UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica

Desenvolvimento de inibidor enzimático β-secretase (BACE-1), por

planejamento de fármaco, para bloqueio no avanço da doença de

Alzheimer.

Rodrigo Soares Siqueira

Trabalho de Conclusão do Curso de

Farmácia-Bioquímica da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da

Universidade de São Paulo.

Orientador(a):

Prof. Dr. Gustavo Henrique Goulart

Trossini.

São Paulo

2017

1

SUMÁRIO

Pág.

Lista de Abreviaturas----------------------------------------------------------------------- 2

RESUMO-------------------------------------------------------------------------------------- 3

1. INTRODUÇÃO----------------------------------------------------------------------------- 4

1.1 A Doença: epidemiologia, diagnóstico e fisiopatologia. --------------

1.2 Estágios Clínicos da Doença de Alzheimer. ----------------------------

1.3 Fisiopatologia. ---------------------------------------------------------------

1.4 Hipóteses do Amiloide Beta (Aβ), ação da BACE-1----------------------

1.5 Avanços na descoberta de inibidores BACE-1(LBDD e SBDD)-----------

5

6

7

7

8

2. OBJETIVOS-------------------------------------------------------------------------------- 10

2.1 Objetivos específicos---------------------------------------------------------- 10

3. MATERIAIS E MÉTODOS------------------------------------------------------------------ 10

3.1 Ferramentas Computacionais------------------------------------------------ 10

3.2 Seleção da Estrutura 3D------------------------------------------------------ 11

3.3 Campos de Interação Molecular--------------------------------------------- 11

3.4 Docking-------------------------------------------------------------------------- 11

3.5 Virtual Screening-------------------------------------------------------------- 12

4. RESULTADOS------------------------------------------------------------------------------ 12

4.1 Alinhamento dos resíduos de 10 estruturas cristalográficas no

programa BIOEDIT® (visão 1D).--------------------------------------------------

12

4.2 Visualização 3D no Pymol® e tratamento da estrutura PDB: 3TPP--- 12

4.3 Avaliação das Interações ---------------------------------------------------- 14

4.4 Construção do Modelo Farmacofórico------------------------------------- 14

4.5 Validação do Modelo Farmacofórico.-------------------------------------- 16

4.6 ReeDocking-------------------------------------------------------------------- 17

4.7 Triagem Virtual (do inglês Virtual Screening – VS)----------------------- 17

4.8 Docking das estruturas do VS----------------------------------------------- 18

5. DISCUSSÃO-------------------------------------------------------------------------------- 20

6. CONCLUSÃO------------------------------------------------------------------------------- 22

7. Referências------------------------------------------------------------------------------- 22

2

LISTA DE ABREVIATURAS

Aβ Amiloide β

ADI Alzheimer's Disease International

APP Amyloid Precursor Protein

DA Doença de Alzheimer

BACE-1 Beta-site Amyloid precursor protein Cleaving Enzyme 1

CADD Computer-Aided Drug Design

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística.

LBDD Ligand-Based Drug Design

LITEC Laboratório de Integração entre Técnicas Experimentais e

Computacionais no Planejamento de Fármacos

MIF Molecular Fields Interactions

OMS Organização Mundial da Saúde.

PDB Protein Data Bank

RCSB Research Collaboratory for Structural Bioinformatics

ROC Receiver Operating Characteristic

sAPPα e

sAPPβ

soluble Amyloid Precursor Protein α e β

SBDD Structure-Based Drug Design

VS virtual screening

3

RESUMO

SIQUEIRA,R.S. Desenvolvimento de inibidor enzimático β-secretase (BACE-1), por planejamento de fármaco, para bloqueio no avanço da doença de Alzheimer. 2017. 26f. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017. A Doença de Alzheimer (DA) acomete grande parcela da população idosa, chegando a mais de 40% das pessoas acima de 85 anos. Até o presente momento, não há medicamento capaz de evitar ou frear totalmente o desenvolvimento da DA. Uma das hipóteses mais aceitas para o surgimento e avanço da DA é o desenvolvimento das placas neuríticas (constituídas de

peptídeo β-amiloide) em regiões do cérebro responsáveis pela memória. O

peptídeo β-amiloide (fragmento c99 resíduos C-terminal, via Amiloidogênica) é

derivado da clivagem da proteína APP (Proteína Precursora Amiloide), quando

participa a enzima β-secretase (BACE-1); sendo assim, o desenvolvimento de

um bloqueador da BACE-1 poderia resultar em avanço no arsenal terapêutico de combate a DA. Este trabalho tem como objetivo o planejamento computacional de um inibidor para a BACE-1, utilizando diversas técnicas de modelagem e planejamento molecular, culminando em uma triagem virtual, tomando como base um inibidor já descrito e caracterizado nos depósitos do PDB. Palavras-chave: Planejamento de Fármacos, Inibidor BACE-1, Doença de Alzheimer.

4

1- Introdução

A Doença de Alzheimer (DA) é uma patologia neurodegenerativa que acomete

principalmente populações acima de 60 anos, até o momento não existe cura,

apenas tratamentos que retardam o progresso da doença e controlam os

sintomas, melhorando a qualidade de vida do paciente, mas sem muito

sucesso a longo prazo(1).

Dois achados fisiopatológicos têm despertado interesse da comunidade

científica na busca de prognósticos melhores para a DA, emaranhados

neurofibrilares (hiperfosforilação da proteína tau) e placas neuríticas ou senis

(acúmulo de proteína β-amiloide).

Os esforços para encontrar novos fármacos para o tratamento da DA veem

recaindo no bloqueio e/ou regressão das placas β-amiloides, originadas do

processamento da proteína transmembrânica APP (Proteína Precursora

Amiloide). Tal proteína é clivada em sua parte extracelular por uma protease

aspártica, α- secretase ou β-secretas (BACE-1), e posteriormente, na parte

transmembrânica, pela γ-secretase (2).

As enzimas α-secretase (liberação do fragmento sAPPα) e a γ-secretase, tem

ação pela clivagem da APP gerando um fragmento com 83 resíduos, C-

terminal (c83), esta via é não amiloidogênica. Já, quando atuam as enzimas β-

secretase (liberação do fragmento sAPPβ) e a γ-secretase, é gerado o

fragmento com 99 resíduos C-terminal (c99), esta é a via amiloidogênica

(Figura-1). O fragmento c99 conhecido como Amiloide-β (Aβ), se apresenta

como maior responsável pelo aparecimento das placas β-amiloide (2).

Figura 1. Ilustração das clivagens realizadas pelas secretases, com a via

amiloidogênia e não amiloidogênica; surgimento do fragmento Aβ e do

agregado (modificado de ROBBINS E COTRAN1).

5

A neurotoxicidade, atribuída às placas β-amiloides, aumentam o estresse

oxidativo, gerando resposta inflamatória (micróglia), o que pode estimular a

secreção de mediadores causadores de danos. Além disso, as placas β-

amiloides são marcadores histológicos para DA, além de parecerem ter

cronologia anterior ao surgimento dos emaranhados neurofibrilares, os quais

podem surgir em resposta às placas (3).

Seguindo esta linha de raciocínio, a ação da enzima β-secretase (BACE-1),

que em última análise gera as placas β-amiloides, é um ponto crucial no

desenvolvimento da DA. Sendo assim, este trabalho pretende realizar uma

triagem virtual de candidatos inibidores da BACE-1, por meio de técnicas

computacionais de planejamento de fármaco.

1.1 - A Doença: epidemiologia, diagnóstico e fisiopatologia.

O relatório da Organização Mundial da Saúde (OMS) de 2012, em conjunto

com Associação Internacional de Doença de Alzheimer (ADI), estima que 35,5

milhões de pessoas apresentavam quadro de demência no mundo, e que no

ano de 2050 o número pode chegar a 115,4 milhões. Destes casos, até 70%

estariam relacionados à DA(7). Sendo demência a deterioração intensa da

função cognitiva, interferindo com o desempenho social e ocupacional do

doente. A função cognitiva é descrita como o processo pelo qual as

informações são transformadas, elaboradas, guardadas, recuperadas e

utilizadas, gerando a habilidade de aprender e manipular informações(8).

Segundo o IBGE (2012), há uma pessoa de mais de 60 anos para cada duas

pessoas com menos de 15 anos (9), o que deixa claro o envelhecimento da

população brasileira, e isso, junto com o aumento da expectativa de vida, está

diretamente relacionado com o aumento das doenças crônicas e

incapacitantes, o que provoca uma preocupação maior quando analisamos os

dados sobre a DA.

Dados publicados por Herrera e colaboradores em 2002(10) mostram que, no

Brasil, 55,1% das demências são decorrentes exclusivas da DA, e que outros

14,1% são da associação da DA com doenças cerebrovasculares.

Estudo de Nitrini e colaboradores em 2004(11) demonstrou que após os 65 anos

de idade, a taxa de demência dobra a cada 5 anos, indicando a idade como

fator principal de risco para o desenvolvimento da DA. Como a incidência da

DA dobra a cada 5 anos, partindo de 1% entre 60 a 64 anos, teremos em torno

de 40% de incidência de DA por volta dos 85 a 89 anos. Outro estudo

demonstrou que mulheres (59%) são mais propensão a DA do que homens

(41%) (8).

6

Não é só em detrimento da idade que surge a DA, cerca de 5% a 10% dos

casos tem origem familiar, ligado a alguma alteração genética (discutido mais à

frente) (1).

Do ponto de vista de diagnóstico, existem três níveis adotados; possível,

quando os sintomas iniciais não são característicos da DA; provável, quando os

sintomas são característicos, complementados com exames de neuroimagens;

e definitivos, após a morte é realizado exames do tecido cerebral por

necropsia(5). Para evitar erros de diagnóstico foi desenvolvido o mnemônico

DEMENTIA, um trabalho prévio de exclusão de outras possíveis patologias que

não a DA (8) (Tabela 1). Assim, sendo excluídas estas possibilidades, torna-se

provável a causa da demência ser a DA.

Tabela 1. Significado do mnemônico DEMENTIA.

D Drogas (atividade anticolinérgica). E Emocional (depressão). M Metabólico (hipotireoidismo). E Eyes and ears (olhos e ouvidos, declínio da visão e audição). N Hidrocefalia com pressão Normal. T Tumor (ou outra lesão que ocupe espaço). I Infecção (vírus, AIDS, sífilis,...). A Anemia (deficiência de vitamina B12 ou folato).

1.2 - Estágios Clínicos da DA.

A DA é uma doença neurodegenerativa progressiva, a evolução do quadro

clínico pode ser dividida em estágios. Apesar de serem encontradas algumas

divisões mais compactas, optou-se por apresentar um quadro mais detalhado,

o qual é composto por sete estágios (Tabela 2) (8). Em média, a sobrevida dos

pacientes diagnosticados com DA é de 8 a 10 anos após os primeiros sinais da

doença, variando muito de pessoa para pessoa, em detrimento da

escolaridade, cuidados sociais, assistência médica e estilo de vida adotado

pelo paciente (1).

Tabela 2. Avanço cronológico da DA. Nas fases finais são necessárias

internação e assistência médica total.

Estágio Características

1 Sem comprometimento das funções normais. 2 Declínio cognitivo muito leve, pequenos lapsos de memória. 3 Declínio cognitivo leve, falta de palavras, perda de objetos. 4 Declínio cognitivo moderado, memória de curto prazo comprometida. 5 Declínio cognitivo moderado/grave, necessária pequena ajuda. 6 Declínio cognitivo grave, necessária supervisão de cuidador. 7 Declínio cognitivo total, estágio final, perda da habilidade de resposta

aos estímulos, acamados.

7

É importante ressaltar que, nem todos os idosos que apresentam os estágios

leves da doença têm, necessariamente DA. Porém, todos, independentemente

da faixa etária, estão suscetíveis a lapsos de memória. Exames clínicos e

radiológicos, somados a técnicas avançadas de imagens, podem ter precisão

de 80% a 90% no diagnóstico da DA (1).

1.3 - Fisiopatologia.

Do ponto de vista fisiopatológico, pessoas com DA apresentam atrofia do lobo

temporal médio (incluindo hipocampo, córtex e amígdala), o que pode

aumentar o volume do ventrículo (hidrocefalia) (1;13;14); placas neuríticas (senis)

formadas por amiloide beta (Aβ); emaranhados neurofibrilares de proteínas

fibrosas enroladas umas ao redor das outras (helicoidal), resistente à

degradação química e enzimática, persistindo até após a morte do neurônio,

forma anormal hiperfosforilada da proteína tau (proteína axonal associada a

microtúbulos)(13). O número e a distribuição das placas, e dos emaranhados,

parecem contribuir para a evolução da doença (1;3).

Ocorre, também, diminuição na enzima colina acetiltransferase (córtex e

hipocampo), diminuindo assim a síntese da acetilcolina (neurotransmissor

associado à memória) (13).

A DA parece ser multifatorial, além do já exposto, existem outros fatores que

contribuem para o desenvolvimento da doença. Fatores genéticos causando

início precoce (Figura 2), traumatismos (boxeadores) e fatores inflamatórios

(estresse oxidativo (15)).

1.4 - Hipóteses do Amiloide Beta (Aβ), ação da BACE-1.

A enzima β-secretase (BACE-1 (beta-site amyloid precursor protein cleaving

enzyme 1); Memapsina 2 (membrane-associated aspartic protease 2) ou ASP-2

(aspartyl protease 2)) é uma protease aspártica, responsável pela clivagem da

parte extracelular da proteína APP. Essa proteína atua especificamente entre a

metionina 671 e o ácido aspártico 672(2). O Fragmento gerado a partir da ação

da BACE-1 (c99 ou Aβ) é o principal responsável pelo aparecimento das placas

de Beta Amiloides (Aβ), e existem evidências que estes são precursoras da

DA(1;8;17). A hipótese da placa Aβ foi melhor demonstrada quando estudado o

aparecimento precoce da DA em certas populações. Mutações específicas

puderam ser identificadas e estudas, gerando dados confirmatórios de que o

aparecimento das placas Aβ é evento antecessor ao surgimento da DA(2; 17). Já,

mutações que levam a um aporte da APP (ex: Down, já que a APP é codificada

no cromossomo 21) ou a incremento da atividade da BACE-1, acarretam

aparecimento da DA em idade precoce (40-50 anos), com uma quantidade de

placas Aβ maior (18).

8

Figura 2. Alguns dos fatores genéticos que provocam a DA, bem como os

cromossomos relacionados. Os números nos círculos representam os

cromossomos afetados, e nos quadros uma concisa explicação.

Relatos da literatura indicam que o número de placas Aβ no cérebro não

corresponde ao grau de declínio da atividade cognitiva (19). Apesar de enormes

esforços, os efeitos neurotóxicos do Aβ não são totalmente conhecidos in vivo.

Ainda assim, a hipótese Amiloide é aceita, tendo em vista que gera eventos

fisiopatológicos na DA (1) (Figura 3). Outro ponto relevante e confirmatório

desta hipótese e a relação da placa Aβ com o emaranhado de proteína tau.

Assim, mutações que levam ao incremento do Aβ, levam a formação de

emaranhado e DA, porém, mutações no gene que codifica a proteína tau

(MAPT- microtubule associated protein tau) leva a demência fronto-temporal

(Parkinsonismo), sem aumento de Aβ nem DA (1;20).

1.5 - Avanços na descoberta de inibidores BACE-1(LBDD e SBDD).

Ambas as enzimas BACE-1 e APP, são encontradas em endossomos, provável

local para a atividade enzimática, com pH ótimo de 4,5 (22). A resolução da

estrutura da BACE-1 por cristalografia de raios x gerou grandes avanços na

descoberta de inibidores. A primeira estrutura da BACE-1, obtida por Tang e

colaboradores, foi obtida em co-cristalização com um inibidor peptídico (PDB

OM99-2). Esse cristal possibilitou a geração uma série de inibidores

peptidomiméticos (23).

21

19 (alelo

ε4)

14

1

Presenilina 1 e 2

respectivamente, proteínas

intracelulares componentes da

γ-secretase, envolvida no

processamento da APP.

Apoproteína E, aumenta o risco da

DA (ainda não se sabe como isso

ocorre), indivíduos com o alelo ε4

estão bem representados na

população de pacientes com Da(14).

Incremento da APP,

praticamente todas as pessoas

com Down apresentam DA

quando envelhecem.

9

Figura 3. Sequência de eventos da hipótese β- Amiloide e como o fragmento

Aβ causaria a DA (21).

Antes da identificação do sítio ativo da BACE-1, a tentativa de produzir um

inibidor foi focada na técnica de LBDD (ligand-based drug design), a qual toma

como base para a elaboração da nova molécula o ligante. A partir do

conhecimento das características do ligante ou série de ligantes e sua atividade

biológica, é possível otimizar características desejadas. No caso do inibidor,

fazer com que ele tenha uma ligação mais efetiva, bloqueando o acesso do

substrato normal à enzima, preenchendo melhor os bolsões ou, até mesmo,

interagindo em bolsões acessórios. Essa técnica ‘’imita’’ a estrutura do ligante,

por isso muitas das estruturas tem ligações peptídicas (peptidomiméticos),

como os derivados de hidroxietilaminas e estatinas (17).

Com a obtenção da estrutura tridimensional da proteína alvo é possível aplicar

a técnica SBDD (struture-based drug design). Com a visualização do sítio ativo,

e as informações obtidas por cristalografia (raios x), ressonância (RMN) e

modelos 3D do receptor, a técnica de desenho de novos fármacos SBDD pode

representar grande auxílio para a elaboração de novos ligantes, além de

otimizar as propriedades já conhecidas(25). Pequenas moléculas podem ser

utilizadas para compor uma estrutura maior, que simule a proteína-substrato no

sítio ativo (Figura 4). É comum o emprego simultâneo das duas técnicas (LBDD

e SBDD), para reduzir tempo e custos no desenvolvimento de novos fármacos.

Partindo-se do principio que existem milhares de compostos no espaço químico

atual faz-se necessário uma filtragem dos mesmos (27), com o intuito da

obtenção de um inibidor da BACE-1.

Os compostos geralmente fazem parte de bibliotecas de compostos ou

ligantes, sendo um banco de dados de instituições públicas ou privadas, com

milhões de compostos químicos. Para efetuar a filtragem, utiliza-se a estratégia

10

de triagem virtual, na qual são utilizados diversos programas computacionais

disponíveis que, por meio de algoritmos, equações e estatísticas, selecionam

os compostos baseados em parâmetros estabelecidos pelos pesquisadores (27).

Figura 4. Esquema representativo das etapas para obter um ligante por SBDD

(retirado de AVILA, C.M) (27).

Utilizando as estratégias descritas acima, pesquisadores desenvolveram

grande quantidade de inibidores BACE-1 na última década. Alguns destes

servindo apenas para compor uma estratégia de desenvolvimento posterior,

porém outros com utilização promissora e testes realizados in vitro(17). O fato é

que, até o momento, temos algumas moléculas promissoras, mas nenhum

novo fármaco.

2 - Objetivo.

Este trabalho tem como objetivo realizar uma Triagem Virtual (do inglês Virtual

Screening – VS), seguida de Ancoragem (do inglês Docking) Molecular, para

selecionar inibidores BACE-1 candidatos a fármacos contra doença de

Alzheimer.

2.1 - Objetivos específicos.

Construção de modelo farmacofórico da BACE-1 baseado na estrutura do

receptor (SBDD);

Validação do modelo farmacofórico construído;

Aplicar o modelo farmacofórico na triagem virtual.

3 - Materiais e Métodos.

3.1 Ferramentas computacionais.

Todos os estudos de planejamento de fármacos auxiliado por computador (do

inglês Computer-Assisted Drug Design – CADD) foram realizados em estações

11

computacionais disponíveis no Laboratório de Integração entre Técnicas

Experimentais e Computacionais no Planejamento de Fármacos (Litec) da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas e Bioquímica – USP.

Formam utilizados os programas PYMOL®, BIOEDIT®, GRID®, AUTODOCK®,

plataforma SYBYL®, CHEMDRAW® e GOLD 5.2®; além do banco de dados

ZINC15 para a triagem virtual.

3.2 Seleção da estrutura 3D

O inibidor 5HA co-cristalizado com a BACE-1 (Código PDB: 3TPP) foi

selecionado como modelo, visto que apresentou IC50 de 15 nM in vitro e de 29

nM ensaios celulares, seletividade 15 vezes em relação a BACE-2, 500 vezes

em relação a catepsina D e ainda seletividade maior do que 3000 vezes em

relação a renina

3.3 Campos de Interação molecular.

Uma análise dos campos de interação molecular (do inglês, MIF - Molecular

Interactions Fields) foi realizada no programa GRID, utilizando sondas

determinação das características físico-químicas (Tabela 3). A caixa de 15 Å x

15 Å x 15 Å de eixo, com uma resolução de 5.0 Å, foi centrada no inibidor 5HA,

e suas coordenadas são definidas nos eixos x, y e z.

Tabela 3. Sondas utilizadas para calcular os campos de interações.

Código da Sonda Descrição

C (carbono alifático) Avalia as interações apolares de cadeia aberta.

A (aromático) Avalia as interações apolares de resíduo aromático.

OA (oxigênio HBA) Oxigênio aceptor de ligação de hidrogênio.

N (nitrogênio não HBA) Nitrogênio não aceptor de ligação de hidrogênio.

NA (nitrogênio HBA) Nitrogênio aceptor de ligação de hidrogênio

SA (enxofre HBA) Enxofre aceptor de ligação de hidrogênio.

*HBA- Hydrogen Bond Acceptor (aceptor de ligação de hidrogênio).

3.4 Docking

Para validação da metodologia foi realizado o Reedocking do inibidor 5HA

(programa GOLD 5.2®), com caixas de 5, 8 e 10 Angstrom(Å).

O docking dos ligantes foi realizado no programa Gold 5.2® com 30 poses para

cada estrutura e caixa de análise de 10 Å de modo a refinar a seleção, com os

mesmos parâmetros adotados e validados no ReeDocking.

12

3.5 Virtual Screening - VS

Foi utilizado o banco de dados ZINC15, contendo 35 milhões de compostos,

nos estudos de triagem virtual. Inicialmente, uma filtragem destes compostos

foi realizada utilizando um filtro de propriedades físico-químicas que

representasse o espaço drug-like (número de HBD entre 0 e 5, número de HBA

entre 0 e 10 e logaritmo do coeficiente de partição octanol/água (logP) entre -

2,5 e 5,5), mantendo no máximo 1 grupo nitro para evitar toxicidade dos

compostos e carga formal entre -2 e 2 para evitar grandes problemas de

permeabilidade celular. A partir da aplicação deste filtro, apenas 11 milhões de

compostos foram mantidos na base de dados. Assim sendo, o programa

UNITY implementado no pacote computacional SYBYL.2.1 foi empregado para

a triagem de compostos que possuem os pontos identificados pelo modelo

farmacofórico.

4 – Resultados.

4.1 - Alinhamento dos resíduos de 10 estruturas cristalográficas no

programa BIOEDIT® (visão 1D).

Após a escolha do PDB 3TPP como referência, fez-se necessário avaliar a

conservação dos resíduos de aminoácidos entre as várias estruturas

cristalograficas da BACE-1. Para isso foram selecionados 10 estruturas

(incluindo a 3TPP) junto ao banco de dados (Research Collaboratory for

Structural Bioinformatics - RCSB)28; tendo como parâmetro de escolha as

estruturas com melhor resolução (tabela 4). Este alinhamento possibilitou

visualizar todos os aminoácidos componentes das enzimas cristalografadas e,

dessa forma, avaliar sua conservação nas referidas estruturas encontradas no

PDB (Figura 5).

4.2 - Visualização 3D no Pymol® e tratamento da estrutura PDB:

3TPP

As mesmas 10 estruturas foram visualizadas e alinhadas no programa Pymol®,

para avaliação das caracteristicas tridimensional (Figura 6).

Após este alinhamento, foi necessário tratar tanto a visualização da enzima

quanto do seu ligante (PDB 3TPP) utilizando o programa Pymol®. Esse

tratamento consistiu na extração da estrutura do ligante (5HA), gerando dois

novos arquivos, um só com o ligante e outro da enzima sem ligante (Fig. 7). As

duas estruturas tratadas foram transferidas para o programa Autodock®, no

qual foram analisadas pela função Autogrid.

13

Tabela 4. Seleção dos 10 PDBs para estudo de conservação e alinhamento

dos resíduos de aminoácidos. Resolução menor que 1.8 Å

Código PDB Resolução (Å) Ligante

3TPP 1.6 5HA

2QP8 1.5 SC7

2VIJ 1.6 C44

2VIZ 1.6 VG4

2VJ7 1.6 VG6

2VJ9 1.6 VG7

2QMD 1.65 CS7

2B8L 1.7 5HA

2IQG 1.7 F2I

1W50 1.75 IOD

Figura 5. Imagem demonstrativa com parte do alinhamento dos resíduos das

10 estruturas cristalográficas selecionadas.

Figura 6. Visualização 3D (retirada do programa PYMOL®) da sobreposição

das 10 estruturas cristalográficas.

14

Figura 7. Imagem tratada do ligante 5HA (esquerda) e da enzima isolada do

seu ligante (direita). Código PDB: 3TPP

4.3 - Avaliação das Interações.

No programa Autodock®, com a função Autogrid, foram estipuladas as

dimensões da caixa de análise, de modo que abrangesse toda a área ocupada

pelo ligante 5HA junto à enzima (dimensões da caixa de análise 15X15X15Å).

Foi realizado então um Autogrid, uma técnica de modelagem molecular muito

importante no desenvolvimento de fármacos, que estuda a interação energética

entre o ligante e o receptor, utilizando para isso campo de interação molecular

(do inglês, MIF-Molecular Fields Interactions). As forças envolvidas são

múltiplas, entre elas forças eletrostáticas, dinâmicas e estéricas, além de

intrínsecas do inibidor, como graus de flexibilidade e interações com o solvente.

4.4 - Construção do Modelo Farmacofórico.

‘’ O farmacóforo pode ser definido como o arranjo e orientação espacial de um

conjunto de características eletrônicas e estéricas necessárias para garantir as

interações supramoleculares ótimas com a estrutura do alvo biológico

específico’’ 26.

Tendo em mente essa definição, o modelo farmacofórico deve possuir alta

complementaridade química e estrutural em relação ao receptor-alvo.

Para construir o modelo farmacofórico foram utilizadas as muitas informações

obtidas até aqui; o mapa de interações tridimensionais, visualizações no

Pymol®, pesquisa na literatura, nos bancos de dados (RCSB) e uma nova

informação, a visão 2D (Ligplot - Figura 8).

Com todos esses dados, foram estipulados seis pontos de interação

específicos (três são pontos doadores de ligação de hidrogênio, um ponto

aceptor de ligação de hidrogênio e dois pontos hidrofóbicos/ aromáticos), onde

a ligação do inibidor seria mais possível de ocorrer. Estipulados esses pontos

de interação, o modelo farmacofórico foi visualizado no Pymol® (Figura 9) e a

distância entre os pontos selecionados também pode ser avaliada.

15

Figura 8. Imagem 2D demonstrando as interações entre a enzima e o inibidor

(PDB 3TPP). Em verde as interações hidrofóbicas; em pontilhado as ligações

intermediadas por hidrogênio. Imagem retirada do site https://www.rcsb.org.

Figura 9. Modelo farmacofórico construído com todas as informações

coletadas. Em azul os resíduos doadores de ligação de hidrogênio, em amarelo

resíduo aceptor de ligação de hidrogênio e em vermelho os grupos

hidrofóbicos.

16

4.5 - Validação do Modelo Farmacofórico.

Paralelamente a confecção do modelo farmacofórico uma série de inibidores de

BACE-1 foram selecionados (Tabela. 5).

Após seleção de 15 inibidores, os mesmos foram desenhados no programa

CHEMDRAW® e convertidos e SMILES (código binário, linguagem mais leve

para envio via internet – Figura 10), para serem utilizados no site

http://dude.docking.org (DUD-E: Database of Useful (Docking) Decoys-

Enhanced) onde são gerados os decoys (molécula inativa). O mesmo site

retorna um conjunto de novas estruturas (também em forma SMILES) para a

validação. Assim, foram usadas 60 estruturas para validação do modelo

construído.

Para validação, o modelo farmacofórico deve ser capaz de encontrar as

moléculas ativas no meio dos decoys. Para isso, a metodologia adotada foi a

ROC (Característica de Operação do Receptor (COR), ou Receiver Operating

Characteristic (ROC), ou simplesmente curva ROC), que consiste em uma

representação gráfica que ilustra o desempenho de um sistema classificador

binário e como o seu limiar de discriminação é variado, assim, identificando a

capacidade desse modelo proposto de encontrar moléculas com possível

potencial de atividade, por isso usamos as moléculas que já possuem atividade

contra seu alvo e contra os decoys.

Tabela 5: Seleção das 15 estruturas (códigos PDBs) para estudo de validação,

com seus respectivos ligantes.

Código PDB Ligante Código PDB Ligante Código PDB Ligante

5T1U P6U 5HU1 66F 5HD0 60Y

5T1W 74B 5ENM 5QU 5EZZ 5T6

5TOL 7H3 5KR8 6WE 5CLM 52K

5HTZ 66J 5I3V 68M 4ZPE 4QA

5HU0 66H 5IE1 6BS 3TPP 5HA

C[C@H]1CCc2c(sc(c2C(=O)OC)NC(=O)[C

@H]()N3C(=O)c4ccccc4C3=O)C1

Figura 10. Exemplificação da conversão de

uma estrutura química tridimensional em

um SMILE. As duas representações do

inibidor 5HA; a direita estrutura química e

acima forma SMILE.

17

A curva ROC gerada demonstrou a validade do modelo farmacofórico, onde

fica evidenciado a alta sensibilidade e especificidade do modelo, como pode

ser visto no gráfico 1. Com o modelo validade foi realizado o VS.

Gráfico 1. Curva ROC com os valores de especificidades e sensibilidade.

4.6 - ReeDocking

Para validar a metodologia de docking, foi realizado o Reedocking do inibidor

5HA (programa GOLD 5.2®) com caixas de 5, 8 e 10 Angstrom(Å).

Assim, retirou-se o ligante (5HA) da enzima (PDB 3TPP) e depois o mesmo foi

docado, em poses diferentes, com graus de rotação e flexibilidade (Docking

‘’de novo’’), usando caixas de análise de tamanhos diferentes e funções

matemáticas de pontos (GoldScore e ChemScore - dois parâmetros para

melhor interpretação e validação) para avaliar qual a melhor dimensão para

realizar o Docking. Foram rodadas 30 poses para cada tamanho de caixa, o

que gerou 90 poses do ligante no Docking ‘’de novo’’.

Baseado no Score e na análise visual das poses geradas no Reedocking, foi

selecionado o tamanho de 10 Å como o melhor para aplicação no docking,

visto que nesse tamanho foram geradas a maior quantidades de poses

coerentes com a estrutura inicial, contida no PDB 3TPP.

4.7 - Triagem Virtual (do inglês Virtual Screening – VS)

Com os pontos de interação estipulados para o modelo farmacofórico, foi

realizada a triagem das possíveis estruturas moleculares candidatas a inibidor

BACE-1. O bando de dados utilizado foi o Zinc15, com um total 35 milhões

estruturas analisadas, (reduzidas para 11 milhões com o filtro de propriedades

físico-químicas) desta foram selecionadas 84 estruturas como promissoras,

através do programa Sybyl®. Nas 84 estruturas químicas selecionadas

18

encontravam-se isômeros, o que reduziu o total de moléculas para 40

compostos diferentes.

4.8 - Docking das estruturas do VS.

Após a triagem foi realizado um docking (programa Gold 5.2®) de 30 poses

para cada estrutura, a fim de refinar a seleção, com os mesmos parâmetros

adotados e validados no ReeDocking.

Um Score foi estabelecido pelo programa, indicando as melhores poses de

cada uma das 40 estruturas (Tabela 6), tais poses foram analisadas

visualmente, também, no programa Pymol®, para melhor qualificá-las. Poucas

discrepâncias foram encontradas entre a melhor pose segundo o score do

programa e a análise visual (Tabela 7).

Todas as melhores poses do docking foram analisadas visualmente no

programa Pymol®, estipulando um valor aleatório de 1 (um) para cada ligação

efetiva entre a molécula e o modelo farmacofórico (Tabela 8). Desta maneira foi

possível escolher algumas poucas moléculas promissoras para dar

prosseguimento na obtenção de um fármaco.

Tabela 6. As 40 moléculas distintas com sua melhor pose (melhor Score) e

seus respectivos códigos do banco de dados ZINC15.

Código da Molécula

Melhor SCORE

Código Zinc Código da Molécula

Melhor SCORE

Código Zinc

M2 26 ZINC000504217416 M41 20 ZINC000493957137

M3 1 ZINC000504657678 M42 11 ZINC000493968003

M5 29 ZINC000123207862 M43 1 ZINC000496077281

M9 6 ZINC000154594226 M45 14 ZINC000496199038

M11 8* ZINC000154634613 M46* 22 ZINC000496312264

M13 12* ZINC000154816113 M47 30 ZINC000497053495

M15 26 ZINC000178871872 M49 10 ZINC000504530982

M17 3 ZINC000178871894 M50 23 ZINC000504807277

M19 3 ZINC000189692489 M51 7 ZINC000120092803

M21 11 ZINC000189692522 M56 12 ZINC000123238176

M23 28 ZINC000193144953 M57 4 ZINC000126153540

M25 28 ZINC000285881986 M60 27 ZINC000130595327

M28 27 ZINC000285881992 M63 4 ZINC000154584695

M29 24 ZINC000337274693 M64 6 ZINC000154584788

M31 20 ZINC000492220486 M66 3 ZINC000179042436

M32 18 ZINC000492220487 M68 27 ZINC000179042450

M34 25 ZINC000426254929 M71 1 ZINC000293471666

M35 1* ZINC000004774977 M75 3 ZINC000493326397

M36 23 ZINC000004023143 M78 28 ZINC000493326405

M37 16 ZINC000504707079 M84 1 ZINC000492202475

*discrepância entre o melhor score e a observação no programa Pymol®.

19

Tabela 7. Discrepâncias encontradas entre as melhores poses segundo a

pontuação Score e análise visual.

Molécula Triada Melhor Score Melhor visual

M11 8 26

M13 12 3

M35 1 20

M46 22 9

Tabela 8. Interação efetiva entre o modelo farmacofórico e as moléculas

triadas. Estão colocados os resíduos participantes do modelo e suas

respectivas características de ligação. Valor arbitrário de 1 (um) para cada

ligação observada (marcadas com um X).

ANÁLISE VISUAL DAS INTERAÇÕES MODELO FARMACOFÓRICO - MOLÉCULAS TRIADAS

DOADOR ACEPTOR HIDROFÓBICA

MOLÉCULA/POSE ASP 32 GLN 73 ASN 233 ASP 228 PHE 108 TRP 115 TOTAL

M2/26 X X X X X 5 M3/1 X X 2 M5/29 X X 2 M9/6 X X 2 M11/8 X X 2 M13/12 X 1 M15/26 X X X 3 M17/3 X X X X 4 M19/3 X X 2 M21/11 X 1

M23/28 X X 2 M25/28 X X 2 M28/27 X X 2 M29/24 X X 2 M31/20 X X 2 M32/18 X X 2 M34/25 X X 2 M35/1 X 1 M36/23 X 1 M37/16 X X 2 M41/20 X X 2 M42/11 X 1 M43/1 X X 2 M45/14 X X 2 M46/22 X X X 3 M47/30 X X 2 M49/10 0 M50/23 X 1 M51/7 X X X 3 M56/12 X X 2 M57/4 X X 2 M60/27 X X X 3 M63/4 X X 2 M64/6 X 1 M66/3 X X X X 4 M68/27 X X X 3 M71/1 X X X X X 5 M75/3 X X 2 M78/28 X X 2 M84/1 X X 1

20

5 – Discussão.

Analisando as moléculas, após o docking, no Pymol, foi possível estabelecer as

que tiveram maior interação com o modelo farmacofórico. Assim, com maior

probabilidade de agirem como inibidores da BACE-1. Entenda-se com melhor

interação com o modelo farmacofórico uma quantidade maior de ligações

efetivas (representado pela distância equivalente de 4 Å para ligações

intermediadas por hidrogênio e de 2 a 4 Å quando hidrofóbica) entre os pontos

selecionados no modelo e as moléculas triadas. Com todos os dados em mãos,

foram selecionadas as estruturas M2, M17, M66 e M71, que obtiveram a

melhor interação com o modelo farmacofórico quando das medidas de suas

ligações com o modelo (Gráfico 2), suas respectivas imagens foram extraídas

do banco de dados ZINC1529 (Figura 11).

Gráfico 2. Moléculas agrupadas segundo a quantidade de interações com o

modelo farmacofórico. Em destaque as moléculas com maiores quantidades de

interações e selecionadas como possíveis inibidores.

Figura 11. Estruturas químicas

das moléculas selecionadas,

com seu respectivo código

ZINC.

21

As estruturas selecionadas mostraram boa afinidade pelo modelo farmacofórico

(Figura 12), estabelecendo consideráveis ligações com ele (Figura 13). As

quatro estruturas selecionadas apresentam dois anéis, que diferentemente do

que possam parecer na figura 13, não são sempre coplanares, podendo

posicionar-se de forma até perpendicular, melhorando, assim, as interações

entre as moléculas selecionadas e o modelo farmacofórico, lembrando que as

interações e estruturas não são estáticas e sim dinâmicas.

FIGURA 12. Enzima BACE-1 com destaque para os resíduos que compõem o

modelo farmacofórico.

Figura 13. Imagem das interações efetivas das quatro moléculas escolhidas.

Os pontilhados em vermelho representam as ligações que ocorrem entre os

resíduos da BACE-1 e os compostos escolhidos. Direita M2 e M71; esquerda

M17 e M66.

22

6 - Conclusão

A Triagem Virtual - VS mostrou-se bastante eficiente, pois foi capaz de

selecionar com clareza e robustez as possíveis moléculas bioativas (do inglês

hit) em meio a uma coleção de estruturas químicas de 35 milhões de

compostos. Desta forma, foram selecionados quatro (4) compostos (M2, M17,

M66 e M71) para compra ou síntese, a fim de dar prosseguimento a este

trabalho.

Vale ressaltar que os compostos selecionados são apresentados com dois

ciclos coplanares, mas isso não é o que ocorre quando da interação, sendo

possível a síntese de tais compostos em planos diferentes, o que poderia

estabelecer mais ligações efetivas entre as moléculas triadas e o modelo

farmacofórico.

A parte computacional foi bem-sucedida, sendo necessária (a partir de agora)

uma abordagem experimental, com testes in vitro para avaliar a eficácia das

moléculas triadas frente à enzima BACE-1, e prosseguir com a busca por um

fármaco eficaz no combate da Doença de Alzheimer.

7 - Referências.

1. ROBBINS E COTRAN, Bases Patológicas das Doenças. 8.ed. Rio de

Janeiro: Elsevier, 2010, p. 1325-1331.

2. SELKOE, D. J. Physiol. Rev., v. 81, p.741–766, 2001.

3. GUZEN,F. P.; CAVALCANTE,J.R. Influência das proteínas Beta

Amiloide e Tau na Doença de Alzheimer. Facene/Famene - 2012;

v.10, p.57-60, 2012.

4. http://www.alzheimer-haus.de. Acessado entre Dezembro de 2016 e

Fevereiro de 2017.

5. http://www.institutoalzheimerbrasil.org.br. Acessado entre Dezembro de

2016 e Fevereiro de 2017.

6. ALZHEIMER, A. Über eine eigenartige Erkrankung der Hirnrinde

Allgemeine Zeitschrift fur Psychiatrie und Psychisch-gerichtliche

Medizin. 1907 Jan ; 64():146-8. Disponível em: http://www.alzheimer-

haus.de. Acesso em: 15 01 2017.

7. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs362/es/. Acessado entre

Dezembro de 2016 e Fevereiro de 2017.

23

8. PORTH, C.M.; MATFIN, G. Fisiopatologia. 2.ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2010. p.1405-1409.

9. http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/populacao. Acessado entre

Dezembro de 2016 e Fevereiro de 2017.

10. Herrera, E.J.; Caramelli, P; Silveira, A.A.S.; Nitrini, R. Epidemiologic

survey of dementia in a community-dwelling Brazilian population.

Alzheimer Dis Assoc Disord, v.16, n.2, p. 103-8, 2002.

11. Nitrini, R.; Caramelli, P; Herrera, J.R. Incidence of dementia in a

community-dwelling brazilian population. Alzheimer Dis. Assoc.

Disord., v. 18, n 4, p. 241-6, 2004.

12. Herrera, E.J.; Caramelli, P.; Nitrini, R. Estudo epidemiológico

populacional de demência na cidade de Catanduva, Estado de São

Paulo, Brasil. Ver. Psiquiatr.clín; 25(2):70-3,1998.

13. Thojanowsky J. O., Kenyon L.(2008). The nervous systen. apud PORTH,

C.M.; MATFIN, G. Fisiopatologia. 2.ed. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, 2010. p.1405-1409.

14. Frosch M. P, Anthony D.C., DeGirolami U. (2005). The central nervous

system. apud PORTH, C.M.; MATFIN, G. Fisiopatologia. 2.ed. Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan, 2010. p.1405-1409.

15. Lippincott Williams & Wilkins. Handbook of pathophysiology, 2.ed.,

2005. p. 659.

16. KANG,J.; LEMAIRE, H. G.; UNTERBECK, A.;SALBAUM, J. M.;.

MASTERS, C. L; GRZESCHIK, K. H.;MULTHAUP, G.; BEYREUTHER,

K.; MULLER-HILL,B. Nature, 1987, 325, 733–736. apud, GHOSH, A. K.;

HEATHER L. O. BACE1 (b-secretase) inhibitors for the treatment of

Alzheimer’s disease. Chem. Soc. Rev., v.43, p. 6765, 2014.

17. GHOSH, A. K.; HEATHER L. O. BACE1 (b-secretase) inhibitors for

the treatment of Alzheimer’s disease. Chem. Soc. Rev., v.43, p. 6765,

2014.

18. Haass, C.; Lemere, C. ; Capell, A.; Citron, M.; Seubert, P. ; Schenk, D.;

Lannfelt L. ; Selkoe, D. J. Nat. Med., 1995, 1, 1291–1296. apud,

GHOSH, A. K.; HEATHER L. O. BACE1 (b-secretase) inhibitors for

the treatment of Alzheimer’s disease. Chem. Soc. Rev., v.43, p. 6765,

2014.

19. SELKOE, D. J.; JAMA, J. A. Med. Assoc., v. 283, p.1615–1617, 2000.

20. HARDY, J.; SELKOE, D. J. Science, v. 297, p.353–356, 2002

21. D. J. Selkoe, Science, v. 298, p.789–791, 2002. apud, GHOSH, A. K.;

HEATHER L. O. BACE1 (b-secretase) inhibitors for the treatment of

Alzheimer’s disease. Chem. Soc. Rev., v.43, p. 6765, 2014.

22. J. Med. Chem., v.48, p. 3749-3755, 2005.

23. GHOSH, A. K.; BILCER, G.; HARWOOD, C.; KAWAHAMA, R.; SHIN, D.;

HUSSAIN, K. A.; HONG, L.; LOY, J. A.; NGUYEN, C.; KOELSCH, G.;

ERMOLIEFF, J.; TANG, J. Structure-Based Design: Potent Inhibitors

24

of Human Brain Memapsin 2 (â-Secretase). J. Med. Chem., v.44, p.

2865-2868, 2001.

24. MIYAMOTO, M.; MATSUI, J.; FUKUMOTO, H.; TARUI, N. Patent WO

01/187293, 2001.

25. BHISETTI, G. R.; SAUNDERS, J. O.; MURCKO, M. A.; LEPRE, C. A.;

Britt, S. D.; COME, J. H.; DENINGER, D. D.; WANG, T. Vertex

Pharmaceuticals Incorporated, Patente WO 02/88101, 2002.

26. MONTANARI, C. A. Química Medicinal: Métodos e Fundamentos em

Planejamento de Fármaco. São Paulo: Edusp, 2011. 714p.

27. AVILA, C.M. Estudos de modelagem molecular para o planejamento

estrutural de novos protótipos antiinflamatórios inibidores da ikk-β.

Rio de Janeiro, 2010. 160p. Dissertação de Mestrado - Instituto de

Ciências Biomédicas – Universidade Federal do Rio de Janeiro – RJ

28. Protein Data Bank. Disponível em: https://www.rcsb.org/pdb/. Acessado

entre Outubro de 2016 e Julho de 2017.

29. Banco de Dados Gratuitos Zinc. Disponível em: http://zinc.docking.org/.

Acessado entre Fevereiro e Agosto de 2017.

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Data e assinatura do aluno(a) Data e assinatura do orientador(a)