Download - Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Transcript
Page 1: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Επιβλέποντες Καθηγητές: Κωνσταντίνος Βοργιάς και Σταύρος Χαμόδρακας

«Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη: η περίπτωση της διϋδροφολικής αναγωγάση (DHFR)»

Τμήμα ΒιολογίαςΤομέας Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής-

Τομέας Βιοχημείας-Μοριακής ΒιολογίαςΜ.Δ.Ε. Βιοπληροφορικής

Page 2: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκεςΣτη γη συναντώνται ακραία περιβάλλοντα που οι ζώντες οργανισμοί έχουν προσαρμοστεί ώστε να επιβιώνουν σε αυτά με:

αποφυγή του στρεςαντιστάθμιση του στρεςεπαύξησηςτης σταθερότητας των κυτταρικών τους συστατικών

Οι ακραίες συνθήκες αναφέρονται σε:ΘερμοκρασίαΥδροστατική πίεσηPHAλατότηταΑκτινοβολία

Ακραιόφιλα ή‘extremophiles’ είναι οι οργανισμοί που αγαπούν (‘philos’στα ελληνικά) τα ακραία περιβάλλοντα

Παρουσιάζει μεγάλο θεωρητικό και πρακτικό ενδιαφέρον!

Page 3: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Θερμοκρασία περιβάλλοντος

Κάθε οργανισμός χαρακτηρίζεται από μια ελάχιστη θερμοκρασία ανάπτυξης (Tmin), μια βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης (Topt), μια μέγιστη θερμοκρασία (Tmax).

Σε ακραία υψηλές θερμοκρασίες, οι οργανισμοί δεν

επιβιώνουν καθώς αποδιατάσσονται τα ένζυμα, οι πρωτεΐνες μεταφορείς κι άλλες

πρωτεΐνες τους και οι κυτταρικές τους

μεμβράνες.

Εικόνα 1. Γραφική αναπαράσταση του ρυθμού ανάπτυξης συναρτήσει της θερμοκρασίας σε ⁰C.

Κύριος περιβαλλοντικός παράγοντας που επηρεάζει την αύξηση και την επιβίωση των οργανισμών

Page 4: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Θερμοκρασία περιβάλλοντοςΟι οργανισμοί έχουν καταφέρει να

επιβιώνουν σε ένα μεγάλο εύρος θερμοκρασιών που εκτείνεται από -5°C έως θερμοκρασίες άνω των 113°C.

Ζωή συναντάται τόσο σε αρκτικούς κι ανταρκτικούς ωκεανούς όσο και σε υπέρθερμα νερά σε θερμές πηγές.

Εικόνα 2. Καμπύλες ανάπτυξης για τις ομάδες οργ/σμων με διαφορετικά θερμοκρασιακά εύρη ανάπτυξης

Πίνακας 1. Κατηγορίες οργανισμών συναρτήσει των θερμοκρασιών ανάπτυξης τους

Page 5: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Ακραίες θερμοκρασίες περιβάλλοντος

Εικόνα 3. Hydrothermal vents. Black smokers. Βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης: θ≥80C. Μη ύπαρξη ανάπτυξης σε θ≤60C.

Εικόνα 4. Yellowstone National Park, USA.

Page 6: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Οι οργανισμοί ταξινομούνται σε τρία Φύλα:στα Archaea, στα Bacteria και στα Eucarya

Εικόνα 5. Το φυλογενετικό δέντρο που βασίζεται στο μόριο rRNA της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας όπου διακρίνονται τα τρία φύλα της ζωής.

Page 7: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

ΒακτήριαΑνήκουν στους προκαρυωτικούς οργανισμούςΗ ποικιλία των φυσικών θερμικών συνθηκών αύξησης τους είναι ασύγκριτηΈχουν την δυνατότητα να αναπτυχθούν σε θερμοκρασίες υψηλότερες από αυτές των ευκαρυωτικών οργανισμώνΠεριλαμβάνουν ψυχρόφιλα, μεσόφιλα και θερμόφιλα είδη με κύριους εκπροσώπους το ψυχρόφιλο Moritella profunda, το μεσόφιλο Escherichia coli K-12 και το θερμόφιλο Thermotoga maritima.

Κατηγορία Ψυχρόφιλο Μεσόφιλο Θερμόφιλο

Είδη Moritella profunda Escherichia coli K-12 Thermotoga maritima

Tmin ≤2 °C 11.33 °C 60 °C

Topt 2 °C 40.85 °C 80°C

Tmax 12 °C 46.54 °C 90 °C

Πίνακας 2. Οργανισμοί μοντέλα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη και οι θερμοκρασίες ανάπτυξης που τα χαρακτηρίζουν

Page 8: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Μηχανισμοί «ανθεκτικότητας» των οργανισμώνσε ακραίες θερμοκρασίες

Εξωγενείς Σταθεροποιητικά μόρια όπως οσμωλύτες και μεταβολίτες Μεγαλύτερη σύνθεση κι αντικατάσταση βιομορίων Τσαπερόνια

Ενδογενείς Πιο ανθεκτικά βιομόρια και βιομόρια που διατηρούν την λειτουργικότητα τους σε

ακραίες θερμοκρασίες αντισταθμίζοντας το στρες (ασθενείς αλληλεπιδράσεις, επίπεδα οργάνωσης δομής)

Page 9: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Βιομόρια κι ακραίες συνθήκες θερμοκρασίας περιβάλλοντος

Οι οργανισμοί δεν έχουν υιοθετήσει καινούργια βιομόρια ή νέες δομικές υπομονάδες για τις ακραίες συνθήκεςΗ προσαρμογή τους σε ακραίες θερμοκρασίες εξαρτάται από την προσαρμογή των βιομορίων τους ώστε να παραμένουν λειτουργικά

Ενδεχόμενος κίνδυνος η αποδιάταξης (πολύ θερμές συνθήκες) ή η ακαμψίας και παύση

της λειτουργίας τους (πολύ ψυχρές συνθήκες) των βιομορίων !!!

Εικόνα 6. Βιομόρια και θερμοκρασία

Page 10: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Θερμοσταθερά ένζυμαΟι βιοτεχνολογικές διεργασίες συνήθως απαιτούν υψηλές θερμοκρασίες ώστε να μεγιστοποιηθεί η παραγωγή προϊόντος και για τον λόγο αυτό τα θερμοσταθερά ένζυμα έχουν τεράστιο πρακτικό ενδιαφέρον.Τα θερμοσταθερά ένζυμα είναι συνήθως ανθεκτικά κι έναντι χημικής αποδιάταξης π.χ πρωτεόλυσης Θερμοσταθερά ένζυμα μπορούν να απομονωθούν από θερμόφιλους οργανισμούς (η φύση μέσω της εξέλιξης έχει σχεδιάσει) ή να σχεδιαστούν με γενετική μηχανική (βάσει των αρχών που η ίδια η φύση χρησιμοποιεί για αύξηση της σταθερότητας τους)

Διερεύνηση του μοριακού μηχανισμού θερμόφιλης προσαρμογής της κάθε πρωτεϊνικής οικογένειας με σκοπό την κατανόηση των αρχών που η φύση έχει υιθετήσει ώστε οι «ίδιες» πρωτεΐνες να αποκτούν θερμοσταθερότητα

Page 11: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Διϋδροφολική αναγωγάση DHFR Κεντρικό ένζυμο (EC 1.5.1.3) στο μονοπάτι βιοσύνθεσης του φολικού οξέος σε προκαρυωτικά, ευκαρυωτικά κύτταρα και μερικά ιϊκά κύτταρα. σύνθεση γλυκίνης και πρόδρομων μορίων για τη σύνθεση του DNAΚαταλύει την αναγωγή του διϋδροφολικού σε τετραϋδροφολικό οξύ με απαραίτητο συμπαράγοντα το ανηγμένο φωσφορικό δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου-αδενίνης (NADPH)Στόχος αρκετών σημαντικών φαρμάκων, όπως του αντικαρκινικού παράγοντα της μεθοτρεξάτης (MTX).

Εικόνα 7. Δομή της DHFR ως σύμπλοκο με το συνένζυμο NADPH (μπλε χρώμα) και τον χημικό αντικαρκινικό αναστολέα της MTX (πράσινο χρώμα), με PDB ID 3DAU με διακριτική ικανότητα 1.5Å

Page 12: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Θερμόφιλη προσαρμογή κι εξέλιξηΗ κάθε πρωτεΐνη έχει διαμορφωθεί από την μοναδική εξελικτική της ιστορία που αποτελεί το αποτέλεσμα των «ατελών διαπραγματεύσεων» ανάμεσα στην σταθερότητα και την ενεργότητα Η επιλογή στρατηγικής θερμόφιλης προσαρμογής μιας πρωτεΐνης είναι άμεση συνέπεια της εξελικτικής ιστορίας της ίδιας αλλά και του είδους απ’όπου απομονώθηκε και των περιβαλλοντικών συνθηκών

Κύριες στρατηγικές θερμόφιλης προσαρμογής

Κύρια χαρακτηριστικά

Η γενική, μη-ειδική, «η βασιζόμενη στην δομή»

Σημαντική δομική τάση προς πρωτεΐνες πιο συμπαγείς ή πρωτεΐνες με περισσότερο υδρόφοβο πυρήνα

Μεγαλύτερο συνολικό αριθμό σταθεροποιητικών επαφών, χωρίς κάποια από αυτές να είναι ιδιαίτερα ισχυρή

Η ειδική, «η βασιζόμενη στην αλληλουχία»,

Οι αποκλίσεις στην αλληλουχία στοχεύουν στην ισχυροποίηση ειδικών τύπων αλληλεπιδράσεων (π.χ ηλεκτροστατικών)

Στις πρωτεΐνες που προέρχονται από αρχαία παρατηρήθηκε η θερμόφιλη προσαρμογή που βασίζεται στη δομή ενώ σε πρωτεΐνες από βακτήρια παρατηρήθηκε κυρίως αυτή που

βασίζεται στην αλληλουχία!!!

Πίνακας 3. Οι δύο κυριότερες στρατηγικές θερμόφιλης προσαρμογής

Page 13: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Σκοπός

Η διερεύνηση της στρατηγική προσαρμογής της DHFR σε διαφορετικές θερμοκρασίες, με έμφαση στη ψυχρόφιλη και θερμόφιλη προσαρμογή και η συσχέτιση της θερμόφιλης προσαρμογής (θερμοσταθερότητα) με την Εξέλιξη.

Page 14: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

ΜεθοδολογίαΑ. Επιλογή των πρωτεϊνών που θα μελετηθούν

Ομολογία

Υψηλής διακριτικής ικανότητας

δομές DHFRs

Ίδιοι προσδέτες

Βακτηριακή προέλευση

Πηγή:Ψυχρόφιλο βακτήριο

Πηγή:Μεσόφιλο βακτήριο

Πηγή:Θερμόφιλο βακτήριο

Page 15: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Μεθοδολογία

Μήκος, όγκος, σφαιρικότητα,

επιφάνειαΕνεργό κι

αλλοστερικό κέντρο.

Κοιλότητες πρωτεΐνης

Προσβασιμότητα στον διαλύτη.

Περιοχές βάσει αυτής

Στοιχεία δευτεροταγούς

δομής

Αμινοξική σύσταση

Τρισδιάστατη δομή

Ασθενείς αλληλεπιδράσεις

Ηλεκτροστατικό δυναμικό

Β. Συγκριτική μελέτη των ομολόγων πρωτεϊνών

Περιοχές βάσει απόστασης από το γεωμετρικό

κέντρο

1

2

3

8

4

56

6

7

Page 16: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

ΜεθοδολογίαΓ. Απόφανση για την στρατηγική θερμόφιλης/ψυχρόφιλης

προσαρμογής

Δ. Φυλογενετική ανάλυση

Ε. Μελέτη εξέλιξης της DHFR βάσει της θερμοφιλικότητας της

ΣΤ. Συσχέτιση θερμοσταθερότητας με Εξέλιξη

Page 17: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Αποτελέσματα Συλλογή δομών DHFR υψηλής διακριτικής ικανότητας ως σύμπλοκα με

Μεθοτρεξάτη από ψυχρόφιλα, μεσόφιλα και θερμόφιλα βακτήρια.

Επιλέχθηκαν 3 δομές DHFR ως σύμπλοκα με Μεθοτρεξάτη και NADPH από το ψυχρόφιλο βακτήριο Moritella profunda, τo μεσόφιλo Escherichia coli K-

12 και τo υπερθερμόφιλo Thermotoga maritima. Οι δομές παρουσίαζαν ταύτιση>35%.

Στοίχιση ακολουθιών:

Εικόνα 1. Στοίχιση αμινοξικής ακολουθίας της ψυχρόφιλης,Εικόνα 1. Στοίχιση αμινοξικής ακολουθίας της ψυχρόφιλης, της μεσόφιλης και της θερμόφιλης της μεσόφιλης και της θερμόφιλης DHFRDHFR με το πρόγραμμα με το πρόγραμμα Clustal Omega Clustal Omega ((McWilliam et al., 2013).). Οι τρεις πρωτεΐνες Οι τρεις πρωτεΐνες σχολιάζονται και χρωματίζονται ως προς τονσχολιάζονται και χρωματίζονται ως προς τον βαθμό συντήρησης της κάθε θέσης της βαθμό συντήρησης της κάθε θέσης της ακολουθίας τους.ακολουθίας τους.

Page 18: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Αποτελέσματα

Κατηγορία DHFR Ψυχρόφιλη Μεσόφιλη Θερμόφιλη

Κωδικοι στην PDB 3IA4 3DAU 1D1G

Αριθμός

υπομονά

δων

Αρχείο PDB 4 1 2

βιολογική δράση 1 1 2

Μήκος/υπομονάδα 162 159 168Θερμοκρασία τήξης 38 ⁰C 53⁰C 83⁰C

Όγκος(Å3) 27187 26251 29006

Επιφάνεια(Å2) 5919 5839 6658

Σφαιρικότητα,Ψ 0.74 0.73 0.69

Ενεργή ακτίνα (Å) 13.78 13.49 13.07

Πίνακας 1. Συγκριτική μελέτη των φυσικών ιδιοτήτων των τριών δομών Πίνακας 1. Συγκριτική μελέτη των φυσικών ιδιοτήτων των τριών δομών DHFRDHFR

Page 19: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

ΑποτελέσματαΕνεργή Ακτίνα ως Δείκτης

Θερμοφιλικότητας

(β)

Εικόνα 2. (α) Ραβδόγραμμα της ενεργής ακτίνας συναρτήσει της θερμοφιλικότητας (β)Έλεγχος της γραμικότητας της σχέσης

R2=0.99

Page 20: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Ενεργό κι αλλοστερικό κέντρο της DHFR

Εικόνα 3. Με το πρόγραμμα Open-Source Pymol 1.6.x απεικονίζονται οι περιοχές πρόσδεσης της μεθοτρεξάτης MTX (με πράσινο χρώμα, μορφή “sticks”) και του συνενζύμου NDP (με μπλε χρώμα, μορφή “sticks”) για (α) την ψυχρόφιλη, (β)την μεσόφιλη και (γ) την θερμόφιλη DHFR , οι οποίες παρουσιάζονται διαφοροποιημένες

(α) Ψυχρόφιλη πρωτεΐνη

(β) Μεσόφιλη πρωτεΐνη (γ) Θερμόφιλη πρωτεΐνη

(PDB ID 3IA4)

(PDB ID 3DAU) (PDB ID 1D1G)

Page 21: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

ΠοσοτικοποίησηΚοιλότητων

3V: Voss Volume Voxelator

Όγκος (Å3) DHFR Επιφάνεια (Å2)

Channel_1

Channel_2

Channel_1

Channel_2

Ψυχρόφιλη(PDB ID 3IA4) 104 806 174 1151Μεσόφιλη (PDB ID 3DAU) 216 1540 314 1437Θερμόφιλη(PDB ID 1D1G) 507 1898 722 1637

Η λειτουργία που καλείται να επιτελέσει η ψυχρόφιλη DHFR διευκολύνεται από μια ευκολότερη και ταχύτερη πρόσβαση των προσδετών στις περιοχές πρόσδεσης. Στη θερμόφιλη DHFR οι περιοχές πρόσδεσης του υποστρώματος και του συνενζύμου παρουσιάζουν αυξημένο μέγεθος πιθανότατα με σκοπό την προστασία έναντι του αντίξοου περιβάλλοντος

Πίνακας 2. Ποσοτικοποίηση των 2 μεγαλύτερων κοιλοτήτων που αντιστοιχούν σε ενεργό κι αλλοστερικό κέντρο

Επιφάνεια (Å2)

(α) (β)

Όγκος (Å3)

(β)

Διαγράμματα της επιφάνειας (α) και του όγκου (β) των 2 κοιλοτήτων συναρτήσει της θερμοφιλικότητας της DHFR

Εικόνα 4.

Page 22: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Στοιχεία δευτεροταγούς δομής

Η ψυχρόφιλη DHFR περιέχει περισσότερες ελικοειδείς περιοχές για μεγαλύτερη ευκινισία Η θερμόφιλη DHFR περιέχει περισσότερες β-πτυχωτές περιοχές για μεγαλύτερη σταθερότηταΜε αύξηση της θερμοφιλικότητας, αυξάνει η έκταση των βρόχων πιθανόν λόγω μεγαλύτερης ανάγκης καλύτερου πακεταρίσματος της δομής

(α)

(β) (γ)

Εικόνα 5. Διαγράμματα του ποσοστού (α) των β-πτυχωτών επιφανειών και (β) των περιοχών της α-έλικας και (γ) του μήκους των βρόγχων συναρτήσει της θερμοφιλικότητας

Page 23: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Αμινοξική σύσταση (1)ΣυνολικάΚατηγορία Ψυχρόφιλη Μεσόφιλη Θερμόφιλη

A 9.3% 8.2% 3%

V 6.8% 6.9% 11.3%

F 2.5% 3.8% 9.5%

P 5% 6.3% 4.8%

L 10.6% 6.9% 8.9%

I 6.8% 7.6% 4.8%

R 5.6% 5.7% 7.7%

D 5.6% 8.2% 3%

E 8.1% 7.6% 10.1%

S 3.1% 5.7% 6.6%

T 5.6% 3.8% 5.4%

C 0.6% 1.3% 0.0%

N 5.6% 3.8% 4.2%

Q 3.7% 2.5% 0.0%

H 2.5% 3.2% 0.6%

K 3.1% 3.8% 7.7%

M 3.1% 3.2% 1.8%

Y 4.4% 2.5% 2.4%

W 1.9% 3.1% 0.6%

G 6.2% 6.3% 7.7%

Οι ψυχρόφιλοι, οι μεσόφιλοι και οι θερμόφιλοι οργανισμοί έχουν διαφορετικές συχνότητες αμινοξέων στις DHFRs τουςΣτην θερμόφιλη DHFR δεν παρατηρούνται τα θερμοευαίσθητα κατάλοιπα κυστεΐνη και γλουταμίνη και η συχνότητα της θερμοευαίσθητης μεθειονίνης και της ιστιδίνης είναι σημαντικά μειωμένηΗ συχνότητα της αργινίνης και της λυσίνης είναι σημαντικά αυξημένη στην θερμόφιλη DHFR καθώς και της ογκώδης αρωματικής φαινυλαλανίνη

Πίνακας 5. Αμινοξική σύσταση των 3 δομών

Εικόνα 6. Σύσταση φορτ/νων αμινοξέων

Page 24: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Αποστάσεις από το γεωμετρικό κέντρο

Κατηγορία Αμινοξική Σύσταση

Μη πολικά Πολικά ΦορτισμέναΘετικά Αρνητικά

0-7Å Ψυχρόφιλη 100% 0 0 0

Μεσόφιλη

Θερμόφιλη

7-14Å Ψυχρόφιλη 61.8% 20.6% 13.2% 4.4%

Μεσόφιλη 61.2% 16.4% 16.4% 6%

Θερμόφιλη 63.9% 13.1% 14.8% 8.2%

14-21Å Ψυχρόφιλη 54.2% 18.1% 8.3% 19.4%

Μεσόφιλη 50% 14.9% 12.2% 23%

Θερμόφιλη 50% 15.4% 14.1% 20.5%

Αμινοξική σύσταση (4) Πίνακας 6. Αμινοξική σύσταση σε περιοχές συναρτήσει της απόστασης από το γεωμετρικό κέντρο

Υδρόφοβος πυρήνας(100% μη-πολικά κατάλοιπα)Κατηγορία Απόσταση

από το γεωμετρικό κέντρο

Ψυχρόφιλη 0-8.5ÅΜεσόφιλη 0-8.5ÅΘερμόφιλη 0-9Å

Page 25: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Πίνακας 7. Αμινοξική σύσταση σε στοιχεία δευτεροταγούς δομής

Αμινοξική σύσταση (6)

α-έλικες Κατηγορία3IA4 3DAU 1D1G

%Σύσταση σε:

Κατάλοιπα που ευνοούν τις έλικες:R

4.3

6.8

8.6

Kατάλοιπα που δεν ευνοούν τις έλικες:C , H, P

C 4.3 0 0

H 0 2.3 0

P 2.2 4.5 2.9

(α)

(β)

Εικόνα 8. Αμινοξική σύσταση σε (α) β-κλώνους και (β) α-έλικες

Page 26: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Μελέτη τρισδιάστατης δομήςΨυχρόφιλη

Μεσόφιλη Θερμόφιλη

Open-Source Pymol 1.6.x (DeLano, 2002)Με κόκκινο τα φορτισμένα, με κίτρινο τα πολικά και καφέ τα μη-πολικά κατάλοιπα Διαφορετική κατανομή στην τρισδιάστατη δομή της πρωτεΐνης των 3 βασικών κατηγοριών αμινοξικών καταλοίπων στις 3 δομές.

Εικόνα 9. Γραφική αναπαράσταση των 3 δομών της ψυχρόφιλης (α), της μεσόφιλης (β) και της θερμόφιλης (γ)

(α)

(β) (γ)

Page 27: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Υπερθεση δομών

RMSD: 1,421RMSD: 2,471

RMSD: 0,531

Περισσότερο δομικά όμοιες η ψυχρόφιλη και η μεσόφιλη DHFR και κατόπιν περισσότερο δομικά όμοιες η ψυχρόφιλη και η θερμόφιλη DHFR

Εικόνα 10. Υπέρθεση (α) μεσόφιλης-ψυχρόφιλης (β) μεσόφιλης-θερμόφιλης (γ) θερμόφιλης-ψυχρόφιλης(α)

(β) (γ)

Page 28: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Υπέρθεση ψυχρόφιλης,

μεσόφιλης και θερμόφιλης DHFR

Εικόνα 11. Υπέρθεση μεσόφιλης-ψυχρόφιλης -θερμόφιλης DHFR (α) αναπαράσταση δομών ως ribbon(β) αναπαράσταση δομών ως cartoon

(α)

(β)

Οι δομές της DHFR με προσαρμογή σε διαφορετικά θερμοκρασία εύρη έχουν αρκετά όμοιες δομές

Page 29: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις

Ψυχρόφιλη Ψυχρόφιλη ((3IA43IA4))

Μεσόφιλη Μεσόφιλη ((3DAU3DAU))

Θεμόφιλη (Θεμόφιλη (1D1G1D1G))

Δεσμοί υδρογόνου 129 135 146(133 χωρίς διεπιφάνεια)

3IA4_ WATER 3DAU_ WATER 1D1G _ WATER

524 392 249

Γέφυρες άλατος 53 55 72(236 χωρίς διεπιφάνεια)

Αλληλεπιδράσεις με τους προσδέτες

104 121 127

Μόρια νερού στην αλληλεπίδραση με προσδέτες

12 14 5

Πίνακας 8. Πλήθος μη-ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων στις 3 δομές και πλήθος μορίων νερού που συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση τους με τους προσδέτες

Page 30: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Αποτελέσματα. Φυλογενετική ανάλυση

Ψυχρόφιλη DHFR

Μεσόφιλη DHFR

Θερμόφιλη DHFR

Η θερμόφιλη DHFR εξελικτικά είναι περισσότερο απομακρυσμένη από την μεσόφιλη και ψυχρόφιλη DHFRΗ εξελικτική αυτή σχέση συμφωνεί με την εξέλιξη των 16S rRNA γονιδίων

Εικόνα 12.Φυλογενετικό δέντρο

“Neighbour Joining tree Using BLOSUM62” για τις

αμινοξικές ακολουθίες των 3 δομών

Page 31: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Συμπέρασμα 1: Στρατηγική θερμόφιλης προσαρμογής της DHFR

Προσαρμογή της αμινοξικής της ακολουθίας (αύξηση συχνότητας φορτισμένων καταλοίπων, σταθεροποίηση α-ελίκων) χωρίς να διαφοροποιείται σημαντικά η δομή της πρωτεΐνης για να επιτύχει μεγαλύτερη συμπαγότητα ή μεγαλύτερη υδροφοβικότητα στον πυρήνα. Η διαφοροποίηση της αμινοξική αλληλουχίας έχει ως αποτέλεσμα την σημαντική αύξηση των δεσμών άλατος, οι οποίοι μπορούν να θεωρηθούν υπεύθυνοι για την αυξημένη θερμοσταθερότητα ιδίως όταν αυτοί σχηματίζουν δίκτυα. Η αφθονία σε δεσμούς άλατος της θερμόφιλης DHFR επαυξάνεται από το φαινόμενο του ολιγομερισμού (διεπιφάνεια του διμερούς). Με τον ομοδιμερισμό, το πλήθος των δεσμών υδρογόνου της θερμόφιλης DHFR επίσης συμπληρώνεται κι έτσι ξεπερνά αυτό της μεσόφιλης ομόλογης της. Δομικές διαφοροποιήσεις όπως αύξηση της παρουσίας των β-κλώνων, μεγαλύτερος σε έκταση υδρόφοβος πυρήνας και διαφοροποιημένες οι περιοχές πρόσδεσης του υποστρώματος και του συνενζύμου (ποσοτικά, ποιοτικά).Μικρότερη συμμετοχή των μορίων νερού στην μοριακή αναγνώριση των προσδετώνΟι πρωτεΐνες που ακολουθούν αυτό το είδος θερμόφιλης προσαρμογής συνηθέστερα δεν ανήκουν στους αρχαίους υπερθερμόφιλους οργανισμούς που πιστεύεται ότι εξελίχθηκαν απευθείας σε θερμό περιβάλλον αλλά σε οργανισμούς των οποίων η θερμόφιλη προσαρμογή ήταν συνέπεια της επαναποικιοποίησης τους σε θερμό περιβάλλον.

Page 32: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

Συμπέρασμα 2: Στρατηγική ψυχρόφιλης προσαρμογής της DHFR

Προσαρμογή της αμινοξικής της ακολουθίας στο σύνολο της δομής αλλά κυρίως στην επιφάνεια της με ελάχιστη διαφοροποίηση της δομή της πρωτεΐνηςΠολύ αυξημένος αριθμός δεσμών υδρογόνου μεταξύ πρωτεΐνης και μορίων του διαλύτη.Ο διαλύτης (το νερό) και οι εξωτερικοί δεσμοί υδρογόνου της DHFR με τον διαλύτη είναι πολύ σημαντικοί για την προσαρμογή ενώ οι υπόλοιπες διαμοριακές δυνάμεις εμφανίζονται μειωμένες πιθανότατα για να επιτρέπουν την απαιτούμενη για την κατάλυση ευελιξία (κατάλυση με χαμηλότερο ενεργειακό κόστος). Η ευελιξία της ψυχρόφιλης DHFR στο ψύχος εξασφαλίζεται επίσης λόγω της παρουσίας περισσότερων α-ελίκων και λιγότερων β-πτυχωτές επιφανειών στην δομή τους.Διαφοροποιημένες οι περιοχές πρόσδεσης του υποστρώματος και του συνενζύμου.

Page 33: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

ΣυζήτησηΤο ένζυμο της διϋδροφολική αναγωγάση (DHFR) προέρχεται από ένα housekeeping γονίδιο και είναι συντηρημένο μελέτη σχέσης βακτηρίου και περιβάλλοντοςΤο ένζυμο αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως συντηρημένος μοριακός δείκτης και να χρησιμοποιηθεί στην εγκαθίδρυση μιας εξελικτικής σχέσης. Η φυλογενετική ανάλυση αυτού του ενζύμου έγινε με βάσει την αμινοξική ακολουθία των υπό μελέτη πρωτεϊνών και τα αποτελέσματα αυτής συμφωνούν με τις δομικές συγκρίσεις (υπερθέσεις). Η εξελικτική αυτή σχέση συμφωνεί με την εξέλιξη των 16S rRNA γονιδίων κι αυτό συνεπάγεται ότι δεν έχει πραγματοποιηθεί «Οριζόντια μεταφορά γονιδίων» από άλλα είδη οργανισμών ή «Κάθετη μεταφορά γονιδίων» από κάποιον προγονικό είδος οργανισμών για την DHFR.Η θερμοφιλικότητα των πρωτεΐνών εμφανίζεται εξελικτικά απομακρυσμένη από την μεσοφιλικότητα και την ψυχροφιλικότητα και πιθανότατα προϋπήρχε αυτών (θερμόφιλη αρχέγονη γη).Κάθε πρωτεΐνη ακολουθεί τον δικό της μηχανισμό θερμόφιλης και ψυχρόφιλης προσαρμογής, ενώ υπάρχουν κάποιοι κοινοί μηχανισμοί θερμόφιλης προσαρμογής και για τον λόγο αυτό εξετάσαμε όλους τους μηχανισμούς θερμοκρασιακής προσαρμογής που έχουν παρατηρηθεί.

Page 34: Θερμοσταθερότητα πρωτεϊνών μέσα στην εξέλιξη

ΕυχαριστίεςΚαθηγητή Κωνσταντίνο ΒοργιάΚαθηγητή Σταύρο ΧαμόδρακαΛέκτορα Βασιλική ΟικονομίδουΔιδάκτορα Νίκο ΠαπανδρέουΌλα τα μέλη του Εργαστηρίου Βιοπληροφορικής και Βιοφυσικής και τους συμμετέχοντες στο Μ.Δ.Ε. «Βιοπληροφορικής»Όλους εσάς για την προσοχή σας!