Μέθοδοι εξυγίανσης φυτικού πολλαπλασιαστικού υλικού

Θεοδώρα Καπαρή

Κλάδος Φυτοπροστασίας ΙΓΕ

15 Οκτωβρίου, 2015

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 1

1. Μύκητες 2. Βακτήρια 3. Φυτοπλάσματα 4. Ιοί 5. Ιοειδή

Παθογόνα φυτών

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 2

Αντιμετώπιση των ασθενειών

• Ανάλογη με το παθογόνο που προκαλεί

την ασθένεια

• Χημική καταπολέμηση μυκήτων,

βακτηρίων

• Οι ασθένειες που οφείλονται σε ιούς,

ιοειδή και φυτοπλάσματα δεν

αντιμετωπίζονται με χημικά ή άλλα

μέσα

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών

3

Ιοί: Αποτελούνται από RNA

(ριβονουκλεϊκό οξύ) ή DNA

(δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ) που

περιβάλλεται από ένα

προστατευτικό κάλυμμα πρωτεΐνης

ή καλύμματα πρωτεΐνης. Μέγεθος

RNA 4-20 Χιλ. βάσεις)

Ιοειδή: Αποτελούνται από ελεύθερο

κυκλικό RNA μικρού μεγέθους (250-

370 βάσεων) και δεν περιβάλλονται

από πρωτεϊνικό περίβλημα

Φυτοπλάσματα: Μονοκύτταροι

οργανισμοί που στερούνται κυτταρικού τοιχώματος

Ioί – Ιοειδή- Φυτοπλάσματα

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 4

Αντιμετώπιση ιολογικών και συναφών ασθενειών

• Πρόληψη

χρήση υγιούς πολλαπλασιαστικού υλικού απαραίτητη για την πρόληψη των ιολογικών ασθενειών και των τεράστιων ζημιών που προκαλούνται απ΄αυτές

• Για όλα τα είδη που πολλαπλασιάζονται με αγενή πολλαπλασιασμό (μοσχεύματα, εμβολιασμό, κονδύλους κ.ά. )

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 5

Εξυγίανση φυτικού πολλαπλασιαστικού υλικού ειδών που πολλαπλασιάζονται με αγενή

πολλαπλασιασμό

• Απαλλαγή του πολλαπλασιαστικού

υλικού από ιούς ιοειδή και

φυτοπλάσματα

• Πολλαπλασιασμός του πρωτογενούς

υγιούς υλικού υπό αυστηρούς

κανονισμούς και ελεγχόμενες

συνθήκες για αποτροπή

επαναμολύνσεων 15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών

6

Μέθοδοι εξυγίανσης φυτικού

πολλαπλασιαστικού υλικού

1. Θερμοθεραπεία

2. Θεραπεία χαμηλών θερμοκρασιών

3. Μεριστωματική καλλιέργεια

4. Μικροεμβολιασμός

5. Χημειοθεραπεία

6. Κρυοθεραπεία

• Οι μέθοδοι αυτές μπορεί να εφαρμοστούν και σε συνδυασμό μεταξύ τους για εξυγίανση

συγκεκριμένων παθογόνων.

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών

7

Θερμοθεραπεία • Η αρχαιότερη μέθοδος εξυγίανσης

• Εφαρμόστηκε από τα τέλη του 19ου αιώνα για απαλλαγή του πολλαπλασιαστικού υλικού από ιούς και άλλα συναφή παθογόνα.

• Χρησιμοποιήθηκε έκτοτε για εξυγίανση πολλαπλασιαστικού υλικού πολλών ειδών όπως αμπέλια, πυρηνόκαρπα, μηλοειδή, εσπεριδοειδή, πατάτες, φράουλες κ.α.

• Η έκθεση των φυτών σε ψηλές θερμοκρασίες μειώνει την συγκέντρωση των ιών ή τους καθιστά ανενεργούς. 15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών

8

Τεχνική θερμοθεραπείας

• Τα μολυσμένα δενδρύλλια επωάζονται σε θαλάμους με θερμοκρασίες που κυμαίνονται συνήθως από 30-40 oC για 6 μέχρι 12 βδομάδες.

• Η απαλλαγή ολόκληρου του φυτού από τον ιό είναι συνήθως αδύνατη χωρίς να προκληθούν πολύ σοβαρές ζημιές ή και ολοκληρωτική αποξήρανση του φυτού από την ψηλή θερμοκρασία στην οποία είναι εκτεθειμένο.

• Ο ιός μπορεί να είναι ανενεργός σε νέους βλαστούς αλλά όχι σε παλαιότερους ή στις ρίζες.

• Στις περισσότερες περιπτώσεις μετά τη θερμοθεραπεία μοσχεύματα ή εμβόλια αφαιρούνται από το δενδρύλλιο που έχει υποστεί θερμοθεραπεία και πολλαπλασιάζονται περαιτέρω για παραγωγή νέων υγιών φυτών.

• Σε αρκετές περιπτώσεις η παραγωγή νέων υγιών φυτών διενεργείται με ιστοκαλλιέργεια in vitro μεριστωμάτων που προέρχονται από τα μητρικά δενδρύλλια ή μοσχεύματα που έχουν υποστεί θερμοθεραπεία.

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 9

Θερμοθεραπεία in vitro

• Η θερμοθεραπεία μπορεί να εφαρμοστεί με καλλιέργεια βλαστών του μητρικού φυτού in vitro.

• Οι βλαστοί αυτοί αφού ολοκληρωθεί η θερμοθεραπεία μπορεί να πολλαπλασιαστούν in vitro για παραγωγή νέων υγιών φυτών.

• Σε ορισμένες περιπτώσεις η παραγωγή νέων υγιών φυτών διενεργείται με ιστοκαλλιέργεια in vitro μεριστωμάτων που προέρχονται από τα μητρικά μοσχεύματα που έχουν υποστεί θερμοθεραπεία.

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 10

Θεραπεία χαμηλών θερμοκρασιών • Η θερμοθεραπεία δεν μπορεί να χρησιμοποιεί για εξυγίανση

φυτών που είναι προσβεβλημένα με ιοειδή.

• Τα μολυσμένα δενδρύλλια επωάζονται σε θαλάμους με

θερμοκρασίες που κυμαίνονται συνήθως από 4 oC μέχρι 8 °C

για μερικές βδομάδες ή μήνες.

• Potato spindle tuber viroid (PSTVd), 8 °C, Cucumber palefruit

viroid, 6 μήνες στους 5 °C, Apple scar skin viroid

• Σε ορισμένες περιπτώσεις η παραγωγή νέων υγιών φυτών

διενεργείται με ιστοκαλλιέργεια in vitro μεριστωμάτων που

προέρχονται από τα μητρικά μοσχεύματα που έχουν υποστεί

θεραπεία χαμηλών θερμοκρασιών.

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 11

Μεριστωματική καλλιέργεια in vitro • Χρησιμοποιείται για εξυγίανση πολλών φυτικών ειδών που

πολλαπλασιάζονται αγενώς.

• 1949, παρατηρήθηκε ότι η συγκέντρωση του ιού (virus titer) παρήκμαζε στο ακραίο μερίστωμα

• 1952, παρήχθησαν με μεριστωματική καλλιέργεια φυτά ντάλιας απηλλαγμένα ιώσεων

• Με την πάροδο των χρόνων η μεριστωματική καλλιέργεια εφαρμόστηκε ευρέως σε όλο τον κόσμο και σήμερα αποτελεί ένα απαραίτητο εργαλείο για εφαρμογή προγραμμάτων εξυγίανσης πολλαπλασιαστικού υλικού

• Με την καλλιέργεια του ακραίου μεριστώματος επιτυγχάνεται ο αγενής πολλαπλασιασμός του μητρικού δένδρου με ταυτόχρονη αποφυγή των ιών και συναφών παθογόνων από ένα συγκεκριμένο φυτό και παράλληλα παραγωγή νέων φυτών που είναι ίδια με τα μητρικά.

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 12

Το ακραίο μερίστωμα • Αποτελείται από τις καταβολές των φύλλων από

τις οποίες αναπτύσσονται τα νέα φύλλα • Είναι το σημείο απ΄όπου αναπτύσσεται ο νέος

βλαστός του φυτού • Οι μεριστωματικοί ιστοί βρίσκονται στην άκρη

των βλαστών και ριζών και αποτελούν τα κέντρα διαίρεσης κυττάρων και παραγωγής νέων ιστών και οργάνων του φυτού.

• Αποτελούν κέντρα αποθήκευσης γενετικών πληροφοριών και έχουν την ικανότητα παραγωγής νέων φυτών.

• Το ακραίο μερίστωμα είναι συνήθως απηλλαγμένο από ιούς και συναφή παθογόνα για τους εξής λόγους:

• α) Υπάρχει ψηλή συγκέντρωση αυξίνης στα διαιρούμενα κύτταρα του μεριστώματος,

• β) το περιβάλλον του μεριστώματος είναι ακατάλληλο για την αντιγραφή πολλών ιών,

• γ) η ταχύτητα διαίρεσης των κυττάρων του φυτού είναι μεγαλύτερη από την ταχύτητα πολλαπλασιασμού των ιών.

•

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 13

Ακραίο μερίστωμα προσβεβλημένο με ιούς και συναφή παθογόνα

• Σε περιπτώσεις που το ακραίο μερίστωμα είναι προσβεβλημένο με ιούς και συναφή παθογόνα, αυτά μπορούν σε κάποιες περιπτώσεις να εξαλειφθούν κατά την μεριστωματική καλιέργεια με την βοήθεια των ακόλουθων παραγόντων:

α) δράση χημικών ουσιών που καθορίζουν την αύξηση όπως των κυτοκινίνων και των αυξινών,

β) παρουσία ουσιών αναστολής όπως οι φαινολαμίνες,

γ) καταστροφή ενζύμων απαραίτητων για την αντιγραφή των ιών,

δ) αποδόμηση του RNA του ιού που προκαλείται από την καταστροφή κυττάρων κατά την αποκοπή

του μεριστώματος.

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 14

Εντοπισμός ιοειδούς Potato spindle tuber viroid (PSTVd) σε μολυσμένο φυτό τομάτας (Yijun Qi and Biao Ding)

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 15

Τεχνική μεριστωματικής καλλιέργειας

• Αφαίρεση του ακραίου μεριστώματος από το προσβεβλημένο μητρικό φυτό και καλλιέργεια του σε ειδικό θρεπτικό υπόστρωμα in vitro υπό ασηπτικές συνθήκες μέσα σε θάλαμο συνεχούς οριζόντιας ροής αποστειρωμένου αέρα (laminar flow).

• Το θρεπτικό υπόστρωμα βασίζεται συνήθως στο υπόστρωμα ΜS (Murashige and Skoog, 1962),ή παραλλαγές του και περιλαμβάνει μακροστοιχεία και ιχνοστοιχεία.

• Ανάλογα με το είδος του φυτού που καλλιεργείται το θρεπτικό υπόστρωμα μπορεί να εμπλουτιστεί με ορμόνες, βιταμίνες και άλλα στοιχεία.

• Η χρήση του κατάλληλου θρεπτικού υποστρώματος είναι κρίσιμη για την επιτυχία της μεριστωματικής καλλιέργειας

• Όταν το νέο φυτό αναπτυχθεί ικανοποιητικά ακολουθεί η φύτευση του σε χώμα και η σκληραγώγηση του ώστε να μπορέσει να αναπτυχθεί περαιτέρω

σε συνθήκες θερμοκηπίου αρχικά και αργότερα περιβάλλοντος

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 16

Μικροεμβολιασμός ή μεριστωματικός

εμβολιασμός in vitro • Ο μικροεμβολιασμός χρησιμοποιείται κυρίως για

ξυλώδη είδη που δεν αναπτύσσονται με την μέθοδο της μεριστωματικής καλλιέργειας σε θρεπτικό υπόστρωμα.

• Aναπτύχθηκε για πρώτη φορά το 1975 για εξυγίανση των εσπεριδοειδών.

• Αργότερα χρησιμοποιήθηκε και για εξυγίανση άλλων ειδών, όπως τα πυρηνόκαρπα, τα μηλοειδή, ακρόδρυα, αμπέλια, αβοκάντο κ.ά.

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 17

Η τεχνική του μικροεμβολιασμού

• Εμβολιασμός του ακραίου μεριστώματος της υπό εξυγίανση ποικιλίας σε υγιές σπορόφυτο/υποκείμενο που έχει αναπτυχθεί in vitro.

• Κατά την εφαρμογή του μικροεμβολιασμού που γίνεται κάτω από ασηπτικές συνθήκες αφαιρούνται από τα σπορόφυτα- υποκείμενα που έχουν αναπτύχθεί in vitro οι κοτυληδόνες και το επικοτύλιο όλα τα πλάγια ριζίδια και μέρος της ρίζας. Στο πάνω μέρος του υποκειμένου χαράσσεται ένα ανάποδο Τ και εκεί τοποθετείται το εμβόλιο μεγέθους 0.1-0.2 mm 15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών

18

Η τεχνική του μικροεμβολιασμού •Ο μικροεμβολιασμός γίνεται κάτω από στερεομικροσκόπιο.

•Τα μικροεμβολιασμένα φυτά τοποθετούνται σε

δοκιμαστικούς σωλήνες και επωάζονται σε θάλαμο σταθερής

θερμοκρασίας.

•Τα μικροεμβολιασμένα φυτά παρακολουθούνται και σε

περίπτωση ανάπτυξης του υποκειμένου πάνω από το σημείο

εμβολιασμού ή στα πλάγια αφαιρούνται οι νέοι αυτοί βλαστοί ώστε να μπορέσει να αναπτυχθεί το μερίστωμα.

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 19

Η τεχνική του μικροεμβολιασμού • Tο μέγεθος του ιστού που περιέχει το ακραίο

μερίστωμα (καταβολές φύλλων και μερίστωμα) παίζει ρόλο στην επιτυχία μικροεμβολιασμού.

• Σε περιπτώσεις που ο ιστός αυτός είναι μεγαλύτερου μεγέθους (2-3 mm) η επιτυχία μικροεμβολιασμού είναι μεγαλύτερη. Όμως, αν ο ιστός αυτός έχει μικρότερο μέγεθος (1-1.5 mm) η επιτυχία εξυγίανσης είναι σε ποσοστό 100%, παρόλο που η επιτυχία μικροεμβολιασμού είναι μικρή.

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 20

Μετεμβολιασμός η Μεταφύτευση

• Εμβολιασμός μικρόφυτων σε αναπτυγμένα υγιή σπορόφυτα για περαιτέρω ανάπτυξη

• Αναπτυγμένα εμβολιασμένα μικρόφυτα φυτεύονται σε γλάστρες με φυτόχωμα

• Τοποθετούνται σε δωμάτιο με συνθήκες 22-25 οC και 16 ώρες φωτισμού

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 21

Χημειοθεραπεία in vitro

• Η καταπολέμηση του ιών με χρήση χημικών σκευασμάτων όπως το acyclquanosine, το azidothymidine, το ribavirin, το acyclovir κ.ά.

• Προστίθενται στο θρεπτικό υπόστρωμα της ιστοκαλλιέργειας και παρεμποδίζουν τον πολλαπλασιασμό των ιών ή την μετακίνηση τους.

• Η χρήση χημικών σκευασμάτων συνδυασμένη με μεριστωματική καλλιέργεια μπορεί να οδηγήσει σε εξυγίανση των φυτών από συγκεκριμένους ιούς

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 22

Κρυοθεραπεία • Η κρυοθεραπεία των ακραίων ιστών ή μεριστωμάτων είναι

μια νέα εφαρμογή της μεθόδου της κρυοσυντήρησης και σήμερα αποτελεί ένα νέο βιοτεχνολογικό εργαλείο για την απαλλαγή του πολλαπλασιαστικού υλικού από ιούς, ιοειδή και φυτοπλάσματα.

• Βασίζεται στη θεωρία της κρυοσυντήρησης ακραίων ιστών του φυτού.

• Κατά την εφαρμογή μεθόδων κρυοσυντήρησης μόνο τα κύτταρα που περιλαμβάνονται στον μεριστωματικό ιστό παραμένουν ζωντανά ενώ όλα τα άλλα καταστρέφονται από την έκθεση τους σε πολύ χαμηλές θερμοκρασίες (-196oC).

• Το ακραίο μερίστωμα είναι συνήθως απηλλαγμένο ιών και άλλων παθογόνων και έτσι η καλλιέργεια του in vitro μετά την κρυοθεραπεία οδηγεί στην εξυγίανση.

• Η κρυοθεραπεία των ακραίων μεριστωμάτων εφαρμόστηκε για πρώτη φορά το 1997 για απαλλαγή υποκειμένων Prunus από τον ιό της ευλογιάς ή σιάρκας των πυρηνοκάρπων (Plum pox virus).

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 23

Η τεχνική της κρυοθεραπείας • Η τεχνική της κρυοθεραπείας περιλαμβάνει

τα ακόλουθα στάδια:

α) ιστοκαλλιέργεια προσβεβλημένου φυτικού ιστού

β) αφαίρεση και επεξεργασία μεριστωμάτων

γ) κρυοθεραπεία

δ) ιστοκαλλιέργεια μεριστωμάτων που υπέστησαν κρυοθεραπεία για ανάπτυξη των νέων φυτών

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 24

Συνδυασμός των μεθόδων εξυγίανσης

• Ο συνδυασμός των 6 μεθόδων μπορεί να εφαρμοστεί για εξυγίανση του πολλαπλασιαστικού υλικού από διάφορα παθογόνα.

• Εξυγίανση της μανταρινιάς Σατσούμα από τον ιό Tatter leaf-citrange stunt virus με θερμοθεραπεία και μικροεμβολιασμό.

• Εξυγίανση της κερασιάς από τους ιούς Prune dwarf virus (PDV), Prunus necrotic ring spot virus (PNRSV) και Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) με συνδυασμό χημειοθεραπείας, θερμοθεραπείας και μεριστωματικής καλλιέργειας in vitro.

• Εξυγίανση της νεκταρινιάς από τους ιούς PPV και PNRSV με θερμοθεραπεία και μεριστωματική καλλιέργεια in vitro.

• Εξυγίανση της μανταρινιάς από τον ιό Citrus ringspot virus με χημειοθεραπεία και μικροεμβολιασμό.

• Εξυγίανση πυρηνοκάρπων από τους ιούς ACLSV and PNRSV με συνδυασμό θερμοθεραπείας και χημειοθεραπείας in vitro.

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 25

Ιολογικός έλεγχος

• Βιολογικός έλεγχος

με χρήση φυτών

δεικτών

• Ορολογική μέθοδος

ELISA

• Μοριακές Μέθοδοι

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών

26

Εξυγίανση φυτικού πολλαπλασιαστικού υλικού στο ΙΓΕ Εσπεριδοειδή, Αμπέλια,

Πατάτες, Πυρηνόκαρπα Αναστασία Κυριακού, Λάμπρος

Παπαγιάννης, Νίκος Σεραφείδης, Νίκος

Ιωάννου, Ι. Ιωαννίδης, Γιώργος Μηνάς,

Σοφοκλής Γρηγορίου, Στέλιος Σαμουήλ,

Τεύκρος Ιακωβίδης, Γιαννάκης Γαβριήλ κ.α.

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 27

Παραγωγή πολλαπλασιαστικού υλικού δενδρωδών καλλιεργειών

Φυτοκαραντίνα-

Ελεγχος για

ιολογικές και

άλλες ασθένειες

και εχθρούς

Εξυγίανση Ιολογικός

έλεγχος

Προβασική

Φυτεία ΙΓΕ

Βασική

Φυτεία

Τμήματος

Γεωργίας

Εισαγωγή από

άλλες χώρες

Επιλογή

αξιόλογων

τοπικών

ποικιλιών

Διάθεση

στους

παραγωγούς

Ιολογικός

έλεγχος

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 28

Κανονισμοί για πολλαπλασιαστικό υλικό

Target crop Standard Year EPPO

Bulletin

Frui

t /sm

all f

ruit

cr

ops

Almond, apricot, peach and plum

PM 4/30(1) 2001 31, 463–478

Cherry PM 4/29(1) 2001 31, 447–462 Citrus trees and rootstocks PM 4/12(1) 1995 25, 737–755

Grapevine varieties and rootstocks

PM 4/8(2) 1994 24, 347–367

Hazelnut PM 4/31(1) 2004 34, 145–147

Hop PM 4/16(2) 1997 27, 175–184

Malus, Pyrus and Cydonia spp.

PM 4/27(1) 1999 & 2001

29, 239–252 & 31, 445–446

Olive trees and rootstocks PM 4/17(2) 2006 36, 77–83 Ribes spp. PM 4/9(2) 2008 38, 14–18

Rubus spp. PM 4/10(2) 1994 24, 865–873 Sambucus spp. PM 4/32(1) 2008 38, 19–24

Strawberry PM 4/11(2) 1994 24, 875–889

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 29

Εξυγίανση αμπέλου με μεριστωματική καλλιέργεια

25 κλωνικές ποικιλίες αμπελιών (VIONNER,

ΜΑΡΑΘΕΥΤΙΚΟ, ΚΑΝΕΛΛΑ, ΦΛΟΥΡΙΚΟ,

ΓΙΑΝΝΟΥΔΙ, ΞΥΝΟΜΑΥΡΟ, ΜΟΣΧΟΦΙΛΕΡΟ,

ΑΘΗΡΙ ΛΕΥΚΟ, ΑΓΙΩΡΓΗΤΙΚΟ, ΛΗΜΝΙΟ,

ΑΗΔΑΝΙ, ΑΣΥΡΤΙΚΟ, AUTUMN ROYAL, EARLY

SUPERIOR, BLACKROSE, BARLINCA,

CRIMSON SEEDLESS, ITALIA, JULY MUSCAT,

RED GLOBE, RUBY SEEDLESS, ΣΙΔΕΡΙΤΗ, VICTORIA, MONUKKA, ΚΑΤΟΜΥΛΗΤΙΚΟ)

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 30

Θερμοθεραπεία αμπέλου • Τα επιλεγμένα φυτά

τοποθετηθήκαν για 40 ημέρες, σε θερμοθάλαμο με θερμοκρασία 32 ο C και σχετική υγρασία 95% φωτοπερίοδο 16/8 ώρες φωτισμού

• Μεριστώματα των βλαστών αυτών αποτέλεσαν το υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την έναρξη της μεριστωματικής καλλιέργειας. 15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 31

Μεριστωματική καλλιέργεια αμπελιών in-vitro

•Μεριστώματα από τους

αλπινικούς βλαστούς των

μητρικών φυτών

τοποθετούνταν σε

δοκιμαστικούς σωλήνες με

θρεπτικό υπόστρωμα, υπό

ασηπτικές συνθήκες.

•Οι καλλιέργειες αυτές αφού

επωάστηκαν σε απόλυτο

σκοτάδι για 15 μέρες, στη

συνέχεια τοποθετήθηκαν σε

θάλαμο σταθεράς θερμοκρασίας 23+2 οC

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 32

Προβασική Φυτεία Αμπέλου, Ζύγι 1338-1 PINOT NOIR GR

ITALIA

1325-1 MATARO

1329-1 CABERNET SAUVIGNON

FANTASY

1338-1 PINOT NOIR GR

158/10 EARLY SUPERIOR

ΑΣΥΡΤΙΚΟ

1619-1 CARIGNAN

1638-1 EMERALD RIESLING

BLACK EMERALD

1643-1 EARLY MUSCAT

1613-1 SHIRAZ

AUTUMN ROYAL

1326-1 GEWURZTRAMINER

1642-1 FLAME TOKAY

1334-1 THOMPSON SEEDLESS

1613-1 SHIRAZ

1624-1 MUSCAT OTTONEL

RED CLOBE

1623-1 CABERNET FRANC

1647-2 DELIGHT

1625-1 CANNER

1624-1 MUSCAT OTTONEL

138-7 SUPLIMA

CRIMSON SEEDLESS

1615-1 PINOT NOIR

1339-1 EMERALD SEEDLESS

1639-1 BRONX SEEDLESS

1327-1 CHENIN BLANC+

1617-1 MERLOT

PRIMA 1645-3 CHRISTMAS

1616-1 MULLER THURGAN

1337-1 MALVASIA BIANCA

1617-1 MERLOT

1641-1 SENECA

PINOT BLANC 1328-1 CHARDONNAY

1622-1 EMPEROR

1341-1 CALMERIA

1641-1 SENECA

1621-1 QUEEN

FANTASY SEEDLESS

1333-1 GOLD

1618-1 GRENACHE

1620-1 ALLICANTE BOUCHET

1621-1 QUEEN

1332-1 CARDINAL

AGIORGHTIKON 1335-1 CAMAY

1646-2 MUSCAT FLAME

1636-2 WHITE RIESLING

1332-1 CARDINAL

1340-1 FLAME SEEDLESS

ORA

1614-1 SEMILLON

1637-1 SAINT EMILION

1612-1 SYLVANER

1340-1 FLAME SEEDLESS

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 33

Προβασική Φυτεία Αμπέλου, Ζύγι SL-98-15 ΣΙΔΕΡΙΤΗΣ

SL-98-15 ΣΙΔΕΡΙΤΗΣ

1627-1 COUDERC 1616

SL-89-12-2 ΣΠΟΥΡΤΙΚΟ

SL-88-1-10 ΛΕΥΚΑΔΑ

SL-98-14 ΣΙΔΕΡΙΤΗΣ

SL-98-14 ΣΙΔΕΡΙΤΗΣ

SL-98-1 ΒΕΡΙΚΟ

1629-1 DOGRIDGE

SL-87-6-9 ΜΑΛΑΓΑ

SL-89-15-2 ΑΣΠΡΟ Χ

SL-98-13 ΣΙΔΕΡΙΤΗΣ

SL-98-13 ΣΙΔΕΡΙΤΗΣ

1331-1 5BB

1632-1 99R

SL-87-2-8 ΜΑΥΡΟ-ΝΑΤΑ

SL-88-6-8 ΜΑΡΑΘΕΥΤΙΚΟ

SL-98-12 ΣΙΔΕΡΙΤΗΣ

SL-98-12 ΣΙΔΕΡΙΤΗΣ

1634-2 SALT CREEK

SL-89-12-2 ΣΠΟΥΡΤΙΚΟ

SL-87-4-4 ΞΥΝΙΣΤΕΡΙ

SL-89-12-1 ΣΠΟΥΡΤΙΚΟ

SL-98-11 ΣΙΔΕΡΙΤΗΣ

SL-98-11 ΣΙΔΕΡΙΤΗΣ

1630-1 33EM

SL-89-15-2 ΜΩΡΟΚΑΝΕΛΛΑ

SL-87-6-3 ΜΑΛΑΓΑ

SL-87-3-4 ΜΑΥΡΟ

SL-98-8 ΒΕΡΙΚΟ

SL-98-8 ΒΕΡΙΚΟ

1628-1 COUDERC 3309

SL-87-5-4 ΞΥΝΙΣΤΕΡΙ ΚΑΘΗΚΑΣ

SL-88-8-2 ΜΑΡΑΘΕΥΤΙΚΟ

SL-89-9-5 ΜΩΡΟΚΑΝΕΛΛΑ

SL-98-6 ΒΕΡΙΚΟ

1336-1 OPPENHEIM

SL-88-6-8 ΜΑΡΑΘΕΥΤΙΚΟ

SL-87-5-5 ΞΥΝΙΣΤΕΡΙ

SL-88-9-5 ΛΕΥΚΑΔΑ

SL-98-5 ΒΕΡΙΚΟ

SL-98-6 ΒΕΡΙΚΟ

1335-1 420A

SL-89-7-1 ΜΑΥΡΟ

SL-88-9-3 ΛΕΥΚΑΔΑ

SL-88-7-1 ΜΑΡΑΘΕΥΤΙΚΟ

SL-98-3 ΒΕΡΙΚΟ

SL-98-5 ΒΕΡΙΚΟ

1633-1 110R

SL-87-2-7 ΜΑΥΡΟ

SL-90-1-19 ΟΦΘΑΛΜΟ

SL-89-2-6 ΜΟΣΧΑΤΟ

SL-98-1 ΒΕΡΙΚΟ

SL-98-3 ΒΕΡΙΚΟ

1631-2 41B

SL-88-6-9 ΜΑΡΑΘΕΥΤΙΚΟ

SL-90-1-15 ΟΦΘΑΛΜΟ

SL-87-3-6 ΜΑΥΡΟ

ΕΠΑΝΑΛΗΨΗ I

25/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 34

Προβασική Φυτεία Αμπέλου, Ζύγι

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 35

Εξυγίανση πατατοσπόρου • Ιοί: PLRV, PVA, PVS, PVX, PVY, PVM.

• Θερμοθεραπεία: Κόνδυλοι πατάτας από τις ποικιλίες «Σπούντα», «Κάρα» και «Νίκολα» διατηρήθηκαν για στους 36 oC και υγρασία 90%, σε απόλυτο σκοτάδι για 40 ημέρες.

• Μεριστωματική καλλιέργεια in vitro: Από τους κονδύλους απομονώθηκαν αλπινικοί βλαστοί, μεριστώματα μήκους 0.5 mm και καλλιεργήθηκαν σε σωλήνες

• Ιστοκαλλιέργεια in vitro: Παραγωγή μικροφυτών

25/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 36

Εξυγίανση πυρηνοκάρπων

Ιολογικές ασθένειες πυρηνοκάρπων

25/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 37

Εξυγίανση πυρηνοκάρπων με μεριστωματική καλλιέργεια

• Ροδακινιά (Royal Gold, Spring Crest, Red June, Arm King, Suellen Crepel, Fair Lane, Florida King, Flavour Top, Royal April, H. Harley, Bullard’s, Φαντασία, Ανεξαρτησία),

• Κερασιά (Griotte DV Nord, Utah Giar, B. Lapine, B. Revershon),

• Δαμασκηνιά (Santa Rosa, Stanley, President, Red Beauty, Black Amber, Tende)

• Βερικοκιά (Palen, Dixie red, Brecaucia Licia, Μπεμπέκο, Monique). 15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 38

Μεριστωματική καλλιέργεια πυρηνοκάρπων in vitro

• Μεριστώματα που προέρχονταν από τα μητρικά δένδρα που βρέθηκαν ιωμένα καλλιεργήθηκαν in vitro υπό ασηπτικές συνθήκες

• Θρεπτικά υποστρώματα:

1) Lloyd and McCown medium for woody plants

2) Άλατα MS (Murashige and Skoog), 0.5mg 6-benzylaminopurine, 0.5 indole-3-butyric acid, 0.1 mg gibberellic acid,

3) Άλατα MS με προσθήκη 100 mg inositol, 100 mg Adenine Sulfate.2H2O, 1 mg N6Benzyladenine, 0.4 mg Thiamine.HCl

4) Άλατα MS με προσθήκη 100 mg inositol, 100 mg Adenine Sulfate.2H2O, 1 mg N6Benzyladenine, 0.4 mg Thiamine.HCl, 0.5 mg indole-3-butyric acid, 1 mg Pyridoxine, I mg Nicotinic acid

• Τα μεριστώματα προέρχονταν από μητρικά δένδρα που διατηρούνται στο δικτυοκήπιο 15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 39

Εξυγίανση πυρηνοκάρπων με μεριστωματικό εμβολιασμό

• Μεριστωμάτα

πυρηνοκάρπων σε σπορόφυτα - υποκείμενα αμυγδαλιάς, βερικοκιάς και κερασιάς

• Μεριστωματικός μικροεμβολιασμός in vitro μεριστωμάτων πυρηνοκάρπων σε μικρομοσχεύματα - υποκείμενα.

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 40

Προβασική Φυτεία Πυρηνοκάρπων,Ζύγι

• .

Ανεξαρτησία 7γ

Spring Time 15γ Red Haven 6γ

Flavour Top 14γ Φαντασία 5γ

Η Χαλεϊ 13γ

Stanley 23γ Πούλαρτς 12γ Arm King 3γ

President 22γ May Grande 10γ Red June 2γ

Sanda Rosa 21γ Φαγιέτ 8γ Spring Grest 1γ

Χρυσομηλιά33β Royal gold 16β Φαγιέτ 8β

B. Lapine 30β Spring Time 15β Ανεξαρτησία 7β

Παλεν 28β Flavour Top 14β Red Haven 6β

Tente 26β Η. Χάλεϊ 13β Φαντασία 5β

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 41

Προβασική Φυτεία στο Σαϊττά

ΣΤΕΛΛΑ 2 Π. ΛΙΤΣΙΑ 2 BLACK 2

TARTARIAN

ΑΝΕΞΑΡΤΗΣΙΑ 1 Η. ΧΑΛΕΪ 2 ΜΑΡΚΟΝΑ 1

ΤΡΟΥΪΤΟ 2 ΜΠΕΜΠΕΚΟΥ2 ΣΟΥΕΛΛΕΝ 2

ΚΡΕΠΕΛ

Π. ΣΠΙΝΟΖΑ 2 RIVER CHOCK 1 ΛΟΥΪΖΕΤ 1

ΦΛΟΡIΤΑ ΚΙΝΓΚ 2 ΑΝΤΖΕΛΙΝΟ 2 AΝΤΖΕΛΙΝΟ 1 ΣΟΥΕΛΛΕ ΚΡΙΠΕΛ FLORIDA KING 1 ΜΠΙΚΑΡΟ ΠΟΥΡΛΑ

GREEΝ GAGE 2 ΤΡΟΥΪΤΟ 1 ΜΑΡΚΟΝΑ 2 ΓΑΛΑΤΑΣ 2 H. ΧΑΛΕΪ 1 ΤΥΡΙΝΘΟΥ 1

ΜΠΙΓΚ 2 ΤΥΡΙΝΘΟΥ 2 (RED BEAUTY) MONIQUE 1 ΜΠΙΓΑΡΟ ΛΑΠΙΝ BLACK TARTARIAN

ΦΕΡΑΝΙΑ 2 ΙΣΠΑΝΙΚΟ 1 ΛΟΥΪΖΕΤ 2

ΣΤΑΝΛΕΪ 1 Π. ΛΙΤΣΙΑ 1 ΦΟΡΜΟΖΑ 1

GREEΝ GAGE 1 ΧΑΛΑΟΥΪ 2 ΜΠΛΑΚ ΝΤΑΪΑΜΟΝΤ

ΑΝΕΞΑΡΤΗΣΙΑ

ΝΕΚΤΑΡΙΝΙΑ 2

ΠΟΥΛΑΡΤΣ 2 ΧΑΛΑΟΥΪ 1

ΓΑΛΑΤΑ 2 PRESIDENT 1 ΜΠΕΜΠΕΚΟY 1

ΜΟΝΙΚΟΥΪ 2 ΚΟΥΡΩ 1 Π. ΣΠΙΝΟΖΑ 2

ΙΣΠΑΝΙΚΟ 2 RIVER CHOCK ΧΑΤΣΟΝ 2

ΚΟΥΡΩ 2 ΠΟΥΛΑΡΤΣ 1 ΜΠΛΑΚ ΝΤΑΪΑΜΟΝΤ

ΦΟΡΜΟΖΑ 2 RED BEAUTY 1 ΦΕΡΑΝΙΑ 1

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 42

Εξυγίανση εσπεριδοειδών

Ιολογικές ασθένειες εσπεριδοειδών

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 43

Εξυγίανση κυπριακών ποικιλιών εσπεριδοειδών με μικροεμβολιασμό

• Επισκόπηση στις

περιοχές καλλιέργειας

εσπεριδοειδών της

Κύπρου

• Επιλογή δένδρων

Περγαμόντο, Φράππας,

Κουμανταντά, Λεμονιάς

Λαπήθου και Πολύφορης,

Μανταρινιάς Αρακαπά,

και των πορτοκαλιών

Γιαφίτικης, Αιματούσικης, Σιεκέρικης και Βαλέντσια

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 44

Εξυγίανση ελληνικών ποικιλιών εσπεριδοειδών με μικροεμβολιασμό

Λεμονιά Αδαμοπούλου, Λεμονιά Ζαμπετάκη, Πορτοκαλιά Salustiana, Μανταρινιά Page, Κλημεντίνη SRA, Navel late, Star Ruby, Novela Anthous, Μανταρινιά Ενκορ, Λεμονιά Intertonato, Berna , Κλημεντίνη Πόρου, Ομφαλοφόρο Αργους, Κλασουελίνα, Βακαλου, Γκρέιπφρουτ Shambar, Νταρβίλο Ντε Τσακουλλι, Βαλέντσια Πόρου, Βαλέντσια Olinda, Marisol, πορτοκαλιά Moro,

Πορτοκαλιά Lane Late, Nova, Xoνδρολέμονο, Γλυκολέμονο και Πορτοκαλιά Valencia

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 45

Εξυγίανση εσπεριδοειδών Εξυγιάνθηκαν: • Μανταρινιά Αρακαπά • Γιαφίτικη Πορτοκαλιά • Περγαμόντ • Φράππα • Κουμανταντάς • Πολύφορη Λεμονιά • Λεμονιά Λαπήθου

• Πορτοκαλιά Moro • Πορτοκαλιά Lane Late • Μανταρινιά Nova • Πορτοκαλιά Βαλέντσια

• Μανταρινιά Page • Γκρεϊπφρουτ Star Ruby

25/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 46

Eξυγίανση του ιού της τριστέζας των εσπεριδοειδών με

θερμοθεραπεία και μικροεμβολιασμό in vitro

• Οι σωλήνες επωάστηκαν αρχικά για 20 μέρες στους 30οC, για 20 μέρες στους 35οC, για 25 μέρες στους 38οC και τέλος για 5 μέρες στους 40οC. Ισάριθμοι σωλήνες επωάστηκαν σε θάλαμο σταθεράς θερμοκρασίας 22οC

• Μέχρι τους 38οC ο ιός ανιχνεύτηκε ενώ μετά την επώαση στους 40οC καταστράφηκαν 56 μικρόφυτα και στα υπόλοιπα ο ιός δεν ανιχνεύτηκε.

• Ακολούθως εφαρμόστηκε η τεχνική του μικροεμβολιασμού in vitro που συνίσταται στον εμβολιασμό του ακραίου μεριστώματος της επιθυμητής ποικιλίας σε υγιές σπορόφυτο/υποκείμενο που έχει αναπτυχθεί in vitro

25/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 47

Eξυγίανση του ιού της τριστέζας των εσπεριδοειδών με χημειοθεραπεία και

μικροεμβολιασμό in vitro • Μικρομοσχεύματα μήκους 2-4 cm που έφεραν 1-3

οφθαλμούς φυτεύτηκαν υπό ασηπτικές συνθήκες σε δοκιμαστικούς σωλήνες που περιείχαν θρεπτικό υπόστρωμα εμπλουτισμένο με

• α)Ribavirin (C8Η12Ν4Ο5) σε συγκέντρωση 20, 30, 40 και 50 mg/lt

• β) Μethotrexate 30, 40 and 50 mg/lt και τοποθετήθηκαν για χημειοθεραπεία σε θάλαμο σταθεράς θερμοκρασίας 22οC για 30-50 μέρες,

• Ακολούθως εφαρμόστηκε η τεχνική του μικροεμβολιασμού in vitro που συνίσταται στον εμβολιασμό του ακραίου μεριστώματος της επιθυμητής ποικιλίας σε υγιές σπορόφυτο/υποκείμενο που έχει αναπτυχθεί in vitro

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 48

Eξυγίανση του ιού της τριστέζας των εσπεριδοειδών με χημειοθεραπεία in vitro

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6

Ribavirin mg/lt

Shoot survival %

CTV elimination%

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 49

Eξυγίανση ιοειδών των εσπεριδοειδών με Θεραπεία

χαμηλών θερμοκρασιών, χημειοθεραπεία και μικροεμβολιασμό in vitro

•Θεραπεία χαμηλών θερμοκρασιών in vitro για δενδρύλλια προσβεβλημένα

με CEVd η HSVd.

•Εξυγίανση για τα ιοειδή δεν

επετεύχθη στα μικρόφυτα που επωάστηκαν στους 10 C για 4 βδομάδες

•Εξυγίανση για τα ιοειδή επετεύχθη στα μικρόφυτα που επωάστηκαν

στους 4 C για 4 βδομάδες

•Εξυγίανση για τα ιοειδή επετεύχθη

στα μικρόφυτα που υπέστησαν

χημειοθεραπεία σε συγκεντρώσεις Ribavirin 40 και 50 mg/lt

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 50

Eξυγίανση των ιοειδών CEVd και HSVd των εσπεριδοειδών από μικρομοσχεύματα λεμονιάς Λαπήθου με τη μεθόδο

Θεραπείας χαμηλών θερμοκρασιών in vitro

0

5

10

15

20

25

30

22C/8 weeks 10C/5 weeks 4C/5 weeks

Infected shoots number

survival shoots number

viroids elimination

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 51

Προβασική Φυτεία Εσπεριδοειδών Ζύγι

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 52

Προβασική Φυτεία εσπεριδοειδών, Ζύγι Πορτοκαλιές Βαλέντσια

Frost Valencia, Valencia Delta, Midnight, Champman

Πορτοκαλιές Ομφαλοφόρες

Washington navel, Navelina, Nawhall, Gillette

Lanelate, Fisher, Cara-cara (κοκκινόσαρκο)

Πορτοκαλιές Ερυθρόσαρκες

Sanquinelli, Ruby, Tarocco, Moro

Βοτρυόκαρποι και Υβρίδια

Marsh seedless, Star Ruby, Rio Red, Oroblanco, Melogold,

Chandler, Flame

Μανταρινιές και Υβρίδια

Clementine, Nova, Fortuna, Robinson, Murcott

Sunburst, Kinnow, Ortanique, Ellendale,

Orlando, Page, Monreal, Caffin, Sue-Linda Temple, Fina

Λεμονιές Λαπήθου

Λεμονιά Πολύφορη

Μανταρινιές Αρακαπά

STG 77, STG 174, STG 201, STG 212, STG 2627

ΜΕ 52

ΜΕ30, ΜΕ 38, ΜΕ41, ΜΕ 48, ΜΕ 67

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών

53

Τεχνικοί και Ωρομίσθιοι Εκφράζονται θερμές ευχαριστίες σε όσους συνέβαλαν στην διεξαγωγή

των πιο πάνω εργασιών σε διάφορες περιόδους και ιδιαίτερα στους:

Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών: Δημήτρης Κωνσταντίνου, Δημήτρης

Πολυκάρπου, Σπυρούλα Αρσένη, Νίκος Λοϊζιάς, Ανδρέας Χατζηνικολής,

Άρτεμις Χατζηνικολή, Μαρία Παναγιώτου, Κυριάκος Κωνσταντίνου,

Δήμος Αναγιωτίδης, Ειρήνη Χάρκου, Γιάννης Μάρκου, Ανδρέας Κινέζος,

Κούλα Νικολάου κ.α.

Τμήμα Γεωργίας:Γιώργος Σάββας, Χάρης Κινέζος κ.α.

15/10/2015 Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών 54

Ευχαριστώ

Aγιος Ιλαρίωνας, Απρίλης 2015 55