Apresentao do PowerPoint

Efeito do cido Giberlico, do cido Abcsico, e do Clcio na sntese e actividade da -amilase, em sementes de Hordeum vulgare L. Realizado por:-Ana Rita Brs-Marta Silva-Pedro Mateus-Tnia Moura

Unidade Curricular: Fisiologia Vegetal Ano letivo: 2014/15Faculdade de Cincias da Universidade do Porto

1Objetivo do trabalho: - O presente trabalho teve como objetivo verificar o papel do GA na sntese da -amilase e a ao do GA, ABA, glucose e Ca2+ no nvel de atividade da enzima em sementes de cevada.

2As sementes de Cevada As sementes utilizadas foram de Hordeum vulgare L. mais conhecidas como sementes de cevada. Para a realizao do trabalho teve-se em conta que com a germinao das sementes o teor de amido vai diminuindo.

Fig.0 - sementes de cevada3Germinao nas sementes de cevada H uma fase da germinao da semente que requer acares, nomeadamente no crescimento do embrio; Por isso, numa fase em que necessrio uma quantidade admirvel de acares disponveis produzida -amilase. O amido hidrolisado na endosperma amilfero.

Fig.1 -Processos na semente no desenvolvimento do embrio4-amilaseA -amilase uma enzima induzida pelo embrio das sementes sendo responsvel pela hidrolizao do amido.

Fig.2 - -amilase

Fig.3 - amido5cido Giberlico (GA)O cido giberlico produzido no interior da sementes. Quanto maior a concentrao de GA, maior ser a produo de -amilase.

Fig. 4 - cido Giberlico6cido Abscsico (ABA) Fito-hormona que controla a maturao das sementes . Regulador do crescimento da planta atravs da inibio de produo da -amilase.

Fig.5 - cido asbcsico7Ca 2+ Os caties Ca2+ so importantes no processo pois a -amilase necessita de se ligar a eles para permanecer funcional e estvel.

Fig.6 - Catio de clcio8A cicloheximida A cicloheximida um inibidor da sntese proteica em clulas, atuando ao nvel da transcrio do DNA.

Fig. 7 - Cicloheximida

Fig.8 - Transcio do DNA9Preparao de reagentes: Lixvia a 10%: Preparar 100 mL a partir de lixvia comercial. gua destilada e esterilizada: Preparar 1 L. Tampo HEPES 0,01 M pH 6: Preparar 1 L. (MM = 238,3 g/mole). Soluo de GA 10-6 M em tampo HEPES: Dissolver 18,25 mg de GA em 500 mL de tampo HEPES; aquecer para dissolver, verificar o volume o pH = 6,0. Soluo de GA 10-6 M com CaCl2 10 mM em tampo HEPES: Dissolver 0,147 g de CaCl2.2H2O em 100 mL da soluo GA 10-6 M em tampo HEPES; verificar o pH. Soluo de ABA 1 M + GA 10-6 M em tampo HEPES: dissolver ABA em 1 mL de etanol 95%. Completar o volume com soluo de GA 10-6 M em tampo HEPES. Soluo de GA 10-6 M + cicloheximida 1 g/cm3 em tampo HEPES: dissolver a cicloheximida em 1 mL de etanol 95%. Completar o volume com soluo de GA 10-6 M em tampo HEPES (guardar a 4 C)Material e Procedimento1. Procedeu-se desinfeco de 250 sementes de cevada com lixvia a 10%, seguindo-se de lavagens sucessivas com gua destilada. Manteve-se as sementes em papel de filtro humedecido, em obscuridade, durante 24h, temperatura de 4C:

2. Seccionou-se transversalmente as sementes e separou-se as suas metade com e sem embrio

Parte I - Preparao e tratamento das sementes

Fig.9 - Esquema ilustrativo da separao da metade com embrio da metade sem embrioA identificao do embrio foi feita por comparao, sendo a parte com embrio tenuemente mais clara.

Quando as sementes so esverdeadas o embrio mais fcil de identificar;

11As sementes so ricas em amido e, por isso, so susceptveis a ataques de microorganismos.

Para prevenir esse ataque necessrio trabalhar com bastantes cuidados asspticos:-As lminas utilizadas anteriormente foram passadas pela chama;-Material lavado por autoclavagem(lavagem a altas presses e temperaturas);-Trabalho a baixas temperaturas (4C);

Fig. 10-Corte das sementes 123. Catorze placas de Petri, com 2 discos de papel de filtro na base, foram esterilizadas por autoclavagem;

Fig. 11- Colocao das sementes na placa de PetriNota:As metades devem ser colocadas com a parte cortada em contacto com o papel de filtro.4. Numeraram-se placas de Petri de 1 a 6, fazendo duplicados, e pipetou-se 5 mL das seguintes solues para cada tratamento:

Placas 1 e 2: tampo HEPES 0,01 M, pH 6;

Placa 3: GA 10-6 M em tampo HEPES;

Placa 4: GA 10-6 M + CaCl2 10 mM em tampo HEPES;

Placa 5: GA 10-6 M + ABA 1 M em tampo HEPES;

Placa 6: GA 10-6 M + cicloheximida em tampo HEPES;

Em cada uma das placas foram colocadas 15 metades das sementes previamente preparadas: na placa 1 colocaram-se metades com embrio e nas restantes placas sementes sem embrio;

Fig. 12 - Placa de Petri com as sementes

Fig. 13 - Placa de Petri a ser vedada com parafilme5. Fecharam-se e vedaram-se as placas com parafilme e colocaram-se a incubar na obscuridade durante 48h a uma temperatura de 250C;

Nota:As plantas tm vrios tipos de amilases, por isso importante ser rigoroso com o tempo de incubao, caso contrrio comeam a surgir outras amlases ( amilase) e assim na quantificao no teramos apenas a -amilase; 156. Procedeu-se ao congelamento das amostras at data da extrao;7. Procedeu-se quantificao da atividade da -amilase;

Fig. 14 - Placas de Petri completas e vedadas

Fig. 15 -Tubos contendo as amostras para congelamentoParte II - Preparao dos extratos para a quantificao de protenas1. Em gelo, homogeneizaram-se as sementes em 2mL de tampo de cido ctrico-citrato de sdio 10 mM, pH 5;

Fig. 16 - Homogeneizado de sementes2. Foram adicionados mais 2 mL de tampo. Depois de todo o material estar bem esmagado foi transferido com uma pipeta de Pasteur para um tubo de centrfuga. O almofariz foi lavado com 2 mL de tampo que foi adicionado ao tubo com o extrato, perfazendo um volume final de 6mL;Nota:Para utilizar a centrfuga necessrio que o suporte no lado oposto quele que contm a nossa amostra tenha um mesmo peso para contrabalanar.

ContrabalanoFig. 17 - Colocao das amostras na centrfugaO pH pode desnaturar a -amlase e, por isso, necessrio o uso de tampo que evita variaes de pH;Tambm ser necessrio trabalhar em gelo para que as protenas no desnaturem, uma vez que h tendncia de a temperatura subir.3. Centrifugou-se o extrato a 5000 rpm durante 5min., no frio. Transferiu-se o sobrenadante para tubos envoltos em gelo;

Fig.18- Esquema ilustrativo de uma amostra depois de centrifugadaParte III - Quantificao de protenas pelo mtodo de Bradford1. Preparam-se 10 mL 6 solues de albumina com concentraes crescentes com o intervalo de 0,2 mg/mL (0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/mL);

Fig. 19 - Utilizao do Reagente de Bradford2. Adicionou-se 1mL reagente de Bradford a 100 L de cada sobrenadante diludo em cuvetes. - Deixou-se repousar temperatura ambiente durante 15 min.;

3. L-se a absorvncia a 595 nm;Nota:O corante de Bradford tem uma cor acastanhada e reage com as protenas corando-as de azul. A cor ideal neste caso em especfico aps os 15 min de reaco castanho.

Fig. 20 - Aspeto de cada soluo aps a reao com o reagente de Bradford Parte IV-Quantificao da actividade da -amilase nos diferentes grupos de sementes1. Marcaram-se e prepararam-se os tubos de acordo com a seguinte tabela:TubosTratamentoVolume extrato(mL)Volume amido(mL)Tempo de reao(min)1Controlo c/embrio0,510,5-12Controlo s/ embrio0,512-33GA0,510,5-14GA+Ca0,510,5-15ABA+GA0,512-36Ciclohexamida+GA0,512-32. Pipetou-se 0,5 mL de extrato e 1mL de soluo de amido para cada tubo de ensaio. Aps o tempo de reao tabelado adicionou-se 1,5 mL de HCl a 1M. Adicionaram-se 0,5mL Lugol a cada um dos tubos;3. Mediu-se a absorvncia das solues a 580nm;4. Determinou-se a quantidade de -amilase;TuboAbs 595 nmConcentrao proteica (g/mL)Tempo de reao (min)Abs 580 nm% amido hidrolisado /mL/min% de amido hidrolisado /minuto/g de protena10,9674,4x1020,500,437112,60,520,7293,4x1022,530,40023,70,130,8063,7x1020,500,347130,60,740,7853,6x1020,580,45494,10,550,7323,4x1021,000,30869,20,460,9144,2x1022,580,30027,10,17--------------1,088--------Tratamento de resultados

Exemplo de clculos:1. Determinao da concentrao de protenas na amostra- Reta padro da atividade das protenas:y = 0,0022x 0,0089x concentrao de protenas na amostra (g/mL)y absorvncia a 595 nmAdmitindo:

Absorvncia a 595 nm (extrato tubo 1) = 0,725

Concentrao proteica (x) = 333,59 g/mLSe X representar a quantidade de amido presente no incio da reaco (A580nm do tubo 7) e Y representar o teor de amido presente no fim da reao (A580nm de cada um dos tubo 1 - 6), ento:

X - Y = Z ,

em que Z representa a quantidade de amido hidrolisado durante a reao em cada um dos tubos e,

100(Z/X), representa a % de amido hidrolisado.Exprimir os resultados % de amido hidrolisado/mL/minAbsorvncia a 580 nm tubo 7 = 1,7820 (X)Absorvncia a 580 nm tubo 1 = 0,6683 (Y)

X - Y = 1,1137 (Z)% de amido hidrolisado :

Tempo de reao: 2,5 min

Ento:62,50 % / 2,5 min = 25 % amido hidrolisado/min

Para calcular a % de amido hidrolisado por mL, temos:

25 % ---------- 0,5 mL (volume SN na mistura de reao) X ---------- 1 mL

X = 50 %

Ento:

50 % amido hidrol/min/mL ----------- 333,59 g/mL protena Y ----------- 1 g

Y = 0,1499 0,150 % amido hidrol/min/g protena Tubo% amido hidrolisado/min/g de protena1 - C/ emb0,2252 - S/ emb0,0713 - C/ GA0,3794 - C/ GA + Ca0,3835 - C/ GA + ABA0,1716 - C/ GA + ciclohex0,094Tubo% amido hidrolisado/min/g de protena1 C / emb0,52 S/ emb0,13- C/ GA0,74 C/ GA + Ca0,55 C/ GA + ABA0,46 C/ GA + ciclohex0,1Resultados esperados:Resultados obtidos:Concluso e discusso dos resultadosPlaca 1Placa 2Concluso: A produo de amilase est relacionado com a parte da semente que contm o embrio, dado que ocorre maior degradao de amido na presena do embrio.

Mas, o que dar o sinal aleurona para iniciar a produo de amilase? 0,225Com embrio + HEPES

Sem embrio + HEPES

0,071Sem embrio + HEPES + GA0,379Placa 3Concluso: Nesta placa, tratamos a semente sem embrio com GA e h um aumento de amido hidrolisado, at maior que o verificado na placa 1.O GA responsvel pela induo de amilase e, por isso, o sinal que libertado pelo embrio.

21-Frmula estrutural do GAGA estimula a produo de a-amilase; curiosidade: frmula estrutural do cido giberlico; 310,383Sem embrio + HEPES + GA + ABA0,171Placa 4Placa 5Imagem de transcrio e traduo que dar origem a uma protena( enzima) para explicar a cicloheximida.32

Etapas da sntese proteica:TranscrioTraduoSabe-se que ABA inibidor na fase da transcrio.Fig. 22-Mecanismo de sntese de protenasNo esquecer de referir que os resultados esto de acordo com o esperado!!!!!!!!33Sem embrio + HEPES + GA + cicloheximida0,094Pressuposto: A cicloheximida inibidor da ao da amilase.

Concluso: Na presena de GA e de cicloheximida, amilase no atua. Logo, a cicloheximida interfere na sntese proteica e o GA ativa a enzima, aps a sua formao.Placa 6Como?

23-Frmula estrutural da cicloheximida

Etapas da sntese proteica:TranscrioTraduoAtualmente, sabe-se que a cicloheximida interfere na fase da traduo, nomeadamente, no deslocamento das molculas tRNA e mRNA, ao nvel do ribossoma.Figura 23Neste slide, referir que a cicloheximida tem ao numa das etapas da sntese proteica.35Concluses finais Neste trabalho, inferimos acerca dos papis de GA, ABA e de clcio na sntese e atividade de -amilase.

Deste modo, verificamos que a induo da produo de a-amilase comandada pelo embrio e que este, por sua vez, produz GA para induzir tal produo. O GA estimula, pela anlise de resultados, a produo de -amilase. Mas, em presena de cicloheximida, ocorre uma inibio de produo de -amilase, o que indica que a cicloheximida inibe a -amilase, numa fase anterior sua produo. Quanto ao Ca2+ e tambm ao ABA, verifica-se que a produo de -amilase aumenta e diminui, respetivamente. Logo, conclumos que o Ca2+ tem um papel importante na estabilidade da enzima, enquanto que o ABA interfere na fase da produo da protena que depois de ativada, se torna na enzima em causa.BibliografiaPlant Physiology Lincoln Taiz & Eduardo Zeiger, Sinauer Associates, Inc., Publishers. 2010http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0103-84782007000200010&script=sci_arttexthttp://www.gepe.ufpr.br/pdfs/Crescimento%20de%20Hemerocallis%20hybrida%20cv%20Graziela%20Barroso%20submetida%20a%20aplicacoes%20de%20acido%20giberelico.pdf