UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CS. DE LA SALUD DPTO. BIOQUMICA CLNICA E INMUNOHEMATOLOGA

BIOQUIMICA CLINICA I CTEDRA- TALLER CONTROL DE ERRORES EN ESPECTROFOTOMETRA

PROF. T.M. MSc. ELBA LEIVA MADARIAGA

Relacin entre el porcentaje de transmitancia (%T) y la concentracin%T

Concentracin

LEYES DE LA ESPECTROFOTOMERIAIo

c

It

Lambert-Bourguer-Bunsen-Roscoe-Beer ( Lambert-Beer)

b Io = Intensidad de la luz incidente It = Intensidad de la luz transmitida b = espesor del medio = coef. de absorcin molar (cte. para cada solucin a una solucin de 1 molar) c= concentracin de la solucin It = Io*10-bc Transmitancia = It/Io Absorbancia = -logT Entonces: Abs = -log (10-bc) Abs = *b*c

Errores en EspectrofotometraEscala de absorbancia y porcentaje de transmitanciaAb2.0 1.0 .80.70 .60 .50 .40 . 30 .20 .10 0

% T 0 10 100

20

30

40

50

60

70

80

90

ERROR EN LA ABSORBANCIA EN FUNCIN DEL PORCENTAJE DE TRANSMITANCIA.

%T

Absorbancia

Variacin en absorbancia

Porcentaje de error en la medida de absorbancia 15.8 8.60 5.79 5.44 5.78 8.03 21.2

4 10 25 35 50 70 90

1 1 1 1 1 1 1

1.398 1.000 0.602 0.456 0.301 0.155 0.046

0.22 0.041 0.035 0.025 0.017 0.012 0.0097

Rayo de luz monocromtica que muestra el ancho de banda espectralAIntensidad

B

C

D

Longitud de onda

E

INTERFERENCIAS ESPECTRALES

60

Absorbanci a40

20

Oxihemoglobina

0 400

500

600

700

Longitud de onda (nm) Espectro parcial de la oxihemoglobina (HbO2)

Curva estndar para medir protenas totales por reaccin de Biuret: A540 v/s concentracin.Lneas continua, A540 para un estandar de protenas de 50 g/L; lnea punteada, A540 para el mismo estndar que adems contiene hemoglobina.

1.2

Absorbancia (540 nm)

1.0 0.8 0.6

Hemoglobina estndar 50 g/L

0.40.2

0

25

50

75

100

Protenas totales (g/L)

CORRECIN DE LA INTERFERNCIA ESPECTRALBlancos de muestras Mediciones cintica

PROPIEDADES FOTOMTRICASEXACTITUD DE LA LONGITUD DE ONDA EXACTITUD FOTOMTRICA LINEALIDAD FOTOMTRICA PRECISIN FOTOMTRICA PRESENCIA DE LUZ PARSITA ESTABILIDAD FOTOMTRICA: DERIVA Y RUIDO

CONTROL DE EXACTITUD DE LA LONGITUD DE ONDA Es necesario calibrar la longitud de onda como mnimo una vez al mes:METODOS PRIMARIOS

a.- Uso de filtro de Didimio: se puede usar en espectrofotometros que tengan un ancho de banda espectral de 20 nm, este tiene la mxima absorbancia a 585 nm. b.- Uso de filtro de Oxido de Olmio: se puede usar en espectrofotometros que tengan un ancho de banda espectral de 2-8 nm, y se obtiene la mxima absorbancia a 360 nm. METODOS SECUNDARIOSUtilizacin de Punto Isosbstico

EXACTITUD FOTOMETRICASolucin de 50 mg/l Dicromato de Potasio en cido sulfrico 0.01 N Absorbancia a 350 nm debe ser 0.535 Tolerancia de la medicin 2 % Dicromato de Potasio: Calidad mxima normalizado del National Bureau of Standar, secado overnight a 110C y enfriado a temperatura ambiente en un desecador. Otras soluciones usadas son :SOLUCIN DE SULFATO DE COBRE: SOLUCIN DE SULFATO DE AMONIO Y COBALTO SOLUCIN DE CROMATO DE POTASIO

EXACTITUD FOTOMTRICA1.- DISOLUCIN DE SULFATO DE COBRE: 20,0 g CuSO4 x 5 H2O + 10 ml de H2SO4 concentrado aforado a 1000 ml, dan una disolucin con las siguientes longitudes de onda. 400 nm 0,002 600 nm 0,068 650 nm 0,224 700 nm 0,527 2. DISOLUCIN DE SULFATO DE AMONIO Y COBALTO: 14,481 g de CoSO4 NH4 SO4 x 6 H2O + 10 ml de H2SO4 concentrado aforados a 1000 ml con agua de pureza analtica, dan una disolucin con las siguientes absorbancias en las longitudes de ondas especficas. 400 nm 0,012 450 nm 0,077 500 nm 0,163 550 nm 0,077

EXACTITUD FOTOMTRICA(UV)

3.- DISOLUCIN DE CROMATO DE POTASIO: 40 mg de KCrO4 en 1000 ml de KOH 0,05 N (3,3 g/L), dan una disolucin con las siguientes absorbancias en las longitudes de onda especficas. 340 nm 375 nm 400 nm 450 nm 0,316 0,991 0,396 0,033

LINEALIDAD FOTOMTRICASOLUCIONES DE DISTINTA CONCENTRACIN CUYAS ABSORBANCIAS ABARQUEN EL RANGO DE TRABAJO A CADA LONGITUD DE ONDA

UV . DICROMATO DE POTASIO EN MEDIO CIDO 405 nm: p-NITROFENOL EN MEDIO ALCALINO 510 nm: NITRATO DE COBALTO EN MEDIO CIDO

PRESENCIA DE LUZ PARSITA

340nm: SOLUCIN DE NITRITO DE SODIO LECTURA DE ABSORBANCIA O % DE T

LMITE DE ACEPTABILIDAD :% DE T < 1 %

PRECISIN FOTOMTRICAESTUDIO A 650 nm CON SULFATO DE COBRE EN MEDIO CIDO. 1O MEDIDAS DE LA ABS. DE ALCUOTAS DE LA MISMA SOLUCIN. CLCULO DE LA PRECISIN DE LAS LECTURAS DE ABSORBANCIA LMITE DE ACEPTABILIDAD: CV< 1 %

SERIE DISTRIBUCIN NORMAL

88,2 95,5 99,7 3DE 2DE 1DE X 1DE 2DE 3DE

Curva de Gauss

ANLISIS DE LOS n DATOS x x=i

n DE = (xi -x)2 estndar Desviacin n -1 S2 = ( xi - x)2 n-1 CV = DE - 100 Coeficiente de Variacin x Varianza

Distribuciones de Frecuencia

Frecuencia

Valores

Distribucin de frecuencia de los resultados de una muestra por dos mtodos diferentes, 1 y 2. Ambos mtodos son de igual precisin ( ) pero con promedios diferente una de otra (x1 = x2). 1 2 Frecuencia x1 = x2

x1

x2

ESTABILIDAD FOTOMTRICA

340nm:

SOLUCIN DE DICROMATO DE POTASIO EN MEDIO CIDO

- ESTUDIO DE LA DERIVA Y RUIDO FOTOMTRICOS - CLCULO DE LA PENDIENTE Y DE LA DISPERSIN DE LA RECTA ABS/TIEMPO

LIMITE DE ACEPTABILIDAD: ( DERIVA +RUIDO < 1 % )

Deriva y RuidoAbsorbancia AbsorbanciaTiempo bajo ruido y baja deriva

Tiempo bajo deriva y alto ruido

Absorbancia

AbsorbanciaTiempo alta deriva y bajo ruido Tiempo alta deriva y alto ruido

Error constante y proporcional(Westgard J, de Vos D, Hunt M, et al: Am J Med Technol 1978;44:290)

30Error constante Sin error Error proporcional

20

10

10

20

30

Medido por mtodos comparativos

A continuacin se presenta una serie de datos al medir diferentes concentraciones de una sustancia determinada por un mtodo de referencia ( IDEAL, tericamente sin errores) en el eje X y por otra metodologa en el eje Y. De acuerdo a los siguientes datos y observando el grfico Ud. debe encontrar para cada uno de ellos la ecuacin de la recta que los identifica, e interpretar su resultado.

Tecnica de referencia X / Y 0 / 0 10 / 8

Error X / Y 0 / 3 10 / 11

Error.. X /Y 0 /0 20 / 12