aa0_VMP2.pdfPara una distribución normal el 95 % de los datos cae dentro de los límites z=-1,96

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La ecuación de la curva normal

viene dada por la expresión

Los valores de x están distribuidos

normalmente con promedio µ y una

varianza σ2

]2/)(exp[2

1)(

22 σµπσ

−−= xxf

),(2σµNx ≈

Distribución normal

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Función de densidad de probabilidad normal para distintos valores de µ2 y σ2.

Distribución normal

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� La desviación estándar, σσσσ, mide la distancia desde la media, µµµµ, hasta elpunto de inflexión de la curva.

�� Un 95% de los valores están comprendidos en el interyalo µµµµ ± 1,9600σσσσ.

�� Un 99% de los valores están comprendidos en el intervalo µµµµ ± 2,576σσσσ.

�� Un 99,7% de Ios valores están comprendidos en el intervalo µµµµ ± 3,290σσσσ.

Distribución normal

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Estandarización de variables

Planillas decálculo, tablas

µ−=

−=

2exp

1)(

zfπ

Distribución normal

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Intervalos de confianza

Para una distribución normal el 95 % de los datos cae dentro de los límites z=-1,96 a z=1,96 (µµµµ± 1,96σσσσ)

Los promedios de las muestras tambien se

distribuyen normalmente

Existe un 95 % de probabilidad de que (estimador de µµµµ) este comprendido en ese rango

σµ 96.1±

Distribución normal

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El teorema del límite central proporciona el fundamento estadísticoque permite esperar dicha tendencia de los datos experimentales.

“Aún cuando la población original no esté distribuidanormalmente, tiende a la distribución normal cuando aumenta n”(valores medios)

Teorema del límite central.

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Para muestras grandes (n>30), los límites de confianza de la media vienen dados por :

nzσµ ±

Donde z depende del nivel de confianza requerido

Para el 95%, z = 1.96

Para el 99%, z = 2.58Para el 99.7%, z = 2.97

Distribución normal

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Para muestras pequeñas (n<20), los límites de confianza de la media vienen dados por :

ntsx ±

Donde t depende del nivel de confianza requerido y los grados de libertad.

Distribución t de Student.

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Distribución t de Student.

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No existen diferencias significativas entre nuestras

observaciones y una referencia o entre conjuntos de datos

Hipótesis Nula (H0) Hipótesis Alternativa (H1)

Si existen diferencias significativas entre nuestras

observaciones y una referencia o entre conjuntos de datos

¿Las diferencias entre nuestras observaciones y una referencia o entre conjuntos de datos son de naturaleza química (por ejemplo) o estadística?

Sistemática a seguir: Comprobación de hipótesis

Validez

Tests Estadísticos

Una decisión no es estrictamente verdadera, sino que, NO puede demostrarse su falsedad

(probabilidades)

Hipótesis estadísticas.

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Tipos de errores en el analisis inferencial de datos

Decisión Tomada

Aceptar H0 Rechazar H0

Resultado verdadero

verdaderaNo existe

errorTipo I (falso positivo, αααα)

H0 falsaTipo II (falso negativo, ββββ)

No existe error

La implementación de los procedimientos estadísticos tienen por objetivo minimizar los errores αααα y ββββ

αααα : β β β β αααα : β β β β αααα : β β β β : n

Tipos de errores en el análisis inferencial.

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Comparación de una media con un valor determinadon < 30

Suposiciones: Distribución Aproximadamente Normal

Hipótesis: Nula: H0: µ = µ = µ = µ = µµµµ0000

Alternativa: H1,

dos colas: µ µ µ µ ≠≠≠≠ µµµµ0000

una cola: µ µ µ µ < µ< µ< µ< µ0 0 0 0 y µ >µ >µ >µ > µµµµ0000

Test estadístico: Distribución t con (n-1) grados de libertad

Decisiones:

H1: µ µ µ µ ≠≠≠≠ µµµµ0000 (test dos colas) -tαααα /2, n-1 < t < -tαααα /2, n-1 H0 aceptada

H1: µ µ µ µ <<<< µµµµ0000 (test una cola) t > -tαααα , n-1 H0 aceptada

H1: µ > µ > µ > µ > µµµµ0000 (test una cola) t < tαααα , n-1 H0 aceptada

xt 0µ−

Hipótesis estadísticas.

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Hipótesis estadísticas.

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Excel

Hipótesis estadísticas.

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Suposiciones: Dos muestras independientes (1 y 2) de Distribución

Aproximadamente Normal

Hipótesis: Nula: H0: µ = µ = µ = µ = µµµµ0000

Alternativa: H1,

dos colas: µ µ µ µ ≠≠≠≠ µµµµ0000

una cola: µ µ µ µ < µ< µ< µ< µ0 0 0 0 y µ >µ >µ >µ > µµµµ0000

Test estadístico: Depende de que la relación (varianza mayor / varianza menor) sea menor o mayor de 3. (también test F: si Fcalculado >

Fcritico : varianzas diferentes).

Comparación de dos muestrasn < 30

Hipótesis estadísticas.

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nns

xxt

p +

−= ( ) ( )

−+

−+−=

snsns p

xxt

−= ( )

( ) ( )11 2

−+

−

nsnsdf

Varianzasiguales

Varianzasdistintas

Relación de varianzas

Hipótesis estadísticas.

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Varianza

VarianzaFcal =

Varianzasiguales

Varianzasdistintas

Prueba F

Varianza

VarianzaFcal =

crítcal FF <

crítcalFF >

Hipótesis estadísticas.

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Decisiones:

Tener en cuenta los “nuevos” grados de libertad (df)

H1: µ µ µ µ ≠≠≠≠ µµµµ0000(test dos colas) -tαααα/2, df < t < tαααα/2, df H0 aceptada

H1: µ µ µ µ <<<< µµµµ0000(test una cola) t > -tαααα, df H0 aceptada

H1: µ > µ > µ > µ > µµµµ0000(test una cola) t < tαααα, df H0 aceptada

Hipótesis estadísticas.

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Minitab

Hipótesis estadísticas.

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Excel

Hipótesis estadísticas.

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Suposiciones: D, (D = tratamiento 1 – tratamiento 2)se distribuye

aproximadamente en forma normal

Hipótesis: Nula: H0: µµµµD = = = = 0000

Alternativa: H1,

dos colas: µµµµD ≠≠≠≠ 0000

una cola: µµµµD < 0< 0< 0< 0 y µµµµD >>>> 0000

Test estadístico:

Decisiones:

H1: µµµµD ≠≠≠≠ 0000 (test dos colas) -tαααα /2, df < t < -tαααα /2, df H0 aceptada

H1: µµµµD < 0< 0< 0< 0 (test una cola) t > -tαααα , df H0 aceptada

H1: µµµµD >>>> 0000 (test una cola) t < tαααα , df H0 aceptada

Comparación de medias de dos muestras apareadas

Hipótesis estadísticas.

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Excel

Hipótesis estadísticas.

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Minitab

Hipótesis estadísticas.

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En el trabajo analítico suelen presentarse a menudo comparaciones en lasque intervienen más de dos medias.

Ejemplos

Comparar la concentración media de proteína en una solución para muestras almacenadas en condiciones diferentes

Comparar los resultados medios obtenidos de la concentración de un mensurando utilizando diferentes métodos

Comparar la media de los resultados en una valoración obtenidos por diferentes operadores que usan los mismos aparatos

Determinar una varianza de muestreo

ANOVA.

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ANOVA se utiliza para “analizar medidas que dependen de varios tipos de efectos que actuan

simultáneamente con el doble fin de decidir cuales de ellos son importantes y de poder estimarlos”

(Scheffé, 1953)

Compara medias de diversos conjuntos, a través de sus varianzas

ANOVA.

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Es posible separar la variación debida al error aleatorio de cualquier otra variación provocada al cambiar el factor de control. Podemos así evidenciar si una modificación del factor de control generadiferencias significativas entre los valores medios obtenidos.

Posibles fuentes de variación

Errores aleatorios Factor controlado

Para los ejemplos anteriores

Condiciones bajo las cuales se almacenó la solución

Método de análisis empleado

Operadores que realizaron la titulación

ANOVA.

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ANOVA puede emplearse en situaciones donde existe más de unafuente de variación aleatoria

Por ejemplo: Una situación de muestreo

Las muestras se toman al azar

ANOVA.

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Ambos tipos de análisis estadísticos, en donde hay un factor,ya sea controlado o aleatorio, además del error aleatorio de

las medidas, se conoce como ANOVA de un factor

Este tipo de analisis, con mayor grado de dificultad, tambien esaplicable a situaciones más complejas en las que existen dos omás factores, posiblemente interactuando entre sí

ANOVA.

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Ejemplo:

Ejercicio interlaboratorio: Se comparan k laboratorios que determinan nj veces la concentración de una determinada especie en una misma muestra con un mismo método.

Quien patrocina el ejercicio intentará detectar si alguno de los laboratorios genera resultados estadísticamente diferentes al resto

Hipótesis a cumplirse

• Los conjuntos de datos son independientes entre si

• La distribución de los datos obtenidos para cada conjunto es normal

• Las varianzas de cada conjunto de datos no difieren significativamente

ANOVA.

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Labs ResultadosMedia

aritmética

1 X11 X12 X13… X1i X1

2 X21 X22 X23 X2i…X2n X2

3 X21 X22 X23 X2i…X2n X3

j Xj1 Xj2 Xj3…Xji…Xjn Xj

k Xk1 Xk2 Xk3…Xki…Xkn Xk

ANOVA.

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Medida de dispersión

dentro de los laboratorios

Medida de dispersión entre los

laboratorios

( ) ( ) ( )∑∑∑∑∑ −+−=−i

ii j

y xxnxxxx222

TSS

RSS labSS

)(

)1(

kNSS

kSSF

labcal

−

−=

ANOVA.

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cal tab Si Fcal > Ftab

Al menos uno de los laboratorios genera valores diferentes del

resto

ANOVA.

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ANOVA no nos indica cuantos laboratorios difieren entre si ni cuales son

ANOVA evidencia o no la existencia de diferencias significativas entre laboratorios

Pero ...

ANOVA.

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Excel

ANOVA.

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Hora de almorzar

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Métodos ampliamente utilizados en el campo del análisis instrumental

Se calculan los resultados y se evalúan los errores aleatorios de una manera diferente a la que se utiliza cuando se repite una solamedición varias veces

Permite trabajar en un intervalo amplio de concentraciones

Curva de calibración (señal vs

[mensurando])

Comparación de dos métodos analíticos

RL puede aplicarse en:

Regresión lineal.

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•Grado de linealidad en nuestro intervalo de trabajo.•Límites de confianza para la pendiente y la ordenada en el origen de la recta.•Errores y límites de confianza para la concentración determinada de una muestra incógnita.•Límite de detección del método (menor concentración de mensurando que se puede detectar con un nivel de confianza predeterminado).

y = bx + a

Pendiente

Ordenada al origen

Parámetros a tener en cuenta

Regresión lineal.

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Análisis de regresión: Curva de Calibración

La concentración de muestras incógnita se determina generalmente porinterpolación y no por extrapolación

Inclusión de muestra blanco

Utiliza dos suposiciones básicas

Los errores en la calibración sólo ocurren en los valores de ordenadas (señal)

La magnitud de los errores en ordenadas es constante (homocedasticidad) e independiente de la concentración de mensurando

Regresión lineal.

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Para y = bx + a

El método de los cuadrados mínimos encuentra la recta de regresión de y sobre x que mejor se ajusta a nuestros puntos experimentales

La obtención de rectas de regresión ponderadas se adaptan mejor al problema pero requieren informacion adicional respecto a los errores en distintos niveles de concentración

Regresión lineal.

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y = bx + a

Error típico

Regresión lineal.

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y = bx + a

Errores en la pendiente y ordenada al origen

Regresión lineal.

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100

Es posible obtener los límites de confianza para la pendiente y la ordenada al origen de nuestra recta de ajuste

b ±±±± tSb a ±±±± tSa

Para un nivel de confianza deseado y (n-2) grados de libertad

y = bx + a

Regresión lineal.

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101

Comparación de métodos analíticos

Identificación de errores sistemáticos

Se utilizan para intervalos relativamente grandes de concentración

En cada eje se representan los resultados de cada método a analizar

Si se utiliza el método de los cuadrados mínimos debe colocarse en el eje x el método analítico mas preciso (referencia), (este método no admite error en el eje de abscisas)

Recientemente se ha desarrollado el test conjunto para la ordenada al origen y la pendiente considerando errores en ambos métodos analíticos (RIU 1996)

Si los dos métodos comparados producen resultados que no difierensignificativamente a un nivel de significancia αααα la ordenada de la recta de regresión no ha de ser estadísticamente diferente de 0 y la pendiente no ha de serlo de 1

Supone que los errores en el eje de ordenadas son constantes

Regresión lineal.

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102

Situación ideal: a = 0, b = r= 1 curva a

Un error sistemático proporcional: b ≠≠≠≠ 1 curva b

Un error sistemático constante: a ≠≠≠≠ 0 curva c

Error sistemático constante + error sistemático proporcional + errores aleatorios: curva d

Regresión lineal.

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103

Ensayos prácticos y simulaciones muestran que esta aproximación conduce a resultados fiables

siempre y cuando:

El método mas preciso se represente en el eje x

Se comparen al menos 10 puntos

El rango de concentración de interés esté cubierto uniformemente por

puntos experimentales

Regresión lineal.

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104

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105

Detector � Medio nutriente en su recipiente

Líquidos(P/A – MPN)

Sólidos(Recuento de Colonias)

Enfoque de la Validación en Microbiología

Comparación de Detectores

Detectores

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106

Deben ser cuantificables y evaluables

�Alcance�Precisión

�Linealidad�Recuperación

�Límites de trabajo (inferior y superior)�Selectividad�Especificidad

�Robustez

Siempre y cuando apliquen

Características de Performance del

Método de Ensayo

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107

Método de Referencia

Ha sido investigado a

fondo

Ha demostrado poseer la exactitud y precisión apropiadas

para el uso pretendido

Es un método normalizado (nacional o

internacional)

Métodos de referencia

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108

En validación primaria:

�Identificación morfológica del target (presuntivo)

�Declaraciones respecto de condiciones de incubación y

características del medio.

�Declaraciones de límites de trabajo fiables (colonias o número de placas por detector si es posible)

�Expresión de la incertidumbre dentro de los límites fiables.

�Alcance y limitaciones

Expresiones numéricas o cualitativas de características de

performance o de límites de trabajo derivadas de ellas

Especificaciones del Método de Ensayo

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109

�Imposibilidad de conocer la cantidad exacta de unidades formadoras de colonia (CFU), partículas formando colonias, gérmenes, propágulos.

�Imposibilidad de obtener recuperación absoluta

�Puede medirse la recuperación relativa (comparando entre diferentes detectores)

Recuperación del analito

Limitaciones y Características del Método

Microbiológico

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110

�Distribuciones desiguales.

�La varianza de muestreo no es característica del método

�Si puede serlo la varianza de sub-muestreo en el laboratorio

�Algunas características de performance necesitan evaluarse para diferentes matrices.

Varianza de la muestra

Limitaciones y Características del Método

Microbiológico

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111

�La variación aleatoria debido a la distribución desigual de partículas entre muestras paralelas, aun en suspensiones perfectamente mezcladas, es una propiedad característica del

método microbiológico .

�La variación aleatoria se rige por la distribución de Poisson

�Las imperfecciones técnicas y muchas otras causas generan variación adicional a la explicada por la distribución de Poisson. A esto se denomina “sobre-dispersión”.

�Muchos otros modelos se basan en la distribución binomialnegativa para explicar la sobre-dispersión.

Distribución de partículas y sobre-dispersión

Limitaciones y Características del Método

Microbiológico

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112

�Se generan dificultades considerables desde interacciones entra factores bióticos y abióticos.

�Los detectores líquidos son afectados por posibles

cohabitaciones de una variedad de micro flora en el mismo tubo

�Los detectores de colonias son afectados por “crowding” y enmascaramientos de colonias target por desechos y crecimientos de colonias no target

Interacciones en el detector

Limitaciones y Características del Método

Microbiológico

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113

�Los métodos microbiológicos son muy poco robustos

�Las pérdidas de robustez se deben a: la muestra, la competencia del personal, la preparación de la muestra, las

condiciones de incubación y el medio de detección (estas 3 últimas deben estar estandarizadas).

�La validación primaria debe establecer los limites generales dentro de los cuales se espera un buen comportamiento del método.

�En normas estandarizadas generalmente se da poca importancia a la sensibilidad de estos métodos respecto del tiempo.

Robustez

Limitaciones y Características del Método

Microbiológico

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114

�La posición o el apilamiento de los platos dentro de la estufa de cultivo debilita la robustez (efectos de la temperatura)

�El stress por enfriamiento que sufren las muestras, en la etapa

de almacenamiento puede no ser importante para las cuentas totales pero si para métodos altamente selectivos.

Robustez

Limitaciones y Características del Método

Microbiológico

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115

�Alta predisposición a problemas inesperados, con frecuencia en un solo plato (colonia perturbadoras simples, humedad, ∆T, sólidos y otras impurezas, contaminación)

�Los cultivos líquidos son menos susceptibles

�Estos error son impredecibles por los modelos matemáticos, si son frecuentes pueden considerarse como fuente adicional de incertidumbre.

Errores espurios

Limitaciones y Características del Método

Microbiológico

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116

�Posibilidades limitadas

�No aplican los controles que se emplean en los PMQ

�Dificultad en establecer los fuera de control (no son

determinantes)

�Mas utilizadas en controles, por ejemplo, de temperaturas de incubación

Cartas de control

Limitaciones y Características del Método

Microbiológico

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117

La probabilidad de variación entre alícuotas de prueba paralelas en el rango óptimo de trabajo de los detectores microbiológicos es considerable aun si la mezcla es perfecta (completamente

aleatoria) y no son incluidas incertidumbres técnicas de medición.

Variación Básica – La Distribución de Poisson

Modelos Matemáticos de Variación