BIOQUIMICA CLINICA I

CÁTEDRA- TALLER

CONTROL DE ERRORES

EN ESPECTROFOTOMETRÍA

PROF. T.M. MSc. ELBA LEIVA MADARIAGA

UNIVERSIDAD DE TALCA

FACULTAD DE CS. DE LA SALUD

DPTO. BIOQUÍMICA CLÍNICA E INMUNOHEMATOLOGÍA

Relación entre el porcentaje

de transmitancia (%T) y la

concentración%

T

Concentración

b

Io ε

c It

Io = Intensidad de la luz incidente

It = Intensidad de la luz transmitida

b = espesor del medio

ε = coef. de absorción molar (cte. para cada solución a una solución de 1

molar)

c= concentración de la solución

It = Io*10-εbc

Transmitancia = It/Io

Absorbancia = -logT

Entonces:

Abs = -log (10-εbc)

Abs = ε*b*c

LEYES DE LA

ESPECTROFOTOMERIA

Lambert-Bourguer-Bunsen-Roscoe-Beer

( Lambert-Beer)

Errores en Espectrofotometría

Escala de absorbancia y porcentaje de

transmitancia

2.0 1.0 .80.70 .60 .50 .40 . 30 .20 .10 0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

Ab

%

T

ERROR EN LA ABSORBANCIA EN FUNCIÓN DEL

PORCENTAJE DE TRANSMITANCIA.

Variación en Porcentaje de error %T Absorbancia absorbancia en la medida de absorbancia

4 1 1.398 0.22 15.8

10 1 1.000 0.041 8.60

25 1 0.602 0.035 5.79

35 1 0.456 0.025 5.44

50 1 0.301 0.017 5.78

70 1 0.155 0.012 8.03

90 1 0.046 0.0097 21.2

Rayo de luz monocromática

que muestra el ancho de

banda espectral

A

B C

D ELongitud de onda

Inte

ns

ida

d

INTERFERENCIAS ESPECTRALES

0

20

40

60

400

Ab

so

rba

nc

i

a

Longitud de onda (nm)500 600 700

Oxihemoglobina

Espectro parcial de la oxihemoglobina

(HbO2)

Curva estándar para medir proteínas totales

por reacción de Biuret: A540 v/s concentración.

Líneas continua, A540 para un estandar de proteínas de

50 g/L; línea punteada, A540 para el mismo estándar que

además contiene hemoglobina.

0 25 50 75 100

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

Ab

so

rba

nc

ia (

54

0

nm

)

Proteínas totales (g/L)

Hemoglobina

estándar 50 g/L

CORRECIÓN DE LA

INTERFERNCIA ESPECTRAL

Blancos de muestras

Mediciones cinética

PROPIEDADES FOTOMÉTRICAS

EXACTITUD DE LA LONGITUD DE ONDA

EXACTITUD FOTOMÉTRICA

LINEALIDAD FOTOMÉTRICA

PRECISIÓN FOTOMÉTRICA

PRESENCIA DE LUZ PARÁSITA

ESTABILIDAD FOTOMÉTRICA: DERIVA Y RUIDO

CONTROL DE EXACTITUD DE LA LONGITUD

DE ONDA

• Es necesario calibrar la longitud de onda como mínimo

una vez al mes:

METODOS PRIMARIOS

a.- Uso de filtro de Didimio: se puede usar en espectrofotometros

que tengan un ancho de banda espectral de 20 nm, este tiene la

máxima absorbancia a 585 nm.

b.- Uso de filtro de Oxido de Olmio: se puede usar en espectrofotometros

que tengan un ancho de banda espectral de 2-8 nm, y se obtiene la máxima

absorbancia a 360 nm.

METODOS SECUNDARIOS

Utilización de Punto Isosbéstico

EXACTITUD FOTOMETRICA

Solución de 50 mg/l Dicromato de Potasio en Ácido

sulfúrico 0.01 N Absorbancia a 350 nm debe ser 0.535

Tolerancia de la medición 2 %

Dicromato de Potasio:

Calidad máxima normalizado del National Bureau of

Standar, secado overnight a 110ªC y enfriado a

temperatura ambiente en un desecador. Otras soluciones

usadas son :

SOLUCIÓN DE SULFATO DE COBRE:

SOLUCIÓN DE SULFATO DE AMONIO Y COBALTO

SOLUCIÓN DE CROMATO DE POTASIO

EXACTITUD FOTOMÉTRICA

1.- DISOLUCIÓN DE SULFATO DE COBRE: 20,0 g CuSO4 x 5 H2O + 10 ml de H2SO4 concentrado aforado a 1000 ml, dan una disolución con las siguientes longitudes de onda.

400 nm 0,002600 nm 0,068650 nm 0,224700 nm 0,527

2. DISOLUCIÓN DE SULFATO DE AMONIO Y COBALTO:14,481 g de CoSO4 NH4 SO4 x 6 H2O + 10 ml de H2SO4concentrado aforados a 1000 ml con agua de pureza analítica, dan una disolución con las siguientes absorbancias en las longitudes de ondas específicas.

400 nm 0,012 450 nm 0,077 500 nm 0,163550 nm 0,077

EXACTITUD FOTOMÉTRICA

(UV)

3.- DISOLUCIÓN DE CROMATO DE POTASIO: 40 mg

de KCrO4 en 1000 ml de KOH 0,05 N (3,3 g/L), dan

una disolución con las siguientes absorbancias en

las longitudes de onda específicas.

340 nm 0,316

375 nm 0,991

400 nm 0,396

450 nm 0,033

LINEALIDAD FOTOMÉTRICA

SOLUCIONES DE DISTINTA CONCENTRACIÓN CUYAS ABSORBANCIAS ABARQUEN EL RANGO DE TRABAJO A CADA LONGITUD DE ONDA

UV . DICROMATO DE POTASIO EN MEDIO ÁCIDO

405 nm: p-NITROFENOL EN MEDIO ALCALINO

510 nm: NITRATO DE COBALTO EN MEDIO ÁCIDO

PRESENCIA DE LUZ PARÁSITA

340nm: SOLUCIÓN DE NITRITO DE SODIO

LECTURA DE ABSORBANCIA O % DE T

LÍMITE DE ACEPTABILIDAD :% DE T < 1 %

PRECISIÓN FOTOMÉTRICA

ESTUDIO A 650 nm CON SULFATO DE COBRE EN MEDIO ÁCIDO.

1O MEDIDAS DE LA ABS. DE ALÍCUOTAS DE LA MISMA SOLUCIÓN.

CÁLCULO DE LA PRECISIÓN DE LAS LECTURAS DE ABSORBANCIA

LÍMITE DE ACEPTABILIDAD: CV< 1 %

3DE 2DE 1DE X 1DE 2DE 3DE

88,2

95,5

99,7

Curva de Gauss

SERIE DISTRIBUCIÓN NORMAL

ANÁLISIS DE LOS

DATOS n

x = xi

n

DE = (xi -x)2 Desviación estándar

n -1

S2 = ( xi - x)2 Varianza

n - 1

CV = DE - 100 Coeficiente de Variación

x

Valores

Fre

cuen

cia

Distribuciones de

Frecuencia

x1 x2

1 2

Distribución de frecuencia de los resultados de una muestra

por dos métodos diferentes, 1 y 2. Ambos métodos son de

igual precisión ( ) pero con promedios diferente una de

otra (x1 = x2).

x1 = x2

Fre

cuencia

ESTABILIDAD FOTOMÉTRICA

340nm: SOLUCIÓN DE DICROMATO DE

POTASIO EN MEDIO ÁCIDO

- ESTUDIO DE LA DERIVA Y RUIDO FOTOMÉTRICOS

- CÁLCULO DE LA PENDIENTE Y DE LA DISPERSIÓN

DE LA RECTA ABS/TIEMPO

LIMITE DE ACEPTABILIDAD: ( DERIVA +RUIDO < 1 % )

Deriva y Ruido

Tiempo

bajo ruido y baja deriva

Tiempo

bajo deriva y alto ruido

Tiempo

alta deriva y bajo ruido

Tiempo

alta deriva y alto ruido

Ab

so

rba

nc

ia

Ab

so

rba

nc

ia

Ab

so

rba

nc

ia

Ab

so

rba

nc

ia

10 20 30

Medido por métodos comparativos

Error constante y proporcional(Westgard J, de Vos D, Hunt M, et al: Am J Med Technol 1978;44:290)

Error constante

Sin error

Error proporcional

30

20

10

A continuación se presenta una serie de datos al medir diferentes

concentraciones de una sustancia determinada por un método de referencia

( IDEAL, teóricamente sin errores) en el eje X y por otra metodología en el

eje Y.

De acuerdo a los siguientes datos y observando el gráfico Ud. debe encontrar

para cada uno de ellos la ecuación de la recta que los identifica, e interpretar su

resultado.

Tecnica de referencia Error ………………… Error……………………..

X / Y X / Y X / Y

0 / 0 0 / 3 0 / 0

10 / 8 10 / 11 20 / 12