Fabiana da Silva Lima

Modulação da glutamina sobre a via de sinalização do fator nuclear kappa B (NF-κB) em macrófagos peritoniais em um

modelo murínico de desnutrição protéica

Dissertação para obtenção do grau de

MESTRE

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Ambrosio Fock

São Paulo 2011

Fabiana da Silva Lima

Modulação da glutamina sobre a via de sinalização do fator nuclear kappa B (NF-ҡB) em macrófagos peritoniais em um modelo murínico de desnutrição protéica

Comissão Julgadora da

Dissertação para obtenção do grau de Mestre

Prof. Dr. Ricardo Ambrosio Fock Orientador/Presidente

_____________________________________

1o Examinador

________________________________

2o Examinador

São Paulo,______ de 2011.

Ao meu Pai Cicero: trabalhador, inteligente e guerreiro. Ensinou-me a lutar e a viver com dignidade.

Ao meu marido Moises: meu anjo protetor, amigo e companheiro. Por acreditar em mim e estar

sempre ao meu lado: todo meu amor.

Ao Prof. Dr. Ricardo Ambrosio Fock: Orientador é a palavra que melhor lhe define: não só esteve sempre presente, mas caminhou junto, trabalhando com dedicação e entusiasmo. A você toda minha gratidão,

admiração e respeito.

AGRADECIMENTOS

A Daisy M.C. Santos, amiga e companheira, sempre ao meu lado. Aos amigos do

Hospital Universitário e a todos aqueles que sempre torceram por mim, obrigada.

Aos amigos do laboratório de Hematologia Clínica, em especial a Luciana Simão

Carmo, Mayara Caldas Ramos, Alexandra Siqueira Melo, Graziela Batista da Silva, e

Jackeline Soares.

A Profa. Dra. Primavera Borelli, exemplo de dedicação ao ensino e a pesquisa, a

você toda minha admiração, respeito e carinho.

Ao Prof. Dr. Marcelo Macedo Rogero, do Departamento de Nutrição da Faculdade

de Saúde Pública, pela contribuição na realização desse trabalho.

A técnica de laboratório Mariana Ferreira pelo auxílio prestado.

Aos estagiários de iniciação científica, em especial a Mayara Cortez, todo meu

carinho e amizade.

Ao Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, e a todo o pessoal da

secretaria da pós-graduação, pelo trabalho realizado.

A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo apoio financeiro

para a realização desta pesquisa.

A todos aqueles não citados aqui, mas que de alguma forma contribuíram para

realização desse trabalho. Muito obrigada.

“De tudo ficaram três coisas:

A certeza de que estamos sempre começando,

A certeza de que precisamos continuar...

A certeza que seremos interrompidos antes de terminar.

Portanto devemos:

Fazer da interrupção, um caminho novo...

Da queda, um passo de dança,

Do medo uma escada,

Do sonho uma ponte...

Da procura, um encontro”

Fernando Sabino

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS ................................................................................. ix

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... xi

RESUMO.................................................................................................................................. xii

ABSTRACT ............................................................................................................................ xiv

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA .................................................................................. 16

2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 18

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 18

3. REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................ 19

3.1 DESNUTRIÇÃO PROTÉICA E PROTÉICO – ENERGÉTICA ................................. 19

3.2 MACRÓFAGOS ............................................................................................................ 23

3.3 ATIVAÇÃO CELULAR MEDIADA POR LPS ........................................................... 24

3.4 GLUTAMINA ................................................................................................................ 28

4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 30

4.1 ANIMAIS ....................................................................................................................... 30

4.2 RAÇÕES ........................................................................................................................ 31

4.3 INDUÇÃO À DESNUTRIÇÃO .................................................................................... 31

4.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ........................................................................ 32

4.6 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTÉICA DAS RAÇÕES ......................... 33

4.7 OBTENÇÃO DE SANGUE TOTAL E SORO .............................................................. 33

4.8 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS, ALBUMINA, PRÉ-ALBUMINA,

GLUTAMINA SÉRICA, CORTICOSTERONA E HEMOGRAMA. ................................. 33

4.9 OBTENÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES PERITONIAIS E

IMUNOFENOTIPAGEM .................................................................................................... 34

4.10 CULTURA DE CÉLULAS MONONUCLEARES PERITONIAIS............................ 35

4.11 DETERMINAÇÃO DA EXPRESSÃO DE TRAF-6, IKK, IҠB-α E IҠB-α

FOSFORILADO, NF-ҠB E NF-ҠB FOSFORILADO ....................................................... 36

4.11.1 SDS-PAGE e “Western blotting ............................................................................ 36

4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................... 38

5. RESULTADOS .................................................................................................................... 39

5.1 AVALIAÇÃO DO CONSUMO DE ÁGUA, PROTEÍNAS, RAÇÃO E VARIAÇÃO

DO PESO CORPÓREO ....................................................................................................... 39

5.2 ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE PROTEÍNAS TOTAIS,

ALBUMINA E PRÉ-ALBUMINA ...................................................................................... 40

5.3 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE GLUTAMINA PLASMÁTICA .............. 41

5.4 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CORTICOSTERONA ............................ 41

5.5 HEMOGRAMA.............................................................................................................. 42

5.5.1. Eritrograma ............................................................................................................. 42

5.5.2. Leucograma ............................................................................................................ 43

5.6 AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DA MEDULA OSSEA........................................... 44

5.7 LAVADO PERITONIAL ............................................................................................... 45

5.8 ANÁLISE IMUNOFENOTÍPICA (ENSAIOS EX VIVO) .......................................... 46

5.9 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE TNF- E IL-1α ..................................... 49

5.10 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE IL-10 .................................................... 50

5.11 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO TOTAL DE TRAF-6 ............................................. 51

5.12 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO TOTAL DE IKK .................................................. 52

5.13 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE IҠB- TOTAL E IҠB- FOSFORILADO ... 52 5.14 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE NF-ҠB TOTAL E NF-ҠB FOSFORILADO 54

6. DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 56

7. CONCLUSÃO......................................................................................................................61

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 62

ANEXO A : CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS ................ 72

ix

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS

AP-1: Ativador da proteína-1

BCG: Bacilo Calmette-Guérin

CARS: Síndrome da resposta antiinflamatória compensatória

CD14: Marcador mielomonocítico, receptor de lipopolissacarídeo

CD71: Marcador monocítico. Receptor de transferrina

CD86: Marcador monocítico/co-ativador.

DPE: Desnutrição Protéico - Energética

DNA: Ácido Desoxirribonucléico

EDTA: Ácido Etilenodiaminotetracético

ELISA: Enzima Linked Immuno Sorbent Assay

FAO: Organização das Nações Unidas para Agricultura e alimentação

GSH: Glutationa (forma reduzida)

GM-CSF: Fator estimulador de colônia grânulo-monocítica

GTP: Guanosina Trifosfato

IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IL-1: Interleucina 1

IL-6: Interleucina 6

IL-8: Interleucina 8

IL-10: Interleucina 10

IL-12: Interleucina 12

IRAK: Serina-treonina proteína quinase

IҡB: Inibidor kappa B

IKK: I kappa B quinase

LBP: Lipoproteína ligadora do lipopolissacarídeo

x

LPS: Lipopolissacarídeo

LPS-LPB: Complexo lipoproteína ligadora do lipopolissacarídeo

LPS-CD14: Complexo lipopolissacarídeo /Marcador mielomonocítico

MAPK: Proteína quinase ativada por mitógeno

MHC: Complexo Principal de Histocompatibilidade

mCD14: CD14 ligado a membrana

MyD88: Fator diferenciador mieloide 88

NAD+ : Nicotinamida adenina dinucleotídeo

NaCl: Cloreto de sódio

NF-ҡB: Fator de transcrição nuclear kappa B

PAMP: Padrão molecular associado ao patógeno

PBS: Phosphate buffered saline

PMSF: Phenylmethanesulfonyl fluoride

pIҡB-α: Inibidor kappa B alfa fosforilado

pNF-Ҡb: Fator de transcrição nuclear kappa B fosforilado

RNA: Ácido ribonucléico

SDS: Sodium dodecyl sulfate

sCD14: CD14 solúvel

SIRS: Síndrome da resposta inflamatória sistêmica

TBS: Tris buffered saline

TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa

TLR: Receptor toll-like

TLR-4: Receptor toll-like 4

TRAF-6: Fator 6 associado ao receptor de TNF

WHO: World Health Organization

xi

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. REPRESENTAÇÃO DA ATIVAÇÃO DO FATOR NUCLEAR KAPPA B (NF-

ҠB) ATIVADO PELO LIPOPOLISSACARÍDEO ................................................ 26

FIGURA 2. METABOLISMO DA GLUTAMINA EM MACRÓFAGOS ............................ 29

FIGURA 3. COMPOSIÇÃO DAS RAÇÕES .......................................................................... 31

FIGURA 4. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ............................................................... 32

FIGURA 5. CONSUMO DE ÁGUA, PROTEÍNAS, RAÇÃO E VARIAÇÃO DO PESO

CORPÓREO ..................................................................................................................... 39

FIGURA 6. PROTEÍNAS TOTAIS, ALBUMINA E PRÉ-ALBUMINA ............................... 40

FIGURA 7. CONCENTRAÇÃO DE GLUTAMINA PLASMÁTICA ................................... 41

FIGURA 8. CONCENTRAÇÃO DE CORTICOSTERONA .................................................. 42

FIGURA 9. ERITROGRAMA ................................................................................................. 42

FIGURA 10. LEUCOGRAMA ................................................................................................ 43

FIGURA 11. MIELOGRAMA ................................................................................................. 44

FIGURA 12. LAVADO PERITONIAL ................................................................................... 45

FIGURA13. ANÁLISE IMUNOFENOTÍPICA DA POPULAÇÃO DE CÉLULAS

PERITONIAIS.................................................................................................................. 46

FIGURA 14. ANÁLISE IMUNOFENOTÍPICA (CD14, F4/80)............................................47

FIGURA 15. ANÁLISE IMUNOFENOTÍPICA (TLR-4/MD-2)............................................48

FIGURA 16. EXPRESSÃO DE TNF-ALFA E INTERLEUCINA - 1 .................................... 49

FIGURA 17. AVALIAÇÃO DA INTERLEUCINA-10 .......................................................... 50

FIGURA 18. EXPRESSÃO TOTAL DE TRAF-6 .................................................................. 51

FIGURA 19. EXPRESSÃO TOTAL DE IKK ......................................................................... 52

FIGURA 20. EXPRESSÃO DE IKB ALFA TOTAL E FOSFORILADO .............................. 53

FIGURA 21. EXPRESSÃO DE NFKB TOTAL E FOSFORILADO ..................................... 54

xii

RESUMO

LIMA, F.S. Modulação da glutamina sobre a via de sinalização do fator nuclear kappa B (NF-κB) em macrófagos peritoniais em um modelo murínico de desnutrição protéica. Dissertação [Mestrado] – Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.72p.

Os mecanismos exatos que comprometem o sistema imune em estados de

desnutrição ainda não estão totalmente esclarecidos, sendo que a desnutrição

modifica a funcionalidade das células efetoras da resposta inflamatória/infecciosa,

ocasionando menor síntese de citocinas pró-inflamatórias, além de ocasionar

alterações da hemopoese. Macrófagos apresentam papel chave tanto na resposta

imune inata quanto adaptativa, e apresentam alta taxa de utilização do aminoácido

glutamina, que é fundamental para o fornecimento de energia e nitrogênio. Nesse

contexto, verifica-se que o metabolismo da glutamina em macrófagos desempenha

um papel importante para a síntese de citocinas, sendo que a síntese de diversas

citocinas é dependente da concentração extracelular de glutamina. Dada a

importância desse aminoácido no organismo e que sob condições de estresse sua

manutenção encontra-se prejudicada e diante do fato de que macrófagos utilizam

altas taxas desse aminoácido para seu funcionamento propusemo-nos a estudar

alguns aspectos da influência desse aminácido sobre células macrofágicas em

situação de desnutrição protéica. Camundongos BALB/c, machos, submetidos à

desnutrição protéica, após perda de aproximadamente 20% do peso corpóreo, foram

eutanasiados. Hemograma, mielograma, e análise das concentrações séricas de

glutamina, proteínas totais, albumina e pré-albumina séricas foram realizadas.

Células macrofágicas coletadas da cavidade peritonial foram cultivadas, in vitro, com

glutamina, em diferentes concentrações, e a capacidade de produção de TNF-, IL-1

e IL-10, bem como a expressão de moléculas envolvidas na ativação da via do fator

de transcrição NF-ҡB, foram quantificadas. Animais desnutridos apresentaram

diminuição da concentração de glutamina plasmática e aumento do corticosterona

circulante. Anemia, leucopenia e severa redução na celularidade da medula óssea

com comprometimento do setor mielóide foram evidenciadas nos animais

desnutridos, bem como diminuição da celularidade da cavidade peritonial com

redução da população de células macrofágicas. Os resultados demonstram que a

glutamina apresenta um efeito dose dependente na ativação de macrófagos

peritoniais cultivados in vitro e estimulados com LPS por 30 minutos, mostrando-se

xiii

capaz de induzir a uma menor produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-

e IL-1, e ao mesmo tempo aumentar a produção de IL-10, modulando negativamente

a via de sinalização do fator de transcrição NF-ҡB, principal via para indução de

genes da resposta inflamatória e imune, sendo essa modulação mais evidente nos

animais desnutridos. Baseando-se nestes resultados, discutimos o papel do estado

nutricional modificando a resposta do organismo frente a um estímulo inflamatório e

o papel da glutamina, in vitro, em modular esse processo.

Palavras-Chave: Desnutrição, Glutamina, Macrófagos, Citocinas, NF-ҡB.

xiv

ABSTRACT

Lima, F.S. Modulation of glutamine on the signaling pathway of nuclear factor kappa B (NF-ҡB) in peritoneal macrophages in a mouse model of protein malnutrition. 72.Dissertação [Mestrado] – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São

Paulo, São Paulo, 2011.

The exact mechanisms that commits the immune system in condition of malnutrition

are still not fully understood, being that malnutrition modifies the functionality of

effector cells in inflammatory/infectious response, leading a reduced synthesis of pro-

inflammatory cytokines besides causing changes in hematopoiesis. Macrophages

play an essential role on the innate and adaptive immune response, and have high

utilization rate of the amino acid glutamine, which is essential for the supply of energy

and nitrogen. In this context, it appears that the glutamine metabolism in

macrophages is essential for the synthesis of cytokines and synthesis of several

cytokines are dependent of the extracellular glutamine concentration. Given the

importance of this amino acid in the body and knowing that in stress conditions

situations its maintenance is impaired and besides that macrophages use high levels

of this amino acid to function, we proposed to investigate some aspects of the

influence of this amino acid on macrophages in a situation of protein malnutrition.

BALB/c male, subjected to protein malnutrition, after attained about 20% loss of their

original body weight were sacrificed. Hemogram, myelogram, and analysis of serum

concentrations of glutamine, protein, albumin and prealbumin were evaluated.

Macrophages collected from peritoneal cavity were cultivated, in vitro, with glutamine,

at different concentrations and the TNF-α, IL-1 and IL-10 capacity of production, as

well as the expression of molecules involved in the transcription factor NF-ҡB

activation were evaluated. Malnourished animals showed lower plasma glutamine

and increase of corticosterone levels. Anemia, leucopenia and severe reduction of

cellularity of bone marrow with myeloid impaired, as well as reduction of the

peritoneal cavity cellularity with reduced macrophages population were observed in

malnourished animals. Data showed that glutamine has a dose dependent effect on

peritoneal macrophages activation in vitro when stimulated with LPS for 30 minutes,

being able to induce a decrease of pro-inflammatory cytokines production as TNF-α

and IL-1, while at same time an increase of IL-10 production, modulating negatively

the signaling pathway transcription factor NF-ҡB activation which is the main pathway

xv

to induce genes of the inflammatory and immune response, and this modulation was

more pronounced in malnourished animals. Based on these results, we discuss the

role of nutritional status modifying immune response face to inflammatory stimulus

and the role of glutamine in vitro in modulating this process.

Keywords: Malnutrition, Glutamine, Macrophages, Cytokine, NF-ҡB.

16

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

A desnutrição protéica e protéico-energética (DPE) é o tipo mais frequente de

desnutrição, estimando-se que mais de 30% da humanidade sofrem de algum grau

de desnutrição, sendo mais encontrada em crianças e idosos, pacientes portadores

de neoplasias, doenças crônicas ou sob quimioterapia (WAITZBERG et al., 1999;

MARCOS, 2000; WHO, 2000; GADDUCCI et al., 2001; AKNER;CEDERHOLM, 2001;

NOVA et al., 2002; KEUSCH, 2003).

O binômio desnutrição-infecção pode ser visto sob dois aspectos: a desnutrição

alterando os mecanismos de defesa do indivíduo e a infecção agravando o estado

carencial previamente instalado ou ainda, a doença desencadeando-o (BEISEL,

1984; KEUSCH et al., 1986; POWANDA;BEISEL, 2003; SCRIMSHAW, 2003).

Nessas condições a desnutrição pode facilitar a invasão do agente, favorecer sua

proliferação no organismo, facilitar infecções secundárias e modificar o curso e a

evolução da enfermidade (LAMUS, 1975; BRUNDTLAND, 2000).

Dados da literatura e do nosso grupo evidenciam que a desnutrição

compromete órgãos linfo-hemopoéticos e modifica a resposta imune. Nossos

trabalhos demonstram alterações estruturais e ultra-estruturais da medula óssea,

baço e timo; alterações funcionais como redução da migração celular, do

espraiamento, fagocitose, atividade bactericida e fungicida bem como alterações na

produção de espécies reativas do oxigênio (CHANDRA, 1991; KEUSCH, 1994;

BORELLI et al., 1995; NARDINELLI;BORELLI, 2001; BRIASSOULIS et al., 2001;

VITURI et al., 2001) e nitrogênio (FOCK et al., 2003). Nossos dados também

revelam que macrófagos de animais desnutridos apresentam menor capacidade em

sintetizar citocinas pró-inflamatórias como TNF-, IL-1, IL-1 e IL-6 quando

estimulados com lipopolissacarídeo (LPS) (FOCK et al., 2007).

Macrófagos apresentam papel chave tanto na resposta imune específica

quanto adquirida, e apresentam alta taxa de utilização do aminoácido glutamina, que

é fundamental para o fornecimento de energia e nitrogênio (NEWSHOLME et al.,

2001). A ativação de macrófagos in vitro por LPS acarreta em aumento da síntese

de RNA mensageiro, a qual é mantida pelo aminoácido glutamina, que atua como

precursor de bases nitrogenadas. O aumento do processo de transcrição de

citocinas por macrófagos permite a modulação das respostas imune e inflamatória.

Nesse contexto, verifica-se que o metabolismo da glutamina em macrófagos é

17

essencial para a síntese do Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e de

interleucinas (ILs), como IL-1, IL-6 e IL-8, sendo a síntese dessas citocinas

dependente da concentração extracelular de glutamina (NISHIYAMA;CURI, 2000).

Todavia, os mecanismos moleculares de ação da glutamina em macrófagos

ativados, decorrente de processos infecciosos e inflamatórios, não estão

completamente elucidados.

Uma vez que, animais desnutridos apresentam alterações funcionais em

macrófagos, e que para essas células a concentração extracelular do aminoácido

glutamina é essencial para síntese de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α,

investigamos a participação da glutamina na via de sinalização do fator nuclear

Kappa-B (NF-ҡB) (principal via da resposta inflamatória e imune), e a concentração

do Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e Inteleucina 1, in vitro, em macrófagos

peritoniais de camundongos desnutridos suplementados in vitro previamente com L-

glutamina em diferentes concentrações e estimulados posteriormente com LPS

(Lipopolissacarideo).

18

2. OBJETIVOS

Sabendo-se que animais desnutridos apresentam hipoplasia severa de órgãos

linfo-hemopoéticos e alterações funcionais das células efetoras da resposta

inflamatória/infecciosa, e que o metabolismo da glutamina em macrófagos é

essencial para a síntese de diversas citocinas, nos propusemos a avaliar, neste

trabalho, o efeito da glutamina sobre a via de sinalização do fator de transcrição

NFҡB em macrófagos peritoniais, estimulados com LPS, obtidos de camundongos

submetidos à desnutrição protéica.

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Como objetivos específicos propusemos avaliar:

Parâmetros bioquímicos indicativos do estado nutricional: concentração

de proteínas totais, albumina e pré-albumina;

A concentração plasmática de glutamina e corticosterona;

Hemograma, mielograma e contagem da celularidade peritoneal;

Análise por citometria de fluxo da porcentagem de células

macrofágicas na cavidade peritoneal;

Os efeitos da suplementação com L-glutamina, in vitro, em diferentes

concentrações, sobre a capacidade de macrófagos peritoniais em sintetizar

TNF-, IL-1 e IL-10 quando estimulados com LPS;

A expressão da molécula TRAF-6 e IKK em macrófagos peritoniais

estimulados in vitro com LPS e suplementados em diferentes concentrações

de glutamina;

A expressão do IҡB total e da porção fosforilada em macrófagos

peritoniais estimulados in vitro com LPS e suplementados em diferentes

concentrações de glutamina;

A expressão total do fator de transcrição NFҡB e da porção fosforilada

em macrófagos peritoniais estimulados in vitro com LPS e suplementados em

diferentes concentrações de glutamina.

19

3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1 DESNUTRIÇÃO PROTÉICA E PROTÉICO – ENERGÉTICA

A desnutrição protéico-energética (DPE) é definida pela Organização Mundial

da Saúde como "condição (ões) patológica(s) que provém da menor ingestão, em

várias proporções, de proteínas e calorias‖ (de ONIS et al., 1993).

A desnutrição pode ter origem na deficiência ou ausência de qualquer nutriente,

sendo que sua instalação e gravidade dependem da causa, intensidade e duração

da carência (STINNETT, 1983).

Clinicamente, a desnutrição é caracterizada pela ingestão inadequada ou

mesmo pela ingestão de um excesso de nutrientes de forma desbalanceada. Os

indivíduos desnutridos apresentam-se incapazes de utilizar totalmente os alimentos

que consomem, ou ainda, indivíduos que consomem excesso de calorias, sendo que

a dieta desbalanceada não fornece nutrientes adequados para o crescimento e

manutenção do organismo (WHO, 2000).

Enquanto nos países em desenvolvimento a principal causa de DPE é primária

e atinge principalmente lactantes e crianças, nos países industrializados a DPE

geralmente é secundária, estando associada a outras doenças, acometendo tanto

crianças como adultos (BARON, 1997).

Quanto à etiologia, a desnutrição apresenta causas multifatoriais, podendo ser

classificada em:

Primária: ocorre pela ingestão de uma dieta inadequada devido à

indisponibilidade em várias proporções de alimentos. Abrange

principalmente países em desenvolvimento e em regiões como Pacífico,

Sudeste da Ásia e África Subsaariana. É também consequência direta

dos maiores índices de pobreza nesses países e de zonas de

guerras/conflitos em algumas regiões (SHETTY, 2006).

Secundária: atinge tanto países desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento. Acometem principalmente indivíduos hospitalizados

por períodos prolongados, aqueles que necessitam de dieta

enteral/parenteral, portadores de doenças crônicas e inflamatórias, que

sofrem de neoplasias e aqueles que realizam quimioterapia (STINNETT,

1983; SHETTY, 2006).

20

Em países como Alemanha, França, Reino Unido e Estados Unidos os índices

de prevalência da desnutrição aguda nos últimos dez anos em crianças

hospitalizadas variou de 6 para 14%, enquanto que na Turquia, um índice de até

40% têm sido descrito (JOOSTEN;HULST, 2010).

Por ano, 10,8 milhões de crianças com menos de cinco anos morrem de

causas que envolvem direta ou indiretamente a desnutrição. Associada a doenças

infecciosas, a desnutrição leva a uma indisposição grave por parte da comunidade,

diminuindo a qualidade de vida, fazendo com que se perpetue o ciclo desnutrição-

infecção-doença e pobreza (SCHAIBLE;KAUFMANN, 2007; KATONA;KATONA-

APTE, 2008).

De acordo com a FAO (2010), a maior parte da população desnutrida vive em

países em desenvolvimento. A principal causa da fome e consequente desnutrição

é a pobreza. Um total de aproximadamente 925 milhões de pessoas sofreu fome em

2010 comparados ao ano anterior que atingiu aproximadamente 1,020 bilhão. Na

Ásia e no Pacífico é estimado que 578 milhões de pessoas sofram de fome crônica,

239 milhões passam fome na África Subsaariana, 53 milhões na América Latina e

Caribe, 37 milhões no Oriente Médio e África do Norte e 19 milhões em países

desenvolvidos.

No Brasil, o índice de desnutrição é irregular. Em 2003, no Norte e Nordeste

urbano e rural os índices de desnutrição variaram entre 36,2 a 48,3%. No Sul,

Sudeste e Centro-Oeste esses índices foram menores (17%, 18,3% e 22,3%

respectivamente). Dados mostraram que 6,6% das crianças com até cinco anos de

idade que vivia no Semi-Árido, uma das áreas mais pobres do país, sofriam de

desnutrição crônica (déficit de altura) (MONTEIRO, 2003). Porém, o quadro nacional

está modificando gradualmente.

De acordo com Monteiro et al., (2009), houve um declínio substancial da

desnutrição infantil no Brasil, sendo que os fatores responsáveis por esse declínio

seria a melhoria da distribuição de renda, redução da pobreza, consequência da

reativação do crescimento econômico e diminuição do desemprego, reajustes do

salário mínimo e expansão da cobertura dos programas de transferência de renda.

Essa evolução do declínio da desnutrição no Brasil entre 1996-2007 indica que a

meta do milênio das Nações Unidas relativa à desnutrição infantil de 6% (redução à

metade no período de 1990-2015) poderá ser alcançada pelo Brasil.

21

Segundo a Pesquisa de Orçamento Familiar (POF) nacional 2008-2009, o

déficit de altura nos primeiros anos de vida (principal indicador da desnutrição

infantil) tem apresentado os menores índices da última década, mas ainda atinge

intensamente a região norte do Brasil (IBGE, 2010).

As manifestações clínicas da DPE dependem do grau e severidade da

deficiência protéico-calórica, da causa e duração da deficiência, bem como da idade

do indivíduo e da associação ou não com outras doenças. Desta forma, a

desnutrição compreende uma gama de síndromes clínicas. As formas clínicas

características com manifestações mais severas são o Kwashiorkor e o Marasmus

(De ANGELIS, 1986; SHETTY, 2006).

Em 1933, a médica Dra. Cicely Williams, na Costa do Ouro (Colônia da África

Ocidental), descreveu uma síndrome bem definida chamada Kwashiorkor. É uma

palavra do dialeto africano que significa ―doença do segundo filho‖ ou ―doença do

desmame‖, pois ocorre quando há de se desmamar o primeiro filho para amamentar

o segundo. Esses indivíduos apresentavam edema, principalmente das mãos e dos

pés, irritabilidade, diarréia, descamação das áreas da pele chegando a ulcerações.

Consiste numa desnutrição essencialmente protéica, desencadeada pela ingestão

protéica em quantidades insuficientes e também devido a uma alimentação

desbalanceada. Os acometidos por Kwashiorkor apresentam atraso no crescimento,

alterações psicomotoras e fraqueza muscular. Tende a ser limitado em algumas

partes do mundo como a África Subsaariana, Pacífico e Sudeste da Ásia (De

ANGELIS, 1986; SHETTY, 2006).

O Marasmus é uma forma clínica que consiste em severa alteração no

crescimento, com intensa atrofia muscular, raramente apresenta edema e

dermatoses, porém a perda de gordura subcutânea e da camada muscular é muito

aparente, dando aquele aspecto de ―pele enrrugada‖. É definido pela diminuição no

consumo tanto de proteínas como de calorias, ou seja, uma desnutrição protéico-

energética (De ANGELIS, 1986; AUGUSTO, 1995; SHETTY, 2006).

Tanto Kwashiorkor quanto Marasmus podem cursar com retardo no

crescimento, alterações psicomotoras e alterações morfológicas e funcionais

acentuadas em diversos órgãos como coração, pulmões, músculo esquelético, perda

da elasticidade da pele, sistema gastrintestinal, hepatobiliares, rins e sistemas

endócrino e imunológico como, por exemplo, supressão da medula óssea (De

ANGELIS, 1986; AUGUSTO, 1995; SHETTY, 2006;). Outros quadros intermediários

22

podem surgir pela combinação dos mais variados graus de privação protéica com

diversos graus de deficiência calórica total.

O comprometimento dos orgãos linfo-hematopoéticos na desnutrição está

diretamente associado com a modificação da resposta imune que se traduz por

maior suscetibilidade a infecções (GROSS;NEWBERNE, 1980; TOMKINS, 1986;

VICTORIA;HERNANDEZ, 1990; SCRIMSCHAW, 2003).

A atrofia linfóide é uma das características mais severas da desnutrição. O

tamanho e o peso do timo estão reduzidos. Instala-se uma deficiência intensa de

linfócitos T, aumentando a susceptibilidade a patógenos, infecções virais e

oportunistas (CHANDRA, 1997; CUNNINGHAM-RUNDLES et al., 2005;

SCHAIBLE;KAUFMANN, 2007). A associação desnutrição-infecção é responsável

pelos altos índices de morbidade e mortalidade principalmente entre crianças,

adolescentes e idosos (BEISEL, 1977; VICTORIA;HERNANDEZ, 1990).

A desnutrição também acarreta diversas alterações hematológicas

quantitativas, como anemia e leucopenia (MARTINS et al., 1971; De ANGELIS,

1986; LEE;HERBERT, 1999).

Trabalhos anteriores em nosso laboratório sobre desnutrição protéica e

protéico-energética demonstram que a anemia instalada em animais desnutridos, é

uma anemia decorrente da redução do número de precursores eritróides e que são

hiporesponsivas à eritropoetina (BORELLI et al., 2007). A desnutrição acarreta

alterações na medula óssea que levam a diminuição da população celular,

resultando em anemia, diminuição de reticulócitos e leucopenia (BORELLI et al.,

2009).

Outras alterações hematológicas quantitativas, também evidenciadas na

desnutrição, como leucopenia, linfocitopenia e neutropenia são um reflexo do

comprometimento dos órgãos linfo-hemopoéticos, particularmente do microambiente

hemopoético (GARCIA, 1992; BORELLI et al., 1995; AUGUSTO, 1995; BARON,

1997; XAVIER et al., 2007). Na desnutrição há uma aparente dificuldade da resposta

leucocitária em processos infecciosos, que pode ocorrer, em parte, devido a uma

redução no compartimento de reserva da medula óssea (BORELLI;BLATT, 2004),

com consequente alteração no processo de mobilização dos leucócitos do sangue

para os tecidos (BORELLI et al., 1995, LANDGRAF et al., 2007), além de alterações

dos mecanismos funcionais de resposta celular (BORELLI et al., 1995; NARDINELLI

;BORELLI, 2001; VITURI et al., 2001; FOCK et al., 2003).

23

1METCHNIKOFF, E.Lectures on the comparative pathology of inflammation. London, 1893.

3.2 MACRÓFAGOS

Em 1892 os estudos de Metchnikoff e colaboradores demonstraram a

importância das células fagocitárias, descrevendo o princípio da imunidade celular

gerada através do processo de fagocitose por macrófagos (METCHNIKOFF1, 1893

apud JENKIN;ROWLEY, 1963).

As células mononucleares originam-se na medula óssea e os monoblastos são

os precursores mais imaturos derivados da célula progenitora pluripotente que se

diferencia em promonócito e monócito. Os monócitos circulam pelo sangue periférico

e migram através dos vasos sanguíneos para os vários órgãos e sistemas teciduais,

onde se transformam em macrófagos, que constitui uma fase mais avançada na vida

da célula mononuclear fagocitária (VAN FURTH et al., 1972; 1979).

Macrófagos são caracterizados pela sua alta atividade endocítica e também

pela elevada capacidade de secretar grande número de compostos, incluindo

enzimas, proteínas plasmáticas, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio,

prostaglandinas e citocinas, o que reforça o papel dessas células em iniciar e regular

as respostas imune e inflamatória (YASSAD et al., 1997; GREENBERG;

GRINSTEIN, 2002).

Os macrófagos desempenham um importante papel como célula apresentadora

de antígeno. Os antígenos insolúveis fagocitados e os antígenos solúveis

pinocitados são ingeridos e degradados enzimaticamente em pequenos fragmentos,

os quais são ligados com moléculas de classe II do MHC, sendo transportados para

a superfície externa da membrana plasmática, o que permite que estes fragmentos

sejam apresentados para linfócitos T (YASSAD et al., 1997; GREENBERG;

GRINSTEIN, 2002).

Os macrófagos são geralmente subclassificados de acordo com o seu estado

de ativação em residentes, inflamatórios ou células ativadas (COHN, 1978). Os

macrófagos residentes representam células teciduais que não foram expostas a

substâncias estranhas, apresentando baixa atividade funcional, como, por exemplo,

baixas taxas de secreção de proteinases ou síntese de espécies reativas de

oxigênio. Os macrófagos inflamatórios representam aqueles que receberam um

estímulo inflamatório não microbicida. Possui muita semelhança com o macrófago

ativado já que há um aumento do espraiamento, fagocitose, membrana plasmática

24

mais proeminente, mas não há um aumento acentuado na produção de espécies

reativas de oxigênio e nitrogênio. Porém macrófagos que demonstram elevadas

taxas de síntese de espécies reativas de oxigênio (O2

- e H2O2) e nitrogênio,

aumento da atividade antimicrobiana e da capacidade tumoricida, difusão mais

rápida sobre a superfície de vidro, membrana plasmática mais proeminente,

aumento do tamanho celular e do conteúdo de lisossomos e maior taxa de

fagocitose, são denominados macrófagos ativados (COHN, 1978).

Estudos do nosso grupo têm demonstrado que a desnutrição parece modificar

a produção e a mobilização de células sanguíneas e o ―burst‖ respiratório (BORELLI

et al., 1995; NARDINELLI;BORELLI, 2001).

Além disso, a desnutrição parece acarretar alterações funcionais em

macrófagos, como redução da migração celular, do espraiamento, fagocitose,

atividade bactericida e fungicida bem como alterações na produção de espécies

reativas do oxigênio e nitrogênio (CHANDRA, 1991; KEUSCH, 1994; BORELLI et

al.,1995; NARDINELLI;BORELLI, 2001; BRIASSOULIS et al., 2001; VITURI et al.,

2001; FOCK et al., 2003). Dados do nosso grupo também revelam que macrófagos

oriundos de animais desnutridos apresentam menor capacidade em sintetizar

citocinas pró-inflamatórias como TNF-, IL-1, IL-1 e IL-6 quando estimulados com

lipopolissacarídeo (LPS) (FOCK et al., 2007).

3.3 ATIVAÇÃO CELULAR MEDIADA POR LPS

O lipopolissacarídeo (LPS) é um componente da parede de bactérias gram-

negativa e está relacionada ao choque tóxico. Quando o LPS é liberado, por

exemplo, quando a bactéria sofre autólise da parede celular, o LPS é liberado

causando diversos efeitos fisiopatológicos, estimulando a produção de citocinas. As

principais células afetadas pelo LPS são monócitos e macrófagos, que produzem

citocinas pró-inflamatórias, entre elas IL-1, IL-6 e TNF-, que atuam como

mediadores da reposta inflamatória (OPAL;ESMON, 2003; BEUTLER; RIETSCHEL,

2003).

O sistema imune inato possui estratégias para o reconhecimento de

microorganismos. Uma estratégia é o reconhecimento do padrão molecular

filogeneticamente conservado associado ao patógeno (pathogen-associated

25

molecular patterns - PAMP). Receptores tipo Toll like (TLR) desempenham um

importante papel no reconhecimento de diversos padrões moleculares associados à

patógeno (MEDZHITOV, 2006; VANDEWALLE, 2008).

Células como macrófagos possuem receptores de superfície chamados de

CD14. O CD14 é uma molécula que está presente na maioria das células e pode

apresentar-se como CD14 solúvel (sCD14) ou ligado à membrana (mCD14)

(TOBIAS et al.,1999).

Para que ocorra a ativação celular é preciso que haja ligação do LPS a célula

pela ligação do complexo LPS-LBP (Proteína Ligante de LPS) ao CD14, onde o LBP

dissocia-se e o complexo LPS-CD14 associa-se com o receptor do tipo TLR4. O

sCD14 possui afinidade pelo LPS-LBP circulante (ZIEGLER-HEITBROCK;

ULEVITCH, 1993; LANDMANN et al., 2000; BEUTLER, 2003). Segundo Detmers et

al.,(1996), a internalização do LPS pode ser necessária, sendo considerado um fator

importante para a ativação celular.

O TLR4 necessita de uma molécula adicional conhecida como MD-2,

necessária para a ativação celular. Essa molécula forma um complexo com o

domínio extracelular do TLR4 (SHIMAZU et al., 1999; AKASHI et al., 2000;

TRIANTAFILOU;TRIANTAFILOU, 2002).

Quando o complexo TLR4 é ativado ocorre uma série de eventos.

Inicialmente há a associação de uma proteína chamada MyD88 que recruta

membros da família quinase associada ao receptor de IL-1: serina-treonina proteína

quinase do receptor de IL-1 (IRAK4 e IRAK1), que são fosforilados associando-se a

proteína TRAF-6 (fator de necrose tumoral associado ao fator 6).

O TRAF-6 ativa quinases da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), as

quais podem promover a ativação do ativador da proteína-1 (AP-1) por meio da

MAPK (figura 1.) (BEUTLER;RIETSCHEL, 2003; BEUTLER, 2004; KAWAI;AKIRA,

2005).

No citoplasma de células não estimuladas, o fator de transcrição denominado

fator nuclear-ҡB (NF-ҡB) — que se apresenta na forma de dímero — encontra-se na

forma inativa devido a sua associação com proteínas denominadas inibidores κB

(IκB). A família de proteínas IҡB inclui IҡBα, IҡBβ, IҡBε, Bcl-3, e as regiões carboxi-

terminal do NF-ҡB1 (p105), NF-ҡB2 (p100). As proteínas IҡB ligam-se, com diferentes

afinidades e especificidades, para diferentes dímeros do NF-ҡB. Portanto, além da

existência de diferentes dímeros de NF-ҡB em um tipo celular específico, há também

26

grande número de combinações entre o IҡB e os dímeros do NF-ҡB

(CAAMAÑO;HUNTER, 2002; LI; VERMA, 2002).

O TRAF-6 promove a ativação por fosforilação do complexo IҡB quinases (IKK).

Esse complexo é composto de duas subunidades catalíticas IKKα e IKKβ e uma

subunidade regulatória IKKγ e induz a fosforilação do IҡB (BEUTLER, 2004; KAWAI;

AKIRA, 2005).

A fosforilação dos IҡB resulta na sua poliubiquitinação, a qual, por sua vez,

acarreta sua degradação mediada pelo proteossoma 26S, o que permite, desse

modo, que o fator de transcrição NF-ҡB transloque para o interior do núcleo celular e

ative a transcrição de diversos genes dependentes desse fator, como genes de

citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-α, IL-1 e IL-6 (figura 1) (BEUTLER, 2004;

KAWAI;AKIRA, 2005).

O NF-ҡB também promove a estimulação da síntese do IҡB, uma vez que a

região promotora do gene que codifica para o IҡB contém sítios funcionais para o

NF-ҡB. Desse modo, o IҡB recém-sintetizado liga-se ao NF-ҡB e suprime a sua

atividade (HATADA et al., 2000; MAGNANI et al., 2000; DOBROVOLSKAIA;VOGEL,

2002; FUJIHARA et al., 2003; KAWAI;AKIRA, 2005).

Figura 1. Representação da

ativação do fator nuclear B (NF-

B) ativado pelo lipopolissacarídeo (LPS). (Adaptado de MIYAKE, 2003).

27

Vários estímulos levam à fosforilação do IҡB, que é fundamental para sua

degradação. A proteína IҡB fosforilada recebe a adição de ubiquitina, pela ação da

ubiquitina ligase, sendo em seguida degradada pelo complexo proteossoma 26S.

Isso resulta na liberação do NF-ҡB. Tanto o IҡB como o IҡB ligam-se ao p50,

tornando a sequência localizadora do núcleo inacessível, impedindo sua

translocação (GHOSH et al.,1998).

O desmembramento do complexo IҡB/ NF-ҡB permite o transporte do NF-ҡB

para o núcleo, com consequente ligação desse nos genes que apresentam a

sequência regulatória GGGACTTTCC junto à região promotora, levando a um

aumento na expressão do gene alvo. A fosforilação do IҡB ocorre pela ação de

proteínas quinases específicas, como o complexo IҡB quinase (IKK), que contém

duas subunidades com propriedades de quinase: IKK e IKK (também

denominadas IKK1 e IKK2, respectivamente) (CAAMANO; HUNTER, 2002; LI;

VERMA, 2002).

O complexo IKK é capaz de discernir entre o IҡB complexado e o IҡB livre,

explicando o fato do IҡB poder acumular-se nas células onde o IKK permanece

ativado (ZANDI et al.,1997). Vale lembrar que muitas proteínas quinase estão

envolvidas nesse processo de fosforilação e que esse mecanismo não está

totalmente elucidado.

Dessa forma o LPS estimula a síntese de citocinas, induzindo a ativação de

vários fatores de transcrição como o NF-ҡB, entre outros como AP-1 e o STAT, os

quais ativam ou reprimem os genes alvo. Estes fatores podem também intensificar e

perpetuar a expressão de citocinas, visto que as regiões promotoras de muitas

citocinas e seus genes de receptores revelam numerosos sítios reguladores para

estes fatores de transcrição. Desde que as citocinas não atuam sozinhas, sendo

produzidas e liberadas em rede bem coordenada, os níveis relativos destes fatores

de transcrição podem ser responsáveis pela ação inflamatória e antiinflamatória

prolongada das citocinas e seus ativadores (CAAMANO;HUNTER, 2002; LI;

VERMA, 2002; BILLACK, 2006).

28

3.4 GLUTAMINA

Aminoácidos são requeridos para a síntese de uma variedade de proteínas e

possuem importante papel na resposta imune. Uma dieta adequada de todos os

aminoácidos é necessária para a manutenção do sistema imune e prevenção de

doenças e infecções. Quando a demanda de aminoácidos é insuficiente o impacto é

negativo sobre a imunidade (LI et al., 2007).

A glutamina é um aminoácido não essencial, sendo sintetizada principalmente

pelo músculo esquelético. Entretanto, segundo Newsholme et al.,(2001), em

determinadas condições a glutamina torna-se ―condicionalmente essencial‖ como em

traumas, cirurgias e septicemia. A glutamina é essencial para função de células

como neutrófilos, linfócitos e macrófagos, possui diversas funções no organismo na

biossíntese de nucleotídeos, detoxificação de amônia, síntese de glutationa,

manutenção do equilíbrio ácido-base e transferência de nitrogênio entre os órgãos

(NEWSHOLME et al., 2001).

Segundo Frisina et al.,(1994) e Rowbottom et al.,(1995), a taxa de utilização de

glutamina por macrófagos é similar ou superior à de glicose. Contudo, apenas

pequena parte dos carbonos da molécula de glicose (<10%) e do aminoácido

glutamina (5-25%) são completamente oxidados por macrófagos em meio de cultura.

Sendo assim, a maioria das moléculas de glicose é convertida em lactato (glicólise),

enquanto grande parte da glutamina é convertida em glutamato, aspartato e lactato

(glutaminólise) (figura 2) (NEWSHOLME et al.,1999).

Os processos de glicólise e glutaminólise fornecem intermediários

metabólicos para vias biossintéticas de macromoléculas. A glicólise fornece glicose-

6-fosfato para a formação de ribose-5-fosfato, a qual é precursora da síntese de

DNA e RNA e glicerol-3-fosfato para a síntese de fosfolipídios. Paralelamente, a

glutaminólise fornece amônia e aspartato para a síntese de purinas e pirimidinas,

que são necessárias para a formação de DNA e RNA. Glutamina também fornece

nitrogênio para a formação de glicosamina, GTP e NAD+ (NEWSHOLME et al., 1987;

NEWSHOLME et al., 2001).

29

Figura 2. Metabolismo da glutamina em macrófagos. Enzimas estão indicadas

como: 1. glutaminase; 2. aspartato aminotransferase; 3. enzimas da metade esquerda do ciclo de Krebs; 4. malato desidrogenase NAD-dependente; 5. enzima málica 6. fosfoenolpiruvato carboxiquinase; 7. piruvato quinase; 8. lactato desidrogenase; (modificado de CALDER, 1995).

Macrófagos são células caracterizadas por alta taxa de secreção de proteínas,

que depende do aumento da síntese de RNAm, a qual utiliza purinas, pirimidinas e

ribose-5-fosfato. Isto caracteriza papel relevante da glutamina na manutenção de

elevadas taxas de transcrição (NEWSHOLME et al., 1996). De acordo com essa

hipótese, alguns estudos têm investigado a relação entre secreção de TNF-, IL-1 e

IL-6 – que são citocinas quantitativamente relevantes sintetizadas por macrófagos –

e a concentração extracelular de glutamina, desde que macrófagos podem ser

totalmente dependentes da concentração extracelular de glutamina para atingirem

uma atividade secretória ótima (MURPHY;NEWSHOLME, 1999). Segundo

NEWSHOLME et al., (1999), macrófagos peritoniais de camundongos ativados com

BCG e incubados em meio de cultura na presença de 2 mM de glutamina

apresentam a capacidade de sintetizarem TNF- em altas taxas quando estimulados

por LPS. Além disso, WALLACE;KEAST (1992) e YASSAD et al., (1997)

demonstraram, respectivamente, que o aumento da secreção de IL-1 e IL-6 por

macrófagos estimulados por LPS foi dependente da concentração de glutamina

extracelular.

extracelular

glutamina

glutamato

1

oxaloacetato

aspartato

alfacetoglutarato

malato

piruvato

lactato

fosfoenolpiruvato

2

3

4

5

6

7

8

NH3

30

Rogero et al., (2008), também observaram que animais desmamados

prematuramente e suplementados com glutamina apresentaram aumento na função

de macrófagos e na hemopoese quando estimulados com BCG. Li et al., (2007),

também relata que a glutamina é o maior combustível para as células do sistema

imune, atuando na proliferação de linfócitos T, na síntese de proteína, produção de

citocinas e inibição da apoptose.

Entretanto, a literatura apresenta divergências em relação à capacidade da

glutamina em melhorar a resposta imune e aumentar a produção de citocinas pró-

inflamatórias. Segundo Engel et al., (2009), um estudo realizado com pacientes

submetidos à cirurgia cardíaca demonstrou que a produção de IL-6, IL-8 e TNF-,

não foi influenciada pela normalização dos níveis de glutamina após trauma

cirúrgico. Hubert-Buron et al., (2006), avaliaram os efeitos do pré-tratamento com

glutamina nas células epiteliais do intestino humano na ubiquitinação do IҡB-α e

verificaram que a glutamina diminui a produção de IL-1, IL-6, e IL-8, e aumenta a

produção de IL-10 na mucosa duodenal de humanos. Também demonstraram que a

ativação de NF-ҡB,está diminuída nas células epiteliais do intestino. De acordo com

Singleton;Wischmeyer (2008), a glutamina tem apresentado efeito antiinflamatório

em modelo experimental de sepse. Este efeito tem sido associado com a diminuição

da ativação do NF-ҡB.

Os mecanismos responsáveis pela habilidade da glutamina em regular a

resposta inflamatória e diminuir a ativação do NF-ҡB ainda não estão totalmente

esclarecidos. Assim, a divergência dos dados obtidos pode dever-se a diferenças

nos métodos utilizados (in vivo e in vitro), nas concentrações de glutamina, e nos

tipos celulares avaliados nesses estudos.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 ANIMAIS

Para realização dos experimentos foram utilizados camundongos BALB/C, de

dois a três meses de idade, isogênicos, machos, provenientes do Biotério Central do

Conjunto das Químicas da Universidade de São Paulo.

Os animais foram submetidos, desde o nascimento, às mesmas condições

ambientais (temperatura ambiente entre 22-25C, ciclo de luz de 12 horas). Logo

31

após o desmame, os animais passaram a ser alimentados com ração Purina e

água ad libitum até o início do experimento.

Os animais foram pesados e distribuídos em gaiolas metabólicas (ZUCAS et

al., 1969), pesados a cada 48 horas durante o período de adaptação (BORELLI et

al., 1995), que foi definido pelo ganho e estabilidade do peso corpóreo.

4.2 RAÇÕES

A ração I controle, destinada aos animais nutridos contém 12% de proteína

(Tabela 1. Ração I controle), e a ração II hipoprotéica, destinada aos animais do

grupo desnutrido, contém 2% de proteína (Tabela 1. Ração II hipoprotéica). As

rações são isocalóricas, sendo diferente apenas o conteúdo protéico. A caseína foi

à fonte protéica das rações, sendo a concentração protéica da caseína e das rações

determinadas pelo método micro-Kjeldahl (INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 1985). A

mistura salínica e vitamínica utilizadas foram às recomendadas por REEVES et al.,

(1993) (Tabela 1.). As rações foram produzidas em nosso laboratório na forma de

granulado e conservadas a -4C até o momento de uso.

Tabela 1: Composição das Rações

Constituintes Ração I Controle

Ração II Hipoprotéica

(g/kg ração)

Proteína 120 20 Mistura salínica

1 35 35

Mistura vitamínica1 10 10

Sacarose 100 100 Óleo Soja 40 40 Celulose 50 50 L-Cistina 1,8 0,257

Bitartarato de Colina 2,5 2,5 Tert-butilhidroquinona 0,008 0,008

Amido (q.s.p.) 100 100 Tabela 1.

1As misturas salínica e vitamínica foram preparadas

sob encomenda de acordo com as recomendações de 1993 do Instituto Americano de Nutrição para camundongos adultos (REEVES, 1993).

4.3 INDUÇÃO À DESNUTRIÇÃO

No período de adaptação de aproximadamente 3 semanas, os animais foram

32

colocados individualmente em gaiolas metabólicas e mantidos nas mesmas

condições de ciclo de luz de 12h (claro/escuro), onde foram alimentados com ração

Purina e água ad libitum até adaptação ao gaioleiro, estabilidade do peso corporal

e início do experimento.

Após o período de adaptação, os animais foram separados em dois grupos:

controle e desnutrido. Ao grupo controle (nutrido) foi administrado ração contendo

12% de proteína e ao grupo experimental (desnutrido) foi administrada uma dieta

com 2% de proteína. Em ambos os grupos, foi determinado a cada 48 horas o

consumo de ração, água e o peso corpóreo de cada animal. Quando houve perda de

aproximadamente 20 a 25 % do peso corporal do grupo desnutrido, os animais

foram sacrificados para obtenção das amostras biológicas.

4.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Figura 3. Delineamento experimental.

1 Avaliação do consumo de água, peso e ração a cada 48

horas. 2 Coleta de material biológico para determinação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos.

Período de adaptação

BALB/c machos de 3 meses de idade

adaptação

Ração 12%

Proteína (Controle)

Período

Experimental

Ração 2% Proteína

(Desnutrido)

Eutanásia

Coleta de amostra

biológica2

5 semanas

1

Ciclo de luz 12 hs (claro/escuro)

22 – 25ºC

Coleta de Macrófagos

Peritoniais

33

4.5 AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL DOS ANIMAIS

A avaliação do estado nutricional dos animais foi baseada no peso corpóreo, no

consumo diário das rações e no consumo total de proteína, hemograma, dosagem

de proteínas totais, albumina e pré-albumina sérica.

4.6 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTÉICA DAS RAÇÕES

A determinação da concentração protéica das rações foi realizada pelo método

de micro-Kjedahl (WARD, 1963) e realizada no laboratório de Nutrição Experimental

da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – USP, sob responsabilidade do Profº Dr.

Júlio Tirapegui.

4.7 OBTENÇÃO DE SANGUE TOTAL E SORO

As amostras sanguíneas foram obtidas, a partir do plexo axilar com auxílio de

uma pipeta de transferência, em camundongos previamente anestesiados com

cloridrato de quetamina (50 mg/Kg de massa corporal) associado ao cloridrato de

xilazina (50 mg/Kg de massa corporal), por via intramuscular.

Amostras, sem anticoagulante, foram utilizadas para obtenção do soro, e

amostras utilizando-se EDTA 10%, como anticoagulante, para obtenção do sangue

total, o qual foi utilizado para a realização do hemograma. Amostras contendo

heparina como anticoagulante, na proporção de 40 µL de heparina (25000UI/5 mL)

para 1,0 mL de sangue foram utilizadas para dosagem de glutamina plasmática.

O soro foi separado por centrifugação (2000 x g por 10 minutos) a 4C e

utilizado para a dosagem das proteínas totais, albumina e pré-albumina séricas.

4.8 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS, ALBUMINA, PRÉ-

ALBUMINA, GLUTAMINA SÉRICA, CORTICOSTERONA E HEMOGRAMA.

A determinação de proteínas totais foi realizada pelo método do Biureto

(GORNALL et al.,1949) e a determinação de albumina realizada pelo método do

Verde de Bromo Cresol (DOUMAS, et al. 1971). As amostras foram processadas em

duplicata e a leitura realizada em espectrofotômetro automatizado COBAS MIRA

PLUS (ROCHE).

34

A pré-albumina foi avaliada pela determinação quantitativa em soro por técnica

automatizada de nefelometria utilizando-se reagentes comerciais N-ANTISORO pré-

albumina (Dade Behring®, Marburg, USA), seguindo-se a metodologia indicada pelo

fabricante.

A determinação de glutamina foi realizada segundo a metodologia descrita por

LUND (1985), que se baseia na conversão de NAD+ para NADH (cuja concentração

é medida pelo espectrofotômetro). Esta conversão é proporcional à quantidade de L-

glutamina inicial.

O Corticosterona foi avaliado pelo método de ELISA (Enzyme Linked

ImmnunoSorbent Assay ), kit Enzo Life Sciences.

Para a realização do hemograma as amostras foram coletadas como descrito

no item 4.7 (DACIE;LEWIS, 1995). O número de eritrócitos e de leucócitos foi

determinado pelo analisador automático de células sanguíneas ABC Vet (ABX

DIAGNOSTICS). Os valores relativos do número de leucócitos foram determinados

em extensões sanguíneas realizadas após a coleta do sangue e coradas pela

coloração de May Grunwald-Giensa, modificada (ROSENFELD, 1947).

4.9 OBTENÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES PERITONIAIS E

IMUNOFENOTIPAGEM

Após exsanguinação dos animais, a cavidade peritonial foi lavada com 5 mL de

meio RPMI 1640 (Cultilab, Campinas, Brasil), pH 7,4, estéril, contendo 10% de

soro bovino fetal (Cultilab Campinas, Brasil). O líquido peritonial aspirado contém

as células, as quais foram contadas em hemocitômetros e cuja viabilidade celular foi

avaliada pelo teste de exclusão com o azul de tripan 0,1%.

Alíquotas de 106 células/mL de suspensão contendo as células do lavado

peritonial dos camundongos, controles e desnutridos, foram suspensas em meio

RPMI 1640 (Cultilab, Campinas, Brasil), pH 7,4, incubadas com 1g de anticorpos

monoclonais, durante 20 minutos sob agitação em temperatura ambiente. Após

este período os tubos foram centrifugados a 450 X g por 10 minutos, o

sobrenadante descartado e o sedimento celular lavado duas vezes com PBS azida

a 0,1%, sendo que após a última lavagem o sedimento foi ressuspenso com 500L

de paraformaldeído a 1% e submetido à analise por citometria de fluxo. Um total de

35

10.000 eventos foram adquiridos em citômetro de fluxo contendo laser de argônio

de 488nm e 15mW modelo FACS CALIBUR (Becton Dickinson) e as análises

realizadas empregando-se o programa Cell Quest Pro.

As células foram caracterizadas imunofenotipicamente pelos anticorpos F4/80,

CD14 e TLR-4/MD-2. Em todos os casos utilizaram-se os controles negativo de

cadeia conjugado ao respectivo fluorcromo.

4.10 CULTURA DE CÉLULAS MONONUCLEARES PERITONIAIS

As células foram coletadas como descrito no item 4.9 e cultivadas em meio

RPMI 1640 com 10% de soro bovino fetal, suplementado ou não com 0,6, 2 e 10

mmol/L de glutamina. As células foram incubadas por 24 horas.

A escolha pela concentração de glutamina de 0,6 mmol/L durante o período de

cultura celular se deve ao fato dessa concentração corresponder àquela observada

no plasma de animais adultos saudáveis. A concentração 2 mmol/L é uma

concentração padrão em cultura de células e apesar desse valor estar acima das

concentrações de glutamina in vivo (0,6 mmol/L), experimentalmente 2 mmol/L

propiciaram melhores resultados em condições de incubação de células por

períodos prolongados (24–72 horas) (EAGLE et al.,1955). A concentração de 10

mmol/L — apesar de significativamente superior àquela utilizada em ensaios in vitro

com macrófagos — é devido ao fato de estudos, que utilizaram outros tipos

celulares, tais como enterócitos e células mononucleares do sangue periférico,

terem verificado efeitos opostos da glutamina sobre a expressão de genes que

codificam para citocinas quando a concentração desse aminoácido foi igual ou

superior a 2 mmol/L (WISCHMEYER et al., 2003; HUBERT-BURON et al., 2006).

As células foram inicialmente plaqueadas na concentração de 1x106

células/mL/poço em placas de cultura durante 2 horas a 37°C em atmosfera

contendo 5% de CO2. Após este período, o sobrenadante foi retirado a fim de

remover as células não aderentes e em seguida foi adicionado meio de cultura. As

amostras foram cultivadas por 24 horas com diferentes concentrações de glutamina

(0; 0,6; 2 e 10 mmol/L) em meio RPMI 1640, pH 7,4, estéril, apirogênico,

suplementado com soro fetal bovino (10%). Após 24 hs, as células foram incubadas

com 1,25 µg/mL de LPS de Eschericia coli, sorotipo 055:B5 (Sigma Chemical

Company, USA®), durante 30 minutos. Após esse período, o sobrenadante foi

36

retirado e armazenado em freezer a -40ºC, para determinação da concentração de

TNF- e IL-1α presente no sobrenadante das culturas celulares realizado pelo

método de ELISA (Enzyme Linked ImmnunoSorbent Assay) – kits R&D Systems.

As células aderentes foram lisadas por meio da adição em cada poço de

tampão RIPA (0,1 % SDS, 1 % Igepal CA-630, 1 % deoxicolato de sódio, 10 mM

Tris.HCL, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 µg/mL aprotinina, 1 µg/mL leupeptina, 100 µg/mL

PMSF, 0,5 mM EDTA). A partir desse lisado celular foram realizados os ensaios de

determinação das proteínas TRAF-6, IҡB-α, IҡB-α fosforilado, IKK, NF-ҡB e NF-ҡB

fosforilado por Western Blot .

4.11 DETERMINAÇÃO DA EXPRESSÃO DE TRAF-6, IKK, IҠB-α E IҠB-α

FOSFORILADO, NF-ҠB E NF-ҠB FOSFORILADO

A expressão do TRAF-6, IKK, IKB-α total, IKB-α fosforilado, NF-B total e NF-B

fosforilado em células mononucleares peritoniais, mantidos sob cultura como descrito

no item 4.10, foi determinado pela técnica de Western Blotting.

4.11.1 SDS-PAGE e “Western blotting”

4.11.1.2 Preparo do gel de poliacrilamida

O procedimento foi realizado conforme protocolo de SAMBROOK et al., (1989),

e HARLOW;LANE (1988), descrito sucintamente a seguir.

Foram preparados géis em bicamada, sendo a camada superior (gel de

empacotamento) constituída de acrilamida a 5%, 125 mM Tris pH 6,8, 0,1% SDS,

0,1% persulfato de amônio e 0,1 % TEMED. O gel inferior (resolutivo) foi preparado

com 6 a 10 % de poliacrilamida, 380 mM Tris.HCl, pH 8,8, 0,1 % persulfato de

amônio e 0,077 % TEMED.

4.11.1.3 Preparo de lisado de proteínas para SDS-PAGE e “Western blotting”

Os lisados foram preparados a partir de 1x106 células em tampão RIPA (0,1 %

SDS, 1 % Igepal CA-630, 1 % deoxicolato de sódio, 10 mM Tris.HCL, pH 7,5, 150

mM NaCl, 2 µg/mL aprotinina, 1 µg/mL leupeptina, 100 µg/mL PMSF, 0,5 mM

37

EDTA). O material foi sonicado (30 segundos), centrifugado por 10 minutos, a

2000xg, e 4 °C. O sobrenadante foi quantificado e um volume correspondente a 200

µg foi misturado ao tampão de amostra (3 x concentrado, 100 mM Tris.HCL, pH 6,8,

5 % 2-mercaptoetanol (v/v), 2 % SDS, 20 % glicerol, 0,01 % azul de bromofenol),

fervido por 10 minutos e submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida. Foi

utilizado a mistura pré-corada BenchMark (GIBCO BRL, MD, EUA) (5-10 µg de

proteína).

4.11.1.4 Transferência de proteínas do gel para a membrana (nitrocelulose)

O gel contendo as proteínas fracionadas por eletroforese foi incubado por 10

minutos em tampão de transferência (3 mM glicina, 48 mM Tris base, 0,037

% SDS , 20 % metanol, pH 8,3). Paralelamente, a membrana de nitrocelulose foi

hidratada e então também incubada em tampão de transferência. Um "sanduíche"

foi então montado na seguinte ordem: 3 folhas de papel filtro, membrana, gel, 3

folhas de papel filtro. A transferência foi realizada em cuba de eletroforese, na

presença de tampão de transferência, sob corrente de 200-400 mA, por 30-90

min.

A eficiência da transferência foi verificada corando-se a membrana por 5-

10 minutos com corante Ponceau (1% Ponceau, 1 % ácido acético), seguida de

lavagem com água destilada ou TBS (Tris, pH 7,5, 20 mM, NaCI 0,9 %).

4.11.1.5 Reatividade dos anticorpos frente as proteínas

Os sítios sem proteínas das membranas foram bloqueados com proteínas de

leite desnatado Molico, a 5 %, em tampão TBS, por 12 horas, sob agitação. O

anticorpo específico (anti TRAF-6, anti IKK, anti IҡB- total, anti IҡB-

fosforilado, anti NF-ҠB total e anti NF-ҠB fosforilado) foi diluído em TBS com

0,05% Tween 20 (TBST) e utilizado para a incubação com as membranas, por

12 horas, sob agitação, à temperatura ambiente. A membrana foi lavada 3

vezes, por 10 minutos, com TBST. As proteínas foram então sondadas com

anticorpo anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase de raiz forte, diluído

1:5.000 em TBST, por 2 horas, sob agitação. A membrana foi lavada 3 vezes, por

10 minutos, sob agitação.

38

4.11.6 Revelação com sistema Quimioluminescente

A revelação foi realizada utilizando-se o Kit ECL Plus (luminol, fenol e peróxido

de hidrogênio), com exposição das membranas em filmes de raio X. Para análise foi

utilizado o digitalizador de Imagem ImageQuant 400 (GE Helthcare).

4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados obtidos foram analisados utilizando-se o programa

GraphPadInstat Tm for Windows. Os dados foram primeiramente submetidos ao teste

de homocedasticidade da amostra e classificados em paramétricos ou não

paramétricos pela aderência à curva Normal (curva Gaussiana). Dados obtidos em

nossos experimentos foram submetidos à análise estatística do teste U e ANOVA e

considerados significativos quando o p 0,05.

39

5. RESULTADOS

5.1 AVALIAÇÃO DO CONSUMO DE ÁGUA, PROTEÍNAS, RAÇÃO E

VARIAÇÃO DO PESO CORPÓREO

Verificamos que animais que receberam dieta hipoprotéica consumiram

quantidades semelhantes de ração em relação aos animais do grupo controle, mas

houve uma significativa redução na ingestão de proteínas, já que a dieta

hipoprotéica contém apenas 2% de proteína. Não houve diferença significativa no

consumo de água. Os animais do grupo desnutrido apresentaram uma perda de

peso significativa em relação ao peso inicial, quando comparados com o grupo

controle.

Consumo de água

Controle Desnutrido0

2

4

6

8

Grupos

(mL

/dia

/an

imal)

Consumo de proteínas

Controle Desnutrido0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

***

Grupos

(g/d

ia/a

nim

al)

Consumo de ração

Controle Desnutrido0

1

2

3

4

5

6

Grupos

(g/d

ia/a

nim

al)

Variação Peso Corpóreo

-30

-20

-10

0

10

*

Grupos

Controle Desnutrido

(%)

Gráfico 1. Resultado, em valores médios o desvio padrão do consumo de água,

proteínas, ração e variação do peso corpóreo. Os animais do grupo controle (n=27

animais) e desnutrido (n=27 animais) receberam, respectivamente, a ração I e a

ração II. * Valores significativos para p 0,05. *** Valores significativos para p

0,001. n representa o número de animais avaliados.

40

5.2 ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE PROTEÍNAS TOTAIS,

ALBUMINA E PRÉ-ALBUMINA

Verificamos uma redução significativa nas concentrações de proteínas totais,

albumina e pré-albumina séricas nos animais desnutridos em relação ao grupo

controle, caracterizando o quadro de desnutrição.

Proteínas totais

Controle Desnutrido0

1

2

3

4

5

6

7

Grupos

*

(g/d

L)

Albumina

Controle Desnutrido0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

*

Grupos

(g/d

L)

Pré- albumina

Controle Desnutrido0

5

10

15

**

Grupos

(mg

/dL

)

Gráfico 2. Resultado, em valores médios o desvio padrão de proteínas totais,

albumina e pré-albumina dos animais do grupo controle e desnutrido. Os animais do

grupo controle (n=12 animais) e desnutrido (n=12 animais) receberam,

respectivamente, a ração I e a ração II. * Valores significativos para p 0,05. **

Valores significativos para p 0,01. n representa o número de animais avaliados.

41

5.3 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE GLUTAMINA PLASMÁTICA

Podemos observar que os animais do grupo desnutrido apresentaram uma

diminuição significativa dos níveis plasmáticos de glutamina (p 0,05) quando

comparado com animais do grupo controle.

Controle Desnutrido0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0*

Grupos

Glutamina

(mm

ol/

L)

Gráfico 3. Resultado, em valores médios o desvio padrão da concentração de

glutamina plasmática dos animais dos grupos controle (n=6) e desnutrido (n=6). *

p 0,05, quando comparamos ambos os grupos de animais. n representa o número

de animais avaliados.

5.4 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CORTICOSTERONA

Podemos observar que os animais do grupo desnutrido apresentaram um

aumento significativo dos níveis plasmáticos de corticosterona (p 0,05) quando

comparado com animais do grupo controle.

42

Controle Desnutrido0

5

10

15

20

25 *

Corticosterona

Grupos

(ng

/mL

)

Gráfico 4. Resultado, em valores médios o desvio padrão da concentração de

glutamina plasmática dos animais dos grupos controle (n=10) e desnutrido (n=10).

* p 0,05, quando comparamos ambos os grupos de animais. n representa o número

de animais avaliados.

5.5 HEMOGRAMA

5.5.1. Eritrograma

Os animais do grupo desnutrido apresentaram valores significativamente

menores (p 0,05) do número de eritrócitos, volume hematócrito e concentração de

hemoglobina , em relação aos respectivos controles.

Controle Desnutrido0

5

10

15

*

Grupos

Nú

mero

de E

ritr

ócit

os

(x 1

06/m

m3)

Controle Desnutrido0

5

10

15*

Grupos

He

mo

glo

bin

a(g

/dL

)

Controle Desnutrido0

10

20

30

40

50

*

Grupos

He

ma

tóc

rito

(%)

Gráfico 5. Resultado, em valores médios o desvio padrão do número eritrócitos,

dosagem de hemoglobina, volume hematócrito dos animais dos grupos controle

(n=10) e desnutrido (n=10). * p 0,05, quando comparamos ambos os grupos de

animais. n representa o número de animais avaliados.

43

5.5.2. Leucograma

Os animais do grupo desnutrido, quanto ao número de leucócitos apresentaram

diferença estatísticamente significativa, em relação ao grupo controle. Podemos

observar que os animais do grupo desnutrido apresentaram leucopenia com

acentuada neutropenia em relação aos respectivos controles (Gráfico5).

Controle Desnutrido0

1000

2000

3000

4000

**

Grupos

Le

uc

óc

ito

s

(/m

m3)

Controle Desnutrido0

5

10

15

20

25

*

Grupos

Ne

utr

ófi

los

(%)

Controle Desnutrido0

200

400

600

800

***

Grupos

Ne

utr

ófi

los

(/m

m3)

Controle Desnutrido0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Grupos

Eo

sin

ófi

lo

(%)

Controle Desnutrido0

10

20

30

Grupos

Eo

sin

ófi

lo

(/m

m3)

Controle Desnutrido0.0

0.2

0.4

0.6

Grupos

Ba

só

filo

(%)

Controle Desnutrido0

5

10

15

20

Grupos

Ba

só

filo

(/m

m3)

Controle Desnutrido0

20

40

60

80

100 *

Grupos

Lin

fóc

ito

(%)

Controle Desnutrido0

500

1000

1500

2000

2500

**

Grupos

Lin

fóc

ito

(/m

m3)

Controle Desnutrido0

50

100

150

*

Grupos

Mo

nó

cit

o

(/m

m3)

Controle Desnutrido0

1

2

3

4

5

Grupos

Mo

nó

cit

o

(%

)

Controle Desnutrido0

200

400

600

800

Grupos

Pla

qu

eta

s

(x

10

3/m

m3)

Gráfico 6 . Resultado, em valores médios o desvio padrão do número de

leucócitos, do número de bastonetes, segmentados, linfócitos, monócitos e

eosinófilos presentes no sangue dos animais dos grupos controle (n=10) e

desnutrido (n=10). * p 0,05 quando comparamos ambos os grupos de animais, **

p 0,01 quando comparamos ambos os grupos de animais, *** p 0,001 quando

comparamos ambos os grupos de animais. n representa o número de animais

avaliados.

44

5.6 AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DA MEDULA OSSEA

A análise do quadro hematológico medular dos animais desnutridos evidenciou

hipoplasia com significativa redução no número de células nucleadas blásticas e na

série granulocítica, além de significativa redução na série eritrocitária plasmocitária e

monocítica, porém não observamos diferenças significativas nas contagens de

linfócitos (Gráfico 7).

Controle Desnutrido0

2

4

6

8

10

Nú

me

ro d

e c

élu

las

(x1

06/m

L)

Número de células totais

**

Grupos

Controle Desnutrido0

2

4

6

8N

úm

ero

de

cé

lula

s

(x10

5/m

L)

Blastos

*

Grupos

Controle Desnutrido0

2

4

6

8

10

Nú

me

ro d

e c

élu

las

(x10

5/m

L)

Formas Jovens

*

Grupos

Controle Desnutrido0

5

10

15

20

Nú

me

ro d

e c

élu

las

(x1

05/m

L)

Forma Anel

*

Grupos

Controle Desnutrido0

5

10

15

20

25

Segmentado

Nú

me

ro d

e c

élu

las

(x1

05/m

L)

*

Grupos

Controle Desnutrido0

1

2

3

Eosinófilo

Nú

me

ro d

e c

élu

las

(x1

05/m

L) *

Grupos

Controle Desnutrido0

10

20

30

Série Linfocitária

Nú

me

ro d

e c

élu

las

(x1

05/m

L)

Grupos

Controle Desnutrido0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Plasmócitos

Nú

me

ro d

e c

élu

las

(x1

05/m

L)

*

Grupos

Controle Desnutrido0

1

2

3

Linhagem Mono-Macrofágica

Nú

me

ro d

e c

élu

las

(x1

05/m

L)

*

Grupos

Controle Desnutrido0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Eritroblastos Jovens

*

Grupos

Nú

me

ro d

e c

élu

las

(x1

05/m

L)

Controle Desnutrido0

2

4

6

8

Eritroblastos Policromáticos

*

Grupos

Nú

me

ro d

e c

élu

las

(x1

05/m

L)

Controle Desnutrido0

2

4

6

8

Nú

me

ro d

e c

élu

las

(x10

5/m

L)

Eritroblastos Ortocromáticos

*

Grupos

Gráfico 7. Resultado, em valores médios o desvio padrão do número total de

células nucleadas e dos diferentes tipos celulares presentes na medula óssea de

camundongos do grupo controle (n=10) e desnutrido (n=10). * p 0,05, quando

45

comparamos ambos os grupos de animais. ** p 0,01 quando comparamos ambos

os grupos de animais, n representa o número de animais avaliados.

5.7 LAVADO PERITONIAL

O número total de células no lavado peritonial de animais desnutrido foi

estatisticamente menor quando comparado ao grupo controle. Os animais do grupo

desnutrido apresentaram também diminuição das células mononucleares e

polimorfonucleadas, em relação ao grupo controle (Gráfico 8).

Controle Desnutrido0

1

2

3

*

Grupos

Célu

las T

ota

is

(x 1

06/m

L)

Controle Desnutrido0

50

100

150

Grupos

Mo

no

nu

cle

are

s

(%)

Controle Desnutrido0

1

2

3

*

Grupos

Mo

no

nu

cle

are

s

(x 1

06/m

L)

Controle Desnutrido0.0

0.2

0.4

0.6

Grupos

Ma

stó

cit

os

(%)

Controle Desnutrido0.000

0.005

0.010

0.015

Grupos

Ma

stó

cit

os

(x 1

06/m

L)

Controle Desnutrido0

2

4

6

8

Grupos

Se

gm

en

tad

os

(%)

Controle Desnutrido0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

*

Grupos

Se

gm

en

tad

os

(x 1

06/m

L)

Gráfico 8 . Resultado, em valores médios o desvio padrão do número de células

totais, mononucleadas e polimorfonucleadas no lavado peritonial de camundongos

do grupo controle (n=10) e desnutrido (n=10). * p 0,05, quando comparamos

ambos os grupos de animais. n representa o número de animais avaliados.

46

5.8 ANÁLISE IMUNOFENOTÍPICA (ENSAIOS EX VIVO)

O perfil das diferentes populações celulares não marcadas no lavado peritonial

de camundongos dos grupos desnutrido e controle, obtidos por citometria de fluxo,

encontram-se no gráfico 9. As letras (A) e (B) representam os respectivos controles

de cadeias isotípicas.

Gráfico 9. Representação gráfica do resultado da imunofenotipagem da população

total de células do lavado peritonial de camundongos do grupo controle e desnutrido,

sendo a aquisição de 104 células realizada em citômetro de fluxo contendo laser de

argônio 488nm, FACS Calibur – Becton Disckinson. A imunofenotipagem mostra as

regiões selecionadas – gate R1 e gate R2 - das populações celulares não marcadas

com fluorcromos. SSC na ordenada vs. FCS na abscissa. Dispersão lateral (side

scatter channel – SSC – ângulo reto de 90) e Dispersão frontal (foward scatter

channel – FSC – ângulos pequenos 0,5 a 1,0). O controle do isotipo corresponde (A)

FL2= IgG 1 rat PE vs.FL1= IgG 2b rat FITC e (B) FL2= IgG2a rat PE vs. FL1=

IgG 2b rat FITC. Resultado de um experimento representativo de três experimentos

independentes.

FL

2-H

eig

ht

100 101 102 103 104

FL1-Height

FL

2-H

eig

ht

100 101 102 103 104

FL1-Height

FL

2-H

eig

ht

100 101 102 103 104

FL1-Height

FL

2-H

eig

ht

100 101 102 103 104

FL1-Height

A

B

R1

R2

R1

R2

Controle DesnutridoF

L2

-He

igh

t

100 101 102 103 104

FL1-Height

FL

2-H

eig

ht

100 101 102 103 104

FL1-Height

FL

2-H

eig

ht

100 101 102 103 104

FL1-Height

FL

2-H

eig

ht

100 101 102 103 104

FL1-Height

FL

2-H

eig

ht

100 101 102 103 104

FL1-Height

FL

2-H

eig

ht

100 101 102 103 104

FL1-Height

FL

2-H

eig

ht

100 101 102 103 104

FL1-Height

FL

2-H

eig

ht

100 101 102 103 104

FL1-Height

A

B

R1

R2

R1

R2

Controle Desnutrido

47

A imunofenotipagem demonstra no gráfico 10, que a população no gate R1 é

negativa para a dupla marcação CD14, F4/80 em ambos os grupos, porém

observamos a presença de populações marcadas para o CD14 e F4/80 (Gate R2),

nos ensaios ex vivo de células do lavado peritonial de camundongos do grupo

desnutrido e controle, sendo que os animais do grupo desnutrido apresentaram menor

intensidades de fluorescência (R2= 50,1 da região selecionada, gate 2) em relação

aos animais do grupo controle (R2= 61,1% da região selecionada, gate 2).

Gráfico 10. Representação gráfica da imunofenotipagem das populações celulares do

lavado peritonial de camundongos do grupo desnutrido e controle, sendo a aquisição

de 104 células realizada em citômetro de fluxo contendo laser de argônio 488nm,

FACS Calibur – Becton Disckinson. A partir da região selecionada os resultados do

CD14 e F4/80 foram expressos em ―dot plot‖: ordenada (SSC e abscissa (FSC)

mostrando a janela eletrônica (―gate‖ R1 e R2) referente a expressão de CD14 e

F4/80. * p 0,01, quando comparamos o grupo controle com o grupo desnutrido .

CD

14

Controle

F4/80

71,21%

6,33%3,70%

58,08%58,08%

R1

R2

0,8 ± 0,2 % 0,3 ± 0,1 %

61,1 ± 4,7 % * 50,1 ± 2,9 %

Desnutrido

CD

14

Controle

F4/80

71,21%

6,33%3,70%3,70%

58,08%58,08%

R1

R2

0,8 ± 0,2 % 0,3 ± 0,1 %

61,1 ± 4,7 % * 50,1 ± 2,9 %

Desnutrido

48

No gráfico 11 observamos que a intensidades de fluorescência para o TLR-

4/MD-2 e F4/80, foi menor nos animais do grupo desnutrido em relação aos animais

do grupo controle, sendo que a população do ―gate‖ R1 a marcação foi muito baixa

em ambos os grupos.

Gráfico 11. Representação gráfica da imunofenotipagem das populações celulares do

lavado peritonial de camundongos do grupo desnutrido e controle, sendo a aquisição

de 104 células realizada em citômetro de fluxo contendo laser de argônio 488nm,

FACS Calibur – Becton Disckinson. A partir da região selecionada os resultados do

TLR-4/MD-2 e F4/80 foram expressos em ―dot plot‖: ordenada (SSC e abscissa (FSC)

mostrando a janela eletrônica (―gate‖ R1 e R2) referente a expressão de TLR-4/MD-2

e F4/80. * p 0,01, quando comparamos o grupo controle com o grupo desnutrido.

3,70%0,5 ± 0,2 %0,8 ± 0,2 %

TL

R-4

/MD

-2

Controle Desnutrido

R1

R2

F4/80

9,3 ± 0,9%14,2 ± 0,5% *

3,70%0,5 ± 0,2 %0,8 ± 0,2 %

TL

R-4

/MD

-2

Controle Desnutrido

R1

R2

F4/80

9,3 ± 0,9%14,2 ± 0,5% *

49

5.9 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE TNF- E IL-1α

Nos resultados apresentados no gráfico 12 podemos observar que animais de

ambos os grupos apresentaram diminuição da capacidade de produção de TNF- e

IL-1 quanto maior a concentração de glutamina. Após 30 minutos de estímulo com

LPS, in vitro, nas culturas com células mononucleares peritoniais suplementadas

com 2 mmol/L e 10 mmol/L observamos menor capacidade de animais desnutridos

produzirem TNF-.

Gráfico 12. Resultado, em valores médios o desvio padrão da concentração de

TNF- e IL-1 α produzido por células macrofágicas de camundongos do grupo

controle (n=10) e desnutrido (n=10) estimuladas, in vitro, durante 30 minutos com

1,25 g de LPS e cultivadas na presença de diferentes concentrações de glutamina.

* p 0,05 quando comparado o grupo controle com o respectivo grupo desnutrido. a

p 0,05 quando comparado o grupo controle 0 mmol/L glutamina com outros grupos

controle. b p 0,05 quando comparado o grupo desnutrido 0 mmol/L glutamina com

os demais grupos desnutridos.

TNF-

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0

200

400

600

800

1000

*a

*

a

(Glutamine mmo/L)

(pg

/mL

)

IL-1

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0

200

400

600 a

a a

b

bb b

(Glutamine mmo/L)

pg

/mL

TNF-

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0

200

400

600

800

1000

*a

*

a

(Glutamine mmo/L)

(pg

/mL

)

IL-1

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0

200

400

600 a

a a

b

bb b

(Glutamine mmo/L)

pg

/mL

50

5.10 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE IL-10

Os perfis de produção de IL-10 após 30 minutos de estímulo com LPS, in vitro,

nas culturas com células mononucleares peritoniais foram bastante similares.

Entretanto células peritoniais de animais do grupo desnutrido independente da

concentração de glutamina que foram cultivadas apresentaram maior produção de

IL-10 quando comprado com os respectivos grupos controles.

Gráfico 13. Resultado, em valores médios o desvio padrão da concentração de IL-

10 produzido por células peritoniais de camundongos do grupo controle (n=10) e

desnutrido (n=10) estimuladas, in vitro, durante 30 minutos com 1,25 g de LPS e

cultivadas na presença de diferentes concentrações de glutamina. * p 0,05 quando

comparado o grupo controle com o respectivo grupo desnutrido.

IL-10

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0

20

40

60

80

100

**

* *

(Glutamine mmo/L)

(pg

/mL

)

IL-10

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0

20

40

60

80

100

**

* *

(Glutamine mmo/L)

(pg

/mL

)

51

5.11 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO TOTAL DE TRAF-6

A avaliação da expressão de TRAF-6 evidenciou que células peritoniais de

animais desnutridos quando cultivadas com 2 mmol/L ou 10 mmol/L de glutamina

por 24 horas e estimuladas com 1,25 g de LPS por 30 minutos apresentam menor

expressão de TRAF-6 quando comparado com os respectivos controles.

Gráfico 14. Resultado, em valores médios o desvio padrão da quantificação de

TRAF-6 em células peritoniais de camundongos do grupo controle (n=6) e

desnutrido (n=6) estimuladas, in vitro, durante 30 minutos com 1,25 g de LPS e

cultivadas na presença de diferentes concentrações de glutamina. * p 0,05 quando

comparado o grupo controle com o respectivo grupo desnutrido.

TRAF-6

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

*

*

Glutamina mmol/L

(U/A

)

TRAF-6

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

*

*

Glutamina mmol/L

(U/A

)

52

5.12 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO TOTAL DE IKK

A expressão de IKK não apresentou diferenças estatisticamente significativas

quando comparado os diferentes grupos entre si.

Gráfico 15. Resultado, em valores médios o desvio padrão da quantificação de

IKK em células peritoniais de camundongos do grupo controle (n=6) e desnutrido

(n=6) estimuladas, in vitro, durante 30 minutos com 1,25 g de LPS e cultivadas na

presença de diferentes concentrações de glutamina.

5.13 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE IҠB- TOTAL E IҠB-

FOSFORILADO

A avaliação da expressão de IҡB- total de células peritoniais de animais

desnutridos apresentou diferença estatisticamente significativa quando comparada

IKK

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Glutamina mmol/L

(U/A

)

IKK

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Glutamina mmol/L

(U/A

)

53

com os respectivos controles quando cultivada com 2mmol/L de glutamina por 24

horas e estimulada com 1,25 g de LPS por 30 minutos. A expressão do IҡB-

fosforilado apresentou diferenças estatisticamente significativas quando comparado

os grupos desnutridos 0, 2 e 10 mmol/l de glutamina como respectivos controles.

Células de animais controles cultivadas na ausência de glutamina apresentaram

maior expressão de IҡB- fosforilado quando comparado com células de animais

controles cultivadas na presença de 2 ou 10 mmol/L de glutamina. Células de

animais desnutridos apresentaram maior expressão IҡB- fosforilado na

concentração 0,6 mmol/L sendo esta diferente estatisticamente dos grupos

desnutridos 2 e 10mmol/L de glutamina.

Gráfico 16. Resultado, em valores médios o desvio padrão da quantificação de

IҡB-α e p-IҡB-α em células peritoniais de camundongos do grupo controle (n=6) e

desnutrido (n=6) estimuladas, in vitro, durante 30 minutos com 1,25 g de LPS e

cultivadas na presença de diferentes concentrações de glutamina. * p 0,05 quando

comparado o grupo controle com o respectivo grupo desnutrido. a p 0,05 quando

comparado o grupo controle 0 mmol/L glutamina com os demais grupos controle, b p

0,05 quando comparado o grupo desnutrido 0,6 mmol/L glutamina com os demais

grupos desnutrido.

p IkB-

C0 D0 C0,6 D0,6 C2 D2 C10 D100.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0a

*

a

*,b

b

*,b

a

Glutamina mmol/L

(U/A

)

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Glutamina mmol/L

*

IkB-

(U/A

)

p IkB-

C0 D0 C0,6 D0,6 C2 D2 C10 D100.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0a

*

a

*,b

b

*,b

a

Glutamina mmol/L

(U/A

)

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Glutamina mmol/L

*

IkB-

(U/A

)

54

5.14 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE NF-ҠB TOTAL E NF-ҠB

FOSFORILADO

A avaliação da expressão de NF-ҡB total de células peritoniais de animais

desnutridos e animais controle apresentaram maior expressão quando as células

foram cultivadas na presença de 10mmol/L de glutamina por 24 horas e estimulada

com 1,25 g de LPS por 30 minutos.

A expressão do NF-ҡB fosforilado apresentou gradativa redução de sua

expressão de acordo com a concentração de glutamina nas quais as células foram

cultivadas. Quanto maior a concentração de glutamina menor foram os resultados

referentes à expressão do NF-ҡB fosforilado. Células de animais desnutridos

apresentaram menor expressão de NF-ҡB fosforilado quando comparado com os

respectivos grupos controle.

Gráfico 17. Resultado, em valores médios o desvio padrão da quantificação de

NF-ҡB e pNF-ҡB em células peritoniais de camundongos do grupo controle (n=6) e

desnutrido (n=6) estimuladas, in vitro, durante 30 minutos com 1,25 g de LPS e

cultivadas na presença de diferentes concentrações de glutamina. * p 0,05 quando

comparado o grupo controle com o respectivo grupo desnutrido. a p 0,05 quando

comparado o grupo controle 0 mmol/L glutamina com os demais grupos controle, b p

0,05 quando comparado o grupo desnutrido 0 mmol/L glutamina com os demais

NFB

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

*,d

e

e

d d

Glutamina mmol/L

U/A

p NF-B

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

*,b

**,b

a

a,c

b c

Glutamina mmol/L

U/A

NFB

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

*,d

e

e

d d

Glutamina mmol/L

U/A

p NF-B

0C 0D 0,6C 0,6D 2C 2D 10C 10D0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

*,b

**,b

a

a,c

b c

Glutamina mmol/L

U/A

55

grupos desnutrido. c p 0,05 quando comparado o grupo controle 0,6 mmol/L

glutamina com os demais grupos controle, d p 0,05 quando comparado o grupo

desnutrido 10 mmol/L glutamina com os demais grupos desnutrido, e p 0,05

quando comparado o grupo controle 10 mmol/L glutamina com os demais grupos

controle.

56

6. DISCUSSÃO

A desnutrição, nos mais variados graus, ainda constitui sério problema de

saúde pública, principalmente em países em desenvolvimento, porém não estando

restrita a estes (MONTEIRO, 2003). A desnutrição protéica e protéico-energética

acarreta diversas alterações fisiológicas sendo a causa mais comum de deficiência

imune secundária em todo o mundo, levando a atrofia de órgãos linfóides, do timo,

deficiência de células T, aumento da susceptibilidade a infecções, reativação de

infecções virais e desenvolvimento de infecções oportunistas (CUNNINGHAM-

RUNDLES et al., 2005).

Até a década de 50, havia pouca ligação entre a interação nutrição-infecção. Já

em meados da década de 60, pesquisas realizadas no Sul da África, Chile e América

Central, demonstraram uma interação entre nutrição, imunidade e infecção, os quais

demonstraram as interações cíclicas do binômio desnutrição-infecção (KEUSH,

2003; KATONA;KATONA-APTE, 2008). Atualmente, é bem definido na literatura

que uma dieta deficiente em proteínas compromete o sistema imune alterando os

mecanismos de defesa do indivíduo, que são dependentes de uma dieta equilibrada

em proteínas, vitaminas e minerais. A nutrição desempenha um papel central no

sistema imune inato (não-específico) e adaptativo (adquirido-específico) consistindo

na manutenção da resposta imune, sendo que a deficiência desses compostos

acarreta a predisposição do organismo frente a agentes infecciosos (FIELD et al.,

2002; LI et al., 2007).

Neste trabalho, optamos pela indução de uma desnutrição protéica devido a

sua elevada endemicidade em países em desenvolvimento, e que não

coincidentemente, são as áreas em que predominam doenças infecciosas e altos

índices de mortalidade. A desnutrição protéica e protéico-energética são as formas

mais frequentes de desnutrição em pacientes hospitalizados, pacientes portadores

de neoplasias ou doenças crônicas, pacientes sob quimioterapia ou ainda indivíduos

que fazem dietas radicais (WAITZBERG et al., 1999; MARCOS, 2000;

BRUNDTLAND, 2000; GADDUCCI et al., 2001; AKNER et al., 2001; NOVA et al.,

2002; KEUSCH, 2003).

Neste modelo de desnutrição as rações foram elaboradas considerando os

teores de vitaminas, ácidos graxos e sais minerais necessários para fornecer uma

dieta adequada, restringindo-se apenas a quantidade de proteína da ração ofertada

57

(ração hipoprotéica) (REEVES et al.,1993). Na elaboração das rações utilizamos

caseína que é uma proteína de alto valor biológico. Em nosso estudo os

camundongos que receberam a dieta, ad libitum, deficiente em proteínas (ração

hipoprotéica, contendo 2% de proteínas), consumiram quantidade semelhante de

ração em relação aos animais controles, porém apresentaram uma significativa

perda de peso corpóreo de aproximadamente 20% do peso corpóreo inicial.

Ao desenvolvermos a desnutrição experimental optamos por trabalhar com

camundongos BALB/c, isogênicos, machos, visando maior uniformidade dos grupos,

evitando-se as flutuações hormonais que ocorrem durante o ciclo estral nas fêmeas.

Utilizamos ainda, animais adultos cuja estabilização do sistema hemopoético já foi

atingida, uma vez que, tanto em animais quanto em humanos ocorrem importantes

modificações fisiológicas na hemopoese em função da idade (BANNERMAN, 1993).

A perda de aproximadamente 20% do peso corpóreo inicial, associados aos valores

do hemograma, da concentração de proteínas totais, albumina e pré-albumina

séricas, mostraram-se como bons indicadores na avaliação da desnutrição protéica.

Nossos resultados também demonstram menores níveis plasmáticos de

glutamina nos animais do grupo desnutrido, o que em parte pode ser explicado pelo

estresse fisiológico causado pela desnutrição, onde a demanda é maior que a

produção, estabelecendo um quadro de deficiência de glutamina. Uma dieta

hipoprotéica acarreta diversas alterações fisiológicas, entre elas a liberação de

hormônios como a corticosterona que estimula a perda muscular. Isso pode explicar

a diminuição de glutamina plasmática nos animais do grupo desnutrido, uma vez que

o músculo esquelético é o principal sítio de síntese de glutamina e nossos resultados

demonstram que animais desnutridos apresentam maior nível de corticosterona

circulante.

Outro ponto chave no aumento da demanda de glutamina pelo organismo na

desnutrição seria justificado pelo fato que, na desnutrição o organismo comporta-se

como no jejum prolongado, onde os processos degradativos estão acentuados,

sendo a glutamina um aminoácido utilizado durante a gliconeogênese. Há, portanto,

um aumento da captação hepática desse aminoácido, o que poderia levar a uma

diminuição dos níveis no plasma (COLLEONE et al., 2000).

Em estudos anteriores (BORELLI et al., 2007; FOCK et al., 2007; 2010), nosso

grupo demonstrou que a leucopenia e a anemia estão associadas a uma hipoplasia

medular e esplênica especialmente importante no setor mielóide. Nesse trabalho

58

também encontramos anemia, com diminuição do número de eritrócitos, da

concentração de hemoglobina e volume do hematócrito. Dados do nosso grupo têm

demonstrado que a anemia vista nesses animais não é ferropriva e sim devido à

diminuição nos progenitores eritróides na medula óssea e que os mesmos são

hiporresponsivos ao estímulo com eritropoetina (BORELLI et al., 2007).

Também observamos leucopenia no sangue periférico dos animais do grupo

desnutrido e dados do nosso laboratório têm demonstrado que em situações onde a

desnutrição não está associada a outras doenças, a leucopenia é a regra (BORELLI

et al., 2007; FOCK et al., 2007; 2010).

Macrófagos ativados desempenham papel relevante na respostas imune e

inflamatória, por meio da liberação de uma variedade de mediadores que incluem

lipídios, espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, quimiocinas e citocinas

(BEUTLER, 1990; LEE et al., 2003). Nesse contexto, nosso grupo já havia

demonstrado diminuição da capacidade de síntese de citocinas pró-inflamatórias em

um modelo de desnutrição, no entanto esses resultados foram obtidos em animais

não isogênicos (FOCK et al., 2007). No atual trabalho, também, demonstramos que

células obtidas do lavado peritoneal de animais isogênicos desnutridos apresentam

menor capacidade de síntese de TNF-, bem como IL-1 e aumento da produção de

IL-10.

A síntese de TNF-α e IL-1 in vitro em macrófagos ativados por LPS está

relacionada ao fato dessa endotoxina ativar essas células, inicialmente, por meio da

sua ligação às proteínas CD14 e TLR4, que estão presentes na membrana

plasmática (MIYAKE, 2003). Esse fato acarreta na ativação de moléculas envolvidas

na transdução do sinal até culminar com a fosforilação do inibidor do NF-ҡB (IҡB-α).

Isto resulta na degradação do IҡB-α e, subsequente liberação e translocação do NF-

ҡB para o núcleo, onde o NF-ҡB promove a ativação de genes, entre eles os que

codificam a produção de TNF-α e IL-1 (BEUTLER;RIETSCHEL, 2003; BEUTLER et

al., 2006).

Nesse trabalho, avaliamos a capacidade da glutamina, in vitro, em modular

células obtidas do lavado peritoneal quando estimuladas com LPS. Especificamente

avaliamos o efeito da glutamina sobre a via de sinalização do fator de transcrição

NF-ҡB e a ação sobre a síntese de citocinas como TNF-α, IL-1 e IL-10.

Nossos resultados demonstram que células cultivadas na presença de

glutamina apresentam menor capacidade de produzir TNF-, bem como IL-1. Esses

59

resultados foram obtidos em ambos os grupos, onde observamos um efeito dose

dependente e paralelamente um aumento da concentração de IL-10. Todavia células

de animais desnutridos, mesmo suplementadas com glutamina, apresentaram menor

capacidade de produção de TNF-, bem como IL-1 e aumento de IL-10.

No presente estudo foi verificado que a ativação de macrófagos com LPS

acarretou em redução da expressão da proteína IҡB-α fosforilado, sendo que quanto

maior a dose de glutamina maior a redução da expressão de IҡB-α fosforilado e

paralelamente menor expressão de NF-ҡB fosforilado. Esses resultados corroboram

com os resultados encontrados para a produção de citocinas pró-inflamatórias, onde

observamos diminuição de TNF- e IL-1.

Esse fato pode ser explicado, em parte, pela capacidade da glutamina de

aumentar intracelularmente a quantidade de GSH (glutationa reduzida) reduzindo a

atividade de kinases sensíveis ao estado redox. Sendo assim, não há liberação do

NF-ҡB para o núcleo. O NF-ҡB encontra-se no citoplasma celular na forma inativa

devido a sua associação com o IҡB e sendo sensível ao estado redox celular, onde

pode ser fosforilado, ubiquitinado e posteriormente degradado pelo proteossoma

26S, liberando o NF-ҡB e sua translocação para o núcleo, onde irá se ligar a

sequências específicas no DNA regulando a transcrição de diversos genes (ROTH

et al., 2002; CAAMAÑO;HUNTER, 2002; LI;VERMA, 2002). A literatura demonstra

que células cultivadas com glutamina apresentam um aumento na concentração de

GSH e que a suplementação in vitro com glutamina é capaz de inibir a produção de

TNF-α por células do epitélio alveolar quando estimuladas com LPS (ROTH et al.,

2002; ZHANG et al., 2009).

Wischmeyer et al., (2003), também relatam que a suplementação in vitro com

glutamina acima de 4 mmol/L possui capacidade de diminuir a produção de TNF-α

em células mononucleares do sangue periférico estimuladas in vitro com LPS,

enquanto Cruzat et al., (2009) demonstrou in vivo que a suplementação com L-

glutamina na forma livre ou como dipeptídio diminui a liberação de TNF-α

imediatamente após o exercício intenso e que a razão GSH/GSSH no músculo sóleo

e no fígado apresenta-se maior.

Estudos revelam que a glutamina diminui a produção de IL-1, IL-6, e IL-8, e

aumenta a produção de IL-10 na mucosa duodenal de humanos (COEFFIER et al.,

2001; 2003). Hubert-Buron et al., (2006), avaliaram os efeitos do pré-tratamento com

glutamina nas células epiteliais do intestino humano na ubiquitinação do IҡB-α.

60

2 BONE, R.C.;BALK, R.A.; CERRA, F.B. Definitions for sepsis and organ failure guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The

ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine. Chest. v.101,p.1644-1655, 1992.

Entretanto os efeitos da suplementação com glutamina na degradação do IkB-α

não estão bem esclarecidos. Hubert-Buron et al., (2006), também, demonstraram

que a ativação de NF-ҡB está diminuída nas células epiteliais do intestino e que a

glutamina reduz a produção de citocinas pró-inflamatórias, e que na presença de 10

mM de glutamina leva a uma menor expressão de IkB-α ubiquitinado e a um

aumento do IҡB-α livre, mostrando que a glutamina pode influenciar na ubiquitinação

de IҡB-α regulando enzimas especificas do processo de ubiquitinação.

De acordo com Singleton;Wischmeyer (2008), a glutamina tem apresentado

efeito antiinflamatório em modelo experimental de sepse. Este efeito tem sido

associado com a diminuição da ativação do NF-ҡB.

Outra hipótese para a diminuição da produção de citocinas pró-inflamatória e o

aumento da síntese de IL-10 está relacionado à síndrome da resposta anti-

inflamatória compensatória (CARS). Na desnutrição, existe um mecanismo de

adaptação ao estado metabólico. Um descontrole do estado de inflamação poderia

levar a falência total da defesa do organismo contra agentes infecciosos. O conceito

de CARS foi proposto em 1997 por Roger Bone (BONE2 et al., 1992 apud ADIB-

CONQUY;CAVAILLON, 2008).

A síndrome da reposta inflamatória sistêmica (SIRS), foi caracterizado em

meados da década de 90, conceituado pela excessiva produção de mediadores pró-

inflamatórios. Estudos têm demonstrado que existe uma relação SIRS/CARS, e que

na CARS ocorre à desativação parcial do sistema imune, restaurando a homeostase

devido ao estado inflamatório (WARD et al., 2008). Nas infecções, as células da rede

do sistema imune inato apresentam receptores de superfície para reconhecer e

reagir a microorganismos, como apresentação de antígenos, expansão e ativação

de linhagens de células tal como polimorfonucleares e linfócitos B, aumento da

produção de IL-1 e TNF-α. A presença dessas citocinas pode levar a outras

manifestações clínicas, tal como febre e vasodilatação (WARD et al., 2008; ADIB-

CONQUY;CAVAILLON, 2008; OSUCHOWSKI et al., 2006). A CARS reverte muitos

desses processos de profundo impacto no paciente, podendo causar a redução da

proliferação de linfócitos e a diminuição da produção de citocinas. Em monócitos

leva a redução da expressão de CD14, CD71, CD86, GM-CSF, redução da produção

de IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 e TNF-α em resposta ao estímulo com LPS, e a redução da

fagocitose (WARD et al., 2008; ADIB-CONQUY;CAVAILLON, 2008).

61

7. CONCLUSÃO

Nosso trabalho demonstra que macrófagos peritoniais de animais desnutridos

quando suplementados com glutamina e estimulados com LPS, apresentam uma

diminuição da síntese de TNF-α e IL-1, decorrente da alteração na modulação na via

de sinalização do fator de transcrição NF-ҡB, sendo essa resposta dose-dependente

da concentração de glutamina.

62

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ADIB-CONQUYI, M.; CAVAILLON, J.M. Compensatory anti-inflammatory response syndrome. Journal of Thrombosis and Homeostasis, v.101, p.36-47, 2009.

AUGUSTO, A. P. Terapia Nutricional. São Paulo: Atheneu. p. 28-35, 1995.

AKASHI, S.; OGATA, H.; KIRIKAE, F.; KIRIKAE T.; KAWASAKI, K.; NISHIJIMA, M.; SHIMAZU, R.; NAGAI, Y.; FUKUDOME, K.; KIMOTO, M.; MIYAKE, K. Regulatory roles for CD14 and phosphatidylinositol in the signaling via toll-like receptor 4-MD-2. Biochemestry and Biophysical Research Communications, v. 268, p.172-177, 2000.

AKNER,G.; CEDERHOLM, T. Treatment of protein-energy malnutrition in chronic nonmalignant disorders. American Journal of Clinical Nutrition, v. 74, p. 6-24, 2001.

BANNERMAN, R. M. Hematology. In: FOSTER, H. L.; SMALL, J. D.; FOX, J. G. The mouse in biomedical research: normative biology, immunology, and husbandry. (American College of Laboratory Animal Medicine Series) New York: Academic Press, v.3, p. 293-304, 1993.

BARON, R.B. Desnutrição protéico-calórica. In: Bennett, J.C.; PlUM, F.; Tratado de medicina interna. 20a ed. Editora Guanabara-Koogan, Rio de Janeiro: v. 1, p. 1273-1277, 1997.

BEISEL, W.R. Impact of infection on nutritional status: definition of the problem and objectives of workshop. American Journal of Clinical Nutrition, v. 20, p. 1206-12-10, 1977.

BEISEL, W.R. Metabolic effects of infection. Program Food Nutrition Science. Oxford, v.8, p.43-75, 1984.

BEUTLER, B. Science review: Key inflammatory and stress pathways in critical illness – the central role of the Toll-like receptors. Critical Care, v.7, p. 39-46, 2003.

BEUTLER, B.; JIANG, Z.; GEORGEL, P.; CROZAT, K.; CROKER, B.; RUTSCHMANN, S.; DU, X.; HOEB, K. Genetic analysis of host resistance: Toll-like receptor signaling and immunity at large. Annual Reviews Immunology, v. 24, 353-389, 2006.

BEUTLER, B.; RIETSCHEL, E.T. Innate immune sensing and its roots: the story of endotoxin. Nature Reviews Immunology, v.3, p.169-176, 2003.

BEUTLER, B. Innate immunity: an overview. Molecular Immunology, v.40, p.845-859, 2004.

63

BEUTLER, B. TNF in pathophysiology biosynthetic regulation. Journal Investigative Dermatology, v. 95, p. 81S-84S, 1990.

BILLACK B. Macrophage activation: role of toll-like receptors, nitric oxide, and nuclear factor kappa B. American Journal Pharmacology Education, v. 15, p.70-102, 2006.

BORELLI, P.; BLATT, S.; PEREIRA, J.; MAURINO, B. B.; TSUJITA, M.; SOUZA, A. C.; XAVIER, J. G.; FOCK, R. A. Reduction of erythroid progenitors in protein energy malnutrition, British Journal of Nutrition, v. 97, p. 307-314, 2007.

BORELLI, P.; BARROS, F.E.V.; NAKAJIMA, K.; BLATT, S.L.; BEUTLER, B.; PEREIRA, J.; TSUJITA, M.; FAVERO, G.M.; FOCK, R.A. Protein-energy malnutrition halts hemopoietic progenitor cells in the G0/G1 cell cycle stage, thereby altering cell production rates. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 42, p. 523-530, 2009.

BORELLI, P.; MARIANO, M.; BOROJEVIC, R. Protein malnutrition: effect on myeloid cell production and mobilization into inflammatory reactions in mice. Nutrition Research, v. 15, p.1477-85, 1995.

BORELLI, P.; BLATT, S. L.; ROGERO, M. M.; FOCK, R. A. Hematological alterations in protein malnutrition. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, v. 26, p.49-56, 2004.

BRIASSOULIS, G.; ZAVRAS, N.; HATZIS, T. Malnutrition, Nutrition indices, and early enteral feeding in critically III children. Nutrition, v.17, p. 548-57, 2001.

BRUNDTLAND, G.H. Nutrition and infection: malnutrition and mortality in public health. Nutrition of Review, v. 58, p. S1-S4, 2000.

CAAMANO, J.; HUNTER, C.A. NF-ҡB family of transcription factors: central regulators of innate and adaptive immune functions. Clinical Microbiology Reviews, v. 15, p. 414-29, 2002.

CALDER, P.C. Fuel utilization by cells of the immune system. Nutrition Society, v. 54, p.65-82, 1995.

CHANDRA, R. K. Nutrition and immunity: lessons from the past and new insights into the future. American Journal of Clinical Nutrition, v. 54, p. 1087–104, 1991.

CHANDRA, R.K. Nutrition and the immune system: an introduction. American Journal of Clinical Nutrition, v.66, p. 460-463, 1997.

COEFFIER, M.; MIRALLES-BARRACHINA, O.; Le PESSOT, F.; LALAUDE, O.; DAVEAU, M.; LAVOINNE, A.; LEREBOURS, E.; DECHELOTTE, P. Influence of glutamine on cytokine production by human gut in vitro. Cytokine, v.13, p.148-54, 2001.

64

COEFFIER, M.; MARION, R.; DUCROTTE, P.; DECHELOTTE, P. Modulating effect of glutamine on IL-1 beta-induced cytokine production by human gut. Clinical Nutrition, v. 22, p. 407-13, 2003.

COHN, Z.A. The activation of mononuclear phagocytes: fact, fancy, and future. Journal of Immunology, v.121, p.813-816, 1978.

COLLEONE, V. V.; KANUNFRE, C. C.; MARTINS, A. K. A.; SAMPAIO, S. C.; CURI, R. Glutamina sintetase (E. C. 6.3.3.2 ou Glutamato: Amônia Ligase). In : CURI, R. Glutamina: Metabolismo, Aplicações Clínicas e no esporte. Rio de Janeiro, p.65-83, 2000.

CUNNINGHAM-RUNDLES, S.; McNEELEY, D. F.; MOON, A. Mechanism of nutrient modulation of the immune response. Journal Allergy Clinical Immunology. v. 115, p. 1119-1128, 2005.

CRUZAT, V. F.; TIRAPEGUI, J. Effects of oral supplementation with glutamine and alanyl-glutamine on glutamine, glutamate, and glutathione status in trained rats and subjected to long-duration exercise. Nutrition, v. 25, p. 428-435, 2009.

DACIE, J.V.; LEWIS, S.M. Practical haematology. 8ºed., Churchill livingstone. p. 57-58,1995.

DE ANGELIS, R.C. Fisiologia da nutrição. 3a ed. Ed. Nobel, v. 2, p.38-56, 1986.

DE ONIS, M.; MONTEIRO, C.; AKRE, J.; GLUGSTON, G. The worldwide magnitude of protein-energy malnutrition: an overview from the WHO Global Database on Child Growth. Bull World Health Organ, v.71, p.703-712, 1993.

DETMERS, P. A.; THIEBLEMONT, N.; VASSELON, T.; PIRONKOVA, R.; MILLER, D.S.; WRIGHT, S. D. Potential role of membrane internalization and vesicle fusion in adhesion of neutrophilis in response to lipopolysaccharide and TNF. Journal of Immunology, v. 157, p. 5589-5596, 1996.

DOBROVOLSKAIA, M.A.; VOGEL, S.N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection, v.4, p. 903-914, 2002.

DOUMAS, B. T.; WATSON, W. A.; BIGGS, H. G. Albumin standards and the measurement of serum albumin with bromocresol green. Clinical Chimica Act, v. 31, p. 87-96, 1971.

EAGLE, H.; OYAMA, V.I.; LEVY, M. The growth response of mammalian cells in tissue culture to L-glutamine and L-glutamic acid. Journal of Biological Chemistry, v. 218, p. 607-617, 1955.

ENGEL, J.M.; MUHLING, S.P.; MENGES, T.; MARTENS, F.; KWAPISZ, M.; HEMPELMANN, G. Role of glutamine administration on T-cell derived inflammatory response after cardiopulmonary bypass. Clinical Nutrition, v. 28, p. 15–20, 2009.

65

FIELD, C. J.; JOHNSON, I. R.; SCHLEY, P. D. Nutrients and their role in host resistance to infection. Journal of Leukocyte Biology, v. 71, p. 16-32, 2002.

FOCK R. A.; SILVA, O. P. P. S.; BORELLI, P. Desnutrição protéica modifica a síntese de óxido nítrico em macrófagos. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 39, p.115, 2003.

FOCK, R. A., VINOLO, M. A. R., SÁ ROCHA, V. M., SÁ ROCHA, L. C., BORELLI, P. Protein-energy malnutrition decreases the expression of TLR-4/MD-2 and CD14 receptors in peritoneal macrophages and reduces the synthesis of

TNF- in response to lipopolysaccharide (LPS) in mice. Cytokine, v. 40, p. 104-114, 2007.

FOCK, R. A.; ROGERO, M. M.; VINOLO, M. A. R.; CURI, R.; BORGES; M. C.; BORELLI, P. Effects of Protein-energy malnutrition on NF-KappaB signaling in murine peritoneal macrophages. Inflammation, vol. 33, p.101-109, 2010.

FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS FAO). Global hunger declining, but still unacceptably high. International hunger targets difficult to reach. Economic and social development department. September, 2010. accessed : 28/02/2011.

FRISINA, J.P.; GAUDIERI, S.; CABLE, T.; KEAST, D.; PALMER, T.N. Effects of acute exercise on lymphocyte subsets and metabolic activity. International Journal of Sports Medicine, v.15, p. 36-41, 1994.

FUJIHARA, M.; MUROI, M.; TANAMOTO, K.; SUZUKI, T.; AZUMA, H.; IKEDA, H. Molecular mechanisms of macrophage activation and deactivation by lipopolysaccharide: roles of the receptor complex. Pharmacology & Therapeuties, v.100, p. 171-94, 2003.

GADDUCCI, A.; COSIO, S.; FANUCCHI, A.; GENAZZANI, A.R. Malnutrition and caquexia in ovarian cancer patients: pathophysiology and management. Anticancer Research, v. 21, p. 2941-2947, 2001.

GARCIA, P. B. Inflamação em camundongos submetidos à desnutrição protéica: análise da mobilização celular e da hematopoese. Tese de Doutorado. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil, 1992.

GHOSH, S.; MAY, M.J; KOPP, E.B. NF-ҡB and rel proteins: evolutionary conserved mediators of immune responses. Annual Review Immunology, v.16, p. 225-60, 1998.

GORNALL, A. G.; BARDAWILL, C. J.; DAVID, M.M. Determination of serum proteins by means of the biuret reactions. Journal Biological Chemistry, v.177, p.751, 1949.

GREENBERG, S.; GRINSTEIN, S. Phagocytosis and innate immunity. Current Opinion in Immunology, v.14, p. 136-145, 2002.

66

GROSS, R. L.; NEWBERNE, M. P. Role of nutrition in immunologic function. Physiology Review, v. 60, p. 188–302, 1980.

HARLOW, M.B.; LANE, D. Antibody. New York: Cold Spring Harbor Laboratory. 726 p, 1988.

HATADA, E.N.; KRAPPMANN, D.; SCHEIDEREIT, C. NF-KappaB and the innate immune response. Current Opinion in Immunology. v,12, p.52-58, 2000.

HUBERT-BURON, A.; LEBLOND, J.; JACQUOT, A.; DUCROTTE, P.; DECHELOTTE, P.; COEFFIER, M. Glutamine pretreatment reduces IL-8 production in human intestinal epithelial cells by limiting IkappaB-alpha ubiquitination. Journal of Nutrition, v. 136, p. 1461-1465, 2006.

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz: Métodos químicos e físicos para análises de alimentos. 3 ed. São Paulo: IAL, 1985. v.1, p. 23-25, 1985.

INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA. Pesquisa de orçamento familiar 2008-2009 (POF). Desnutrição cai e peso das crianças brasileiras ultrapassa padrão internacional. Comunicação social. 27/08/2010.

JENKIN, C.R.; ROWLEY, D. Basis for immunity to typhoid in mice and the question of ―cellular immunity‖. Bacteriological Review, v. 27, p. 391-402, 1963.

JOOSTEN, K. F.; HULST, J. M. Malnutrition in pediatric hospital patients: Current issues Nutrition, v. 2, p. 133-137, 2010.

KATONA, P.; KATONA-APTE, J. The interaction between nutrition and infection. Clinical Practice, v. 46, p. 1582-1588, 2008.

KAWAI, T.; AKIRA, S. Pathogen recognition with Toll-like receptors. Immunology, v.17, p. 338–344, 2005.

KEUSCH, G.T.; FARTHING, M.J.G. Nutrition and infection. Annual Review of Nutrition, v. 6, p. 131-54, 1986.

KEUSCH, G.T. Nutrition and infection. In: SHILS, M.E.; OlSON, J.A.; SHIKE, M. Modern nutrition in health diseases. Philadelphia: Lea & Febiger, v. 2, p. 1241-58, 1994.

KEUSCH, G.T. History of nutrition: malnutrition, infection and immunity. Journal of Nutrition, v. 133, p. 336S-340S, 2003.

LAMUS, E. R. Desnutriton e infecciones. Importancia en la salud publica. Archive Venez Pueric Pediatric, v. 41, p. 75-93, 1975.

LANDMANN, R.; MULLER, B.; ZIMMERLI, W. CD14, new aspects of ligand and signal diversity. Microbes and Infection, v. 2, p. 295-304, 2000.

67

LANDGRAF, M. A.; TOSTES, R. D. E. C.; BORELLI, P.; ZORN, T. M.; NIGRO, D.; CARVALHO, M.H.; FORTES, Z. B. Mechanisms involved in the reduced leukocyte migration in intrauterine undernourishment. Nutrition, v. 23, p. 145-56, 2007.

LEE, G.R.; HERBERT, V. Nutritional factors in the production and function of erythrocytes. In: LEE, G.R., Wintrobe’s clinical hematology; 10a. ed; Williams & Wilkins, p. 228-266, 1999.

LEE, S.; CHOI, M.; KIM, Y.; SHIN, C. Nosocomial infection of malnourished patients in an intensive care unit.Yonsei. Medical Journals, v. 44, p. 203-209, 2003.

LI Q.; VERMA I. M. NF-KappaB regulation in the immune system. Nat Rev Immunol. 2002 Oct; 2(10):725-34. Review. Erratum in: Nature Review Immunology, v. 2, p. 975, 2002.

LI, P.; YIN, Y.L.; LI, D.; KIM, S.W.; WU, G. Amino acids and immune function. British Journal of Nutrition, v. 98, p. 237-252, 2007.

LUND, P. L-Glutamine and L-Glutamato: UV-Method with glutaminase and glutamate dehydrogenase. In: Methods of enzymatic analisys, v. 8, p. 357-363, 1985.

MAGNANI, M.; CRINELLI, R.; BIANCHI, M.; ANTONELLI, A. The ubiquitin-dependent proteolytic system and other potential targets for the modulation of nuclear factor-kB (NF-ҡB). Current Drug Targets, p.387-399, 2000.

MARCOS, A. Eating disorders: a situation of malnutrition with peculiar changes in the immune system. Eur. Journal Clinical of Nutrition, v. 54, p. S61-S64, 2000.

MARTINS, G.L.; SALZANO, A.C.; BATISTA, M.; VARELLA, R.M. Padrões hematológicos em grupos de população da zona da mata de Pernambuco. Revista Brasileira de Pesquisas Médicas e Biológicas, v. 4, p. 399-403, 1971.

MEDZHITOV, R.; PASARE, C. Toll-like receptors and antibody responses. Nature, v.18, p. 441, 2006.

MIYAKE, K. Innate recognition of lipopolysaccharide by CD14 and toll-like receptor 4-MD-2. International Immunopharmacology, v. 3, p. 119-28, 2003.

MONTEIRO, C. A. A dimensão da pobreza, da desnutrição e da fome no Brasil. Estudos Avançados, v. 48, p. 7-20, 2003.

MONTEIRO, C.A.; BENICIO, M.H.; KONNO, S. C.; SILVA, A.C.F.; CONDE, W.L. Causas do declínio da desnutrição infantil no Brasil 1996-2007. Revista de Saúde Pública, v. 43, p. 35-43, 2009.

MURPHY, C.J.; NEWSHOLME, P. Macrophage-mediated lysis of a -cell line,

TNF- release from BCG-actived murine macrophages and IL-8 release from

68

human monocytes are dependent on extracelular glutamine concentration and glutamine metabolism. Clinical Science, v.96, p.89-97, 1999.

NARDINELLI, L. & BORELLI, P. Protein calorie-malnutrition a decreased in the macrophage’s respiratory burst capacity. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 37, p. 51-60, 2001.

NEWSHOLME, P.; GORDON, S.; NEWSHOLME, E.A. Rates of utilization and fates of glicose, glutamine, pyruvate, fatty acids and ketone bodies by mouse macrophages. Biochemical Journal, v.242, p.631-636, 1987.

NEWSHOLME, P.; COSTA ROSA, L.F.B.P.; NEWSHOLME, E.A.; CURI, R. The importance of fuel metabolism to macrophage function. Cell Biochemistry and Function, v.14, p.1-10, 1996.

NEWSHOLME, P.; CURI, R.; CURI, T.C.P.; MURPHY, C.J.; GARCIA, C.; MELO, M.P. Glutamine metabolism by lymphocytes, macrophages, and neutrophils: its importance in healthy and disease. Journal of Nutritional and Biochemistry, v. 10, 316-324, 1999.

NEWSHOLME, P. Why is L-glutamine metabolism important to cells of the immune system in health, postinjury, surgery or infection? Journal of Nutrition, v.131, p. 2515S-2522S, 2001.

NISHIYAMA, A.; CURI, R. Metabolismo da glutamina no macrófago. In: CURI, R.. Glutamina: metabolismo e aplicações clínicas e no esporte. Rio de Janeiro: Sprint, p.190-198, 2000.

NOVA, E.; SAMARTÍN, S.; GÓMEZ, S.; MORANDÉ, G.; MARCOS, A. The adaptive response of the immune system to the particular malnutrition of eating disorders. European Journal of Clinical Nutrition, v. 56, p. S34-S37, 2002.

OPAL, S. M.; ESMON, C. T. Bench-to-beside review: Functional relationships between coagulation and the immune response and their respective roles in the pathogenesis os sepsis. Critical Care, v. 7, p. 23-38, 2003.

OSUCHOWSKI, M.F.; WELCH, K.; SIDDIQUI, J.; REMICK, D. G. Circulating cytokine/inhibitor profiles reshape the understanding of the SIRS/CARS continuum in sepsis and predict mortality. The Journal of Immunology, v. 177, p.1967-1974, 2006.

POWANDA, M.C.; BEISEL, W.R. Metabolic effects of infection on protein and energy status. The Journal of Nutrition, v.133, p. 322S-327S, 2003.

REEVES, P. G.; NIELSEN, F. H.; FAHEY, G. C. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition Ad Hoc Writing Committee on the Reformulation of the Ain-76a Rodent. Dietetic Journal of Nutrition, v.123, p.1939-51, 1993.

69

ROGERO, M. M.; TIRAPEGUI, J.; VINOLO, M. A.; BORGES, M. C.; CASTRO, I. A.; PIRES, I. S. O. ; BORELLI, P. Dietary glutamine supplementation increases the activity of peritoneal macrophages and hemopoiesis in early-weaned mice inoculated with Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin. The Journal of Nutrition, v. 138, p. 1343-1348, 2008.

ROSENFELD, G. Método rápido de coloração de esfregaços de sangue: noções práticas sobre corantes pancrômicos e estudo de diversos fatores. Memorial Instituto Butantan, v. 20, p. 315-28, 1947.

ROTH, E.; OEHLER, R.; MANHART, N.; EXNER, R.; WESSNER, B.; STRASSER, E.; SPITTLER, A. Regulative potential of glutamine regulation to glutatione metabolism. Nutrition, v.18, p. 217-221, 2002.

ROWBOTTOM, D.G.; KEAST, D.; GOODMAN, C.; MORTON, A.R. The haematological, biochemical profile of athletes suffering from the overtraining syndrome. European Journal of Applied Physiology, v.70, p. 502-509, 1995.

SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory. Manual. 2 ed. Cold Spring Harbor, p. 174-184,1989.

SCHAIBLE, U.E.; KAUFMAN, S.H.E. Malnutrition and infection: complex mechanisms and global impacts. Plos Medicine, v. 4, p. 806-812, 2007. SHETTY, P. Malnutrition and undernutrition. Medicine, v. 34, p. 524-529, 2006. SINGLETON, K. D.; WISCHMEYER, P. E. Glutamine attenuates inflammation and NF-kB activation via Cullin-1 deneddylation. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 29, p. 445-449, 2008.

SCRIMSHAW, N.S. Historical concepts of interactions, synergism and antagonism between nutrition and infection. Journal of Nutrition, v. 133, p. 316S-321S, 2003.

SHIMAZU R.; AKASHI, S.; OGATA, H.; NAGAI, Y.;FUKUDOME, K.;MIYAKE, K.; KIMOTO, M. MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4. The Journal of Experimental Medicine, v. 189, p. 1777-82, 1999.

STINNETT, J. D. Nutrition and the immune response. CRC PRESS, 150p, 1983.

TOBIAS, P. S.; TAPPING, R. I.; GEGNER, J. A. Endotoxin interactions with lipopolysaccharide - responsive cells. Clinical Infection Disease, v. 28, p. 476-481, 1999.

TOMKINS, A.M. Protein-energy malnutrition and risk of infection. Proceedings Nutrition Society, v. 45, p. 289-304, 1986.

TRIANTAFILOU, M.; TRIANTAFILOU, K. Lipopolysaccharide recognition: CD14, TLRs and the LPS-activation cluster. Immunology, v. 23, p. 301-314, 2002.

70

VANDERWALLE, A. Toll-like receptors and renal bacterial infections. Chang Gung Medical Journal, v. 31, 06, p. 525-537, 2008.

Van FURTH, R.; COHN, Z. A.; HURSCH, J. G.; HUMPHREY, J. H.; SPECTOR, W. G.; LANGEVOORT, H. L. The mononuclear phagocyte system: a new classification of macrophages, monocytes and their precursor cells. Bull World Health Organ, v. 46, p. 845-852, 1972.

Van FURTH, R.; RALBURN, J.A.; VAN ZWET, T. L. Characteristics of human mononuclear phagocytes. Blood Journal, v. 54, p. 485-500, 1979.

VICTORIA, J. W.; HERNANDEZ, V. Q. Efecto del estado nutricional de los pacientes sometidos a cirurgia eletiva. Revista de Gastroenterología de Mexico, v. 55, p. 207-210, 1990.

VITURI, C. L.; BORELLI, P.; ALVAREZ-SILVA, M.; TRETIN, A. Z. Alteration of the bone marrow in extracellular matrix in mice undernourished. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 33, p. 889-95, 2001.

WARD, P. G. A micro-Kjeldahl procedure for field use. The Journal of Medical Laboratory Technology, v. 20, p. 191-195, 1963.

WARD, N.S.; CASSERLY, B.; AYALA, A. The compensatory anti-inflammatory response syndrome (CARS) in critically ill patients. Clinics in Chest medicine, v. 29, p. 617-618, 2008.

WAITZBERG, D.L.; PLOPPER, C.; TERRA, R. M. Postoperative total parenteral nutrition. World Journal Surgery, v. 23, p. 560-564, 1999.

WALLACE, C.; KEAST, D. Glutamine and macrophages function. Metabolism, v.41, p.1016-1020, 1992.

WISCHMEYER, P.E.; RIEHM, J.; SINGLETON, K.D.; REN, H.; MUSCH, M.W.; KAHANA, M.; CHANG, E.B. Glutamine attenuates tumor necrosis factor-alpha release and enhances heat shock protein 72 in human peripheral blood mononuclear cells. Nutrition, v. 19, p. 1-6, 2003.

WORLD HEALTH ORGANIZATION. Dept of Nutrition for Health and Development: Nutrition for health and development: a global agenda for combating malnutrition. Geneva World Health Organization, 2000.

XAVIER, J. G.; FAVERO, M. E.; VINOLO, M. A. R.; ROGERO, M. M.; DAGLI, M. L. Z.; ARANA-CHAVEZ, V.E.; BOROJEVIC, R.; BORELLI, P. Protein-energy malnutrition alters histological and ultrastructural characteristics of the bone marrow and decreases haematopoiesis in adult mice. Histology & Histopathology, v. 22, p. 651-660, 2007.

YASSAD, A.; LAVOINNE, A.; BION, A.; DAVEAU, M.; HUSSON, A. Glutamine accelerates interleukin-6 production by rat peritoneal macrophages in culture. Federation of European Biochemical Societies Letters, v. 413, p. 81-84, 1997.

71

ZANDI, E.; ROTHWART, D. M.; DELHASE, M.; HAYAKAWA, M.; KARIN, M. The IkB kanase comples (IKK) contains two kinase subunits, Ikka and IKKb, necessary for IkB phosphorylation and NF-ҡB activation. Cell, v. 91, p. 243-52, 1997.

ZHANG, F.; WANG, X.; PAN, L.; WANG, W.; LI, N.; LI, J. Glutamine attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury. Nutrition, v. 25, p. 692-698, 2009.

ZIEGLER-HEITBROCK, H. W.; ULEVITCH, R. J. CD14: cell surface receptor and differentiation marker. Immunology Today, v. 14, p. 121-125, 1993.

ZUCAS, S. M.; LAJOLO, F. M.; BARBÉRIO, J. C. Gaiola metabólica para ratos, testada por meio de zinco radiativo. Revista Faculdade Farmácia e Bioquímica. São Paulo, v.7, p. 353-359, 1969.

72

ANEXO A : CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS