Download - 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

Transcript
Page 1: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

48

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

De seguida, são apresentados os resultados obtidos nos ensaios

realizados com a enzima β-galactosidase (E.C. 3.2.1.23) proveniente do

microrganismo Kluyveromyces lactis. Será feita uma apreciação dos valores

obtidos assim como uma comparação desses mesmos valores com estudos

semelhantes anteriormente realizados.

3.1. Ensaios com a Enzima Sóluvel Lactozym® 2600L

A enzima utilizada nestes ensaios foi a Lactozym® 2600L sob a forma de

solução. A β-galactosidase apresentou uma actividade de 2600 U por grama

de preparação enzimática. Esta preparação enzimática apresenta uma

densidade de 1,15 g/mL .

É também conhecida sob as denominações de β-galactosidase, Hydrolact,

Lactase ou Maxilact.

Todos os ensaios realizados com esta enzima foram efectuados a pH 6,8

pois é o pH reportado como o óptimo para esta enzima (43, 44, 45).

Os resultados a seguir apresentados pretendem avaliar o desempenho da

enzima a Lactozym® 2600L na hidrólise do substrato padrão, o o-nitrofenol-β-

ᴅ-galactosideo (o-npg), nas várias condições experimentais.

Como foi referido anteriormente, os produtos da hidrólise deste

substrato são a galactose e o-nitrofenol (o-np) que é um composto de cor

amarela.

3.1.1. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Enzima

Os resultados que seguidamente são apresentados pretendem demostrar de

que modo a variação de concentração de enzima influencia a actividade

Page 2: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

49

enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão,

o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.

Através da análise do gráfico 4., é possível observar que a formação de o-np

depende da concentração de enzima. A concentração de enzima mais elevada,

2,3 mg/mL, origina uma concentração de o-np também mais elevada e atinge

um pico máximo aos 45 min, decrescendo consideravelmente dos 60 aos 90

min.

Gráfico 4. Efeito da variação da concentração de enzima livre ao longo do tempo

O facto da concentração inicial de enzima ser elevada de enzima faz com que

o substrato seja rapidamente convertido, por um lado, e levando ao

aparecimento de galactose, por outro, pois é um produto da hidrólise

enzimática do substrato. A galactose é um inibidor competitivo da enzima

diminuído a sua actividade (27,43,46).

A concentração inicial de enzima de 0,920 mg/mL foi a que demonstrou

melhores resultados. De facto formou-se o-np durante um maior período de

tempo, tendo sido registado o seu pico de concentração aos 90 minutos de

ensaio.

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

1400,00

1600,00

1800,00

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Co

nce

ntr

ação

de

o-n

p (

uM

)

Tempo (min)

1,150 mg/mL

2,300 mg/mL

0,920 mg/mL

0,575 mg/mL

0,460 mg/mL

Page 3: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

50

As concentrações de 0,575 e de 0,460 mg/mL apesar de terem registado

valores de actividade iniciais bastante aceitáveis, a partir dos 60 minutos de

ensaios originaram um patamar na conversão do o-npg (Gráfico 4.).

A concentração enzimática de 1,150 mg/mL, sendo a segunda mais elevada

só demonstrou actividade significativa nos primeiros 30 minutos de reacção,

atingindo o o-np um valor de concentração semelhante aos 90 minutos de

ensaio.

Na avaliação dos resultados no estudo do efeito da concentração de enzima

livre foi escolhida uma abordagem alternativa que recorre à equação clássica de

Henri-Michaelis–Menten, empregue por alguns autores e que sugere que a

velocidade inicial de hidrólise, vo pode ser expressa como função da

concentração inicial de enzima ([Eo]), ou seja: vo = (Vemax x [Eo])/(Ke + [Eo]).

A relação entre a velocidade inicial aumenta com o aumento de concentração

enzimática no entanto esse aumento não é linear, tendendo para estabilizar

aquando do emprego de soluções enzimáticas mais concentradas, devido à

saturação da superfície do substrato.

O modelo escolhido permite calcular o valor das duas constantes Vemax e Ke,

respectivamente 20,3 mM/min e 51 g/mL, e que correspondem à velocidade

máxima quando a concentração enzimática tende para infinito e à concentração

de enzima correspondente a metade da saturação.

Gráfico 5. Efeito da variação da concentração de enzima livre na actividade enzimática

0

5

10

15

20

25

0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500

Act

ivid

ade

en

zim

átic

a (0

-np

M

/min

)

Concentração Enzima Livre (mg/mL)

Exp

Modelo

Page 4: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

51

3.1.2. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Substrato

Os resultados seguintes pretendem avaliar o efeito da concentração de

substrato na actividade enzimática e foram obtidos em ensaios à temperatura

de 37 °C e com uma concentração de enzima livre de 0,920 mg/mL.

Os valores representados no gráfico 5 sugerem um aumento da actividade

enzimática com o aumento da concentração inicial de substrato.

Gráfico 6. Efeito da Variação da Concentração de Substrato na enzima livre

No entanto, e a partir dos 60 minutos de ensaio, a reacção progride mais

lentamente pois é a partir deste ponto que o substrato disponível no meio

reaccional para hidrólise diminui consideravelmente, havendo já, neste ponto

da reacção de hidrólise com a enzima livre, muito produto formado. O produto

formado pela hidrólise do o-npg é, como já foi referido, o-np e galactose. Alguns

trabalhos (45) referem que a galactose disponível no meio funciona como

inibidor competitivo da enzima β-galactosidase, fazendo com que deste modo a

reacção seja mais lenta e a enzima demonstre menor actividade enzimática.

A teoria de inibição da actividade da β-galactosidase pela galactose foi antes

confirmada em vários estudos (22,46,49), principalmente na investigação da

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Co

nce

ntr

ação

de

o-n

p (

uM

)

Tempo (min)

2,5 mM

5 mM

7,5 mM

10 mM

12,5 mM

15 mM

Page 5: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

52

produção de galacto-oligossacáridos através da utilização da actividade

transglicolítica desta enzima.

Gráfico 7. Actividade enzimática da enzima livre às diferentes concentrações de substrato

A influência da concentração de o-npg na actividade hidrolítica da β-

galactosidase nas condições referidas anteriormente foi avaliada com

determinação dos parâmetros cinéticos. Neste trabalho verificou-se que a

actividade da β-galactosidase é favorecida com o aumento da concentração de

substrato de 0,25 até 12,5 mM (Gráfico 6).

O modelo de Michaelis-Menten {vo = (Vmax x [S])/(KM + [S])}, ajustado por

regressão não linear, aos pontos experimentais obtidos nos ensaios de

bioconversão (Gráfico 6) permitiu a estimativa dos parâmetros cinéticos:

velocidade máxima, Vmáx, de 30,20 mM.min-1, constante de Michaelis-Menten

(constante de afinidade pelo substrato), KM, de 5,27 mM e uma constante

catalítica (kcat) de 32,83 M/min.mg. A constante catalítica corresponde ao

número máximo de moléculas de substrato, que são convertidas em produto,

por unidade de tempo, por sítio catalítico, quando a enzima se encontra

saturada com o substrato.

A eficiência cinética de uma enzima, relativamente a um substrato, é avaliada

pela constante de especificidade (kcat/KM), que dá uma medida da rapidez, com

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20

Act

ivid

ade

En

zim

átic

a

( µ

M o

-np

/min

)

Concentração de Substrato Inicial (mM)

Exp

Model

Page 6: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

53

que a enzima actua sobre um substrato em baixas concentrações. Esta

constante foi de 0,00623 min-1.mg-1, valor ao qual a enzima atingiu o seu

máximo de eficiência.

Realizando uma análise comparativa com estudos anteriores, nota-se que, a

com mesma enzima mas proveniente de Kluyveromices fragilis, sob condições

experimentais de pH e temperatura semelhantes, se obteve um KM de 1,7 mM

(43), inferior ao valor de KM de 5,27 aqui obtido. Já noutro estudo, de 2012, o

valor de KM obtido nos ensaios com a enzima livre foi de 4,77 mM, tendo sido

neste estudo utilizada exactamente a enzima proveniente também de

Kluyveromyces lactis (30).

Um estudo publicado em 2011 (45), realizado com β-galactosidase de

Aspergilus oryzae e sob condições experimentais favoráveis a esta enzima,

demonstra que a actividade enzimática é favorecida com as concentrações

elevadas de substrato. Este estudo confirma os resultados aqui obtidos.

3.1.3. Estudo do Efeito da Variação da Temperatura

Os ensaios que culminaram na obtenção destes resultados foram

realizados com uma concentração de substrato de 15mM e com uma

concentração de enzima livre de 0,920 mg/mL. Avaliando o efeito da variação

da temperatura na actividade enzimática, notam-se diferenças significativas

na hidrólise enzimática do substrato às diferentes temperaturas testadas, tal

como se pode observar no gráfico 7.

Page 7: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

54

Gráfico 8. Efeito da variação da temperatura na enzima livre

A enzima demostrou actividade mais elevada a temperaturas mais baixas,

sendo que à temperatura de 20 °C demostrou ter a maior actividade. A

temperaturas mais elevadas a enzima não demostrou ter actividade

significativa, sendo que se nota um decréscimo acentuado nos valores de

actividade enzimática a temperaturas superiores a 37 °C.

À temperatura de 15 °C apenas foi possível cumprir 45 minutos de ensaio

uma vez que as amostras recolhidas após este tempo não apresentavam

valores de absorvância fixos quando introduzidas no espectrofotómetro para

leitura, apesar de ter sido cumprido o mesmo procedimento para parar a

reacção (com 500 µL carbonato de sódio e manutenção da amostra em gelo

até à leitura da absorvância). Os valores de absorvância aumentavam

rapidamente, diminuído logo de seguida, não fixando nenhum valor.

A partir dos 60 minutos de ensaio nota-se uma evolução bem mais lenta

na hidrólise do substrato. Este facto deve-se ao decréscimo de substrato

disponível no meio reaccional devido à elevada taxa de conversão nos

primeiros 45 minutos, em todos os casos.

Estudos efectuados anteriormente com a mesma enzima e com o mesmo

substrato demonstraram, sob condições experimentais semelhantes, que a

temperatura óptima desta enzima usando o o-npg como substrato seria de

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

1400,00

1600,00

1800,00

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Co

nce

ntr

ação

de

o-n

p (

uM

)

Tempo (min)

15 ºC

20 ºC

30 ºC

37 ºC

50 ºC

60 ºC

Page 8: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

55

50 °C (43). No entanto, e no mesmo estudo, não foram conseguidos valores

de actividade enzimática pertinentes a 60 °C, tal como no nosso estudo,

sendo que actividade decrescia circunstancialmente a temperaturas

superiores a 50 °C.

Outro estudo de 2011 (18), realizado também sob as condições

experimentais semelhantes, demonstrou que a temperatura de 25 °C é a

temperatura a que a enzima possuiu maior actividade de hidrólise do

substrato, sendo que a temperaturas elevadas a enzima demonstrou fraca

actividade de hidrólise do substrato, tal como no nosso estudo. Como prova

disso, existe também outro trabalho de 2011 (48) onde se comprova que à

temperatura de 40 °C, a β-galactosidase proveniente de Kluyveromyces lactis,

após 45 minutos de ensaio perda cerca de cem por cento da actividade.

Num estudo em que foram utilizadas condições experimentais

semelhantes mas com recurso a β-galactosidase proveniente de outros

microrganismos ficou demostrado que, para hidrólise do substrato padrão (o-

npg), a enzima proveniente de Lactobacilus reuteri apresentou, também,

actividade máxima a 50 °C (1) enquanto que a enzima proveniente de Bacilus

stearothermophilus apresentou máxima actividade na hidrólise de substrato

padrão a 70 °C, sendo que a temperaturas inferiores a esta, houve um

declínio acentuado da actividade (39). Enzimas provenientes de

microrganismos termófilos, como é o caso de Bacilus stearothermophilu ou

da Thermotoga marítima, que demonstrou valores máximos de actividade a

80 e 85 °C (48), são estáveis a temperaturas mais elevadas do que as

provenientes de microrganismos mesófilos, como é o caso do Kluyveromyces

lactis.

Um estudo semelhante mas realizado com β-galactosidase proveniente

de Aspergilus oryzae, demonstrou que a temperatura óptima da enzima

proveniente desse microorganismo foi de 50 °C, apesar do seu pH óptimo ser

de 4.5, valor ao qual foram realizados os ensaios nesse estudo (11). A enzima

Page 9: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

56

proveniente do microrganismo Aspergilus oryzae, como já foi referido antes

neste trabalho, encontra-se extensivamente estudada academicamente e é,

também, bastante aplicada a nível industrial por possuir o estatuto GRAS,

podendo desta forma ser utilizada em produtos alimentares.

Dado os resultados obtidos e aqui apresentados, pode-se inferir que, a

enzima em estudo, sendo proveniente de microrganismo mesófilo, não

apresenta actividade a temperaturas elevadas uma vez que as altas

temperaturas desnaturam a enzima, desactivando-a.

Gráfico 9. Actividade enzimática da enzima livre a diferentes temperaturas

Analisando todos os resultados aqui apresentados, prova-se que a

enzima utilizada tem uma temperatura óptima de actividade de 20 - 30 °C na

hidrólise do substrato padrão, o o-npg. O valor de actividade obtido à

temperatura de 15 °C é semelhante às anteriores 20 e 30 °C contudo a

formação de o-npg não foi avaliada para tempos superiores a 45 min.

Page 10: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

57

3.2. Ensaios com a enzima imibond galactosidase SPRIN®

A enzima utilizada nestes ensaios foi a imibond galactosidase SPRIN®

disponibilizada comercialmente pela SPRIN tecnhologies® sob a forma

imobilizada. A enzima imobilizada é a enzima β-Galactosidase proveniente do

microganismo Kluyveromyces lactis e apresenta uma actividade de 20 U por

grama de preparação enzimática imobilizada. O suporte de imobilização é

uma resina amino acrílica e as esferas têm um tamanho de partícula de 200-

500 µm.

A enzima foi armazenada no frigorífico a temperaturas entre os 2 e os 8

°C, na sua embalagem de origem, de modo não perder actividade. Antes da

sua utilização em ensaios, e como foi referido anteriormente neste trabalho,

a enzima sofria uma preparação. Todos os ensaios realizados com esta

enzima foram efectuados a pH 6,8 pois é o reportado como o óptimo para

esta enzima (41,43).

Os resultados a seguir apresentados pretendem avaliar o desempenho da

enzima a imibond galactosidase SPRIN® na hidrólise do substrato padrão, o o-

nitrofenol-β-ᴅ-galactosideo (o-npg), nas várias condições experimentais.

3.2.1. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Enzima

Todos os resultados que seguidamente serão apresentados pretendem

demostrar de que modo a variação de concentração de enzima influencia a

actividade enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de

substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.

Os resultados esquematizados graficamente sugerem um aumento da

actividade enzimática com o aumento da concentração de enzima até ao valor

de 10 mg de biocatalizador por mL de meio reaccional. Nos ensaios realizados

Page 11: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

58

com 12 mg de biocatalizador por meio reaccional imobilizada os valores de

conversão do substrato padrão são inferiores ao que seria de esperar.

Gráfico 10. Efeito da variação da concentração de enzima SPRIN®

Nos ensaios em que se utilizou concentrações de enzima de 4, 6, 8 mg

por mL de volume reaccional verificou-se uma velocidade inicial de reacção

hidrolitica mais elevada, com um pico de concentração de o-np aos 60 minutos

de ensaio.

Com a massa de enzima de 10 mg/mL a reacção dá-se um modo mais

gradual até aos 90 minutos de ensaio, sendo que após este tempo, os valores de

reacção de hidrólise são mais lento.

Apesar de ter sido mantida uma agitação constante de 200 rpm durante todo

o ensaio, os valores menos elevados de conversão de substrato em produto

para os valores de massa de enzima de 12 mg/mL, podem dever-se à pequena

dimensão dos frascos utilizados nos ensaios e que não permitiram que toda a

enzima contactasse com o substrato, neste caso em que a quantidade física de

enzima era maior.

Em todos os outros casos, não se encontrou grandes aumentos de

concentração de produto no meio após os 90 minutos de ensaio pois o

substrato já estaria, na sua maioria, convertido, restando pouco substrato

disponível no meio reaccional para ser hidrolisado.

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

0 30 60 90 120 150 180 210

Co

nce

ntr

ação

de

o-n

p (

uM

)

Tempo (min)

4 mg/mL

6 mg/mL

8 mg/mL

10 mg/mL

12 mg/mL

Page 12: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

59

Dentro deste parâmetro e com esta enzima em especifico, não foram

encontrados mais estudos sendo, deste modo, impossível uma comparação com

outros trabalhos realizados.

Gráfico 11. Actividade enzimática da enzima SPRIN® às diferentes concentrações de enzima.

3.2.2. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Substrato

Neste ponto, serão apresentados os resultados obtidos nos ensaios

realizados com objectivo de avaliar o efeito da concentração de substrato. Estes

ensaios foram realizados à temperatura de 37 °C e com uma concentração total

de enzima imobilizada de 10 mg/mL.

No geral, através da interpretação dos resultados apresentados no gráfico 10,

conclui-se que a actividade enzimática é maior quanto maior for a concentração

de substrato, uma vez que valores mínimos de conversão de substrato em

produto foram registados para os ensaios realizados com uma concentração de

substrato de 2,5 mM e valores máximos para os ensaios realizados com

concentração de substrato de 15 mM.

No entanto, e como evidenciado anteriormente nos ensaios de avaliação do

efeito da concentração de enzima, a reacção dá-se mais rapidamente os

0

5

10

15

20

25

30

35

0 2 4 6 8 10 12 14

Act

ivid

dad

e e

nzi

mát

ica

(M

o-n

p/m

in)

Concentração de biocatalisador (mg/mL)

Page 13: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

60

primeiros noventa minutos de ensaio, sendo que depois dos noventa minutos

seguintes, a reacção continua a dar-se mas de um modo mais lento.

Gráfico 12. Efeito da variação da concentração de substrato na enzima SPRIN®

Como excepção, aponta-se o ensaio realizado com concentração de substrato

de 2,5 mM onde há um aumento da concentração de produto até aos 120 min

de ensaio.

Pode-se apontar como principal razão para a estabilização aparente dos

valores de concentração de produto no meio reaccional a depleção do substrato

existente no meio, que já foi evidenciada em ensaios anteriores utilizando-se a

mesma enzima.

Gráfico 13. Actividade enzimática da enzima SPRIN® às diferentes concentrações de substrato

0,000

500,000

1000,000

1500,000

2000,000

0 30 60 90 120 150 180

Co

nce

ntr

ação

de

o-n

p

(uM

)

Tempo (min)

2,5 mM

5 mM

7,5 mM

10 mM

12,5 mM

15 mM

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 5 10 15 20

Act

ivid

ade

Enzi

mát

ica

(

µM

o-n

p/m

in)

Concentração de Substrato Inicial (mM)

Exp

Model

Page 14: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

61

A influência da concentração de o-npg na actividade hidrolítica da β-

galactosidase nas condições referidas anteriormente foi avaliada com

determinação dos parâmetros cinéticos. Neste trabalho verificou-se que a

actividade da β-galactosidase é favorecida com o aumento da concentração de

substrato de 2,5 até 10 mM (Gráfico 12). Uma maior concentração inicial de

substrato favorece a actividade enzimática, tendo sido obtidos melhores

resultados de actividade enzimática com a concentração de substrato de 10

mM. O modelo de Michaelis-Menten, ajustado por regressão não linear, aos

pontos experimentais obtidos nos ensaios de bioconversão (Gráfico 12)

permitiu a estimativa dos parâmetros cinéticos: velocidade máxima, Vmáx, de

20,5 mM.min-1, constante de Michaelis-Mente (constante de afinidade pelo

substrato) KM, de 2,66 mM e uma constante catalítica (kcat) de 2,05 M/min.mg.

A constante catalítica corresponde ao número máximo de moléculas de

substrato, que são convertidas em produto, por unidade de tempo, por sítio

catalítico, quando a enzima se encontra saturada com o substrato.

A eficiência cinética de uma enzima, relativamente a um substrato, é avaliada

pela constante de especificidade (kcat/KM), que dá uma medida da rapidez, com

que a enzima actua sobre um substrato em baixas concentrações. Esta

constante foi de 0,80 M/min mg, valor ao qual a enzima atingiu o seu máximo

de eficiência.

Comparativamente com a enzima livre, como esperado, os valores obtidos

foram superiores para o Vmax e para o KM, afirmando que, na sua forma livre a

enzima está mais disponível para se ligar ao substrato e formar produto do que

na forma imobilizada. No entanto e em ambos os casos, a enzima atingiu o seu

máximo de eficiência.

Neste caso, e como no ponto anterior, não há estudos comparativos que

possam ser referidos.

Page 15: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

62

3.2.3. Estudo do Efeito da Variação da Temperatura

Iremos avaliar, de seguida, os resultados obtidos nos ensaios com esta

enzima mas a diferentes temperaturas. Nestes ensaios foi utilizada uma

concentração de substrato de 15 mM e uma concentração total de

biocatalizador de 10 mg/mL de meio reaccional.

Nos ensaio realizados a diferentes temperaturas foram obtidos os

resultados que aqui se representam graficamente no gráfico 12.

Gráfico 14. Efeito da variação da temperatura na enzima SPRIN®

A enzima imibond galactosidase SPRIN® demonstrou estabilidade

operacional às várias temperaturas a que foi testada, não havendo grandes

diferenças entre a hidrólise do substrato, o-npg, nos ensaios realizados a

diferentes temperaturas.

Não houve possibilidade de se realizarem ensaios noutras temperaturas

devido à limitação dos equipamentos em que foram realizados os ensaios, uma

vez que não estavam programados para temperaturas inferiores a 20 °C e

superiores a 60 °C.

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

1400,00

1600,00

1800,00

2000,00

0 30 60 90 120 150 180

Co

nce

ntr

ação

de

o-n

p (

uM

)

Tempo (min)

20 ºC

30 ºC

37 ºC

50 ºC

60 ºC

Page 16: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

63

Gráfico 15. Actividade enzimática da enzima SPRIN® a diferentes temperaturas

No entanto, apesar de muito semelhantes, podemos inferir pela análise

dos valores de actividade enzimática expressos no gráfico em cima

representado que se obteve o valor de actividade enzimática ligeiramente mais

elevado à temperatura de 30°C.

Em todas a temperaturas testadas em ensaio, a reacção hidrolítica de

conversão do substrato ocorre rapidamente nos primeiros 30 minutos de

ensaio, sendo que após este período de tempo, a conversão se dá de forma

mais lenta, continuando a verificar-se um aumento da concentração de

produto, o-np, no meio.

Mais uma vez, não existem estudos semelhantes pelo que torna uma

análise comparativa, impossível. Contudo a comparação com a enzima solúvel

mostra que a enzima imibond galactosidase SPRIN® é mais termoestável. De

facto esta enzima apresenta uma actividade semelhante entre os 20 e os 60 °C,

enquanto a actividade da enzima solúvel decresce significativamente (~88%) a

temperaturas entre 40 a 60 °C.

0

1

2

3

4

5

6

7

0 10 20 30 40 50 60 70

Act

ivid

ade

En

zim

átic

a

M o

-np

/min

)

Temperatura (°C)

Page 17: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

64

3.2.4. Estudo da actividade enzimática durante o processo em

contínuo

Uma das vantagens da imobilização enzimática é possibilitar a reutilização

das enzimas, tornando os processos de conversão por catálise enzimática mais

económicos.

Os resultados seguintes dizem respeito ao estudo realizado com a enzima

imibond galactosidase SPRIN® e pretendem avaliar a actividade da enzima em

vários ciclos de utilização. Para tal, foram realizados ensaios à temperatura de

37 °C e com uma concentração de substrato de 15 mM. Os ensaios tiveram

duração de 60 minutos, no final dos quais a solução de substrato era substituída

por uma nova solução de igual concentração inicial.

Os resultados encontram-se representados graficamente (Gráfico 13 e 14).

Gráfico 16. Reutilizações da enzima SPRIN®

Os ensaios foram realizados ao longo de três dias diferentes mas

consecutivos em que, em cada dia, eram realizados 5 ciclos de ensaio. Entre a 5ª

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

1400,00

1600,00

1800,00

2000,00

0 15 30 45 60 75

Co

nce

ntr

ação

o

-np

(u

M)

Tempo (min)

10ª

11ª

12ª

13ª

14ª

15ª

Page 18: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

65

e a 6ª reutilizações e entre a 10ª e a 11ª reutilização, a enzima ficou

armazenada no frigorífico, em solução tampão.

Gráfico 17.Actividade enzimática da enzima SPRIN® em cada reutilização.

Gráfico 18.Actividade residual da enzima SPRIN® ao longo do tempo

Pela análise dos gráficos, verifica-se que a enzima manteve uma actividade

bastante significativa até à 9ª reutilização, sendo que no 10º ciclo de ensaio, a

actividade decaiu consideravelmente. Nota-se que a actividade demostrada na

11ª reutilização aumentou consideravelmente. O ensaio número 11 foi o

0

5

10

15

20

25

30

0 5 10 15 20

Act

ivid

ade

En

zim

átic

a

( µ

M o

-np

.min

)

Nº Reutilização

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Act

ivid

ade

Res

idu

al (%

)

Tempo (h)

Page 19: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

66

primeiro ensaio realizado no terceiro dia consecutivo de ensaios de reutilização,

tendo estado a enzima armazenada no frigorífico toda a noite, em solução

tampão. O valor mais elevado de actividade demostrada pode dever-se a este

facto, uma vez que a solução tampão utilizada na sua armazenagem é também a

solução de lavagem.

No entanto, e após a 11ª reutilização, os valores de actividade enzimática

decrescem consideravelmente até à 15 ª reutilização, altura em que são

registados os mais baixos valores de concentração de produto, o-np, no meio

reaccional.

A enzima imibond galactosidase SPRIN® demostrou que, em ensaios

contínuos, manter actividade hidrolítica durante quinze ensaios. Esta

capacidade de manter a actividade enzimática é bastante favorável quando

aplicada a nível industrial pois diminui significativamente os custos associados

aos processos de bioconversão.

Através do método de Bradford para o doseamento da proteína, foram

analisados, entre cada reutilização os valores de proteína existentes no meio

reaccional de modo a perceber se o decaimento da actividade enzimática se

devia a perda de enzima do suporte de imobilização para o meio reaccional ou

se era devido à saturação da própria enzima. Por análise da proteína no meio

reaccional pelo método Bradford verificou-se que a perda de enzima foi

inexistente ao longo dos ensaios de reutilização da β-galactosidase.

O suporte de imobilização, neste caso, funciona muito bem pois não permite

grandes perdas de enzima para o meio durante os ensaios, mesmo ao final de

quinze ensaios.

Page 20: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

67

3.3. Ensaios com a enzima imobilizada em esferas de Alginato de

Cálcio

Nestes ensaios, pretendeu-se testar a enzima Lactozym® 2600L

imobilizada em alginato de cálcio pelo método de encapsulamento.

As esferas utilizadas tinham 2 mm de diâmetro e 10 µL de volume. As

esferas eram sempre feitas com 24 horas de antecedência de modo a que

pudessem ficar a consolidar no frigorífico antes de ser utilizadas nos

diferentes ensaios.

Foram igualmente feitas microesferas utilizando-se o mesmo polímero e

preparação enzimática que a esferas utilizadas nestes ensaios mas não foi

possível obter-se reprodutibilidade na sua produção e por isso não foi

possível serem testadas em ensaios.

A solução tampão utilizada nestes ensaios é diferente da solução tampão

utilizada nos ensaios anteriores, uma vez que soluções tampão contendo iões

fosfato agem como agentes sequestrantes para o cálcio, extraindo-o do

alginato, promovendo a desintegração das esferas (31). Foi então utilizado

uma solução tampão de Tris-HCl, 0,1 M, pH 7,0. De modo a evitar esta

situação.

Os resultados a seguir apresentados pretendem avaliar a actividade

enzimática da Lactozym® 2600L quando imobilizada em esferas de alginato

de cálcio na hidrólise do substrato padrão, o o-nitrofenol-β-ᴅ-galactosideo (o-

npg), em várias condições experimentais. Os ensaios foram todos realizados

num agitador orbital com agitação de 200 rpm.

Como foi referido anteriormente, os produtos da hidrólise deste substrato

são a galactose e o-nitrofenol (o-np) que é um composto de cor amarela.

Não foram encontrados estudos em que fosse testada esta enzima

imobilizada em alginato de cálcio. Há apenas alguns estudos que investigam a

imobilização neste suporte da enzima proveniente de Aspergilus oryzae.

Page 21: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

68

Deste modo, sempre que forem referidos estudos anteriores no decorrer da

análise dos resultados obtidos nos ensaios realizados dizem respeito a

enzimas provenientes deste microorganismo e servirão apenas como

referência e não em termos comparativos uma que a enzima deste

microrganismo possui mecanismos de actuação e condições experimentais

diferentes.

3.3.1. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Enzima

Os resultados seguintes, dizem respeito à variação da concentração de

enzima imobilizada e ao efeito das várias concentrações na actividade

enzimática e capacidade hidrolítica. Foram imobilizadas diferentes volumes de

enzima que correspondem a esferas com diferentes concentrações de enzima.

Os ensaios foram realizados a 37°C e com uma concentração de substrato de 15

mM.

Gráfico 19.Efeito da variação da concentração de enzima imobilizada em alginato de cálcio

Como esperado, nos ensaios com concentrações de enzima mais

elevadas houve uma maior hidrólise do substrato, o que resultou numa maior

concentração de produto no meio reaccional. Com todas as concentrações de

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

1400,00

1600,00

1800,00

2000,00

0 30 60 90 120 150 180 210

Co

nce

ntr

ação

de

oN

P (

uM

)

Tempo (min)

17,25

28,75

40,25

57,50

Page 22: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

69

enzima testada é notado um aumento gradual da formação de produto

proveniente da hidrólise de substrato, sendo mais acentuado nos primeiros 30

minutos de ensaio para a concentração de enzima de 57,5 mg/mL.

Gráfico 20. Actividade enzimática da enzima imobilizada em alginato de cálcio a várias concentrações

3.3.2. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Substrato

Neste ponto, irão ser analisados os efeitos da concentração de substrato

na actividade enzimática. Os ensaios realizados para avaliar o efeito da

concentração de substrato sobre a actividade enzimática foram realizados a

37 °C e com esferas de alginato contendo 40,25 mg/mL de enzima.

Apresenta-se de seguida o gráfico 16 onde estão esquematizados os

resultados obtidos.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00

Act

ivid

ade

En

zim

átic

a

M o

-np

/min

)

Concentração de enzima (ug/mL)

Page 23: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

70

Gráfico 21. Efeito da Variação da Concentração de Substrato na enzima imobilizada em alginato

cálcio

Pela análise dos resultados, conclui-se que o aumento da concentração

inicial de substrato aumenta a actividade enzimática, no sentido de se obterem

concentrações mais elevadas de produto formado no meio.

Observa-se também que, com todas as concentrações de substrato

testadas, há um aumento significativo da conversão de substrato em produto

nos primeiros 60 minutos de ensaio, continuando depois a existir conversão

mas dando-se esta mais lentamente. Este abrandamento da conversão pode

dever-se ao facto de haver menos substrato disponível no meio ao mesmo

tempo que a enzima sofre inibição competitiva pela galactose, sendo também

este monossacárido um produto da hidrólise do o-npg.

Gráfico 22. Actividade enzimática da enzima imobilizada em alginato de cálcio às diferentes

concentrações de substrato

0,000

150,000

300,000

450,000

600,000

750,000

900,000

0 30 60 90 120 150 180

Co

nce

ntr

ação

de

o-n

p

(uM

)

Tempo (minutos)

2,5 mM

5 mM

7,5 mM

10 mM

12,5 mM

15 mM

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20

Act

ivid

ade

Enzi

mát

ica

(

µM

o-n

p.m

in-1

)

Concentração de Substrato Inicial (mM)

Exp

Model

Page 24: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

71

A influência da concentração de o-npg na actividade hidrolítica da β-

galactosidase nas condições referidas anteriormente foi avaliada com

determinação dos parâmetros cinéticos. Neste trabalho verificou-se que a

actividade da β-galactosidase é favorecida com o aumento da concentração de

substrato de 0,25 até 12,5 mM (Gráfico 17). Uma maior concentração inicial de

substrato favorece a actividade enzimática, tendo sido obtidos melhores

resultados de actividade enzimática com a concentração de substrato de 10

mM. O modelo de Michaelis-Menten, ajustado por regressão não linear, aos

pontos experimentais obtidos nos ensaios de bioconversão (Gráfico 17)

permitiu a estimativa dos parâmetros cinéticos: velocidade máxima, Vmáx, de

7,07 mM.min-1, constante de Michaelis-Mente (constante de afinidade pelo

substrato) KM, de 3,66 mM e uma constante catalítica (kcat) de 0,176

M/min.mg. A constante catalítica corresponde ao número máximo de

moléculas de substrato, que são convertidas em produto, por unidade de

tempo, por sítio catalítico, quando a enzima se encontra saturada com o

substrato.

A eficiência cinética de uma enzima, relativamente a um substrato, é

avaliada pela constante de especificidade (kcat/KM), que dá uma medida da

rapidez, com que a enzima actua sobre um substrato em baixas concentrações.

Esta constante foi de 0,218 mM/min mg, valor ao qual a enzima atingiu o seu

máximo de eficiência.

Comparando estes valores com os dos ensaios realizados anteriormente,

concluímos que este tipo de imobilização demostrou maior afinidade para o

substrato do que a preparação de enzima adquirida comercialmente (SPRIN)

pois a constante de Michaelis-Menten é inferior nesse caso.

Page 25: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

72

3.3.3. Estudo do Efeito da Variação da Temperatura

Seguidamente serão apresentados os resultados dos estudos sobre o efeito

da temperatura sobre a enzima imobilizada, sendo que os ensaios foram

realizados com esferas de alginato com uma concentração de enzima de 40,25

mg/mL e com concentração de substrato de 15 mM.

Como demostrado nos resultados evidenciados no gráfico 18., à temperatura

de 30 °C foi a qual a enzima imobilizada demostrou melhor desempenho, não

havendo diferenças significativas entre os ensaios realizados às temperaturas de

20 e 50 °C.

Gráfico 23. Efeito da variação da temperatura na enzima imobilizada em alginato de cálcio

A todas as temperaturas testadas, os resultados demostraram haver um

aumento gradual da concentração de produto formado no meio reaccional.

Até aos 60 minutos de ensaio à temperatura de 37 °C verifica-se que a

conversão é ligeiramente superior às dos ensaios realizados com as restantes

temperaturas, mas após este período de tempo a concentração de produto no

meio reaccional torna-se, praticamente, constante.

Durante os primeiros 90 minutos de ensaio os valores de concentração de

produto formado são semelhantes, em todas as temperaturas, mas partir dos

90 minutos de ensaio, os valores obtidos á temperatura de 30 °C destacam-se

bastante dos demais por serem mais elevados.

0,000

500,000

1000,000

1500,000

2000,000

0 30 60 90 120 150 180Co

nce

ntr

ação

de

ON

P

(uM

)

Tempo (minutos)

20 ºC

30 ºC

37 ºC

50 ºC

Page 26: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

73

Gráfico 24. Actividade enzimática da enzima imobilizada em alginatode cálcio a diferentes

temperaturas

Um estudo de 2007, realizado com a mesma enzima mas proveniente de

outro microrganismo, demostra que a actividade máxima se registou aos 50 °C,

para a enzima imobilizada em alginato de cálcio (11).

Pode-se também referir, que neste caso, nota-se uma alteração na

temperatura óptima para 30 °C quando comparado com enzima solúvel, que

demostrou maior actividade aos 20 °C.

3.3.4. Estudo da actividade enzimática durante o processo em

contínuo

A imobilização da enzima foi realizada para que pudesse ser testada a sua

estabilidade operacional em ensaios consecutivos, uma vez que a capacidade de

reter a actividade hidrolítica deve ser um das características das enzimas

imobilizadas pois permite que sejam reutilizadas várias vezes.

Os resultados que serão apresentados em seguida correspondem aos ensaios

realizados com esferas de alginato de cálcio contendo 40,25 mg de enzima

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 10 20 30 40 50 60

Act

ivid

ade

en

zim

átic

a (o

-np

fo

rmad

o.m

in-1

)

Temperatura (°C)

Page 27: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

74

imobilizada e foram realizados a 37 °C e com concentrações de o-npg de 15

mM. A cada 180 minutos de ensaio, a solução de substrato era substituída por

outra de igual concentração inicial. Os ensaios foram realizados todos no

mesmo dia e consecutivamente.

Os resultados obtidos nos ensaios de reutilização estão sumariados no gráfico

20., em baixo apresentado.

Gráfico 25. Reutilizações da enzima imobilizada em alginato de cálcio (2%)

Existem discrepâncias muito grandes nos valores de conversão de substrato

entre as reutilizações. Como seria de esperar, no primeiro ensaio, os resultados

obtidos foram os melhores, com um aumento bastante acentuado da

concentração de produto formado nos primeiros 60 minutos de reacção sendo

que depois, apesar de haver aumento dos valores, já não é tão significativo.

Na segunda utilização da enzima, houve um aumento gradual, ao longo de

todo o ensaio, da concentração de produto formado, de 212, 3 para 307,0 µM.

No entanto, na terceira reutilização foi notado que a enzima tinha perdido a

maioria da sua capacidade hidrolítica, não havendo aumento do produto

formado, apesar de haver bastante substrato disponível no meio reaccional.

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

700,00

800,00

900,00

1000,00

0 30 60 90 120 150 180

Co

nce

ntr

ação

o-n

p (

uM

)

Tempo (min)

Page 28: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

75

Gráfico 26. Actividade enzimática da enzima imobilizada em alginato de cálcio (2%) em cada

reutilização.

A actividade enzimática diminuiu exponencialmente ao longo do tempo,

obedecendo a um modelo de 1ª ordem de desactivação das enzimas, excepto

em enzimas imobilizadas, cuja equação pode ser representada por:

Onde, A0 – actividade enzimática inicial (µM.min-1); A – actividade

enzimática no tempo t (µM/min); Kd – constante de desactivação (min-1) e t –

tempo de reacção (min).

O tempo de meia-vida (t1/2) é aquele em que a enzima ainda retém 50 %

da sua actividade inicial. A diminuição exponencial é seguida pela equação de

desactivação:

(

)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Act

ivid

ade

En

zim

átic

a

( µ

M o

-np

.min

-1)

Nº Reutilização

Page 29: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

76

A constante de desactivação é de 1,15h e o tempo de meia-vida da β-

galactosidade imobilizada em alginato de cálcio foi de 0,60h.

A perda de actividade pode dever-se à inibição da enzima imobilizada pela

galactose formada no meio, logo no primeiro ensaio, perdendo a sua

capacidade de conversão e demostrando uma redução abrupta da actividade

durante o segundo ensaio.

Outra causa da diminuição da actividade é a perda de enzima que ocorre ao

longo da primeira reacção e que pode ser comprovada pelo ensaio de

doseamento de proteínas através do método de Bradford, onde se obteve o

resultado de 0,0020 mg/mL. Este valor é bastante significativo uma vez que

pequenos volumes da enzima Lactozym® 2600L apresentam valores de

actividade muito elevados.

Gráfico 27. Actividade residual da enzima imobilizada em alginato de cálcio (2%) em cada

reutilização.

0

20

40

60

80

100

120

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Act

ivid

ade

Re

sid

ual

(%)

Nº Reutilização

Page 30: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

77

3.4. Comparação da β-galactosidase livre, imibond galactosidase

SPRIN® e enzima imobilizada em alginato de cálcio

Neste ponto, será realizada uma análise comparativa entre as três

preparações enzimáticas.

Tanto nos ensaios com a enzima livre como nos ensaios com a enzima

imobilizada em alginato, a concentração mais elevada de substrato inicial

favoreceu a reacção. Apenas nos ensaios com a enzima SPRIN®, a reacção foi

favorecida pela segunda concentração mais elevada de substrato inicial.

Através dos valores de KM e de Vmáx obtidos para cada enzima e que são

resumidos na tabela 6, conclui-se que a enzima livre é a que tem uma maior

afinidade para o substrato, seguida pela enzima imobilizada em alginato. A

enzima SPRIN® é a que tem menor KM, ou seja, demostrou uma maior afinidade

para o substrato, com o Vmáx desta enzima a ser o segundo mais elevado,

apresentando um valor de 20,5 mM.min-1 quando comparado com o Vmáx obtido

para a enzima livre, 30,20 mM.min-1.

Tabela 6. Constantes cinéticas

Nos ensaios realizados a diferentes temperaturas foram obtidos resultados

bastante diferentes, tendo a enzima livre demostrado valores mais elevados de

actividade a 20 °C, não tendo demostrado praticamente actividade a

Enzima KM (mM) Vmáx (mM.min-1) kcat

(M/min.mg)

Kcat/KM

(mM/min mg)

Livre 5,27 30,20 32,83 0,0062

SPRIN® 2,66 20,5 2,05 0,800

Imobilizada em

alginato

3,66 7,07 0,176 0,218

Page 31: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

78

temperaturas superiores a 50 °C, notando-se um decréscimo significativo

(> 88%) na actividade a temperaturas superiores a 40 °C. Nos ensaios de

temperatura realizados com a enzima SPRIN®, obtiveram-se resultados bastante

semelhantes a todas as temperaturas, com particular destaque para a

temperatura de 30 °C, que, tal como nos ensaios com a enzima imobilizada em

alginato, foi a temperatura que demonstrou valores mais elevados de

actividade.

Nos ensaios de reutilização, onde se pretendeu testar a estabilidade

operacional dos suportes de imobilização no processo com reutilizações

sucessivas, e, comparando os dois suportes de imobilização, conclui-se que o

suporte utilizado na imobilização da enzima SPRIN® não só é mais estável como

permite um maior número de reutilizações, tendo sido efectuadas quinze

reutilizações de uma hora cada. Verificou-se apenas um decréscimo de

actividade após a 11 ª reutilização, ou seja, após a 11ª hora de ensaio em

contínuo. Já a enzima imobilizada em alginato, demonstrou menor estabilidade

operacional e menores valores de actividade, tendo-se verificado um

decréscimo de actividade após o primeiro ensaio de três horas. Apenas se

conseguiu obter valores de conversão de substrato até à sexta hora de ensaio,

ou seja, até ao final da segunda reutilização.

3.5. Ensaios de Bioconversão na Matriz Alimentar: Leite

O leite é um alimento extremamente rico a nível nutricional. No entanto, o

facto de possuir lactose como o seu principal hidrato de carbono torna o seu

consumo impossível para uma percentagem da população que sofre de

intolerância à lactose, uma vez que estes indivíduos possuem deficiência na

enzima que catalisa a hidrólise da lactose, a lactase ou β-galactosidase. É então,

imprescindível, estudar técnicas que permitam a hidrólise da lactose nos seus

Page 32: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

79

monossacáridos, glucose e galactose, sem prejuízo do restante aporte

nutricional que poderá ser fornecido pelo leite.

Neste estudo, testou-se leite gordo, meio-gordo e magro, UHT, da marca

MIMOSA, disponível na maioria dos estabelecimentos comerciais de venda de

produtos alimentares.

Em primeiro lugar testou-se as concentrações de glucose existentes nos três

tipos de leite, sendo que os valores existentes de lactose são de 4,7 % para o

leite de vaca UHT gordo e de 4,9 % para os leites de vaca UHT meio-gordo e

magro.

Tabela 7. Teores de hidratos de carbono e lactose no leite (5) e valores de glucose doseados em

amostras de leite durante os ensaios.

Hidratos de

Carbono totais (5)

(%)

Lactose(5)

(%) Glucose (g/mL)

Leite Gordo 4,7 4,7 20

Leite Meio-Gordo 4,9 4,9 20

Leite Magro 4,9 4,9 20

De acordo com a fonte de onde foram retirados os valores de hidratos de

carbono totais e de lactose existentes no leite, podemos afirmar que todos os

hidratos de carbono existentes em qualquer um dos três tipos de leite

correspondem aos valores de lactose no leite e que, os valores de glucose

encontrados não são significativos.

Depois, foram realizados ensaios de bioconversão da lactose no leite

utilizando-se as três formas enzimáticas utilizadas em ensaios anteriores:

Lactozym®2600L, imibond galactosidase SPRIN® e as esferas em alginato de

cálcio contendo enzima imobilizada. Os ensaios foram realizados a duas

temperaturas, 20 e 37°C. Aqui são apresentados os resultados apenas da

Page 33: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

80

amostra de leite meio gordo uma vez que as diferenças de valores não se

mostraram relevantes.

Os resultados encontram-se sumariados na tabela 7.

Tabela 8. Valores de actividade enzimática das diferentes enzimas a 20 e a 37 °C ; e valores de glucose

das amostras de leite aos 180 minutos de ensaio a 20 e a 37 °C

Actividade enzimática

(g/mL.min-1)

Concentração de Glucose (mg/mL) aos 180 minutos de ensaio

-galactosidase 20 ° C 37 °C 20 ° C 37 °C

Livre 0,647 2,08 0,404 0,458

SPRIN® 0,179 0,36 0,166 0,201

Alginato de cálcio 0,718 0,44 0,281 0,324

A actividade enzimática foi superior para a enzima livre, seguindo-se a

enzima imobilizada em alginato e por último a enzima SPRIN®. Tanto a enzima

livre como a enzima da SPRIN® demonstram níveis mais elevados de actividade

a 37 °C. Pelo contrário, as esferas de alginato com enzima imobilizada

demostraram maior actividade a 20 °C. Estes valores de actividade relacionados

com a temperatura contrariam os valores obtidos com o substrato padrão, o-

npg, nos ensaios realizados anteriormente, em que a tanto a enzima imobilizada

em alginato de cálcio como a enzima livre possuíam temperaturas óptimas de

actuação aos 37 e 20 °C, respectivamente.

Quanto aos valores de glucose, os valores mais elevados de concentração

de glucose foram obtidos no final do ensaio a 37 °C com a enzima livre e foram

de 0,458 mg/mL. O valor mais baixo de concentração de glucose foi de 0,166

mg/mL e foi no ensaio com a enzima da SPRIN®. Através da estequiometria da

reacção de conversão da lactose em glucose, percebe-se que, em qualquer um

dos casos, apenas uma pequena quantidade da lactose que se encontra no leite

foi hidrolisada e que a reacção de conversão se dá de um modo muito lento,

não tendo sido possível observar a total hidrólise da lactose nos ensaios de 180

minutos realizados.

Page 34: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

81

Os valores de lactose reais das amostras de leite em estudo não foram

possíveis de calcular uma vez que o seu doseamento deveria ser realizado por

HPLC com um detector de índice de refracção (45) e tal equipamento não estava

disponível. Daí que os valores apresentados e que servem de termo de

comparação para este ensaio tenham que ser os valores disponíveis em

literatura.

3.5.1. Optimização da bioconversão em leite pela Metodologia das Superfícies

de Resposta

A metodologia das superfícies de resposta (RSM) com um design baseado

num ponto central (CCRD) foi realizada fazendo variar três variáveis

independentes, concentração de imibond galactosidase SPRIN®, temperatura e

tempo, em leite. Foram efectuadas e réplicas do ponto central e uma análise

para os outros pontos, num total de 16 pontos, em 16 experiências. O efeito das

três variáveis foi avaliado na bioconversão da lactose e ajustaram-se os

resultados a uma função polinomial quadrática de segunda ordem.

A quantificação da glucose resultante da referida bioconversão foi realizada

com recurso ao kit da glucose/oxidase.

Inicialmente, os termos da equação polinomial quadrática gerada, foram

analisados pelo teste de F (ANOVA), e foram avaliados os termos

estatisticamente significativos (p <0,05). Esses termos significativos estão

identificados com o símbolo * na tabela 9 Verifica-se que a concentração de

imibond galactosidase SPRIN® (termos linear e quadrático) e o tempo de

reacção (termos linear e quadrático) têm efeitos significativos na bioconversão

de lactose em glucose, no leite (Tabela 9).

Page 35: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

82

Tabela 9. Efeito da concentração de imibond galactosidase SPRIN®, da temperatura e do

tempo na bioconversão da lactose em glucose no leite.

Variável [Glucose] (mg/mL)

[β-Galactosidase] (termo linear) 0,258***

[β -Galactosidase] (termo quadrático) 0,115*

Temperatura (termo linear) -0,026

Temperatura (termo quadrático) -0,031

Tempo (termo linear) -0,140*

Tempo (termo quadrático) 0,691***

[β -Galactosidase] x Temperatura -0,056

[β -Galactosidase] x Tempo -0,055

Temperatura x Tempo - 0,019 *P < 0.05;

**P < 0.01;

***P < 0.001

A bioconversão da lactose em glucose pela enzima imibond galactosidase

SPRIN®, como função da temperatura e do tempo, no leite é representada por

uma superfície em forma de sela (Gráfico 28) verificando-se uma interacção

negativa (não significativa) entre a temperatura e o tempo (Tabela 9). A

avaliação do gráfico da superfície de resposta ajustada à formação de glucose

permite identificar as regiões óptimas dentro da gama experimental. Verifica-se

que se consegue uma actividade mais elevada ao seleccionar tempos de reacção

até aos 10 min, na gama de temperaturas entre 16 e 44 °C, com uma

concentração imibond galactosidase SPRIN® de 8 mg/mL.

Page 36: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

83

Gráfico 28. Superfície de resposta ajustada à formação de glucose como função da temperatura e do

tempo em leite, com uma concentração de imibond galactosidase SPRIN® de 8 mg/mL.

Relativamente ao efeito da concentração de imibond galactosidase

SPRIN® e do tempo na bioconversão de lactose (Gráfico 29) verifica-se que se a

formação de glucose é favorecida a concentrações de enzima elevadas, mas nos

> 0,9

< 0,9

< 0,8

< 0,7

< 0,6

< 0,5

< 0,4

< 0,3

> 0,9

< 0,9

< 0,8

< 0,7

< 0,6

< 0,5

< 0,4

< 0,3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Tempo (min)

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

42

44

Tem

per

atu

ra (

ºC)

Page 37: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

84

primeiros minutos da reacção, provavelmente devido ao efeito inibitório da

galactose. Este facto confirma-se pela interacção negativa verificada entre as

variáveis [β-Galactosidase] x Tempo (Tabela 9).

Gráfico 29. Superfície de resposta ajustada à formação de glucose como função do tempo e da

concentração de imibond galactosidase SPRIN® em leite, à temperatura de 30 °C.

> 1,2

< 1,2

< 1

< 0,8

< 0,6

< 0,4

> 1,2

< 1,2

< 1

< 0,8

< 0,6

< 0,4 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Tempo (min)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

[-G

alac

tosi

das

e]

(mg/

mL)

Page 38: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

85

A avaliação do gráfico 30 que relaciona a concentração de imibond

galactosidase SPRIN® com a temperatura, indica que a formação de glucose é

favorecida a concentrações mais elevadas de β-galactosidase e temperaturas

mais baixas. De facto a interacção negativa entre estes dois parâmetros

permite verificar que actividades superiores são obtidas quando a

concentração de enzima é levada e a temperatura mais baixa (Tabela 9).

As superfícies de resposta traduzem-se por polinómios de segunda

ordem, em função da concentração de imibond galactosidase SPRIN®, da

temperatura e do tempo (Tabela 10). Na génese destes modelos

consideraram-se os efeitos significativos (p<0,05) e os que apresentaram um

intervalo de confiança inferior ao efeito ou ao desvio padrão. Estes efeitos

apesar de terem uma menor probabilidade de virem a ocorrer, os valores não

são suficientemente baixos para que possam ser desprezados.

A função polinomial obtida para a descrição da superfície de reposta, da

formação de glucose a partir de lactose em função da concentração de

imibond galactosidase SPRIN®, da temperatura e do tempo, apresentou

elevados valores de R2 e R2ajustado, indicativo de um bom ajuste do modelo

quadrático aos resultados experimentais. Ambos os valores de R2 e R2ajustado,

das funções encontradas revelam uma aproximação entre os resultados

experimentais e os valores teóricos previstos pelos modelos.

Ao efectuar-se o cálculo do máximo da formação de glucose (0,23

mg/mL) resultante da bioconversão de lactose no leite, ocorre a uma

temperatura de 33 ºC, uma concentração de imibond galactosidase SPRIN®

de 4 mg/mL, durante 28 min.

Page 39: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

86

Gráfico 30. Superfície de resposta ajustada à formação de glucose como função da temperatura e da

concentração de imibond galactosidase SPRIN® em leite, ao fim de 30 min.

> 0,8 < 0,8 < 0,7 < 0,6 < 0,5 < 0,4 < 0,3 < 0,2

> 0,8

< 0,8

< 0,7

< 0,6

< 0,5

< 0,4

< 0,3

< 0,2 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44

Temperatura (ºC)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

[-G

ala

cto

sid

as

e]

(mg

/mL

)

Page 40: 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO · O 49 enzimática. Nestes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato padrão, o-npg, de 15 mM e os ensaios foram realizados a 37 °C.Através

RES

ULT

AD

OS

E D

ISC

USS

ÃO

87

Tabela 10. Equações dos modelos das superfícies de resposta, ajustados aos resultados experimentais

obtidos em leite na bioconversão da lactose em glucose (mg/mL) por acção da imibond galactosidase

SPRIN® [Gal] em função da concentração de enzima (mg/mL), da temperatura (T) (°C) e do tempo (t)

(min) e respectivos R2 e R

2ajustado

Equações do modelo R2 R2ajustado

[Glucose] = 0,435 + 3,6*10-3 [Gal]2 - 3,5*10-3 [Gal] + 3,17*10-4 T2 –

-2,7*10-2T + 8,54*10-4t2 - 4,67*10-2t - 1,01*10-3 (Gal*T)+

+ 3,41*10-4 (Galxt) - 6,7*10-5 (Txt)

0,975 0,930