Identificazione mediante Identificazione mediante analisi dei lipidi della pareteanalisi dei lipidi della parete

gli acidi micolicigli acidi micolici• acidi grassi, ramificati in posizione acidi grassi, ramificati in posizione ββ• presenti nella parete batterica dei generi:presenti nella parete batterica dei generi:

• CorynebacteriumCorynebacterium: 22-38 atomi di C: 22-38 atomi di C• RhodococcusRhodococcus: 34-52 atomi di C: 34-52 atomi di C• NocardiaNocardia: 44-60 atomi di C: 44-60 atomi di C• GordoniaGordonia: 48-66 atomi di C: 48-66 atomi di C• TsukamurellaTsukamurella: 64-78 atomi di C: 64-78 atomi di C• MycobacteriumMycobacterium: 60-90 atomi di C: 60-90 atomi di C

• presenza di numerosi gruppi funzionali che presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobattericidifferenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici• alfa-, alfa'-, metoxi-, keto-, epoxi-, waxalfa-, alfa'-, metoxi-, keto-, epoxi-, wax  ester-, ester-,

omega'omega'  metoxi-mycolati metoxi-mycolati

la parete dei micobatterila parete dei micobatteri

peptidoglicano

arabino-galattano

acidi micolici

membrana cellulare

altri lipidi complessi

struttura degli acidi micolicistruttura degli acidi micolici

Catena alchilica principale (38-58C)

Ramificazione alchilica (21-23C)

CHOH

CH2

CH-COOH

• separazione dei vari ac. micolici su piastre di gel separazione dei vari ac. micolici su piastre di gel di silice e successivo evidenziamento mediante di silice e successivo evidenziamento mediante opportune colorazioniopportune colorazioni

• identificazione delle “macchie” in base alla loro identificazione delle “macchie” in base alla loro posizione rispetto al fronte di avanzamento della posizione rispetto al fronte di avanzamento della fase mobile fase mobile

• identificazione del microorganismo in base al identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi micolicipattern di acidi micolici

cromatografia su strato sottilecromatografia su strato sottile

cromatografia su strato sottilecromatografia su strato sottile

• pirolisi degli acidi micolici in esteri pirolisi degli acidi micolici in esteri metilici saturi di 22, 24 e 26 atomi di Cmetilici saturi di 22, 24 e 26 atomi di C

• separazione dei prodotti di clivaggio separazione dei prodotti di clivaggio nonché degli acidi grassi saturi ed nonché degli acidi grassi saturi ed insaturi (fra i quali l’acido insaturi (fra i quali l’acido tubercolostearico) e degli alcoltubercolostearico) e degli alcol

• identificazione delle catene di C identificazione delle catene di C preferibilmente usando la spettrometria preferibilmente usando la spettrometria di massadi massa

• identificazione del microorganismo in identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi grassibase al pattern di acidi grassi

gas-cromatografiagas-cromatografia

gas-cromatografiagas-cromatografia

14:0

16:

1 16:0

2-O

H 1

6:0

17:0

18:1 TB

S

2 -O

H 2

0:0

20:0

20:0

22:0

24:

0

2 4 6 8 10 12 14 16 m in

il principio della HPLCil principio della HPLC

• la fase mobile è spinta ad elevata la fase mobile è spinta ad elevata pressione attraverso la fase stazionaria pressione attraverso la fase stazionaria (particelle paccate) contenuta nella (particelle paccate) contenuta nella colonnacolonna

• il campione viene iniettato direttamente il campione viene iniettato direttamente all'interno del flusso della fase mobileall'interno del flusso della fase mobile

• la separazione delle varie frazioni del la separazione delle varie frazioni del campione è determinata dalla diversa campione è determinata dalla diversa polarità delle due fasipolarità delle due fasi

• le frazioni eluite vengono quantizzate in le frazioni eluite vengono quantizzate in base alla loro assorbanzabase alla loro assorbanza

le componenti del sistema le componenti del sistema

solventi

pompe

colonna

cromatogramma

iniettore

recorder

detector

preparazione del campionepreparazione del campione

• saponificazionesaponificazione• una ansata di colonie in potassa alcolica per 1h a 121°Cuna ansata di colonie in potassa alcolica per 1h a 121°C

• estrazioneestrazione• aggiunta di cloroformio dopo acidificazioneaggiunta di cloroformio dopo acidificazione• evaporazione dello strato non acquosoevaporazione dello strato non acquoso• aggiunta di bicarbonato e ulteriore evaporazioneaggiunta di bicarbonato e ulteriore evaporazione• solubilizzazione del residuo secco in cloroformiosolubilizzazione del residuo secco in cloroformio

• derivatizzazionederivatizzazione• esterificazione con bromofenacil bromuro, in presenza di esterificazione con bromofenacil bromuro, in presenza di

catalizzatore, per 40 min a 80°Ccatalizzatore, per 40 min a 80°C• evaporazione e aggiunta al residuo secco di cloroformio, evaporazione e aggiunta al residuo secco di cloroformio,

ac.ac.  cloridrico e metanolocloridrico e metanolo• recupero ed evaporazione dello strato di cloroformio recupero ed evaporazione dello strato di cloroformio

identificazione dei picchi 1identificazione dei picchi 1

SI

5,39,6

TRR=5,3/9,6

identificazione dei picchi 2identificazione dei picchi 2

SI1

SI2

esempi di profili HPLCesempi di profili HPLC

M. tuberculosis

M. simiae

le fasi del processo di identificazione le fasi del processo di identificazione mediante HPLCmediante HPLC

• confronto visivo del profilo confronto visivo del profilo comatografico in esame con quelli comatografico in esame con quelli di specie note identificando, di specie note identificando, quando necessario, i picchi in base quando necessario, i picchi in base ai tempi di ritenzione relativiai tempi di ritenzione relativi

• il riconoscimento, per confronto il riconoscimento, per confronto con i tracciati cromatografici con i tracciati cromatografici presenti in memoria, è operato da presenti in memoria, è operato da un apposito softwareun apposito software

i vantaggi dell'impiego della HPLCi vantaggi dell'impiego della HPLC

• rapido (poche ore)rapido (poche ore)• single-stepsingle-step• specie-specificospecie-specifico• economicoeconomico• utilizzabile per:utilizzabile per:

• diagnostica clinica (identificazione isolati)diagnostica clinica (identificazione isolati)• ricerca (riconoscimento di nuove specie)ricerca (riconoscimento di nuove specie)

i limiti della HPLCi limiti della HPLC

• specie con profili simili (MAC e specie con profili simili (MAC e M.M.  scrofulaceumscrofulaceum, nuovi micobatteri a crescita , nuovi micobatteri a crescita rapida)rapida)

• apparecchiatura costosaapparecchiatura costosa• non utilizzabile direttamente sui materiali clinicinon utilizzabile direttamente sui materiali clinici