (inhibiteur) ou des composés fluorène (morphactines) qui entraînent des morphologies anormales.

• Raccourcissement des tiges • Ramification désordonnée des rameaux • Nanisme

La théorie proposée pour le transport polarisé est appelée théorie chimiosmotique de la diffusion polaire. Cette théorie implique que la cellule végétale dépense de l’énergie pour maintenir un gradient de pH de part et d’autre du plasmalemme de telle manière que l’espace pariétal est acide par rapport à l’intérieur de la cellule. Ce sont des ATPases qui expulsent les protons vers la paroi. Puisque les membranes sont plus perméables aux molécules non ionisées l’auxine sous sa forme non dissociée pénètre facilement de la paroi vers le cytoplasme par simple diffusion. Une fois dans le cytoplasme la plupart de ces molécules se dissocient en raison du pH cytoplasmique plus élevé et ce phénomène permet une accumulation de l’auxine dans le cytoplasme par déplacement de l’équilibre, la membrane étant relativement imperméable à la forme ionisée. La théorie implique en outre que la portion basale du plasmalemme est plus perméable à l’anion auxine ou possède une plus grande proportion de transporteurs d’efflux que la partie apicale. En fonction de ces différents éléments on peut concevoir le transport polarisé de l’AIA. Il a été effectivement localisé par des techniques d’immunofluorescence, un transporteur d’auxine à la partie basale de parenchyme de tiges de pois. Les gènes codant le transporteur d’efflux, les gènes PIN sont au nombre de 8 chez Arabidopsis thaliana. Des travaux récents ont remis en cause le dogme du transfert unidirectionnel de l’auxine. Ainsi a été démontré un changement de localisation de certains gènes PIN au cours du développement et le rôle de ces gènes dans l’établissement d’un axe apico-basal lors de l’embryogénèse : Nature 13 novembre 2003 Vol 426 – p 147 Friml et al. La mise en place de cet axe est commune aux plantes et aux animaux. La première étape chez les plantes consiste en la division du zygote en deux cellules distinctes. Chez Arabidopsis par exemple la cellule apicale est plus petite que la cellule basale. La cellule apicale se divise ensuite verticalement et la cellule basale continue à se diviser horizontalement pour produire le suspenseur. Il a été montré que dans les premiers stades la cellule basale transporte l’auxine et que la cellule apicale répond à l’auxine. Cette complémentarité est liée à l’intervention d’une protéine impliquée dans l’efflux de l’auxine à l’apex de la cellule basale : PIN 7.

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PIN 7 est localisé par immunoréaction dans la cellule basale immédiatement après la division du zygote dans le système endomembranaire et sur la membrane plasmatique à l’interface avec la cellule apicale. Jusqu’au stade 32 cellules PIN 7 continue à être localisé au sommet du suspenseur à l’interface avec l’embryon en développement.

Après le stade 32 cellules la localisation asymétrique de PIN 7 évolue se déplaçant vers la partie basale des cellules du suspenseur. Il existe un redondance entre les différents gènes PIN et des mutants simples n’aboutissent pas à 1 phénotype particulier, en revanche des quadruples mutants (pin1, pin3, pin4, pin7) montrent des défauts profonds dans l’établissement d’une polarité apico-basale. Ces résultats montrent : Le polymorphisme génique des gènes PIN Leur redistribution spatiale / polarisée au cours du développement précoce de l’embryon Leur rôle dans la création de gradients d’auxine important pour la création d’un pôle

apico-basal et pour la morphogenèse. Inactivation :

L’AIA peut être converti en formes conjuguées inactives par associations avec des métabolites présents dans les cellules.

ac. aminés - liaisons peptidiques ex : indolyl aspartate oses - liaisons esters ex : indolyl glucose

indolyl inositol Ces formes conjuguées peuvent être mise en évidence à la suite de l’apport d’AIA radioactif à une plante : 50 % de l’AIA est parfois retrouvé sous forme conjuguée après 3 heures. On peut également montrer par identification et dosage que l’AIA conjugué représente 50 à 90 % de l’AIA total (dans les feuilles de pois de 2 semaines). Ces formes conjuguées sont souvent présentes à des concentrations supérieures aux formes libres et elles sont très répandues dans les graines, où elles semblent participer à la libération d’AIA libre (par hydrolyse de liaisons esters alors que les liaisons peptidiques sont stables). Ainsi chez les semences de maïs les formes conjuguées diminuent lors de la germination alors que l’AIA libre augmente, on caractérise la présence d’une enzyme qui hydrolyse l’AIA inositol. Ces formes conjuguées peuvent contribuer à maintenir une certaine homéostasie des teneurs en AIA. Ainsi chez les mutants tryp 5-1 chez Arabidopsis l’anthramilate synthase est insensible au tryptophane son effecteur allostérique normal. On observe ainsi une forte augmentation des teneurs en tryptophane mais une stabilité de l’AIA libre avec une augmentation des teneurs en AIA conjuguées.

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La dégradation de l’auxine : L’AIA peut être dégradé par des oxydase de type péroxydase (l’AIA oxydase) selon cependant un mécanisme atypique des péroxydases ne consommant pas d’H2O2. Les produits de dégradation correspondent à une voie catabolique sans décarboxylation produisant de l’ acide oxindole 3-acétique ou à une voie catabolique avec décarboxylation : dans ce cas le méthylène oxindole et l’indolaldéhyde sont les produits caractéristiques. Les tissus âgés sont généralement riches en AIA oxydase ainsi que les racines, ce qui contribue à un faible taux d’AIA libre dans ces organes. Le catabolisme auxinique bien étudié dans les années 1950 à 1980 est actuellement peu abordé dans les recherches.

III–C- d- Diversité des effets biologiques. Exemple particulier de la croissance des fruits :

Nous avons dis précédemment qu’une même hormone avait des effets multiples sur le développement des plantes. On parle d’effets pléiotropiques. Ces réponses multiples dépendent du tissu étudié, du stade de développement et correspondent à ce que nous avons appelé un certain état de compétence des tissus lié à la proportion de récepteurs et à leur nature. Les effets pléiotropiques pourraient compenser le faible nombre de messagers hormonaux chez les plantes (6) en comparaison avec les systèmes animaux (40). Ceci sous toute réserve, étant donné la complexité supérieure des animaux au plan fonctionnel. Ces effets multiples sont mis en évidence par :

Apport d’hormones exogène sur les tissus Par l’étude de corrélations entre l’accumulation d’hormones dans l’espace et le temps

et les réponses physiologiques observées.

Cette multiplicité d’action est particulièrement bien illustrée dans le cas de l’auxine qui intervient sur :

▫ Division ≡ cambium ▫ Elongation ≡ action typique sur les coléoptiles ▫ Différenciation ≡ action rhyzogéne classique en interaction

avec les cytokinines

L’effet sur le grandissement cellulaire est classique. Il est à noter :

1. que généralement l’auxine est sans effet lorsqu’on l’apporte sur des apex de plantes intactes. La plante disposant alors de ses centres producteurs d’auxines aurait une concentration optimale et un apport exogène est sans influence. En revanche l’auxine est active sur les tiges dont les apex ont été décapités ou sur des parties isolées d’organes.

2. que la sensibilité des différents organes varie considérablement tiges 10⁶ M

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racines 10¹⁰ M

Au-delà de ces concentrations, l’auxine exerce un effet inhibiteur sur la croissance – effet hyperauxinique. L’auxine intervient dans des phénomènes plus complexes à l’échelle de la plante entière faisant intervenir des interactions entre différentes hormones et dont nous reparlerons : rôle dans la dominance apicale, l’abscission ou le retard de sénescence. Nous détaillerons ici le problème de la croissance des fruits. La formation des fruits correspond chez le végétal à une période de croissance souvent rapide par division et élongation cellulaire. D’une manière générale les fruits résultent de la croissance des parois de l’ovaire de la fleur ou du réceptacle floral qui se produit dès la pollinisation et se poursuit à la fécondation et pendant la formation des graines (l’ovaire est une partie de la fleur femelle qui renferme les ovules où se produira la double fécondation conduisant à l’embryon et au tissu de réserve). Nous avons dit que la croissance du fruit pouvait commencer dès la pollinisation, ceci se produit par exemple chez l’Orchidée et chez cette espèce on a pu montrer que des extraits de pollen pouvaient déterminer la croissance des parois de l’ovaire. Ces extraits contenaient de l’AIA et le pollen est ainsi une source d’auxine. D’une manière plus générale, il semble donc très probable que ce soit l’AIA qui, produit par le pollen ou les graines en formation, soit responsable de la croissance du fruit. Si on élimine les graine de certains fruits en formation (fraise) on arrête la croissance du fruit. Par ailleurs, on a pu également montrer que l’embryon et l’albumen tissu de réserve de la graine produisaient de l’AIA au cours de leur formation. On peut ainsi observer l’obtention de fruits sans pollinisation ni fécondation par simple application d’AIA sur la fleur femelle (Tomates, Figue), on obtient alors des fruits sans graines : parthénocarpiques. On peut également citer les expériences de NITSCH sur la Fraise ou les akènes sont la source d’auxine, leur ablation sur le jeune fruit empêche son développement normal. La forme du fruit peut ainsi être affectée par l’élimination spécifique de certains akènes mais l’addition d’auxine peut remplacer les akènes manquants. La production naturelle de fruits sans pépins (agrumes) correspond à d’autres situations ou certains mutants ont été sélectionnés.

III–C- e- Mécanismes d’action dans le phénomène de grandissement cellulaire :

Avant d’aborder l’étude d’un mécanisme d’action de l’auxine dans le grandissement cellulaire, rappelons les conditions du grandissement cellulaire. Ce grandissement est conditionné par une entrée d’eau dans la cellule. Ainsi quatre types d’évènements se produisent chronologiquement au niveau de la paroi lors de la croissance de la cellule.

1. accroissement des propriétés d’extensibilité de la paroi 2. entrée d’eau résultant de la diminution de la pression de turgescence 3. extension des parois et grandissement de la cellule 4. synthèse de nouveaux éléments des parois.

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Les mouvements de rentrée d’eau dans la cellule qui se font par osmose sont conditionnés par la concentration saline du contenu cellulaire (pression osmotique). Mais la cellule est entourée par un cadre rigide la paroi qui va lors de l’entrée d’eau opposer une résistance (pression de turgescence). L’attraction réelle que subissent les molécules d’eau va donc être égale à la différence entre pression osmotique et pression de turgescence. Pression de succion = Pression osmotique – pression de turgescence. Il apparaît donc qu’un élément déterminant dans l’entrée d’eau peut être la diminution de la pression de turgescence, résultat de l’accroissement des propriétés d’extensibilité des parois. De nombreux arguments sont en faveur d’un rôle de l’auxine sur le grandissement cellulaire via une action sur l’extensibilité de la paroi. Les facteurs intervenants dans le relâchement pariétal :

1. rôle du pH Les mécanismes de modification de la structure pariétales au cours de l’élongation ont été étudiés sur des fragments d’épicotyles, hypocotyles ou coléoptiles, organes dont la croissance est due uniquement à de l’élongation cellulaire (Figure). Placés dans une solution additionnée d’auxine, ces organes subissent une élongation plus importante. Les études des facteurs capables de remanier les parois ont montré que l’élongation de coléoptiles sous contrôle de l’auxine était associée à une acidification du milieu dans lequel était effectuée l’expérience. Il a ensuite été observé que la même élongation était obtenue par l’incubation des coléoptiles dans une solution acide. Rayle et coll. ont alors proposé que les échantillons traités à l’auxine acidifient leur parois et que cette acidification (pH=5,5) pourrait permettre l’activation d’enzymes capables de remanier la paroi (Rayle and Cleland, 1992). C’est l’hypothèse de la croissance acide. Des expériences complémentaires de mesure de potentiels électriques sur des protoplastes traités par une auxine (NAA) ont permis de montrer une hyperpolarisation des protoplastes liés à une excrétion de protons en dehors de la membrane plasmique et une inhibition de cette hyperpolarisation par des anticorps anti-ATPase. Ces résultats suggèrent fortement que l’auxine augmenterait l’activité ATP-ase via une action sur la transcription, la traduction ou le transport de la protéine vers la membrane plasmatique. Comment l’acidification agit-elle sur l’extensibilité de la paroi ? Sans rappeler la structure et la composition chimique de la paroi en détail on peut préciser que la paroi I est un composite formé de plusieurs polymères associés par différents types de liaison

- - - -

cellulose hémicellulose matières pectiques protéines

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Ce sont surtout les interactions entre cellulose et hémicelluloses (2 composants majeurs) par l’intermédiaire de liaisons H qui ont été considérés. Ces liaisons H stabilisent le composite et leur suppression le fragilise en le rendant plus malléable, plus extensible. 3 modes d’action de l’acidification sur l’extensibilité de la paroi ont été envisagés :

1. Hypothèse d’une action chimique d’une concentration accrue de H⁺ sur la rupture de liaisons hydrogènes – Hypothèse peu confirmée par l’expérimentation.

2. Hypothèse de l’optimisation en milieu acide de l’activité d’enzymes de dégradation des polysaccharides type glucanases. Certains arguments plaident en faveur de leur intervention = blocage de l’expansion par des anticorps antiglucanases, l’auxine induit par ailleurs certains glucanases (chez la tomate).

3. Hypothèse de l’intervention d’autres protéines.

2. Rôle des expansines : La paroi contient de nombreuses enzymes hydrolytiques (actives sur les polysaccharides, Fry, 1995) : glycosylhydrolases catalysant soit des hydrolyses au milieu des chaînes (endoglycosylases comme les ß-,4- endoglucanases) ou à leur extrémités (exoglycosylases comme les xylosidases). Par ailleurs, des transglycosylases spécifiques des xyloglucanes (xyloglucane transglycosylases hydrolases ou XTH, anciennement XET, voir §3) ont été identifiées. Néanmoins, aucune de ces enzymes n’apparaît plus active à pH acide, et aucune n’induit une élongation in vitro quel que soit le pH. Par contre, la purification d’extraits pariétaux d’hydrocotyle de concombre a permis d’identifier des protéines, appelées Ex29 et Ex30 pour expansines, sans activité catalytique détectable, capables d’induire une importante élongation cellulaire à pH acide (McQueen-Mason et al., 1992). Le clonage des gènes correspondant a conduit à l’identification d’une famille multigénique subdivisée en expansines α et expansines ß conservées chez les Dicotylédones et les Monocotylédones (Cosgrove, 1999). Récemment, grâce au séquençage complet du génome d’Arabidopsis thaliana, une nouvelle classe est également distinguée : les expansines γ ou « expansin-like proteins » (Li et al., 2002). L’ensemble des expansines comporte, d’une part une domaine similaire au domaine catalytique d’endoglucanases mais sans acides aminés catalytiques, d’autre par un domaine similaire aux CDB (Cellulose Binding Domains) de cellulases microbiennes (Figure). Les expansines forment une famille de 38 gènes chez Arabidopsis thaliana (www.bio.psu.edu/expansins/). Elles sont largement exprimées dans tous les organes, et en particulier dans les tissus en élongation (Cosgrove, 1999 ; Cosgrove, 2000 ; Li et al., 2002). On peut noter en particulier différentes observations en faveur de leur rôle majeur dans le relâchement pariétal (revue par Cosgrove, 2000) : en particulier : les expansines Ex29 et Ex30 ne sont présentes que dans des zones en élongation de l’hypocotyle.

3. Rôle des XTH (ou xyloglucanes transglycosylases hydrolases) : Malgré leur incapacité à induire « in vitro » un relâchement pariétal plusieurs enzymes hydrolytiques sont exprimées spécifiquement dans les tissus en expansion.

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Les XTH peuvent couper une molécule de xyloglucane et rattacher un des fragments sur une seconde molécule. Dans certains cas le transfert peut avoir lieu sur une molécule d’eau résultant en un clivage simple comme celui réalisé par une endoglucanase. Les XTH sont exprimés dans des tissus en élongation et induites par des traitements inducteurs de l’élongation (auxine). Par ailleurs, des fragments courts de xyloglucane (oligosaccharides) induisent une élongation cellulaire mais les longs fragments l’inhibent. Les résultats suggèrent que le métabolisme des xyloglucanes contrôle l’élongation. 33 gènes de XTH ont été identifiées chez Arabidopsis associés à des profils d’expression tissus –spécifiques mais aussi à des spécificités de substrats.

4. Rôle des endoglucanases : Elles sont incapable d’induire l’élongation in vitro mais des arguments plaident en faveur de leur intervention comme l’induction par IAA de la glucanase CEL 7 chez la Tomate.

III–C- f- Les récepteurs d’auxine : Des protéines de liaisons (Auxin binding proteins : ABP) pour l’auxine ont été caractérisés initialement par des techniques chimiques du type photoaffinité. Les expériences ont conduit à la caractérisation d’anticorps vis-à-vis de ces protéines et à l’identification de gènes correspondants. Une difficulté d’interprétation a porté sur la localisation majoritaire d’ABP sur le reticulum endoplasmique, seule une faible proportion d’ABP étant situé au niveau de la membrane plasmique (en contradiction avec la localisation théorique des récepteurs sur la M. P. et sur l’effet biologique d’auxines non perméantes). La protéine est un dimère de 44 Kd correspondant à 2 sous-unités de 22 Kd. Son rôle fonctionnel est démontré par quatre types d’arguments :

1. L’apport d’ABP1 de maïs purifié à des protoplastes de tabac, augmente la réponse d’hyperpolarisation en présence de NAA

2. Au contraire l’apport d’anticorps ABP supprime cette réponse 3. Un mutant d’insertion dans le gène ABP1 a été identifié chez Arabidopsis

thaliana. A l’état d’homozygote le mutant meurt dans la phase globulaire de l’embryogénèse démontrant le caractère essentiel de ce gène.

4. La surexpression du gène ABP1 chez le tabac (associé à un promoteur inductible par la tétracycline) amplifie certaines réponses à l’AIA.

Ces différents résultats ne préjugent pas de l’existence d’autres récepteurs au-delà d’ABP1.

III–C- g- L’auxine et le contrôle de l’expression des gènes :

L’impact de l’auxine sur le grandissement cellulaire via une acidification de la paroi n’est qu’une des réponses biologiques à l’AIA. Cette action biochimique sur une ATPase

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s’accompagne par ailleurs d’un effet positif sur l’expression de gènes dans le cas du grandissement cellulaire ou d’autres phénomènes. En clair, l’apport d’AIA entraîne l’augmentation d’expression d’un grand nombre de gènes (le plus souvent dans le sens d’une surexpression). Bien qu’on connaisse mal la chaîne de transduction du signal auxine on a approfondi au cours des dernières années certains des mécanismes impliqués au niveau du contrôle de la transcription par l’AIA.

• Les promoteurs des gènes sensibles à l’AIA possèdent en commun des séquences (simples ou composites) communes qualifiées d’auxine responsive éléments AUX-RE. Cette situation est expérimentalement démontrée par des expériences de délétion du promoteur ou par un couplage d’un promoteur minimum contenant ces éléments avec le gène GUS, qui est ainsi exprimé et réponse à l’AIA. Cette présence de séquences spécifiques dans les promoteurs des gènes dont l’expression est contrôlée par les hormones est générale pour l’ensemble des hormones.

Au-delà, des facteurs de transcription capables de reconnaître les séquences AUX-RE ont été caractérisés : les ARF1 (auxine response factor) et 23 gènes ARF1 ont été caractérisés chez A. thaliana (pour des protéines de 67 à 129 Kd).

Cette multiplicité de facteur de transcription qui peut correspondre à des voies de transduction spécifiques se complique encore par l’intervention d’une autre classe de gènes la famille AUX/AIA pour laquelle on a démontré l’existence de 25 gènes. Ces gènes répondent très rapidement à l’auxine et comportent dans leur séquence des éléments très comparables à la séquence de gènes ARF1 (dans la partie C terminale).

Cette identité de domaine (domaine III et IV) facilite l’interaction des protéines AUX/AIA et ARF1 et cette liaison avec ARF1 module sa capacité d’activation de la transcription. Les protéines AUX/AIA ont des demi-vies très courtes de 8 à 10 minutes et leur dégradation contrôlée par le système protéasome ubiquitine dépendant est stimulée par l’AIA.

Une complexité du système réside dans le fait que selon les situations le complexe AUX/AIA/ARF1 stimule ou inhibe la transcription (le cas plus fréquent est l’inhibition).

Des mutants manquant de certains facteurs ARF présentent des anomalies de développement ainsi que certains mutants des gènes AUX/AIA. Récemment un travail sur la tomate impliquant la sous expression selon la stratégie anti-sens d’un gène AUX/AIA, le gène DR4, a montré l’apparition de phénotypes caractéristiques d’une hyperauxinie telle que par exemple l’apparition de fruits parthénocarpiques, AUX/AIA serait dans ce cas un régulateur négatif et d’une manière générale le système AUX/AIA pourrait représenter un système de rétrocontrôle par l’AIA des phénomènes induits par l’AIA (empêchant que la machine « s’emballe »).

On a ici une démonstration de la complexité des facteurs qui interviennent dans la régulation de la nature et de l’intensité des mécanismes transcriptionnels contrôlés par l’AIA.

- Spécificité des gènes et protéines ARF1 et AUX/AIA. - Teneurs en protéines ARF1 et AUX/AIA.

Dans le cas des gènes AUX/AIA la teneur en protéines correspondantes résulte à la fois de l’intensité de la transcription et de la vitesse de dégradation, toutes deux contrôlées par l’AIA.

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III–D- LES GIBBERELLINES :

Les gibbérellines constituent un deuxième groupe de substances de croissance qui paraissent actuellement avoir une importance peut être aussi grande que les auxines dans le développement de la plante. Si les premières observations relatives à la découverte de l’auxine étaient liées à une réponse physiologique normale de la plante (les tropismes), les gibbérellines ont été mises en évidence à la suite de l’observation d’un fonctionnement pathologique. Elles ont en effet été caractérisées à la suite de l’étude d’une maladie du riz.

III–D– a – Historique – Découverte : Dès le début du siècle, des fermiers japonais avaient constaté que certains plants de riz étaient atteints de gigantisme. Ces plants cependant ne fructifiaient pas et ne présentaient donc pas d’intérêt pour la production. Il fut établi que cette anomalie dans la croissance résultait de l’infection par un Ascomycète parasite appelé Gibberella fujikuroi (KUROSAWA, 1926) ou Fusarium moniliforme quand le champignon est cultivé in vitro = un extrait de son milieu de culture provoque les mêmes symptômes d’élongation, et vers 1938 on arriva à isoler de ces milieux de culture un mélange de substances actives appelées gibbérellines. Ces travaux ne furent pendant longtemps connus qu’au Japon et ce n’est qu’après la deuxième guerre mondiale que des recherches furent entreprises dans le monde occidental. Vers 1956, à partir d’une souche de Gibberella ne produisant qu’une seule gibbérelline on put isoler et caractériser chimiquement l’acide gibbérellique ou GA3 (travaux de CROSS). Pendant ce temps, les physiologistes démontraient les effets spectaculaires des gibbérellines isolées des filtrats de cultures de champignons sur la croissance de végétaux (à très faibles doses ces substances stimulent en particulier la croissance des espèces naines : haricot, pois, maïs) qui sont souvent des mutants de production de GA. Une dose de 0,1 µg par plant permet de doubler la hauteur de pois nains. Parallèlement on démontrait la présence des gibbérellines dans les tissus végétaux (non infectés) (PHINNEY et WEST en 1956 chez le concombre). Avec la mise en évidence de la répartition générale des gibbérellines il apparaissait donc que l’on était en présence d’un nouveau groupe d’hormones végétales.

III–D– b-Nature Chimique et Diversité des Gibbérellines Naturelles : Nous avons parlé de ces substances au pluriel car la caractérisation de la première gibbérelline GA3 a été suivie de la mise en évidence de nombreuses autres gibbérellines dans les tissus végétaux puisqu’on connaît plus d’une centaine de gibbérellines (130) à l’heure actuelle caractérisées chez les végétaux supérieurs et les champignons (certaines étant présentes dans les deux sources). Ces différentes structures possèdent en commun un squelette carboné le squelette gibbane qui constitue un système de cycles pratiquement unique dans la chimie des substances naturelles. Les substituants carbonés portés en 7 et 9a du noyau C étant réunis par une liaison pour donner un 4ème cycle. Définition des gibbérellines : Substances synthétisées par les plantes possédant le squelette gibbane et actives vis-à-vis de tests biologiques spécifiques tels que la croissance de mutants nains (Maïs) ou la production d’αamylase par des albumens d’orge.

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Les différentes gibbérellines se différencient par :

Le nombre total d’atomes de carbone (gibbérellines en C19, ex : GA3 et en C20, ex : GA18).

La présence ou non de doubles liaisons Le nombre de carboxyles Le nombre et la position des substituants (OH ou CH3 en

particulier). Différentes remarques à propos de cette multiplicité de gibbérellines naturelles :

• La progression dans le nombre des gibbérellines connues est liée à l’utilisation des techniques très efficaces de chromatographie en phase gazeuse associée à la spectrométrie de masse (ce qui permet à la fois séparation et analyse de la structure des molécules).

• Les gibbérellines sont affectées d’un nombre qui correspond à la chronologie de leur découverte (exception GA3, la première mise en évidence).

• Un même végétal ne contient au maximum que 8 à 10 formes différentes (nous verrons l’exemple du maïs).

• Ces différentes formes ont des activités différentes vis-à-vis des tests biologiques ou même peuvent être inactives. GA3, GA4, GA7, GA14 ont le plus grand spectre d’activité.

• Cette diversité de structures actives pose un problème au niveau de la finalité. S’agit-il de substances hormonales voisines mais plus particulièrement affectées à une fonction particulière ? ou d’intermédiaires dans la synthèse d’une seule forme active. L’exemple du maïs permet de conclure en retenant la 2ème hypothèse. Chez le maïs 8 gibbérellines ont été identifiées GA53, GA44, GA20, GA29, GA19, GA17, GA1, GA8. Chez cette espèce où de très nombreux mutants sont disponibles différents mutants nains ont été étudiés en particulier d1 et d5 (d pour dwarf) dont nous verrons les caractéristiques après la description de la voie de biosynthèse des gibbérellines.

Pour conclure à propos de cette diversité il faut noter que l’on retrouve cette pluralité de structures pour les hormones stéroïdes chez les vertébrés qui présentent par ailleurs des analogies de structure avec les gibbérellines. Sur un plan pratique des mélanges commerciaux de GA4 et GA7 sont produits à partir de cultures de Gibbérella fugikuroi.

III–D– c– Biosynthèse et Métabolisme des Gibberellines : Alors que les gibbérellines ont une structure assez complexe on a une bonne idée de leurs voies de synthèse. Travaux initiaux de WEST (1965-1970) aux USA. Les gibbérellines appartiennent au groupe des terpénoïdes composés résultant de la condensation d’unités isoprène elles-mêmes provenant d’unités acétate. Acétate isoprène terpènes (mono –sesqui – diterpènes) Appartiennent à ce groupe une autre hormone végétale l’acide abcissique et des constituants végétaux importants comme les stérols végétaux, les caroténoïdes, le caoutchouc polymère de milliers d’unités isoprènes.

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Sur un premier schéma où est représenté une voie de biosynthèse simplifiée des gibbérellines vous pouvez voir : l’origine métabolique de différents terpènes, le niveau d’intervention de certaines substances (régulateurs de croissance) comme l’AMO16-18 ou le CCC qui sont des antigibbérellines car elles bloquent la synthèse des gibbérellines (ce sont des retardants de croissance). Sur un deuxième schéma plus complet on peut voir que la voie de biosynthèse des gibbérellines se déroule à 3 niveaux à localisation subcellulaire distincte : chloroplaste, réticulum endoplasmique, cytoplasme. Toutes les enzymes de la voie de synthèse ont été caractérisées ainsi que la plupart des gènes correspondants. Certaine de ces enzymes sont multifonctionnelles (elles catalysent plusieurs réactions séquentielles sur la chaîne) et certaines sont codées par de petites familles multigéniques dont les membres sont régulés indépendamment par des facteurs endogènes ou exogènes (stade de développement, lumière, hormones…). Voir figure. La copalyl phosphate synthase est très fortement exprimée dans les tissus en croissance. La kaurène synthase est la première étape spécifique de la synthèse des gibbérellines il s’agit vraisemblablement d’une enzyme régulatrice. Des cytochromes monooxygénases transforment le kaurene en GA 12 aldéhyde. Des GA 20 oxydases transforment GA12 en GA 20. Finalement 2 classes d’hydroxylases sont importantes : Les 3ßhydroxylases conversion de GA 20 en GA 1 ou de GA 9 en GA4 les formes actives. les 2ßhydroxylases qui transforment GA1 en GA8 en l’inactivant en participant ainsi à l’homéostasie du pool de gibbérellines actives en limitant l’accumulation excessive de GA1. Plusieurs commentaires sont à faire à propos de cette voie de synthèse

- L’accumulation de gibbérellines entraîne par un phénomène de feedback la répression des gènes de GA20 oxydases et 3ßhydroxylases.

- Diverses expériences de génie génétique ont montré le rôle in vivo de ces gènes et enzymes ex : la surexpression de la 2ßhydroxylases entraîne le nanisme des plantes par inactivation des gibbérellines. Un mutant de pois muté sur cet enzyme conduit au contraire à un phénotype de réponse « exagérée » aux gibbérellines. La multiplicité des gibbérellines une ou plusieurs formes actives ? Si l’on revient maintenant aux mutants nains de maïs d1 et d5 on a pu montrer que le mutant d5 voyait sa croissance rétablie par addition de Kaurène : le gène muté est celui de la Kaurène synthase. En revanche pour le mutant d1 seul l’apport de GA1 permet la reprise de croissance toutes les autres gibbérellines en particulier GA20 sont inefficaces. Ces résultats permettent donc de conclure, qu’au moins chez le maïs, une seule gibbérelline GA1 est active et que toutes les autres gibbérellines sont des précurseurs ou des formes d’inactivation/ dégradation. Le gène muté correspond dans ce dernier cas à l’enzyme de conversion de GA20 en GA1.

- Les gibbérellines existent également sous forme liées avec des oses (glucosides inactifs) dont le rôle physiologique est peu clair. Rôle dans le transport, réversibilité de la liaison ?

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III–D- d- Les Gibberellines dans la plante – Répartition- Transport : Les gibbérellines sont présentes chez toutes les plantes supérieures, elles sont synthétisées également par certains champignons. Comme nous l’avons dit on ne retrouve que quelques gibbérellines chez une espèce donnée, et les gibbérellines détectées varient selon le stade de développement. On pense que les sites de synthèse sont les organes contenant les concentrations les plus élevées en gibbérellines, apex des tiges et des racines, jeunes feuilles, mais aussi embryon et tissu de réserve des graines en développement, fruits… Les concentrations habituelles sont de 0,1 à 100 ng / g de tissu frais mais de 1 à 10 µg au niveau des graines. Les gibbérellines ne présentent pas de transport polarisé à la différence de l’auxine. Appliquées à un niveau quelconque de la plante, elles peuvent avoir des effets régulateurs sur toutes les autres parties. Elles ont été retrouvées dans la sève brute et la sève élaborée et leur vitesse de transport (5 cm/h) analogue à celle des sucres laisse supposer qu’elles sont transportées passivement dans les flux de sève dans le xylème et le phloème. Un transport de cellules à cellules de type symplastique est également probable, on constate en effet une réduction du transport par des inhibiteurs métaboliques de type azide.

III–D– e–Effets Physiologiques : Au niveau cellulaire comme les auxines, les gibbérellines ont à la fois une action sur la division, l’élongation et la différenciation. Parmi les effets observables on peut citer : - L’action sur la croissance des tiges (au niveau des racines et feuilles on observe de très

faibles réponses) – Cette action est particulièrement spectaculaire sur des :

1) Mutants nains qui dans la majorité des cas ont perdu la faculté de synthétiser des gibbérellines, par blocage génétique. Les retardants de croissance peuvent déterminer également un nanisme chez des espèces comme Chrysanthemum et leur effet est levé par apport de gibbérellines exogènes.

2) Espèces en rosette bisanuelles – choux, laitue dont les entre-nœuds sont très courts pendant la 1ère année de végétation et les feuilles sont accolées les unes aux autres. Dans la nature, chez ces espèces les tiges s’allongent la deuxième année. Un traitement par les gibbérellines (0,1 mg / semaine) peut conduire rapidement à des croissances spectaculaires (3 m de haut). Cependant, les gibbérellines ont un effet sur la croissance de nombreuses plantes normales et intactes comme la Tomate (qui ne posséderaient donc pas des concentrations optimales pour leur croissance). Le plus souvent on assiste à un accroissement des entre-nœuds existant par des phénomènes d’élongation essentiellement).

Croissance des fruits Effet commun avec les auxines, mais les gibbérellines agissent sur des espèces pour lesquelles l’auxine n’a pas d’action (Rosacées, Pêcher, Pommier, Raisins). La parthénocarpie peut être obtenue avec des gibbérellines. Levée de dormance

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L’application de gibbérellines à des bourgeons dormants permet la levée de dormance et leur débourrement. Même effet sur la levée de dormance des graines. Initiation de la floraison Pour des espèces ayant des exigences photopériodiques ou de vernalisation pour fleurir, la transformation d’un méristème végétatif en méristème floral peut être obtenue dans de nombreux cas par application de gibbérellines. Sans que l’on sache si ces hormones sont directement impliquées dans le processus physiologique normal.

III–D– f- Mécanismes Moléculaires d’action des Gibbérellines : Nous l’avons vu les gibbérellines déterminent un nombre important de réponses mais leur mode d’action au niveau moléculaire a été, comme dans le cas de l’auxine, essentiellement étudié en détail vis-à-vis d’un seul phénomène : l’induction des enzymes d’hydrolyse de l’amidon dans les graines de céréales. Exposition du problème L’embryon des graines de céréales est entouré d’un tissu de réserve : l’albumen qui est lui-même entouré d’une fine couche de cellules riches en protéines (grains d’aleurone) appelée couche d’aleurone. Quand la germination débute, sous l’influence de l’humidité par exemple, les cellules de la couche d’aleurone libèrent des enzymes qui hydrolysent l’amidon, les protéines et le RNA de l’albumen, les produits solubles formés étant ensuite utilisés pour le développement de l’embryon. En 1958, YOMO au Japon et PALEG en Australie trouvèrent que des graines d’Orge privées de leur embryon et placées à l’humidité ne produisaient pas d’amylase. Si les grains et les embryons étaient placés en suspension dans une même fiole, les grains présentaient alors une activité amylasique comme des semences normales. YOMO montra de plus que des extraits purifiés d’embryon appliqués sur les graines déterminaient l’apparition de l’activité amylase. Ceci suggère, bien que l’embryon fournit normalement à la couche d’aleurone une substance qui lui permet de libérer l’α amylase. Il s’agit d’une hormone la gibbérelline qui a été isolée des grains d’Orge sous la forme GA3 et qui peut remplacer l’action de l’embryon. Les étapes suivantes ont permis de montrer que l’augmentation de l’activité α amylase provenait d’une synthèse de novo de l’enzyme (expériences de marquage en densité D₂O ou avec des acides aminés ¹⁸0 suivi d’une centrifugation à l’équilibre) et que cette synthèse provenait elle-même de la production de nouveaux ARN messagers spécifiques (expérience de Northern, inhibiteurs de la transcription). De nombreuses études ont ensuite porté sur la chaîne de transduction du message gibbérelline. Si diverses expériences démontrent la présence de récepteurs de GA sur le plasmalemme (action d’hormone non perméante, inefficacité de la micro–injection de GA) la nature moléculaire du récepteurs n’est pas connue.

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En revanche, de nombreux messagers secondaires et éléments de la chaîne de transduction ont été proposés dans le mécanisme d’action des gibbérellines avant la stimulation de la transcription : L’ion Ca⁺⁺ Le pH cytosolique La calmoduline Le GMP cyclique Ces différents paramètres augmentent séquentiellement lors du traitement de protoplastes de cellules d’aleurone par GA. Par exemple, GA3 accroît la teneur en calcium cytosolique via l’ouverture de canaux calciques, le retour à des concentrations « normales » de calcium serait du à des Ca⁺⁺ ATPases de la membrane plasmique et à un influx de calcium vers le RE. Des protéines G hétérotrimèriques sont également impliquées dans les premières étapes de la transduction : le MAS 7 qui stimule l’échange GDP/GTP stimule la production d’α amylase. Au niveau terminal de la chaîne de transcription il faut souligner dans le promoteur du gène d’α amylase l’existence d’un « Gibberellic acid responsive complex » GARC avec 3 régions essentielles dont une le GARE (gibberellic acid responsive element). Par ailleurs, un cDNA codant une protéine de 60 Kda (GAB1) avec un domaine en doigt de Zinc répété a été caractérisé ainsi qu’un gène GAMyb (facteur myb) stimulant la production d’α amylase en l’absence de GA. GA stimule, par ailleurs, la production de GAMyb. La réponse finale dépend d’un équilibre entre GAB1 inhibiteur de la transcription et GAMyb activateur. Enfin il faut souligner que l’α amylase est une glycoprotéine sécrétée à l’extérieur des cellules d’aleurone (pour qu’elle puisse migrer ensuite vers l’albumen). Des inhibiteurs de glycosylation bloquent donc cette sécrétion.

III–D– g– Modification des taux de Gibberellines chez les plantes par génie génétique :

Une amélioration de la productivité des céréales a reposé sur l’obtention de variétés semi-naines chez lesquelles l’utilisation de l’azote des amendements était plutôt utilisé pour la mise en place du grain que de la tige. De ce point de vue on peut rappeler que deux gènes dits de la « révolution verte » le gène de blé Rht et le gène de riz Sd1 sont impliqués dans la signalisation associé à GA et à sa biosynthèse respectivement. Par génie génétique plusieurs approches peuvent être envisagées pour réduire les taux de GA

1. réduire la biosynthèse 2. augmenter le catabolisme

1. Par exemple des constructions anti-sens du gène de GA 20 oxydase

réduisent les taux de gibberellines chez Arabidopsis 2. Surproduction de GA2 oxydase une enzyme du catabolisme de GA. Un

groupe Japonais (2003) vient d’obtenir des résultats intéressants selon cette approche en transformant une variété de riz par une construction associant le gène de GA2 oxydase au promoteur (la synthèse de GA chez le riz est dépendante des organes) d’un gène de biosynthèse de GA dans les tiges.

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Les plantes transformées ont un phénotype semi-nain mais une floraison et un développement du grain normal contrairement à des plantes où le gène était associé à un promoteur constitutif (actine).

III–E - LES CYTOKININES La troisième catégorie d’hormones que nous abordons aujourd’hui les cytokinines présentent comme les précédentes AIA, gibberellines des effets biologiques multiples mais l’effet initialement mis en évidence porte sur la division cellulaire, plus particulièrement sur la cytokinèse d’où le nom de cytokinines.

III–E– a- Historique et découverte :

La découverte des cytokinines a été associée à la recherche des exigences hormonales des cultures d’organes ou de tissus végétaux in vitro. Ces tissus ou organes isolés de la plante exigent en effet pour se développer des éléments divers dans le milieu et en particulier des hormones. 1941 Van Overbeek met en évidence les propriétés actives du lait de noix de coco* vis-à-vis de la croissance de jeunes embryons de Datura stramonium. Ce milieu est toujours utilisé en culture de tissus végétaux. * endosperme liquide de la noix de coco qui se solidifie par la suite et qui est très riche en acides nucléïques. 1954 Le groupe de SKOOG montre que la croissance in vitro des tissus de moelle de tabac ne peut se faire avec la seule présence d’auxine (faible croissance pas de division, seulement grandissement cellulaire). La recherche de substances actives conduit à mettre en évidence l’action positive

• Du lait de noix de coco • D’extrait de levure • De DNA autoclavé

1955 Miller obtient à partir de sperme de Hareng autoclavé (très riche en ac. nucléïques) une substance capable d’induire la division cellulaire des tissus de moelle de tabac à de très faibles concentrations 1 µg/litre. Cette substance a été identifiée il s’agit de la 6-furfurylaminopurine ou kinétine actuellement encore utilisé comme régulateur de croissance. D’autres substances synthétiques de nature voisine et des dérivés de l’adénine isolés des végétaux ont une action comparable. L’ensemble de ces substances est regroupé sous le terme de cytokinines : Adénines substituées ayant une action sur la croissance et la différenciation des tissus végétaux en culture « in vitro »

III–E– b- Nature chimique : A côté de la kinétine d’autres substances synthétiques à activités cytokinine existent dont la plus connue est la benzyladénine disponible commercialement très utilisée en culture « in vitro ».

Page 26: Les régulateurs de croissance

Des activités cytokinines ont été initialement caractérisées dans divers extraits végétaux : lait de noix de coco, extraits de divers fruits mais sans identification des structures actives. En 1964, 9 ans après la découverte des cytokinines LETHAM identifie dans les endospermes laiteux de maïs (Zea Mays) la 4-hydroxy-3méthyl-2butényl amino purine ou Zéatine. Depuis cette molécule a été caractérisée dans de nombreuses plantes ; elle est responsable de l’activité biologique du lait de noix de coco. Par la suite on a abouti à la caractérisation chez les végétaux de l’isopentenyladénine libre ou sous forme de riboside qui semble la plus largement répandue. Ces cytokinines naturelles sont plus efficaces que les cytokinines synthétiques. Relations structure activité : De nombreuses substitutions sont possibles au niveau du groupement NH2 de l’adénine tout en conservant l’activité.

Substitution sur les cycles : perte d’activité à l’exception de la substitution en 9 d’un hydrogène par un groupement ribose ou ribose phosphate.

III–E– c- Biosynthèse – Métabolisme :

La voie de Biosynthèse est très simple. Les cytokinines sont des adénines substituées, l’adénine est une base purique, constituant naturel des végétaux qui intervient dans la synthèse des acides nucléiques. Les cytokinines naturelles connues résultent de la substitution d’un hydrogène du NH2 (en 6) par une chaîne, à 5 atomes de carbone correspondant à une unité isoprène de type pyrophosphate d’isopentényle (Cf synthèse Gibb-ABA). Cette origine a été démontrée par des incorporations de mévalonate marquée dans les cytokinines. Une enzyme réalisant le couplage 5’AMP + pyrophosphate d’isopentenyle est l’isopentenyltransférase IPT (cytokinine synthase) cette enzyme n’accepte pas l’adénine ou l’adénosine comme substrats elle a été caractérisée initialement ainsi que son gène chez les microorganismes et c’est La caractérisation récente du gène chez les végétaux qui conclut définitivement le débat polémique relatif à la production des cytokinines non pas par la plante mais par la flore épiphyte qui la colonise. Les cytokinines existent et sont actives à la fois à l’état libre à l’état de nucléosides et de nucléotides. Curieusement on trouve des structures de type cytokinine dans les ARN de transfert (tRNA). Les t RNA après avoir fixé un ac. aminé vont le transférer et permettre son incorporation dans une chaîne polypeptidique en voie de formation au niveau des ribosomes. Chaque t RNA possède 2 régions de sa molécule particulièrement typiques

celle où se fixe l’ac. Aminé celle appelée anticodon (correspondant à une séquence de 3 nucléotides) qui lui

permet de s’apparier avec le codon correspondant du RNA messager et donc de contribuer à la traduction de cet ARN messager en introduisant au bon endroit le bon ac. aminé.

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Les ARN de transfert qui ont une structure secondaire en feuille de trèfle en raison de liaisons hydrogénes entre bases complémentaires comportent de nombreux nucléotides rares ou inhabituels : natures des bases méthylées, addition, substitution type de liaisons entre base et sucre et parmi ces nucléotides rares on trouve des structures de type cytokinine comme les adénines substituées.

Ces cytokinines occupent une position spécifique adjacente à l’anticodon se terminant par un A.

Cette présence des cytokinines dans les t RNA se retrouve donc chez les végétaux mais aussi chez les animaux et bactéries.

On a envisagé que les cytokinines proviendraient de la dégradation des t RNA végétaux mais les études réalisées sur le renouvellement (turn over) des t RNA végétaux semblent indiquer que celui-ci n’est pas suffisamment rapide pour maintenir une quantité de cytokinines compatible avec les exigences pour la croissance.

Par ailleurs c’est la forme isomèrique cis-zéatine qui est présente dans les t RNA alors que la forme trans-zéatine est la forme prédominante et la plus active dans les tissus, il existe cependant une cis-trans isomérase dans les tissus végétaux. Au final on pense que les cytokinines ont une double origine : synthèse via l’IPT et via la dégradation des t RNA. Les cytokinines lorsqu’elles sont apportées de façon exogène subissent 3 types de transformation.

Formation de nucléotides mono-di-triphosphates qui sont actifs au même titre que les cytokinines bases et qui pourraient même être les formes actives les plus générales.

Formation de glucosides O-cytokinines glucosylés sur la chaîne latérale – ces réactions sont réversibles et les glucosides constituent donc des formes de réserves inactives.

N-cytokinines glucosylés sur les N en 7, 9, 3 ; il s’agit dans ce cas d’une désactivation réversible (le glucose est dans ce cas lié à un atome d’azote du noyau purique).

Dégradation par élimination de la chaîne latérale et perte d’activité sous l’action d’une cytokinine oxidase. Cette enzyme maintiendrait l’homéostasie du taux de cytokinines (elle est ainsi inhibée par la diphénylurée qui mime, par effet indirect, les effets de l’apport de cytokinines exogènes). La réaction catalysée est du type : isopentenyladénosine adénosine.

III–E– d- Cytokinines dans la plante :

Il est classiquement admis que les cytokinines sont produites de façon préférentielle dans les racines, bien que les embryons, les jeunes fruits, les bourgeons aient aussi une autonomie de production.

Elles sont présentes dans les racines en grande quantité et sont synthétisées à partir de précurseurs radioactifs.

On retrouve des cytokinines dans les exsudats racinaires de certaines plantes (Maïs)

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Les feuilles sont dépendantes des racines pour la production de cytokinine

Exemple : Phaseolus vulgaris lorsque l’on sectionne une tige feuillée et si on la maintient en survie dans l’eau le taux de cytokinines diminue mais recommence à augmenter lors de la formation de racines adventives.

Les cytokinines seraient transportées dans le xylème. Appliquées de façon exogène au niveau des feuilles elles migrent peu.

Division cellulaire : Un des effets des cytokinines est de permettre la cytokinèse c'est-à-dire la formation d’une paroi transversale assurant la séparation de deux cellules filles. C’est en raison de cette action spécifique sur cette phase de la division cellulaire que le nom de cytokinine a été donné à ces hormones. Il faut également remarquer que dans les conditions des essais biologiques les cytokinines seules sont sans action sur la division cellulaire mais qu’elles ne peuvent agir qu’en présence d’auxine. Ceci est un exemple de complémentarité d’action entre deux substances de croissance = synergie qui doit vraisemblablement se retrouver dans de nombreux cas. Si l’on considère l’intervention des cytokinines dans les conditions naturelles on peut faire référence aux tissus tumoraux pour lesquels on a montré une nette activation de la synthèse des cytokinines et on peut penser que dans les zones méristématiques des tissus normaux ces systèmes de synthèse sont particulièrement actifs.

Différenciation Les cytokinines permettent la différenciation de bourgeons sur des tissus en culture leur action est contrebalancée par celle des auxines qui favorisent la production de racines, la différenciation du tissu dépendant en fait de l’équilibre . auxine

cytokinines

Levée de dormance : les semences de diverses graines Tabac, Laitue, voient leur germination stimulée par les cytokinines. Cet effet peut avoir des répercussions écologiques. Aux USA les graines d’une plante parasite des cultures Striga asiatica ne germent qu’au contact des sécrétions racinaires de la plante-hôte Maïs. Au-delà de cette observation il est possible que les cytokinines aient un rôle plus général dans la germination des semences dans les conditions naturelles.

Effet sur la mobilisation des métabolites MOTHES (1961) a découvert que des applications localisées de cytokinines à des feuilles entraînait une mobilisation de métabolites apportés de façon exogène des zones de dépôt vers la zone traitée ou une rétention de métabolites au niveau du traitement (sels minéraux – acides aminés).

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Cet effet actuellement inexpliqué peut être en partie à l’origine des deux autres manifestations de l’action des cytokinines que nous développerons plus tard

• L’action sur la dominance apicale • L’action anti-sénescence

Les cytokinines produites par les bactéries : différentes bactéries pathogènes ou colonisatrices des plantes produisent des cytokinines ce qui entraîne au niveau des végétaux des phénomènes tumoraux par multiplications cellulaires anarchiques. Agrobacterium tumefaciens avec transfert du gène IPT à la plante Pseudomonas savastanoi sans transfert de gène mais excrétion de cytokinines

Rodococcus fascians producteur de cytokinines produit un phénotype particulier que nous verrons à propos de la levée de dominance apicale : les balais de sorcière.

On ne connaît pas de mutants affectés dans la synthèse des cytokinines ni d’inhibiteurs de la synthèse des cytokinines. Cependant la transformation génétique des plantes par différents génotypes d’Agrobacterium tumefaciens a apporté des conclusions intéressantes. En culture de tissus les tissus tumoraux résultant de l’action de cette bactérie se révèlent autotrophes par rapport aux hormones suggérant que le transfert de TDNA entraîne une surproduction d’hormones (ils n’ont pas besoin d’apport d’hormones exogènes contrairement aux tissus normaux). Trois gènes ont été ainsi identifiés dans le TDNA. Deux impliqués dans la production d’AIA. Le gène 1 code une enzyme de formation d’indole acétamide. Le gène 2 code une enzyme hydrolysant l’indole acétamide en tryptophane. Le 3ème gène correspond à l’IPT enzyme de synthèse des cytokinines. Des expériences de mutagenèse par insertion de transposons (transposon TN) chez agrobacterium tumefaciens ont conduit à des souches affectées dans certains de ces gènes. La transformation des plantes par ces souches modifiées a conduit à des phénotypes tumoraux spécifiques qui on conduit à associer le locus affecté à l’allure de la tumeur. tms pour tumour shooty tmr pour tumour rooty Les mesures de teneurs en hormones de ces tissus tumoraux ont montré une réduction des quantités en auxine chez tms, une réduction des quantités en cytokinines chez tmr. Les locus ont été ensuite associés à des gènes codant des enzymes de synthèses de ces hormones mais ces expériences ont surtout montré l’impact des balances hormonales sur la différenciation. La corrélation observée confirme les résultats décrits à l’origine pas Skoog et Miller pour les tissus de tabac en culture. Formation de tiges favorisée par un rapport élevé

racines favorisée par un rapport faible

cytokininesauxine

cytokininesAIA
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III–E– e- La perception et la transduction du signal cytokinine :

Un des systèmes les plus conservés pour la transduction des signaux extracellulaires est la voie des protéines G liant le GTP. Ce sont les protéines G qui en changeant de conformation lors de l’échange GDP-GTP se lient à des protéines effecteurs et les activent (enzymes, canaux ioniques). De nombreuses évidences démontrent l’existence de ce système chez les plantes.

♦ ♦

Systèmes affines pour ³²P GTP Systèmes réagissant aux anticorps contre les unités G α, G β mais pas G γ

Il est vraisemblable que le système des G protéines existe donc chez les plantes. Ces observations suggèrent que des récepteurs membranaires à 7 domaines transmembranaires (qui sont couplés aux protéines G) existent donc également chez les plantes. Ces récepteurs sont très nombreux 1 % du génome chez les animaux et sont capables de reconnaître des messages aux structures aussi variées que les photons, les ions, des effecteurs chimiques… En 1998 le groupe de Hooley à Bristol en exploitant les homologies de séquence aux niveaux des EST de Arabidopsis, riz, pin a pu trouver des séquences présentant des homologies avec les 7 TM receptors. A partir de ces informations on est arrivé au clonage d’un gène chez Arabidopsis : GCR1 qui est exprimé à un faible niveau dans différents organes de la plante. La transformation de plantes avec des constructions antisens (promoteur 35 S) conduit à des transformants à phénotype modifié analogue à celui de plantes manquant de cytokinines ou à celui d’un mutant CVR1 insensible aux cytokinines. Par ailleurs, le transformant est moins sensible à l’apport exogène de benzyladénine.

Arguments en faveur d’un système à double composante dans la perception / transduction du signal cytokinine

Ces systèmes comprennent comme cela a été mentionné précédemment :

une partie récepteur une partie transmetteur (histidine kinase) une partie régulateur de réponse Une approche par Activation TDNA Tagging a consisté à transformer un grand nombre de plantes (50 000 cals d’A. thaliana) par une construction comprenant un tétramère du domaine enhancer du promoteur 35S. L’insertion au hasard de cette séquence dans un promoteur quelconque va amplifier la transcription du gène correspondant et permettre également de localiser le promoteur interrompu (par hybridation). Le crible de sélection a porté sur la recherche de plantes présentant un phénotype comparable à celui résultant d’un apport de cytokinines (prolifération de tiges, verdissement accéléré, inhibition de la formation de racines…).

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Le gène CKI1 a été caractérisé, il code pour un système à deux composantes et sa surexpression donne un phénotype correspondant à l’apport de cytokinines exogènes (pas encore de liaison entre la protéine et les cytokinines démontrée). Enfin un screening de mutants par rapport à la perte de sensibilité aux cytokinines en cultures de tissu a conduit à isoler le mutant Cre1-1 cytokinine . Le mutant ne répond pas à l’apport exogène de kinétine, zéatine, IPA. Le gène correspond à une histidine kinase et la mutation correspond au changement d’une Glycine 467 par Asparagine 467. Cependant le mutant ne présente pas d’anomalie au niveau du système aérien sur la plante entière mais seulement des altérations du système vasculaire des racines suggérant le fonctionnement majoritaire de CRE 1 dans les racines, d’où l’idée de récepteurs tissus spécifiques.

III–E– f- Ingénierie de la production des cytokinines : Deux démarches ont été envisagées à des fins soit fondamentales ou appliquées. La surexpression du gène IPT. Ce gène a été associé à différents promoteurs.

- un promoteur constitutif fort comme le 35 S entraîne une surproduction de cytokinines avec les symptômes associés classiques :

perte de dominance apicale réduction du système racinaire augmentation du nombre de chloroplastes.

Cependant la plante a un développement général perturbé par excès de cytokinines. Le gène IPT a donc été associé à des promoteurs inductibles ou exprimés de façon spécifique dans le temps.

gène de protéine de heat shock induit par un élévation de T° gène exprimé lors de la sénescence

Dans ces conditions la surproduction de cytokinines modérée ou limitée dans le temps se traduit par des effet positifs, antisénescence en particulier. La deuxième approche consiste à inhiber par une stratégie antisens ou RNAi le gène de cytokinines oxydase. Cette approche potentiellement intéressante a été encore peu utilisée. III–F - L’ETHYLENE

III–F– a- Découverte du rôle hormonal :

La démarche qui a conduit à la découverte du rôle hormonal de l’éthylène est tout à fait différente de celle que nous avons évoquée pour les autres hormones.

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En effet, l’action de l’éthylène exogène est connue depuis longtemps sur les végétaux et ce n’est qu’à la suite de la démonstration de la présence naturelle de l’éthylène chez les plantes que l’on a conclu à son action hormonale. Dès 1886 une jeune Botaniste russe NELJUBOW observait l’effet du gaz d’éclairage sur la morphologie de plantules de pois : raccourcissement et épaississement des tiges, perte du géotropisme négatif : ensemble de réponses regroupées sous le terme de triple réponse. Parmi les différents effets de l’éthylène ce sont cependant les observations relatives à la maturation des fruits qui ont été décisives dans la découverte de son rôle hormonal.

1924 : DENNY : l’éthylène permet le jaunissement et la maturation des citrons 1937 : GANE : montre que les émanations gazeuses de pommes

mûres initient la maturation des fruits verts et que l’éthylène constituait le gaz actif (première démonstration de la production d’éthylène par un végétal). A partir de ce moment on attribue un rôle à l’éthylène dans la maturation des fruits et l’on montre que de nombreux fruits émettent de l’éthylène.

1955-1960 : le développement de chromatographie en phase gazeuse fit

franchir une nouvelle étape car cette méthode très sensible et particulièrement adaptée à la détection de ce gaz permet de montrer que l’éthylène était présente dans toute les parties de la plante.

Parallèlement on démontrait au-delà de la maturation les actions diverses de l’éthylène sur le développement des végétaux et en 1969 ce composé était finalement rangé parmi les hormones végétales.

Produite par les végétaux, active à faible dose et à distance du lieu de

synthèse l’éthylène répond tout à fait à la définition d’une hormone. Elle représente cependant des caractéristiques particulières au niveau du transport : on observe en effet une diffusion gazeuse à l’intérieur de la plante mais aussi à l’extérieur d’où la possibilité d’action sur d’autres individus. Cette propriété suggère une analogie avec les phéromones animales. Son caractère gazeux la fait, par ailleurs, comparer à un autre gaz l’oxyde nitrique (NO) molécule gazeuse impliquée dans la signalisation chez les animaux (les végétaux produisent aussi de l’oxyde nitrique).

III–F– b– Production par la plante : En raison de la sensibilité et de la spécificité de l’analyse chromatographique en phase gazeuse on ne retient pratiquement pas de test biologique pour estimer les quantités d’éthylène dans la plante (sensibilité 10¹² mole - 10⁶ µl). Les fruits, les fleurs et différents organes de la plante produisent de l’éthylène. On distingue généralement :

La teneur interne (TI) L’émission dans l’atmosphère (EAth)

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Exemple pour la Poire Williams : TI= 80 µl/g

EAth = 200 µl/g/24h Aux USA, ABELES a estimé que la production d’éthylène par les plantes était de 2.10⁴ tonnes par an. Cette production peut être comparée à celle provenant des véhicules et des industries 15.10⁶ tonnes par an. Ces concentrations pourraient être toxiques pour les plantes mais l’éthylène est soit transformé par oxydation par l’ozone par réaction avec les oxydes d’azote à la lumière ou utilisée par les microorganismes du sol.

Il est à noter :

1) Que la production d’éthylène est très sensible aux facteurs de l’environnement : lumière, température, différents types de « stress » (blessures, radiations, sécheresse, attaques par les microorganismes, etc…). Dans le cas de ces agressions cette synthèse accrue d’éthylène s’accompagne de la formation de composés phénoliques, les enzymes de synthèse PAL ou d’oxydation (peroxydase) de ces composés étant nettement activées. L’éthylène déclenche ainsi des réactions de la plante qui peuvent être assimilées à des sortes de réactions de défense de la plante (cicatrisation, protection…) d’où l’appellation d’Hormone de Stress.

2) Que la production d’éthylène est stimulée par les auxines (naturelles ou synthétiques). Les travaux d’ ABELES et de BURG (1968-1972) ont montré que de nombreuses réponses obtenues chez les plantes lors de l’application d’auxine pouvaient être reproduites par l’exposition des plantes à l’éthylène. Ainsi de nombreuses réponses attribuées à l’auxine aux fortes concentrations se produiraient par l’intermédiaire de l’éthylène (inhibition de l’élongation). Cette interaction pourrait fournir un contrôle naturel lors de la production excessive d’auxine.

III–F– c– Voies de biosynthèse et régulation de la synthèse :

Depuis longtemps il avait été démontré que la méthionine (ac. aminé) était un précurseur de l’éthylène. En effet, si on apporte de la méthionine marquée à des tranches de pommes ou de bananes on observe une incorporation de la radioactivité dans l’éthylène. L’éthylène dériverait des carbones 3 et 4. Les étapes intermédiaires ont été ensuite caractérisées selon la séquence : Méthionine S-adenosyl méthionine Acide cyclopropane carboxylique (ACC) Ethylène L’enzyme de synthèse de S-adenosyl méthionine la SAM synthase n’est pas spécifiquement impliquées dans la synthèse de l’éthylène car son produit est majoritairement utilisé comme donneur de méthyle dans d’autres synthèses : lignines, polyamines… Les autres enzymes plus en aval ont un rôle plus spécifique. L’enzyme de synthèse de l’ACC semble jouer un rôle régulateur important dans la production de l’éthylène. C’est une ACC synthase enzyme comportant un groupement prosthétique pyridoxal – phosphate dont l’activité est bloquée par des inhibiteurs, des enzymes à pyridoxal-P.

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L’ACC synthase a été purifiée et clonée. C’est un exemple d’une famille multigénique dont chaque membre est différemment exprimé en réponse à des facteurs du développement, de l’environnement ou des facteurs hormonaux. Avec des sondes spécifiques une expression différentielle des différents gènes a été évaluée par exemple : Une forme augmente lors de la maturation Une autre forme augmente en réponse à des blessures Une dernière forme augmente en réponse à l’auxine L’ACC oxydase qui transforme l’ACC en éthylène est une dioxygénase qui demande du fer et de l’ascorbate et fonctionne en présence d’O2. Elle correspond également à une famille multigénique et subit également une augmentation de son activité lors du stress. Plusieurs observations tendent à montrer que la stimulation de la production d’éthylène à la suite du stress procède d’une néosynthèse d’ACCsynthase qui jouerait un rôle limitant dans la production d’éthylène. En effet, le système de conversion de l’ACC en éthylène apparaît constitutif dans la plupart des tissus car l’apport d’ACC à une large variété de plantes ou de tissus détermine un accroissement très important de production d’éthylène. L’auxine, le « wounding », le « flooding » stimulent la synthèse d’ACC synthase et la

production d’ACC et d’éthylène. Certains mutants de tomate « rin » sont incapables de mûrir en raison d’un défaut dans la

production d’éthylène. L’apport d’ACC maturation. La mutation concerne le gène de l’ACC-synthase l’effet négatif de l’apport de différents précurseurs de l’ACC.

L’épinastie constatée au niveau des feuilles lors de la croissance sur sols inondés est due au transport vers les parties aériennes d’ACC non transformé au niveau des racines en raison de l’absence d’O2. Enfin l’ACC peut être transformé en une forme conjuguée de manière irréversible : le malonyl ACC. Il a été proposé de façon « humoristique » que la quantité de malonyl ACC retrouvée chez une plante soit un indicateur des situations de stress vécues par la plante. Au-delà des voies de biosynthèse naturelle un certains nombre de composés chimiques exogènes sont utilisés comme précurseurs d’éthylène il s’agit de l’ethephon ou de l’ethrel. La dégradation de l’éthylène essentiellement à l’extérieur de la plante implique une conversion en oxyde d’éthylène ou en éthylène glycol.

III–F – d– Effets physiologiques : L’éthylène peut être considéré comme une hormone mixte avec des effets positifs : initiation de la floraison, et des effets négatifs sur le développement : inhibition de la croissance, abscission, sénescence. Elle exerce une influence sur toutes les phases du développement de la germination à la sénescence souvent en interaction avec d’autres hormones.

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Maturation des fruits : Le phénomène de maturation englobe des changements biochimiques profonds qui conduisent à des modifications de texture, du goût, de la couleur du fruit et le rendent apte à la consommation. Sans entrer dans le détail de ces modifications il faut signaler qu’elles sont précédées chez de nombreux fruits par un accroissement très net de l’intensité respiratoires que l’on appelle crise climactérique, la période antérieure ou phase pré climactérique étant une période d’activité métabolique ralentie (voir figure). Changements biochimiques lors de la maturation : Hydrolyse des composés pectiques pectine soluble Hydrolyse de l’amidon sucres Disparition des acides organiques oses Disparition des substances astringentes (tannins)

1. on a pu montrer que l’apport de l’éthylène déclenche la crise climactérique et les phénomènes de maturation qui s’en suivent.

2. des mesures de la production d’éthylène dans le fruit révèlent que la quantité de gaz s’accroît avec la crise climactérique.

3. enfin l’utilisation d’inhibiteur de la production d’éthylène « la rhizobitoxine » retarde la maturation des pommes.

Selon les fruits on constate que la production d’éthylène est parallèle à la montée de la crise climactérique ou la précède en revenant à sa valeur initiale lors de la montée (Banane). On considère donc que l’éthylène est l’hormone de maturation naturelle des fruits. Le contrôle de la production éthylène a des applications commerciales dans le contrôle de la maturation des fruits. La maturation des fruits peut être considérée comme une étape précoce de la sénescence qui est définie par rapport à des critères de consommation. L’éthylène de façon plus générale, induit la sénescence chez d’autres organes comme les fleurs ou les feuilles.

III–F – e– Mécanismes d’action de l’éthylène : L’éthylène est sans doute l’hormone végétale dont les mécanismes moléculaires d’action (perception, transduction du signal…) sont les mieux connus. Ces résultats sont liés à une exploitation extensive de mutants d’Arabidopsis thaliana insensibles à l’éthylène au niveau de la réponse physiologique classique de la triple réponse. Le mutant ETR1 (éthylène résistant) a permis l’isolement du récepteur d’éthylène. Ce gène isolé par clonage positionnel code une protéine qui comporte des homologies avec les systèmes régulateurs bactériens à deux composantes :

Domaine senseur

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Domaine histidine kinase (transmetteur) Domaine receveur (régulateur de réponse).

La protéine récepteur existe sous forme de dimères les 2 sous unités étant liée par 1 pont disulfure. La protéine recombinante est capable de fixer l’éthylène au niveau de sa région N terminale hydrophobe. La cystéine 65 est impliquée dans cette fixation. D’autres mutants de sensibilité ont été caractérisés tels que CTR1, EIN2, EIN3, ETR2, EIN4, ERS. Certains des gènes correspondants (ETR2, EIN4) correspondent peut être à une redondance des récepteurs, d’autres codent pour des intermédiaires de la chaîne de transduction. CTR1 code pour une protéine répresseur, car la mutation entraîne une triple réponse constitutive. La liaison du récepteur ayant fixé l’éthylène avec CTR1 désactive ce dernier. L’ordre d’intervention de ces différentes protéines le long de la cascade perception transduction a commencé à être identifié : ETR1 CTR1 EIN2 EIN3 ERF1 Réponses Le domaine cytoplasmique de ETR1 interagit avec le domaine régulateur de CTR1(protéine kinase de type RAF). EIN2 protéine membranaire, EIN3 et ERF1 (Ethylene response factor) qui sont pour les deux derniers des protéines nucléaires à rôle de facteur de transcription se situent plus en aval. ERF1 est rapidement induit en réponse à l’éthylène et déclenche un ensemble de réponses physiologiques quand il est exprimé ectopiquement. L’intervention de ces gènes sur une même voie de transduction a été ordonnée par des tests génétiques d’épistasie qui permettent par croisement de 2 mutants suivie d’une autofécondation de déterminer par analyse du phénotype le gène qui agit avant l’autre sur la chaîne (le gène qui agit en 1er donne le phénotype).

III–F– f– Applications biotechnologiques : Le métabolisme de l’éthylène a fait l’objet de manipulations génétiques en vue de contrôler la maturation. De nombreuses pertes de fruits résultent en effet de phénomènes de maturation / sénescence non contrôlés après la récolte.

Les interventions ont porté sur la sous-expression des gènes d’ACC synthase ou d’ACC oxydase ou sur la surexpression d’un gène bactérien d’ACC désaminase du genre Pseudomonas qui réalise la conversion (ACC acétobutyrate)

Par ces différentes stratégies on a pu obtenir des plantes à maturation différée (tomate, melon…). La maturation peut être déclenchée par apport d’éthylène (comme c’est le cas industriellement pour la banane récoltée verte).

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Une amélioration du procédé consiste en l’utilisation de promoteurs spécifiques associés à ces gènes.

Fruit spécifique pour éviter des effets pléiotropiques Ou inductibles par des conditions particulières

Lumière inductible et transfert à l’obscurité par exemple pour initier la maturation.

III–G – L’ACIDE ABCISSIQUE

Des inhibiteurs de croissance ont depuis longtemps été caractérisés chez les plantes il s’agit souvent de composés phénoliques sécrétés ou excrétés souvent actifs après leur oxydation. Ces composés sont impliqués dans les phénomènes d’allélopathie c'est-à-dire l’inhibition de croissance d’une plante par une autre plante à proximité. Au-delà de ces phénomènes une substance à effet inhibiteur de la croissance qui a une répartition générale et une fonction hormonale est l’acide abcissique.

III–G– a– Historique – Découverte : La découverte de l’acide abcissique est intéressante car elle a été réalisée simultanément par des chercheurs travaillant dans des laboratoires différents sur des problèmes physiologiques distincts. Dans les années 1960, WAREING et ses collaborateurs au Pays de Galles recherchaient la cause de l’arrêt de la croissance des arbres en automne et le facteur qui provoque la formation des bourgeons dormants. Ils obtinrent à partir des feuilles d’Acer pseudoplatanus un extrait acide qui était un puissant inhibiteur de la croissance et qui appliqué aux apex des tiges feuillées était capable d’induire la formation de bourgeons dormants. Ils appelèrent la substance active encore inconnue : la dormine. ADDICOT et ses collaborateurs à l’Université de Californie DAVIS s’intéressaient au problème de l’abcission des feuilles et obtinrent à partir du cotonnier deux substances abcissine I et abcissine II capables d’accélérer l’abcission des feuilles de jeunes plants de coton. Parallèlement était caractérisé un inhibiteur de croissance du Lupin par WAIN en Angleterre. L’isolement de la dormine par CORNFORTH et al. (1966) permet sa caractérisation chimique et fut suivie par des travaux qui montrèrent que dormine inhibiteur de croissance du Lupin et abcissine II étaient en fait la même substance qui fut définitivement appelée acide abcissique en 1967 (ABA).

III–G– b– Nature chimique –Biosynthèse :

L’ABA est un sesquiterpène, molécule en C₁₅ résultant de l’association de 3 molécules d’isoprène. L’ABA présente 2 types d’isomérie lié d’une part à la présence d’un carbone assymétrique (le composé naturel est dextrogyre, le produit commercial est un racémique mélange des 2 isomères optiques) et d’autre part à l’existence d’une double liaison sur la chaîne latérale isomérie cis-trans.

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Le cis ABA est le seul actif dans le cas de l’action de l’ABA sur la fermeture des stomates. Deux voies de biosynthèse ont été successivement proposées pour l’ABA, la première dite voie en C₁₅ correspondrait à la condensation de 3 molécules d’isopentenyl pyrophosphate selon un mécanisme analogue à celui de la synthèse des gibberellines. La 2ème voie dite en C₄₀ a été caractérisée plus récemment elle correspond à une coupure de caroténoïdes en C₄₀ du type zeaxanthine selon la séquence : Zéaxanthine Violaxanthine Xanthoxine ABA aldéhyde ABA (C₄₀) (C₄₀) (C₁₅) (C₁₅) (C₁₅) Divers mutants ont permis de caractériser cette voie de synthèse à travers des études qui sont de bons exemples de combinatoire d’approches génétiques, moléculaires et biochimiques. Des mutants de tabac déficients en ABA (mutants ABA₂) sont altérés au niveau de la zéaxanthine époxydase (cette enzyme possède en fait 2 activités conversion de la zéaxanthine en antheraxanthine puis en violaxanthine). La zéaxanthine qui est non détectable chez la plante sauvage est bien représentée chez le mutant alors que la violaxanthine présente chez la plante sauvage n’est pas caractérisable. D’autres mutants chez la tomate comme flacca (phénotype à flétrissement permanent) sont affectés dans des étapes terminales comme la conversion de ABA aldéhyde en ABA. Différents mutants dits vivipares chez le maïs (les graines germent sur le pied mère par défaut d’ABA) sont bloqués à différents niveaux de la chaîne de synthèse du ß-carotène (Vp1, Vp2, Vp5, Vp9, Vp7) Vp7 par exemple est bloqué au niveau de la conversion lycopène en carotène. Au total il est maintenant admis que la voie en C₁₅ n’est pas opérationnelle chez les plantes mais chez certains champignons, la totalité de l’ABA venant de la voie en C₄₀ chez les organismes chlorophylliens où la synthèse de l’ABA a d’ailleurs lieu dans les chloroplastes riches en caroténoïdes (la zéaxanthine epoxydase correspond à un cDNA présentant une séquence d’adressage vers le chloroplaste). Le catabolisme de l’ABA procède via une hydroxylation pour donner le 8 hydroxy ABA ensuite converti en acide phaséïque, l’ABA 8 hydroxylase est une monooxygénase à phytochrome P₄₅₀. Cette dégradation intervient, par exemple lors du retour à un état hydrique normal après une période de sécheresse pour réduire le taux d’ABA. L’ABA peut également être converti en formes conjuguées inactives :

ABA glucosyl ester sur le COOH ABA glucoside sur l’OH du carbone assymètrique.

Au cours de la période hivernale on assiste chez certaines espèces à une interconversion entre formes libres et formes conjuguées.

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III–G– c– Effets physiologiques et mécanismes d’action : Action sur la fermeture des stomates : il s’agit d’un phénomène très important au plan physiologique puisqu’il permet de contrôler les pertes d’eau de la plante et de maintenir l’homéohydrie. C’est un exemple de réponse rapide à une hormone de l’ordre de quelques minutes (lors de l’apport d’ABA exogène). Harris et coll (1990) en utilisant un radio immuno essai (extrêmement sensible) pour l’ABA ont été capables de quantifier l’ABA dans une seule cellule de garde. A la suite d’un stress hydrique on observe un accroissement du taux d’ABA par un facteur 20. La production d’ABA se ferait en 1er au niveau des racines stressées qui perçoivent le stress et l’ABA serait transporté vers les apex. Le mécanisme d’action de l’ABA sur la fermeture des stomates a été étudié via des mesures électrophysiologiques au niveau de canaux ioniques. On a montré que l’ABA active un canal calcique du plasmalemme ce qui entraîne un accroissement en calcium cytoplasmique qui secondairement induit l’ouverture d’un canal potassique sortant, de canaux anioniques et la fermeture canal K⁺ entrant. Le résultat global est une fuite de K⁺ et la fermeture des stomates. Le mécanisme fin est plus complexe faisant intervenir des phénomènes de phosphorylation / déphosphorylation. Certains mutants insensibles à l’ABA et présentant une tendance au flétrissement ont permis l’isolement d’un gène muté qui est une phosphatase. De plus différentes études pharmacologiques à l’aide d’inhibiteurs de Kinases ou de phosphatases ont montré l’importance d’étapes de phosphorylation et de déphosphorylation dans la régulation de l’activité des canaux ioniques impliqués dans la fermeture des stomates. A l’inverse des autres cellules végétales, les cellules de garde ne comportent pas de plasmalemmes et sont donc isolées de leurs voisines. Il s’agit d’un système clos adapté aux techniques électrophysiologiques et aux micro-injections. Une approche originale ayant confirmé l’intervention de l’ABA dans la fermeture des stomates repose sur l’expression ectopique, obtenue par transgénèse, d’anticorps contre l’acide abcissique, ARTSAENKO et al, 1995. Un anticorps monoclonal présentant une forte spécificité et affinité pour l’ABA a été caractérisé et le cDNA correspondant cloné puis introduit dans une construction avec un promoteur fort pour la transformation du tabac. Le gène étranger est exprimé dans le tabac et son expression conduit à un phénotype flétri analogue aux mutants à phénotype flétri de tomate (flacca). Différents travaux déjà décrits ont montré que le récepteur à l’ABA était sur la face extérieure de la membrane plasmique (voir partie du cours concernant les récepteur d’hormones) mais la structure moléculaire de récepteur n’est pas connue. Formation des graines et dormance : L’ABA intervient comme nous le verrons ultérieurement dans le contrôle de l’expression de gènes qui correspondent à des protéines de réserve des graines et à des protéines permettant sans dommage la déshydratation des tissus (les déhydrines). Parmi ces protéines une classe particulière a été spécialement étudiée ce sont les LEA protéines (late embryogenesis abundant) produite durant les phases tardives de l’embryogénèse. Leur expression est associée à l’acquisition de la tolérance à la déshydratation et elles sont censées protéger les structures

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cellulaires des effets de la perte d’eau (protection de protéines ou de membranes). L’ABA est, par ailleurs, nécessaire à l’entrée en dormance des graines et des bourgeons. L’ABA est d’une manière générale un antagoniste des gibbérellines dans des phénomènes comme la dormance ou la production d’α-amylase par les cellules d’aleurone. Abcission : Bien que l’hormone ait été initialement caractérisée en relation avec l’abcission. Ce sont des doses supraphysiologiques qui sont actives et on pense que ces doses entraîneraient la surproduction d’éthylène véritable hormone responsable de l’abcission. En conclusion le nom de dormine aurait été beaucoup plus adapté pour ce que nous appelons aujourd’hui l’acide abcissique.

III–H - LES BRASSINOSTEROIDES

Les Brassinostéroïdes (BR) représentent une classe d’hormones végétales présentant en commun des structures de stéroïdes qui ont de multiples effets sur le développement : germination des graines, élongation des tiges, expansion des feuilles, différenciation du xylème. Le rôle des Br a été clairement démontré par l’étude de mutants soit déficients, soit insensibles aux brassinostéroïdes qui présentent différentes anomalies de développement. Des phénotypes comparables peuvent être obtenus par des inhibiteurs de biosynthèse des Br comme le brassinazole (Brz).

III–H– a- Découverte , Historique : Ces molécules ont été initialement isolées en 1970 du pollen de Brassica majus sous le terme de brassines, une molécule particulière appelée brassinolide étant caractérisée en 1979. Ces molécules appliquées sur divers systèmes expérimentaux à des concentrations nanomolaires présentent un effet marqué sur l’élongation cellulaire ou sur la prolifération cellulaire. Ceci indépendamment des effets induits par d’autres hormones comme l’auxine, les cytokinines ou les gibbérellines. Une quarantaine de structure actives ont été actuellement caractérisées les Brs étant présents chez les algues, fougères, gymnospermes, angiospermes mais pas chez les microorganismes. Le brassinolide est le plus actif biologiquement et le plus répandu. Les preuves génétiques, démontrant que les Brs étaient essentiels pour le développement normal des plantes, ont été très récemment apportées par l’étude de mutants ainsi que des informations sur les mécanismes d’action des brassinostéroïdes.

III–H– b- Structure et Biosynthèse des Brassinostéroïdes : Le brassinolide (Br type) est un stéroïde présentant un squelette cholestane qui possède un cycle B-7oxalolactonique et 2- hydroxyles adjacents sur le cycle A(C₂α et C₃α) et sur la chaîne latérale C₂₂ et C₂₃.

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Des analyses de structure fonction des Brs ont montré que les structures actives devaient présenter un certain nombre de caractéristiques qui sont retrouvées dans le Br type le Brassinolide. Les différents Brs se distinguent par le nombre et la nature des substituants sur les cycles A et B et sur la chaîne latérale. La voie de synthèse du Brassinolide à partir du campestérol, un stérol végétal de répartition très générale a été établie au cours des dernières années. Elle comprend une série de réductions, d’oxydation et d’épimérisation (voir figure). Différents mutants ont été caractérisés sur les nombreuses étapes de la chaîne de synthèse. Le mutant nain det₂ est un mutant déficient en BR qui est complémenté par l’apport de Br exogène. La mutation concerne une stéroïde réductase assurant la conversion du campestérol en campestanol. L’auxine et les gibbérellines ne complémentent pas la mutation au plan fonctionnel. Le fait que le gène det₂ est nécessaire à la biosynthèse des Brs et que la perte de fonction entraîne des modifications profondes du développement : nanisme mais aussi d’autres manifestations sur la dominante apicale, la sénescence… démontre sans ambiguïté le rôle hormonal des Brs. Un autre mutant nain appelé CPD a été étudié, le gène a été cloné et séquencé. Les analogies de séquence observées montrent que ce gène code pour une étape d’hydroxylation dans la chaîne de synthèse des Brs. Les apports de teasterone, thyphastérol, castastérone « complémentent » la mutation. L’apport de casthastérone est sans effet. La protéine correspondant au gène muté catalyse la conversion de casthastérone en teasterone. C’est une hydroxylase a cytochrome P₄₅₀ (appelée CYP 90) qui présente des analogies avec les stéroïdes hydroxylases. Le phénotype sauvage est retrouvé par transformation génétique avec le cDNA de cette hydroxylase. Mutants insensibles aux Brs : Des mutants de sensibilité au Br ont été caractérisés par un crible de sélection simple : absence d’inhibition de la croissance racinaire par des doses élevées de Br. Un excès de Br comme dans le cas de l’AIA, entraîne en effet, une inhibition de croissance. Un de ces mutants BRI1 (Brassinosteroid insensitive) correspond à ces critères. A maturité il est nain et présente d’autres altérations phénotypiques. Il demeure sensible aux autres hormones : l’auxine, cytokinines, AIA, éthylène. La caractéristique du gène a permis l’identification du récepteur aux Brs (voir plus bas).

III–H– c- Effets physiologiques des brassinostéroïdes : Les brassinostéroïdes ont des effets pléiotropiques sur les systèmes végétaux. Nous avons déjà parlé de leur action sur la division et l’élongation cellulaire. Ils interviennent également dans la différenciation des tissus vasculaires qui est supprimée par apport d’uniconazole inhibiteur de la synthèse des stéroïdes mais rétablie par apport de Brassinolide. Ils accélèrent la sénescence dans des systèmes simplifiés (feuilles, cotylédons isolés) par des effets antagonistes des cytokinines.

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Les effets sur l’élongation cellulaire présentent des cinétiques différentes de ceux induits par l’AIA dont les premières manifestations s’observent après 15’ et le maximum après 30 à 45’. Les premiers effets des Brs se manifestent, en effet, après 45’ et peuvent se prolonger et augmenter pendant plusieurs heures.

III–H– d- La perception et la transduction des brassinostéroïdes : Trends in Plant Science Vol 9 Feb 2004. Une première remarque concerne le lieu de perception des hormones stéroïdes qui est différent dans le règne animal et le règne végétal. La plupart des réponses aux stéroïdes chez les animaux impliquent la perception du message par des récepteurs nucléaires alors que la perception se fait par un récepteur plasmalemmique chez les végétaux. Des études sur des mutants de sensibilité au Br chez Arabidopsis qui sont des mutants nains ont conduit à l’identification d’un récepteur et d’éléments de la chaîne de transduction. Le récepteur a été appelé BRI1 pour « Br insensitive » c’est un leucine rich repeats LRR receptor like kinase : LRR-RLK. BRI1 a un domaine extracellulaire contenant 25 LRR, un domaine transmembranaire et un domaine cytoplasmique qui porte une activité sérine / thréonine Kinase. La fixation de Br sur le récepteur provoque son autophosphorylation et des mutations sur le domaine extracellulaire suppriment la fixation de Br et l’activation de la Kinase. La situation est cependant plus complexe avec l’intervention potentielle de deux autres composants BAK1 qui pourrait former un hétèrodimère avec BRI1 et une sérine carboxypeptidase BRS1 qui réaliserait le processing d’une partie extracellulaire de la protéine BRI1 (voir figure). Divers composants de la voie de transduction ont été caractérisés BIN2 est un régulateur négatif dont l’effet est levé par l’activation du récepteur. BZR1 et BES1 sont des protéines nucléaires régulateurs positifs en aval de BIN2. Au total l’activation du complexe BRI1 – BAK1 inhibe BIN2 à travers un mécanisme inconnu, ce qui permet l’accumulation des formes non phosphorylées de BZR1 et BES1 qui sous cette forme activent les gènes cibles des Br. En l’absence de Br la kinase BIN2 inhibe les réponses en phosphorylant BZR1 et BES1 et en les orientant vers la voie de dégradation impliquant le protéosome 26S. Cette voie de transduction présente de nombreuses analogies avec des voies impliquées pour d’autres signaux chez les animaux et les végétaux (par exemple l’auxine ou l’éthylène). De façon surprenante le récepteur BRI1 de tomate a deux fonctions : la fixation de Br mais aussi de systèmine, une hormone peptidique qui induit des réponses à la blessure chez la tomate via la production d’acide jasmonique. Les fixations se produisent sur 2 sites différents, se pose alors le problème de la spécificité de la réponse en aval et du choix de ce récepteur

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commun parmi les centaines de LRR-RLKcaractérisés chez les plantes (210 chez Arabidopsis). Une situation comparable a été trouvée chez la Drosophile avec le récepteur Toll, à la fois important pour le patterning dorsoventral et pour l’acquisition de l’immunité innée aux bactéries et aux champignons. Dans ce cas les 2 phénomènes sont temporellement séparés lors du développement ce qui n’est pas le cas chez la tomate pour BRI1. Les Brs contrôlent l’expression génique : Il a été montré par des expériences d’apport de Brs à des systèmes végétaux et de suivi de la synthèse protéique, et de la transcription et par des analyses de criblage différentiel (transcrits produits uniquement ou stimulés en présence de Br) que les Brs favorisent la transcription de certains gènes. Chez le soja un gène a été caractérisé appelé BRU1 (brassinosteroid upregulated) dont les transcrits augmentent 2h après l’apport de Br mais non lors de l’apport d’auxine de cytokinine, de gibbérelline ou d’acide d’abcissique. La séquence de ce gène BRU1 présente des analogies fortes avec celle du gène connu codant pour la xyloglucane endotransglycosylase (XET). L’augmentation du message BRU1coincide avec l’accroissement d’extensibilité de la paroi et il est probable que les Brs agissent sur l’élongation cellulaire par l’intermédiaire de la production de XET (gène appelé aussi TCHU). L’activation de la transcription se faisant par l’intermédiaire d’un facteur de transcription TCH4-BF1 qui se lie au promoteur du gène TCH4.