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APLICAÇÃOO ensaio Fungitell® é um ensaio colorimétrico à base de zimogénio de protease para a deteção qualitativa de (1→3)-β-D-glucano no soro de doentes com sintomas de infeção fúngica invasiva ou com condições clínicas que predisponham os doentes a tal infeção. A concentração sérica de (1→3)-β-D-glucano, um importante componente da parede celular de vários fungos importantes do ponto de vista médico1, pode ser utilizada como auxiliar no diagnóstico de micoses profundas e de fungemias2. Um resultado positivo não indica o género do fungo que pode estar a causar a infeção.

As titulações de (1→3)-β-D-glucano devem ser utilizadas em conjunto com outros procedimentos de diagnóstico, como cultura microbiológica, exame histológico de amostras de biopsia e exame radiológico.

IMPORTANTE Forneça estas informações ao médico que solicita o teste: Alguns fungos, como os pertencentes ao género Cryptococcus, produzem níveis de (1→3)-β-D-glucano muito baixos que poderão não produzir um nível de (1→3)-β-D-glucano sérico suficientemente elevado para ser detetado pelo ensaio3,4. Também se observou que infeções por fungos da ordem Mucorales, como Absidia, Mucor e Rhizopus1,4, paras os quais não se conhece atividade de produção de (1→3)-β-D-glucano, produzem titulações de (1→3)-β-D-glucano séricas muito baixas. Além disso, a fase de levedura de Blastomyces dermatitidis produz pouco (1→3)-β-D-glucano e poderá não ser detetada pelo ensaio5.

Inclua esta declaração ao apresentar os resultados de teste do ensaio Fungitell®.

RESUMO E EXPLICAÇÃOExiste uma incidência crescente de infeções fúngicas por agentes patogénicos oportunistas, sobretudo em doentes imunocomprometidos6,7,8. As doenças fúngicas invasivas, como infeções oportunistas, são frequentes em tumores malignos hematológicos e em doentes com SIDA e correspondem a um número crescente de infeções nosocomiais, sobretudo em doentes transplantados e outros doentes medicados com tratamentos imunossupressores9,10. Muitas doenças fúngicas são adquiridas por inalação dos esporos fúngicos do solo, detritos de plantas, sistemas de gestão do ar e/ou superfícies expostas. Alguns fungos oportunistas estão presentes no interior da pele ou à sua superfície, no trato intestinal e nas membranas mucosas11,12. O diagnóstico de micoses e fungemias invasivas baseia-se normalmente em técnicas de diagnóstico ou radiológicas não específicas. Recentemente, foram adicionados marcadores biológicos de infeção fúngica a métodos de diagnóstico disponíveis2.

Os agentes patogénicos fúngicos oportunistas incluem Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Acremonium spp., Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, Exserohilum rostratum e Pneumocystis jirovecii. O (1→3)-β-D-glucano produzido por estes e por outros organismos pode ser detetado pelo ensaio Fungitell®1,8,13,14.

PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTOO ensaio Fungitell® mede o (1→3)-β-D-glucano. O ensaio baseia-se numa modificação da via do lisado de amebócitos de Limulus (LAL)15,16,17,18, Figura 1. O reagente Fungitell® é modificado para eliminar a reatividade de endotoxinas bacterianas e reagir apenas ao (1→3)-β-D-glucano através do lado da via mediado pelo fator G. O (1→3)-β-D-glucano ativa o fator G, um zimogénio da serina protease. O fator G ativado converte a enzima de pré-coagulação inativa na enzima de coagulação ativa, que, por sua vez, cliva a paranitroanilida (pNA) a partir do substrato peptídico cromogénico, Boc-Leu-Gli-Arg-pNA, criando um cromóforo, a paranitroanilina, com absorção a 405 nm. O ensaio cinético Fungitell®, descrito abaixo, baseia-se na determinação do aumento da taxa de densidade ótica produzida por uma amostra. Esta taxa é interpretada por comparação com uma curva padrão de modo a produzir estimativas da concentração de (1→3)-β-D-glucano na amostra.

MATERIAIS FORNECIDOS COM O KIT FUNGITELL®

O kit Fungitell® destina-se à utilização em diagnóstico in vitro. Os seguintes materiais fornecidos com cada kit são suficientes para ensaios em 110 micropoços em duas placas de microtitulação (55 micropoços cada):

1. reagente Fungitell®, um LAL específico do (1→3)-β-D-glucano liofilizado (dois frascos);

2. tampão de reconstituição Pyrosol® (dois frascos). Frascos adicionais de tampão de reconstituição Pyrosol® (número de catálogo BC051) podem ser adquiridos em separado;

3. padrão do glucano, com o teor em (1→3)-β-D-glucano indicado no rótulo (dois frascos);

4. água grau de reagente (dois frascos);

5. solução de pré-tratamento alcalina (dois frascos).

Todos os anteriores, com exceção do padrão, não contêm níveis interferentes de (1→3)-β-D-glucano.

MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOSNenhum material pode conter glucano interferente. Os utensílios de vidro têm de ser despirogenados por calor seco durante pelo menos 7 horas a uma temperatura mínima de 235 °C (ou um equivalente validado) para serem considerados adequados para a utilização.

1. pontas de pipetas* (250 μl - n.º ref. PPT25, 1000 μl - n.º ref. PPT10);

2. pipetas com capacidade para administração de volumes de 5 μl-25 μl e 100 μl-1000 μl;

3. pipeta de repetição com pontas de seringa com 100 μl de capacidade;

4. tubos de ensaio* para a preparação da série de padrões (curva de calibração) e combinação de reagentes de tratamento de soro. (12 mm x 75 mm - n.º ref. TB240 ou 13 mm x 100 mm - n.º ref. TB013);

5. leitor de placa de incubação (37 °C) com capacidade de leitura a 405 nm (de preferência capaz de monitorizar dois comprimentos de onda, a 405 nm e a 490 nm) com um intervalo dinâmico de, pelo menos, 2,0 unidades de absorvância, juntamente com software de ensaio cinético informatizado adequado;

6. tubos de conservação com tampa de rosca, estéreis e sem glucano para distribuição de alíquotas das amostras (a maioria dos tubos que são certificados como não contendo RNAse, DNAse e sendo apirogénicos não contêm níveis interferentes de (1→3)-β-D-glucano);

7. Parafilm®;

8. microplacas com 96 micropoços.*

* Estes produtos, fornecidos pela Associates of Cape Cod, Inc. (ACC), são certificados como não contendo níveis de glucanos interferentes.

Cuidado — as pipetas de vidro com tampões de algodão e as pontas de micropipetas com filtros de celulose são potenciais fontes de contaminação com glucano.

ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕESEste produto destina-se À UTILIZAÇÃO EM DIAGNÓSTICO IN VITRO.

O ensaio Fungitell® exige uma atenção rigorosa à técnica e ao ambiente de teste. A formação completa do técnico no método de ensaio e em formas de evitar a contaminação são fundamentais para a eficácia do ensaio.

1. Certas espécies fúngicas produzem níveis muito baixos de (1→3)-β-D-glucano e não são habitualmente detetadas pelo ensaio Fungitell®. Incluem o género Cryptococcus3,4 e também fungos da ordem Mucorales, como Absidia, Mucor e Rhizopus1,4. Além disso, o Blastomyces dermatitidis, na sua forma de levedura, produz baixos níveis de (1→3)-β-D-glucano, pelo que não é normalmente detetado pelo ensaio Fungitell®5.

2. Não pipete qualquer material com a boca. Não fume, não coma nem beba nas áreas de manuseamento de espécimes ou reagentes do kit. Cumpra os regulamentos de segurança da empresa e locais.

3. Prepare um ambiente limpo onde realizar o ensaio. Utilize materiais e reagentes que tenham certificação como não contendo níveis de fundo de (1→3)-β-D-glucano detetáveis. Tenha em atenção que o glucano, bem como a contaminação fúngica do corpo humano, vestuário, recipientes, água e poeiras aéreas podem interferir com o ensaio Fungitell®. Os materiais de celulose, como gaze, toalhetes e cartão, podem contribuir com (1→3)-β-D-glucano para o ambiente onde o ensaio vai ser realizado.

4. Não utilize reagentes após o fim do prazo de validade.

5. Amostras descoradas ou turvas, tais como amostras muito hemolisadas ou lipémicas ou com bilirrubina excessiva podem originar interferência ótica com o ensaio. Caso tais amostras sejam testadas, os resultados dos testes devem ser examinados para evidências de interferência ótica e/ou padrões cinéticos invulgares.

6. Use vestuário protetor adequado e luvas sem pó quando manusear os espécimes do doente.

7. O soro de doentes sujeitos a hemodiálise pode conter níveis elevados de (1→3)-β-D-glucano quando são utilizadas determinadas membranas de diálise em celulose19,20,38. A hemodiálise com membranas de triacetato de celulose, de polissulfona ou de polimetilmetacrilato não parecem interferir com o ensaio.

8. Gazes e compressas cirúrgicas podem eliminar níveis elevados de (1→3)-β-D-glucano que podem contribuir para um resultado positivo transitório no ensaio Fungitell®, causado por contaminação, tal como foi observado em doentes pós-cirúrgicos21,22.

9. Produtos de fracionamento do sangue, como imunoglobulina e albumina intravenosas, também podem conter (1→3)-β-D-glucano que, se injetado ou perfundido, aumentará as titulações séricas de (1→3)-β-D-glucano durante vários dias23.

10. Não utilizar os kits com conteúdo danificado.

11. Os materiais expostos a fluidos potencialmente contaminados (contendo agentes patogénicos) têm de ser eliminados de forma consistente com os regulamentos locais.

CONSERVAÇÃO DOS REAGENTESConserve todos os reagentes, tal como fornecidos, a uma temperatura de 2 °C-8 °C ao abrigo da luz. O reagente Fungitell® reconstituído deve ser conservado a uma temperatura de 2 °C-8 °C e utilizado dentro de 2 horas. Em alternativa, o reagente Fungitell® reconstituído pode ser congelado a -20 °C durante até 20 dias, descongelado uma vez e utilizado.

MANUSEAMENTO DE ESPÉCIMES1. Colheita de espécimes: As amostras de sangue podem ser colhidas em tubos de preparação de soro

ou em tubos de separação de soro estéreis para a preparação do soro.

2. Conservação dos espécimes: As amostras de soro podem ser conservadas temporariamente a 2 °C-8 °C antes do ensaio ou congeladas a uma temperatura inferior ou igual a -20 °C em caso de conservação prolongada.

3. Identificação dos espécimes: Os espécimes devem ser identificados de forma clara de acordo com práticas aprovadas pela instituição.

PROCEDIMENTONota: as definições podem variar com diferentes instrumentos e software. Em geral, aplicam-se as seguintes: Coloque o software do leitor de placas para a recolha de dados no modo vmean. Consulte as definições adequadas no manual do software para assegurar que o valor calculado é a taxa média da alteração da densidade ótica de todos os pontos de dados reunidos. Coloque o intervalo de leitura do detetor no mínimo permitido pelo software/instrumento durante o período de 40 minutos do teste. As definições do comprimento de onda do software devem ser de 405 nm menos o fundo a 490 nm. Se a leitura de duplo comprimento de onda não estiver disponível, leia o teste a 405 nm. A temperatura de incubação deve ser definida em 37 °C. A mistura/agitação da placa deve ser definida para 5 a 10 segundos antes do início da leitura. Selecione a definição de ajuste da curva para “linear/linear” ou equivalente. A leitura deve começar sem qualquer atraso.

1. Preparação do padrão de glucano fornecido no kit.a. Dissolva um frasco do padrão de glucano com o volume de água grau de reagente indicado no

frasco para fazer uma solução de 100 pg/ml. Misture no agitador de vórtex pelo menos 30 segundos em velocidade média a média-alta para reconstituir o padrão (solução 1). A solução de glucano deve ser conservada a 2 °C-8 °C e utilizada dentro de três dias. Os passos “b” a “e” abaixo ilustram um exemplo de um esquema de preparação de uma curva padrão.

b. Prepare um padrão de 50 pg/ml (solução 2), misturando 500 μl de água grau de reagente com 500 μl da solução 1 num tubo sem glucano (solução 2). Misture no agitador de vórtex durante pelo menos 10 segundos.

c. Prepare um padrão de 25 pg/ml (solução 3), misturando 500 μl de água grau de reagente com 500 μl da solução 2 num tubo sem glucano (solução 3). Misture no agitador de vórtex durante pelo menos 10 segundos.

d. Prepare um padrão de 12,5 pg/ml (solução 4), misturando 500 μl de água grau de reagente com 500 μl da solução 3 num tubo sem glucano (solução 4). Misture no agitador de vórtex durante pelo menos 10 segundos.

e. Prepare um padrão de 6,25 pg/ml (solução 5), misturando 500 μl de água grau de reagente com 500 μl da solução 4 num tubo sem glucano (solução 5). Misture no agitador de vórtex durante pelo menos 10 segundos.

2. Abra a solução de pré-tratamento alcalina. A solução de pré-tratamento de soro alcalina converte os glucanos de tripla hélice em glucanos de hélice única17,18, que são mais reativos no ensaio. Além disso, o pH alcalino serve para inativar as proteases e inibidores séricos que podem interferir com o ensaio24.

Elimine o frasco (de acordo com os procedimentos laboratoriais) exceto se for utilizá-lo num teste a seguir, caso em que deverá tapá-lo com Parafilm, utilizando o lado do Parafilm que estava virado para o revestimento de papel.

3. Introduza as concentrações padrão nas definições do software como 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml e 31 pg/ml, respetivamente. Tenha em atenção que as concentrações padrão introduzidas são cinco vezes superiores às preparadas no ponto n.º 1. acima. Isto deve-se ao facto de o volume do padrão utilizado no ensaio ser de 25 μl por micropoço, o que corresponde a cinco vezes o volume da amostra de soro utilizada (ver ponto 4.b. abaixo). Configure a disposição da placa de microtitulação no software com os padrões (St), os controlos negativos (Neg) e 21 amostras desconhecidas (Uk) cada uma analisada em duplicado, tal como se segue:Nota 1: os micropoços externos podem ser utilizados caso se tenha demonstrado que o desempenho destes micropoços é semelhante ao dos micropoços internos.Nota 2: para evitar a contaminação acidental, volte a colocar a tampa na microplaca depois de adicionar as amostras e os reagentes aos micropoços. Retire a tampa antes de a colocar no leitor para evitar interferência ótica proveniente de condensação.Nota 3: o controlo negativo não se destina a ser utilizado na curva padrão.

4. Adição de soro e de reagente pré-tratamento.a. Descongele as amostras de soro congeladas à temperatura ambiente. Misture bem todas as

amostras no agitador de vórtex durante pelo menos 30 segundos em velocidade média a média-alta.

b. Transfira 5 μl da amostra de soro para cada um dos micropoços designados (Uk) pelo menos em duplicado. Repita para cada amostra de soro.

c. Adicione 20 μl do reagente de pré-tratamento de soro a cada micropoço que contenha soro. Certifique-se de que as gotículas do soro e do reagente de pré-tratamento entram em contacto.Nota: os passos “b” e “c” podem ser realizados por ordem inversa segundo a preferência do técnico.

d. Agite a placa durante 5 a 10 segundos para misturar o conteúdo do micropoço (poderá utilizar a função de agitação de placa do leitor) e, em seguida, incube durante 10 minutos a 37 °C no leitor da placa de incubação.

5. Reconstituição do reagente Fungitell®. Nota: poderá ser feito de forma cómoda enquanto a incubação do reagente de pré-tratamento decorre. A consistência do momento da reconstituição melhorará a reprodutibilidade, uma vez que a reação do ensaio Fungitell® começa após a reconstituição, apesar de num nível baixo.a. Reconstitua um frasco de reagente Fungitell®, adicionando 2,8 ml de água grau de reagente e,

em seguida 2,8 ml de tampão de reconstituição Pyrosol com a pipeta de 1000 μl. Tape o frasco com Parafilm utilizando o lado do Parafilm que estava virado para o revestimento de papel. Rode o frasco suavemente para dissolver na totalidade — não misture no agitador de vórtex.

6. Adição de controlos negativos e padrões de glucano. No fim da incubação do reagente de pré-tratamento de soro (passo 3. d), retire a placa do leitor da placa de incubação e adicione os padrões e os controlos negativos à placa. Modelo de concentração de padrões recomendado:a. Adicione 25 μl de água grau de reagente aos micropoços G2 e G3.b. Adicione 25 μl da solução padrão 5 de 6,25 pg/ml aos micropoços F2 e F3.c. Adicione 25 μl da solução padrão 4 de 12,5 pg/ml aos micropoços E2 e E3.d. Adicione 25 μl da solução padrão 3 de 25 pg/ml aos micropoços D2 e D3.e. Adicione 25 μl da solução padrão 2 de 50 pg/ml aos micropoços C2 e C3.f. Adicione 25 μl da solução padrão 1 de 100 pg/ml aos micropoços B2 e B3.

7. Procedimento de adição do reagente Fungitell® e incubação da placa.a. Adicione 100 μl do reagente Fungitell® a cada micropoço (contendo os controlos negativos, os

padrões e as amostras) com uma pipeta de repetição (faseada).b. Insira a placa no leitor de microplaca (à temperatura de 37 °C) com a tampa colocada. Nota:

deixe a tampa fora se o leitor de placa não tiver uma opção de pausa antes da leitura e agite durante 5 a 10 segundos. Leia a placa sem a tampa a 405 nm menos 490 nm, durante 40 minutos a 37 °C. Se a subtração do fundo (a 490 nm) não estiver disponível, é aceitável fazer a leitura a 405 nm. Se o leitor de placa não tiver uma função de agitação da placa disponível, poderá utilizar-se um agitador de microplaca externo.

c. Recolha os dados e analise-os da seguinte forma: Examine os gráficos da densidade ótica das amostras de teste e verifique se existem padrões cinéticos além de um aumento uniforme comparável ao dos padrões. Invalide os gráficos que indiquem interferência ótica (p. ex., os perfis cinéticos não seguem os dos padrões). Calcule a taxa média de alteração da densidade ótica (unidades de miliabsorvância por minuto) para todos os pontos entre 0 e 40 minutos (efetuado pelo software). Proceda à interpolação das concentrações de (1→3)-β-D-glucano da amostra a partir da curva padrão (efetuado pelo software).

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOSOs resultados do teste Fungitell® devem ser utilizados como auxiliares no diagnóstico de infeção fúngica invasiva. Os resultados são expressos em pg/ml de soro e variam desde não detetáveis (< 31 pg/ml) a > 500 pg/ml, e são impressos pelo software ou lidos a partir da curva padrão. Para valores exatos acima de 500 pg/ml, é necessário diluir a amostra com água grau de reagente e voltar a testá-la.

O laboratório que está a realizar o teste deve informar o médico que pediu o teste de que nem todas as infeções fúngicas produzem níveis elevados de (1→3)-β-D-glucano no soro. Alguns fungos, como os do género Cryptococcus3,4, produzem níveis muito baixos de (1→3)-β-D-glucano. Não se conhece atividade de produção de (1→3)-β-D-glucano pelos fungos da ordem Mucorales, como Absidia, Mucor e Rhizopus1,4. De igual modo, o Blastomyces dermatitidis, na sua fase de levedura, produz pouco (1→3)-β-D-glucano, tendo os doentes com blastomicose normalmente níveis indetetáveis de (1→3)-β-D-glucano no ensaio Fungitell®5.

RESULTADO NEGATIVOValores de (1→3)-β-D-glucano < 60 pg/ml são interpretados como resultados negativos.

RESULTADO INDETERMINADOValores de 60 pg/ml a 79 pg/ml sugerem uma possível infeção fúngica. Recomenda-se a colheita e teste de soro adicionais. A colheita e o teste de amostras frequentes aumentam a utilidade do diagnóstico.

RESULTADO POSITIVOValores ≥ 80 pg/ml são interpretados como positivos. Um resultado positivo significa que foi detetado (1→3)-β-D-glucano. Um resultado positivo não define a presença de doença e deve ser utilizado em conjunto com outros resultados clínicos para se estabelecer um diagnóstico.

CONTROLO DE QUALIDADE• O coeficiente de correlação (r) da curva padrão (linear vs. linear) deve ser ≥ 0,980.• Os micropoços com 25 μl de água grau de reagente são os controlos negativos. Os controlos

negativos devem ter valores de taxa da densidade ótica (unidades de miliabsorvância por minuto) inferiores a menos de 50% do padrão mais baixo. Se não for o caso, o ensaio deve ser repetido utilizando novos reagentes (todos).

• Gestão de amostras com problemas. Se um analista observar uma cinética de densidade ótica invulgar num teste de uma amostra opaca, descorada ou turva (como amostras muito hemolisadas, lipémicas ou com bilirrubina excessiva), a amostra tem de ser diluída com água grau de reagente e ser novamente testada. Na apresentação dos resultados, é necessário ter a diluição em consideração, multiplicando o resultado pelo fator de diluição. Tipicamente, o fator de diluição é introduzido na configuração do software para a amostra e a correção é automaticamente aplicada.

• Amostras de controlo, em níveis de “cut-off” e positivas altas podem ser analisadas para confirmar se os reagentes e o ensaio estão a ter um desempenho correto. Cada utilizador do teste deve estabelecer um programa de controlo de qualidade para assegurar a proficiência no desempenho do teste de acordo com os regulamentos aplicáveis à sua localização.

LIMITAÇÕES DO TESTE 1. As localizações da infeção fúngica nos tecidos10, a encapsulação e a quantidade de (1→3)-β-D-

glucano produzido por determinados fungos podem afetar a concentração deste analito no soro. A capacidade reduzida de contribuição com (1→3)-β-D-glucano para a corrente sanguínea pode reduzir a capacidade de detetar certas infeções fúngicas. O Cryptococcus spp. produz baixos níveis de (1→3)-β-D-glucano3,4. Não se conhece atividade de produção de (1→3)-β-D-glucano dos fungos da ordem Mucorales, incluindo Absidia spp., Mucor spp. e Rhizopus spp.1,4. O Blastomyces

ENSAIO

29 de março de 2018PN001268-pt Rev6

Instruções de utilização

Ensaio para (13)-β-D-glucano no soro

42

Telefone: +1 (508) 540-3444Linha gratuita: +1 (888) 395-2221Fax: +1 (508) 540-8680Assistência Técnica: +1 (800) 848-3248Apoio ao Cliente: +1 (800) 525-8378

FIGURA 1Via do lisado de amebócitos de Limulus

Endotoxina (LPS)

Enzima da coagulação

(1→3)-β-D-glucanoFator C ativado

Fator B

Fator C

Fator B ativado

Enzima da pró-coagulação

Fator G ativado Fator G

Boc-Leu-Gli-Arg-pNA(substrato artificial)

Boc-Leu-Gli-Arg + pNA

Via inativada

dermatitidis, na sua fase de levedura, produz pouco (1→3)-β-D-glucano e os resultados dos testes são geralmente negativos5.

2. Alguns indivíduos têm níveis elevados de (1→3)-β-D-glucano que se situam na zona indeterminada. Nestes casos, recomenda-se um teste de vigilância adicional.

3. A frequência dos testes do doente dependerá do risco relativo de infeção fúngica. Recomendam-se taxas de colheita de amostras de pelo menos duas a três vezes por semana nos doentes em risco.

4. Encontraram-se resultados positivos em doentes hemodialisados19,20, participantes tratados com derivados do sangue fracionados, como albumina e imunoglobulinas séricas25, e em espécimes ou participantes expostos a gaze e compressas cirúrgicas que contenham glucano. Após a exposição cirúrgica a compressas e gazes com (1→3)-β-D-glucano, os doentes necessitam de 3 a 4 dias para a reposição dos níveis de (1→3)-β-D-glucano no soro iniciais21,22. De igual modo, o momento de colheita de amostras em doentes cirúrgicos deve ter este fator em consideração.

5. As amostras obtidas por métodos de picada no calcanhar ou dedo são inaceitáveis, uma vez que foi demonstrado que a compressa com álcool utilizada para preparar o local (e, potencialmente, a acumulação de sangue à superfície da pele) contamina os espécimes. Nos estudos realizados até à data, não se observaram diferenças entre as amostras obtidas por colheitas em linha ou por venopunção26,27.

6. Os níveis de teste foram estabelecidos em participantes adultos. Os níveis normais em bebés e crianças são próximos dos níveis dos adultos28. Os dados para recém-nascidos e bebés com menos de seis meses são limitados, mas sugerem que um “cut-off” mais alto para recém-nascido pode ser adequado29.

7. O intervalo do ensaio reportável é de 31 pg/ml a 500 pg/ml. Valores inferiores a 31 pg/ml são apresentados como < 31 pg/ml. Valores superiores a 500 pg/ml são apresentados como > 500 pg/ml, exceto se a amostra tiver sido diluída.

SUBSTÂNCIAS INTERFERENTESAs condições seguintes podem interferir com a exatidão de um resultado do ensaio Fungitell®:

• Hemólise• Turvação da amostra causada por lipemia• Presença de bilirrubina aparente visualmente• Soro turvo• Níveis elevados de imunoglobulina G, tais como os que podem existir no soro devido a mieloma

múltiplo, podem resultar em precipitação na mistura da reação após a adição de Fungitell® ao soro pré-tratado30.

VALORES ESPERADOSOs valores de beta-glucano estão elevados em diversas infeções fúngicas. Quando existirem sinais e sintomas no nível de 80 pg/ml ou superior, o valor preditivo de que o participante é positivo para uma infeção fúngica varia entre 74,4% e 91,7%. Na ausência de sinais e sintomas em níveis inferiores a 60 pg/ml, os valores preditivos negativos variaram de 65,1% a 85,1%.

CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHOTeste comparativoFoi realizado um estudo prospetivo multicêntrico para validar as características de desempenho do ensaio Fungitell®31. O teste foi comparado com outros métodos de deteção padrão (ou seja, hemocultura, exame histopatológico de amostra de biopsia e sinais radiológicos) de micoses e fungemias.

No ensaio, foram testados trezentos e cinquenta e nove (359) participantes. Foi obtida uma amostra única de cada participante. Os participantes de baixo risco incluíram indivíduos aparentemente saudáveis e indivíduos nos centros clínicos cujo internamento hospitalar se deve a outras razões além das infeções fúngicas. A adição de participantes foi realizada em seis centros clínicos nos Estados Unidos da América. Quatro dos centros clínicos efetuaram o ensaio e testaram um total de 285 amostras. A ACC testou todas as 359 amostras duas vezes, embora apenas o segundo conjunto de resultados tenha sido utilizado para determinar o desempenho do ensaio. Os resultados do segundo conjunto de análises não foram estatisticamente diferentes do primeiro conjunto.

A sensibilidade para toda a população de participantes (359), incluindo os doentes com criptococose, foi de 65,0% ([intervalo de confiança (IC) de 0,1%–70,0% 95%]). A especificidade foi de 81,1% (IC de 77,1%-85,2%) (Tabela 1).

Tabela 1 Resultados do teste ACC no nível de “cut-off” de 60 pg/ml–80 pg/ml por centro

Centro

Sensibilidade comprovada/comprovável >= 80 pg/ml

Especificidade< 60 pg/ml

Am

bígu

o60

<=

X <

80

Total

Pos./

Clin

. pos

.

Sens

ibili

dade

Valo

r pre

ditiv

o po

sitiv

o

Neg

./ Cl

in. n

eg.

Especificidade

Valo

r pre

ditiv

o ne

gativ

o

1 32/50 64,0 97,0 39/40 97,5 69,6 1 902 14/24 58,3 93,3 17/20 85,0 70,8 5 443 14/19 73,7 46,7 36/54 66,7 90,0 3 734 25/33 75,8 92,6 37/43 86,0 86,0 6 765 21/36 58,3 80,8 30/39 76,9 69,8 6 756 0/1 0,0 N/A 0/0 N/A 0,0 0 1

Total 106/163 65,0 80,9 159/196 81,1 76,8 21 359Quando os resultados obtidos por ACC (359 amostras) e pelos centros clínicos (285 amostras) foram comparados com o diagnóstico clínico, a sensibilidade foi de 64,3% (IC de 58,8%-69,9%) para o ACC e de 61,5% (IC de 55,9%-67,2%) para os centros. A especificidade foi de 86,6% (IC de 82,7%-90,6%) para o ACC versus 79,6% (IC de 74,9%-84,3%) para os centros.

CANDIDÍASENo estudo prospetivo, houve 107 participantes com diagnóstico positivo de candidíase. 83 dos 107 foram positivos no ensaio Fungitell®.

A Associates of Cape Cod, Inc. forneceu cento e setenta e cinco amostras de biblioteca de candidíase, tendo 145 das 175 sido positivas no ensaio.

ASPERGILOSENo total, 10 participantes foram positivos para aspergilose. 8 dos 10 foram positivos no ensaio.

FUSARIOSETrês participantes foram positivos para a fusariose. 2 dos 3 foram positivos no ensaio.

TERAPÊUTICA MEDICAMENTOSA ANTIFÚNGICAA presença ou ausência da terapêutica medicamentosa antifúngica não teve efeito estatisticamente significativo na sensibilidade do ensaio. Foi comprovado em 118 participantes a positividade para infeção fúngica invasiva durante terapêutica antifúngica. 82 foram positivos no ensaio (sensibilidade, 69,5%; IC de 61,2%–77,8%). Além disso, foi comprovada a positividade de vinte e quatro (24) participantes que não estavam medicados com terapêutica antifúngica. 18 foram positivos no ensaio (sensibilidade, 75%; IC de 57,7%–92,3%).

ESPECIFICIDADENo total, 170 participantes foram negativos para infeção fúngica e eram indivíduos aparentemente saudáveis. A especificidade foi de 86,5% com o ensaio (IC de 82,8%-90,1%). Quando foram incluídos os 26 participantes adicionais que foram negativos para infeção fúngica, mas tinham outras doenças, observou-se uma especificidade de 81,1% (IC de 77,1%-85,2%).

CORRELAÇÕES DO TESTEQuatro dos centros clínicos analisaram um total de 285 amostras. Os resultados dos testes nos centros tiveram uma correlação quantitativa de 96,4% com os resultados da Associates of Cape Cod, Inc. As correlações da Associates of Cape Cod, Inc. com os diferentes centros de teste variaram de 90,6% a 99,2%.

PRECISÃONos estudos de precisão, foram testadas dez (10) amostras diferentes por três centros de testes em três dias diferentes. A variação intraensaio variou de 0,9% a 28,9%. Os valores interensaio variaram de 3,9% a 23,8%. As quatro (4) amostras negativas foram excluídas de ambas as análises.

META-ANÁLISESAlém dos dados do estudo único apresentados anteriormente, foram publicados mais de cem estudos revistos por pares sobre o suporte baseado em evidências do (1→3)-β-D-glucano sérico no diagnóstico de doenças fúngicas invasivas. Vários destes estudos foram utilizados em meta-análises que fornecem avaliações de base alargada do desempenho do diagnóstico. Na meta-análise de Karageorgopoulos et al.32, foram analisados nove estudos utilizando o Fungitell®. Para estes nove estudos, a sensibilidade e a especificidade médias do Fungitell® para casos comprovados e prováveis de infeção fúngica invasiva foram de 74,9% e 79,0%, respetivamente. De igual forma, Hou et al.33 avaliaram seis estudos à base de Fungitell e determinaram os seguintes resultados acumulados (IC de 95%): sensibilidade de 0,82 (0,68–0,90); especificidade de 0,86 (0,77–0,92); rácio de verosimilhança de positivos de 5,69 (3,46–9,35); rácio de verosimilhança de negativos de 0,22 (0,12–0,39); rácio de probabilidade de diagnóstico de 19,53 (11,16–34,18) e área sob a curva do recetor-curva do operador de 0,90 (0,88–0,93). Meta-análises adicionais que avaliam o desempenho do diagnóstico dos testes de (1→3)-β-D-glucano incluem as de Lamoth et al., 201234; Onishi et al., 201235; Karageorgopoulos et al., 201336 e He et al., 201537.

LEGENDA DOS SÍMBOLOS

“Prazo de validade” “Limites de temperatura”

“Conteúdo suficiente para ‘N’ testes” “Fabricante”

“Código do lote” “Consultar as instruções de utilização”

“Dispositivo médico para diagnóstico in vitro” “Representante autorizado”

“N.º de catálogo” “Marca CE”

Associates of Cape Cod International, Inc. Deacon Park, Moorgate Road, Knowsley, Liverpool, L33 7RX, Reino Unido

Promotor australiano: Emergo Australia, Level 20, Tower II, Darling Park, 201 Sussex Street Sydney, NSW 2000, Austrália

BIBLIOGRAFIA

Poderá encontrar mais referências bibliográficas no nosso website em Fungitell.com.

PREPARAR

TESTAR AS AMOSTRAR

43 Incubar a 37 °C durante 10 minutos.

PROCEDIMENTO DE TESTE DO ENSAIO FUNGITELL®

ESQUEMA DE CONSULTA RÁPIDA

5 µl

20 µl

Incubar e recolher os dados cinéticos a 37 °C durante 40 minutos.

8

Reconstituir a reserva de glucano e preparar os padrões.

1 Pipetar 5 µl de amostra para os micropoços Pyroplate.

2

Fungitell® Assay Report Date: Patient Beta-Glucan Interpretation

I.D.

pg/mL

~ ~ ~ ~ ~ 35

- ~ ~ ~ ~ ~

70 n/a

~ ~ ~ ~ ~ 290

+

9 Ler dados do relatório.

Reconstituir o reagente Fungitell®.

5 625 µl

7 100 µl

Adicionar 100 µl de reagente de lisado Fungitell® aos micropoços Pyroplate.

Adicionar 20 µl de solução de pré-tratamento alcalina aos micropoços de amostra Pyroplate.

Adicionar 25 µl dos padrões ao Pyroplate.