AUTOINMUNIDAD EN LA

DIABETES MELLITUS

PERSPECTIVA DESDE EL

LABORATORIO

Mª Teresa Herrera del Rey

Unidad de Gestión Clínica de Laboratorios

HH.UU Virgen del Rocío Sevilla

I ) Diabetes tipo 1:

A. Inmunomediada

B. Idiopática

II ) Diabetes tipo 2

III) Otros tipos específicos:

1.- Defectos genéticos de la función de la célula β (MODY,

mitocondrial)

2.- Defectos genéticos de la acción de la insulina

3.- Enfermedades del páncreas exocrino

4.- Endocrinopatías

5.- Inducida por fármacos

6.- Infecciones

7.- Formas no comunes de diabetes inmunomediada

8.- Otros síndromes genéticos asociados ocasionalmente con diabetes

IV ) Diabetes gestacional

CLASIFICACIÓN ETIOLÓGICA DE DIABETES MELLITUS

DIABETES TIPO 1 AUTOINMUNE

En 1998 se presentan los resultados del estudio UKPDS:

Seguimiento de 5000 pacientes con DM tipo 2 durante 20 años.

Relación entre control intensivo de glucemia y morbi-mortalidad.

HALLAZGO: 7.5-10% de los pacientes diagnosticados de DM tipo 2

presentaron autoanticuerpos positivos ( anti- GAD e IA-2 ), no obesos y

con pocas manifestaciones de síndrome metabólico.

Edad < 50 años

Síntomas agudos

IMC<25

Anti- GAD positivos

Requieren insulina

LADA (Latent Autoimmune Diabetes in Adults)

T1D onset

<10 years

T1D

adult

onset

Autoimmune

phenotypic T2D

Nonimmune

phenotypic T2D

Age-related

deterioration of

glucose

tolerance

Debido a los descubrimientos de los últimos años, se propone un

cambio en el esquema de la clasificación tradicional de la

diabetes.

Tradicionalmente:

Edad de inicio

Síntomas hiperglucemia

Cetosis

Obesidad

Necesidad de tratamiento con

insulina

Actualmente: el sistema

inmune juega un papel

importante en la DM 2, con

similitudes y diferencias

entre DM 1 y DM2.

Is diabetes mellitus a continuous spectrum? Brooks-Worrell B, Palmer JP. Clinical Chemistry February 2011 vol. 57 no. 2 158-161

IS DIABETES MELLITUS A CONTINUOUS SPECTRUM?

PREDICCIÓN RIESGO DIABETES

• Marcadores genéticos

Sistema de antígenos humanos HLA: DR3/4 y DQ2/8 (2,4% desarrollan ICAs + antes de los 5 años) (No defecto genético sino variantes de genes)

• Pruebas metabólicas

Test tolerancia glucosa

Hemoglobina glicosilada (>6,5%)

• Medición de autoanticuerpos

AUTOANTICUERPOS EN LA DIABETES

ANTI ISLOTES PANCREÁTICOS (ICA)

ANTI INSULINA

ANTI GLUTAMATO DESCARBOXILASA (GADA)

ANTI TIROSINA FOSFATASA (IA-2)

TRANSPORTADOR ESPECÍFICO DE Zn T8

ANTICUERPOS CONTRA ANTÍGENOS DEL CITOPLASMA DE LAS CÉLULAS DE LOS ISLOTES PANCREÁTICOS (ICA)

• Descubiertos en 1974 (Bottazzo et al. Lancet)

• Positivos en aprox. 80% pacientes con diabetes mellitus

(DM) tipo1 recién diagnosticada

• Disminuyen conforme merma el funcionamiento de los

islotes

• Tipo IgG

Inmunofluorescencia indirecta (IFI)

Conjugado

anti-hIgG /

fluorocromo

Analito

Ej.: ICA

Luz

UV

Tejido

Ej.: Páncreas Islotes Acinos

Detección de ICA mediante inmunofluorescencia

indirecta sobre un corte de páncreas.

ANTI INSULINA IAA

• Anticuerpos frente a la insulina (previo a la

administración de insulina)

Palmer et al (1983) describieron la presencia

de anticuerpos contra la insulina en el 50% de

pacientes de diagnóstico reciente (RIA)

• Su frecuencia estaba asociada a la edad:

niños, sobre todo menores de 10 años (RIA)

• Informes contradictorios sobre su prevalencia y

valor pronóstico que parecen debidos a la diferente

metodología utilizada para su medición

• Los que se miden por RIA se encuentran más

vinculados a la enfermedad

• Los que se miden por ELISA no sirven para el

diagnóstico de la Diabetes Mellitus, sí para el

diagnóstico de las hipoglucemias autoinmunes.

ANTI INSULINA IAA

ANTI DESCARBOXILASA DEL ÁCIDO GLUTÁMICO (GAD)

• Específicos contra enzima glutamato

decarboxilasa, síntesis del neurotransmisor

inhibidor ácido gamma-amino-butírico (GABA)

• Dos genes GAD:

GAD1: se traduce en proteína GAD67 (islotes de

ratón)

GAD2 (cromosoma 10): proteína GAD65 (islotes

cél. β humanos)

ANTI DESCARBOXILASA DEL ÁCIDO GLUTÁMICO (GAD)

• Más del 70% de los pacientes de reciente

diagnóstico tienen niveles positivos después 10

años

• El GAD debe ser considerado como la primera

herramienta de screening.

• En DM tipo 2 distinguen a los pacientes que

necesitan insulina (LADA) (Van Deutekom y cols.

Diabet Med.2088;25:117-25)

ANTI TIROSINA FOSFATASA DE MEMBRANA IA-2

ICA-512

Glicoproteína transmembrana perteneciente a la

familia de las proteínas tirosina fosfatasa, localizada

en los gránulos secretores densos de las células

endocrinas secretoras de proteínas y las neuronas

Favorece unión de los gránulos secretores al cito-

esqueleto: activa transporte celular y la exocitosis

ANTI TIROSINA FOSFATASA DE MEMBRANA IA-2

•Son los de mayor valor predictivo positivo (VPP)

•Su presencia en la fase preclínica en niños predice

progresión a diabetes clínica (Grise y cols.

Diabetologia 2010; 53:517-524)

•Método de determinación: RIA y ELISA

Inmunoanálisis con reactivos marcados

- Con compuestos radiactivos:

RIA heterogeneo competitivo

IRMA heterogeneo no competitivo

- Con enzimas: Enzimoinmunoanálisis

Peroxidasa, fosfatasa alcalina, Glucosa 6-fosfato, deshidrogenasa, B- galactosidasa...

Ventajas ELISA

Disponibles comercialmente

Se pueden conjugar por técnicas simples

Tienen varios sustratos

No se utiliza radiactividad (problema de desechos,etc)

En nuestro laboratorio realizamos como apoyo al diagnóstico del

debut diabético:

Ac. Anti GAD

Ac. IA-2

Método de determinación

mediante ELISA en

microplaca.

Analizador Triturus (Grifols)

IA-2

Incubación 16-20 h

IA2 - biotina

Lavado

Streptavidina -

Peroxidasa

TMB

Streptavidina -

Peroxidasa

Streptavidina -

Peroxidasa

Lavado

450 nm

A - [C] ELISA IA-2

MODELOS ELISA

MATRIZ

Pocillo de la

micro placa

INSULINA

Analito: IAA

anti-IgG

humana

conjugado

con

peroxidasa

Mab anti-IgG

humana

Conjugado

anti-rIg /

peroxidasa

ELISA convencional aELISA (amplificado)

Ag

absorbido

a la

superficie

Sustrato tetra metil

bencidina (TMB)

Expresión de Trx-GAD en E. coli

Obtención de la

fracción

intracelular soluble

Trx-GAD-biotina Biotinilación

Determinación de GADA

Marcación de la Trx-GAD recombinante con biotina

ELISA Ag-específico (Ae-ELISA)

Trx-GAD

Trx-GAD-biotina

Avidina-Px

Purificación

Thio-Bond

Resin

*

Trx-GAD *

GADA

Se utiliza como

LIGANDO un

CONJUGADO

GADA65-BIOTINA

(IA-2-BIOTINA)

Función: transportar zinc desde el citoplasma

de las células beta al interior del gránulo de

secreción

Es el principal autoantígeno descubierto en los

últimos 10 años

Transportador de Zn T8

Específico de células beta

Aporta información complementaria al

resto de los autoanticuerpos, aumentando

el porcentaje de detección

Método de determinación: RIA y ELISA

Transportador de Zn T8

IAA: RESULTADOS DISCORDANTES ENTRE RIA

Y ELISA

“ La comparación frecuente de los méritos relativos de los

métodos radiactivos y enzimáticos es básicamente errónea, ya

que los principios que rigen estos ensayos son diferentes”

R. Ekins, 1980

Conocer la prevalencia de auto-anticuerpos anti-GAD, anti-IA-2 y anti-insulina en el debut de la diabetes mellitus en nuestro medio, medidos mediante técnica ELISA.

Valorar su papel como apoyo diagnóstico.

OBJETIVOS

MATERIAL Y METODOS

• Estudio observacional descriptivo para determinación de prevalencia y valoración de pruebas diagnósticas

• Muestra 111 pacientes debut diabético: 61 DM tipo 1 (incluye 12 casos DM tipo LADA (Latente Autoinmune del Adulto), 50 DM tipo 2. Grupo control de 64 personas no diabéticas.

• Enzimoinmunoanálisis en micro placa: Glutamic Acid Decarboxylase (GAD) Autoantibody ELISA kit from RSR (RSR Limited), IA-2 Autoantibody ELISA versión 2 kit from RPR y AESKULISA Insulin-G (AESKU DIAGNOSTICS) para IAA.

• Criterio (+): GADA >5 U/ml, IA-2 >7,5 U/ml e IAA >15 U/ml.

• Análisis estadísticos mediante paquete PASW Statistics versión 18.

RESULTADOS

PREVALENCIA AUTOANTICUERPOS EN DIABETES MELLITUS DE INICIO

RESULTADOS

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

%

Figura 1. Gráfico de frecuencias

Anti-GAD 78,7 2,0 7,8

Anti-IA2 31,7 4,0 3,1

IAA 10,3 6,0 1,7

DM 1 DM 2 Control

VALORES MEDIANAS AUTOANTICUERPOS

Muestra Medianas (U/ml) Percentil 25-75

Control 2.59 1.88 – 3.54

GAD DM 1 108.00 4.56 – 304.00

DM 2 1.84 1.54 – 2.64

Control 5.16 4.56 – 5.70

IA2 DM 1 6.05 5.28 – 264.50

DM 2 5.21 4.73 – 5.73

Control 2.22 1.39 – 4.05

IAA DM 1 3.17 2.04 – 5.75

DM 2 3.72 1,69 – 5.84

GAD IA2 IAA

Control - DM 1 P< 0.0001 P< 0.0001 P = 0.0309

Control - DM 2 P = 0.0176 P = 0.3269 P = 0.0196

DM 1 - DM 2 P< 0.0001 P = 0.0002 P = 0.5850

0

20

40

60

80

100

120

Gráfico 2. Medianas

CONTROL 2,58 5,16 2,22

DM 1 108 6,05 3,17

DM 2 1,83 5,26 3,84

GAD IA2 IAA

RESULTADOS

CURVAS ROC (RECEIVER

OPERATING

CHARACTERISTICS)

RESULTADOS

La diabetes Mellitus tipo I es una enfermedad asociada a fenómenos de auto inmunidad humoral y celular que pueden ser detectados tanto en el momento del diagnóstico clínico como mucho tiempo antes.

La predicción de riesgo de diabetes incluye la combinación de marcadores genéticos, pruebas metabólicas y medición de auto-anticuerpos.

Los auto anticuerpos son de gran utilidad como marcadores precoces de enfermedad y como apoyo diagnóstico.

CONCLUSIONES

Los informes contradictorios sobre su prevalencia parecen debidos a los distintos procedimientos utilizados para su análisis.

Las técnicas ELISA, de fácil realización están sustituyendo a los métodos RIA, salvo en el caso de IAA, donde ELISA no alcanza la sensibilidad de RIA.

En nuestro estudio, la prevalencia de GAD (+) en el debut diabético es alta, y su determinación se ha mostrado eficaz para el diagnóstico de MD tipo 1. También lo son, aunque en menor medida IA-2.

La determinación conjunta de GAD e IA-2 incrementa la probabilidad de diagnóstico.

Los anticuerpos IAA no tienen valor como marcador en el diagnóstico y tipificación de diabetes mellitus

CONCLUSIONES

Momento actual El GAD es el parámetro más fiable para el apoyo al

diagnóstico de la DM I y LADA. 78% positividades en el debut de la DM I

IA-2: nuestra técnica por ELISA RSR junto con Medipan son las técnicas más utilizadas.

Los laboratorios Royal Devon and Exeter NHS utilizan técnicas ELISA RSR para IA-2 y GAD.

Estamos trabajando en mejorar la especificidad y la sensibilidad de los ensayos IA-2.

Estamos inscritos en un programa internacional de controles, puestos en marcha a partir de Enero 2013 dentro de la estandarización de los anticuerpos.

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