FUNZIONI BIOLOGICHE DELLEPROTEINE

ENZIMIPROTEINE DI TRASPORTO

PROTEINE DI RISERVAPROTEINE CONTRATTILI

PROTEINE DI DIFESAPROTEINE REGOLATRICIPROTEINE STRUTTURALI

ENERGIA LIBERA (G)

ΔG = ΔH - TΔS

Variazioni di energia libera di un sistemache sta subendo una trasformazione apressione e temperatura costanti

ΔH: variazione di entalpiaΔS: variazione di entropia

Il ΔG può essere usato per stabilire se un processo puòavvenire spontaneamente(ΔG negativo)

ΔG=0 equilibrio

Il ΔG dipende dalla differenza di energia libera tra prodottie reagenti. E’ indipendente dalla via seguita dallatrasformazione.

Il ΔG non indica a che velocità avviene la reazione

ΔG° variazioni di Energia Libera Standard(in cui i reagenti sono 1M)

ΔG°’ variazioni di Energia Libera Standard a pH7

Le BIOMOLECOLE sono stabili a pH 7, a37°C, in ambiente acquoso

Difficoltà di una reazione:•Formazione di intermedi instabili•Collisione tra molecole con un precisoorientamento

Un ENZIMA supera questi problemigenerando un ambiente specifico in cui una

data reazione avviene

Le reazioni avvengono in unatasca detta SITO ATTIVO

SITO ATTIVO

• Contiene una regione di specificità chepermette il legame del substrato

• Contiene un sito di reazione in cui ilsubstrato è trasformato

ENZIMI• Sono nella maggior parte proteine• Sono i catalizzatori delle reazioni biologiche• Hanno elevata specificità• Operano in soluzione acquosa in condizioni

blande di temperatura e pH• La loro attività dipende dall’integrità della

conformazione proteica nativa• La loro attività può essere regolata

(fosforilazione, glicosilazione, ecc…)

COFATTORI

Alcuni enzimi per essere attivi necessitanodi cofattoriI cofattori possone essere:• Ioni inorganici (Fe2+; Mg2+; Mn2+; Zn2+)• Molecole organiche o metallo-organichedette coenzimi

Se lo ione inorganico o il coenzima sonolegati covalentemente all’enzima vienedetto “gruppo prostetico”

ENZIMI E SPECIFICITA’

Catalizzano in genere UNA SOLA reazionechimica perché hanno un sito specifico acui si lega il substratoEsempio: ENZIMI PROTEOLITICI

Alcuni ENZIMI PROTEOLITICI catalizzanoreazioni diverse ma correlate

TRIPSINA TROMBINA

Il ΔG°’ tra S e P è negativo. L’equilibrio favorisce laformazione di P. L’enzima non interviene su questoequilibrio. La velocità della reazione non dipende però dalΔG°’ ma dalla barriera energetica che corrispondeall’energia necessaria ad allineare i gruppi reagenti, ariorganizzare legami affinché la reazione possa procedere.Questo punto della reazione è detto STATO DITRANSIZIONE

ΔG‡ = ENERGIA DI ATTIVAZIONE

Un enzima aumenta la velocità di reazione abbassando l’energia diattivazione ΔG‡.

L’enzima non viene consumato durante il processo e il punto diequilibrio rimane inalterato.

La reazione raggiunge l’equilibrio più velocemente

Gli equilibri di reazioni sono collegati al ΔG°’, mentre la velocità al ΔG‡.

L’energia che si libera dalle interazioni

enzima-substrato viene detta ENERGIA DI

LEGAME.

L’energia di legame è la fonte principale di

energia libera usata dall’enzima per

abbassare l’energia di attivazione della

reazione.

L’energia di legame viene utilizzata persuperare le barriere fisiche etermodinamiche di una reazione:

1. RIDUZIONE ENTROPICAL’energia di legame mantiene i substrati nellaposizione corretta

2. DESOLVATAZIONELa formazione di legami tra E e S portano allarimozione di H2O del substrato

3. STIRAMENTO O DISTORSIONE DELSUBSTRATO

La somma delle interazioni deboli tra E e Scompensano le modifiche termodinamicamentesfavorite del substrato che nello stato ditransizione può subire distorsioni sia elettronicheche strutturali

4. ADATTAMENTO DELL’ENZIMAL’enzima può subire cambi conformazionali,adattandosi al substrato. La nuova conformazioneesalta le proprietà catalitiche dell’enzima

IL SITO ATTIVO:

• Promuove la prossimità dei reagenti• Destabilizza lo stato fondamentale

(stabile) con attivazione di alcuni gruppiche diventano più reattivi

• Stabilizza lo stato di transizione evitandola formazione di prodotti secondari

TIPI DI REAZIONI CATALIZZATE:

• Ossido-riduzioni• Addizione/sottrazione di gruppi• Idrolisi• Decarbossilazioni

Per poter catalizzare una reazione un enzima deveessere complementare allo stato di transizione

1. Nel complesso enzima-substrato siformano alcune interazioni deboli cherappresentano la forza trainante dellacatalisi

2. Nel complesso enzima-substrato nellostato di transizione si formano tutte leinterazioni possibile che contribuisconoalla catalisi

Modello ESOCHINASI:variazione conformazionale indotta dal

legame con il substrato (glucosio)

CINETICA ENZIMATICA

y = mx + qVmax

Km

V0

=1

Vmax

1+

[S]

1⋅

V0

1

[S]

1

Vmax

KmPendenza =

Vmax

1

1Km

-

• Valori di Km di alcuni enzimi

• Numero di turnover di alcuni enzimi5,0L-TreoninaTreonina deidradasi

4,0D-Lattosioβ-Galattosidasi

1082,5

GliciltirosinilglicinaN-Benzoiltirosinamide

Chimotripsina

9HCO3-Anidrasi carbonica

0,40,051,5

ATPD-GlucosioD-Fruttosio

Esochinasi (cervello)

25H2O2Catalasi

Km (mM)SubstratoEnzima

0,4ATPProteina RecA (ATPasi)

800FumaratoFumarasi

2’000Benzilpenicillinaβ-Lattamasi

140’000AcetilcolinaAcetilcolinesterasi

400’000HCO3-Anidrasi carbonica

40’000’000H2O2Catalasi

KcatSubstratoEnzima

Inibizione enzimatica

GLI ENZIMI POSSONO ESSERE INIBITI

Gli INIBITORI enzimatici possono essere

• REVERSIBILI

• IRREVERSIBILI

Hanno importanti applicazioni in campofarmaceutico

Gli inibitori reversibili possono esserecompetitivi e non competitivi

INIBIZIONECOMPETITIVA

EFFETTO DELL’INIBIZIONE COMPETITIVASULLA CINETICA ENZIMATICA

INIBIZIONENON COMPETITIVA

EFFETTO DELL’INIBIZIONE NONCOMPETITIVA SULLA CINETICA ENZIMATICA

REGOLAZIONE

DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA

ENZIMI REGOLATORI1. ENZIMI ALLOSTERICI

Questi enzimi esistono in più di una forma. Lamolecola regolatrice può cambiare la conformazionedell’enzima. Questo gruppo di enzimi può essereregolato finemente.

2. ENZIMI REGOLATI DA MODIFICAZIONICOVALENTI REVERSIBILI

Questo gruppi di enzimi o è attivo o inattivo (tutto onulla)

Tutte e due le classi di enzimi regolatori hanno più subunitàe i siti regolatori e siti catalitici sono su subunità diverse

ENZIMI Allosterici

• Sono un gruppo di enzimiche non seguono a cineticadi Michaelis-Menten

• La loro attività è aumentatao diminuita da piccolemolecole o cofattori

• Regolano importanti viemetaboliche

B

A

C

D

E

E1

E3

E2

E4

INTERAZIONI TRA SUBUNITA’ DI UNENZIMA ALLOSTERICO

CURVA DI SATURAZIONE DA SUBSTRATO DIUN ENZIMA ALLOSTERICO

ENZIMI REGOLATI DAMODIFICAZIONI COVALENTI

• REGOLAZIONE ALLOSTERICA

Controlla enzimi che lavorano in maniera

continua.

• REGOLAZIONE COVALENTE

Controlla enzimi che …o funzionano …o sono

spenti. Alcune modificazioni sono reversibili,

altre no. Spesso è sotto il controllo ormonale

fine

REGOLAZIONE DI ACTasi• Lega i substrati in modo cooperativo

(effettori omotropici positivi)• CTP inibisce l’enzima

(effettore eterotropico negativo)

• ATP è un attivatore allostericoL’ATP si lega nello stesso sito del CTPElevato ATP: la cellula ha energia sufficiente perdividersi. Eccesso di purine

ASPARTATOTRANSCARBAMMILASI (ACTasi)

Enzima allosterico che catalizza la primatappa nella biosintesi delle pirimidine

ENZIMI ALLOSTERICIETEROTROPICI E CINETICA

1. Un modulatore puòaumentare o diminuirela K0.5

2. Un modulatore puòaumentare o diminuirela Vmax

ORGANIZZAZIONE DELL’ENZIMA

E’ un eteromultimero del tipo α6β6. Questo enzimapuò essere dissociato dal para-idrossimercurilbenzoato che abolisce le proprietàallosteriche dell’enzima

ACTasi (α6β6)

+ pHMBCatena C Catena R

2 subunità C 3 subunità R

Ogni subunità ècostituita da 3 cateneC; possiede 3 siti peraspartato e 3 siti percarbamilfosfato.Ogni singola catena èinattiva ⇒ ognunacontribuisce ai siti

Ogni subunità R puölegare 2 ATP o 2 CTP

e contiene uno Zn2+ lacui rimozione faperdere l’attivitä

regolatoria.

MODIFICAZIONICOVALENTI

Gli enzimi possono utilizzare diversi tipi dicatalisi per facilitare la rottura o laformazione di legami.

I più caratterizzati sono:

1.CATALISI ACIDO-BASICA

2.CATALISI COVALENTE

3.CATALISI DA IONI METALLICI, legati agruppi prostetici tipo EME o con legami dicoordinazione ad aminoacidi

PROTEASI A SERINA

• TRIPSINA• CHIMOTRIPSINA• ELASTASI

• TROMBINA• PLASMINA

Enzimi digestivisintetizzati nel pancrease secreti come proenziminel tratto digerente

Deriva dal plasminogenoRompe i polimeri difibrina dei coaguli

PROENZIMA O ZIMOGENO (tripsinogenochimotripsinogeno

elastasi)

ENZIMA ATTIVO

ACETILCOLINESTERASINon è una proteasi ma è una serinaesterasi che degrada l’acetilcolina a livellodello spazio sinaptico.Stesso meccanismo d’azione.

taglio

SPECIFICITA’ DI TAGLIO• TRIPSINA ⇒ ARG, LYS• CHIMOTRIPSINA ⇒ PHE, TYR• ELASTASI ⇒ piccoli residui neutri

Sono enzimi strutturalmente simili:• residui idrofobici e aromatici all’interno;• residui carichi sono esposti sulla superficieTre residui polari formano la TRIADE CATALITICAin corrispondenza del sito attivo:

HIS57, ASP102, SER195

CHIMOTRIPSINA

E’ una proteasi specifica per legamipeptidici adiacenti a residui aminoacidiciaromatici o idrofobici

La reazione enzimatica illustra il principiodella stabilizzazione dello stato ditransizione da parte dell’enzima ed è unesempio di catalisi acido-basica e di catalisicovalente

MECCANISMO DI CATALISIDELLA CHIMOTRIPSINA

MECCANISMO DI CATALISIDELLA CHIMOTRIPSINA

1. Posizionamento del substrato

2. Attacco nucleofilo della serina 195. L’istidina 57agisce come base, si ha la formazione di unossianione

3. Rottura del legame peptidico e formazione di un acil-enzima. L’istidina 57 cede il protone (catalisi acida)

4. L’istidina 57 prende un protone dall’H2O (catalisibasica). Intermedio tetraedrico.

5. L’istidina 57 cede un protone alla serina 195. Siottiene enzima libero e prodotto

1. POSIZINAMENTO DEL SUBSTRATONEL SITO ATTIVO

• Legami idrogeno con serina

195 e glicina 193 (sito attivo)

• Inserimento dell’anello

aromatico nell’incavo

idrofobico (adiacente al sito

attivo)

2. FORMAZIONE DI UN INTERMEDIOTETRAEDRICO PER ATTACCO NUCLEOFILODELL’OH DELLA SERINA AL C CARBONILICO

DEL PEPTIDE

• L’-OH della serina 195diventa reattivo (nucleofilo)

• L’isitidina 57 può accettareun protone della serina 195.L’aspartato 102 stabilizzal’istidina carica, che agiscecome base.

L’ossianione èstabilizzato da legamiidrogeno conSerina 195Glicina 193

OSSIANIONE: INTERMEDIOTETRAEDRICO CARICO

ROTTURALEGAME

PEPTIDICO

ACIL-ENZIMA

DEACILAZIONE CON INTERVENTO DI UNAMOLECOLA DI ACQUA

La rete Asp 102 e His 57strappa in protone all’acqua

L’OH- attacca immediatamenteil C carbossilico del gruppoacilico legato alla serina 195.Intermedio tetraedricotemporaneo.

L’istidina 57 dona poi un protonealla serina 195 che rilascia ilsubstrato modificato

CATALISI DA IONI METALLICI

Il metallo dell’enzima può fare legami ionicicon il substrato

I metalli possono anche mediare reazioni diossido-riduzione variando reversibilmente illoro stato di ossidazione

CARBOSSIPEPTIDASI A:un metallo enzima

CINETICA ENZIMATICA• La concentrazione del substrato

modifica la velocità di reazione.Per semplicità si studia la velocitàiniziale V0 in condizioni in cui [S]>>[E]

• Quando si raggiunge Vmax tuttol’enzima è saturato e si trova nellaforma ES. Aggiunte di substrato nonmodificano la Vmax

E + S ES E + PK1

K-1

K2

K-2

• A basse concentrazioni si S, l’enzima si trova nella forma liberaE. Aumentando la [S] aumenta la forma ES e la V0

E + S ES E + PK1

K-1

K2

K-2

La relazione tra concentrazione del substrato evelocità della reazione enzimatica può essereespressa in modo quantitativo dell’equazionedi MICHAELIS-MENTENVmax[S]

Km + [S]V0 =

Km =K2 + K-1

K1

TRASFORMAZIONE DELL’EQUAZIONE DIMICHAELIS-MENTEN

Facendo il reciproco di entrambi i termini dell’equazione

Vmax[S]

Km + [S]

V0

=1

Vmax[S]

Km + [S]V0 =

Vmax[S]

Km

V0

=1

Vmax[S]

[S]+

Vmax

Km

V0

=1

Vmax

1+

[S]

1⋅ y = mx + q

K2 è la costante che limita la velocità.Se K2 << K-1

che rappresenta la costante di dissociazione delcomplesso ES. Solo in queste condizioni Kmrappresenta l’affinità dell’enzima per il substrato.

Km =K2 + K-1

K1

Km =K-1

K1

Kcat

Le reazioni enzimatiche possono avvenire a 2 o più tappe. Kcat

descrive la tappa che limita la velocità di una reazioneenzimatica in condizioni di saturazione.

Kcat = K2 reazione a 2 tappe

Kcat = K3 reazione a 3 tappe

Se le tappe limitanti sono più di una Kcat diventa una funzionecomplessa contenente le costanti di velocità delle varie tappedella reazione

Kcat è una costante espressa in S-1 e viene detta numero diturnover (molecole di substrato convertite in prodotto nell’unitàdi tempo da una singola molecola di enzima)

Il modo migliore per confrontare l’efficienzacatalitica di un enzima per diversi substratio di enzimi diversi è di paragonare ilrapporto

Kcat

Km

detto COSTANTE DI SPECIFICITA’