Εργαστηριακή Διάγνωση της HIV λοίμωξης

Δρ. Μαρία ΚοτσιανοπούλουΒιολόγος

Υπεύθυνη Εργαστηριού Κέντρου Αναφοράς AIDS, ΕΣΔΥ

Διάγνωση της HIV λοίμωξης

Από το 1985 και μέχρι σήμερα η διαγνωστική διαδικασία

που ακολουθείται προκειμένου να καθοριστεί η HIV

λοίμωξη είναι:

�η αναζήτηση αντισωμάτων έναντι του ιού με ανοσοενζυμική μέθοδο (EIA)

και ακολουθεί σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος

� η επιβεβαίωση με τη μέθοδο Western Blot (W.Bl.).

Ο έλεγχος ξεκινάει πάντα με την ανοσοενζυμική

δοκιμασία διαλογής που ανιχνεύει την παρουσία

αντισωμάτων έναντι του ιού HIV

και έχει σχεδιαστεί για να ανιχνεύσει όσο το δυνατόν

περισσότερες HIV περιπτώσεις .

Χρησιμοποιούνται ευρέως, λόγω της υψηλής

ευαισθησίας και καταλληλότητάς τους για τον έλεγχο

μεγάλου αριθμού δειγμάτων, ιδιαίτερα στις

αιμοδοσίες.

Ο πρωταρχικός ρόλος της επιβεβαιωτικής δοκιμασίας

είναι η εξασφάλιση ότι τα δείγματα που βρίσκονται

anti-HIV θετικά με τις δοκιμασίες διαλογής είναι

πραγματικά θετικά ή αρνητικά για τη HIV λοίμωξη.

Η δοκιμασίαW.Blot ( ή ανοσοαποτύπωση)

στην πραγματικότητα είναι παρόμοια με τη δοκιμασία ΕΙΑ

με την έννοια ότι ανιχνεύουν στο δείγμα αντισώματα έναντι

των ειδικών πρωτεϊνών του ιού.

• Η δοκιμασία Western Blot είναι η πιο διαδεδομένη

επιβεβαιωτική μέθοδος που εφαρμόζεται στα Κέντρα

Αναφοράς AIDS μέχρι και σήμερα στη χώρα μας και

στην Ευρώπη.

Επιβεβαιωτική δοκιμασία (Western Blot).

Οι ιικές πρωτεΐνες (αντιγόνα) χωρίζονται ανάλογα με το

μοριακό βάρος τους μέσω ηλεκτροφόρησης και

μεταφέρονται σε μια μεμβράνη, η οποία στη συνέχεια

χρησιμοποιείται ως μία ταινία για κάθε δείγμα και

επωάζεται με τον ορό ή πλάσμα του αντίστοιχου

δείγματος.

Western blot

strip

5

min

PATIENT SAMPLE

2 H

CONJUGATE

1 H

CHROMOGEN

6 to 15

min

New Lav Blot I / II protocol

Ανάλογα με τα αντισώματα που υπάρχουν στο δείγμα

αντίστοιχες μπάντες εμφανίζονται στην ταινία.

Οι διάφορες πρωτεΐνες του HIV ταξινομούνται σε δύο

λειτουργικές ομάδες, που παράγονται από τρείς

γονιδιακές περιοχές του HIV (gag, env, pol):

"p" - πρωτεΐνες,

"gp" – γλυκοπρωτεΐνες

p66/51

p17

Western blot

HIV1 HIV2

HIV Confirmation : New Lav Blot I / II• Με τη δοκιμασία W. Bl.

συνήθως αναζητούμε τα

αντισώματα έναντι των

ακόλουθων πρωτεινών του

ιού HIV:

• πρωτεινες του

περιβλήματος:

gp41, gp120/160

• πρωτεινες του πυρήνα:

p18, p24, p55

• ένζυμα του ιού:

p31, p51, p66.

Για να θεωρηθεί ένα δείγμα θετικό με Western Blot

σύμφωνα με τα προτεινόμενα κριτήρια κατά CDC για

την HIV-1 και HIV-2 λοιμώξεις απαιτείται η παρουσία

αντίστοιχων αντισωμάτων έναντι δύο τουλάχιστον

πρωτεϊνών από τις παρακάτω:

p24 p26

gp41 gp31

gp120/160 gp125/140

Οι επιβεβαιωτικές δοκιμασίες αυξάνουν σημαντικά την

εξειδίκευση της ανίχνευσης, όταν χρησιμοποιούνται σε

συνδυασμό με τις δοκιμασίες διαλογής.

Στις περισσότερες περιπτώσεις, είναι τουλάχιστον

τόσο ευαίσθητες όσο και οι συγκεκριμένες δοκιμασίες

διαλογής.

Στην πλειονότητα των περιπτώσεων, τα αποτελέσματα

είναι είτε σαφώς θετικά ή αρνητικά.

Διάγνωση της HIV λοίμωξης

Είναι δυνατόν η επιβεβαιωτική δοκιμασία ενός

θετικού με EIA δείγματος να δώσει αρνητικό

ή ακαθόριστο αποτέλεσμα.

• Στην εικόνα παρουσιάζονται

δυο δείγματα με τη δοκιμασία

W. Blot, που ελέγχθηκαν μετά

από 15-30 ημέρες.

Σε κανένα δείγμα δεν είχε

αλλάξει το προφίλ κλασμάτων

που παρατηρήθηκε σε

αρχικές λήψεις.

Η σωστή και γρήγορη αντιμετώπιση των

ακαθόριστων αποτελεσμάτων, όπως φαίνεται, δεν

μπορεί να γίνει με συμβατικές στρατηγικές

(επιβεβαίωση θετικού anti-HIV αποτελέσματος με τη

δοκιμασία Western Blot).

Θα μπορούσε να εφαρμοσθεί η αναζήτηση του p24 Ag HIV στον ορό,

που επιτυγχάνεται σε 2-4 εβδομάδες

πριν από την εμφάνιση των αντισωμάτων,

περίπου τη 14 η -15 η ημέρα μετά την

μόλυνση με τον HIV.

Η ανίχνευση του p24 AgHIV στον ορό

αποτελεί μάλλον ένα ασταθές εύρημα,

δεδομένου ότι η δοκιμασία στερείται

ευαισθησίας για τη διάγνωση

της HIV πρωτολοίμωξης,

αφού ανιχνεύεται μόνο στο 75% των

περιπτώσεων οξείας HIV λοίμωξης

και η περίοδος αντιγοναιμίας είναι σύντομη και μετά την ανάπτυξη

αντισωμάτων συνήθως δεν

ανιχνεύεται.

Αν η δοκιμασία ανίχνευσης

του p24 Ag HIV έχει

περιορισμένες δυνατότητες,

οι δοκιμασίες ανίχνευσης του

HIVRNΑ έχουν πολύ υψηλή

ευαισθησία και όλο πιο

συχνά εφαρμόζονται στις

μέρες μας.

Για την επίλυση των

περιπτώσεων με ακαθόριστα

αποτελέσματα οι

καταλληλότερες μέθοδοι είναι

η ανίχνευση του

HIV RNA και του p24 AgHIV

Πιστεύουμε ότι η προσθήκη της δοκιμασίας

ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων (HIVRNA) και AgHIV

είναι πλέον επαρκής για να μας επιτρέπουν

να συμπεράνουμε ότι αυτή η μορφή των δοκιμών

θα πρέπει να είναι ένα πρότυπο εργαλείο για την

πρόληψη και την επιτήρηση της HIV λοίμωξης

και για τη φροντίδα των οροθετικών ατόμων.

Ανάλογα με την κλινική εικόνα του ασθενούς και τους παράγοντες κινδύνου προτείνεται η εξής πορεία δράσης:

1) για ασθενείς με χαμηλούς παράγοντες κινδύνου συνιστάται η

επανάληψη της δοκιμασίας ανίχνευσης anti-HIV εντός 15-30

ημερών

2) για ασθενείς με παράγοντες υψηλού κινδύνου συνιστάται

έλεγχος για p24 Ag και HIV RNA για το ενδεχόμενο μιας οξείας

HIV λοίμωξης

Εντούτοις, επειδή δεν είναι δυνατή η διερεύνηση του

παράγοντα κινδύνου σε κάθε περίπτωση, σε όλα τα ακαθόριστα

δείγματα συνιστάται να γίνεται έλεγχος για την ανίχνευση του

p24 Ag και HIV RNA.

Οι μεγάλες δυσκολίες με την εργαστηριακή διάγνωση της HIV

λοίμωξης περιλαμβάνουν:

1) ψευδώς θετικά αποτελέσματα με ανοσοενζυμικές

δοκιμασίες ανίχνευσης αντισωμάτων έναντι του ιού,

2) ακαθόριστα αποτελέσματα με τη δοκιμασία Western blot,

3) εργαστηριακή διάγνωση της HIV πρωτολοίμωξης,

4) εργαστηριακή διάγνωση της HIV λοίμωξης στα

νεογέννητα οροθετικής μητέρας και

5) ύπαρξη των τεχνικών λαθών.

Το σημαντικότερο πρόβλημα είναι η διάγνωση της

οξείας HIV λοίμωξης.

Παρά τη μεγάλη πρόοδο στην κλινική θεραπεία της

λοίμωξης, τα HIV οροθετικά άτομα εξακολουθούν να

αναγνωρίζονται πολύ αργά στη πορεία της λοίμωξης.

Περίπου το ήμισυ των ασθενών που έχουν

ταυτοποιηθεί με τον ιό HIV γνωρίζουν τη κατάσταση

τους μόνο όταν έχουν προχωρημένη νόσο.

Πρόσφατες εκτιμήσεις του CDC δείχνουν ότι το 38,3%

ασθενών αναπτύσσουν AIDS σε 1-3 χρόνια μετά τη

διάγνωση της HIV λοίμωξης.

Συμφώνα με τις εκτιμήσεις, στις χώρες της

Ευρωπαϊκής Ένωσης οι καθυστερημένες διαγνώσεις

κυμαίνονται από 26% έως 53%.

Τα στοιχεία αυτά υποδεικνύουν ότι οι προσπάθειες

για τον εντοπισμό των ατόμων νωρίς στην πορεία της

HIV λοίμωξης είχαν περιορισμένη επιτυχία.

Υπάρχουν τρείς κύριοι λόγοι για τους οποίους η

ανίχνευση όλων των περιπτώσεων HIV λοίμωξης είναι

ιδιαίτερα σημαντική.

Πρώτον, η αναγνώριση της οξείας HIV λοίμωξης

επιτρέπει την κατάλληλη κλινική διαχείριση.

Όταν ενδείκνυται, η αντιρετροϊκή θεραπεία μπορεί να

παρέχεται και να καθυστερήσει την εξέλιξη της νόσου.

Δεύτερον, η αναγνώριση των ατόμων με οξεία HIV

λοίμωξη μπορεί να βοηθήσει στην πρόληψη

περαιτέρω μετάδοσης του ιού.

Τρίτον, η αναγνώριση της οξείας λοίμωξης μπορεί να

επιφέρει τη βελτίωση της εποπτείας της HIV/AIDS

επιδημίας.

Αλγόριθμος ορολογικού screening

ELISA HIV1/2 &O

-+ AΡΝΗΤΙΚΟ

HIV-1 WB

+ - AMΦΙΒΟΛΟ

HIV-1

ΛΟΙΜΩΞΗ

ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ

HIV-2 WB

Οι τρέχουσες κατευθυντήριες οδηγίες που προτείνει

το CDC υποστηρίζουν των αποκλεισμό της

δοκιμασίας Western Blot από τον αλγόριθμο

ανίχνευσης της HIV λοίμωξης.

anti-HIV1/2 – Ag HIV ( EIA 4 ης γενιάς)

Θετικό (+) Αρνητικό (-)

Western blot

Θετικό (+) Αρνητικό (-) ή ακαθόριστο

p24 AgHIV

Θετικό (+) Αρνητικό (-) HIVRNA

θετικό

αρνητικό

3073 anti-HIV1/2 – Ag HIV ( EIA 4 ης γενιάς)

1927 (+) 1146 (-)

Western blot

1741(+) 184 (-) ή ακαθόριστα

p24 AgHIV

91 (+) 93 Αρνητικά (-) HIVRNA

2 θετικά

91 αρνητικα

Με τον αλγόριθμο αυτό ο αριθμός HIV οροθετικών

δειγμάτων ήταν κατά 93 κρούσματα παραπάνω,

αυξάνοντας έτσι την ακρίβεια και την αποτελεσματική

εκτίμηση της HIV λοίμωξης.

Σε αυτή τη μελέτη βρήκαμε ότι με τη συμβατή διαδικασία

εντοπίσαμε το 94,83% των HIV λοιμώξεων (1743 από τα

1836 δείγματα) σε σύγκριση με έναν αλγόριθμο που

περιλαμβάνει τη δοκιμασία ανίχνευσης του p24 Ag και

HIV RNA για τον καθορισμό της οξείας HIVλοίμωξης.

Εργαστηριακή διάγνωση

κάθετης μετάδοσης

�γέννηση

�4η-7η εβδομάδα�8η-16η εβδομάδα

King SM, Pediatrics 2004

εφαρμογή ποσοτικής μέτρησης του HIV-RNA

Αποκλεισμός κάθετης μετάδοσης HIV

� ≥ 2 αρνητικές ιολογικές εξετάσεις

� ηλικία ≥ 1 μήνα

� ηλικία ≥ 4 μήνες

� ≥ 2 αρνητικές εξετάσεις προσδιορισμού Abs σε ηλικία ≥ 6 μήνες

Έλεγχος HIV λοίμωξης στην εγκυμοσύνη: WHO συστάσεις

� εγκυμοσύνη

� εξέταση στο 1ο τρίμηνο� επαναληπτικός έλεγχος στο δεύτερο τρίμηνο

σε άτομα υψηλού κινδύνου

Έλεγχος HIV λοίμωξης: WHO συστάσεις

Σήμερα τα περισσότερα προγράμματα

επαγρύπνησης και πρόληψης, στοχεύουν στη μείωση της εξάπλωσης της νόσου μέσω της

έγκαιρης διάγνωσης.

� εργαστηριακός έλεγχος ρουτίνας σε όλα τα άτομα (13-64 ετών)

� επανάληψη κάθε χρόνο σε άτομα με συμπεριφορά υψηλού κινδύνου

Κλινική χρήση ποσοτικού προσδιορισμού ιϊκού

φορτίου

Ο ποσοτικός προσδιορισμός του HIV RNA

αποτελεί μία πολύ σημαντική εξέταση για την

μέτρηση των επιπέδων ιϊκού φορτίου

(συγκέντρωση του HIVRNA) στο αίμα του

ασθενούς.

ΓΟΝΟΤΥΠΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ (ΑΝΤΟΧΗ) ΓΙΑ ΤΟΝ ΙΟ HIV

• Ο ιός HIV μεταλλάσεται πολύ γρήγορα.

Αυτό μπορεί να συμβεί τυχαία, αλλά συνήθως

προκαλείται απο τα φάρμακα που χορηγούνται

στον ασθενή.

• Η μελέτη ανάπτυξης αντοχής (resistance testing)

είναι ένα απαραίτητο εργαλείο για την ανίχνευση

αποτέλεσματηκότητας φαρμάκων στον ασθενή.

Ποιοτικός έλεγχος.

Ο ποιοτικός έλεγχος για την επιβεβαιωτικές δοκιμασίες

είναι πιο δύσκολή διαδικασία από αυτή της ΕΙΑ.

Ο κύριος λόγος είναι ότι οι συστάσεις για τον ποιοτικό

έλεγχο πρέπει να συμβιβάζεται με το τι είναι

επιστημονικά αναγκαίο και τι είναι οικονομικά εφικτό.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ ΠΟΛΥ!