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Page 1: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Universidad Nacional Andrés Bello

Facultad de Medicina

Escuela de Tecnología Médica.

Unidad de Investigación

Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

moléculas MIP3α y SLPI en células epiteliales de trompa de

Falopio humana infectadas con Neisseria gonorrhoeae.

Diciembre, 2017

Sede República

Page 2: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Índice

Resumen……………………………………………………………………………...3

Introducción……………………………………………………………..……………5

Hipótesis……………………………………………………………………..………11

Objetivos generales y específicos………………………………………….……..….11

Metodología…………………………………………………………………….……12

Resultados………………………………………………………………….………...26

Discusión……………………………………………………………………….……30

Conclusión………………………………………………………………….…..……41

Planificación de trabajo………...………………………...……………...…...…...…43

Referencias bibliográficas……...……………………………………………………44

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Resumen

La gonorrea es una infección de transmisión sexual (ITS) causada por el agente

patógeno Neisseria gonorrhoeae, que corresponde a un microorganismo bacteriano con

morfología cocoide estructuralmente caracterizado por su disposición en diplococo y con

afinidad tintorial Gram-negativo. Se considera un patógeno humano exclusivo y dentro de

sus factores de virulencia destaca la presencia de Pili, que le proporciona alta capacidad de

fijación a mucosas. La presentación clínica de esta ITS en mujeres es principalmente

asintomática, pero puede llegar a generar graves secuelas cuando logra ascender hacia la

mucosa epitelial de las trompas de Falopio, ya que puede desencadenar enfermedad

inflamatoria pélvica, embarazo ectópico e incluso producir infertilidad.

Si bien en la infección con gonococo se ha estudiado ampliamente la secreción de

algunas citoquinas proinflamatorias por parte de tejido infectado con reclutamiento masivo

de macrófagos y neutrófilos a la zona de infección, se desconoce si hay participación de

factores moleculares involucrados en el reclutamiento de células de la inmunidad innata,

tales como la molécula secretora de leucocitos inhibidores de proteasas (SLPI), cuya función

es proteger a la mucosa de la enzima elastasa liberada desde los gránulos primarios o

azurófilos de los neutrófilos y la proteína inflamatoria de macrófagos (MIP3α), con función

en el reclutamiento de linfocitos y neutrófilos.

Por lo tanto, el objetivo de esta unidad de investigación fue evaluar los niveles de

expresión de los genes codificantes para estas tres moléculas. La metodología para evaluar

la expresión de estos genes fue mediante el análisis de transcripción reversa y PCR

cuantitativo (RT-qPCR) desde RNAm total de células epiteliales de trompas de Falopio

humanas infectadas con Neisseria gonorrhoeae a distintos tiempos (4, 8, y 24 horas). El

control de la expresión de genes se realizó mediante la detección de la expresión del gen

ribosomal 18S, y como control de la infección se utilizó la medición de la expresión de los

mismos genes en células que no han sido infectadas. Nuestros resultados mostraron que

para el gen MIP3α a las concentraciones de RNA total empleadas en este estudio no es

posible obtener resultados que demuestren que exista un aumento en la concentración de

este ante la infección por Neisseria gonorrhoeae, mientras que para el gen SLPI si bien se

logran obtener resultados que demuestran un aumento en la expresión del gen en estado de

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infección, no se puede asegurar que este pertenezca SLPI ya que se detectó la presencia de

lo que podría ser posible contaminación o dímeros de primers.

Se concluye que para MIP3α es necesario aumentar la concentración de RNA total

utilizadas por sobre 4000 pg y sobre los 40 ciclos de PCR esto en base al ensayo realizado

en este estudio, con el fin de poder responder si existe un aumento de MIP3α durante la

infección por gonococo. Para el gen SLPI si bien existe un aumento de concentración se

deben tomar todas las precauciones necesarias para evitar contaminaciones las cuales

interfieren y de esta forma poder comprobar si el aumento de concentración se debe

efectivamente a el gen SLPI.

Page 5: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Introducción

Las infecciones de transmisión sexual (ITS), en la actualidad siguen siendo un gran

problema tanto a nivel mundial como en Chile, causando graves efectos en la salud sexual y

reproductiva de la población. Cada día más de 1 millón de personas contrae algún tipo de

infección de transmisión sexual y se estima que anualmente unos 357 millones de personas

contraen alguna ITS, de esta cifra, 78 millones contraen gonorrea. (1). En Chile los grupos

etarios más afectados comprenden pacientes de entre 20 a 24 años, seguido por el grupo de

25 a 29 años (2). La gonorrea es una infección de notificación obligatoria tanto por

establecimientos públicos y privados según el decreto 158 del año 2004, además establece

que Neisseria gonorrhoeae está sujeta a vigilancia para la resistencia de antimicrobianos (3).

El género Neisseria se compone de especies tanto comensales como patógenas las

cuales colonizan el epitelio columnar simple de las mucosas. Las especies patógenas

corresponden a Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae las que son capaces de

generar una potente respuesta inflamatoria y dañar las barreras mucosas. Ambas especies

patógenas se encuentran en estrecha relación al ser fisiológica y genéticamente muy similares

ya que expresan un conjunto de determinantes de virulencia comunes que permiten una

colonización eficaz, evasión inmune y transmisión, pero se diferencian en la presentación

clínica de la enfermedad (4). Neisseria gonorrhoeae corresponde a un patógeno humano

exclusivo y en condiciones experimentales también afecta a simios (5). Aunque la uretra y el

cuello uterino sirven como los sitios iniciales para la infección gonocócica en hombres y

mujeres, respectivamente, dependerá principalmente del comportamiento sexual de los

individuos, la presencia de la infección en conjuntiva, faringe y mucosa rectal (6), aunque no

se descarta la oftalmia neonatal gonocócica al haber contacto de la conjuntiva del recién

nacido con el canal de parto de la madre.

Las complicaciones generadas por la infección se presentan principalmente en

mujeres y se debe a su carácter predominantemente asintomático del tracto genital inferior,

luego la infección no tratada de cuello uterino puede conducir al tracto genital superior

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afectando a la mucosa de las trompas de Falopio con lo cual puede causar salpingitis

gonocócica, enfermedad inflamatoria pélvica, embarazo ectópico e incluso infertilidad (7).

Neisseria gonorrhoeae es un microorganismo bacteriano con morfología cocoide (en

forma de riñón o grano de café) con disposición en diplococo y afinidad tintorial Gram-

negativo, no móviles, no esporulados, con un diámetro aproximado de 0.6 a 0.8 mm (de

manera individual), siendo además muy lábil al calor, a temperaturas de refrigeración y a

diversos antisépticos. También es sensible a la desecación; bajo ciertas condiciones, puede

resistir poco tiempo en exposición al aire (de una a dos horas) (6). La bacteria inicia su ciclo

infectivo a nivel celular cuando se adhiere a la superficie del epitelio columnar uretral,

endocervical, vaginal e incluso a los espermatozoides humanos y a las células epiteliales no

ciliadas que recubren las trompas de Falopio (actualmente llamadas tubas uterinas) (6), luego

de este proceso ocurre el ingreso de la bacteria a la célula hospedera hasta su depósito en la

submucosa. Estos eventos están sustentados por la participación de una serie de factores de

virulencia y sus receptores en las células epiteliales; la interacción entre las adhesinas y sus

receptores induce la transducción de señales que fluyen desde el patógeno hasta el hospedero

y viceversa (8). Se debe considerar que parte de estos factores de virulencia que interaccionan

con las células hospederas experimentan dos tipos de cambios: variación de fase, cuando el

factor detiene su síntesis y expresión de manera temporal; y variación antigénica,

correspondiente a una modificación química de la molécula, ambos cambios facilitan la

evasión de la respuesta inmune por parte del hospedero al microorganismo (8). Dentro de los

factores de virulencias de importancia en la adherencia e invasión presentes en Neisseria

gonorrhoeae se encuentran:

• Pili tipo IV: esta estructura permite la adherencia de la bacteria a la superficie de células

hospederas. Está compuesto por al menos dos proteínas distintas: la subunidad principal

y altamente variable, PilE (pilina), que constituye la mayor parte de la fibrilla y participa

en el reconocimiento del receptor (10); y la adhesina PilC, que se localiza en la punta del

pili, es esencial en la unión de la bacteria a las células epiteliales (10). Esto ocurre

mediante la unión a la glicoproteína de superficie CD46, que se ha encontrado en casi la

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totalidad de las células humanas y está involucrada en la regulación de la cascada del

complemento (12).

• Proteína Opa: corresponde a una familia de proteínas de membrana externas

denominadas Opa debido a la opacidad que presentan las colonias que las expresan.

Fueron las primeras moléculas en identificarse como invasinas y ligandos con capacidad

de unirse a los residuos oligosacáridos del lipooligosacárido (LOS) de otras células de

Neisseria gonorrhoeae, lo que tiene importancia en la formación de microcolonias (12).

Promueven la invasión de las células del hospedero al interactuar con sus receptores que

incluyen varios miembros de la familia CD66 y a ciertos proteoglicanos cuya porción

polisacárida está constituida por heparán sulfato, esta unión de las variantes de esta

proteína Opa a su respectivo receptor desencadena diversas cascadas de señalización,

permitiendo el ingreso de la bacteria y, posiblemente, la selección a un destino

intracelular (13).

• Porinas: son las proteínas más abundantes en la membrana externa de Neisseria

gonorrhoeae, llamadas Por o P.I. Tienen como principal función permitir el ingreso de

nutrientes de bajo peso molecular mediante difusión por la membrana externa (11).

Como funciones específicas, post-inserción en la membrana de los neutrófilos, estas

porinas inhiben la fagocitosis, la polimerización de la actina, la secreción de enzimas

microbicidas, la expresión de los receptores para las opsoninas, la maduración del

fagosoma y la fusión fagolisosomal; además de modificar el metabolismo oxidativo de

los neutrófilos, modulando reacciones antimicrobianas dependientes de oxígeno (14).

Existen dos subtipos de Por: P. IA y P. IB, N. gonorrhoeae presenta sólo uno de los dos

alelos porB para las porinas; porB1a o porB1b que codifica la proteína PIA o PIB,

respectivamente. PorB se ubica en la membrana como una proteína trimérica en la que

cada monómero PIA o PIB forman una estructura de barril de hoja β con ocho bucles

expuestos hacia a la superficie (15); Las cepas productoras de P.IA se asocian a

infecciones diseminadas, son más resistentes al suero e invaden a las células del

hospedero en ausencia de las proteínas Opa, por su parte, las cepas productoras de P.IB

están relacionadas con infecciones localizadas y requieren de las proteínas Opa para

concentrar su invasión (13).

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• Lipooligosacárido (LOS): involucrado en el mimetismo molecular característico de

gonococo: la lacto-N-neotetraisa es similar a ciertos segmentos en algunos

glucoesfingolipidos humanos, además que el LOS también comparte epítopos con

globósidos, gangliósidos y lactósidos humanos, explicando la capacidad del gonococo

de evitar el reconocimiento por el sistema inmune (8). Por otra parte existe el proceso de

sialización, donde la galactosa terminal presente en el LOS es catalizada por una enzima

del gonococo llamada sialiltransferasa, permitiendo a la molécula del hospedero ácido

citidínmonofosfato-N-acetilneuramínico (CMP-NANA) la donación de ácido siálico a la

superficie bacteriana, impidiendo la acción bactericida del suero ya que impide la

interacción de los componentes del complemento con la bacteria, debido a la captación

de factor H por medio del ácido sálico, proteína del hospedero que bloquea el ensamblaje

de la C3 convertasa, bloqueando la vía alterna y permitiendo la proteólisis del péptido

C3b (8). El LOS también es responsable de estimular la producción de mediadores

inflamatorios por parte de macrófagos y neutrófilos, destacando el TNF-a (factor de

necrosis tumoral alfa), IL-8, IL-6, IL-1 y GM-CSF (factor estimulador de colonias de

macrófagos y granulocitos) (12), cuando la producción de estas citoquinas resulta ser

muy abundante, se produce lo llamado shock endotóxico, que destaca con fiebre, colapso

circulatorio, CID (coagulación intravascular diseminada) y necrosis hemorrágica,

conjunto sucesos que pueden conducir a un fallo orgánico múltiple (16).

Respecto a lo anterior cobra gran importancia la respuesta dada por el sistema inmune

innato ya que es crítica para prevenir la invasión y diseminación microbiana. Es importante

considerar las diferencias anatómicas en los microambientes que se presentan en el tracto

reproductor femenino inferior "no estéril" y superior "estéril". Cada uno de estos ambientes

presentan una respuesta inmune innata que muestra cambios temporales en su expresión de

moléculas inmunes innatas en respuesta al estrógeno y la progesterona. La vagina y

ectocérvix albergan una variedad de bacterias comensales y están sujetos a contaminación

secundaria como resultado de su proximidad al recto. A pesar de esta exposición constante a

microorganismos, las infecciones son relativamente poco frecuentes, lo que sugiere una

contención eficaz o la eliminación de patógenos. El endocérvix representa un área de

transición que se encuentra en el centro del cérvix formando el canal endocervical que une

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el orificio cervical externo con la cavidad uterina susceptible a infecciones. La infección del

endometrio y de la trompa de Falopio es efectiva si los patógenos rompen la barrera cervical,

resultando en graves consecuencias. Durante el embarazo el tapón del mucus cervical, la

placenta y las membranas fetales también contribuyen a la respuesta inmune innata,

manteniendo la esterilidad de la cavidad uterina y protegiendo al feto en desarrollo (17).

Las moléculas involucradas en la respuesta inmune innata desencadenada por la

infección bacteriana incluyen péptidos antimicrobianos naturales secretados por la superficie

mucosa del tracto genital femenino y son liberados frente a un proceso inflamatorio

descontrolado que puede causar destrucción de los tejidos del hospedero y que en parte es

mediada por proteasas. Dos de estas enzimas secretadas son el inhibidor secretor de proteasas

leucocitarias (SLPI) el cual inhibe una serie de proteasas tales como la elastasa liberada de

los gránulos primarios de los neutrófilos, tripsina y catepsina G (17). La proteína inflamatoria

de macrófagos (MIP3α) también es responsable de la respuesta innata y que tiene como

función el reclutamiento de linfocitos y neutrófilos, enlaza y activa CCR6, interfiere con

CCR5 y CXCR4 en la inhibición de la infección por VIH (18).

Si bien la infección por gonococo se ha estudiado ampliamente respecto a la secreción

de algunas citoquinas proinflamatorias por parte de tejido infectado, con reclutamiento

masivo de macrófagos y neutrófilos a la zona de infección, se desconoce la totalidad del ciclo

infectivo que tiene Neisseria gonorrhoeae y en profundidad como se monta la respuesta

inmune del hospedero, incluyendo la respuesta de los genes de expresión de estas dos

moléculas: SLPI y MIP3α, que podrían desarrollar un rol fundamental en la inmunidad innata

como mecanismo defensivo al momento de producirse la invasión del tejido mucoso del

tracto reproductor femenino por parte de Neisseria gonorrhoeae.

La importancia de este estudio radica en los nuevos antecedentes que se aportarían

acerca de estas dos moléculas, cuya expresión da cuenta del papel que cumplen en la

respuesta inmune innata frente a la infección con Neisseria gonorrhoeae, permitiendo

comprender de forma más detallada cómo se articula la respuesta inmune del hospedero, con

el fin de que en un futuro se logre manejar detalladamente el modelo infectivo para llevar a

cabo nuevos tratamientos ante la infección, ya que actualmente el gonococo ha desarrollado

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una alta resistencia antibiótica dejando nula o escasa posibilidades de tratamientos

antibióticos disponibles en el mercado farmacéutico (19)

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Hipótesis

Neisseria gonorrhoeae induce un aumento en la expresión de los genes codificantes

para las moléculas MIP3α y SLPI durante la infección de células epiteliales de Trompa de

Falopio humana.

Objetivo General

Evaluar la expresión de los genes codificantes para MIP3α y SPLI, a partir de RNA

total previamente aislado de células epiteliales de trompa de Falopio humana (FTECs)

infectadas con Neisseria gonorrhoeae durante distintos tiempos (4, 8, y 24 h), mediante RT-

qPCR.

Objetivos Específicos

A. Analizar la expresión de los genes de las moléculas MIP3α y SLPI a partir de RNA

total proveniente de células epiteliales de trompa de Falopio humana previamente

infectadas.

B. Cuantificar la cantidad de DNA complementario para cada gen mediante emisiones

de fluorescencia a través de la sonda SYBRgreen por el método de PCR en tiempo real

de tipo cuantitativo.

C. Comparar la expresión de MIP3α y SLPI respecto al gen de referencia de expresión

18s de tipo constitutivo, con el fin de determinar si existe un aumento considerable de

ambos genes como respuesta ante la infección por Neisseria gonorrhoeae.

Page 12: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Metodología

1) Tipo de estudio:

Estudio de tipo cuantitativo.

2) Lugar de desarrollo:

Centro de Medicina Integrativa y Ciencia Innovativa (CIMIS) de la Universidad Andrés

Bello.

3) Materiales:

• RNA total de células epiteliales de trompa de Falopio humana infectadas con

Neisseria gonorrhoeae, purificado previamente con Trizol Reagent (AmbionTM,

Thermo Scientific) y resuspendido en H2O - DPEC.

• RQ1 (RNA-Qualified) RNase-Free Dnase: es una DNasa I (endonucleasa) que

degrada el DNA bicatenario y monocatenario, produciendo 3-OH oligonucleótidos.

Es aplicada para eliminar trazas de DNA contaminante en muestras de RNA total.

• Equipo fluorométrico Qubit 2 (Invitrogen): permite la cuantificación sensible,

específica y precisa de DNA, RNA y proteínas basado en la detección de

fluorescencia específica del objetivo. Tiene como características que utiliza los

ensayos QubitTM que contienen tintes avanzados que solo emiten fluorescencia

cuando están unidos a ADN, ARN o proteínas. Esta especificidad le permite obtener

resultados muy precisos porque la tecnología QubitTM solo informa la concentración

de la molécula de interés y no de contaminantes (20).

• M-MLV Reverse Transcriptase (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse

Transcriptase, de Invitrogen); enzima que utiliza RNA o DNA monocatenario en

presencia de un partidor para sintetizar una cadena de DNA complementaria. Esta

enzima se aísla de E. coli, la cual expresa una porción del gen pol de M-MLV en un

plásmido. La enzima se usa para sintetizar DNAc de primera cadena de hasta 7 kb.

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• Kit KiCqStartTM SYBR® Green qPCR ReadyMixTM (Sigma-Aldrich): Kit de

qPCR, sus reactivos contenidos en el buffer de reacción incluyen concentraciones

óptimas de MgCl2, nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), KiCqAtart Taq DNA

polimerasa, Moléculas SYBR Green y estabilizadores; No están incluidos los

partidores y la hebra molde.

• Mastercycler Nexus Gradient PCR (Eppendorf): termociclador con un rango de

temperatura de 4-99 ºC, con un bloque térmico de aluminio que permite 96 tubos de

PCR de 0,2 ml, 77 tubos de PCR de 0,5 ml o una placa de PCR con 96 pocillos.

• Eco Real time PCR system (Illumina): con sensibilidad hasta 1 copia, rango dinámico

>9 registros, discrimina entre 5.000 y 10.000 copias con 99% de confianza. Soporta

todas las aplicaciones de PCR en tiempo real, incluyendo la cuantificación absoluta

por curva estándar o cuantificación relativa usando el método 2 delta-delta Ct.

• Partidores:

• Dos Partidores para el gen codificante para la molécula secretora de leucocitos

inhibidores de proteasas (SLPI).

- GAG ATG TTG TCC TGA CAC TTG TG forward

- AGG CTT CCT CCT TGT TGG GT reverse

• Dos Partidores para el gen codificante para la proteína inflamatoria de

macrófagos (MIP3a).

- GCG CAA ATC CAA AAC AGA CT forward

- CAA GTC CAG TGA GGC ACA AA reverse

• Dos partidores para el gen ribosomal 18s (Gen housekeeping).

- 5’-CTAACACGGGAAACCTCAC-3’ forward

- 5’-CGCTCCACCAACTAAGAACG-3’ reverse

• Gen de Referencia: rRNA 18S de expresión constitutiva como normalizador;

expresión de los genes codificantes para la molécula secretora de leucocitos

inhibidores de proteasa (SLPI), proteína inflamatoria de macrófagos (MIP3α)

de células sin infectar como control negativo.

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• Muestras: Las muestras de FTECs (células epiteliales de trompa de Falopio humana)

provinieron de donantes fértiles voluntarias sometidas a histeroctomía por motivos

ajenos a este estudio (previo consentimiento informado) desde el Servicio de

Ginecología de Clínica Dávila (21).

• El procesamiento de las muestras se realizó de acuerdo con los protocolos pertinentes

para este tipo de ensayos para así obtener la aislación de FTECs (células epiteliales

de trompa de Falopio humana) (21). Las FTECs crecieron en medio TC-199

suplementado con suero fetal bovino inactivado 10%, insulina recombinante humana

5 mg/ml y piruvato de sodio 1mM a 37ºC y CO2 5% hasta alcanzar una confluencia

de 80%, luego se digirieron con tripsina-EDTA 0.25% y se sembraron en placas de

cultivo celular de 12 pocillos al menos 4 días antes de la infección. (21)

• Posterior al cultivo celular, se procedió a infectar estas células con Neisseria

gonorrhoeae variante P9-17 (Pili+ Opa+, cepa silvestre) con multiplicidad de

infección (MOI) de 50. Luego se retiró el sobrenadante, mientras que las células se

lavaron con PBS estéril y se incubaron con gentamicina (100 μg/ml) por una hora

para eliminar las bacterias extracelulares. Finalmente, las células se lavaron

nuevamente con PBS estéril y se lisaron para la obtención de RNA total mediante la

adición de Trizol Reagent (AmbionTM, Thermo Scientific). El control negativo

consistió en células sin infectar (21).

• Obtención de RNA total: Se realizó la purificación del RNA total de las FTECs

(células epiteliales de trompa de Falopio humana) mediante el uso de Trizol ReagenT

(AmbionTM, Thermo Scientific) siguiendo las instrucciones del proveedor.

Procedimientos:

Los procedimientos de extracción, purificación con Trizol Reagent y resuspensión en

H2O-DEPC del RNA total proveniente de células de trompa de Falopio sanas (control) e

Page 15: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

infectadas con Neisseria gonorrhoeae en los distintos tiempos de infección (4, 8 y 24 horas),

fueron realizados por la Docente Guía, Dra Paula I. Rodas como se describió previamente en

el ítem “Muestras” de Materiales y Métodos, técnicas realizadas con anterioridad al comienzo

de ésta investigación; posibilitando al equipo de estudiantes participantes de este estudio

comenzar desde el Tratamiento del RNA con DNasa prontamente descrito.

A continuación, se presenta un diagrama resumen de los procedimientos realizados

durante esta investigación, con el fin de permitir la comprensión del flujo de trabajo

realizado, para posteriormente poder detallar cada etapa. Cabe destacar que cada

procedimiento fue realizado con las precauciones estándar tanto del proveedor como del

laboratorio donde se ejecutaron.

Page 16: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Tratamiento de RNA para eliminación de DNA contaminante: se realizó el

tratamiento del RNA de las FTECs (células epiteliales de trompa de Falopio humana)

alicuotados diferenciando control e infección en sus respectivos tiempos de 4, 8 y 24 horas

para el paciente 6 y paciente 7, mediante el uso del kit RQ1 RNase-Free DNase siguiendo las

instrucciones del proveedor como se representa en la Tabla 1.

Tratamiento de RNA

•Para eliminación de DNA contaminante mediante el uso del kit RQ1 RNase-Free DNase.

Medición de

[ RNA ]

•Medición de concentración de RNA con equipo fluorométrico Qubit 2.0.

Dilusiones

•Dilusiones dependiendo de la concentración de RNA de cada muesta con el fin estandarizar la cantidad de RNA que se utilizó en la siguiente etapa.

Transcriptasa reversa

•Aplicación de la técnica de transcripción reversa que usa la enzima M-MLV para la obtención de cDNA para cada gen con ell uso del termociclador Mastercycler Nexus

Gradient PCR para las distintas incubaciones.

RT-qPCR

•Se Realizó esta técnica empleando cDNA (para cada gen), Kit KiCqStartTM SYBR-Green qPCR ReadyMixTM, partidores forward y reverse (para cada gen), y H2O-PCR y el uso

del equipo Eco Real time Illumina.

Análisis de Datos

•Cuantificación relativa de la expresión de los genes en estudio mediante el método 2 delta-delta Ct.

•Se utilizó el programa GraphPad Prism 6, con el fin de graficar la base de datos obtenidos.

Page 17: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Tabla 1: Volúmenes de reactivos utilizados durante el Tratamiento del RNA para la eliminación de DNA

contaminante, incorporados a cada tubo donde P6= Paciente 6, P7= Paciente 7, C= control e I=infección con el

tiempo de extracción correspondiente (4, 8 y 24 horas), en el siguiente orden, H2O-DEPC, RNA *(RNA

correspondiente al tubo. Ej: P1 I4h: RNA de células del paciente 6 infectadas con Neisseria gonorrhoeae en un

tiempo de infección de 4 horas), RQ1 RNase-Free DNase 10X reaction Buffer y por último RQ1 RNase-Free

DNase.

Medición de concentración de RNA: se realizó la medición de la concentración de

RNA total para cada tubo de control e infección en sus tiempos respectivos de 4, 8 y 24 horas

para el paciente 6 y paciente 7 mediante la utilización del equipo Qubic 2.0, con los reactivos

correspondientes del kit, siguiendo las instrucciones del proveedor de la siguiente manera:

La técnica requería la preparación de la solución de trabajo (Qubit Working Solution)

con el uso del Reactivo que contiene el fluoróforo (Qubit Reagent) en una proporción 1 x n

μL y el Buffer de reacción (Qubit Buffer) en una proporción 199 x n μL. Se preparó la

solución de trabajo con un n=12, siendo cada n una muestra de RNA tratado con DNasa

correspondientes a los pacientes 6 y 7 en condiciones de control e infección en sus tiempos

respectivos de 4, 8 y 24 horas. La preparación de la solución se detalla en la Tabla 2.

TUBO H2O-

DEPC

RNA* RQ1 RNase-Free

DNase 10X reaction

Buffer

RQ1 RNase-

Free DNase

Volumen

total

P6 C-4h 4 L 4 L 1 L 1 L 10 L

P6 I-4h 4 L 4 L 1 L 1 L 10 L

P6 C-8h 4 L 4 L 1 L 1 L 10 L

P6 I-8h 4 L 4 L 1 L 1 L 10 L

P6 C-24h 4 L 4 L 1 L 1 L 10 L

P6 I-24h 4 L 4 L 1 L 1 L 10 L

P7 C-4h 4 L 4 L 1 L 1 L 10 L

P7 I-4h 4 L 4 L 1 L 1 L 10 L

P7 C-8h 4 L 4 L 1 L 1 L 10 L

P7 I-8h 4 L 4 L 1 L 1 L 10 L

P7 C-24h 4 L 4 L 1 L 1 L 10 L

P7 I-24h 4 L 4 L 1 L 1 L 10 L

Page 18: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

1 L de Qubit

Reagent

X n, donde n=12

12 L de Quit

Reagent

= 2400 L de

Qubit Working

Soluction

199 L de Qubit

Buffer

2388 L de Qubit

Buffer

Tabla 2: Volúmenes de Reactivos utilizados para la preparación de la solución de trabajo (Qubit Workink

Solution) del equipo

La técnica permite un volumen de muestra en un rango de 1-20 μL para completar

con Qubit Working Solution hasta los 200 μL. De esta forma se decidió a utilizar 2 μL de

muestra (RNA tratado con DNasa) y 198 μL de Qubit Working Solution. La preparación de

los tubos para la lectura de la concentración de RNA en cada tiempo (4, 8 y 24 horas) en sus

dos condiciones (control e infección) para los pacientes 6 y 7, se describe en la Tabla 3.

TUBO Muestra Qubit Working Soluction Volumen Total

P6 C-4h 2 L 198 L 200 L

P6 I-4h 2 L 198 L 200 L

P6 C-8h 2 L 198 L 200 L

P6 I-8h 2 L 198 L 200 L

P6 C-24h 2 L 198 L 200 L

P6 I-24h 2 L 198 L 200 L

P7 C-4h 2 L 198 L 200 L

P7 I-4h 2 L 198 L 200 L

P7 C-8h 2 L 198 L 200 L

P7 I-8h 2 L 198 L 200 L

P7 C-24h 2 L 198 L 200 L

P7 I-24h 2 L 198 L 200 L

Tabla 3: Volúmenes de reactivos utilizados durante la medición de la concentración de RNA tratado con DNasa,

incorporados a cada tubo donde P6= Paciente 6, P7= Paciente 7, C= control e I=infección con el tiempo de

extracción correspondiente (4, 8 y 24 horas). Muestra= RNA tratado con DNasa correspondiente a su respectivo

tubo.

Luego de la preparación de cada tubo se procedió a vortexear durante 2-3 segundos

según protocolo para homogenizar la solución previa a la incubación de 2 minutos a

temperatura ambiente, tiempo donde se une el fluoróforo al RNA en la solución. Terminada

la incubación, se continuó con la lectura en el equipo Qubit 2 utilizando el ítem de detección

Page 19: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

de RNA e ingresando el volumen de muestra utilizado (2 μL) el equipo entregó las

concentraciones del Stock de RNA tratado con DNasa para cada muestra.

Diluciones: dependiendo de la concentración de RNA para cada tubo obtenida

mediante la utilización del equipo Qubic 2.0, se procedió a diluir con H2O-DEPC para

estandarizar la cantidad de RNA en primera instancia con 1000 pg a modo de ensayo y luego

2000 pg de RNA total tratado con DNasa contenidos en un volumen determinado entre 1-5

μL que serían utilizados en el siguiente paso de transcripción reversa.

Transcripción Reversa: con el fin de obtener cDNA para posteriormente

amplificarlo mediante qPCR se utilizó el kit de la enzima M-MLV Reverse Transcriptase

(Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) utilizando un partidor específico

para cada gen (18s, MIP3a y SLPI) en los estados de control e infección para los tiempos 4,

8 y 24 horas. Se aplicó para tener un futuro control negativo en la reacción de qPCR, una

repetición simultánea de cada tubo donde se reemplazó el volumen correspondiente a 1 μL

de la enzima con acción transcriptasa reversa por 1 μL de agua DEPC (suplementada con

inhibidor de RNAsa), esperando que posteriormente en los resultados de la reacción de qPCR

de estos ensayos, no haya curva de amplificación debido a la ausencia de cDNA.

Esta técnica se realizó mediante el uso del kit de la enzima M-MLV Reverse Transcriptase

(Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) siguiendo las instrucciones del

proveedor con sus reactivos correspondientes como se representa en la Tabla 4.

Page 20: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

TUBO

H2O DEPC +

Solución de RNA

diluido.

Primer específico

para el gen en

estudio (2mM)

dNTP Mix

10mM

Volumen

Total

P6 C-4h c/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P6 C-4h s/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P6 I-4h c/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P6 I-4h s/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P6 C-8h c/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P6 C-8h s/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P6 I-8h c/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P6 I-8h s/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P6 C-24h c/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P6 C-24h s/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P6 I-24h c/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P6 I-24h s/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P7 C-4h c/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P7 C-4h s/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P7 I-4h c/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P7 I-4h s/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P7 C-8h c/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P7 C-8h s/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P7 I-8h c/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P7 I-8h s/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P7 C-24h c/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P7 C-24h s/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P7 I-24h c/E 10 L 1 L 1 L 12 L

P7 I-24h s/E 10 L 1 L 1 L 12 L

Tabla 4: Volúmenes de reactivos utilizados durante la técnica de Transcripción Reversa incorporados a cada

tubo donde P6= Paciente 6, P7= Paciente 7, C= control e I=infección con el tiempo de extracción

correspondiente (4, 8 y 24 horas), además se adiciona el rotulo c/E y s/E, correspondientes a “con enzima” y

“sin enzima” respectivamente, haciendo referencia a la Enzima M-MLV Reverse Transcriptase que sería

agregada posteriormente. En la columna dos, correspondiente a “H2O DEPC + Solución de RNA diluido” varían

los volúmenes de H2O DEPC en función del volumen de la Solución de RNA que contenía 2000 pg de RNA

total tratado con DNasa respectivo para cada tubo, completando con estos dos volúmenes un total de 10 μL. Ej:

Si para un tubo X, la cantidad de RNA ya diluido correspondiente a 2000 pg está contenida en 3 μL de solución,

se completa con 7 μL de H2O DEPC, para tener el volumen total entre estos reactivos de 10 μL; así dependiendo

de la concentración final post diluir de RNA tratado con DNasa, se determinó el volumen utilizado de esta

solución que tuviese 2000 pg de material RNA para cada tubo de manera individual y consecuentemente el

volumen de H2O DEPC a utilizar respectivo.

Page 21: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Posterior a esto, con el uso del equipo Mastercycler Nexus Gradient PCR, se preparó

un programa con diferentes etapas de incubación que varían en tiempo y temperatura como

lo muestra la Tabla 5.

ETAPA

1

ETAPA

2

ETAPA

3

ETAPA

4

ETAPA

5

ETAPA

6

TIEMPO 5’ Pausa 2’ Pausa 50’ 15’

TEMPERATURA 65 º C 4 º C 37 º C 4 º C 37 º C 70 º C

Tabla 5: Programa de etapas de incubación y pausas con sus respectivos tiempos y temperaturas ingresados en

el equipo Mastercycler Nexus Gradient, para la técnica de transcripción reversa según proveedor.

La Etapa 1 de la Tabla 5, es una incubación previa de la muestra por protocolo, luego

de esto se continua con la Etapa 2, donde el equipo disminuye su temperatura a 4 º C con el

fin de simular la temperatura en hielo; Durante la Etapa 2, los tubos fueron retirados del

termociclador y puestos en hielo, para poder agregar 7 μL solución de trabajo (preparación

expuesta en la Tabla 6) a cada uno de los 24 Tubos, solución que contiene el buffer de

reacción y DTT 0.1 M, solución que permite aflojar la estructura secundaria del RNA

facilitando el inicio de la transcripción reversa y luego a progresividad de la enzima M-MLV

Reverse Transcriptase.

4 μL de 5X First

Strand Buffer

X n, donde

n=24

96 μL de 5X First

Strand Buffer

= 168 μL de Solución

de trabajo 2 μL de DTT 0.1 M 48 μL de DTT 0.1 M

1 μL H2O DEPC 24 μL H2O DEPC

Tabla 6: Volúmenes utilizados para la preparación de la solución de trabajo para la reacción de transcripción

reversa.

Posteriormente a la Etapa 2, se introdujeron los tubos al termociclador, para continuar

con la Etapa 3, cuyo fin era permitir la acción del DTT en el RNA presente en cada tubo. Tal

cual como se realizó en la Etapa 2, en la Etapa 4 también fueron retirados los tubos del

Page 22: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

termociclador y dispuestos en hielo, para adicionar la enzima M-MLV Reverse Transcriptase

o en su defecto H2O DEPC como se representa en la Tabla 7.

TUBO

Enzima (M-MLV Reverse

Transcriptase)

H2O DEPC

Volumen Total

P6 C-4h c/E 1 L - 20 L

P6 C-4h s/E - 1 L 20 L

P6 I-4h c/E 1 L - 20 L

P6 I-4h s/E - 1 L 20 L

P6 C-8h c/E 1 L - 20 L

P6 C-8h s/E - 1 L 20 L

P6 I-8h c/E 1 L - 20 L

P6 I-8h s/E - 1 L 20 L

P6 C-24h c/E 1 L - 20 L

P6 C-24h s/E - 1 L 20 L

P6 I-24h c/E 1 L - 20 L

P6 I-24h s/E - 1 L 20 L

P7 C-4h c/E 1 L - 20 L

P7 C-4h s/E - 1 L 20 L

P7 I-4h c/E 1 L - 20 L

P7 I-4h s/E - 1 L 20 L

P7 C-8h c/E 1 L - 20 L

P7 C-8h s/E - 1 L 20 L

P7 I-8h c/E 1 L - 20 L

P7 I-8h s/E - 1 L 20 L

P7 C-24h c/E 1 L - 20 L

P7 C-24h s/E - 1 L 20 L

P7 I-24h c/E 1 L - 20 L

P7 I-24h s/E - 1 L 20 L

Tabla 7: Incorporación de la Enzima M-MLV Reverse Transcriptase durante la Etapa 4 expuesta en la Tabla 5

correspondiente al programa de incubaciones en el equipo Mastercycler Nexus Gradient. En los tubos con el

rótulo “s/E” (sin enzima), se reemplazó el volumen correspondiente a 1 μL de enzima por 1 μL de H2O DEPC,

con el fin de posteriormente ser utilizados como un control negativo de amplificación durante la realización de

la técnica qPCR.

Luego de la incorporación de la Enzima M-MLV Reverse Transcriptase y el H2O

DEPC a los tubos correspondientes, se procedió a reincorporar los tubos al termociclador

para continuar con las Etapas 5 y 6 de la transcripción reversa. Al finalizar estas incubaciones,

los tubos fueron refrigerados a -20 º C hasta el siguiente procedimiento.

Page 23: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Cabe destacar que al finalizar esta técnica se obtuvo como resultado el cDNA

(templado) correspondiente al gen del cual se dispuso el partidor específico para dicho gen

como se expuso anteriormente en la Tabla 4.

RT-qPCR SYBR Green: luego de la obtención del cDNA respectivo para cada gen

(18s, MIP3α y SLPI) en los estados de control e infección para los tiempos 4, 8 y 24 horas y

sus respectivos controles, se procedió a realizar el qPCR mediante el Kit KiCqStartTM

SYBR" Green qPCR ReadyMixTM siguiendo las instrucciones del proveedor y sus

respectivos reactivos, comenzando con la preparación de los tubos, acción expuesta en la

Tabla 8.

TUBO

H2O

PCR

Templado

(cDNA del

gen

específico)

Primer

Forward

para el gen

específico

(2 mM)

Primer

Reverse

para el gen

específico

(2 mM)

KiCqStart

SYBR Green

qPCR

ReadyMix

(2X)

Vol.

Total

P6 C-4h c/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P6 C-4h s/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P6 I-4h c/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P6 I-4h s/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P6 C-8h c/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P6 C-8h s/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P6 I-8h c/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P6 I-8h s/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P6 C-24h c/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P6 C-24h s/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P6 I-24h c/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P6 I-24h s/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P7 C-4h c/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P7 C-4h s/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P7 I-4h c/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P7 I-4h s/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P7 C-8h c/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P7 C-8h s/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P7 I-8h c/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P7 I-8h s/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P7 C-24h c/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P7 C-24h s/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P7 I-24h c/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

P7 I-24h s/E 2,7 L 2,5 L 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

Control PCR 5,2 L - 2,4 L 2,4 L 10 L 20 L

Page 24: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Posterior a la preparación de los Tubos, se procedió a cargar la placa de PCR con

los 20 μL totales de solución con todos los reactivos necesarios para la técnica de RT-

qPCR. Cargada la placa, esta fue centrifugada y transportada en hielo al equipo Eco Real

time PCR system, el cual fue programado para qPCR con ciclos de 3 pasos con la

temperatura y tiempo según proveedor como se detalla en la Tabla 9.

Tabla 9: Programa Ejecutado en el Equipo Eco Real time PCR system para cada reacción individual por gen en

estudio (18S, SLPI y MIP3α).

Al término de la Reacción de qPCR para cada gen de manera individual, se analizaron

los niveles de expresión relativa de los genes por medio de los Ct de cada curva de

amplificación mediante el método 2 delta-delta Ct, método que no utiliza la eficiencia de la

reacción de la PCR como factor de corrección, sin embargo, supone una eficiencia óptima e

idéntica en la eficiencia de la reacción en las PCR en tiempo real tanto del gen en estudio

como del de referencia (22), siendo aplicable para una estimación rápida de la proporción

relativa de la expresión genética en estudio (23). El método 2 delta-delta Ct utiliza la

siguiente fórmula (24):

2-ΔΔCt

Donde:

• ΔCt = Ct gen en estudio − Ct gen de referencia

• ΔΔCt = ΔCt(Infección)−ΔCt(Control) = (CtD − CtB) − (CtC − CtA).

• Siendo:

ETAPA

Incubación qPCR Curva Melting

Paso 1 Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 1 Paso 2 Paso 3

Temperatura 95 º C 95 º C 60 º C 72 º C 95 º C 55 º C 95 º C

Duración 2’ 15’’ 30’’ 30’’ 15’ 15’ 15’

Ciclos 1 40 40 40 1 1 1

Control Infección

Gen de Referencia A B

Gen en Estudio C D

Page 25: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Este método al utilizar los datos de control e infección del gen en estudio y el gen de

referencia, entrega una estimación de la proporción relativa de la expresión del gen en estudio

normalizado por el gen de referencia en los distintos tiempos; lo que permite realizar una

comparación de la expresión relativa del gen en estudio entre los diferentes tiempos

analizados.

Para comparar la expresión del gen en estudio entre control e infección normalizada

por el gen de referencia en los distintos tiempos, se debe utilizar 2-ΔCt; siendo la expresión

del gen en estudio en situación de control normalizada por el gen de referencia para un tiempo

determinado: 2-(Ct C – Ct A); de la misma manera la expresión del gen en estudio en

situación de infección normalizada por el gen de referencia para un tiempo determinado: 2-

(Ct D – Ct B). Esta comparación entre control e infección en los distintos tiempos se podrá

observar en las Figuras 2 y 3 del ítem de resultados para el paciente 6 y 7 respectivamente.

Estas figuras mencionadas fueron obtenidas mediante la gráfica la de data con la ayuda del

Programa GraphPad Prism 6.

Page 26: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Resultados

Para el gen MIP3α paciente 6 y 7 existe una ausencia de emisiones de fluorescencia

debido a las bajas concentraciones de RNA empleadas (2000 pg), lo que se traduce en que

no se obtengan curvas de amplificación, no existiendo un aumento de la expresión del gen

en función del tiempo a las 4, 8 y 24 horas control e infección como se observa en la Figura

1. Además, se realizó un ensayo para el paciente 7 control e infección aumentando la

concentración de RNA (4000 pg) logrando obtener curvas de amplificación.

Page 27: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Los resultados obtenidos para la expresión del gen SLPI control versus infección del

paciente 6 para los distintos tiempos expuestos en la Figura 2, permiten demostrar que en el

tiempo 4 horas se observa que hay un aumento del control que es similar al aumento de la

infección evidenciando que existe presencia de contaminación, si bien para los tiempo 8 y 24

horas también existe un aumento en la concentración del control no tan significativos como

en 4 horas, se puede inferir que también existe una contaminación, por lo que los resultados

obtenidos para infección en estos tiempos no permiten asegurar que realmente exista un

aumento de la concentración.

Page 28: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Los resultados obtenidos para la expresión del gen SLPI control versus infección del

paciente 7 para los distintos tiempos expuestos en la Figura 3, no se puede validar que exista

un aumento del gen SLPI debido a que el control presenta una mayor concentración respecto

a la infección, en el tiempo 4 horas es considerablemente mayor respecto a la infección, lo

mismo ocurre en 8 horas y en 24 horas ambos tanto control e infección presentan la misma

concentración, con lo cual se puede obtener que existe una contaminación del control que

genera este aumento generando resultados que no son válidos.

Page 29: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Discusión

En este estudio se desarrolló la técnica de RT-qPCR en tiempo real de dos puntos,

basada en sonda SYBR Green, para evaluar un aumento en la expresión de los genes

codificantes para las moléculas MIP3α y SLPI durante la infección por Neisseria

gonorrhoeae en células epiteliales de Trompa de Falopio humana.

La interpretación de los resultados se realizó utilizando la curva de amplificación y

la curva de disociación (curvas melting) obtenidas, correspondientes a la expresión de los

genes en estudio y del gen ribosomal 18s de expresión constitutiva.

El gen 18s fue utilizado como gen de referencia para el control de la expresión de los

genes en estudio, del cual se realizaron dos mediciones con distintas enzimas, en primera

instancia, sólo se evaluó el tiempo correspondiente a las 4 horas control y 4 horas infección

del paciente 6, a modo de ensayo, utilizando 1000 pg de RNA en el procedimiento de

transcripción reversa y 30 ciclos durante la realización del qPCR, con el fin de conocer la

técnica a cabalidad y aprender a desarrollarla de manera efectiva. Esta primera determinación

se llevó a cabo con la enzima SuperScript II, que presenta como ventaja requerir bajas

concentraciones de RNA total en un rango de 10 pg a 5 ug para desempeñar su función, pero

de la cual se tuvo que prescindir ya que no se encontraba disponible el stock suficiente para

la realización de todos los ensayos contemplando los tres genes a estudiar, optando por la

utilización de la enzima M-MLV Reverse Transcriptase que permite un rango de RNA total

de 1000 pg a 5 ug, debido a este valor se optó por aumentar la concentración de RNA durante

la transcripción reversa de 1000 a 2000 pg, y aumentar los ciclos del qPCR de 30 a 40 ciclos,

lo que entregó buenos resultados, permitiendo establecer las condiciones para continuar

con los análisis para los genes MIP3α y SLPI.

Respecto del gen MIP3α, mediante los resultados obtenido no es posible determinar

si existe un verdadero aumento en su expresión a los distintos tiempos de infección cuando

se finalizó la técnica de PCR real time, a pesar de que se realizó un aumento en las

concentraciones de RNA utilizadas, de 1000 a 2000 pg para tratamiento con transcriptasa

reversa en todos los ensayos para los genes en estudios (MIP3α, SLPI y 18s) con el fin de

Page 30: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

optimizar la técnica y obtención de resultados, y a la vez se aumentaron los ciclos de PCR

real time de 30 a 40, esto en base a las curvas obtenidas para el gen de referencia 18s.

Se confirmó mediante un ensayo expuesto en la Figura 1 en que se duplicó la

concentración de RNA del tiempo 4 horas control e infección del paciente 7 durante el

tratamiento con transcriptasa reversa de 2000 a 4000 pg donde se obtuvieron curvas de

amplificación que no llegaban a un plató, en comparación a la corrida del qPCR utilizando

2000 pg donde no se observa amplificación, concluyendo que la expresión del gen

codificante para la molécula MIP3α requiere una mayor concentración de RNA para la

realización del RT qPCR.

Una posible causa de la baja o nula expresión de MIP3α, podría explicarse desde el

punto de vista de las distintas funciones que esta molécula desarrolla en el organismo, así

como de la expresión y secreción de MIP3α como molécula constitutiva y de su potencial

como factor antiviral (25); a continuación se ahondan algunas de sus principales funciones y

sitios de expresión constitutiva a modo de comprender detalladamente la relación existente

entre estas determinantes y sus niveles de expresión y los roles que esta molécula desempeña

a distintos niveles fisiológicos. Una de las primeras funciones que se dieron a conocer acerca

de MIP3α, tiene relación con su actividad quimiotáctica: las quimioquinas son pequeñas

moléculas catiónicas que vinculan la respuesta inmune innata y adaptativa atrayendo células

efectoras al sitio de infección o patología. Además de su actividad quimiotáctica, la mayoría

de las quimioquinas también han demostrado actividad antimicrobiana, particularmente

contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (26, 27). Por otra parte, la expresión y

secreción MIP3α como molécula constitutiva se ha demostrado en varios tejidos y líneas

celulares que incluyen líneas de células epiteliales intestinales, pulmonares, cutáneas y

uterinas (28, 29). Así mismo se ha demostrado que la secreción de MIP3α se potencia aún

más por la presencia de patógenos o patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP)

(30, 31). Comprendiendo lo anterior, y dado las múltiples, pero especificas funciones que

MIP3α desarrolla en el organismo, se podría plantear que la expresión de los genes

codificantes para esta molécula y por consiguiente sus niveles de expresión, están ligados a

una estricta regulación de mecanismos epigenéticos, asociados a las funciones y sitios de

Page 31: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

localización en que esta molécula interviene para los diversos procesos fisiológicos. Algunos

de los principales mecanismo de regulación de la expresión génica se nombran a

continuación: hasta el momento, se han identificado más de veinte mecanismos epigenéticos,

los cuales juegan un rol importantísimo en la regulación de la transcripción y, por lo tanto,

en la expresión génica, dichos mecanismos incluyen la metilación del ADN, las

modificaciones post-traduccionales de las histonas, el silenciamiento génico mediado por

ARN no codificantes, los complejos de remodelado de cromatina basados en adenosín

trifosfato (ATP) y los complejos proteicos entre otros (32). Si bien hay mecanismos

epigenéticos mucho más estudiados que otros, realmente se desconoce cuáles son los que

tienen lugar en el caso de MIP3α, incluso es difícil inferir cuántos mecanismos epigenéticos

quedan aún por descubrir, por lo cual sería recomendable evaluar de forma detallada estos

mecanismos en estudios futuros, para comprender los niveles de expresión de los genes

codificantes para la molécula MIP3α.

Cabe destacar que recientemente, algunos estudios han abordado el potencial de esta

molécula como factor antiviral, por ejemplo, en el cáncer de cuello uterino mediado por HPV,

las proteínas virales E6 y E7 reducen los niveles de MIP3α para disminuir el reclutamiento

de células inmunitarias en el sitio de la mucosa (33). Así mismo MIP3α se redujo

significativamente en la piel de pacientes con dermatitis atópica mediada por el virus vaccinia

y se descubrió que era directamente inhibidora del virus (34). Este mecanismo queda en

evidencia y se explica en la infección producida por VIH, donde MIP3α tiene una homología

estructural con la familia de defensinas, moléculas con actividad demostrada anti-VIH, y que

comparten el receptor CCR6 (35, 36).

Ya conociendo que la secreción de MIP3α se potencia por la presencia de patógenos

o PAMP’s y que existen algunos virus con mecanismos de defensa contra la inmunidad de

su hospedero, que inhiben la expresión del gen codificante para MIP3α con el fin de disminuir

el reclutamiento de células del sistema inmune al sitio de infección, sería relevante estudiar

si existe algún mecanismo expresado por Neisseria gonorrhoeae que inhiba la expresión de

MIP3α, explicando así que se necesite una mayor concentración de RNA para poder obtener

una curva de amplificación que evidencie la expresión de esta molécula. En el caso que N.

gonorrhoeae no presente un mecanismo de inhibición para MIP3α, y se desee analizar la

Page 32: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

hipótesis propuesta en este estudio que plantea un aumento en la expresión de este gen cuando

hay infección por gonococo en células de trompa de Falopio se deberían realizar una mayor

cantidad de ensayos con la concentración necesaria de RNA para generar resultados óptimos,

también se deberían aumentar la cantidad de ciclos de PCR para lograr una mejor

amplificación y la llegada de la curva a un plató. O en definitiva desarrollar otra técnica que

sea más adecuada para la evaluación de este gen.

Se optó por no realizar estos ensayos durante este estudio por un stock de RNA y

reactivos, ya que se debía cambiar las condiciones (concentración de RNA en Transcripción

reversa y cantidad de ciclos durante la qPCR) lo que significa repetir la corrida con estos

nuevos requisitos para los genes 18s y SLPI.

Respecto al gen SLPI, de acuerdo la información obtenida y recopilada de otras

investigaciones en que se evalúa la función de SLPI bajo otras condiciones de estudio (37,

38, 39, 40), se ha reportado que es un potente inhibidor de la elastasa, catepsina G y tripsina

de leucocitos humanos que se encuentra presente en fluidos y secreciones, además modula la

función inmune en los tractos genital masculino y femenino donde desempeña un papel (41),

ante estos antecedentes se esperaría que el gen codificante para la molécula SLPI

incrementara su expresión de manera significativa ante la infección por Neisseria

gonorrhoeae, sin embargo no podemos aseverar esto sin evidencia futura adicional, debido

a que al analizar los resultados y sus respectivas curvas Melt de manera detallada para los

pacientes 6 y 7, en los ensayos de control (RNA de células de trompa de Falopio sin infectar)

e infección, para los tiempos 4, 8 y 24 horas se detectó la presencia de contaminación que se

destaca considerablemente en los ensayos del paciente 6 control e infección 4 horas, paciente

7 control 4 horas, control 8 horas y control e infección 24 horas, y los ensayo donde hay poca

o nula contaminación (control de qPCR sin templado) donde si bien se aprecia una diferencia

cualitativa entre la expresión del gen en su control sin infección en comparación con las

células infectadas como se aprecia en la Figura 2 tiempo 8 horas, al considerar estos últimos

antecedentes ,y otros que se discutirán más adelante, no se podría aseverar con certeza que

efectivamente existe un aumento en la expresión del gen codificante para la molécula SLPI

en células de trompa de Falopio infectadas con gonococo por la escasa cantidad de datos y el

número de ensayos realizados exitosos (sin contaminación).

Page 33: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Las curvas de disociación o curvas melting se basan en el análisis de la aplicación de

un gradiente de temperatura creciente posterior a los ciclos de la PCR, donde se obtiene una

gráfica con la cinética de disociación de los fragmentos amplificados, gracias a esto, se logra

conocer la temperatura melting (Tm, temperatura en la cual el 50% del DNA este

desnaturalizado) de los productos de la Técnica PCR (42). La Tm de un fragmento

amplificado depende del largo del fragmento y su constitución en nucleótidos, por tanto, cada

fragmento amplificado tiene una Tm característica (42), considerando esto, está establecido

que en la curva de disociación en un ensayo de RT qPCR para un gen específico donde

antes de la realización de la transcripción reversa, se hizo un tratamiento con DNasa con el

fin de eliminar trazas de DNA remanente y mantener el mRNA, sólo debe existir un pick

destacable que corresponde a la Tm del único fragmento que debiese haberse amplificado,

para este caso, el gen SLPI; en los ensayos mencionados anteriormente (paciente 6 control e

infección 4 horas, paciente 7 control 4 horas, control 8 horas y control e infección 24 horas)

se apreció 2 o 3 picos en diferentes localizaciones de gráfico (distintas curvas), un pick

máximo equivalente a la amplificación del gen en estudio y uno o dos pequeños antes o

después del pick máximo aludiendo a la presencia de contaminación. Dicha contaminación

puede deberse a diferentes motivos, comenzando por establecer la naturaleza de la técnica,

su composición, fundamento y posibles errores; la PCR en tiempo real en términos de la

preparación de la muestra lo podemos dividir en dos categorías; PCR en tiempo real de un

paso o PCR en tiempo real de dos pasos, la PCR en tiempo real de un paso contempla la

retrotranscripción y la amplificación dentro de un mismo ensayo, minimizando las

variaciones experimentales y la posibilidad de contaminación, por otro lado la PCR en tiempo

real de dos puntos (protocolo utilizado en este estudio) separa la transcripción reversa de la

amplificación en dos ensayos distintos permitiendo confirmar la eficiencia de la

retrotranscripción entregando una mayor sensibilidad, sin embargo al aumentar las variantes

experimentales, aumenta la posibilidad de una contaminación efectiva (43). Otro factor a

considerar es el método por el cual se realizará la cuantificación, actualmente se destacan

dos, SYBR Green y TaqMan, SYBR Green (metodología para la cuantificación empleada en

este estudio) consta de una sonda de unión reversible que se une al surco menor de una doble

hebra de DNA, interacción que genera un aumento de hasta 1000 veces en la fluorescencia

del colorante; de este método se destaca su rápida optimización, simpleza y bajo costo, sin

Page 34: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

embargo, tiene como desventaja su poca especificidad (44). Por otra parte se cuenta con las

sondas TacMan, que si bien presentan un mayor costo, presume una mayor especificidad,

basándose en la unión específica de la sonda a una secuencia target (44); En resumen, no

obstante SYBR Green tiene un menor costo y es más fácil de usar que TaqMan ya que no

requiere probar el diseño y la síntesis, científicos prefieren el método TaqMan (45, 46),

debido a que claramente utilizando el método SYBR Green, cualquier producto no específico

como los dímeros de primers, o la presencia de DNA foráneo como contaminación, entregaría

un resultado falso positivo o datos incorrectos (47, 48, 49, 50, 51,)

Desde el punto de vista de la contaminación de la muestra, ésta se puede haber

producido en cualquier momento del proceso de trabajo a pesar de haber tomado todas las

medidas pertinentes al momento de la manipulación de las muestras y la realización de los

diferentes procedimientos, es importante analizar de manera detallada en qué parte del

proceso pudo generarse la contaminación o qué factores influyen a que se produzca. Es

posible analizar de manera secuencial el proceso para determinar en cuál de los cuatro pasos

ocurrió o si se produjo en más de uno: obtención del RNA, tratamiento de RNA para

eliminación DNA contaminante con DNAsa, transcriptasa reversa y RT-qPCR, con el fin de

definir con mayor precisión los parámetros que afectan en la contaminación.

En el primer paso, posterior a la obtención y purificación del RNA realizado con Trizol

Reagent, reactivo diseñado para aislar RNA total de alta calidad, facilitando el aislamiento

de una amplia variedad de RNA de diferentes extensiones en su longitud de nucleótidos, que

además mantiene la integridad del RNA debido a una inhibición altamente efectiva de la

actividad de RNAsa al mismo tiempo que altera las células y disuelve componentes celulares

(52), pudo ocurrir que este procedimiento no haya alcanzado su mayor efectividad dejando

presentes restos de DNA genómico o que hubiese existido alguna contaminación con DNA

foráneo (aerosoles, saliva, piel, etc.) ya que posterior a esto se realizó el alicuotado de la

muestras tanto para su almacenamiento y posterior trabajo, pudiendo provocar alguna

contaminación desde el punto de vista de la manipulación y almacenamiento.

Si llegase a existir alguna contaminación de DNA, la que puede ser foráneo o

genómico, pueden plantearse dos situaciones: que durante el proceso de obtención y

Page 35: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

purificación se llevó a cabo de la forma correcta obteniendo un RNA total libre de DNA y

proteínas, pero que al momento de realizar el tratamiento con DNasa se contaminó con DNA

foráneo, o en segunda instancia que tanto en la obtención y purificación del RNA y además

durante el tratamiento con DNasa hubo contaminación teniendo presencia de DNA genómico

y/o foráneo. Es por esto que se realiza el tratamiento de RNA mediante el uso del kit RQ1

RNase-Free DNase que al ser una endonucleasa degrada DNA bicatenario y monocatenario

(53), con el fin de lograr obtener una muestra que esté libre de DNA para lograr determinar

de manera precisa la concentración total de RNA, si existiese una gran contaminación lo más

probable es que este tratamiento con DNasa no logre ser efectivo de manera que cualquier

contaminación significativa de DNA dará como resultado una cuantificación incorrecta (54).

El paso de transcriptasa reversa cobra importancia para la sensibilidad y precisa

cuantificación de cDNA producido por la enzima para representar con exactitud las

cantidades de RNA empleadas razón por la cual cobra gran importancia el rango dinámico,

sensibilidad y especificidad de la enzima a utilizar para así lograr obtener resultados exitosos

de RT-qPCR. En nuestro procedimiento empleamos la enzima M-MLV que es capaz de usar

tanto RNA como DNA monocatenario para sintetizar una cadena de DNA complementaria

(55). Si bien los posibles focos de contaminación con DNA tanto genómico como foráneo

(ambos de tipo bicatenario) pudiesen haber ocurrido en procedimientos anteriores a este paso

de retrotranscripción, estos no generarían mayor interferencia a la técnica puesto que en este

procedimiento la transcriptasa reversa actúa solo sobre el RNA para producir el cDNA, lo

que si pudiese suceder, es que hasta este procedimiento no hubiera existido ninguna

contaminación, y esta tenga lugar durante la realización del ensayo de transcripción reversa

principalmente debido a causas de manipulación.

Finalmente, para el RT-qPCR la posible contaminación se puede producir en el

momento de preparar y cargar las muestras para realizar la técnica, debido a que se requiere

de una serie de pasos que aun tomando todas las precauciones pertinentes y siguiendo con

los protocolos establecidos, presentan una alta probabilidad de contaminación. En primera

instancia, se deben preparar 12 tubos por paciente, tubos correspondientes a control e

infección en los tiempos de estudio 4, 8 y 24 horas, y con el control negativo de transcripción

Page 36: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

para cada uno de estos, donde no se adiciono la transcriptasa reversa por tanto se espera que

no haya amplificación; cada tubo debe contener el templado del gen en estudio, master mix

el cual contiene la sonda SYBR-green, primers forward y reverse para del gen a evaluar y

agua de PCR que es un agua ultra pura, libre de impurezas biológicamente activas (56), si

bien se utilizan alícuotas esta podrían haberse contaminado al momento de prepararlas y en

caso de afirmar la presencia de contaminación deben ser eliminadas. El siguiente paso y

donde también se puede generar una contaminación es en el momento de carga de la placa a

utilizar para el equipo Eco Real-time de Illumina el cual utiliza una placa de 48 pocillos y se

deben extremar las medidas para evitar cualquier contaminación con DNA (57).

Es importante resaltar que las principales fuentes de contaminación más comunes

suelen ser amplicones y templados, pero dentro de las vías de contaminación la principal

corresponden a aerosoles, razón por la cual es siempre la primera sospecha ante la presencia

de contaminación debido a que presentan una fácil dispersión, también podría deberse a la

formación de microgotas las cuales contienen ácidos nucleicos debido a la manipulación de

tubos y apertura de estos los que pueden contener sondar de PCR, primers, amplicones y

templados (58).

Otro de los foco de contaminación es la superficie de trabajo utilizada, lo que se puede

explicar mediante el derrame y el contacto de soluciones las cuales contiene ácidos nucleicos

(partidores, amplicones y templado), esto se puede explicar ya que los microtubos utilizados

podrían derramarse durante la manipulación liberando su contenido, también por la

distribución de las tapas de los microtubos durante la manipulación provocando que se

contaminen, tener un máximo cuidado con las puntas de micropipetas ya empleadas con su

correcta eliminación y aun mayor cuidado con las puntas que están por utilizarse de evitar

que se contaminen, de ser así deben ser eliminadas y utilizar una nueva ya sea ante la

sospecha o que efectivamente ocurriera ya que podrían tener presencia de residuos

contaminantes (59)

También se debe tener presente que la fuente de contaminación puede provenir desde

el momento en que se manipulan las muestra biológicas para la obtención del RNA o que

Page 37: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

posiblemente podrían generarse en el momento de preparación y carga de las muestras en la

placa para la reacción de RT-qPCR, este tipo de contaminación pueden generar diversos

problemas ya que presentan una gran estabilidad y pueden contaminar superficies, equipos y

elemento de trabajo que van desde micropipetas, microtubos y elementos de protección

personal. Con el objetivo de lograr que exista una disminución de los riesgos de

contaminación durante la metodología es necesario realizar un análisis de todo el

procedimiento y tomar las medidas pertinentes (60).

Ahora que conocemos donde se pueden generar las contaminaciones, se entregaran

precauciones dentro del laboratorio, para futuros ensayos donde se utilice RT- qPCR con el

fin de minimizar la probabilidad de contaminación y asegurar la calidad de los resultados

obtenidos. Algunas de las principales acciones para disminuir la contaminación contemplan

ciertas medidas como: no almacenar en un mismo refrigerador/congelador, reactivos libres

de templado junto con ácidos nucleicos purificados y/o con muestras biológicas, en el caso

de no ser posible esto, realizar el almacenamiento en diferentes contenedores que eviten que

se mezclen y que permita una distribución ordenada y selectiva dentro congelador. Si se

detecta contaminación en algún reactivo, partidor, sonda, agua, enzima, etc., éste debe ser

eliminado y como medida para evitar pérdidas de los stocks de reactivos por contaminación,

es recomendable la preparación de alícuotas previo a su uso, de manera de sólo eliminar la

alícuota en uso si se detecta contaminación. Centrifugar brevemente (spin) los tubos que

contengan ácidos nucleicos y luego abrirlos cuidadosamente para evitar contaminar los

guantes y las superficies, de igual forma se debe evitar la excesiva manipulación de abertura

y cierre de los tubos mientras se realiza algún procedimiento lo que puede llevar a

contaminación (61). La superficie utilizada para preparar las reacciones de PCR como son el

uso de campana debe ser descontaminada con radiación ultravioleta antes y después de la

preparación (15 a 30 min). Si se sospecha contaminación, adicionalmente, una vez terminado

el trabajo, pueden limpiarse las superficies con una solución de 0,5 - 1,0 % de hipoclorito de

sodio, que luego debe ser removido con etanol 70%. De igual forma la utilización de peróxido

de hidrógeno para limpiar manos, superficie de trabajo, caja de puntas para micropipetas,

vástagos de micropipetas, gradillas y cualquier otro elemento empleado en el procedimiento.

El uso constante de mascarilla es otro punto importante ya que evita la contaminación por

Page 38: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

medio de aerosoles y las cuales deben ser eliminadas al finalizar un procedimiento al igual

que el cambio constante de guantes (60).

Considerando las limitantes observadas durante el desarrollo de esta investigación,

se cree que es necesario agregar al modelo de estudio los tiempos 0 y 12 horas con la finalidad

de evaluar un rango más amplio de tiempos y de esta manera determinar en qué momento se

obtiene efectivamente el aumento máximo de la expresión del gen, para que de esta forma

se logren mejores resultados y que sean concluyentes respecto a la interrogante planteada, ya

que analizando solamente los tiempos 4, 8, 24, pero dejando fuera 0 y 12 horas se desconoce

realmente si en uno de estos tiempos se pudiese generar el máximo aumento de expresión.

Además de un “n” mayor, ya que nuestro n es insuficiente presentándose como una

limitante para analizar los resultados obtenidos mediante un método estadístico que permita

establecer si existen diferencias significativas, más aún los pacientes 6 y 7 presentaron

valores de Ct muy distintos, pudiéndose deber tanto a las contaminaciones como a las

diferencias fisiológicas entre las pacientes, por lo que se recomienda, contar con un muestreo

de pacientes que presenten características similares; En este estudio por consideraciones

éticas, de las pacientes solo se conocía su sexo, con un muestreo mayor y un consentimiento

informado que nos entregue una data más completa se podría encasillar a las pacientes según

su edad, contemplar información como la maternidad, si sufrió en el pasado algún aborto, la

frecuencia en su actividad sexual, enfermedades crónicas u otros factores, etc., que puedan

modificar su respuesta fisiológica a su condición, ya que cada individuo responde de manera

diferente ante la exposición de un patógeno, teniendo como ejemplo la presentación clínica

de la infección por gonococo en mujeres donde en su mayoría, estas no presentan

sintomatología, sin embargo un menor porcentaje si lo presenta (62).

Page 39: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Conclusión:

• No es posible cuantificar la cantidad de DNA complementario para la molécula

MIP3α a través de la sonda SYBRgreen por el método de PCR en tiempo real de tipo

cuantitativo debido a la ausencia de emisiones fluorescencia dado por las bajas

concentraciones de RNA total empleadas para el estudio (2000 pg) las cuales no son

suficientes para lograr sintetizar cDNA a partir del mRNA correspondiente a la

expresión de MIP3α.

• No se puede asegurar que exista un aumento considerable de la expresión de MIP3α

como respuesta ante la infección por Neisseria gonorrhoeae utilizando

concentraciones de RNA total de 2000 pg o menores a estas.

• Se puede asegurar que para lograr obtener resultados que permitan cuantificar la

cantidad de DNA complementario mediante emisiones de fluorescencia y considerar

si existe un aumento considerable de la molécula MIP3α es necesario aumentar las

concentraciones de RNA total empleada por sobre los 4000 pg al igual la cantidad de

ciclos de PCR sobre 40.

• Es posible cuantificar la cantidad de DNA complementario para la molécula SLPI

mediante emisiones de fluorescencia a través de la sonda SYBR Green por el método

de PCR en tiempo real de tipo cuantitativo, si bien se obtienen otras emisiones de

fluorescencia a distintos ciclos de PCR y a diferentes niveles de fluorescencia

permiten asegurar la presencia de contaminación.

• Existe un aumento observable en la expresión del gen codificante para SLPI en estado

de infección por Neisseria gonorrhoeae, sin embargo no podemos aseverar esto

debido a que existe presencia de contaminación de la muestra generando resultados

inválidos en algunos tiempos de análisis.

Page 40: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

• Para SLPI se puede asegurar que para generar resultados válidos es necesario realizar

una rigurosa aplicación de las diferentes medidas presentadas en la discusión de

manera de desarrollar un flujo unidireccional de trabajo que permita generar un

control efectivo de las posibles causales de contaminación y lograr la obtención de

resultados confiables para el desarrollo de la técnica de RT-qPCR que logren

responder los objetivos del estudio.

Page 41: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

Planificación de trabajo

Unidad de investigación: “Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

moléculas MIP3α y SLPI en células epiteliales de trompa de Falopio humana infectadas con

Neisseria gonorrhoeae.”

Page 42: Análisis de la expresión de los genes codificantes para las

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