UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHELE Facultad de Ciencias VeterinariasInstituto de Ciencias Clnicas VeterinariasDeterminacin de la actividad serica de la enzima gamma-glutamiltransferasa(-GT) como indicadora del consumo de calostro en ternerosTesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Grado de LICENCIADO EN MEDICINA VETERINARIA Mauricio Andrs Campos CarrascoValdivia Chile 2000 FECHA DE APROBACION:30 de Noviembre de 2000. A MIS PADRES Y HERMANOSCON CARIO... INDICE 1.RESUMEN 1 2.SUMMARY 2 3.INTRODUCCION 3 4.MATERIAL Y METODO 7 5.RESULTADOS 9 6.DISCUSION14 7.BIBLIOGRAFIA18 8.ANEXOS22 11. RESUMEN Elconsumodecalostroenlasprimerashorasdevidadelterneroesunafuente importantedeenerga,yprincipalmentedeinmunoglobulinas.Portalmotivosehan desarrolladodiversosmtodosparadeterminarenformarpidayeconmicaelconsumo precoz de calostro y adquisicin de inmunidad pasiva por el ternero. El objetivo general de este estudio fue evaluar el uso de la actividad srica de la enzima -GT en terneros recin nacidos como indicadora del consumo de calostro. Se utilizaron 11 vacas multparas de la raza Frisn Negro, entre cuatro y nueve aos deedadconsusrespectivostemeros.Muestrasdesangredelasvacasseobtuvieronen forma individual y semanalmente antes del parto. Los terneros fueron sangrados mediante venopuncinyugular,posteriorasunacimientoyantesdequeconsumierancalostro; posteriormentefueronsangradoscada12horas,durantelaprimerasemanadevida.Las muestrasdesangrefueronrecolectadas en tubosde10mlalvaco,luegocentrifugadasa 2500rpmpor10minyguardadasa-20Chastasuposterioranlisis.Lasmuestrasde calostroseobtuvieroninmediatamenteposterioralparto,antesdeamamantar,yluego cada 12 horas por cinco das, el sexto y sptimo da cada 24 horas. El calostro desgrasado fuecentrifugadoa14300rpmportresminutos,posteriormenteelsuerocalostralfue nuevamente centrifugado dos veces ms por 30 minutos a 13200 rpm. La determinacin de la actividad de -GT en el suero sanguneo y calostral se realiz mediante la utilizacin de unkitcomercialMPR2(Lab.BoehringerMannheim).Lasinmunoglobulinassricasy calostralesfuerondeterminadasmedianteelTestdeTurbidezdelSulfatodeCinc,las protenas totales sricas y calostrales se midieron mediante refractometra. Para el anlisis estadstico se utiliz estadstica descriptiva, prueba de "t" de Student y correlaciones entre los diferentes mtodos utilizados. Existi un aumento significativo (P < 0,05) de la actividad de -GT en el suero de losterneroshastalas24horasdevida,paraluegodisminuirsignificativamente(P 0,05). Posterior al consumo de calostro, y principalmente hasta las 48 horas, existi una alta y significativa correlacin entre la actividad de -GT y valores de inmunoglobulinas (r = 0,81) y la actividad de -GT y protenas totales (r = 0,87) en el suero de los terneros. La determinacin de la actividad sangunea de -GT, durante la primera semana de vida de los terneros,especialmentedurantelasprimeras48horas,esunadecuadoindicadordel consumo de calostro e indirectamente de la adquisicin de inmunidad pasiva. Palabras claves: Calostro, Inmunoglobulinas, -GT. 22. SUMMARY Colostrum intake during the first hours of the calf s life is a very important source of energy, but mainly immnunoglobulins. For this reason several and inexpensive methods fordetermininganearlyintakeofcolostrumandacquisitionofpassiveimmnunityin newborncalfhavebeendeveloped.Theaimofthisstudywastoevaluatetheuseofthe serum activityoftheenzyme -GTasanindicator of the intake of colostrum in newborn calf. Eleven multiparous Friesian cows between four and nine years old and their calves were used The cows were individually bled once a week before calving. The calves were bled immediately after birth and before they suckled colostrum, and subsequently every 12 hours during the first week of life. The blood samples were collected in 10 ml vacutainer tubesandthencentrifugedat2500rpmfor10minandstoredat-20Cforsubsequent analysis.Colostrumsampleswereobtainedfromthecowsimmediatelyaftercalving before the calves suckled and every 12 hours during the first five days and every 24 h on days six and seven. Colostrum fat was removed and the whey separated by centrifugation at 14300 rpm for 3 m. Calostrum whey was centrifuged twice at 13200 rpm for 30 min. Thedeterminationof-GTactivityinserumandcolostrumwheywasperformed usingacommercialkitMPR2(Lab.BoehringerMannheim).Calostralandserum immunoglobulinsweredeterminedbyCincSulphateTurbidityTestandtotalproteins were determined by refractometry. Descriptive statistics, Students "t" test and correlations were used when appropiate. Therewasasignificant(P0,05)correlations were found between the-GT activity in the calostrum and serum of the calves. Positive and significant (P< 0,05) correlations after colostrumintakeandmainlyat48hbetweenthe-GTserumactivityandthe immunoglobulins values (r = 0,81) and total proteins (r= 0,87), were found. Determination of the -GT serum activity during the first week of life, especially during the first 48 h, is a good indicator of colostrum intake and indirectly of the acquisition of passive immunity in calves. Key words: Colostrum, Immunoglobulins and -GT 33. INTRODUCCION Sedenominacalostroalaprimerasecrecindelaglndulamamariadelavaca, despusdelparto,siendosteelnicoalimentoquedisponeelterneroensusprimeros dasdevida;suspropiedadesnutritivas,laxantesydedefensa,porsualtocontenidoen inmunoglobulinas, lo convierten en un elemento de vital importancia para la sobrevivencia del ternero recin nacido (Lanuza y Stehr, 1977; Zurita, 1994). Laimportancia delcalostroen la salud del ternero recin nacido se ha reconocido pormuchosaos(HoerleinyJones,1977).Porlargotiemposehaestudiadoelrol fundamentalquecumpleelcalostroenlatransferenciadeinmunidadpasivahacialos terneros, mencionndose factores importantes para que esta sea adecuada, tales como edad de la madre, lactancias previas de sta, adecuada cantidad ingerida por el ternero y tiempo oportuno para ingerirlo, entre otros (Rogers y Capucille, 2000). Idealmente, la inmunidad debiera ser transferida in-tero, de la madre al feto, de tal maneraqueelternerotengaproteccincontraalgunosmicroorganismosalnacer,hasta que su propio sistema inmune sea capaz de defenderlo (Fischer, 1980). En la vaca esto no sucededebidoaltipodeplacentacin(epiteliocorialcotiledonar),porloqueelternero, recin nacido es esencialmente agamaglobulinmico (McEwan y col., 1970; Fetcher y col., 1983;BradleyyNulo,1985).As,elternerodependedelosanticuerposquesumadre puedaentregarleenformapasivapormediodelaingestindecalostro(Banks,1982; Norcross, 1982; Burton y col, 1989; Tyler y Ramsey, 1991). Laglndulamamarialactanteesuntejidosecretoraltamenteactivoqueextrae grandes cantidades de aminocidos desde el plasma para su uso en la sntesis de protenas lcteas(BraumruckeryPocius,1978;Braumrucker,1979).Lasinmunoglobulinasse transfieren a la secrecin calostral durante las ltimas semanas de gestacin a partir de dos fuentes: humoral, provenientes de la circulacin sangunea de la vaca y local, sintetizadas por plasmocitos ubicados junto al epitelio secretor de la glndula mamaria (Larson y col, 1980; Nickerson, 1989). Sedescribencuatrotiposprincipalesdeinmunoglobulinas(Ig)enlosanimales: IgG,IgM,IgAeIgE(Bjotvedt,1981).LaprincipalIgdelasangrebovinaeslaIgGcon sus dos subclases: IgGl e IgG2. El calostro de la vaca normalmente contiene entre 50 a 150 mg/ml de inmunoglobulinas de las cuales la IgG comprende alrededor del 85 a 90 %, IgM alrededor del 7 % e IgA alrededor del 5 %. La IgGl considera alrededor de un 80 a 90 % de la IgG (Larson y col, 1980). El ternero recin nacido tiene la habilidad para absorber macromolculas en forma intactaprincipalmenteensusprimerasveinticuatrohorasdenacidoatravsdesupared intestinal(BushyStaley,1980;Braunycol,1982;Fetcherycol,1983;Ferinoycol, 1993).Estaabsorcinserealizapormediodeunmecanismodetransporte macromoleculartransitorio,detiponoselectivo,atravsdelepiteliodeabsorcindela4paredintestinal,elcualingresaestasmacromolculasjuntoconlalinfaintestinalal conducto torcico y posteriormente a la circulacin sangunea (Besser y Gay, 1985). Sereconocequeparaobtenerunaproteccinptimadelneonato,stedebieraconsumir unacantidaddecalostroequivalenteal10%de supesocorporal,dentrodelasprimeras veinticuatro horas de nacido y al menos la mitad de esta cantidad debiera aportarse en las primeras seis horas de nacido (Lanuza y Stehr, 1977; Zurita, 1994) Diversosmtodossehandesarrolladoparaestimarenformacuantitativay semicuantitativa los niveles de inmunoglobulinas alcanzados pasivamente por el ternero a travs de la ingestin de calostro (Ferino y col., 1993). Estos mtodos varan en exactitud, rapidez,equipamientonecesario,facilidaddeuso,costoylocalizacinalmomentode realizarlo (terreno o laboratorio) (Besser y Gay, 1985). Los mtodos ms utilizados son: - Protenas totales: este mtodo utiliza un refractmetro, instrumento utilizado que mide el ndice de refraccin de una solucin basado en su concentracin, la cual est dada por las protenas presentes en el suero de las cuales las inmunoglobulinas representan un tercio de las protenas totales (McBeath y col, 1971). -Coagulacindelglutaraldehdo:basadoenlacapacidaddelglutaraldehdode condensarseconlasinmunoglobulinasyformarunpolmerogelatinoso,estareaccinse mideentiempoysteesinversamenteproporcionalalaconcentracinde inmunoglobulinas que estn en la muestra (Sandholm, 1974). -Turbidezdelsulfatodecinc(ZnSO4):basadoenunacorrelacinexistenteentrela cantidad de inmunoglobulinas y la intensidad de la reaccin de turbidez de la solucin de ZnSO4(Mullen,1975).Estetestpuedeverseafectadoporeltiempoytemperaturadela reaccin, por la cantidad de dixido de carbono disuelto en la solucin de ZnSO4 y por la presencia de hemlisis en el suero (Pfeiffer y col, 1977). Existen algunas ventajas presentes en estos mtodos como el hecho de su facilidad de realizacinybajocosto,perotambinpresentanciertaslimitacionescomoel,verse afectadosporlahemoconcentracin,loquepuedesucederenanimalesdeshidratados, moribundos o con prdida de protenas por alguna enteropata; esto tiene mayor relevancia para los mtodos de refractometra y turbidez del ZnSO4 (McBeath y col., 1971; Naylor y Kronfeld, 1977; Pfeiffer y col, 1977). Inmunodifusinradial:estemtodoutilizaanticuerposantiinmunoglobulinas especficasbovinas,lascualesalestarpresentesenunacapadeagarsobreunaplaca, reaccionanconelsueroproblemaformandounanillodeprecipitacinproporcionalala cantidaddeinmunoglobulinas(BesseryGay,1985).Entresusventajas,estaprueba presentaunaaltasensibilidadyespecificidad,detectandoinclusoinmunoglobulinasen cantidadespequeascomomicrogramos;perosumayorlimitacinessualtocosto (Pfeiffer y col, 1977). 5En los ltimos aos se ha sealado que la enzima Gamma Glutamil Transferasa (-GT) puede ser utilizada como indicador del consumo de calostro en terneros, debido a que su actividad srica es alta durante la primera semana de vida en animales con un adecuado consumo de l (Bogin, 19991). Elcalostrodelasvacascontieneunagrancantidadde-GT,lacualjuntoconlas inmunoglobulinassonabsorbidasdesdeellumenintestinaldelrecinnacidohaciasu circulacin sangunea (Kramer y Hoffman citado por Kaneco y col, 1997; Tessman y col, 1997).Estaenzimasecreeestasociadaalmetabolismodelglutatinyaltransportede aminocidos;seencuentraprincipalmenteenmembranascelulares,primariamenteen clulasconactivometabolismodeaminocidostalcomorin,hgadoeintestino.La-GTtambinseencuentraenpncreas,prstata,vesculaseminal,glndulasalival, glndulamamariaycerebro(Centerycol,1991;ThompsonyPauli,1981).Estaenzima queseutilizahabitualmenteparadeterminarproblemashepticos,estconcentradaenel calostro de los rumiantes al cual llegara como transportador de aminocidos, y tambin es secretada por el epitelio de la glndula mamaria. Del calostro es absorbida directamente a travs de la pared intestinal del neonato debido a su bajo peso molecular (90.000 Dalton) comparadoconelpesomoleculardelaIgG(160.000Dalton),encontrndoseengran cantidadenelsuerodelternerorecinnacido.Consecuentemente,ternerosconuna adecuadatransferenciadeinmunidadpasivatendranunaaltaactividadsricade-GT (Braumrucker y Pocius, 1978; Ferino y col, 1993; Tessman y col, 1997). En temeros la actividad srica de -GT antes de ingerir calostro, es comparable con la de un adulto clnicamente sano de la misma especie (Thompson y Pauli, 1981; Perino y col,1993)conunvalormenora39U/L(SchmidyForstner,1985).ThompsonyPauli (1981), Boediker (1991), Perino y col. (1993), informaron que 24 horas despus de ingerir calostroestevaloraumenta60,160y26veces,respectivamente,sobreelvalordeun recinnacidoantesdeamamantarse.Laaltaactividadsricade-GTenlosterneros despus de consumir calostro, disminuye rpidamente durante la primera semana posterior al nacimiento, seguido esto por una disminucin gradual y continua entre las cinco a doce semanassiguientes;tiempoenelcualla-GTalcanzaelvalordeunadultonormal. Debido a esta actividad, en terneros jvenes se invalida su uso diagnstico como indicador dealgnproblemahepatobiliardurantelasprimeras12semanasdevida(Thompsony Pauli, 1981; Bouda y col, 1980; Center y col, 1991; Ferino y col., 1993). Porloanteriormentesealado,laactividadde-GTenelplasmasanguneodel ternerorecinnacidopuedeserunapruebafcilydebajocosto,encomparacinala inmunodifisin radial, para medir la ingesta de calostro en el neonato, e indirectamente ser un indicador para estimar la calidad de la transferencia de inmunidad pasiva (Braun y col, 1982; Ferino y col., 1993; Tessman y col, 1997). 1 Bogin, E. Comunicacin personal, Kimron Veterinary Instituto, Bet Dagan, Israel. 6Segn lo expuesto anteriormente, se formularon las siguientes hiptesis: 1.Ho:Noexistecorrelacinentrelaactividadde-GTpresenteenelcalostroyla actividad de -GT presente en el suero de los terneros durante la primera semana de vida. Ha:Existecorrelacinentrelaactividadde-GTcalostralylaactividadde-GT presente en el suero de los terneros durante la primera semana de vida. 2.Ho:Noexistecorrelacinentrelaactividadde-GTylasconcentracionesde Inmunoglobulinas y Protenas Totales presentes en el suero de terneros durante la primera semana de vida. Ha:Existecorrelacinentrelaactividadde-GTylasconcentracionesde Inmunoglobulinas y Protenas Totales presentes en el suero de terneros durante la primera semana de vida. Para esto se plantearon las siguientes objetivos: Objetivo General Utilizarlaactividadsricade-GTenternerosrecinnacidoscomoindicadordel consumo de calostro. Objetivos Especficos 1.Determinarlaactividadsricade-GTenvacasdeunasemanapre-partoyenel calostro y leche durante la primera semana post-parto. 2.Determinar la actividad srica de -GT en terneros desde el nacimiento hasta los 7 das de edad. 3. Correlacionar la actividad de -GT en suero calostral con la actividad de -GT en suero sanguneo, en terneros recin nacidos. 4.Correlacionarlaactividadsricade-GTconlaconcentracindeinmunoglobulinas, obtenidos con el test de Sulfato de Cinc y protenas totales mediante Refractometra, en terneros recin nacidos. 74. MATERIAL Y METODO 4.1 MATERIAL Material Biolgico Animales En este estudio se utilizaron 11 vacas multparas de la raza Frisn Negro entre 4 y 9aosdeedad,identificadasconautocrotalesdelnmero1al11enordencorrelativoy cuya fecha de parto era el mes de agosto de 1999. Las vacas permanecieron estabuladas en elHospitalVeterinariodelaUniversidadAustraldeChileyfueronalimentadasconuna racin base (concentrado y heno). Muestras de sangre y calostro Paralaobtencindelosvaloresdeprotenas,inmunoglobulinasyactividadde-GTsricaseutilizaronmuestrasdesangredelasvacaspreparto,calostrodestasy muestras de sangre de sus terneros. 4.2 METODO Muestras de sangre de las vacas se obtuvieron en forma individual, semanalmente antes del parto. Las muestras de sangre de los terneros fueron obtenidas al momento de su nacimiento antes de amamantarse y posteriormente cada 12 horas durante siete das. Muestrasdesangredevacasyternerosfueroncentrifugadasa2500rpmpor10 minutosenunacentrfugaHeraeusmodeloLabofugeGL,elsueroobtenidofue almacenado en tubos Eppendorf a -20 C. El calostro de las vacas se recolect inmediatamente posterior al parto, antes de que el ternero mamara y posteriormente cada 12 horas por cinco das, y en el sexto y sptimo da, cada 24 horas. Muestrasdecalostroserefrigeraronparasepararlagrasa;elcalostro semidesgrasado fue centrifugado en tubos Eppendorf a 14300 rpm por tres minutos en una centrfugaSigmamodelo20Im,parasepararlagrasarestanteyposteriormenteser congeladas a -20 C. Unavezterminadoelperododemuestreo,lasmuestrasdesuerofueron descongeladas a bao mara por cinco minutos, posteriormente, se determin la actividad de-GT(U/L)mediantelautilizacindeunkitcomercialMPR2dellaboratorio Boehringer Mannheim, en un autoanalizador COBAS MERA PLUS de Roche. Ladeterminacindeinmunoglobulinas(UT)serealizmedianteelmtododeel test de Turbidez del Sulfato de Cinc (McEwan y col., 1970), con un espectrofotmetro 8modelo 4010 de Boehringer Mannheim con filtro de 492 nm y protenas totales (g/100 ml), (McBeath y col, 1971), con un refractmetro Atago modelo SPR-T2. Lasmuestrasdecalostrofuerondescongeladasmediantebaomaraporcinco minutos,paraposteriormentesercentrifugadaspor30minutosyelsuerocalostral obtenido,fuenuevamentecentrifugadapor30minutosms,todoestoa13200rpm (16.1G) en una centrifuga Eppendorf modelo 5415D. La determinacin de la actividad de -GT(U/L)serealizmediantelautilizacindeunkitcomercialMPR2dellaboratorio Boehringer Mannheim,descrito anteriormente, con un espectrofotmetro Hitachi 4020 de BoehringerMannheim.Lasconcentracionesdeinmunoglobulinas(UT)fueron determinadasmedianteeltestdeTurbidezdelSulfatodeCinc,conunespectrofotmetro modelo 4010 de Boehringer Mannheim con filtro de 492 nm y las protenas totales (g/100 ml), con un refractmetro Atago modelo SPR-T2, descritos anteriormente. Paraelanlisisestadsticodelosresultadosdelpresentetrabajoseutiliz estadsticadescriptiva.Sedeterminlanormalidaddelosdatos,secalcularon correlaciones entre los diferentes mtodos utilizados y se realiz prueba de "t" de student para determinar diferencias estadsticas; utilizando el programa computacional Graph Pad Prism 3.00 para Windows (Graph Pad sofware, San Diego California USA, 1999). 95. RESULTADOS Enelgrfico1,seobservaquealmomentodelpartolaactividadde-GTenel suerocalostralfuede80000U/L,laquedisminuyenformasignificativa(P0.05)hastalas48horasdevida,paraluego mantenerse de manera constante hasta las 168 horas de vida (anexo 12). Grfico4.ValoresdeInmunoglobulinas(promediod.e.)enelsuerodelos terneros recin nacidos hasta las 168 horas de vida. 11Enelgrfico5,seobservaalmomentodelpartounaconcentracinpromediode ProtenasTotalesenelsuerocalostralde172g/100ml,laquedisminuy significativamente (P0.05) (anexo 7). Grfico7. Correlaciones entre -GT srico en terneros y -GT calostral en vacas durante las primeras 168 horas de vida y post parto respectivamente. En el grfico 8, se observa que al correlacionar la actividad promedio de -GT y los valorespromediodeInmunoglobulinasenelsuerodelosternerosensusprimeras168 horasdevida,alaprimerahoradevidasteesbajoynosignificativo(P>0.05), posteriormente a partir de la hora 12 y hasta las 168 horas de vida se observan valores de correlacin altos y estadsticamente significativos (P0.05) (anexo 8). Grfico 8. Correlaciones entre-GT y concentraciones de inmimoglobulinas sricas en terneros durante las primeras 168 horas de vida. 13En el grfico 9, se observan los valores de correlacin entre la actividad promedio de-GTylosvalorespromediodeProtenasTotalesenelsuerodelosternerosensus primeras168horasdevida,alaprimerahoradevidasteesbajoynosignificativo (P>0.05),posteriormenteapartir de la hora 12 y hasta las 168horas de vida se observan valores de correlacin altos y estadsticamente significativos (P0.05) (anexo 9). Grfico9.Correlacionesentre-GTyconcentracionesdeProtenas Totales en suero de terneros durante las primeras 168 horas de vida. Enelgrfico10,seobservaquealcorrelacionarlosvalorespromediode InmunoglobulinasconlosvalorespromediodeProtenasTotalesenelsuerodelos terneros en sus primeras 168 horas de vida, a la primera hora de vida ste es negativo y no significativo (P>0.05), posteriormente a partir de la hora 12 y hasta las 168 horas de vida se observan valores de correlacin altos y estadsticamente significativos (P